KR20200112312A

KR20200112312A - 다브라페닙을 유효성분으로 포함하는 알레르기 질환 예방, 치료 또는 개선용 조성물

Info

Publication number: KR20200112312A
Application number: KR1020190032592A
Authority: KR
Inventors: 김상현; 김민종; 장용현; 이소영; 최영애; 이병헌; 백문창
Original assignee: 경북대학교 산학협력단
Priority date: 2019-03-21
Filing date: 2019-03-21
Publication date: 2020-10-05
Also published as: KR102192576B1

Abstract

본 발명은 다브라페닙을 유효성분으로 포함하는 알레르기 질환 예방, 치료 또는 개선용 조성물에 관한 것으로, 알레르기 반응과 관련 있는 비만세포로부터의 히스타민 유리를 억제하고, 염증 유발 사이토카인인 IL-4 유전자의 발현 및 전사인자인 NF-ĸB 활성을 억제하는 효과가 우수하여 알레르기 질환, 특히 비만세포를 매개로 하는 알레르기 질환의 예방 및 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

다브라페닙을 유효성분으로 포함하는 알레르기 질환 예방, 치료 또는 개선용 조성물{Composition comprising Dabrafenib for Preventing, Treating or Improving Allergic Disease}

본 발명은 다브라페닙을 유효성분으로 포함하는 알레르기 질환 예방, 치료 또는 개선용 조성물에 관한 것이다.

알레르기란 광범위하고 복잡한 병리적 현상의 총화로 면역반응에 근거한 생체의 전신적 또는 국소적인 장애이다. 인체에 나타나는 알레르기는 면역 기전에 따라 Ⅰ, Ⅱ, Ⅲ 및 Ⅳ형으로 분류되며, 이 중에서 즉시형 과민반응에 속하는 Ⅰ형 알레르기가 임상에 있어서 중요한 부분을 차지하고 있으며, 아토피성 피부염, 알레르기성 비염, 기관지 천식, 고초열 및 화분증 등이 여기에 속한다.

1953년경 Ⅰ형 알레르기는 비만세포의 활성화에 의해 일어나며, 이러한 비만세포의 과립에는 염증반응의 매개체인 히스타민(histamine)이 다량 함유되어 있는 것으로 보고되었다. 알레르기 반응이 일어날 때 비만세포에서 히스타민이 방출되는 현상이 발견된 후에 이 기전을 규명하던 중, 이시자까(Ishizaka)의 immunoglobulin E(IgE)의 발견은 비만세포가 즉시형 알레르기 반응에 관여함을 밝히는 중요한 계기가 되었다. 즉, 비만세포 표면에는 IgE 고친화성 수용체가 있으며, 이 수용체에 IgE가 결합한 후 다시 항원이 결합하여 가교가 형성되면 탈과립반응이 유발되어 과립 내용물인 히스타민, 세로토닌(serotonin), 브라드키닌(bradykinin) 등과 같은 합성되어 저장되어 있던 매개물질(preformed mediator)과, 프로테아제(protease), 프로테오글리칸(proteoglycan) 등이 동시에 방출되는 것이다(Ishizaka, Hosp Pract.; 12(1):57-67, 1977).

1970년대 이후 새로운 지질성의 염증 매개체에 대한 연구 결과가 보고되기 시작하였으며, 이들은 세포의 활성화에 동반하여 세포막 인지질로부터 생산된 프로스타그란딘류(prostaglandins), 류코트리엔류(leukotriens), 트롬복산(thromboxane), 글리세로포스포리피드(glycerophospholipids) 유도체인 PAF(platelet activating factor) 등으로 다양한 생리활성을 나타내는 신생 매개체들로서 Ⅰ형 알레르기 반응을 포함한 각종의 염증 반응에 관여함이 밝혀졌다. 이러한 지질성 매개체는 IgE 수용체가 가교를 형성할 때 비만세포에서 탈과립반응과 병행해서 생산, 방출되는 것으로 보고되었다.

