KR20200107967A - 가시적인 연속 공간 유도 진화 방법 - Google Patents
가시적인 연속 공간 유도 진화 방법 Download PDFInfo
- Publication number
- KR20200107967A KR20200107967A KR1020207020013A KR20207020013A KR20200107967A KR 20200107967 A KR20200107967 A KR 20200107967A KR 1020207020013 A KR1020207020013 A KR 1020207020013A KR 20207020013 A KR20207020013 A KR 20207020013A KR 20200107967 A KR20200107967 A KR 20200107967A
- Authority
- KR
- South Korea
- Prior art keywords
- evolution
- gene
- bacteriophage
- host
- plasmid
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 66
- 230000000007 visual effect Effects 0.000 title claims description 7
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 198
- 230000012010 growth Effects 0.000 claims abstract description 22
- 238000013508 migration Methods 0.000 claims abstract description 21
- 230000005012 migration Effects 0.000 claims abstract description 21
- 230000008569 process Effects 0.000 claims abstract description 19
- 239000007787 solid Substances 0.000 claims abstract description 19
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 claims abstract description 18
- 238000009826 distribution Methods 0.000 claims abstract description 7
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 claims description 195
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims description 183
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 134
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 claims description 54
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 51
- 102100025721 Cytosolic carboxypeptidase 2 Human genes 0.000 claims description 41
- 101000932634 Homo sapiens Cytosolic carboxypeptidase 2 Proteins 0.000 claims description 41
- 101001033011 Mus musculus Granzyme C Proteins 0.000 claims description 41
- 230000035772 mutation Effects 0.000 claims description 39
- 101710155594 Coiled-coil domain-containing protein 115 Proteins 0.000 claims description 33
- 102100035027 Cytosolic carboxypeptidase 1 Human genes 0.000 claims description 33
- 102100025698 Cytosolic carboxypeptidase 4 Human genes 0.000 claims description 31
- 101000932590 Homo sapiens Cytosolic carboxypeptidase 4 Proteins 0.000 claims description 31
- 101001033003 Mus musculus Granzyme F Proteins 0.000 claims description 31
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 claims description 31
- 102100025707 Cytosolic carboxypeptidase 3 Human genes 0.000 claims description 29
- 101000932588 Homo sapiens Cytosolic carboxypeptidase 3 Proteins 0.000 claims description 29
- 101001033009 Mus musculus Granzyme E Proteins 0.000 claims description 29
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 claims description 22
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 claims description 16
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims description 14
- 101710137500 T7 RNA polymerase Proteins 0.000 claims description 11
- 230000002950 deficient Effects 0.000 claims description 9
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 8
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims description 7
- 230000003071 parasitic effect Effects 0.000 claims description 7
- 230000008093 supporting effect Effects 0.000 claims description 7
- OIRDTQYFTABQOQ-KQYNXXCUSA-N adenosine Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O OIRDTQYFTABQOQ-KQYNXXCUSA-N 0.000 claims description 6
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 6
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 claims description 6
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 6
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 6
- 101150052580 dam gene Proteins 0.000 claims description 5
- 101150093914 seqA gene Proteins 0.000 claims description 5
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 claims description 5
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 claims description 5
- 241000700605 Viruses Species 0.000 claims description 4
- 241000702199 Bacillus phage PBS2 Species 0.000 claims description 3
- 108010080611 Cytosine Deaminase Proteins 0.000 claims description 3
- 101001001786 Homo sapiens Glutamyl-tRNA(Gln) amidotransferase subunit C, mitochondrial Proteins 0.000 claims description 3
- 208000037581 Persistent Infection Diseases 0.000 claims description 3
- 102000006943 Uracil-DNA Glycosidase Human genes 0.000 claims description 3
- 108010072685 Uracil-DNA Glycosidase Proteins 0.000 claims description 3
- 230000004913 activation Effects 0.000 claims description 3
- 230000033001 locomotion Effects 0.000 claims description 3
- 101150056718 mprA gene Proteins 0.000 claims description 3
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 claims description 3
- 241000606161 Chlamydia Species 0.000 claims description 2
- 241000204031 Mycoplasma Species 0.000 claims description 2
- 241000606860 Pasteurella Species 0.000 claims description 2
- 241000589516 Pseudomonas Species 0.000 claims description 2
- 241000607142 Salmonella Species 0.000 claims description 2
- 241000607768 Shigella Species 0.000 claims description 2
- 241000191967 Staphylococcus aureus Species 0.000 claims description 2
- 108700025695 Suppressor Genes Proteins 0.000 claims description 2
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 claims description 2
- 238000001802 infusion Methods 0.000 claims description 2
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 claims description 2
- 241000701959 Escherichia virus Lambda Species 0.000 claims 1
- 102100036263 Glutamyl-tRNA(Gln) amidotransferase subunit C, mitochondrial Human genes 0.000 claims 1
- 102000023732 binding proteins Human genes 0.000 claims 1
- 108091008324 binding proteins Proteins 0.000 claims 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 abstract description 24
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 65
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 48
- 101000960626 Homo sapiens Mitochondrial inner membrane protease subunit 2 Proteins 0.000 description 27
- 101000828788 Homo sapiens Signal peptide peptidase-like 3 Proteins 0.000 description 27
- 102100023501 Signal peptide peptidase-like 3 Human genes 0.000 description 27
- 101000599778 Homo sapiens Insulin-like growth factor 2 mRNA-binding protein 1 Proteins 0.000 description 24
- 101000988591 Homo sapiens Minor histocompatibility antigen H13 Proteins 0.000 description 24
- 102100029083 Minor histocompatibility antigen H13 Human genes 0.000 description 24
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 19
- 101000599782 Homo sapiens Insulin-like growth factor 2 mRNA-binding protein 3 Proteins 0.000 description 16
- 101000702394 Homo sapiens Signal peptide peptidase-like 2A Proteins 0.000 description 16
- 101000960621 Homo sapiens U3 small nucleolar ribonucleoprotein protein IMP3 Proteins 0.000 description 16
- 102100030403 Signal peptide peptidase-like 2A Human genes 0.000 description 16
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 description 16
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 16
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 16
- 235000013902 inosinic acid Nutrition 0.000 description 16
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 description 16
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 description 16
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 description 16
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 description 16
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 15
- 229920002451 polyvinyl alcohol Polymers 0.000 description 15
- 239000000047 product Substances 0.000 description 14
- 229960000268 spectinomycin Drugs 0.000 description 12
- UNFWWIHTNXNPBV-WXKVUWSESA-N spectinomycin Chemical compound O([C@@H]1[C@@H](NC)[C@@H](O)[C@H]([C@@H]([C@H]1O1)O)NC)[C@]2(O)[C@H]1O[C@H](C)CC2=O UNFWWIHTNXNPBV-WXKVUWSESA-N 0.000 description 12
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 11
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 11
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 10
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 10
- FPPNZSSZRUTDAP-UWFZAAFLSA-N carbenicillin Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)C(C(O)=O)C1=CC=CC=C1 FPPNZSSZRUTDAP-UWFZAAFLSA-N 0.000 description 10
- 229960003669 carbenicillin Drugs 0.000 description 10
- 229960005091 chloramphenicol Drugs 0.000 description 10
- WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N chloramphenicol Chemical compound ClC(Cl)C(=O)N[C@H](CO)[C@H](O)C1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N 0.000 description 10
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 10
- ZFXYFBGIUFBOJW-UHFFFAOYSA-N theophylline Chemical compound O=C1N(C)C(=O)N(C)C2=C1NC=N2 ZFXYFBGIUFBOJW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 241001524679 Escherichia virus M13 Species 0.000 description 9
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 8
- 230000000721 bacterilogical effect Effects 0.000 description 8
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 8
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 8
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 7
- 108010028263 bacteriophage T3 RNA polymerase Proteins 0.000 description 7
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 5
- 230000007505 plaque formation Effects 0.000 description 5
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 description 5
- 229960000278 theophylline Drugs 0.000 description 5
- 241001596967 Escherichia coli M15 Species 0.000 description 4
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 4
- 108700008625 Reporter Genes Proteins 0.000 description 4
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 description 4
- 108091006047 fluorescent proteins Proteins 0.000 description 4
- 230000001976 improved effect Effects 0.000 description 4
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 4
- 231100000219 mutagenic Toxicity 0.000 description 4
- 230000003505 mutagenic effect Effects 0.000 description 4
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 4
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 4
- 241000701867 Enterobacteria phage T7 Species 0.000 description 3
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 3
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 3
- 241000660147 Escherichia coli str. K-12 substr. MG1655 Species 0.000 description 3
- 101710196208 Fibrinolytic enzyme Proteins 0.000 description 3
- 108010062010 N-Acetylmuramoyl-L-alanine Amidase Proteins 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N arabinose Natural products OCC(O)C(O)C(O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N beta-D-Pyranose-Lyxose Natural products OC1COC(O)C(O)C1O SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 3
- 230000008859 change Effects 0.000 description 3
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 3
- 230000006735 deficit Effects 0.000 description 3
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 3
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 3
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 3
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 3
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 3
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 3
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 3
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 3
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 3
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 3
- 241000894007 species Species 0.000 description 3
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 3
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 3
- 230000004543 DNA replication Effects 0.000 description 2
- 108020004422 Riboswitch Proteins 0.000 description 2
- 241000352457 Shivajiella indica Species 0.000 description 2
- PYMYPHUHKUWMLA-WDCZJNDASA-N arabinose Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-WDCZJNDASA-N 0.000 description 2
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 2
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 2
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 230000007849 functional defect Effects 0.000 description 2
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 2
- 238000012806 monitoring device Methods 0.000 description 2
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 2
- 230000009684 proliferation defect Effects 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 2
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 1
- 108010032595 Antibody Binding Sites Proteins 0.000 description 1
- 208000035143 Bacterial infection Diseases 0.000 description 1
- -1 CCP2.1 Proteins 0.000 description 1
- 108090000626 DNA-directed RNA polymerases Proteins 0.000 description 1
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 description 1
- 102000009123 Fibrin Human genes 0.000 description 1
- 108010073385 Fibrin Proteins 0.000 description 1
- BWGVNKXGVNDBDI-UHFFFAOYSA-N Fibrin monomer Chemical compound CNC(=O)CNC(=O)CN BWGVNKXGVNDBDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 1
- 102000016943 Muramidase Human genes 0.000 description 1
- 108010014251 Muramidase Proteins 0.000 description 1
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 description 1
- 102000040945 Transcription factor Human genes 0.000 description 1
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 1
- 208000022362 bacterial infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 230000031018 biological processes and functions Effects 0.000 description 1
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 238000000354 decomposition reaction Methods 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 239000007857 degradation product Substances 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 238000009509 drug development Methods 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- 230000007515 enzymatic degradation Effects 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 229950003499 fibrin Drugs 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 210000003495 flagella Anatomy 0.000 description 1
- 102000034287 fluorescent proteins Human genes 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 239000000411 inducer Substances 0.000 description 1
- 238000009776 industrial production Methods 0.000 description 1
- 101150109249 lacI gene Proteins 0.000 description 1
- 101150066555 lacZ gene Proteins 0.000 description 1
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 1
- 229960000274 lysozyme Drugs 0.000 description 1
- 239000004325 lysozyme Substances 0.000 description 1
- 235000010335 lysozyme Nutrition 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 238000002715 modification method Methods 0.000 description 1
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 1
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 1
- 238000007127 saponification reaction Methods 0.000 description 1
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 101150061166 tetR gene Proteins 0.000 description 1
- 238000012800 visualization Methods 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C40—COMBINATORIAL TECHNOLOGY
- C40B—COMBINATORIAL CHEMISTRY; LIBRARIES, e.g. CHEMICAL LIBRARIES
- C40B30/00—Methods of screening libraries
- C40B30/06—Methods of screening libraries by measuring effects on living organisms, tissues or cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
- C12N15/1034—Isolating an individual clone by screening libraries
- C12N15/1058—Directional evolution of libraries, e.g. evolution of libraries is achieved by mutagenesis and screening or selection of mixed population of organisms
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/10—Transferases (2.)
- C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
- C12N9/1241—Nucleotidyltransferases (2.7.7)
- C12N9/1247—DNA-directed RNA polymerase (2.7.7.6)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C40—COMBINATORIAL TECHNOLOGY
- C40B—COMBINATORIAL CHEMISTRY; LIBRARIES, e.g. CHEMICAL LIBRARIES
- C40B50/00—Methods of creating libraries, e.g. combinatorial synthesis
- C40B50/06—Biochemical methods, e.g. using enzymes or whole viable microorganisms
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C40—COMBINATORIAL TECHNOLOGY
- C40B—COMBINATORIAL CHEMISTRY; LIBRARIES, e.g. CHEMICAL LIBRARIES
- C40B60/00—Apparatus specially adapted for use in combinatorial chemistry or with libraries
- C40B60/08—Integrated apparatus specially adapted for both creating and screening libraries
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2513/00—3D culture
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2795/00—Bacteriophages
- C12N2795/00011—Details
- C12N2795/10011—Details dsDNA Bacteriophages
- C12N2795/10031—Uses of virus other than therapeutic or vaccine, e.g. disinfectant
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2795/00—Bacteriophages
- C12N2795/00011—Details
- C12N2795/14011—Details ssDNA Bacteriophages
- C12N2795/14111—Inoviridae
- C12N2795/14131—Uses of virus other than therapeutic or vaccine, e.g. disinfectant
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Virology (AREA)
- Ecology (AREA)
- Bioinformatics & Computational Biology (AREA)
- Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
본 발명은 유도 진화 선별 분야에 속하고, 특히는 가시적인 연속 공간 유도 진화 방법에 관한 것이며, 숙주가 고체 배양 공간에서 성장과 이동을 하는 바, 상기 숙주가 외래의 진화 대기 목표 유전자를 휴대하고 있으며, 상기 숙주 자체에는 목표 유전자 진화를 보조하는 유전자 요소가 포함되고, 상기 목표 유전자는 상기 숙주의 성장과 이동에 관련되며; 상기 숙주의 성장과 이동 과정을 통하여, 상기 고체 배양 공간에서 서로 다른 공간 분포 형태를 형성하고 선별을 하는 것에 의하여 진화 생성물을 취득한다.
Description
[관련 출원의 교차 인용]
본 출원은 2017년 12월 27일에 중국 특허청에 제출하고 출원번호가 201711446362.3이며, 발명의 명칭이 "가시적인 연속 공간 유도 진화 방법"인 중국 특허 출원의 우선권을 주장하며, 이의 전체 내용은 인용에 의하여 본 출원에 편입된다.
[기술분야]
본 발명은 유도 진화 선별의 기술분야에 속하고, 구체적으로 가시적인 연속 공간 유도 진화 방법에 관한 것이다.
유도 진화(실험실 진화라고도 칭함)는 막강한 기술적 방법으로서 생물 진화 과정을 제어하는 것을 통하여, 지정된 기능이 구비된 생물 분자를 생성할 수 있다. 생성된 생물 분자는 이미 산업 생산, 생물 공정, 약품 개발 등 많은 분야에 널리 사용되고 있다. 하버드 대학 David R Liu 실험실에서는 박테리오파지 성장을 기반으로 하는 연속 진화 시스템(박테리오파지 보조 지속 진화, PACE)을 개발하였다. 이 시스템은 주요하게 LWS, CCP, IMP 세 개의 모듈을 포함한다. 박테리오파지 모듈(LWS): 박테리오파지 M13 유전자 중에서 숙주균을 패키징 및 감염시키는데 필요한 gIII 유전자가 절제되고 진화 대기 생물 분자의 유전자가 삽입된다. 박테리오파지는 gIll가 결여된 후, 숙주를 감염시켜 후대 박테리오파지를 생성할 수 없다. 돌연변이 유발 모듈(IMP): 아라비노오스를 유도 물질로 하여 DNAQ926, dam 및 seqA의 발현을 유도하는 것에 의하여 DNA 복제 과정에 중합효소가 도입한 에러 염기가 절제되지 못하도록 하고, 돌연변이율을 향상시키고, 아라비노오스가 유도한 IMP는 박테리오파지의 돌연변이 속도를 몇 백배 향상시킬 수 있다. 보조 모듈(CCP): 박테리오파지가 숙주 세포를 감염시켜 번식을 진행하는데 필요한 gIII 유전자가 포함되어 있고, CCP 위의 gIII의 발현과 LWS 위의 진화 대기 목표 유전자의 생물 활성을 한데 묶는 것을 통하여(예를 들면, 소정의 RNA 중합효소가 특정 방향으로 진화되게 하려면, 진화 방향과 일치한 프로모터를 이용하여 gIII의 발현을 제어하는 것), 각 돌연변이 LWS가 감염 활성을 갖는 후대 박테리오파지 LWS를 생성할 수 있을지 여부를 결정한다.
진화 과정에서, 진화 대기 야생형 목표 유전자를 휴대한 박테리오파지가 숙주 세포를 감염시킬 때, 그 유전 물질 야생형 LWS를 숙주균에 주입하고, 숙주균 내의 복제 시스템을 이용하여 유전 물질의 복제를 진행한다. 이와 동시에, 아라비노오스의 유도하에서, 숙주 세포 내의 IMP 위의 DNAQ926, dam 및 seqA의 발현에 의하여 LWS에 돌연변이가 발생하도록 한다. 만일 LWS가 취득한 돌연변이(즉, LWS 위의 목표 유전자의 돌연변이)가 gIII 단백질의 발현을 프로모트할 수 있다면, 감염성이 있는 후대 박테리오파지를 생성할 수 있다. 새로 생성된 이 후대 박테리오파지 돌연변이체 LWSe가 숙주균 밖으로 분비되어, 새로운 숙주균을 감염시켜, 다음 라운드의 복제 증식을 진행한다. 이로써 gIII 발현을 프로모트할 수 있는 LWSe 돌연변이체는 끊임없이 증식할 수 있으므로 자체의 수량이 증가되고, 야생형의 LWS와 gIII 발현을 프로모트할 수 없는 돌연변이 LWS는 후대 박테리오파지를 분비하여 증식을 진행할 수 없으므로 그 수량이 증가되지 않는다. 이때 만일 일정한 속도로 진화풀에 새로운 숙주균 배양물을 끊임없이 첨가하고 또한 낡은 배양물을 배출시키면, gIII 발현을 프로모트할 수 없거나 또는 발현 능력이 낮은 야생형 LWS 및 그 돌연변이체는 아주 빠르게 용리되고, gIII 발현을 고효율로 프로모트할 수 있는 LWSe 돌연변이체는 최종적으로 남겨지게 된다.
