KR20200112256A - 전기방사 폴리카프로락톤/젤라틴/β-TCP 매트와 알지네이트/젤라틴 하이드로젤로 구성된 골 유도형 이중막 제조방법 - Google Patents

Abstract

전기 방사된 폴리카프로락톤/젤라틴/β-인삼3칼슘포스페이트 나노 분말이 1표면에 코팅된 알긴산 나트륨/젤라틴을 포함하는 이중층 막을 합성하고 골 재생 적용에 대해 평가하였다. 본 발명의 주요 목적은 뼈 재생을 유도할 뿐만 아니라 인장 강도가 충분히 강하고 뼈 결함으로 연조직 이동을 방지하는 유용한 복합 막을 제조하는 것입니다. 멤브레인에서 SA/겔 코팅 표면의 역할은 다공성 전기 방사 층이 뼈 세포 성장을 지원하고 뼈 재생 활동을 촉진하는 반면 상처 덮음을 향상시키고 연조직 이동을 방지하는 것입니다. MCT3T3 및 L929 세포의 MTT 분석 및 SEM 이미지에 의해 얻어진 세포 생존력 및 세포 증식력을 얻었다. 토끼 반경 뼈에 대한 이중층 막 처리가 있거나 없는 경우에 효과를 2 주 및 4 주에 비교 하였다. N-recon 소프트웨어에 의한 미세 CT 재구성 영상에 의해 관찰한 결과, 이중층 구조 막은 4 주 후에 양호한 기계적 강도 및 뼈 유도를 나타내었다.

Description

전기방사 폴리카프로락톤/젤라틴/β-TCP 매트와 알기네이트/젤라틴 하이드로겔을 함유하는 뼈 유도형 이중층 막의 제조방법{Method for manufacturing bone-induction bilayer membrane containing electrospun polycaprolactone/gelatin/β-TCP mat and alginate/gelatin hydrogel}

최근 수십년 동안, 유도된(guided) 뼈 재생(GBR) 막 개념을 이용하는 것은 임플란트 치료, 특히 치과에서 우수한 성능으로 인해 뼈 결함을 복구하기 위해 일반적으로 적용되어왔다. GBR 과정에서, 장벽 막의 역할은 뼈 재생을 위한 공간을 생성하고 뼈 이식물질을 그룹-형성하여 뼈 이식물질의 확산을 방지하는 것이다. 또한 연조직이 뼈 결함으로 이동하는 것을 방지하고 뼈 조직 재생 중에 결함 공간을 유지할 수 있다. 뼈 재생의 최고 성능에 도달하려면, 막은 생체 적합성; 공간 유지를 위한 장벽 특성; 상피세포 이동방지 특성; 및 뼈 재생의 리모델링 후 적절한 재흡수 시간을 가져야 한다.

알긴산나트륨(SA)은 1,4-연결된 β-D-만누론산(M-블록) 및 α-L-굴루론산 (G-블록)으로 구성된 선형의 비분지 다당류로, "계란-박스"-칼슘 연결된 접합부를 형성하는 양이온과 카르복실 작용기 사이의 이온 상호작용으로 인해 칼슘과 같은 2가 양이온의 존재 하에 안정한 겔을 형성한다. 알기네이트 겔은 생체 적합성 및 분해성 및 비독성을 갖는 것으로 알려져 있다. 많은 그룹의 연구자들이 피부조직 피복을 위해 알기네이트 겔을 사용하는 것으로 조사되었으며, 알기네이트 겔은 상처 부위를 덮는 우수한 피복 및 차단 능력을 나타냈지만 여전히 생체분자의 교환을 허용한다. 조직 결함에 대한 장벽으로서의 우수한 특성에 의해, 몇몇 연구 그룹이 초점을 맞추고 알기네이트 막이 유도 뼈 막으로서 사용될 가능성이 높다는 것을 알아냈다.