Ⅰ형 알레르기는 비만세포의 활성화에 의해 방출되는 과립내용물인 활성아민류와 프로테아제(protease)류, 세포막 인지질에서 생성되는 지질성 매개체, 면역반응의 조절인자로 잘 알려진 IL-3(비만세포 증식인자), IL-4, IL-5과 같은 사이토카인(cytokine)인 등이 관련되어 일어나는 생체의 자연스러운 현상이다(Galli SJ et al., Curr Opin Immunol.; 3(6):865-872, 1991; Bradding P et al., J Immunol.;151(7):3853-3865, 1993). 또한, 알레르기 항원에 피부가 노출되면 랑게르한스 세포의 표면에 있는 IgE 수용체에 항원 특이 IgE가 결합하고, 이 항원의 표면에 있는 T세포에 전달되어 T세포가 활성화 된다. 이 경우, 정상과 달리 알레르기성 피부질환, 특히, 아토피 피부염에서는 Th2가 활성화되어 IL-4, IL-5, IL-6, IL-8, IL-10 및 IL-13 등의 사이토카인이 분비되고, 그 결과 B 세포에서 IgE의 생성이 촉진되고, 활성화되어있는 비만세포의 탈과립을 촉진시켜 사이토카인과 히스타민이 유리된다(Baruah C. C. et al.,Pharmacol Res.;38(6):487-92, 1998; Karadag C. H. et al.,Braz J Med Biol Res.;33(3):327-330, 2000; Paolini R. et al., Nature.;353(6347):855-858, 1991).

현재 임상적으로 사용되고 있는 알레르기 치료 약물은 작용기전에 따라 탈과립저해제, 화학전달물질 작용억제제, 화학전달물질 합성저해제 등 있다. 이들 약물들 중, 화학전달물질 작용억제제와 화학전달물질 합성저해제의 경우 약물작용점이 비교적 확실하지만, 탈과립저해제의 경우 그 작용기전이 불분명한 상태이며, 또한 이들 약물들은 장기간 투여에 의해 여러 가지 부작용을 초래할 수 있다. 이에 따라Ⅰ형 알레르기의 치료를 위해 비만세포에서 이들 생리활성 물질의 생산 및 유리에 대한 작용기전을 밝히고, 장기복용에 따른 부작용을 최소화할 수 있는 물질의 개발이 대단히 중요하다고 할 수 있다.

이에, 본 발명자들은 알레르기 질환 개선 물질 발굴을 위한 연구를 수행하여 본 발명을 완성하였다.

대한민국 특허공개 제10-2016-0088884호

본 발명의 하나의 목적은 하기 화학식 1로 표시되는 다브라페닙(dabrafenib) 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 알레르기 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 하기 화학식 1로 표시되는 다브라페닙을 유효성분으로 포함하는 알레르기성 피부염 예방 또는 개선용 화장료 조성물을 제공하는 것이다.

[화학식 1]

본 발명의 일 양상은 하기 화학식 1로 표시되는 다브라페닙(dabrafenib) 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 알레르기 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

[화학식 1]

본 발명에서 사용되는 용어, "알레르기"는 어떤 외래성 물질과 접한 생체가 그 물질에 대하여 정상과는 다른 반응을 나타내는 현상을 의미한다. 알레르기란 광범위하고 복잡한 병리적 현상의 총화로 면역반응에 근거한 생체의 전신적 또는 국소적인 장애이다. 인체에 나타나는 알레르기는 면역 기전에 따라 Ⅰ, Ⅱ, Ⅲ 및 Ⅳ형으로 분류되며, 이 중에서 즉시형 과민반응에 속하는 Ⅰ형 알레르기가 임상에 있어서 중요한 부분을 차지하고 있으며, 아토피성 피부염, 알레르기성 비염, 기관지 천식, 고초열 및 화분증 등이 여기에 속한다. 상기 알레르기 질환은 바람직하게는 염증성 알레르기 질환일 수 있다.

본 발명에서 사용되는 용어, "예방"은 본 발명의 조성물의 투여로 알레르기 질환을 억제시키거나 진행을 지연시키는 모든 행위를 의미한다.

본 발명에서 사용되는 용어, "치료"는 본 발명의 조성물의 투여로 알레르기 질환의 증상이 호전 또는 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다.

본 발명의 약학적 조성물은 약학적으로 허용되는 담체를 포함할 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물에 포함되는 약학적으로 허용되는 담체는 약제의 제조에 통상적으로 이용되는 것으로써, 락토오스, 덱스트로스, 수크로오스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산칼슘, 미세결정성 셀룰로오스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로오스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로오스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences (22th ed., 2013)에 상세히 기재되어 있다.

본 발명의 일 구체예에 따른 약학적 조성물은 하나 이상의 알레르기 질환의 예방 또는 치료에 활성을 나타내는 물질과 함께 투여될 수 있다.