상기 시스템은 부피가 비교적 크고, 고감도의 실시간 모니터링 시스템이 구비된 일련의 자동 공급-배치 배양 장치를 통하여 공급-배치 배양을 끊임없이 진행하여야 한다. 서로 다른 진화물이 혼합된 후 한 배양 탱크 내에 함께 희석되므로 직접 탐지와 분리를 진행하기 어렵다. 시스템은 시약의 소모가 크고, 배양 장치 제조 원가가 비교적 높으며, 진화 조작도 비교적 복잡하다. 아울러 상기 시스템은 한 번에 한 목표 유전자의 진화밖에 진행할 수 없으므로, 효율이 비교적 낮다.
이를 감안하여, 본 발명을 고안하였다.
종래 방법의 샘플을 탐지 및 분리하기 어렵고 효율이 낮으며, 원가가 비교적 높고 진화 조작이 비교적 복잡한 문제를 해결하기 위하여, 본 발명에서는 가시적인 연속 공간 유도 진화 방법을 제공한다. 이 방법을 사용하는 경우, 고체 배양 공간, 예를 들면 고체 배양 플레이트 표면 위에서 직접 진행할 수 있고, 액체 공급-배치 배양 장치를 준비할 필요가 없고, 진화 중에 형성된 감염 얼룩의 공간의 형태와 분포를 육안으로 관찰하는 것에 의하여 진화 효과를 파악할 수 있으므로, 실시간 모니터링 장치를 준비할 필요가 없고, 조작이 간단하고 효율이 높으며, 한 번에 여러 그룹의 진화 실험을 할 수 있다.
본 발명의 상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명에서 하기 기술방안을 사용한다.
가시적인 연속 공간 유도 진화 방법에 있어서, 숙주가 고체 배양 공간에서 성장과 이동을 하는 바, 상기 숙주가 외래의 진화 대기 목표 유전자를 휴대하고 있으며, 상기 숙주 자체에는 목표 유전자의 진화를 보조하는 유전자 요소가 포함되고, 상기 목표 유전자는 상기 숙주의 성장 이동에 관련되며;
상기 숙주의 성장 이동 과정을 통하여, 상기 고체 배양 공간에서 서로 다른 공간 분포 형태를 형성하고, 선별을 하는 것에 의하여 진화 생성물을 취득한다.
본 발명에서 제공하는 가시적인 연속 공간 유도 진화 방법(Spatial Phage-Assisted Continuous Evolution, SPACE)에 있어서, 상기 시스템에는 진화 대기 목표 유전자와 숙주가 포함되고, 숙주에는 목표 유전자의 진화를 보조하는 유전자 요소가 포함되며, 목표 유전자는 숙주에 관련된다. 목표 유전자는 숙주의 고체 배양 공간에서의 성장 이동에 의하여 진화하고, 진화 후 육안으로 관찰할 수 있는 서로 다른 공간 분포 형태를 형성하며, 상기 상태를 통하여 진화 생성물에 대하여 선택을 한다.
전반적인 진화와 선별 과정은 2차원 평면 또는 3차원 공간에서 확장되고, 서로 다른 진화 생성물은 평면의 서로 다른 구역에 분포되고, 서로 혼합되지 않는다. 각 생성물은 그 활성이 다름에 따라, 국소에 육안으로 관찰할 수 있는 서로 다른 공간 분포 형태 이미지가 형성된다. 진화의 연속적인 진행에 따라, 이 이미지는 끊임없이 확대된다. 진화 생성물이 나타나기만 하면 소정의 위치에 이미지를 직접 형성하고, 생성물의 양이 아주 적더라도 그 이미지는 희석되거나 가려지지 않는다. 이미지의 상태에 의하여 필요한 진화 생성물을 직접 분리 선택할 수 있다. 시스템은 조작이 간단하고 원가가 낮으며, 특별한 기기 장치를 사용할 필요가 없고, 한 사람이 한 번에 복수 그룹의 진화 실험을 진행할 수 있어, 고효율적으로 목표 유전자의 유도 진화를 진행할 수 있다.
상기 목표 유전자는 상기 숙주 유전자 그룹 또는 플라스미드 또는 상기 숙주의 소정의 기생 생물 중에 위치한다. 목표 유전자는 유전자 재결합을 통하여 숙주 유전자 그룹에 삽입될 수 있고, 숙주에 플라스미드를 전사시키거나 또는 기생 생물이 숙주에 침입하면, 숙주에 진화 대기 목표 유전자가 포함되는 것을 구현할 수 있다.
상기 기생 생물에는 박테리오파지, 시아노파지, 동식물 바이러스, 진균 바이러스, 마이코플라스마, 클라미디아와, 세균 중의 임의의 한 가지가 포함된다.
상기 기생 생물은 박테리오파지이며;
상기 숙주는,
상기 박테리오파지의 비결손체의 자연 숙주균;
상기 박테리오파지의 비결손체의 자연 숙주균이 유전자 조작을 거친 후 취득한 균주;
유전자 조작을 거친 후 취득한 감수성의 비자연 숙주균 중의 임의의 한가지이다.
상기 숙주에는 대장간균, 파스퇴렐라균, 이질균, 슈도모나스균, 산토모나스균, 살모넬라균, 황색포도상구균 및 유전자 조작으로 감수성을 개변시킨 조작 균주가 포함된다.
바람직하게는, 상기 숙주는 F인자를 휴대한 대장간균이며;
상기 박테리오파지는 용원성 파지, 독성 파지 또는 만성 감염 파지이다.
상기 박테리오파지에는 사상 파지, T4 파지, T7 파지, λ 파지, P1 파지, P2 파지, P22 파지, φX174 파지, SP6 파지가 포함된다.
바람직하게는, 상기 사상 파지에는 M13 사상 파지, f1 사상 파지가 포함된다.
본 발명의 바람직한 실시예에 있어서, 상기 박테리오파지는 M13 파지이고, M13 파지 중의 숙주균의 패키징 및 감염에 사용되는 gIII 유전자는 절제되고; 목표 유전자 진화를 보조하는 유전자 요소, 예를 들면 보조 플라스미드에 상기 gIII 유전자가 포함된다. 박테리오파지는 정상적으로 숙주균에 침입하고, DNA 복제를 진행할 수 있다. 하지만 관련 보조 플라스미드가 존재하지 않는 상황에서, 감염 활성이 있는 후대를 패키징할 수 없다.
상기 목표 유전자는 한 가지 또는 여러 가지 단백질의 암호화 유전자와 비암호화 유전자의 조합이다.
상기 목표 유전자는 T7 RNA 중합효소 유전자, 단백질 분해효소 유전자, 섬유소 분해 효소 유전자, 형광 단백질 유전자, 정족수 감지 유전자 중의 한 가지 또는 여러 가지로부터 선택된다.
상기 목표 유전자 진화를 보조하는 유전자 요소는 돌연변이를 유도하는 플라스미드이고, 상기 돌연변이를 유도하는 플라스미드는 진화 전후의 목표 유전자를 통하여 발현을 프로모트하거나 발현을 유도한다.
바람직하게는, 상기 돌연변이를 유도하는 플라스미드에는 돌연변이 유발 유전자가 포함되고, 상기 돌연변이 유발 유전자는, 제 12와 14 자리 아미노산이 Ala로 돌변하는 DNAQ 유전자 돌연변이체 DNAQ926 유전자, 데옥시아데노신 메틸라아제 dam 유전자, 헤미메틸화 GATC 결합 단백질 seqA 유전자, 활성화 유도된 사이토신 디아미나아제 유전자 AID, 박테리오파지 PBS2 중의 우라실 DNA 글리코실라아제 억제 유전자 Ugi, 전사 억제 인자 emrR 중의 적어도 한 가지로부터 선택된다.
돌연변이 유발 유전자는 유전 정보의 복제와 전사 등 전달 과정에서의 돌연변이율을 향상시킬 수 있다. 그 중에서, 돌연변이를 유도하는 플라스미드 IMP는 동일한 방법을 통하여 유도 발현(예를 들면 psp 프로모터를 통하여 유도 제어를 진행하는 것)을 진행할 수 있고, 서로 다른 실시예에서, 만일 돌연변이를 유도하는 복수의 IMP, 예를 들면 IMP1, IMP2, IMP3 등이 존재하면, 돌연변이를 유도하는 이 몇 가지 플라스미드는 같을 수 있으며; 진화 전후의 목표 유전자가 각각 발현을 직접 프로모트할 수 있다. 이때 IMP1과 IMP2는 서로 다른 IMP를 표시한다.
상기 고체 배양 공간에는 2차원 평면 배양 구조와 3차원 공간 배양 구조가 포함된다.
상기 고체 배양 공간의 수직 방향 위의 이동 진화는, 정기적으로 고체 주입 배양 체계를 구성하는 것을 통하여 연속성을 유지한다.
상기 유도 진화는 고효율 진화이다.
상기 고효율 진화는 복수 그룹의 고체 배양 공간을 선택 사용하거나 또는 고체 배양 공간의 서로 다른 위치에서 구현된다.
상기 목표 유전자와 상기 숙주의 성장 이동은 보조 플라스미드를 통하여 연관되고, 상기 보조 플라스미드에는 적어도 제 1 보조 플라스미드가 포함되며, 상기 제 1 보조 플라스미드는 보조 플라스미드 CCP1 또는 보조 플라스미드 CCP2이고, 보조 플라스미드 CCP1의 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO: 3에 표시된 바와 같고, 보조 플라스미드 CCP2의 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO: 4에 표시된 바와 같다.
상기 보조 플라스미드 CCP1 또는 보조 플라스미드 CCP2는, 박테리오파지 진화 전 낮은 수준의 복제 증식을 지지하고, 목표 유전자 진화 후 활성이 증가되며, 보조 플라스미드 CCP1 또는 보조 플라스미드 CCP2는 박테리오파지가 더욱 높은 수준의 복제 증식으로 진화하도록 지지한다.
상기 보조 플라스미드에는 제 2 보조 플라스미드가 더 포함되고, 상기 제 2 보조 플라스미드는 보조 플라스미드 CCP3 또는 보조 플라스미드 CCP4이며; 보조 플라스미드 CCP3의 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO: 5에 표시된 바와 같다.
상기 보조 플라스미드 CCP3과 보조 플라스미드 CCP4는 기능 결손을 갖고 있어, 진화 전 박테리오파지의 증식을 지지할 수 없다.
구체적으로 말하면, 숙주균 S1이 IMP1과 CCP1을 휴대하고, 배양 플레이트 위에서 성장과 이동을 한다. 숙주균 S1은 이동 과정에서 박테리오파지 LWS를 접촉하게 되고, 진화 후의 목표 유전자를 휴대한 박테리오파지 LWSe를 생성할 때까지 LWS를 휴대하고 진화를 진행한다. 그 중에서, 박테리오파지 LWS는 증식 결손을 갖고 있고, 진화 전의 LWS는 CCP1의 백그라운드를 통하여 발현을 하고, 낮은 수준의 감염과 증식을 할 수 있다. 진화 후의 목표 유전자의 기능은, 적어도 일부분이 CCP2 위에서, 진화 후 박테리오파지 LWSe 증식을 지지하는 유전자 요소의 기능에 관련된다. 따라서, LWSe는 S1 중에서 CCP1을 통하여 고효율의 감염 복제를 진행할 수 있다. 박테리오파지의 고효율 감염 복제는 숙주균의 성장을 억제하므로, LWSe 감염 구역에는 세균이 비교적 적고 육안으로 관찰할 수 있는 하나의 투명 감염 얼룩이 형성될 수 있다. 이 감염 얼룩을 통하여 진화 효과를 직접 분석할 수 있다.
숙주균에는 숙주균 S2 또는 숙주균 S3이 더 포함되고 배양 플레이트 위에서 성장과 이동을 한다. 숙주균 S2는 이동 과정에서 초보적으로 진화된 박테리오파지 LWSe를 접촉하게 되고, 진일보 진화 후의 목표 유전자를 휴대한 박테리오파지 LWSeN을 생성할 때까지 LWSe를 휴대하고 진화를 진행한다. 그 중에서, 상기 숙주균 S2에는, 진화 후 박테리오파지 LWSe 또는 LWSeN 증식을 지지하는 보조 플라스미드 CCP2, 진화 전 박테리오파지 LWS 증식을 억제하는 보조 플라스미드 CCP3과, 돌연변이를 유도하는 플라스미드 IMP2가 포함된다. 진화 후의 목표 유전자의 기능은, 적어도 일부분이 CCP2 위에서, 진화 후 박테리오파지 LWSe 또는 LWSeN 증식을 지지하는 유전자 요소의 기능에 관련된다. CCP3과 CCP4 위의 유전자 요소의 기능은 진화 전의 목표 유전자의 기능에 관련되고, 아울러 CCP3과 CCP4가 휴대하는 유전자 요소는 기능 결손을 갖고 있어, 진화 전 박테리오파지 LWS의 증식을 지지할 수 없다. 이 단계는 박테리오파지 LWSeN 위의 목표 유전자의 야생형 활성을 낮출 수 있다. 박테리오파지 LWSeN 중의 목표 유전자의 야생형 활성이 충분하게 낮아질 때, S2 중에서 CCP2를 통하여 고효율의 감염 복제를 진행할 수 있다. 박테리오파지의 고효율 감염 복제는 숙주균의 성장을 억제하므로, 박테리오파지 LWSeN 감염 구역에는 세균이 비교적 적고 육안으로 관찰할 수 있는 하나의 투명 감염 얼룩이 형성될 수 있다. 이 감염 얼룩을 통하여 진화 효과를 직접 분석할 수 있다. 그 중에서, 상기 숙주균 S3에는 진화 후 박테리오파지 LWSe 또는 LWSeN 증식을 지지하는 보조 플라스미드 CCP2, 진화 전 박테리오파지 LWS 증식을 억제하는 보조 플라스미드 CCP4와, 돌연변이를 유도하는 플라스미드 IMP2가 포함된다. CCP4는 높은 복제 플라스미드이고, 결손 유전자 요소를 발현하는 수준이 더 높다. 즉 CCP4는 CCP3의 증강형이다. S3 세균은 S2 세균을 대신하여, 박테리오파지 LWSe에 대하여 진일보의 진화를 진행한다. 마찬가지 이치로, CCP2 플라스미드 복제 수가 CCP1보다 더욱 낮고, 낮은 복제 수 CCP2 백그라운드 발현이 더욱 낮으며, 진화 전의 박테리오파지인 LWS 박테리오파지의 복제를 지지할 수 없으며, 더욱 강한 진화 선택압을 제공할 수 있다.
상기 방법은 숙주균이 플레이트 변두리까지 이동하였을 때, 숙주균과 진화 후의 박테리오파지를 다음 플레이트 위로 전송하여 계속 진화를 진행하는 것을 더 포함한다.
상기 유도 진화는 서로 다른 숙주를 사용하여 교체로 진행하고, 다음번 숙주에 포함된 박테리오파지 증식을 지지하는 유전자 요소에는 진화 후의 박테리오파지의 증식을 지지하는 보조 플라스미드와 진화 전의 박테리오파지의 증식을 억제하는 보조 플라스미드가 포함된다.
종래의 기술에 비교하여 보면, 본 발명의 기술적 사항을 통하여 아래와 같은 발명의 효과를 획득할 수 있다.
(1) 본 발명에서 제공하는 가시적인 연속 공간 유도 진화 방법은 공간 속성을 갖고 있고, 전반적인 진화 과정이 2차원 평면 공간 또는 3차원 입체 공간에서 전개되며, 공간은 지지 플랫폼일뿐 아니라 또한 진화의 선택압이며, 소량의 진화 생성물이 나타나기만 하면 소정의 위치에 공간 분포 형태, 예를 들면 플라크를 직접 형성할 수 있고, 진화 중에 형성된 감염 얼룩 크기, 플라크 카운트 또는 리포터 유전자 실시간 모니터링을 통하여 목표 유전자 활성과 박테리오파지의 증식 활성을 검출하고, 진화 생성물을 직접 식별 분리할 수 있으므로, 액체 공급-배치 배양 장치를 사용할 필요가 없고, 실시간 모니터링 장치를 사용할 필요도 없다.
(2) 본 발명에서 제공하는 가시적인 연속 공간 유도 진화 방법에서, 서로 다른 공간 위치에 나타난 진화 결과는 상기 위치에 고정되고, 기타 성분에 의하여 희석되거나 혼합되지 않고 직접 분리할 수 있으며, 서로 다른 공간 위치에 나타난 진화 결과의 신호는 진화의 방향에 따라 확대되고, 진화 효과가 증강되며, 더욱 높은 검출 감도를 획득할 수 있다.
(3) 본 발명에서 제공하는 가시적인 연속 공간 유도 진화 방법은 조작이 간단하고 효율이 높으며, 한 번에 여러 그룹의 진화 실험을 할 수 있다.
본 발명의 실시예의 기술적 사항 또는 종래 기술의 기술적 사항을 더욱 명료하게 설명하기 위하여, 아래의 실시예 또는 종래 기술의 설명에서 사용되는 도면에 관하여 간단히 설명한다.
도 1은 본 발명의 실시예 중의 숙주균의 이동과 감염 얼룩 효과를 나타내는 도면이다.
도 2는 본 발명의 실시예 중의 연속 공간 유도 진화 원리를 나타내는 도면이다.
도 3은 본 발명의 실시예 중의 연속 공간 유도 진화 모델을 나타내는 도면이다.
도 4는 본 발명의 실시예 4 중의 제 1 라운드 SPACE 포지티브 스크리닝의 진화 결과를 나타내는 도면이다.
도 5는 본 발명의 실시예 5와 실시예 6 중의 복수 라운드의 SPACE 진화 결과를 나타내는 도면이다.
도 6은 본 발명의 실험예 1 중의 IMP3 유도 SPACE 진화 효과 및 서로 다른 박테리오파지의 개수를 나타내는 그래프이다.
도 7은 본 발명의 실험예 2 중의 T7 파지 감염 이동 효과 및 박테리오파지 개수를 나타내는 그래프이다.
도 1은 본 발명의 실시예 중의 숙주균의 이동과 감염 얼룩 효과를 나타내는 도면이다.
도 2는 본 발명의 실시예 중의 연속 공간 유도 진화 원리를 나타내는 도면이다.
도 3은 본 발명의 실시예 중의 연속 공간 유도 진화 모델을 나타내는 도면이다.
도 4는 본 발명의 실시예 4 중의 제 1 라운드 SPACE 포지티브 스크리닝의 진화 결과를 나타내는 도면이다.
도 5는 본 발명의 실시예 5와 실시예 6 중의 복수 라운드의 SPACE 진화 결과를 나타내는 도면이다.