젤라틴(Gel)은 가축 소, 닭, 돼지 및 물고기와 같은 동물의 피부, 뼈 및 연결 조직에서 추출한 콜라겐의 부분 가수분해에 의해 생성된 펩티드와 단백질의 혼합물이다. 가수분해 동안, 개별 콜라겐 가닥들(strands) 사이의 자연 분자결합은 보다 쉽게 재배열되는 형태로 분해된다. 콜라겐은 생체적합성 및 생분해성에 대해 보고되었고 FDA 인증에 의해 승인되었으며, 젤라틴의 비용은 동일한 출처로부터 콜라겐보다 훨씬 저렴하였다. 폴리카프로락톤(PCL)은 전기방사된 재료에 사용된 가장 보편적인 합성 중합체이며 PCL 생체적합성과 낮은 생분해성이 다른 곳에서 보고되었다. 이 연구에서, PCL/Gel의 전기방사 용액 혼합물에서 젤라틴 함량을 증가시키면 막의 생분해 속도가 증가하고, 그들은 새로운 뼈 조직의 빠른 재생을 촉진하거나 지원하기 위해 마이크로-섬유 내부의 로딩된 인자를 빠르게 방출할 수 있다. SA/Gel 층은 검(gum) 또는 섬유모세포 조직의 이동을 크게 방지하는 장벽으로서 유망하였다. 또한, SA/Gel은 생분해된 물질로 보고되었으며, 2차 수술을 위해 제거될 필요는 없지만 여전히 이식된 막의 뼈 유도 능력을 보장한다.

본 발명의 목적은 임플란트의 장기 생존을 위해 충분한 기계적 강도뿐만 아니라 높은 다공성 전기방사 매트의 유용성을 포함하는 새로운 이중층 전기방사 PCL/Gel/β-TCP 및 Sa/Gel 하이드로겔을 제공하는데 있다. 한편, 본 발명은 막의 생분해성에 대한 젤라틴 농도와 외층 막의 기계적 강도 향상에 대한 SA 농도의 영향을 알아내기 위해 고안되었다.

본 발명은 유도 뼈 재생을 위해 새롭게 제조된 구조의 스캐폴드에 관한 것이며, 모든 재료 및 용액은 하기 설명에 의해 단계적으로 제조된다.

본 발명에 따른 유도 뼈 재생을 위한 새로운 하이브리드 시스템을 제조하는 방법에서는 β-TCP 분말을 운반하는 다공성 전기방사 막의 한 층과 평활 구조 하이드로겔의 한 층을 연결하는 이중층 스캐폴드를 제조한다. SA/Gel의 캐스트 층은 뼈 결함을 덮고 연조직의 이동을 방지하기 위한 것이다. β-TCP 나노-분말을 함유하는 전기방사 막은 혈액 흡수를 나타냈고 뼈 재생 과정 동안 뼈 세포 성장을 촉진시킨다. 이중층 막 시험의 생체내 마이크로-CT 결과, 막의 유도 능력을 나타냈다.