또한, 본 발명의 일 구체예에 따른 약학적 조성물은 알레르기 질환의 치료를 위하여 단독으로, 또는 시술, 호르몬 치료, 약물치료 및/또는 생물학적 반응 조절제를 사용하는 방법들과 병용하여 사용될 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 그 제형의 제제화에 필요하고 적절한 각종 기제 및/또는 첨가물을 포함할 수 있으며, 그 효과를 떨어트리지 않는 범위 내에서 비이온 계면활성제, 실리콘 폴리머, 체질안료, 향료, 방부제, 살균제, 산화 안정화제, 유기 용매, 이온성 또는 비이온성 증점제, 유연화제, 산화방지제, 자유 라디칼 파괴제, 불투명화제, 안정화제, 에몰리언트(emollient), 실리콘, α-히드록시산, 소포제, 보습제, 비타민, 곤충 기피제, 향료, 보존제, 계면활성제, 소염제, 물질 P 길항제, 충전제, 중합체, 추진제, 염기성화 또는 산성화제, 또는 착색제 등 공지의 화합물을 더 포함하여 제조될 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물의 투여량은 성인 기준으로 0.001~1000㎎/kg일 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 비경구 투여할 수 있으며, 예를 들어, 환부에 도포, 점적 또는 분무하는 방법으로 투여 경피할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 약학적 조성물은 비경구 투여시 다양한 제형으로 투여될 수 있는데, 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드, 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들어, 습윤제 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 구체적으로, 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제 및 동결건조제제가 포함될 수 있다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜(Propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 또한, 치료제의 효능 증진을 위해 칼슘이나 비타민 D3를 첨가할 수 있다.

이러한 조성물은 단위-용량(1회분) 또는 다중-용량(수 회분) 용기, 예를 들어, 밀봉된 앰풀 및 바이알에 제시될 수 있고, 사용 직전에 멸균성 액상 담체, 예를 들어, 주사용 수의 부가만을 요구하는 동결-건조 조건하에 저장할 수 있다. 즉석의 사용제 및 현탁제는 멸균성 산제, 과립제 및 정제로부터 제조할 수 있다.

본 발명에서 상기 알레르기 질환은 바람직하게는 비만세포를 매개로 발생되는 알레르기성 질환일 수 있다.

본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 알레르기 질환은 접촉성 피부염, 아토피 피부염, 천식, 알레르기성 결막염, 치주염, 비염, 중이염, 인후염, 편도염, 폐렴, 위궤양, 위염, 크론병, 대장염, 치질, 통풍, 강직성 척추염, 류마티스 열, 루푸스, 섬유근통(fibromyalgia), 건선관절염, 골관절염, 류마티스 관절염, 견관절주위염, 건염, 건초염, 건주위염, 근육염, 간염, 방광염, 신장염, 쇼그렌 증후군(sjogren's syndrome), 아나필락틱 쇼크(anaphylactic shock), 다발성 경화증, 급성 염증, 만성 염증질환, 두드러기, 고초열, 소화관 알레르기, 약제 알레르기, 식품 알레르기 및 화분증으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 질환일 수 있다.

본 발명의 조성물은 비만세포에서 히스타민의 유리를 억제하고, 염증 유발성 사이토카인의 발현을 억제하는 다브라페닙을 유효성분으로 포함하므로, 다양한 알레르기 질환의 예방 또는 치료에 활성을 나타낼 수 있다.

본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 약학적 조성물은 총 용량 0.1㎎/㎏ 내지 10.0㎎/㎏으로 경피 투여될 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물이 경피 투여될 경우, 총 용량 0.1㎎/㎏ 내지 10.0㎎/㎏으로 투여됨으로써, 우수한 알레르기 피부 질환의 예방 또는 치료가 가능하며, 특히, 10.0㎎/㎏으로 투여될 경우, 전사억제의 기작으로써 강력한 항염증작용을 갖는 덱사메타손 대비 동일 용량으로도 현저히 우수한 알레르기 피부 질환의 예방 또는 치료 효과를 나타낼 수 있다.

본 발명의 다른 양상은 하기 화학식 1로 표시되는 다브라페닙을 유효성분으로 포함하는 알레르기성 피부염 예방 또는 개선용 화장료 조성물을 제공한다.