도 6은 본 발명의 실험예 1 중의 IMP3 유도 SPACE 진화 효과 및 서로 다른 박테리오파지의 개수를 나타내는 그래프이다.
도 7은 본 발명의 실험예 2 중의 T7 파지 감염 이동 효과 및 박테리오파지 개수를 나타내는 그래프이다.
아래에서 실시예를 참조하여 본 발명의 기술적 사항을 상세히 설명하지만, 하기 실시예는 본 발명을 설명하기 위한 것이지만 본 발명의 범위를 한정하기 위한 것은 아니다. 실시예에 구체적인 조건이 제시되지 않았을 경우, 일반적인 조건 또는 제조업체에서 권장하는 조건에 따라 본 발명을 실시할 수 있다. 사용하는 시약 또는 기기에 생산 업체가 명확히 기재되지 않았을 경우 이들은 모두 시장에서 구매할 수 있는 일반적인 제품일 수 있다.
본 발명에서 제공하는 가시적인 연속 공간 유도 진화 방법에서, 박테리오파지와 숙주균을 혼합하여 플레이트 위에 도포할 때, M13 파지에 의해 감염된 숙주균과 미감염 숙주균 사이의 성장 차이로 인하여 육안으로 관찰할 수 있는 플라크가 형성된다. 리포터 유전자가 특이성, 감도 및 조작성에 관한 문제를 가지고 있으므로, 본 발명에서는 리포터 유전자를 사용하지 않고, 감염 과정 중에 형성된 얼룩을 직접 SPACE의 지시 신호로 전환하는 것에 의하여, SPACE의 가시화를 실현할 수 있다.
플라크 형성 실험과 같다. 숙주균을 배양 플레이트 중앙에 접종하고, 숙주균 주위의 세 개소에 야생 박테리오파지를 접종한다(도 1a 참조). 이 때 숙주균은 플레이트 위에서 성장하는 한편 플레이트의 변두리로 이동한다. 이동 중의 숙주균은 박테리오파지와 접촉하여 감염되고 후대 박테리오파지를 생성하는 한편 외부 변두리로 계속 이동한다. 감염된 숙주균의 성장이 비교적 느리고, 미감염 구역의 숙주균은 원래 상태를 유지하기 때문에, 감염 구역에 세균이 비교적 적은 하나의 V형의 감염 플라크가 형성된다(도 1b 참조). 이 투명 감염 플라크가 존재하는 것은 박테리오파지의 감염이 존재하는 것을 설명하고, 투명 얼룩의 투명도와 크기는 박테리오파지의 감염 활성을 나타낸다.
본 발명의 발명자가 공간 진화 시스템에 관한 선행 연구를 해온 경험에 의하여 획득한 SPACE의 핵심적 설계 원리는 도 2, 도 3에 도시된 바와 같다. 목표 유전자를 휴대한 박테리오파지 LWS가, 돌연변이 유발 플라스미드 IMP와 보조 플라스미드 CCP가 포함된 숙주균을 감염시킬 때, 박테리오파지 유전자 그룹은 복제와 돌연변이를 한다. 만일 돌연변이 후대 LWS가 CCP 위의 gIII 유전자 발현을 활성화시킬 수 있다면, 감염 활성이 구비된 후대 박테리오파지 LWSe를 생성하고, 다음의 감염 진화를 시작하며; 활성화시킬 수 없으면 감염 활성이 없는 결손 후대 박테리오파지를 생성한다. 진화가 진행됨에 따라 LWSe는 끊임없이 증가되지만, 야생형 LWS 박테리오파지와 감염 활성 결손 후대 박테리오파지는 증가되지 않거나 증가가 아주 적다. 도면 중에서 LWS 위의 GOI(gene of interest)는 진화 대기 목표 유전자를 대표한다. CCP와 IMP가 포함된 숙주균을 배양 플레이트의 중앙에 접종하고, 숙주균 주위의 세 개소에 박테리오파지 LWS를 접종한다. 이때 숙주균은 플레이트 위에서 성장 분열을 하고, 자체의 편모(flagellum)를 이용하여 플레이트 변두리로 이동하는 한편 특정 위치에서 사전에 이 위치에 접종한 박테리오파지 LWS와 접촉한다. 박테리오파지 LWS는 숙주균에 침입하는 한편 숙주균에 휴대되어 앞으로 이동한다. 시작 시, 박테리오파지 LWS는 CCP 위의 gIII 발현을 프로모트할 수 없고, 단지 CCP의 백그라운드를 통하여 낮은 수준의 증식밖에 할 수 없다. 이 때 박테리오파지 증식 수준은 아주 낮으며, 숙주균에 대한 영향이 비교적 작다. 감염된 숙주균과 미감염 숙주균이 거의 같은 속도로 성장 분열을 하고, 형태 상의 차이는 거의 없다. 아울러 박테리오파지 LWS의 낮은 수준의 증식 속도를 숙주균의 성장 이동 속도와 비교할 수 없기 때문에, 이러한 저효율의 박테리오파지 LWS는 이동하는 숙주균에 바로 뒤쳐지게 된다.
박테리오파지 LWS가 증식을 할 때, CCP 발현을 고효율로 프로모트할 수 있는 박테리오파지 LWSe로 진화될 때까지, IMP를 통하여 돌연변이 진화를 진행한다. 이 때 박테리오파지 LWSe는 직접 CCP를 프로모트하는 것에 의하여, 자체가 고효율 증식을 진행하도록 하여 후대 박테리오파지를 끊임없이 생성하고, 이동 중의 세균을 계속 감염시킨다. 박테리오파지 LWSe의 고효율 증식은 숙주균을 성장을 파괴하여, 세균 성장이 늦어지도록 한다. 박테리오파지 LWSe를 진화시킨 후, 소정의 위치에는 숙주균 성장이 늦는 것에 의하여 세균이 비교적 적은 하나의 투명 구역이 형성된다. 진화의 진행과 박테리오파지 LWSe에 감염된 세균이 계속 이동함에 따라, 이 투명 구역은 이동 방향에 따라 끊임없이 확대되고, 최종적으로 플레이트 위에서 육안으로 관찰할 수 있는 하나의 V형 감염 얼룩이 형성된다. 감염 얼룩이 외측에 근접할수록 진화 시간이 길어지고, 진화 효과도 선명하게 된다. 감염 얼룩에서 소정의 진화 후의 박테리오파지 LWSe를 직접 취득할 수 있다.
도 2, 3에 도시된 바와 같이, 본 발명의 일 실시방안의 박테리오파지 보조 연속 공간 유도 진화 시스템에는 포지티브 스크리닝(a, positive screening)과 네거티브 스크리닝(b, Negative screening) 두 부분이 포함되어 있다. 주의받고 싶은 것은, 본 발명을 구현하는 관점으로부터 보면, 단지 포지티브 스크리닝(a) 부분만 있으면 진화 대기 목표 유전자를 진화 후의 목표 유전자로 진화시키는 목적을 구현할 수 있다. 하기의 네거티브 스크리닝(b) 부분을 본 발명의 유도 진화 시스템의 진일보 개선된 기술방안으로 간주할 수 있다. 포지티브 스크리닝(a) 부분을 통하여 "진화 대기 목표 유전자"로부터 "진화 후의 목표 유전자"로의 질적 변화를 구현하고, 네거티브 스크리닝(b) 부분을 통하여 "진화 후의 목표 유전자"의 기능을 진일보 증강시키는 양적 변화를 구현할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 "진화 대기 목표 유전자"(GOI)라고 하는 것은 "진화 전의 목표 유전자", 즉 본 발명의 시스템과 방법에 의하여 진화성 돌연변이가 아직 발생하지 않은 목표 유전자와 같을 수 있고, 일부 상황에서 이것을 "야생형 유전자"라 할 수 있다. 상기 "진화 후의 목표 유전자"라고 하는 것은 "진화 대기 유전자"에 상대하여 말하는 것이며, 이 "진화 후의 목표 유전자"는 진화된 새로운 기능을 가질 수 있고 원래의 기능을 가질 수도 있다. 또한 원래의 기능이 철저하게 사라질 수 있는 것도 물론이다. 간단히 설명하면, 본 발명에서, 목표 유전자가 진화된 새로운 기능을 갖고 있기만 하면 "진화 후의 목표 유전자"라고 할 수 있고, 원래의 기능이 여전히 존재하는 지의 여부와는 상관없다.
주의받고 싶은 것은, 본 발명 중의 부호, 예를 들면 LWS, CCP, IMP 및 S 등은 본 발명의 예시에 지나지 않는 부호 표시이고, 이러한 부호가 의미하는 대상을 완전히 다른 표현 방식으로 표시할 수 있다. 예를 들면, 박테리오파지 LWS는 진화 전의 박테리오파지라고 할 수 있으며; 박테리오파지 LWSe는 진화 후의 박테리오파지라고 할 수 있으며; 박테리오파지 LWSeN은 진일보 진화 후의 박테리오파지라고 할 수 있다. 그 중의 번호 N(예를 들면 1, 2, 3 또는 기타 알파벳과 숫자의 조합 등)은 계대 배양의 세대 수 또는 진화의 횟수, 또는 서로 다른 조건하의 진화 등을 표시한다. 숙주균 S1은 제 1 숙주균이라고 할 수 있으며; 숙주균 S2는 제 2 숙주균이라고 할 수 있으며; 숙주균 S3은 제 3 숙주균이라고 할 수 있으며; 보조 플라스미드 CCP1은 제 1 보조 플라스미드라고 할 수 있으며; 보조 플라스미드 CCP2는 제 2 보조 플라스미드라고 할 수 있으며; 보조 플라스미드 CCP3은 제 3 보조 플라스미드라고 할 수 있으며; 보조 플라스미드 CCP4는 제 4 보조 플라스미드라고 할 수 있으며; 돌연변이를 유도하는 플라스미드 IMP1은 제 1 돌연변이 유도 플라스미드라고 할 수 있으며; 돌연변이를 유도하는 플라스미드 IMP2는 제 2 돌연변이 유도 플라스미드라고 할 수 있다. 돌연변이를 유도하는 플라스미드 IMP3은 제 3 돌연변이 유도 플라스미드라고 할 수 있다. 그 중에서, 진화 후의 박테리오파지 LWSe의 증식을 지지하는 플라스미드 CCP1, CCP2는 포지티브 스크리닝 CCP라고도 통칭한다. 마찬가지로, 진화 전의 박테리오파지 LWS 증식을 억제하는 플라스미드 CCP3, CCP4는 네거티브 스크리닝 CCP라고도 통칭한다. IMP1, IMP2, 및 IMP3의, 돌연변이를 발생시키는 플라스미드를 IMP라 통칭한다.
본 발명 중의 숙주균은 상기 숙주균 S1, S2, S3뿐만 아니라 다른 숙주균을 더 포함할 수 있다. 주의받고 싶은 것은, 본 발명의 숙주균 S1, S2, S3은 "균종"이 다르다는 것을 의미하는 것이 아니고, 균주가 휴대한 보조 플라스미드 또는 돌연변이 유발 플라스미드가 다르다는 것을 의미한다. 본 발명에 있어서, 숙주균 S1, S2, S3은 동일한 균종에 서로 다른 플라스미드를 각각 도입하는 것에 의하여 취득할 수 있고, 예를 들면 F인자를 휴대한 대장간균일 수 있다.
도 2, 3에 도시된 바와 같이, 본 발명의 일 실시예에 따른 박테리오파지가 보조하는 연속 공간 유도 진화 시스템은, 진화 대기 목표 유전자를 휴대한 박테리오파지 LWS를 포함하고, 상기 박테리오파지 LWS는 증식 결손을 갖고 있다. 상기 "증식 결손"이라고 하는 것은 일반적으로 박테리오파지 생명 주기 중의 일부분의 필요한 기능에 결손이 있는 것을 의미한다. 예를 들면 숙주균의 패키징 및/또는 감염에 관한 기능의 결손이며, 이 결손은 관련 유전자의 돌연변이에 의하여 초래된 것일 수 있다. 서로 다른 박테리오파지에서, 숙주균의 패키징 및/또는 감염 등을 담당하는 필요 기능의 유전자가 다르다. 예를 들면, 본 발명의 실시예에 있어서, 박테리오파지 LWS는 M13 파지이고, 그 중에서 숙주균의 패키징 및 감염을 담당하는 gIII 유전자가 절제되어 있으므로, 정상적으로 숙주균을 패키징 및 감염시킬 수 없다. 이 기술분야의 기술자들이 알고있는 바와 같이, 어떠한 유사한 박테리오파지를 모두 본 발명 중의 박테리오파지 LWS로 사용할 수 있으며, M13 파지에만 한정되는 것은 아니다.
도 2, 3에 도시된 유도 진화 시스템에 있어서, 숙주균 S1은 진화 후 LWSe 증식을 지지하는 보조 플라스미드 CCP1과 돌연변이를 유도하는 플라스미드 IMP1을 포함한다. 진화 전의 LWS는 CCP1의 백그라운드를 통하여 발현을 하고 낮은 수준의 감염 증식을 진행할 수 있다. 보조 플라스미드 CCP1과 CCP2가 진화 후의 LWSe 증식을 지지하는 것은, 진화 후의 목표 유전자의 적어도 일부분의 기능과, CCP1과 CCP2 위에서, 진화 후의 박테리오파지 LWSe의 증식을 지지하는 유전자 요소의 기능을 관련시키는 것을 통하여 구현할 수 있다. 상기 "적어도 일부분"이라고 하는 것은, 진화 후의 목표 유전자의 일부분의 기능이, 진화 후의 LWSe 증식의 유전자 요소의 기능에 관련될 뿐만 아니라, 이 일부분의 기능이 진화 전의 LWS 증식의 유전자 요소의 기능에도 관련되는 것을 가리킨다. 예를 들면, 본 발명의 일 실시예에 있어서, 진화 전의 목표 유전자는 T7 RNA 중합효소 유전자를 가리키고, 진화 후의 목표 유전자는 T3 RNA 중합효소 기능을 가진 유전자(T7 RNA 중합효소 기능을 더 포함)를 가리키며, CCP2 위의 유전자 요소는 T3 프로모터를 가리키고, 이 유전자 요소가 하위의 gIII 유전자 발현을 제어하는 것에 의하여 gIII 기능성 결손의 박테리오파지 LWSe의 증식을 보조한다. 이것에 의하여, T7 RNA 중합효소 유전자는 T7 프로모터 기능에 관련되고, T3 RNA 중합효소 유전자는 T3 프로모터 기능에 관련된다. 본 발명의 일 실시예에 있어서, IMP1은 진화 전의 LWS가 휴대한 목표 유전자를 발현하는 T7 RNA 중합효소에 의하여 프로모트되고, LWS가 돌연변이 진화를 하도록 유도한다. IMP2는 진화 후의 LWSe가 휴대한 목표 유전자가 발현한 T3 RNA 중합효소에 의하여 프로모트되고, LWSe가 계속 돌연변이 진화를 하도록 유도한다.
이 기술분야의 기술자들이 알고 있는 바와 같이, 본 발명은 상기 "T7 RNA 중합효소 유전자"를 진화 전의 목표 유전자로 하는 실시예에만 한정되는 것은 아니고, 임의의 유사한 기술방안을 포함할 수 있다. 구체적으로 서로 다른 목표 유전자, 예를 들면 단백질 분해효소 유전자, 섬유소 분해 효소 유전자, 형광 단백질 유전자, 정족수 감지 유전자, 항체 유전자에 관하여, 서로 다른 원리를 통하여 이들의 기능과 보조 플라스미드의 기능을 관련시킬 수 있다.
이해를 쉽게 하기 위하여, 본 발명에서 다른 몇 가지 목표 유전자 활성과 CCP 위의 gIII를 관련시키는 방법을 간단히 소개한다. 주의받고 싶은 것은, 목표 유전자 활성과 gIII를 관련시키는 방법은 아주 많으며, 하기 몇 가지 방법에만 한정되는 것은 아니다. 단백질 분해효소 유전자일 경우: (1) 목표 단백질 분해효소의 분해 서열을 연결 세그먼트로 하고, gIII 유전자와 gIII 단백질을 폐쇄 결합시킬 수 있는 하나의 보조 단백질(예를 들면 M13 파지의 g6 단백질)을 융합시켜 발현을 한다. 이때 융합 단백질의 gIII 부분은 폐쇄되고, 활성을 가지지 않는다. 단지 목표 단백질 분해효소가 특정 활성을 진화시키고, 지정된 분해 서열을 분해시켜야만, 비로소 활성을 가지고 있는 gIII를 방출할 수 있다. (2) T7 중합효소를 중간 매개체로 하고, 목표 단백질 분해효소 분해 서열을 연결 세그먼트로 하고, T7 중합효소와 T7 라이소자임을 융합시켜 발현을 하는 것에 의하여 새로운 중합효소를 형성한다. 상기 새로운 중합효소의 활성은 T7 라이소자임에 의하여 폐쇄된다. 단지 진화된 단백질 분해효소가 설정된 분해 서열을 식별하고 또한 라이소자임 부분을 제거하여 취득한 중합효소만이 활성을 가지고 있다. 섬유소 분해 효소 유전자일 경우: 섬유소의 효소성 분해 생성물인 포도당의 억제를 받는 젖당 오페론을 사용하여, gIII 유전자의 발현을 제어할 수 있다. 형광 단백질 유전자일 경우: 목표 형광 단백질이 방사하는 형광에 민감한 광 유도 프로모터를 사용하여, gIII 유전자의 발현을 프로모트할 수 있다. 정족수 감지 유전자일 경우: 정족수 감지 시스템을 사용하여 gIII 유전자 발현을 제어할 수 있다. 항체 유전자일 경우: 항체와 gIII 발현을 제어하는 전사 인자를 융합 발현시킬 수 있으며, 항체 결합 자리와 전사 효소를 융합시켜 발현한다.