본 방법의 새로운 이중층 유도 뼈 막의 후속적인 형성은 첨부 도면을 참고로 충분히 설명될 것이다.
도 1은 전기방사 용액에서 젤라틴 비율을 증가시킴으로써 섬유의 균질성이 개선되고 젤라틴 양의 증가로 인해 섬유 직경이 감소한 것을 나타내는 SEM 이미지이다.
도 2는 전기방사 섬유 내부에 성공적으로 로드된 TCP 분말을 나타낸 것으로 전기방사 매트의 SEM 이미지 및 EDS 프로파일이다. 건조된 형태의 막과 물의 물 접촉각은 전기방사 막의 친수성이 높은 것으로 나타났다. XRD 결과는 TCP 분말과 동일한 주파수의 TCP 분말 및 막을 나타났으며, 어떠한 화학반응도 없이 용액에서 분말의 물리적 혼합에 대해 입증하였다.
도 3은 직접 접종방법의 MTT 분석에 의해 전조골세포(Preosteoblast cell) 생존력 및 섬유모세포 생존력을 입증하였으며, 결과는 전기방사 매트상에서 생존 가능한 세포의 80% 이상을 나타났으며, 샘플들 사이에서 세포 생존력은 거의 큰 차이가 없었다. 가장 많은 양의 젤라틴을 갖는 막 및 샘플 P1G4의 팽윤 비율에 대한 셀링(selling) 거동 그래프는 가장 높은 팽윤 비율에 도달한다.
도 4는 2층 막의 SEM 이미지를 나타낸다.
도 5는 A75G25 샘플에서 최고 인장강도를 나타내고, 평균 인장강도 값의 그래프 및 인장강도 모듈러스의 그래프를 나타낸다. 젤라틴의 첨가는 막의 유연성을 증가시켰지만 너무 높은 함량의 젤라틴 함량은 기계적 강도의 감소를 야기하였다. 물 접촉각 결과, 내층은 친수성이 높고 외층은 장벽 능력을 나타냈다.
도 6은 2개의 상이한 이중층 막 표면상에서 2개의 상이한 유형의 세포 (MC3T3-E1 및 L929)의 세포증식을 나타낸다.
도 7은 접종 5일 후 내층 막 상에 세포가 양호하게 접착되고 세포가 매우 증식된 것을 나타내는 것으로, 2개의 상이한 막의 표면상에 부착된 세포의 SEM 이미지이다. 제1 층은 세포의 낮은 부착을 보여주었다.
도 8은 막 샘플로 처리 및 처리되지 않은 뼈 결함의 마이크로-CT 재구성 이미지이다.
도 9는 습윤 조건에서 이중층 막의 봉합능력 시험을 예시한 것이다.
도 10은 멸균 후 샘플을 24웰 플레이트에 넣은 후 도시된 개략도이다.

전기방사를 위한 용매의 제조

PCL 및 젤라틴을 용해시키기 위한 용매는 포름산/아세트산의 혼합물(비율 1:9)이었고, 혼합물 산 모액을 자기 교반기로 실온에서 1시간 동안 잘 혼합 하였다. 병에 함유된 용매 혼합물은 증발을 방지하기 위해 파라핀 필름으로 조심스럽게 포장되었다.

전기방사 용액의 제조

용액이 균질해지고 PCL 과립이 남지 않을 때까지 실온에서 자기 교반기로 3-4시간 동안 교반함과 동시에 20ml의 용매에 3g의 PCL 과립을 첨가함으로써 15 % w/v PCl 용액 20ml를 제조하였다. 용액이 완전히 용해될 때까지 60℃에서 자기 교반기로 3-4시간 동안 교반함과 동시에 20ml의 용매에 3g의 Gel 분말을 첨가함으로써 15% w/v의 Gel 용액 20ml를 제조하였다.

15% w/v의 PCL과 15% w/v의 Gel을 자기 교반기로 3시간 동안 잘 혼합하고, 10%의 β-TCP 분말을 첨가한 후 3시간 동안 더 잘 교반하여 TCP 분말을 하기 표 1의 비율로 용액에 분산시켰다.

샘플	PCL 15%	Gel 15%	β-TCP 분말
P1G1	1	1	10%
P1G2	1	2	10%
P1G3	1	3	10%
P1G4	1	4	10%

(샘플 명 및 샘플 비)

전기방사된 막의 제조

P1G1, P1G2, P1G3 및 P1G4 용액을 10ml 루어-락 주사기[직경 14mm, 23-G 바늘(내경 0.23mm) 및 펌프속도 4 ml/시간]에 로딩하여 일련의 전기방사된 샘플을 제조하였다. 사용된 수집기 드럼은 직경 10cm, 길이 25cm, 및 회전속도 350 rpm이었다. 수집기 드럼의 바늘 끝은 10cm이다. 전기방사 전압은 DC 고전압 전원 공급기(휴대형 NNC-30 kv-2 mA, 한국)에 의해 직접 공급되었다. 10ml의 용액을 완성한 후, 전기방사 매트를 분리하고 흄후드(fume hood)에서 1일 동안 건조시켜 남아있는 모든 산성 용매를 증발시켰다.