[화학식 1]

본 발명의 화장료 조성물은 추가로 지방 물질, 유기 용매, 용해제, 농축제 및 겔화제, 연화제, 항산화제, 현탁화제, 안정화제, 발포제(foaming agent), 방향제, 계면활성제, 물, 이온형 또는 비이온형 유화제, 충전제, 금속 이온 봉쇄제 및 킬레이트화제, 보존제, 비타민, 차단제, 습윤화제, 필수 오일, 염료, 안료, 친수성 또는 친유성 활성제, 지질 소낭 또는 화장품에 통상적으로 사용되는 임의의 다른 성분과 같은 화장품 분야에서 통상적으로 사용되는 보조제를 더 포함할 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물은 그 제형의 제제화에 필요하고 적절한 각종 기제 및/또는 첨가물을 포함할 수 있으며, 그 효과를 떨어트리지 않는 범위 내에서 비이온 계면활성제, 실리콘 폴리머, 체질안료, 향료, 방부제, 살균제, 산화 안정화제, 유기 용매, 이온성 또는 비이온성 증점제, 유연화제, 산화방지제, 자유 라디칼 파괴제, 불투명화제, 안정화제, 에몰리언트(emollient), 실리콘, α-히드록시산, 소포제, 보습제, 비타민, 곤충 기피제, 향료, 보존제, 계면활성제, 소염제, 물질 P 길항제, 충전제, 중합체, 추진제, 염기성화 또는 산성화제, 또는 착색제 등 공지의 화합물을 더 포함하여 제조될 수 있다.

본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 알레르기성 피부염은 접촉성 피부염 또는 아토피 피부염일 수 있다.

본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 화장료 조성물은 화장수, 젤, 로션, 연고, 크림, 팩, 에센스, 패치 또는 분무제로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 제형일 수 있다.

다브라페닙을 유효성분으로 포함하는 알레르기 질환 예방, 치료 또는 개선용 조성물에 따르면, 알레르기 반응과 관련 있는 비만세포로부터의 히스타민 유리를 억제하고, 염증 유발 사이토카인인 IL-4 유전자의 발현 및 전사인자인 NF-ĸB 활성을 억제하는 효과가 우수하여 알레르기 질환, 특히 비만세포를 매개로 하는 알레르기 질환의 예방 및 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

도 1A는 RBL-2H3 세포에서, 다브라페닙(Dab)의 히스타민 유리 억제 활성을 나타낸 그래프이다(Dexa: dexamethasone).
도 1B는 랫트 복강 비만세포(rat peritoneal mast cells, RPMCs)에서, 다브라페닙의 히스타민 유리 억제 활성을 나타낸 그래프이다.
도 2은 RBL-2H3 세포에서, 다브라페닙의 세포 내 칼슘 감소 활성을 나타낸 그래프이다.
도 3는 RBL-2H3 세포에서, IL-4 사이토카인에 대한 다브라페닙의 발현 억제 활성을 나타낸 그래프이다.
도 4는 다브라페닙의 IκBα 분해 및 NF-ĸB 활성 억제 활성을 나타낸 그래프이다.
도 5A는 수동형 국소 피부 알레르기 반응(passive cutaneous anaphylaxis, PCA)이 유도된 생쥐에서, 다브라페닙의 피부 알레르기 개선 효과를 나타낸 사진이다.
도 5B는 수동형 국소 피부 알레르기 반응이 유도된 생쥐에서, 다브라페닙의 농도별 피부 알레르기에 대한 귀 두께 변화를 나타낸 그래프이다.
도 5C는 수동형 국소 피부 알레르기 반응이 유도된 생쥐에서, 다브라페닙의 농도별 피부 알레르기에 대한 귀의 발적(absorbance) 변화를 나타낸 그래프이다.
도 6은 RBL-2H3 세포에서, 다브라페닙의 세포독성을 나타낸 그래프이다.

이하 본 발명을 하나 이상의 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 비만세포의 분리 및 배양

<1-1> 시약 및 세포 배양

항-dinitrophenyl(DNP)-IgE(Cat No. D8406), DNP-human serum albumin(HSA)(Cat No. A6661)은 Sigma사(미국)에서 구입하였다. 인간 비만세포주인 RBL-2H3 세포(한국세포주은행에서 구입)는 열에 의해 불활성화한 10% FBS가 첨가된 Gibco사(미국)의 Dulbecco's modified eagle medium(DMEM)(Cat No. 12800-017)에서 배양하였다.