도 2 중의 네거티브 스크리닝(b)은 본 발명의 진일보 개선된 기술방안을 나타낸다. 상기 시스템에는 숙주균 S2 또는 S3이 더 포함되고, 상기 숙주균 S2에는 진화 후 LWSe의 증식을 지지하는 보조 플라스미드 CCP2, 돌연변이를 유도하는 플라스미드 IMP2, 및 보조 플라스미드 CCP3이 포함된다. 상기 숙주균 S3에는 진화 후 LWSe의 증식을 지지하는 보조 플라스미드 CCP2, 돌연변이를 유도하는 플라스미드 IMP2, 및 보조 플라스미드 CCP4가 포함된다. 그 중에서, 보조 플라스미드 CCP2 및 돌연변이를 유도하는 플라스미드 IMP2는 포지티브 스크리닝(a) 부분과 유사하고, 차별점이라면 CCP1은 높은 복제 플라스미드이고, CCP2는 낮은 복제 플라스미드이며; IMP1과 IMP2는, 각각 진화 전과 진화 후의 목표 유전자에 의하여 발현을 프로모트한다. 하지만 CCP3과 CCP4 위의 유전자 요소의 기능은 진화 전의 목표 유전자의 기능에 관련되고, 아울러 CCP3과 CCP4는 기능 결손을 갖고 있어, 진화 전의 LWS의 증식을 지지할 수 없다. 본 발명의 실시예에서, 보조 플라스미드 CCP3, CCP4 위의 유전자 요소는 T7 프로모터이고, 상기 T7 프로모터는 gIII-neg 유전자를 발현하는 것을 제어하며, gIII-neg는 결손형 gIII이고, gIII 유전자 aa280 ~ aa350 사이의 대략 70개의 아미노산이 결손되어 LWS의 증식 진화를 지지할 수 없다. gIII-neg와 gIII가 함께 발현될 때, LWS의 증식을 서로 억제시킨다. 이 기술분야의 기술자들이 알고 있는 바와 같이, gIII-neg는 예시에 지나지 않는 것이고, 서로 다른 박테리오파지에 의하여 서로 다른 유전자를 사용할 수 있고, 동일한 유전자 중에서도 서로 다른 돌연변이를 사용할 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서, IMP2는 진화 후의 LWSe가 휴대한 진화 후의 목표 유전자가 발현한 T3 RNA 중합효소에 의하여 프로모트되고, 또한 LWSe의 돌연변이와 진화를 유도한다. IMP1, IMP2는 같은 방식을 통하여 유도 발현을 진행할 수 있으며(예를 들면 psp 프로모터를 통하여 유도 제어를 진행함), 이 때 IMP1, IMP2의 대신에 동일한 IMP3 플라스미드를 사용할 수 있다. psp 프로모터는 M13 파지의 세균에 대한 감염을 감지할 수 있다. psp 프로모터는 평소에 자기 억제 상태로 되어 있고, psp 프로모터의 제어를 받는 유전자는 기본상 발현을 하지 않으며, 감염이 발생할 때 psp 프로모터가 활성화되고, psp 프로모터의 제어를 받는 유전자는 고효율 발현을 한다. IMP3의 발현 프로모트는 박테리오파지 LWS 위에 목표 유전자가 휴대되었는지의 여부에 관련되지 않기 때문에, IMP1과 IMP2의 대신에 IMP3을 사용할 때, 포지티브/네거티브 스크리닝 중에서 IMP 플라스미드를 교체할 필요가 없다. 돌연변이를 발생시키는 플라스미드 IMP1, IMP2, 및 IMP3을 IMP라고 통칭한다.
본 발명의 바람직한 실시예에서, 돌연변이를 유도하는 플라스미드 IMP는 돌연변이 유발 유전자를 포함하고, 상기 돌연변이 유발 유전자는 제 12와 14 자리 아미노산이 Ala로 돌변하는 DNAQ 유전자 돌연변이체 DNAQ926 유전자, 데옥시아데노신 메틸라아제 dam 유전자, 헤미메틸화 GATC 결합 단백질 seqA 유전자, 활성화 유도된 사이토신 디아미나아제 유전자 AID, 박테리오파지 PBS2 중의 우라실 DNA 글리코실라아제 억제 유전자 Ugi, 전사 억제 인자 emrR 중의 적어도 한 가지일 수 있다. 이들은 DNA의 복제 과정을 간섭하고, 돌연변이 빈도를 높일 수 있다. 돌연변이 효율을 높일 수 있는 어떠한 유전자라도 모두 본 발명의 돌연변이 유발 유전자로 사용할 수 있다.
본 발명에서 제공하는 유도 진화 방법은, 숙주균 S1이 IMP1과 CCP1을 휴대하고, 배양 플레이트 위에서 성장과 이동을 하며; 숙주균 S1은 이동 과정에서 박테리오파지 LWS와 접촉하고, 진화 후의 목표 유전자를 휴대한 박테리오파지 LWSe를 생성할 때까지 LWS를 휴대하는 한편 진화를 진행하는 것을 포함한다. 상기 박테리오파지 LWS는 증식 결손을 갖고 있고, 진화 전의 LWS는 CCP1의 백그라운드를 통하여 발현을 하고, 낮은 수준의 감염과 증식을 진행할 수 있다. 진화 후의 목표 유전자의 기능은, 적어도 일부분이 CCP2 위에서의, 진화 후 LWSe의 증식을 지지하는 유전자 요소의 기능에 관련된다. 따라서, LWSe는 S1 중에서 CCP1을 이용하여 고효율의 감염 증식을 진행할 수 있다. 박테리오파지의 고효율 감염 증식이 숙주균의 성장을 억제하는 것에 의하여, LWSe 감염 구역에는 세균이 비교적 적고 육안으로 관찰할 수 있는 하나의 투명 감염 얼룩이 형성된다. 이 감염 얼룩을 통하여 진화 효과를 직접 분석할 수 있다.
상기 방법의 진일보 개선된 방법은 숙주균 S2 또는 S3이 각각 배양 플레이트 위에서 성장과 이동을 하는 것을 더 포함한다. 숙주균 S2는 이동하는 과정에서 초보적으로 진화된 박테리오파지 LWSe와 접촉하고, 진일보 진화된 후의 목표 유전자를 휴대한 박테리오파지 LWSeN을 생성할 때까지 LWSe를 휴대하면서 진화를 계속 진행한다. 상기 숙주균 S2는 진화 후 LWSe의 증식을 지지하는 보조 플라스미드 CCP2, 진화 전 LWS의 증식을 억제하는 보조 플라스미드 CCP3과 돌연변이를 유도하는 플라스미드 IMP2를 포함한다. 상기 숙주균 S3은 진화 후의 LWSe의 증식을 지지하는 보조 플라스미드 CCP2, 진화 전의 LWS의 증식을 억제하는 보조 플라스미드 CCP4 및 돌연변이를 유도하는 플라스미드 IMP2를 포함한다. 진화 후의 목표 유전자의 기능은, 적어도 일부분이 CCP2 위에서의, 진화 후 LWSe의 증식을 지지하는 유전자 요소의 기능에 관련된다. CCP3과 CCP4 위의 유전자 요소의 기능은 진화 전의 목표 유전자의 기능에 관련되고, CCP3과 CCP4가 휴대하는 유전자 요소는 기능 결손을 갖고 있으므로 진화 전의 LWS 증식을 지지할 수 없다. 이것을 통하여 LWSeN 위의 목표 유전자의 야생형 활성을 낮출 수 있다. LWSeN 중의 목표 유전자의 야생형 활성이 충분하게 낮아질 때, S2 중에서 CCP2를 통하여 고효율의 감염 복제를 진행할 수 있다. 박테리오파지의 고효율 감염 복제는 숙주균의 성장을 억제하므로 LWSeN 감염 구역에는 세균이 비교적 적고 육안으로 관찰할 수 있는 하나의 투명 감염 얼룩이 형성될 수 있다. 이 감염 얼룩을 통하여 진화 효과를 직접 분석할 수 있다. CCP4는 높은 복제 플라스미드이고, 결손 유전자 요소를 발현하는 수준이 더 높다. 즉 CCP4는 CCP3의 증강형이다. S3 숙주균은 S2 숙주균 대신에 사용되는 것이고, S2 숙주균 중에서 진화된 박테리오파지를 진일보 진화시킨다. 마찬가지로, CCP2 플라스미드의 복제 수는 CCP1보다 더 낮고, 낮은 복제 수의 CCP2의 백그라운드 발현이 낮으므로, 진화 전의 LWS 박테리오파지의 복제를 지지할 수 없으며, 더욱 강한 진화 선택압을 제공할 수 있다.
숙주균이 끊임없이 외부로 이동하는 과정에서, 증식 효율이 낮고, 함량이 비교적 적은 야생형 목표 유전자 활성을 휴대한 박테리오파지를 용리시킬 수 있다. 그리고, 진화 감염 얼룩의 크기, 플라크 카운트를 관찰하거나 또는 리포터 유전자의 실시간 모니터링을 하는 것을 통하여, 목표 유전자의 활성과 박테리오파지의 증식 활성을 검출할 수 있다.
CCP2.1은 CCP2 위에서 gIII 유전자를 제어하는 T3을 T7 프로모터로 개조하는 것에 의하여 취득할 수 있다. 숙주균 S4는 CCP2를 휴대하고, 숙주균 S5는 CCP2.1을 휴대한다. 본 발명은 진화 후의 박테리오파지 LWSeN이 S4, S5 숙주균에서 형성한 박테리오파지 수량의 차이를 통하여 LWSeN 위의 진화 후의 목표 유전자의 T7과 T3 중합효소 활성을 비교한다.
아래에서, T7 프로모터(SEQ ID NO: 1)를 식별하는 T7 RNA 중합효소 유전자 T7RNAP가 T3 프로모터(SEQ ID NO: 2)를 식별하는 T3 중합효소 유전자 T3RNAP로 진화되는 것을 예로 하여, 본 발명을 상세히 설명할 것이지만, 본 발명의 보호 범위는 T7 RNA 중합효소 유전자의 진화에만 한정되는 것은 아니다. 여기에서 말하는 T3 중합효소는 진화 시험을 통하여 취득하고 T3 프로모터를 식별할 수 있는 기능을 가지고 있는 중합효소를 가리키지만, 상기 중합효소가 자연의 T3 RNA 중합효소와 같은 유전자 서열을 갖고 있는 것을 의미하지 않는다. 박테리오파지 LWS가 휴대한 진화 대기 유전자는 T7 RNA 중합효소 유전자이며; 보조 플라스미드 CCP1(SEQ ID NO: 3) 위의 gIII 유전자는 T3 프로모터가 발현을 제어하며; 보조 플라스미드 CCP2(SEQ ID NO: 4) 위의 gIII 유전자는 T3 프로모터가 발현을 제어하며; 보조 플라스미드 CCP2.1(SEQ ID NO: 6) 위의 gIII 유전자는 T7 프로모터가 발현을 제어하며; 보조 플라스미드 CCP3(SEQ ID NO: 5) 위의 gIII-neg는 T7 프로모터가 발현을 제어하며; 보조 플라스미드 CCP4 위의 gIII-neg는 T7 프로모터가 발현을 제어한다. 그 중에서, gIII-neg는 결손형 gIII이고, gIII 유전자 aa280 ~ aa350 사이의 대략 70개의 아미노산이 결손되어 있어, LWS의 증식 진화를 지지할 수 없다. gIII-neg와 gIII가 함께 발현될 때 LWS의 증식을 서로 억제한다.
본 발명의 박테리오파지 LWS 및 보조 플라스미드 CCP4는 출원번호가 201610349254.3인 중국특허출원에 공개된 박테리오파지 SM, HP4와 같다.
돌연변이 유발 플라스미드 IMP1 위의 돌연변이 유발 유전자는 T7 프로모터가 그의 발현을 제어한다. 돌연변이 유발 플라스미드 IMP2가 돌연변이 유발 플라스미드 IMP1과 다른 점은, 돌연변이 유발 유전자는 T3 프로모터가 그의 발현을 제어하는 것에 있고, 돌연변이 유발 플라스미드 IMP2의 유전자 서열은 예를 들면 SEQ ID NO: 7에 표시된 바와 같다. 돌연변이 유발 플라스미드 IMP2와 다른 점은, 돌연변이 유발 플라스미드 IMP3 위의 돌연변이 유발 유전자는, psp 프로모터가 그의 발현을 제어하는 것에 있다. 박테리오파지 M13-WT는 NEB에서 구매한 M13KO7 박테리오파지에 유전자를 삽입하는 것에 의하여 획득한 야생형 박테리오파지이다. 박테리오파지 LWS와 비교할 경우, M13-WT(NCBI ACCESSION: V00604)와 T7 파지(NCBI ACCESSION: NC_001604)의 유전자 그룹과 기능은 완전하므로, 숙주균 중에서 독자적으로 감염 증식을 할 수 있다.
본 발명의 일부분의 박테리오파지, 플라스미드는 David R Liu 실험실에서 제공한 일부분의 재료를 본 발명의 발명자가 진일보 개량하여 취득한 것이다. 종래의 관련 문헌은 이 유전 정보를 이미 보도하였다(Nat Chem Biol. 2014 March; 10(3): 216-222). 플라스미드, 균주는 출원인의 연구를 통하여 취득한 것이다. 본 발명에서 사용되는 숙주균은 E.coli M15이고, E.coli M15는 E.coli K12 계열의 E.coli MG1655에 F 플라스미드를 도입하는 것에 의해 취득한 것이며, 유전자형이 F'proA+B+ lacIqΔ(lacZ)M15zzf::Tn10(TetR)/attB::aph tetR이다.
주의받고 싶은 것은, 본 발명의 숙주균은 E.coli M15에만 한정되는 것은 아니고, 이는 F인자를 휴대한 임의의 대장간균일 수 있다. 또한 본 발명의 E.coli M15와 LWS, CCP1, CCP2, CCP2.1, CCP3, CCP4, IMP1, IMP2, IMP3(도4 ~ 12 참조)은 모두 유전자 지도와 서열을 참조할 수 있고, PCR, 효소 절단 연결과 유전자 재조합 등 일반적인 분자 클로닝의 방법을 통하여 취득할 수 있다. 유전자 재조합, PCR과 효소 절단 연결 등과 같은 분자 클로닝 방법은 이 기술분야의 공지 기술이고, 해당 기술을 사용하는 것에 의하여 소정의 균주, 플라스미드와, 박테리오파지를 취득할 수 있다. 본 발명의 숙주균, 플라스미드와, 박테리오파지는 반복성의 특징을 갖고 있고, 이 기술분야의 기술자들은 상용 방법을 통하여 쉽게 취득할 수 있다. 따라서, 본 발명에서 균종 보존을 제공하지 않아도 본 발명이 충분이 공개되어 있다고 이해할 수 있다.
본 발명에서 CCP1과 IMP1을 휴대한 숙주균을 S1이라고 하고, IMP2, CCP2, CCP3을 휴대한 숙주균을 S2라고 하며, IMP2, CCP2, CCP4를 휴대한 숙주균을 S3이라고 한다. 포지티브 스크리닝에 있어서, 초기 LWS는 S1균 중에서 연속 유도 진화를 진행한다. 초기 LWS는 T7RNAP 유전자를 휴대하고, 단지 S1균 중에서만 CCP1의 백그라운드 발현을 통하여 비교적 낮은 수준의 증식과 돌연변이 진화를 진행할 수 있다. LWS가 휴대한 T7RNAP가 T3RNAP측으로 끊임없이 진화함에 따라, CCP1 위의 T3 프로모터가 제어하는 gIII 발현을 프로모트할 수 있는 LWS 돌연변이체가 생성된다. 상기 돌연변이체는 S1균 중에서 비교적 높은 수준의 증식과 진화를 진일보 진행할 수 있고, CCP1 중의 T3 프로모터가 제어하는 gIII의 프로모트 활성을 끊임없이 향상시키는 것에 의하여, 돌연변이 박테리오파지 LWSe와 pre-T3RNAP로 진화된 목표 유전자를 취득할 수 있다(도 2a 참조). 상기 과정을 포지티브 스크리닝이라고 한다.
진화 후, LWSe 위의 pre-T3RNAP는 T7, T3 프로모터에 대하여 모두 비교적 높은 활성을 갖는다. pre-T3RNAP의 T3 프로모터에 대한 특이성을 향상시키기 위하여, T7 프로모터에 대한 식별 프로모트 능력이 비교적 낮은 T3RNAP를 진화 선별하여야 한다. 이 과정을 네거티브 스크리닝이라고 한다.
네거티브 스크리닝은 CCP3 또는 CCP4를 사용하여야 하고, 포지티브 스크리닝과 진화를 진행한 후의 LWSe가 S2균을 감염시킬 때, LWSe 위의 진화 후의 목표 유전자 pre-T3RNAP는 gIII-R5의 발현을 프로모트할 수 있고, 그의 증식은 억제된다. 이러한 상황은 LWSe가 일부 새로운 박테리오파지 돌연변이체를 진화시킬 때까지 줄곧 지속된다. 이러한 새로운 박테리오파지 돌연변이체가 휴대한 목표 유전자는 CCP2 위의 T3 프로모터가 제어하는 gIII 유전자의 발현을 고효율로 프로모트할 수 있지만, CCP3 또는 CCP4 위의 T7 프로모터가 제어하는 gIII-R5 유전자 발현을 프로모트하지 않거나 아주 적게 프로모트한다. 이 때 이러한 새로운 박테리오파지 돌연변이체는 계속하여 S2 또는 S3 균주 중에서 진일보의 진화를 진행하고, 진화에 의하여 최종적으로 높은 특이성의 T3 RNA 중합효소 유전자 T3RNAP를 휴대한 박테리오파지 LWSeN을 취득한다(도 2b 참조). CCP4는 높은 복제 플라스미드이고, 결손 유전자 요소를 발현하는 수준이 더 높다. 즉 CCP4는 CCP3의 증강형이다. S3 숙주균은 S2 숙주균 대신에 사용하는 것이고, S2 숙주균 중에서 진화한 후의 박테리오파지를 S3 숙주균 중으로 전송하여 진화를 진일보 진행할 수 있다.
아래의 실시예를 통하여 본 발명의 실시 가능성을 설명하지만, 하기 실시예는 본 발명의 예시에 지나지 않는 것이다. 하기 실시예를 제출하는 목적은 다만 본 발명의 실시 가능성을 설명하기 위한 것이고, 본 발명의 보호 범위를 한정하려고 하는 의도는 없다.
실시예 1
진화 실험을 하기 전에 하기 작업을 진행한다.
1) CCP1과 IMP1 플라스미드를 휴대한 숙주균 S1을, 50μg/ml의 테트라사이클린, 50μg/ml의 스펙티노마이신, 및 25μg/ml의 클로람페니콜이 포함된 LB 배지에 넣고, 37℃, 220rpm인 조건하에서 OD600=0.3까지 배양한다. 계속하여 S1을 100배로 희석한 후, 동일한 배양 조건하에서 재차 OD600=0.3까지 배양한다. 2회의 배양을 거친 숙주균 S1을 진화 실험에 사용할 수 있다.