전기방사된 매트의 특성

형태 및 β-TCP 분말 함량.

전기방사된 매트의 샘플을 샘플 홀더에 장착하고 스퍼터 코팅기 (Cressington Scientific Instruments, UK)에서 얇은 백금층으로 코팅하였다. 샘플의 마이크로 섬유 형태는 주사전자 현미경(SEM, JSM6701F, JEOL, 일본)으로 관찰되었다. SEM 스캐닝에서 칼슘 및 인산염 함량의 EDS 검출을 이용하여 TCP 분말 함량을 검출하였다. 섬유 직경은 "ImageJ"소프트웨어 측정 툴을 통해 섬유 직경의 30 영역을 무작위로 측정함으로써 결정되었다.

인산염 완충 식염수 용액의 팽윤 거동.

건조된 전기방사 매트의 샘플을 1 x 1cm 크기로 절단하고 1 ml의 PBS 용액 중에서 37℃ 인큐베이터에 침지시켰다. 샘플 중량의 변화는 일련의 기간에 기록되었다.

MC3T3-E1 전조골세포 및 L929 섬유모세포의 세포 생존력.

샘플을 직경 1cm의 둥근 형태로 절단하고 24웰 플레이트에 넣은 후 70% 에탄올 및 UV 광으로 3시간 동안 멸균하였다. 그 후, 샘플을 인큐베이터에서 3시간 배양하는 동안 세포 배양배지에 침지시켜 컨디셔닝하였다. 컨디셔닝 후, 오래된 배지를 제거하고 세포 접종 전에 1시간 동안 900μL의 새로운 배지 및 37℃ 인큐베이터로 교체하였다.

전조골세포(MC3T3-E1)는 세포 배양 플레이트의 70-80% 공간에 도달할 때까지 깨끗한 플레이트에서 10% 소 태아혈청 및 1% 페니실린-스트렙토마이신을 갖는 MEM 배양 배지에서 배양되었다. 그 후, 트립신에 의해 세포를 배양 플레이트로부터 분리한 후 배지로 재현탁하고, 100μL의 10⁴ 세포를 900μL의 배지에서 샘플에 접종하고 24시간 동안 37 ℃, 5% CO₂에서 배양하였다.

배양 플레이트의 70-80%에 도달할 때까지 섬유모세포(L929)를 깨끗한 플레이트에서 10% 말 혈청 및 1% 페니실린-스트렙토마이신을 함유하는 EMEM 배양 배지에서 배양하였다. 다음 단계는 MC3T3 세포 접종방법과 동일한 방법을 거쳤다. 배양 24시간 후, MTT 시약(3-[4,5-디메틸티아졸-2-일]-2,5-디페닐테트라 졸륨 브로마이드; Sigma-Aldrich, USA)을 9:1 비율로 샘플을 갖는 각 웰에 첨가하였다. 이어서 배양액을 37℃에서 4시간 동안 배양하였다. 용액을 제거하고 디메틸설폭사이드(DMSO; 삼천순약 주식회사, 한국)를 각 웰에 첨가하여 포르마잔염을 용해시켰다. 생성된 용액(100L)을 96-웰 플레이트로 옮기고 Infinite F50 마이크로 플레이트 리더(Tecan, Austria)를 사용하여 흡광도(595 nm)를 측정하였다.

캐스팅 용액의 제조

500ml의 증류수에 25g의 알긴산나트륨 분말을 첨가하여 고점도의 5% w/v 알긴산나트륨(SA)의 모액 500ml를 제조하고, 알긴산염 분말과 물의 혼합물을 2,000 rpm 및 실온에서 5시간 동안 고속 교반기에 의해 완전히 용해시켰다. 5% w/v 알긴산나트륨 수용액을 후에 사용하기 위해 4℃ 온도로 유지하였다. 60%로 가열된 자기 교반기에서 돼지 피부의 젤라틴 분말을 증류수에 용해시켜 5% w/v 젤라틴 용액(G)을 제조하였다.