<1-2> 랫트의 복강 비만세포의 분리 및 배양

랫트 복강 비만세포(rat peritoneal mast cells, RPMCs)를 분리하기 위하여 랫트를 이산화탄소로 안락사한 후, 20㎖의 완충용액(Tyrode's buffer: 137mM NaCl, 5.6mM glucose, 12mM NaHCO₃, 2.7mM KCl, 0.3mM NaH₂PO₄, 0.1% gelatin)을 복강 내에 주사하고, 약 90초 동안 복부의 좌우측을 약하게 마사지하였다. 랫트의 복강 외피를 절개한 후, 복강 내의 완충용액을 파스퇴르 피펫을 사용하여 회수하고, 실온에서 원심분리(150g, 10분)하여 침전시켰다. 침전물을 다시 1㎖의 완충용액에 섞은 후, 2㎖의 Histodenz 용액(0.235g/㎖) 위에 조심히 띄우고 실온에서 원심분리(400g, 10분)하였다. 상층액을 제거하고, 남은 침전물에 1㎖의 완충용액을 가하여 세척한 후, 톨루이딘 블루(toluidine blue) 염색을 통해 비만세포를 확인하였으며, 트리판 블루(trypan blue) 염색을 통해 세포의 생존 여부를 확인하였다. RPMCs는 열에 의해 불활성화한 10% FBS가 첨가된 Gibco사(미국)의 Alpha minimum essential media(AMEM)(Cat No. 11900-024)에서 배양하였다.

<1-3> 마우스의 골수 유래 비만세포의 분리 및 배양

마우스 골수 유래 비만세포(bone marrow-derived mast cells, BMMCs)를 분리하기 위하여 마우스를 이산화탄소로 안락사한 후, 엉덩이에서 발목까지 피부를 제거하고, 가위로 뼈를 부수지 않고 쥐의 대퇴골에서 근육을 조심스럽게 제거하였다. 모든 후속 단계는 골수의 오염을 방지하기 위해 멸균 세포 배양 후드 내에서 수행되었다. 그 다음, 대퇴골과 경골을 PBS로 씻어 내고, 각 뼈의 끝 부분을 절단하였다. 골수강을 열고, 골수를 인슐린 주사기를 사용하여 페트리 접시(Sarstedt, Numbrecht, Germany)에 세포를 수집한 후, 세포 현탁액을 T 플라스크로 옮겼다.

실시예 2. 비만세포에서 다브라페닙의 히스타민 유리 억제 효과 확인

비만세포에서 다브라페닙의 히스타민 유리 억제 효과를 확인하기 위하여 실시예 1-1에서 준비한 RBL-2H3 세포와 실시예 1-2에서 분리한 RPMCs를 항-DNP-IgE로 감작시킨 후, DNP-HSA를 처리하여 활성화시킴으로써 세포 내 과립의 주 함유물질이자 알레르기 유발물질인 히스타민을 유리시켰다. 활성화에 앞서 각각의 비만세포들에는 다양한 농도의 다브라페닙(dabrafenib)을 전 처리하였으며, 활성화된 비만세포의 배양액을 회수하여 실험에 사용하였다.

구체적으로, 에펜돌프 튜브에 활성화된 비만세포의 배양액 시료 200㎕를 취하여 0.1N 염산 80㎕와 60％ 과염소산 용액 20㎕를 혼합하고, 원심분리(13,000g, 20분, 5415R, Eppendorf사)하였다. 그 후, 상등액 200㎕를 취해 5N NaOH 용액 100㎕, n-부탄올(n-butanol) 800㎕, 5M NaCl 200㎕를 혼합한 시험관에 넣고 이를 진탕한, 후 원심분리(13,000g, 20분)하였다. 상기 시험관에서 부탄올(butanol)층 500㎕를 취해 0.1N 염산 200㎕, n-헵탄(n-heptane) 500㎕를 가하여 진탕하고, 다시 원심분리(13,000g, 20분)하여 얻어진 수층 150㎕에, 1N NaOH 40㎕, 1％ o-프탈디알데하이드(o-phthaldialdehyde) 용액(Sigma사, Cat No. P1378) 10㎕를 가하여 혼합하고, 5분 동안 방치한 다음, 3N 염산 20㎕을 추가하여 방출파장(emission wavelength) 440nm, 여기파장(excitation wavelength) 360nm에서 형광강도를 형광분석기(GEMINIEM, Molecular Devices 사)를 이용하여 측정하였다.

측정한 결과를 도 1에 나타내었다.

도 1에 나타낸 바와 같이, 활성화된 RBL-2H3 세포(도 1A) 및 RPMCs 세포(도 1B)에서 많은 양의 히스타민이 유리되었으며, 다브라페닙의 처리에 의해 농도 의존적으로 히스타민의 유리가 억제되는 것으로 확인되었다. 특히, 다브라페닙은 양성대조군으로 사용된 덱사메타손(dexamethasone)에 비해 낮은 농도에서 비슷한 수준의 히스타민의 유리 억제 효과를 나타내는 것으로 확인되었다.