2) CCP2, CCP3과 IMP2 플라스미드를 휴대한 숙주균 S2를, 50μg/ml의 테트라사이클린, 50μg/ml의 스펙티노마이신, 50μg/ml의 카르베니실린, 및 25μg/ml의 클로람페니콜이 포함된 LB 배지에 넣고, 37℃, 220rpm인 조건하에서 OD600=0.3까지 배양한다. 계속하여 S2를 100배로 희석한 후, 동일한 배양 조건하에서 재차 OD600=0.3까지 배양한다. 2회의 배양을 거친 숙주균 S2를 진화 실험에 사용할 수 있다.
3) CCP2, CCP4와 IMP2 플라스미드를 휴대한 숙주균 S3을, 50μg/ml의 테트라사이클린, 50μg/ml의 스펙티노마이신, 50μg/ml의 카르베니실린, 및 25μg/ml의 클로람페니콜이 포함된 LB 배지에 넣고, 37℃, 220rpm인 조건하에서 OD600=0.3까지 배양한다. 계속하여 S3을 100배로 희석한 후, 동일한 배양 조건하에서 재차 OD600=0.3까지 배양한다. 2회의 배양을 거친 숙주균 S3을 진화 실험에 사용할 수 있다.
4) CCP2를 휴대한 숙주균 S4를, 50μg/ml의 테트라사이클린과 50μg/ml의 카르베니실린이 포함된 LB 배지에 넣고, 37℃, 220rpm인 조건하에서 OD600=0.3까지 배양한다. 계속하여 S4를 100배로 희석한 후, 동일한 배양 조건하에서 재차 OD600=0.3까지 배양한다. 2회의 배양을 거친 숙주균 S4를 실험에 사용할 수 있다.
5) CCP2.1을 휴대한 숙주균 S5를, 50μg/ml의 테트라사이클린과 50μg/ml의 카르베니실린이 포함된 LB 배지에 넣고, 37℃, 220rpm인 조건하에서 OD600=0.3까지 배양한다. 계속하여 S5를 100배로 희석한 후, 동일한 배양 조건하에서 재차 OD600=0.3까지 배양한다. 2회의 배양을 거친 숙주균 S5를 실험에 사용할 수 있다.
6) CCP1을 휴대한 숙주균 S6을, 50μg/ml의 테트라사이클린과 50μg/ml의 스펙티노마이신이 포함된 LB 배지에 넣고, 37℃, 220rpm인 조건하에서 OD600=0.3까지 배양한다. 계속하여 S6을 100배로 희석한 후, 동일한 배양 조건하에서 재차 OD600=0.3까지 배양한다. 2회의 배양을 거친 숙주균 S6을 진화 실험에 사용할 수 있다.
7) IMP3과 CCP1을 휴대한 숙주균 S7을, 50μg/ml의 테트라사이클린, 50μg/ml의 스펙티노마이신과, 25μg/ml의 클로람페니콜이 포함된 LB 배지에 넣고, 37℃, 220rpm인 조건하에서 OD600=0.3까지 배양한다. 계속하여 S7을 100배로 희석한 후, 동일한 배양 조건하에서 재차 OD600=0.3까지 배양한다. 2회의 배양을 거친 숙주균 S7을 실험에 사용할 수 있다.
8) E.coli M15를, 50μg/ml의 테트라사이클린이 포함된 LB 배지에 넣고, 37℃, 220rpm인 조건하에서 OD600=0.3까지 배양한다. 계속하여 E.coli M15를 100배로 희석한 후, 동일한 배양 조건하에서 재차 OD600= 0.3까지 배양한다. 2회의 배양을 거친 E.coli M15를 실험에 사용할 수 있다.
9) E.coli MG1655를 LB 배지에 넣고, 37℃, 220rpm인 조건하에서 OD600=0.3까지 배양한다. 계속하여 E.coli MG1655를 100배로 희석한 후, 동일한 배양 조건하에서 재차 OD600=0.3까지 배양한다. 2회의 배양을 거친 E.coli MG1655를 실험에 사용할 수 있다.
실시예 2
S4 또는 S5 숙주균 중 LWS 플라크 관찰 방법
1) 사이즈가 10cm인 세균 배양 플레이트 위에 한 층의 10ml의 1.5% 아가로스 겔을 도포하고, 실온에 20min 방치하는 것에 의하여, 이것을 응고시킨다.
2) 박테리오파지 LWS의 농도를 모를 때, LWS를 101, 2, 3, 4, 5, 6, 7배의 비례에 따라 구배 희석을 연속 진행하여야 한다.
3) "실시예 1"에서 획득한 S4 또는 S5 숙주균을 200μL씩 몇 그룹 취하고, 각 그룹에 "2)" 중의 서로 다른 희석 구배의 LWS 10μL를 각각 첨가한 후, 55℃의 환경에서 보존되고 0.4%의 세균학 한천(Bacteriological Agar)이 포함되어 있는 LB 배지와 최종 농도가 50μg/ml인 카르베니실린을 4ml를 첨가한다. 스월 진동 혼합기를 통하여 이것들을 혼합한 후, 샘플을 "1)"에서 준비한 플레이트 위에 도포한다. 그 후 실온에 1h 방치하는 것에 의하여 이것을 응고시킨다.
4) 37℃의 생화학 인큐베이터 내에서 하룻밤 동안 배양한다.
5) 각 구배 희석 샘플이 형성한 플라크의 수량을 통계하는 것에 의하여, 오리지널 샘플 LWS의 농도를 산출한다.
S5가 휴대한 CCP2.1의 gIII 유전자는 T7 프로모터가 프로모트하고, T7RNAP 목표 유전자를 휴대한 박테리오파지 LWS는 S5 숙주균 중에서 플라크를 희석할 수 있다. S4가 휴대한 CCP2의 gIII 유전자는 T3 프로모터가 프로모트하고, 단지 S4가 휴대한 목표 유전자가 T3RNAP 활성의 LWSe를 진화시켜야만, S4 숙주균 중에서 플라크를 형성할 수 있다. LWSe가 S4, S5 숙주균 중에서 형성한 플라크의 수량 변화를 비교하는 것에 의하여, LWSe의 진화 효과를 직접 분석할 수 있다.
실시예 3
숙주균, 박테리오파지 감염과 이동 테스트
1)
사이즈가 10cm인 세균 배양 플레이트에 0.25%의 세균학 한천이 포함된 LB 배지를 10ml 첨가한다. 배지에는 50μg/ml의 테트라사이클린과 50μg/ml의 카르베니실린이 포함된다. 실온에 1h 방치하는 하는 것에 의하여 이것을 응고시킨다.
2)
도 1a에 도시된 바와 같이, "실시예 1"에서 획득한 2μl의 숙주균 S5를 플레이트 중앙 표면에 접종한다. S5 접종 위치에서 1cm 떨어진 외측의 세 개소에 저장 농도가 106pfu/ml인 LWS 박테리오파지를 2μl씩 접종한다.
3)
플레이트를 37℃의 생화학 인큐베이터에 넣고 하룻밤 동안 배양한다. 그 후 도 1b에 도시된 현상을 관찰할 수 있다. 숙주균이 중앙으로부터 변두리로 이동하고, 이동 중의 숙주균은 박테리오파지와 접촉하는 것에 의하여 감염되는 한편 후대 박테리오파지를 생성하고, 아울러 외부 변두리로 계속 이동한다. 감염된 숙주균의 성장이 비교적 느리고, 세균의 수량이 상대적으로 적으며; 미감염 구역의 숙주균은 원래 상태를 유지하려고 하기 때문에 세균 수량이 상대적으로 많다. 따라서, 감염 구역에 형성된 세균이 비교적 적고 투명한 V형 감염 플라크를 볼 수 있다. 이 투명 감염 플라크가 존재한다는 것은 박테리오파지의 감염이 존재한다는 것을 설명하고, 투명 플라크의 투명도와 크기는 박테리오파지의 감염 활성을 대표한다.
실시예 4
SPACE 포지티브 스크리닝 진화
1) 제 1 라운드의 진화: 사이즈가 10cm인 3개의 세균 배양 플레이트 a, b, c를 준비하고, 각 배양 플레이트에 0.25%의 세균학 한천이 포함된 10ml의 LB 배지를 첨가한다. 배지에는 50μg/ml의 테트라사이클린, 50μg/ml의 스펙티노마이신이 포함된다. 실온에 1h 방치하는 것에 의하여 이것을 응고시킨다.
사이즈가 10cm인 4개의 세균 배양 플레이트 d, e, f, g를 준비하고, 각 배양 플레이트에 0.25%의 세균학 한천이 포함된 10ml의 LB 배지를 첨가한다. 배지에는 50μg/ml의 테트라사이클린, 50μg/ml의 스펙티노마이신과, 25μg/ml의 클로람페니콜이 포함된다. 실온에 1h 방치하는 것에 의하여 이것을 응고시킨다.
2) 도 1a에 도시된 바와 같이, "실시예 1"에서 획득한 2μl의 숙주균 S6을 3개의 플레이트 a, b, c의 중앙 표면에 접종한다. a 플레이트의 S6 접종 위치에서 1cm 떨어진 외측의 세 개소에 저장 농도가 108pfu/ml인 LWS 박테리오파지를 2μl씩 접종한다. b 플레이트의 S6 접종 위치에서 1cm 떨어진 외측의 세 개소에 저장 농도가 109pfu/ml인 LWS 박테리오파지를 2μl씩 접종한다. c 플레이트의 S6 접종 위치에서 1cm 떨어진 외측의 세 개소에 저장 농도가 1010pfu/ml인 LWS 박테리오파지를 2μl씩 접종한다.
"실시예 1"에서 획득한 2μl의 숙주균 S1을 4개의 플레이트 d, e, f, g의 중앙 표면에 접종한다. d 플레이트의 S1 접종 위치에서 1cm 떨어진 외측의 세 개소에 저장 농도가 108pfu/ml인 LWS 박테리오파지를 2μl씩 접종한다. e 플레이트의 S1 접종 위치에서 1cm 떨어진 외측의 세 개소에 저장 농도가 109pfu/ml인 LWS 박테리오파지를 2μl씩 접종한다. f 플레이트의 S1 접종 위치에서 1cm 떨어진 외측의 세 개소에 저장 농도가 1010pfu/ml인 LWS 박테리오파지를 2μl씩 접종한다. g 플레이트에는 박테리오파지를 접종하지 않는다.
d, e, f 플레이트는 서로 다른 양의 초기 박테리오파지가 첨가된 SPACE 진화 그룹이며; a, b, c 플레이트는 서로 다른 박테리오파지가 첨가되고 돌연변이 유발 플라스미드 IMP1을 휴대하지 않은 대조 그룹이며; g 플레이트는 박테리오파지가 없는 음성 대조 그룹이다.
3) 플레이트를 37℃의 생화학 인큐베이터에 넣고 하룻밤 동안 배양한다.
4) a ~ g 플레이트의 배양 후의 효과는 도 4a ~ g에 도시된 바와 같다. a, b, c 플레이트에서 S6 숙주균이 돌연변이 유발 플라스미드를 휴대하지 않기 때문에 박테리오파지는 돌연변이 진화를 진행할 수 없다. a, b, c 플레이트 위에서, 박테리오파지 LWS는 단지 CCP1의 백그라운드 발현만을 통하여 미약한 증식을 할 수 있고, 이동 중의 숙주균에 의해 이내 뿌리쳐지게 되므로 관찰 가능한 감염 얼룩이 형성될 수 없다. 최종적인 결과는 g 그룹의 음성 대조 그룹과 같다.
d, e, f 플레이트에서 숙주균 S1은 돌연변이 유발 플라스미드 IMP1을 휴대한다. 비록 박테리오파지 LWS는 초기에 CCP1의 백그라운드 발현만을 통하여 복제 증식을 진행할 수 있지만, 박테리오파지 LWS는 IMP1 위의 돌연변이 유발 유전자를 프로모트할 수 있고, 자체의 돌연변이 진화를 도와 T3RNAP 활성을 가지도록 할 수 있다. 이것에 의하여 d, e, f 플레이트 위에는 감염 얼룩이 이내 형성되고, 초기에 첨가한 박테리오파지의 양이 많을수록 감염 얼룩이 더욱 선명하게 된다.
e 플레이트에 형성된 감염 얼룩은 선명하고, e와 같은 양의 초기 박테리오파지 LWS를 첨가한 b 플레이트에서는 비특이성의 감염 얼룩이 발견되지 않았다. 하기의 실시예에서 e 플레이트를 선택하여 실험 분석을 진행한다.
e 플레이트에서 진화된 감염 얼룩에는 진화 후의 박테리오파지 LWSe가 존재한다. e 플레이트 감염 얼룩의 시작점 α(플레이트 중앙에 근접), 중간점 β, 종점 γ(플레이트 중앙과 멀리 떨어짐) 위치에서 샘플을 5μl씩 취하고, LWSeα, LWSeβ, LWSeγ로 표기한다. 샘플을 LB 액체 배지를 통하여 100배로 희석한 후, 스월 진동 혼합기를 통하여 2min 동안 균일하게 혼합한다. 균일하게 혼합된 샘플을 0.22μm의 소형 필터로 필터링한 후, "실시예 2"의 상기 방법에 따라 샘플 LWSeα, LWSeβ, LWSeγ에 의한, T3 프로모터가 gIII 유전자 발현을 제어하는 S4 숙주균 중의 플라크 T3 plaque의 형성 상황과, T7 프로모터가 gIII 유전자 발현을 제어하는 S5 숙주균 중의 플라크 T7 plaque의 형성 상황을 각각 검출한다.
도 4h에 도시된 바와 같이, 진화 전의 박테리오파지 LWS는 야생형의 T7RNAP 유전자를 휴대하고, 단지 숙주균 S5에서만 T7 plaque를 형성할 수 있고, 숙주균 S4에서 T3 plaque를 형성할 수 없다. 진화의 진행에 따라, 박테리오파지 LWS는 박테리오파지 LWSe로 변한다. LWSe가 휴대한 목표 유전자가 끊임없이 변화하는 것에 의하여, T3RNAP 활성을 갖기 시작하고, T3 프로모터를 식별할 수 있으며, 또한 숙주균 S4 중에서 T3 plaque를 형성할 수 있다. 그리고 플레이트 중앙과 멀리 떨어질수록 진화의 시간이 더욱 길게 되고, 진화의 효과가 더욱 좋게 되며, LWSe가 취득한 T3RNAP 활성이 더욱 선명하게 된다. 도 4h에 도시된 바와 같이, LWS로부터 LWSeγ까지 가면서 S4 중에서 T3 plaque를 형성하는 능력이 점점 강해진다. 하기의 실시예에서 매번의 진화를 진행한 후 플레이트 중앙과 멀리 떨어진 감염 얼룩 종점 위치에서 샘플을 취하여 100배로 희석 후, 0.22μm의 소형 필터로 필터링하고, 분석 또는 진화를 계속 다시 진행한다.
후속 실시예와 일치성을 유지하기 위하여, 뒤에서 LWSeγ 샘플을 LWSe1로 다시 표기한다. 그 중에서 "1"은 1 라운드의 진화가 진행된 것을 표시한다. 따라서, 본 발명에서 LWSe1과 LWSeγ는 동일한 샘플의 서로 다른 상황하의 명칭 표기를 나타낸다.
제 2 라운드의 진화: 동일한 플레이트 위에서, S1 숙주균을 플레이트 중앙에 접종하고, S1 접종 위치에서 외측 방향으로 1cm 떨어진 세 개소에 필터링 후의 박테리오파지 LWSe1을 2μl씩 접종하고, 동일한 조건하에서 제 2 라운드의 진화를 진행한다.
제 2 라운드의 진화가 진행된 감염 얼룩 종점 위치에서 LWSe2 박테리오파지의 샘플 5μl를 취하여 100배로 희석한 후, 0.22μm의 소형 필터로 필터링한다. 그 후, 샘플의 S4 숙주균 중에서의 플라크 T3 plaque의 형성 상황과 S5 숙주균 중에서의 플라크 T7 plaque의 형성 상황을 각각 검출한다. 도 5에 도시된 바와 같이, 1 라운드의 진화를 증가시킨 후, LWSe2의 S4 숙주균 중에서의 플라크 T3 plaque의 형성 능력은 LWSe1보다 더 강하게 된다.
실시예 5
S2 또는 S3 숙주균하의 SPACE 네거티브 스크리닝 진화
1) 제 3 라운드의 진화: 사이즈가 10cm인 세균 배양 플레이트에 0.25%의 세균학 한천이 포함된 10ml의 LB 배지를 첨가한다. 배지에는 50μg/ml의 테트라사이클린, 50μg/ml의 카르베니실린, 50μg/ml의 스펙티노마이신 및 25μg/ml의 클로람페니콜이 포함된다. 실온에 1h 방치하는 것에 의하여 이것을 응고시킨다. S2가 휴대한 CCP3과 CCP4 플라스미드 위에는 T7 프로모터뿐만 아니라 테오필린의 유도를 받는 하나의 리보스위치가 더 존재한다. 하지만 상기 리보스위치는 엄밀한 스위치가 아니므로, 테오필린을 첨가하지 않아도 일정한 gIII-neg 백그라운드 발현이 존재하고, 목표 유전자를 휴대한 야생형 T7RNAP 활성을 갖는 박테리오파지 LWSe의 증식을 억제할 수 있다.
플레이트 중앙에 2μl의 숙주균 S2를 접종하고, S2 접종 위치에서 외측 방향으로 1cm 떨어진 세 개소에 필터링 후의 박테리오파지 LWSe2를 2μl씩 접종하여, 37℃의 생화학 인큐베이터 중에서 하룻밤 동안 배양한다. 이것에 의하여 제 3 라운드의 진화를 진행한다.
제 3 라운드의 진화가 진행된 감염 얼룩 종점 위치에서 LWSe3 박테리오파지 샘플 5μl를 취하여 100배로 희석한 후, 0.22μm의 소형 필터로 필터링한다. 그 후, 샘플의 S4 숙주균 중에서의 플라크 T3 plaque의 형성 상황과, S5 숙주균 중에서의 플라크 T7 plaque의 형성 상황을 각각 검출한다.
2) 제 4 라운드의 진화: 본 실시예 "1)" 단계와 같은 조건하에서 필터링 후의 LWSe3 샘플에 대하여 제 4 라운드의 진화를 진행한다. 마찬가지로 제 4 라운드의 진화가 진행된 감염 얼룩 종점 위치에서 LWSe4 박테리오파지 샘플 5μl를 취하여 100배로 희석한 후, 0.22μm의 소형 필터로 필터링한다. 그 후, 샘플의 S4 숙주균 중에서의 플라크 T3 plaque의 형성 상황과, S5 숙주균 중에서의 플라크 T7 plaque의 형성 상황을 각각 검출한다.