이중층 막의 제조

변형 및 특성화 후, P1G4 전기방사 막은 생체 적합성 및 생분해성 샘플에 대한 최상의 후보로 선택되었다. P1G4 막의 10x20cm 시편을 150μm 깊이의 유리 몰드 바닥에 부착하였다. 5ml의 캐스팅 용액을 유리 몰드에 캐스팅하여 부어 직선형 플라스틱 바에 의해 평평한 표면을 형성하였다. 캐스팅 후, 막 및 캐스팅 용액을 갖는 몰드를 5% CaCl₂ 용액 탱크에 15분 동안 침지시켰다. 침지 후, SA/G 캐스팅 층을 CaCl₂에서 칼슘 이온과 가교결합 및 겔화시키고, SA/Gel 층으로 캐스팅한 막을 분리하고 증류수로 조심스럽게 수회 세척하여 남아있는 모든 염화물염을 제거하였다.

샘플	SA(%)	G(%)	전기방사 층
A100G0	100	0	P1G4
A75G25	75	25	P1G4
A50G50	50	50	P1G4
A25G75	25	75	P1G4

(캐스팅 층 함량 성분비율 및 제2 층 성분)

이중층 막의 특성

이중층 막의 봉합능력 시험

이중층 막의 샘플을 5x25mm 시편으로 절단하기 전에 생물학적 식염수 용액에 5분 동안 침지시키고 의료 봉합사 번호 6으로 샘플의 2팁을 묶었다. 로딩 셀의 속도는 1mm/분이었다. 봉합 능력을 측정하기 위한 샘플 제조 및 설정은 도 9에 도시되어 있다. 도 9는 습식 조건에서 이중층 막의 봉합능력 시험을 예시한다.

물 습윤 접촉각

물 접촉각 측정은 접촉각 측정 시스템(DSA 100, KRUSS GmbH) 장치를 사용하여 수행되었다. 물방울을 시스템의 바늘로부터 분배하여 2중층 막, 캐스팅 층 및 전기방사 층의 상이한 2표면 상에 적하하였다. 적하 직후, 소적 형상의 점진적인 변화를 CCD 비디오 카메라를 사용하여 기록하고 접촉각을 결정하기 위해 분석하였다.

이중층 막의 상이한 2층에서 전조골세포 MC3T3-E1 및 섬유모세포 L929의 증식

특성화 후, A75G25 이중층 막의 샘플은 최고의 기계적 특성을 가지므로, 이 샘플은 시험관내 및 생체내 연구를 위해 선택되었다.

MC3T3 및 L929 세포에 대해 상기 언급된 절차에 따라 세포 배양 및 제조를 수행하였다. 샘플을 둥근 모양(10x10mm)으로 절단하고 배양 배지로 컨디셔닝하는 단계 전에 하루 동안 70% 에탄올 및 UV 광으로 멸균하였다. 멸균 후 샘플을 24웰 플레이트에 넣고 도식도(schematic diagram)를 따라 수행하였다(도 9).

세포의 증식을 MTT 분석에 의해 1일, 3일 및 5일에 수집하고, SEM 이미지를 사용하여 5일째에 막 표면상에 부착된 세포의 세포형태를 검출하였다.