이와 같은 결과를 통하여, 다브라페닙의 알레르기 질환 개선 효과를 확인하였다.

실시예 3. 비만세포에서 다브라페닙의 세포 내 칼슘 감소 효과 확인

칼슘은 세포 내 2차 전달물질로써, 생리활성의 조절에 중요한 역할을 하고, 비만세포의 탈과립을 조절하는 신호전달 물질로 알려져 있다. 즉, 세포 내 칼슘의 양이 증가하면 비만세포가 탈과립되고, 반대로 칼슘의 양이 감소하면 비만세포의 탈과립이 억제된다. 따라서, 비만세포에서 다브라페닙의 히스타민 유리 작용기전을 확인하기 위하여, 세포 내 칼슘에 대한 다브라페닙의 효과를 분석하였다.

구체적으로, 실시예 1-1에서 준비한 RBL-2H3 세포에 항-DNP-IgE와 DNP-HSA를 각각 처리하여 활성화된 비만세포를 Fluo-3, AM(Invitrogen사, Cat No. F1242)으로 형광염색 및 형광분석기로 측정하여, 다브라페닙의 처리 여부에 따른 세포 내 칼슘 변화를 분석하였다.

측정한 결과는 도 2에 나타내었다.

도 2에 나타낸 바와 같이, 활성화된 비만세포에서는 세포 내 칼슘이 급격하게 증가한 반면, 다브라페닙 처리군에서는 유의적으로 세포 내 칼슘이 감소한 것으로 확인되었다. 특히, 다브라페닙은 비교예로 사용된 세포내 칼슘 저해제인 BAPTA-AM(1,2-Bis(2-aminophenoxy)ethane-N,N,N′,N′-tetraacetic acid tetrakis(acetoxymethyl ester))에 비해 낮은 농도에서도 유사한 수준으로 비만세포의 탈과립을 억제하는 것으로 확인되었다.

이와 같은 결과를 통하여, 다브라페닙은 비만세포내 칼슘을 감소시킴으로써, 비만세포의 탈과립을 억제할 수 있으므로, 알레르기 개선 효과를 나타내는 것으로 확인되었다.

이와 같은 결과를 통하여, 다브라페닙의 비만세포 내 칼슘을 감소 및 비만세포의 탈과립 억제에 따른 알레르기 질환 개선 효과를 확인하였다.

실시예 4. 비만세포에서 다브라페닙의 염증 유발 저해 효과 확인

<4-1> 다브라페닙의 염증 유발성 사이토카인 억제 효과 확인

비만세포에서 유리되거나 새로 합성되어 분비됨으로써 염증성 알레르기를 일으키는 생리활성물질인 IL-4와 같은 염증 유발성 사이토카인의 발현에 대한 다브라페닙의 발현 억제 효과를 확인하기 위하여, 비만세포를 항-DNP-IgE로 감작시킨 후, DNP-HSA로 활성화하여 염증 유발성 사이토카인의 분비를 촉진시키고, 효소결합 면역흡착 분석법(ELISA)을 이용하여 각각의 분비량을 측정하였다.

구체적으로, ELISA로 배양액 내의 사이토카인 농도를 산출하기 위하여, 이미 상품화 되어있는 kit(San Diego, BD biosciences 사)을 사용하였다. 항원이 부착되어 있는 웰에 배양액과 농도별로 희석한 표준시료를 200㎕를 넣고 방치하였다. 120분 후, 세척액으로 3회 세척하고, 1차 항체를 100㎕씩 넣고 잘 혼합하여 60분간 방치한 다음, 세척액으로 3회 세척하고, 2차 항체와 효소 시약을 섞은 혼합시약을 100㎕씩 넣었다. 반응이 끝난 후, 혼합물을 버리고 세척액으로 4회 세척한 다음, 기질 용액을 100㎕씩 넣고, 빛을 차단한 실온 상태에서 20분간 방치하였다. 반응 후 정지시약(2N H₂SO₄)을 50㎕씩 넣어주어 반응을 정지하고, 450nm에서의 흡광도를 흡광분석기(Sunnyvale, Molecular devices 사)로 측정하였다.

측정한 결과는 도 3에 나타내었다.