3) 제 5 라운드의 진화: 사이즈가 10cm인 세균 배양 플레이트에 0.25%의 세균학 한천이 포함된 10ml의 LB 배지를 첨가한다. 배지에는 50μg/ml의 테트라사이클린, 50μg/ml의 카르베니실린, 50μg/ml의 스펙티노마이신, 25μg/ml의 클로람페니콜 및 1mM의 테오필린이 포함된다. 실온에 1h 방치하는 것에 의하여 이것을 응고시킨다. 테오필린을 첨가하는 것에 의하여 CCP3과 CCP4의 gIII-neg 발현을 향상시키고, 진화 선택압을 증강시킬 수 있다.
플레이트 중앙에 2μl의 숙주균 S2를 접종하고, 다시 S2 접종 위치에서 외측 방향으로 1cm 떨어진 세 개소에 필터링 후의 박테리오파지 LWSe4를 2μl씩 접종하여, 37℃의 생화학 인큐베이터 중에서 하룻밤 동안 배양한다. 이것에 의하여 제 5 라운드의 진화를 진행한다.
제 5 라운드의 진화가 진행된 감염 얼룩 종점 위치에서 LWSe5 박테리오파지 샘플 5μl를 취하여 100배로 희석한 후, 0.22μm의 소형 필터로 필터링한다. 그 후, 샘플의 S4 숙주균 중에서의 플라크 T3 plaque의 형성 상황과 S5 숙주균 중에서의 플라크 T7 plaque의 형성 상황을 각각 검출한다.
4) 제 6 라운드의 진화: 사이즈가 10cm인 세균 배양 플레이트에 0.25%의 세균학 한천이 포함된 10ml의 LB 배지를 첨가한다. 배지에는 50μg/ml의 테트라사이클린, 50μg/ml의 카르베니실린, 50μg/ml의 스펙티노마이신, 및 25μg/ml의 클로람페니콜이 포함된다. 실온에 1h 방치하는 것에 의하여 이것을 응고시킨다.
플레이트 중앙에 2μl의 숙주균 S3을 접종하고, S3 접종 위치에서 외측 방향으로 1cm 떨어진 세 개소에 필터링 후의 박테리오파지 LWSe5를 2μl씩 접종하여, 37℃의 생화학 인큐베이터 중에서 하룻밤 동안 배양한다. 이것에 의하여 제 6 라운드의 진화를 진행한다.
제 6 라운드의 진화가 진행된 감염 얼룩 종점 위치에서 LWSe6 박테리오파지 샘플 5μl를 취하여 100배로 희석한 후, 0.22μm의 소형 필터로 필터링한다. 그 후, 샘플의 S4 숙주균 중에서의 플라크 T3 plaque의 형성 상황과, S5 숙주균 중에서의 플라크 T7 plaque의 형성 상황을 각각 검출한다.
5) 제 7 라운드의 진화: 10cm 세균 배양 플레이트에 0.25%의 세균학 한천이 포함된 10ml의 LB 배지를 첨가한다. 배지에는 50μg/ml의 테트라사이클린, 50μg/ml의 카르베니실린, 50μg/ml의 스펙티노마이신, 25μg/ml의 클로람페니콜 및 1mM의 테오필린이 포함된다. 실온에 1h 방치하는 것에 의하여 이것을 응고시킨다.
플레이트 중앙에 2μl의 숙주균 S3을 접종하고, S3 접종 위치에서 외측 방향으로 1cm 떨어진 세 개소에 필터링 후의 박테리오파지 LWSe6을 2μl씩 접종하여, 37℃의 생화학 인큐베이터 중에서 하룻밤 동안 배양한다. 이것에 의하여 제 7 라운드의 진화를 진행한다.
제 7 라운드의 진화가 진행된 감염 얼룩 종점 위치에서 LWSe7 박테리오파지 샘플 5μl를 취하여 100배로 희석한 후, 0.22μm의 소형 필터로 필터링한다. 그 후, 샘플의 S4 숙주균 중에서의 플라크 T3 plaque의 형성 상황과, S5 숙주균 중에서의 플라크 T7 plaque의 형성 상황을 각각 검출한다.
제 7 라운드의 진화 효과는 도 5에 도시된 바와 같다. 도 5 중의 5a는 서로 다른 CCP의 복제 수를 나타내는 도면이고, 복제 수의 많고 적음은 그 유전자 발현 수준의 높고 낮음에 영향을 주고, 진화 과정의 선택압 강약에 영향을 준다. 도 5b는 각 라운드 플레이트 위의 효과를 나타내는 도면이고, 그 중의 진화압 줄에 있어서, 연한 색상으로부터 진한 색상으로 변하는 것에 의하여 다른 조건하에서 약한데로부터 강한 진화 선택압으로 변하는 것을 표시한다. 도 5c는 각 라운드의 진화 생성물의 S4, S5 숙주균 중에서의 플라크 형성 효과를 나타내는 도면이다. 도시된 바와 같이, 진화 라운드 수가 증가함에 따라, 진화 과정의 선택압이 점점 강해지고, 진화 효과도 더욱 선명해진다. 야생형 T7RNAP 유전자를 휴대한 LWS 박테리오파지는 단지 T7 프로모터가 gIII 유전자 발현을 제어하는 S5 숙주균 중에서만 플라크 T7 plaque를 형성할 수 있고, T3 프로모터가 gIII 유전자 발현을 제어하는 S4 숙주균 중에서 플라크 T3 plaque를 형성할 수 없다. 진화의 진행에 따라, LWSe1로부터 LWSe7 박테리오파지까지, 이들의 S5 숙주균 중에서 플라크 T7 plaque를 형성하는 능력은 전반적으로 점점 약해지지만, S4 숙주균 중에서 플라크 T3 plaque를 형성하는 능력은 전반적으로 점점 강해진다.
실시예 6
SPACE 생성물 시퀀싱 분석
초기 두 라운드의 진화 생성물인 박테리오파지 LWSe1, LWSe2에 대하여 몇 클로닝을 정제하여 목표 유전자의 시퀀싱을 진행한다. 도 5d에 도시된 바와 같이, 이들이 휴대한 목표 유전자는 모두 N말단 제 1 ~ 310 아미노산에서 소정의 돌연변이가 발생한다. 종래의 보도에 의하면, 이 구역은 T7RNAP가 프로모터의 식별에 연관된다. 그 중에서, David R Liu의 보도에 의하면 E222K 돌연변이는 T7RNAP의 특이성에 영향을 준다.
진화 전후의 박테리오파지의 S5, S4 숙주균 중에서 플라크를 형성하는 능력과 시퀀싱 결과를 비교하여 보면, LWSe 박테리오파지가 휴대한 목표 유전자 활성이 T7RNAP로부터 T3RNAP로 전환되는 것은 SPACE 진화가 초래한 돌연변이에 의한 것이라는 것을 알 수 있다.
실험예 1
IMP3 유도 SPACE 진화 테스트
1) 사이즈가 10cm인 3개의 세균 배양 플레이트 a, b, c를 준비하고, 각 배양 플레이트에 0.25%의 세균학 한천이 포함된 10ml의 LB 배지를 첨가한다. 배지에는 50μg/ml의 테트라사이클린, 50μg/ml의 스펙티노마이신과, 25μg/ml의 클로람페니콜이 포함된다. 실온에 1h 방치하는 것에 의하여 이것을 응고시킨다.
2) 도 1a에 도시된 바와 같이, 실시예 1에서 획득한 2μl의 숙주균 S7을 각각 플레이트 a, c의 중앙 표면에 접종한다. 플레이트 a의 S7 접종 위치에서 1cm 떨어진 외측의 세 개소에 저장 농도가 109pfu/ml인 LWS 박테리오파지를 2μl씩 접종한다. 플레이트 c에는 negative 그룹으로서 박테리오파지를 접종하지 않는다.
실시예 1에서 획득한 2μl의 숙주균 S1을 플레이트 b의 중앙 표면에 접종한다. 플레이트 b의 S1 접종 위치에서 1cm 떨어진 외측의 세 개소에 저장 농도가 109pfu/ml인 LWS 박테리오파지를 2μl씩 접종한다.
3) 플레이트를 37℃의 생화학 인큐베이터에 넣고 하룻밤 동안 배양한다.
4) a ~ c 플레이트 진화 후의 효과는 도 6a ~ c에 도시된 바와 같고, IMP3을 휴대한 숙주균 S7과 IMP1을 휴대한 숙주균 S1은 유사한 진화 감염 얼룩을 가지고 있다. 숙주균 S7 그룹의 진화 감염 얼룩 종점 위치에서 5μl의 진화 후 박테리오파지 샘플 LWSeP1을 취하여 100배로 희석한 후, 0.22μm의 소형 필터로 필터링을 한다. 그 후 샘플에 의한 S4 숙주균 중에서의 플라크 T3 plaque의 형성 상황과, S5 숙주균 중에서의 플라크 T7 plaque의 형성 상황을 각각 검출한다.
숙주균 S1 그룹의 진화 감염 얼룩 종점 위치에서 5μl의 진화 후 박테리오파지 샘플 LWSeT1을 취하여 100배로 희석한 후, 0.22μm의 소형 필터로 필터링을 한다. 그 후 샘플에 의한 S4 숙주균 중에서의 플라크 T3 plaque의 형성 상황과, S5 숙주균 중에서의 플라크 T7 plaque의 형성 상황을 각각 검출한다.
도 6d에 도시된 바와 같이, LWSeT1과 LWSeP1의 T3, T7 plaque 수량이 유사하다. 이것은 psp 오페론이 제어하는 IMP3과 IMP1이 돌연변이 진화를 촉진하는 촉진 효과가 같은 것을 의미한다.
이로부터 알 수 있는 바와 같이, IMP1과 IMP2의 대신에 IMP3을 직접 사용하고, IMP의 발현을 목표 유전자의 활성에서 이탈하게 할 수 있다. 이 때 진화 합성 목표 유전자는 포지티브 스크리닝이든지 네거티브 스크리닝이든지 모두 동일한 IMP3을 사용할 수 있다.
실험예 2
독성 박테리오파지 감염과 이동 테스트
1) 상기 실시예는 만성 감염 M13 파지의 기초 위에 진행한 것이다. 하지만 본 발명은 기타 박테리오파지 위에서 진화 실험을 진행할 수도 있다. 여기에서 독성 박테리오파지 T7 파지를 예로 하여 설명을 한다.
2) 사이즈가 10cm인 세균 배양 플레이트에 0.25%의 세균학 한천이 포함된 10ml의 LB 배지를 첨가하고, 실온에 1h 방치하는 것에 의하여 이것을 응고시킨다.
3) 도 1a에 도시된 바와 같이, "실시예 1"에서 획득한 2μl의 숙주균 E.coli MG1655를 플레이트 중앙 표면에 접종한다. E.coli MG1655 접종 위치에서 1cm 떨어진 외측의 세 개소에 저장 농도가 104,105,106 pfu/ml인 T7 박테리오파지를 2μl씩 접종한다. 대조 그룹에서 박테리오파지 대신에 LB 배지를 사용한다.
4) 플레이트를 37℃의 생화학 인큐베이터 중에 넣고 하룻밤 동안 배양한다. 그 후 도 7b에 도시된 현상을 관찰할 수 있다. 숙주균이 중앙으로부터 변두리로 이동하고, 이동 중의 숙주균은 박테리오파지와 접촉하는 것에 의하여 감염되고 또한 후대 박테리오파지를 생성하고, 아울러 외부 변두리로 계속 이동한다. T7 파지는 독성 박테리오파지이고, 감염된 숙주균은 모두 분해 사망한다. 따라서, 플레이트 위에는 V형의 투명 감염 얼룩이 형성된다. 16a 대조 그룹에는 박테리오파지가 없고, V형의 감염 얼룩은 형성되지 않으며, 그의 세균은 원형으로 균일하게 분포된다. 접종량이 106pfu/ml인 그룹에 있어서, 도 7b의 감염 구역 α점, 미감염 구역 β점, 및 교차 구역 γ점에서 샘플링을 각각 취하고, "실시예 2"와 E.coli MG1655에 따라 박테리오파지 카운트를 진행한다. 도 7c에 도시된 바와 같이, γ점에서 109 pfu/ml 자릿수의 T7 박테리오파지를 측정하였다. 이것은 T7 독성 박테리오파지도 플레이트 위에서 숙주균에 따라 이동과 감염을 하고, 또한 육안으로 관찰할 수 있는 감염 얼룩을 감염 표지로 할 수 있다는 것을 의미한다. 이에 기초하여, 본 발명의 M13 파지 위에서 진행된 실시예를 T7 파지 위에서도 충분히 진행할 수 있다.
상기 실시예에서 T7 프로모터를 식별하는 T7 RNA 중합효소 유전자 T7RNAP를, T3 프로모터를 식별하는 T3 RNA 중합효소 유전자 T3RNAP로 진화시키는 것을 예로 하여 설명을 하여왔다. LWS 중의 T7RNAP 유전자 대신에 기타 목표 유전자(예를 들면 단백질 분해효소 유전자, 섬유소 분해 효소 유전자, 형광 단백질 유전자, 정족수 감지 유전자 등)를 사용하고, 또한 CCP1, CCP2, CCP3, 및 CCP4 플라스미드 중의 gIII와 gIII-R5 유전자의 발현을 조정하고, 발현 후의 수식 방식을 적당히 조정하는 것에 의하여, gIII와 gIII-R5의 발현과 LWS 위의 새로운 진화 대기 목표 유전자의 생물 활성을 한데 묶을 수 있다. 이럴 경우 본 시스템을 통하여 새로운 목표 유전자의 유도 진화를 진행할 수 있다.
구체적인 실시예를 통하여 본 발명을 설명하여 왔지만, 본 발명의 사상과 범위를 벗어나지 않는 범위 내에서 여러가지 변경과 수정을 할 수 있다. 즉 본 발명의 범위 내에 진행된 이러한 변화와 수정들이 있어도 본 발명의 특허청구범위가 정한 범위 내에 포함되는 것은 물론이다.