토끼 요골 결함에 생체내 이식

체중 2-2.5kg의 뉴질랜드 흰토끼 18마리를 구매하여 18개의 상이한 스테인리스강 주거 시설에 가두고, 한국 충청남도 순천향대학교 동물관리센터가 제공한 지침에 따라 승인된 음식과 물을 적절히 공급하였다. 수술하는 날 전에 환경을 조정하기 위한 적응기간이 주어졌으며, 모든 토끼는 수술을 위해 이소플루어런스(Isoflourance) 가스로 마취되었다. 토끼 앞발의 모발을 완전히 면도하고 70% 에탄올 및 포비돈 요오드로 멸균시켰다. 내부에 요골을 갖는 팔뚝을 절개하고 조직과 근육 층에서 요골 영역을 분리한 후, 조직의 탈수를 방지하기 위해서 연속적인 식염수 세척과 함께 트레핀 드릴을 사용하여 요골의 중간 위치에서 길이 8mm의 뼈를 제거하여 결함을 발생시켰다. 이중층 막은 뼈 이식편(Frabone-H, Inobone Company, Korea)에 의해 결함을 충전한 후 랩핑되었다. 피하조직을 닫고 그 위에 있는 피부를 다시 봉합하였다. 실험실 동물을 유지하고 임의로 먹이를 주었다. 이식 후 2주 및 4주에 토끼를 희생시키고 척골(Ulna) 및 요골을 포함한 앞발 뼈의 전부를 수집하였다. 조직을 보존하기 위해 샘플을 40 ℃의 4% 포름알데히드에 침지시켰다.

마이크로-컴퓨터 단층촬영(마이크로-CT) 평가

이식된 스캐폴드의 마이크로-CT 이미지는 Skyscan Desktop 마이크로-CT 1172 (Arrrselaar, 벨기에)를 사용하여 처리되었으며, 167 μA 전류의 60kV 소스 전압을 이용하여 X-선 방사선 사진을 얻었다. NRecon Software를 이용하여 스캔을 재구성하고 CTAn 소프트웨어로 분석하였다.

이하, 첨부된 도면을 참조하여 본 발명의 실시예를 상세히 설명한다.

[다공성 전기방사 막]

전기방사 PCL/Gel/β-TCP의 제조는 전기방사법을 이용하여 수행되었다. 도 1은 전기방사된 P1G1, P1G2, P1G3 및 P1G4 막의 사진을 나타낸다. 동일한 전기방사 조건에서 샘플을 제조했지만 미세구조는 상당히 달랐다. 모든 막 샘플의 섬유는 매끄럽고 균일한 형상을 나타내지만, 전기방사 용액에서 젤라틴 함량을 증가시키면 섬유 직경은 감소하였다.

도 2는 2가지 상이한 유형의 전기방사 막, PCL/Gel 단독 및 PCL/Gel/10% β-TCP 막의 EDS 프로파일을 나타낸다. 인산칼슘 분말이 없는 막의 EDS 프로파일은 C 및 O 피크만을 나타내었고, PCl/Gel/TCP의 전기방사된 막은 칼슘 및 인 원소의 피크를 갖는 EDS 프로파일을 나타냈다. EDS 스펙트럼 프로파일은 β-TCP 분말의 전기방사된 섬유로의 우수한 분산 및 전기방사된 막으로의 성공적인 분말 로딩에 대해 입증하였다. 건조된 상태에서 전기방사된 샘플 P1G1의 물 접촉각 및 물방울의 형상은 측정 1초마다 기록되고, 전기방사된 표면 상에 떨어뜨린 후 6초 후에 물방울이 거의 사라지고 최종적으로 접촉각은 거의 0이었다. 이 결과는 전기방사된 막의 높은 친수성 및 막의 강한 액체 흡수에 대해 입증하였다. 논리적으로, 젤라틴 함량의 증가는 PCL을 함유하는 전기방사 막의 친수성을 향상시킨다. 이 실험에서, PCL 함량이 가장 높은 샘플을 시험하였고 우수한 액체 흡수 능력을 보여주었으므로, 논리 연역에서 샘플 P1G4는 가장 높은 액체 흡수능력을 수행할 것이다.

도 3의 팽윤 거동은 1일 침지 후 PBS 용액에서 전기방사 막의 팽윤 비율을 보여주었다. 샘플 P1G4는 최대 10% 초기 중량까지의 최고 팽창률을 나타냈고, P1G1 샘플이 중량을 감소시키기 시작하는 시점은 PCL 비율이 더 높은 다른 샘플보다 더 일찍 나타났다.