도 3에서 나타낸 바와 같이, 항-DNP-IgE와 DNP-HSA로 활성화시킨 RBL-2H3 세포에서 IL-4 사이토카인의 분비량이 증가하였으며, 다브라페닙의 농도 의존적으로 이들 사이토카인의 분비량이 감소하는 것으로 확인되었다. 또한, 대조군인 덱사메타손(dexamethasone)에 비해 더 낮은 농도에서도 효과적으로 염증 유발성 사이토카인의 분비량을 감소시키는 것으로 확인되었다.

이와 같은 결과를 통하여, 다브라페닙은 덱사메타손에 비해 더욱 효과적으로 염증 유발을 억제할 수 있는 것으로 확인되었다.

<4-2> 다브라페닙의 NF-ĸB 억제 효과 확인

다브라페닙이 염증 유발성 사이토카인인 IL-4의 발현을 억제하는 과정에 관여하는 보다 정확한 신호전달 기전을 밝히기 위하여, 염증성 사이토카인의 전사를 조절하는 인자로써, 면역반응과 염증반응을 매개하는 중요한 신호 전달 물질인 NF-ĸB의 활성화를 측정하였다. 비활성 상태의 NF-ĸB는 내인성 억제 단백질인 IĸBα에 결합하여 비활성화 상태를 유지하다가, 활성화될 경우, IĸBα의 인산화 및 분해에 의해 유리 및 핵으로 이동하여 전사인자로써 활동하므로 IĸBα에 대한 분해 영향도 아울러 측정하였다.

NF-ĸB에 대한 다브라페닙의 억제 효과를 확인하기 위하여, 실시예 1-3에서 분리한 BMMC 세포를 항-DNP-IgE로 감작시킨 후, DNP-HSA로 활성화하여 NF-ĸB를 활성화시킨 다음 웨스턴블랏(Western blot) 분석을 통하여 핵과 세포질에서 단백질량을 각각 측정하였다.

구체적으로, BMMC 세포를 0.5mM 페닐메탄에설포닐 플루오라이드(phenylmethanesulfonyl fluoride, Sigma사, Cat No. P7626)와 5㎍/㎖의 류펩틴(leupeptin, Sigma사, Cat No. L2884)을 함유한 추출완충액(0.5% triton X-100, 1mM Na₃VO₄ 등을 함유한 PBS용액)으로 용해시킨 후, 소니케이션(sonication)하여 DNA를 조각내었다. 단백질 양은 소혈청알부민(bovine serum albumin)을 표준으로 하여 Bio-Rad 사의 protein assay kit(Cat No. 500-0002)를 이용하여 측정하였다. 세포 총 단백 10 내지 50㎍을 0.1％ SDS를 함유한 8~12％(w/v) 폴리아크릴아마이드겔(polyacrylamide gel)에서 전기영동한 후에 겔에 존재하는 단백질을 일렉트로블로팅(electroblotting) 방법으로 니트로셀룰로오스(nitrocellulose, NC) 필터에 옮긴 후, 비특이적인 결합을 차단하기 위하여 니트로셀룰로오스 필터를 5％ 탈지분유를 함유한 tris-buffered saline-tween(TBS-tween, Sigma사) 용액에 넣고 실온에서 1시간 동안 반응시켰다. 필터를 타겟 단백질에 대한 항체를 함유한 TBS-tween 용액에 넣고 4℃에서 12시간 동안 방치한 후에 HRP(horseradish peroxidase, Sigma사, Cat No. P0889)로 표지된 2차 항체로 표지하였으며, ECL(Enhanced chemiluminescence, Thermo scientific 사, Cat No. 34080)을 이용하여 밴드를 측정하였다.

측정한 결과를 도 4에 나타내었다.

도 4에서 나타낸 바와 같이, BMMC 세포를 항-DNP-IgE로 감작시킨 후, DNP-HSA로 활성화하면 IĸBα가 분해되고, 핵 내의 NF-κB가 증가하는 것으로 확인되었다. 한편, 다브라페닙을 처리할 경우 항-DNP-IgE와 DNP-HSA 결합에 의한 IκBα의 분해가 억제되고, 핵 내의 NF-ĸB가 감소함을 확인하였다.

이와 같은 결과를 통하여, 다브라페닙은 NF-ĸB의 활성을 억제하여, 염증 유발성 사이토카인의 발현을 억제할 수 있으므로, 다브라페닙의 염증성 질환 개선 효과를 확인하였다.