<110> SHENZHEN INSTITUTES OF ADVANCED TECHNOLOGY
<120> VISUAL CONTINUOUS SPACE DIRECTED EVOLUTION METHOD
<160> 7
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> artificial sequence
<400> 1
taatacgact cactataggg 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> artificial sequence
<400> 2
attaaccctc actaaaggga 20
<210> 3
<211> 3935
<212> DNA
<213> artificial sequence
<400> 3
ttgagatcct ttttttctgc gcatcgctga gataggtgcc tcactgatta agcattggta 60
actgtcagac caagtttact catatatact ttagattgat ttaaaacttc atttttaatt 120
taaaaggatc taggtgaaga tcctttttga taatctcatg accaaaatcc cttaacgtga 180
gttttcgttc cactgagcgt cagaccccgt agaaaagatc aaaggatctt cttgagatcc 240
ttgcggtggt ttgtttgccg gatcaagagc taccaactct ttttccgaag gtaactggct 300
tcagcagagc gcagatacca aatactgttc ttctagtgta gccgtagtta ggccaccact 360
tcaagaactc tgtagcaccg cctacatacc tcgctctgct aatcctgtta ccagtggctg 420
ctgccagtgg cgataagtcg tgtcttaccg ggttggactc aagacgatag ttaccggata 480
aggcgcagcg gtcgggctga acggggggtt cgtgcacaca gcccagcttg gagcgaacga 540
cctacaccga actgagatac ctacagcgtg agctatgaga aagcgccacg cttcccgaag 600
ggagaaaggc ggacaggtat ccggtaagcg gcagggtcgg aacaggagag cgcacgaggg 660
agcttccagg gggaaacgcc tggtatcttt atagtcctgt cgggtttcgc cacctctgac 720
ttgagcgtcg atttttgtga tgctcgtcag gggggcggag cctatggaaa aacgccagca 780
acgcggcctt tttacggttc ctggcctttt gctggccttt tgctcacatg ttctttcctg 840
cgttatcccc tgattctgtg gataaccgta ttaccgcctt tgagtgagct gataccgctc 900
gccgcagccg aacgaccgag cgcagcgagt cagtgagcga ggaagcggaa gagcgcccaa 960
tacgcaaacc gcctctcccc gcgcgttggc cgattcatta atgcagctgg cacgacaggt 1020
ttcccgactg gaaagcgggc agtgagcgca acgcgtcaag aggacatccg gtcaaataaa 1080
acgaaaggct cagtcgaaag actgggcctt tcgttttgct gaggagactt agggacccta 1140
caattaaccc tcactaaagg gagaaagacc tgcaggtgca gtaaggagga tatataaaaa 1200
aaaatgaaaa aattattatt cgcaattcct ttagttgttc ctttctattc tcactccgct 1260
gaaactgttc atcaccatca ccatcacgct gaaactgttg aaagttgttt agcaaaaccc 1320
catacagaaa attcatttac taacgtctgg aaagacgaca aaactttaga tcgttacgct 1380
aactatgagg gctgtctgtg gaatgctaca ggcgttgtag tttgtactgg tgacgaaact 1440
cagtgttacg gtacatgggt tcctattggg cttgctatcc ctgaaaatga gggtggtggc 1500
tctgagggtg gcggttctga gggtggcggt tctgagggtg gcggtactaa acctcctgag 1560
tacggtgata cacctattcc gggctatact tatatcaacc ctctcgacgg cacttatccg 1620
cctggtactg agcaaaaccc cgctaatcct aatccttctc ttgaggagtc tcagcctctt 1680
aatactttca tgtttcagaa taataggttc cgaaataggc agggggcatt aactgtttat 1740
acgggcactg ttactcaagg cactgacccc gttaaaactt attaccagta cactcctgta 1800
tcatcaaaag ccatgtatga cgcttactgg aacggtaaat tcagagactg cgctttccat 1860
tctggcttta atgaggatcc attcgtttgt gaatatcaag gccaatcgtc tgacctgcct 1920
caacctcctg tcaatgctgg cggcggctct ggtggtggtt ctggtggcgg ctctgagggt 1980
ggtggctctg agggtggcgg ttctgagggt ggcggctctg agggaggcgg ttccggtggt 2040
ggctctggtt ccggtgattt tgattatgaa aagatggcaa acgctaataa gggggctatg 2100
accgaaaatg ccgatgaaaa cgcgctacag tctgacgcta aaggcaaact tgattctgtc 2160
gctactgatt acggtgctgc tatcgatggt ttcattggtg acgtttccgg ccttgctaat 2220
ggtaatggtg ctactggtga ttttgctggc tctaattccc aaatggctca agtcggtgac 2280
ggtgataatt cacctttaat gaataatttc cgtcaatatt taccttccct ccctcaatcg 2340
gttgaatgtc gcccttttgt ctttggcgct ggtaaacctt acgagttcag tatcgactgc 2400
gataagatca acctgttccg cggtgtcttt gcgtttcttt tatatgttgc cacctttatg 2460
tatgtatttt ctacgtttgc taacatactg cgtaataagg agtcttaatc atgaccatga 2520
ttacggattc actggccgtc gttttacaac gtcgtgactg ggaaaaccct ggcgttaccc 2580
aacttaatcg ccttgcagca catccccctt tcgccagctg gcgtaatagc gaagaggccc 2640
gcaccgatcg cccttcccaa cagttgcgca gcctgaatgg cgaatggcgc tttgcctggt 2700
ttccggcacc agaagcggtg ccggaaagct ggctggagtg cgatcttcct gaggccgata 2760
ctgtcgtcgt cccctcaaac tggcagatgc acggttacga tgcgcccatc tacaccaacg 2820
tgacctatcc cattacggtc aatccgccgt ttgttcccac ggagaatccg acgggttgtt 2880
actcgctcac atttaatgtt gatgaaagct ggctacagga aggccagacg cgaattattt 2940
ttgatggcgt taactcggcg taaacttaat taacggcact cctcagcaaa tataatgacc 3000
ctcttgataa cccaagaggg cattttttaa tgcccatggc gtttatttgc cgactacctt 3060
ggtgatctcg cctttcacgt agtggacaaa ttcttccaac tgatctgcgc gcgaggccaa 3120
gcgatcttct tcttgtccaa gataagcctg tctagcttca agtatgacgg gctgatactg 3180
ggccggcagg cgctccattg cccagtcggc agcgacatcc ttcggcgcga ttttgccggt 3240
tactgcgctg taccaaatgc gggacaacgt aagcactaca tttcgctcat cgccagccca 3300
gtcgggcggc gagttccata gcgttaaggt ttcatttagc gcctcaaata gatcctgttc 3360
aggaaccgga tcaaagagtt cctccgccgc tggacctacc aaggcaacgc tatgttctct 3420
tgcttttgtc agcaagatag ccagatcaat gtcgatcgtg gctggctcga agatacctgc 3480
aagaatgtca ttgcgctgcc attctccaaa ttgcagttcg cgcttagctg gataacgcca 3540
cggaatgatg tcgtcgtgca caacaatggt gacttctaca gcgcggagaa tctcgctctc 3600
tccaggggaa gccgaagttt ccaaaaggtc gttgatcaaa gctcgccgcg ttgtttcatc 3660
aagccttacg gtcaccgtaa ccagcaaatc aatatcactg tgtggcttca ggccgccatc 3720
cactgcggag ccgtacaaat gtacggccag caacgtcggt tcgagatggc gctcgatgac 3780
gccaactacc tctgatagtt gagtcgatac ttcggcgatc accgcttccc tcatactctt 3840
cctttttcaa tattattgaa gcatttatca gggttattgt ctcatgagcg gatacatatt 3900
tgaatgtatt tagaaaaata ggccaaatag gccgt 3935
<210> 4
<211> 5320
<212> DNA
<213> artificial sequence
<400> 4
ttttgctgag gagacttagg gaccctacaa ttaaccctca ctaaagggag aaagacctgc 60
aggtgcagta aggaggaaaa aaaaatgaaa aaattattat tcgcaattcc tttagttgtt 120
cctttctatt ctcactccgc tgaaactgtt catcaccatc accatcacgc tgaaactgtt 180
gaaagttgtt tagcaaaacc ccatacagaa aattcattta ctaacgtctg gaaagacgac 240
aaaactttag atcgttacgc taactatgag ggctgtctgt ggaatgctac aggcgttgta 300
gtttgtactg gtgacgaaac tcagtgttac ggtacatggg ttcctattgg gcttgctatc 360
cctgaaaatg agggtggtgg ctctgagggt ggcggttctg agggtggcgg ttctgagggt 420
ggcggtacta aacctcctga gtacggtgat acacctattc cgggctatac ttatatcaac 480
cctctcgacg gcacttatcc gcctggtact gagcaaaacc ccgctaatcc taatccttct 540
cttgaggagt ctcagcctct taatactttc atgtttcaga ataataggtt ccgaaatagg 600
cagggggcat taactgttta tacgggcact gttactcaag gcactgaccc cgttaaaact 660
tattaccagt acactcctgt atcatcaaaa gccatgtatg acgcttactg gaacggtaaa 720
ttcagagact gcgctttcca ttctggcttt aatgaggatc cattcgtttg tgaatatcaa 780
ggccaatcgt ctgacctgcc tcaacctcct gtcaatgctg gcggcggctc tggtggtggt 840
tctggtggcg gctctgaggg tggtggctct gagggtggcg gttctgaggg tggcggctct 900
gagggaggcg gttccggtgg tggctctggt tccggtgatt ttgattatga aaagatggca 960
aacgctaata agggggctat gaccgaaaat gccgatgaaa acgcgctaca gtctgacgct 1020
aaaggcaaac ttgattctgt cgctactgat tacggtgctg ctatcgatgg tttcattggt 1080
gacgtttccg gccttgctaa tggtaatggt gctactggtg attttgctgg ctctaattcc 1140
caaatggctc aagtcggtga cggtgataat tcacctttaa tgaataattt ccgtcaatat 1200
ttaccttccc tccctcaatc ggttgaatgt cgcccttttg tctttggcgc tggtaaacct 1260
tacgagttca gtatcgactg cgataagatc aacctgttcc gcggtgtctt tgcgtttctt 1320
ttatatgttg ccacctttat gtatgtattt tctacgtttg ctaacatact gcgtaataag 1380
gagtcttaat gaccatgatt acggattcac tggccgtcgt tttacaacgt cgtgactggg 1440
aaaaccctgg cgttacccaa cttaatcgcc ttgcagcaca tccccctttc gccagctggc 1500
gtaatagcga agaggcccgc accgatcgcc cttcccaaca gttgcgcagc ctgaatggcg 1560
aatggcgctt tgcctggttt ccggcaccag aagcggtgcc ggaaagctgg ctggagtgcg 1620
atcttcctga ggccgatact gtcgtcgtcc cctcaaactg gcagatgcac ggttacgatg 1680
cgcccatcta caccaacgtg acctatccca ttacggtcaa tccgccgttt gttcccacgg 1740
agaatccgac gggttgttac tcgctcacat ttaatgttga tgaaagctgg ctacaggaag 1800
gccagacgcg aattattttt gatggcgtta actcggcgta aaaagaggag aaatactaga 1860
tgaccatgat tacggattca ctggccgtcg ttttacaacg tcgtgactgg gaaaaccctg 1920
gcgttaccca acttaatcgc cttgcagcac atcccccttt cgccagctgg cgtaatagcg 1980
aagaggcccg caccgatcgc ccttcccaac agttgcgcag cctgaatggc gaatggcgct 2040
ttgcctggtt tccggcacca gaagcggtgc cggaaagctg gctggagtgc gatcttcctg 2100
aggccgatac tgtcgtcgtc ccctcaaact ggcagatgca cggttacgat gcgcccatct 2160
acaccaacgt gacctatccc attacggtca atccgccgtt tgttcccacg gagaatccga 2220
cgggttgtta ctcgctcaca tttaatgttg atgaaagctg gctacaggaa ggccagacgc 2280
gaattatttt tgatggcgtt aactcggcgt aatattgctg tcctttgaac caatgaatga 2340
tttgatgagc caaaaaaatg taatcaatat tgttgatgat aatattaaga agtaccacac 2400
ggaatatacc taaacttaat taacggcact cctcagcaaa tataatgacc ctcttgataa 2460
cccaagaggg cattttttaa tgcccatggc gtttaccaat gcttaatcag tgaggcacct 2520
atctcagcga tctgtctatt tcgttcatcc atagttgcct gactccccgt cgtgtagata 2580
actacgatac gggagggctt accatctggc cccagtgctg caatgatacc gcgagaccca 2640
cgctcaccgg ctccagattt atcagcaata aaccagccag ccggaagggc cgagcgcaga 2700
agtggtcctg caactttatc cgcctccatc cagtctatta attgttgccg ggaagctaga 2760
gtaagtagtt cgccagttaa tagtttgcgc aacgttgttg ccattgctac aggcatcgtg 2820
gtgtcacgct cgtcgtttgg tatggcttca ttcagctccg gttcccaacg atcaaggcga 2880
gttacatgat cccccatgtt gtgcaaaaaa gcggttagct ccttcggtcc tccgatcgtt 2940
gtcagaagta agttggccgc agtgttatca ctcatggtta tggcagcact gcataattct 3000
cttactgtca tgccatccgt aagatgcttt tctgtgactg gtgagtactc aaccaagtca 3060
ttctgagaat agtgtatgcg gcgaccgagt tgctcttgcc cggcgtcaat acgggataat 3120
accgcgccac atagcagaac tttaaaagtg ctcatcattg gaaaacgttc ttcggggcga 3180
aaactctcaa ggatcttacc gctgttgaga tccagttcga tgtaacccac tcgtgcaccc 3240
aactgatctt cagcatcttt tactttcacc agcgtttctg ggtgagcaaa aacaggaagg 3300
caaaatgccg caaaaaaggg aataagggcg acacggaaat gttgaatact catactcttc 3360
ctttttcaat attattgaag catttatcag ggttattgtc tcatgagcgg atacatattt 3420
gaatgtattt agaaaaataa acaaataggg gttccgcgca catttccccg aaaagtgcca 3480
cctgacgtct aagaaaccat tattatcatg acattaacct ataaaaatag gcgtatcacg 3540
aggcccttag gccaaatagg ccgttcagat ccttccgtat ttagccagta tgttctctag 3600
tgtggttcgt tgtttttgcg tgagccatga gaacgaacca ttgagatcat gcttactttg 3660
catgtcactc aaaaattttg cctcaaaact ggtgagctga atttttgcag ttaaagcatc 3720
gtgtagtgtt tttcttagtc cgttacgtag gtaggaatct gatgtaatgg ttgttggtat 3780
tttgtcacca ttcattttta tctggttgtt ctcaagttcg gttacgagat ccatttgtct 3840
atctagttca acttggaaaa tcaacgtatc agtcgggcgg cctcgcttat caaccaccaa 3900
tttcatattg ctgtaagtgt ttaaatcttt acttattggt ttcaaaaccc attggttaag 3960
ccttttaaac tcatggtagt tattttcaag cattaacatg aacttaaatt catcaaggct 4020
aatctctata tttgccttgt gagttttctt ttgtgttagt tcttttaata accactcata 4080
aatcctcata gagtatttgt tttcaaaaga cttaacatgt tccagattat attttatgaa 4140
tttttttaac tggaaaagat aaggcaatat ctcttcacta aaaactaatt ctaatttttc 4200
gcttgagaac ttggcatagt ttgtccactg gaaaatctca aagcctttaa ccaaaggatt 4260
cctgatttcc acagttctcg tcatcagctc tctggttgct ttagctaata caccataagc 4320
attttcccta ctgatgttca tcatctgagc gtattggtta taagtgaacg ataccgtccg 4380
ttctttcctt gtagggtttt caatcgtggg gttgagtagt gccacacagc ataaaattag 4440
cttggtttca tgctccgtta agtcatagcg actaatcgct agttcatttg ctttgaaaac 4500
aactaattca gacatacatc tcaattggtc taggtgattt taatcactat accaattgag 4560
atgggctagt caatgataat tactagtcct tttcctttga gttgtgggta tctgtaaatt 4620
ctgctagacc tttgctggaa aacttgtaaa ttctgctaga ccctctgtaa attccgctag 4680
acctttgtgt gttttttttg tttatattca agtggttata atttatagaa taaagaaaga 4740
ataaaaaaag ataaaaagaa tagatcccag ccctgtgtat aactcactac tttagtcagt 4800
tccgcagtat tacaaaagga tgtcgcaaac gctgtttgct cctctacaaa acagacctta 4860
aaaccctaaa ggcttaagta gcaccctcgc aagctcgggc aaatcgctga atattccttt 4920
tgtctccgac catcaggcac ctgagtcgct gtctttttcg tgacattcag ttcgctgcgc 4980
tcacggctct ggcagtgaat gggggtaaat ggcactacag gcgcctttta tggattcatg 5040
caaggaaact acccataata caagaaaagc ccgtcacggg cttctcaggg cgttttatgg 5100
cgggtctgct atgtggtgct atctgacttt ttgctgttca gcagttcctg ccctctgatt 5160
ttccagtctg accacttcgg attatcccgt gacaggtcat tcagactggc taatgcaccc 5220
agtaaggcag cggtatcatc aacaggctta cccgtcttac tgtcaagagg acatccggtc 5280
aaataaaacg aaaggctcag tcgaaagact gggcctttcg 5320
<210> 5
<211> 4849
<212> DNA
<213> artificial sequence
<400> 5
ttttgctgag gagacttagg gaccctacat aatacgactc actatagggg aaagacctgc 60
aggtgcagta aggaggaaaa aaaaatgaaa aaattattat tcgcaattcc tttagttgtt 120
cctttctatt ctcactccgc tgaaactgtt catcaccatc accatcacgc tgaaactgtt 180
gaaagttgtt tagcaaaacc ccatacagaa aattcattta ctaacgtctg gaaagacgac 240
aaaactttag atcgttacgc taactatgag ggctgtctgt ggaatgctac aggcgttgta 300
gtttgtactg gtgacgaaac tcagtgttac ggtacatggg ttcctattgg gcttgctatc 360
cctgaaaatg agggtggtgg ctctgagggt ggcggttctg agggtggcgg ttctgagggt 420
ggcggtacta aacctcctga gtacggtgat acacctattc cgggctatac ttatatcaac 480
cctctcgacg gcacttatcc gcctggtact gagcaaaacc ccgctaatcc taatccttct 540
cttgaggagt ctcagcctct taatactttc atgtttcaga ataataggtt ccgaaatagg 600
cagggggcat taactgttta tacgggcact gttactcaag gcactgaccc cgttaaaact 660
tattaccagt acactcctgt atcatcaaaa gccatgtatg acgcttactg gaacggtaaa 720
ttcagagact gcgctttcca ttctggcttt aatgaggatc cattcgtttg tgaatatcaa 780
ggccaatcgt ctgacctgcc tcaacctcct gtcaatgctg gcggcggctc tggtggtggt 840
tctggtggcg gctctgaggg tggtggctct gagggtggcg gttctgaggg tggcggctct 900
gagggaggcg gttccggtgg tggctctggt tccggtgatt ttgattatga aaagatggca 960
aacgctaata agggggctat gaccgaaaat gccgatgaaa acgcgctaca gtctgacgct 1020
aaaggcaaac ttgattctgt cgctactgat tacggtgctg ctatcgatgg tttcattggt 1080
gacgtttccg gccttgctaa tggtaatggt gctactggtg attttgctgg ctctaattcc 1140
caaatggctc aagtcggtga cggtgataat tcacctttaa tgaataattt ccgtcaatat 1200
ttaccttccc tccctcaatc ggttgaatgt cgcccttttg tctttggcgc tggtaaacct 1260
tacgagttca gtatcgactg cgataagatc aacctgttcc gcggtgtctt tgcgtttctt 1320
ttatatgttg ccacctttat gtatgtattt tctacgtttg ctaacatact gcgtaataag 1380
gagtcttaat gaccatgatt acggattcac tggccgtcgt tttacaacgt cgtgactggg 1440
aaaaccctgg cgttacccaa cttaatcgcc ttgcagcaca tccccctttc gccagctggc 1500
gtaatagcga agaggcccgc accgatcgcc cttcccaaca gttgcgcagc ctgaatggcg 1560
aatggcgctt tgcctggttt ccggcaccag aagcggtgcc ggaaagctgg ctggagtgcg 1620
atcttcctga ggccgatact gtcgtcgtcc cctcaaactg gcagatgcac ggttacgatg 1680