24 시간 후에 전기방사된 막 샘플 상에 접종된 MC3T3 및 L929 세포의 생존력. 막에 접종된 세포의 80 % 이상이 생존 가능하였고, P1G1 대 P1G4의 세포 생존력 사이에 큰 차이가 없었다. 막 샘플에서 MC3T3의 생존력은 막 샘플 없이 배양된 세포 생존력과 거의 동일하였으며, 모든 막 샘플의 생체 적합성이 우수하다는 것을 나타냈다. L929 세포 생존율에 있어서, 막이 없는 세포 생존율 (100 %)과 비교하여 L929 세포의 감소가 기록되었지만, 샘플과 생존 가능한 80% 이상의 L929 세포 간에 큰 차이가 없었으며, 이 결과에 의해 전기방사된 막에서 젤라틴 함량의 증가는 세포 생존력에 영향을 미치지 않으며 모든 막 샘플이 우수한 생체 적합성을 나타냈다는 결론을 내릴 수 있다.

[이중층 막]

도 4 및 도 5는 이중층 막의 상이한 2층의 SEM 형태와 습윤 조건에서 제1 층 및 제2 층의 액체 흡수능력을 나타낸다. SEM 이미지는 상이한 형태를 갖는 막을 나타내고, 제1 층은 조밀한 구조 및 소수성을 나타내고, 그리고 제2 층은 미세섬유 구조 및 고도의 친수성을 나타냈다. 그래프 2는 막의 제1 및 제2 층의 접촉각 값을 보여주었다. 제1 층은 접촉각이 >90^o이고 소수성 표면으로 표시될 수 있으며, 제2 층은 접촉각이 <70^o로 기록되어 친수성 표면으로 표시될 수 있다.

이중층 막의 기계적 강도, 봉합 지점에서의 막의 인장강도를 풀아웃(pullout) 인장강도 시험을 통해 측정하고 이중층 막의 봉합 능력을 보여주었다. A75G25로 캐스팅된 샘플의 막은 2.95±0.15 MPa에서 가장 높은 인장강도를 나타냈다. 도 8은 막의 상이한 2층에서 MC3T3-E1 세포의 증식을 나타내며, 대조군 세포와 이중층 막의 제2 층에서의 세포증식 사이에 큰 차이가 없었으며, 세포부착과 세포증식에 대한 높은 지원이 입증되었다. 전조골세포는 새로운 뼈 형성에 기여하고 뼈 재생을 촉진하는 가장 중요한 세포주이었다. 막의 제2 층은 뼈 조직과 접촉하는 층이며 내부 뼈 환경과 상호작용 수 있으며, 전조골세포의 세포부착 및 증식에 대한 제2 층 지원의 결과는 막의 효과 측면의 능력으로부터 강하게 유도된 뼈 재생에 유망할 수 있다. 제1 층이 MC3T3 세포의 낮은 증식을 보여주는 이외에. 생체내 시험에서 뼈 재형성을 유도하는 장벽 다이어프램으로서의 장벽 특성 및 예상된 결과를 입증하였다. 배양 1일째에 대조군과 세포밀도의 차이가 크게 다르지 않아, 2개 층 모두가 높은 세포 생체적합성을 나타냈다.

L929 세포의 결과는 2개의 상이한 막 층에서 MC3T3 세포 증식과 동일한 거동을 보여주었다. 생체적응성이 높고 적응력이 뛰어나며 호스트 몸체의 연조직 측면이 있는 막과 양립할 수 있음이 입증되었다. L929 세포의 느린 성장은 막의 제1 층의 장벽 능력에 대해 입증되었으며, 이중층 막은 연조직의 이동을 방지하고 뼈 결함 측면으로부터 새로운 뼈 형성을 위한 이상적인 공간을 형성하기 위한 커버 층으로서 사용될 수 있다.