실시예 5. 국소 피부 알레르기 반응에 대한 다브라페닙의 개선 효과 확인

항알레르기 효과를 갖는 약물을 개발할 때 많이 사용되는 수동형 국소 피부 알레르기 반응(passive cutaneous anaphylaxis, PCA)을 이용하여 다브라페닙의 피부 알레르기에 대한 개선 효과를 확인하였다. PCA는 IgE에 의해 매개되는 알레르기 반응으로, 항체를 국소 피부에 피내주사하고, 48시간 후 항원을 생쥐의 꼬리 정맥으로 투여하여 인위적으로 알레르기 반응을 일으키는 실험 방법이다. 이 경우, 항체 주사부위에서 항원-항체 반응이 일어나 그 주변에 존재하는 비만세포가 활성화되어 히스타민이 분비되고, 국소적으로 알레르기 반응이 일어난다.

따라서, PCA에 의해 알레르기 반응이 발생한 마우스의 귀에 다브라페닙을 도포한 후, 마우스의 발적 정도와 귀의 부종 정도를 관찰하였다(도 5A).

상기의 결과를 도 5에 나타내었다.

도 5에 나타낸 바와 같이, 다브라페닙의 농도 의존적으로 부종이 감소하고(도 5B), 발적 부위가 작아지는 것으로 확인되었다(도 5C).

이와 같은 결과를 통하여, 다브라페닙의 농도 의존적 국소 피부 알레르기 반응 억제 효과를 확인하였다.

실시예 6. 세포독성 실험

MTT(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide) 용액은 살아있는 세포에서 미토콘드리아의 디하이드로게나아제(dehydrogenases)에 의해서 포르마잔(formazan)을 형성하므로, 세포의 생존 여부의 확인에 사용할 수 있다.

다브라페닙의 세포독성을 확인하기 위하여 MTT 분석을 수행하였다.

구체적으로, 실시예 1-1에서 준비한 RBL-2H3 세포를 96 웰 플레이트에 3×10⁴세포/웰로 37℃에서 배양한 후, 다브라페닙을 각각 0.01 내지 100μM로 처리하고 24시간 동안 배양하였다. 24시간 후, 각 웰에 20㎕의 MTT 용액을 첨가하고 2시간 동안 추가로 배양한 후, 배양액을 제거하고 100㎕의 디메틸설폭사이드(dimethylsulfoxide)를 첨가한 후 570nm에서 흡광도를 측정하였다.

상기의 결과를 도 6에 나타내었다.

도 6에 나타낸 바와 같이, 다브라페닙은 10μM의 농도까지 세포독성을 나타내지 않아, 인체에 독성을 나타내지 않는 것으로 확인되었다.

이제까지 본 발명에 대하여 그 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

Claims

하기 화학식 1로 표시되는 다브라페닙(dabrafenib) 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 알레르기 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물:
[화학식 1]

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제 1 항에 있어서, 상기 알레르기 질환은 접촉성 피부염, 아토피 피부염, 천식, 알레르기성 결막염, 치주염, 비염, 중이염, 인후염, 편도염, 폐렴, 위궤양, 위염, 크론병, 대장염, 치질, 통풍, 강직성 척추염, 류마티스 열, 루푸스, 섬유근통(fibromyalgia), 건선관절염, 골관절염, 류마티스 관절염, 견관절주위염, 건염, 건초염, 건주위염, 근육염, 간염, 방광염, 신장염, 쇼그렌 증후군(sjogren's syndrome), 아나필락틱 쇼크(anaphylactic shock), 다발성 경화증, 급성 염증, 만성 염증질환, 두드러기, 고초열, 소화관 알레르기, 약제 알레르기, 식품 알레르기 및 화분증으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 질환인 것인 알레르기 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
제 1 항에 있어서, 상기 약학적 조성물은 총 용량 0.1㎎/㎏ 내지 10.0㎎/㎏으로 경피 투여되는 것인 알레르기 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
하기 화학식 1로 표시되는 다브라페닙을 유효성분으로 포함하는 알레르기성 피부염 예방 또는 개선용 화장료 조성물:
[화학식 1]

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제 4 항에 있어서, 상기 알레르기성 피부염은 접촉성 피부염 또는 아토피 피부염인 것인 알레르기성 피부염 예방 또는 개선용 화장료 조성물.
제 4 항에 있어서, 상기 화장료 조성물은 화장수, 젤, 로션, 연고, 크림, 팩, 에센스, 패치 또는 분무제로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 제형인 것인 알레르기성 피부염 예방 또는 개선용 화장료 조성물.