5일 후 이중층 막의 2개의 상이한 측면상에 부착된 MC3T3 세포의 SEM 이미지는, 제1 층이 세포 부착을 강력하게 방지하는 것 외에도, 세포 막 확산 및 제2 층에서의 성장을 위한 우수한 지원에 대해 입증하였다. 제2 층은 증식된 MC3T3 세포의 고밀도를 나타냈고, 세포막은 양호하게 확산되었으며 제2 층 막 표면을 완전히 덮었다. 제1 층은 세포부착을 거의 감지하지 못하였다.

뼈 이식편 및 이중층 막으로 처리되거나 처리되지 않은 뼈 결함의 마이크로-CT 이미지는 막의 그룹화 및 유도 뼈 재생능력을 입증하였다.

Claims (6)

1. 하기 단계를 포함하고 전기방사법에 의해 PCL/Gel에 로딩된 b-TCP 나노-분말을 포함하는 고 다공성 전기방사 스캐폴드의 제조방법:
   용액이 균질해지고 PCL 과립이 남지 않을 때까지 실온에서 자기 교반기로 3-4시간 동안 교반함과 동시에 20ml의 용매에 3g의 PCL 과립을 첨가함으로써 15 % w/v PCl 용액 20ml를 제조한 후, 용액이 완전히 용해될 때까지 60℃에서 자기 교반기로 3-4시간 동안 교반함과 동시에 20ml의 용매에 3g의 Gel 분말을 첨가함으로써 15 %w/v Gel 용액 20ml를 제조하는 단계;
   15% w/v의 PCL과 15% w/v의 Gel을 자기 교반기로 3시간 동안 잘 혼합하고, 10%의 β-TCP 분말을 첨가한 후 3시간 동안 더 잘 교반하여 TCP 분말을 용액에 분산시키는 단계; 및
   P1G1, P1G2, P1G3 및 P1G4 용액을 10ml 루어-락 주사기[직경 14mm, 23-G 바늘(내경 0.23mm) 및 펌프속도 4 ml/시간]에 로딩하여 일련의 전기방사된 샘플을 DC 고전압 전원 공급기(휴대형 NNC-30 kv-2 mA, 한국)에 의해 직접 공급되는 전기방사 전압에서 직경 10cm, 길이 25cm, 바늘 선단길이 10cm 및 회전속도 350 rpm의 수집기 드럼에 의해 제조하는 단계.
2. 제 1항에 있어서,
   기판으로서 PCL/Gel/b-TCP 다공성 막은 이중층 유도 뼈 막을 제조하기 위한 캐스팅법을 이용하여 얇은 층의 SA/Gel에 의해 코팅되는 것을 특징으로 하는 고 다공성 전기방사 스캐폴드의 제조방법.
3. 제 2항에 있어서,
   CaCl₂를 사용하여 이중층 막을 15분 동안 가교시키고 증류수로 조심스럽게 세척하고 에탄올 70으로 멸균하고 실온에서 건조하는 것을 특징으로 하는 고 다공성 전기방사 스캐폴드의 제조방법.
4. 제 3항에 있어서,
   이중층 유도 뼈 막이 앵글 머신 및 인장강도 머신과 접촉하여 습윤 각도 및 기계적 시험에 사용되는 것을 특징으로 하는 고 다공성 전기방사 스캐폴드의 제조방법.
5. 제 3항에 있어서,
   이중층 지혈 스캐폴드가 주사전자 현미경 및 MTT 분석에 의해 관찰된 세포 생존력 및 세포증식에 사용되는 것을 특징으로 하는 고 다공성 전기방사 스캐폴드의 제조방법.
6. 제 3항에 있어서,
   이중층 유도 뼈 막이 토끼 요골 결함의 생체내 연구에 사용되는 것을 특징으로 하는 고 다공성 전기방사 스캐폴드의 제조방법.

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