cgcccatcta caccaacgtg acctatccca ttacggtcaa tccgccgttt gttcccacgg 1740
agaatccgac gggttgttac tcgctcacat ttaatgttga tgaaagctgg ctacaggaag 1800
gccagacgcg aattattttt gatggcgtta actcggcgta atattgctgt cctttgaacc 1860
aatgaatgat ttgatgagcc aaaaaaatgt aatcaatatt gttgatgata atattaagaa 1920
gtaccacacg gaatatacct aaacttaatt aacggcactc ctcagcaaat ataatgaccc 1980
tcttgataac ccaagagggc attttttaat gcccatggcg tttaccaatg cttaatcagt 2040
gaggcaccta tctcagcgat ctgtctattt cgttcatcca tagttgcctg actccccgtc 2100
gtgtagataa ctacgatacg ggagggctta ccatctggcc ccagtgctgc aatgataccg 2160
cgagacccac gctcaccggc tccagattta tcagcaataa accagccagc cggaagggcc 2220
gagcgcagaa gtggtcctgc aactttatcc gcctccatcc agtctattaa ttgttgccgg 2280
gaagctagag taagtagttc gccagttaat agtttgcgca acgttgttgc cattgctaca 2340
ggcatcgtgg tgtcacgctc gtcgtttggt atggcttcat tcagctccgg ttcccaacga 2400
tcaaggcgag ttacatgatc ccccatgttg tgcaaaaaag cggttagctc cttcggtcct 2460
ccgatcgttg tcagaagtaa gttggccgca gtgttatcac tcatggttat ggcagcactg 2520
cataattctc ttactgtcat gccatccgta agatgctttt ctgtgactgg tgagtactca 2580
accaagtcat tctgagaata gtgtatgcgg cgaccgagtt gctcttgccc ggcgtcaata 2640
cgggataata ccgcgccaca tagcagaact ttaaaagtgc tcatcattgg aaaacgttct 2700
tcggggcgaa aactctcaag gatcttaccg ctgttgagat ccagttcgat gtaacccact 2760
cgtgcaccca actgatcttc agcatctttt actttcacca gcgtttctgg gtgagcaaaa 2820
acaggaaggc aaaatgccgc aaaaaaggga ataagggcga cacggaaatg ttgaatactc 2880
atactcttcc tttttcaata ttattgaagc atttatcagg gttattgtct catgagcgga 2940
tacatatttg aatgtattta gaaaaataaa caaatagggg ttccgcgcac atttccccga 3000
aaagtgccac ctgacgtcta agaaaccatt attatcatga cattaaccta taaaaatagg 3060
cgtatcacga ggcccttagg ccaaataggc cgttcagatc cttccgtatt tagccagtat 3120
gttctctagt gtggttcgtt gtttttgcgt gagccatgag aacgaaccat tgagatcatg 3180
cttactttgc atgtcactca aaaattttgc ctcaaaactg gtgagctgaa tttttgcagt 3240
taaagcatcg tgtagtgttt ttcttagtcc gttacgtagg taggaatctg atgtaatggt 3300
tgttggtatt ttgtcaccat tcatttttat ctggttgttc tcaagttcgg ttacgagatc 3360
catttgtcta tctagttcaa cttggaaaat caacgtatca gtcgggcggc ctcgcttatc 3420
aaccaccaat ttcatattgc tgtaagtgtt taaatcttta cttattggtt tcaaaaccca 3480
ttggttaagc cttttaaact catggtagtt attttcaagc attaacatga acttaaattc 3540
atcaaggcta atctctatat ttgccttgtg agttttcttt tgtgttagtt cttttaataa 3600
ccactcataa atcctcatag agtatttgtt ttcaaaagac ttaacatgtt ccagattata 3660
ttttatgaat ttttttaact ggaaaagata aggcaatatc tcttcactaa aaactaattc 3720
taatttttcg cttgagaact tggcatagtt tgtccactgg aaaatctcaa agcctttaac 3780
caaaggattc ctgatttcca cagttctcgt catcagctct ctggttgctt tagctaatac 3840
accataagca ttttccctac tgatgttcat catctgagcg tattggttat aagtgaacga 3900
taccgtccgt tctttccttg tagggttttc aatcgtgggg ttgagtagtg ccacacagca 3960
taaaattagc ttggtttcat gctccgttaa gtcatagcga ctaatcgcta gttcatttgc 4020
tttgaaaaca actaattcag acatacatct caattggtct aggtgatttt aatcactata 4080
ccaattgaga tgggctagtc aatgataatt actagtcctt ttcctttgag ttgtgggtat 4140
ctgtaaattc tgctagacct ttgctggaaa acttgtaaat tctgctagac cctctgtaaa 4200
ttccgctaga cctttgtgtg ttttttttgt ttatattcaa gtggttataa tttatagaat 4260
aaagaaagaa taaaaaaaga taaaaagaat agatcccagc cctgtgtata actcactact 4320
ttagtcagtt ccgcagtatt acaaaaggat gtcgcaaacg ctgtttgctc ctctacaaaa 4380
cagaccttaa aaccctaaag gcttaagtag caccctcgca agctcgggca aatcgctgaa 4440
tattcctttt gtctccgacc atcaggcacc tgagtcgctg tctttttcgt gacattcagt 4500
tcgctgcgct cacggctctg gcagtgaatg ggggtaaatg gcactacagg cgccttttat 4560
ggattcatgc aaggaaacta cccataatac aagaaaagcc cgtcacgggc ttctcagggc 4620
gttttatggc gggtctgcta tgtggtgcta tctgactttt tgctgttcag cagttcctgc 4680
cctctgattt tccagtctga ccacttcgga ttatcccgtg acaggtcatt cagactggct 4740
aatgcaccca gtaaggcagc ggtatcatca acaggcttac ccgtcttact gtcaagagga 4800
catccggtca aataaaacga aaggctcagt cgaaagactg ggcctttcg 4849
<210> 6
<211> 3601
<212> DNA
<213> artificial sequence
<400> 6
ttgagatcct ttttttctgc gctttttcca taggctccgc ccccctgaca agcatcacga 60
aatctgacgc tcaaatcagt ggtggcgaaa cccgacagga ctataaagat accaggcgtt 120
tccccctggc ggctccctcg tgcgctctcc tgttcctgcc tttcggttta ccggtgtcat 180
tccgctgtta tggccgcgtt tgtctcattc cacgcctgac actcagttcc gggtaggcag 240
ttcgctccaa gctggactgt atgcacgaac cccccgttca gtccgaccgc tgcgccttat 300
ccggtaacta tcgtcttgag tccagcccgg aaagacatgc aaaagcacca ctggcagcag 360
ccactggtaa ttgatttaga ggagttagtc ttgaagtcat gcgccggtta aggctaaact 420
gaaaggacaa gttttggtga ctgcgctcct ccaagccagt tacctcggtt caaagagctg 480
gtagctcaga gaaccttcga aaaaccgccc tgcaaggcgg ttttttcgtt ttcagagcaa 540
gagattacgc gcagaccaaa acgatctcaa gaagatcatc ttattaatcc tctgccagtg 600
ttacaaccac acgatacggg ttactgatga tgaacaagag gacatccggt caaataaaac 660
gaaaggctca gtcgaaagac tgggcctttc gttttgctga ggagacttag ggaccctact 720
aatacgactc actataggga gaaaggctaa taggtaccgg tgataccagc atcgtcttga 780
tgcccttggc agcaccctgc taaggtaaca acaagatgaa aaaattatta ttcgcaattc 840
ctttagtggt gcctttctat tctcactccg ctgaaactgt tcatcaccat caccatcacg 900
ctgaaactgt tgaaagttgt ttagcaaaac cccatacaga aaattcattt actaacgtct 960
ggaaagacga caaaacttta gatcgttacg ctaactatga gggctgtctg tggaatgcta 1020
caggcgttgt agtttgtact ggtgacgaaa ctcagtgtta cggtacatgg gttcctattg 1080
ggcttgctat ccctgaaaat gagggtggtg gctctgaggg tggcggttct gagggtggcg 1140
gttctgaggg tggcggtact aaacctcctg agtacggtga tacacctatt ccgggctata 1200
cttatatcaa ccctctcgac ggcacttatc cgcctggtac tgagcaaaac cccgctaatc 1260
ctaatccttc tcttgaggag tctcagcctc ttaatacttt catgtttcag aataataggt 1320
tccgaaatag gcagggggca ttaactgttt atacgggcac tgttactcaa ggcactgacc 1380
ccgttaaaac ttattaccag tacactcctg tatcatcaaa agccatgtat gacgcttact 1440
ggaacggtaa attcagagac tgcgctttcc attctggctt taatgaggat ccattcgttt 1500
gtgaatatca aggccaatcg tctgacctgc ctcaacctcc tgtcaatgct ggcggcggct 1560
ctggtggtgg ttctggtggc ggctctgagg gtggtggctc tgagggtggc ggttctgagg 1620
gtggcggctc tgagggaggc ggttccggtg gtggctcttc ccaaatggct caagtcggtg 1680
acggtgataa ttcaccttta atgaataatt tccgtcaata tttaccttcc ctccctcaat 1740
cggttgaatg tcgccctttt gtctttggcg ctggtaaacc ttacgagttc agtatcgact 1800
gcgataagat caacctgttc cgcggtgtct ttgcgtttct tttatatgtt gccaccttta 1860
tgtatgtatt ttctacgttt gctaacatac tgcgtaataa ggagtcttaa tggtcagtaa 1920
aggagaagaa cttttcactg gagttgtccc aattcttgtt gaattagatg gtgatgttaa 1980
tgggcacaaa ttttctgtca gtggagaggg tgaaggtgat gcaacatacg gaaaacttac 2040
ccttaaactg atttgcacta ctggaaaact acctgttcca tggccaacac ttgtcactac 2100
tctgggctat ggtctgcaat gctttgccag atacccagat catatgaaac agcatgactt 2160
tttcaagagt gccatgcccg aaggttatgt acaggaaaga actatatttt tcaaagatga 2220
cgggaactac aagacacgtg ctgaagtcaa gtttgaaggt gatacccttg ttaatagaat 2280
cgagttaaaa ggtattgatt ttaaagaaga tggaaacatt cttggacaca aattggaata 2340
caactataac tcacacaatg tatacatcac cgcagacaaa caaaagaatg gaatcaaagc 2400
caacttcaaa attagacaca acattgaaga tggaggcgtt caactagcag accattatca 2460
acaaaatact ccaattggcg atggccctgt ccttttacca gacaaccatt acctgtccta 2520
ccaatctgcc ctttcgaaag atcccaacga aaagagagac cacatggtcc ttcttgagtt 2580
tgtaacagct gctgggatta cacatggcat ggatgaacta tacaaataaa cttaattaac 2640
ggcactcctc agcaaatata atgaccctct tgataaccca agagggcatt ttttaatgcc 2700
catggcgttt atttgccgac taccttggtg atctcgcctt tcacgtagtg gacaaattct 2760
tccaactgat ctgcgcgcga ggccaagcga tcttcttctt gtccaagata agcctgtcta 2820
gcttcaagta tgacgggctg atactgggcc ggcaggcgct ccattgccca gtcggcagcg 2880
acatccttcg gcgcgatttt gccggttact gcgctgtacc aaatgcggga caacgtaagc 2940
actacatttc gctcatcgcc agcccagtcg ggcggcgagt tccatagcgt taaggtttca 3000
tttagcgcct caaatagatc ctgttcagga accggatcaa agagttcctc cgccgctgga 3060
cctaccaagg caacgctatg ttctcttgct tttgtcagca agatagccag atcaatgtcg 3120
atcgtggctg gctcgaagat acctgcaaga atgtcattgc gctgccattc tccaaattgc 3180
agttcgcgct tagctggata acgccacgga atgatgtcgt cgtgcacaac aatggtgact 3240
tctacagcgc ggagaatctc gctctctcca ggggaagccg aagtttccaa aaggtcgttg 3300
atcaaagctc gccgcgttgt ttcatcaagc cttacggtca ccgtaaccag caaatcaata 3360
tcactgtgtg gcttcaggcc gccatccact gcggagccgt acaaatgtac ggccagcaac 3420
gtcggttcga gatggcgctc gatgacgcca actacctctg atagttgagt cgatacttcg 3480
gcgatcaccg cttccctcat actcttcctt tttcaatatt attgaagcat ttatcagggt 3540
tattgtctca tgagcggata catatttgaa tgtatttaga aaaataggcc aaataggccg 3600
t 3601
<210> 7
<211> 4021
<212> DNA
<213> artificial sequence
<400> 7
cactcggtcg ctacgctccg ggcgtgagac tgcggcgggc gctgcggaca catacaaagt 60
tacccacaga ttccgtggat aagcagggga ctaacatgtg aggcaaaaca gcagggccgc 120
gccggtggcg tttttccata ggctccgccc tcctgccaga gttcacataa acagacgctt 180
ttccggtgca tctgtgggag ccgtgaggct caaccatgaa tctgacagta cgggcgaaac 240
ccgacaggac ttaaagatcc ccaccgtttc cggcgggtcg ctccctcttg cgctctcctg 300
ttccgaccct gccgtttacc ggatacctgt tccgcctttc tcccttacgg gaagtgtggc 360
gctttctcat agctcacaca ctggtatctc ggctcggtgt aggtcgttcg ctccaagctg 420
ggctgtaagc aagaactccc cgttcagccc gactgctgcg ccttatccgg taactgttca 480
cttgagtcca acccggaaaa gcacggtaaa acgccactgg cagcagccat tggtaactgg 540
gagttcgcag aggatttgtt tagctaaaca cgcggttgct cttgaagtgt gcgccaaagt 600
ccggctacac tggaaggaca gatttggttg ctgtgctctg cgaaagccag ttaccacggt 660
taagcagttc cccaactgac ttaaccttcg atcaaaccac ctccccaggt ggttttttcg 720
tttacagggc aaaagattac gcgcagaaaa aaaggatctc aagaagatcc tttgatcttt 780
tctactgaac cgctctagat ttcagtgcaa tttatctctt caaatgtagc acctgaagtc 840
agcccaggag gaagaggaca tccggtcaaa taaaacgaaa ggctcagtcg aaagactggg 900
cctttcgttt tagacttagg gaccctttat gacaacttga cggctacaat taaccctcac 960
taaagggaga aagacctgca ggtgcagtaa ggaggaaaaa aaaatgagca ctgcaattac 1020
acgccagatc gttctcgcta ccgcaaccac cggtatgaac cagattggtg cgcactatga 1080
aggccacaag atcattgaga ttggtgccgt tgaagtggtg aaccgtcgcc tgacgggcaa 1140
taacttccat gtttatctca aacccgatcg gctggtggat ccggaagcct ttggcgtaca 1200
tggtattgcc gatgaatttt tgctcgataa gcccacgttt gccgaagtag ccgatgagtt 1260
catggactat attcgcggcg cggagttggt gatccataac gcagcgttcg atatcggctt 1320
tatggactac gagttttcgt tgcttaagcg cgatattccg aagaccaata ctttctgtaa 1380
ggtcaccgat agccttgcgg tggcgaggaa aatgtttccc ggtaagcgca acagcctcga 1440
tgcgttatgt gctcgctacg aaatagataa cagtaaacga acgctgcacg gggcattact 1500
cgatgcccag atccttgcgg aagtttatct ggcgatgacc ggtggtcaaa cgtcgatggc 1560
ttttgcgatg gaaggagaga cacaacagca acaaggtgaa gcaacaattc agcgcattgt 1620
acgtcaggca agtaagttac gcgttgtttt tgcgacagat gaagagattg cagctcatga 1680
agcccgtctc gatctggtgc agaagaaagg cggaagttgc ctctggcgag cataatttaa 1740
tatcagtaaa ccggacataa cccatgaaga aaaatcgcgc ttttttgaag tgggcagggg 1800
gcaagtatcc cctgcttgat gatattaaac ggcatttgcc caagggcgaa tgtctggttg 1860
agccttttgt aggtgccggg tcggtgtttc tcaacaccga cttttctcgt tatatccttg 1920
ccgatatcaa tagcgacctg atcagtctct ataacattgt gaagatgcgt actgatgagt 1980
acgtacaggc cgcacgcgag ctgtttgttc ccgaaacaaa ttgcgccgag gtttactatc 2040
agttccgcga agagttcaac aaaagccagg atccgttccg tcgggcggta ctgtttttat 2100
atttgaaccg ctacggttac aacggcctgt gtcgttacaa tctgcgcggt gagtttaacg 2160
tgccgttcgg ccgctacaaa aaaccctatt tcccggaagc agagttgtat cacttcgctg 2220
aaaaagcgca gaatgccttt ttctattgtg agtcttacgc cgatagcatg gcgcgcgcag 2280
atgatgcatc cgtcgtctat tgcgatccgc cttatgcacc gctgtctgcg accgccaact 2340
ttacggcgta tcacacaaac agttttacgc ttgaacaaca agcgcatctg gcggagatcg 2400
ccgaaggtct ggttgagcgc catattccag tgctgatctc caatcacgat acgatgttaa 2460
cgcgtgagtg gtatcagcgc gcaaaattgc atgtcgtcaa agttcgacgc agtataagca 2520
gcaacggcgg cacacgtaaa aaggtggacg aactgctggc tttgtacaaa ccaggagtcg 2580
tttcacccgc gaaaaaataa ttcagctaag acactgcact ggattaagat gaaaacgatt 2640
gaagttgatg atgaactcta cagctatatt gccagccaca ctaagcatat cggcgagagc 2700
gcatccgaca ttttacggcg tatgttgaaa ttttccgccg catcacagcc tgctgctccg 2760
gtgacgaaag aggttcgcgt tgcgtcacct gctatcgtcg aagcgaagcc ggtcaaaacg 2820
attaaagaca aggttcgcgc aatgcgtgaa cttctgcttt cggatgaata cgcagagcaa 2880
aagcgagcgg tcaatcgctt tatgctgctg ttgtctacac tatattctct tgacgcccag 2940
gcgtttgccg aagcaacgga atcgttgcac ggtcgtacac gcgtttactt tgcggcagat 3000
gaacaaacgc tgctgaaaaa tggtaatcag accaagccga aacatgtgcc aggcacgccg 3060
tattgggtga tcaccaacac caacaccggc cgtaaatgca gcatgatcga acacatcatg 3120
cagtcgatgc aattcccggc ggaattgatt gagaaggttt gcggaactat ctaaacttaa 3180
ttaacggcac tcctcagcca agtcaaaagc ctccgaccgg aggcttttga ctacatgccc 3240
atggcgttta cgccccgccc tgccactcat cgcagtactg ttgtaattca ttaagcattc 3300
tgccgacatg gaagccatca caaacggcat gatgaacctg aatcgccagc ggcatcagca 3360
ccttgtcgcc ttgcgtataa tatttgccca tagtgaaaac gggggcgaag aagttgtcca 3420
tattggccac gtttaaatca aaactggtga aactcaccca gggattggct gagacgaaaa 3480
acatattctc aataaaccct ttagggaaat aggccaggtt ttcaccgtaa cacgccacat 3540
cttgcgaata tatgtgtaga aactgccgga aatcgtcgtg gtattcactc cagagcgatg 3600
aaaacgtttc agtttgctca tggaaaacgg tgtaacaagg gtgaacacta tcccatatca 3660
ccagctcacc gtctttcatt gccatacgga actccggatg agcattcatc aggcgggcaa 3720
gaatgtgaat aaaggccgga taaaacttgt gcttattttt ctttacggtc tttaaaaagg 3780
ccgtaatatc cagctgaacg gtctggttat aggtacattg agtaactgac tgaaatgcct 3840
caaaatgttc tttacgatgc cattgggata tatcaacggt ggtatatcca gtgatttttt 3900
tctccatttt agcttcctta gctcctgaaa atctcgataa ctcaaaaaat acgcccggta 3960
gtgatcttat ttcattatgg tgaaagttgg aacctcttac gtgccaagcc aaataggccg 4020
t 4021
Claims (10)
- 가시적인 연속 공간 유도 진화 방법에 있어서, 숙주가 고체 배양 공간에서 성장과 이동을 하는 바, 상기 숙주가 외래의 진화 대기 목표 유전자를 휴대하고 있으며, 상기 숙주 자체에는 목표 유전자의 진화를 보조하는 유전자 요소가 포함되고, 상기 목표 유전자는 상기 숙주의 성장 이동에 관련되며;
상기 숙주의 성장 이동 과정을 통하여, 상기 고체 배양 공간에서 서로 다른 공간 분포 형태를 형성하고, 선별을 하는 것에 의하여 진화 생성물을 취득하는 것을 특징으로 하는 가시적인 연속 공간 유도 진화 방법. - 제 1 항에 있어서,
상기 목표 유전자는 상기 숙주 유전자 그룹, 플라스미드 또는 상기 숙주의 소정의 기생 생물 중에 위치하는 것을 특징으로 하는 가시적인 연속 공간 유도 진화 방법. - 제 1 항에 있어서,
상기 기생 생물은 박테리오파지, 시아노파지, 동식물 바이러스, 진균 바이러스, 마이코플라스마, 클라미디아, 및 세균 중의 임의의 한 가지를 포함하는 것을 특징으로 하는 가시적인 연속 공간 유도 진화 방법. - 제 1 항에 있어서,
상기 기생 생물은 박테리오파지이며;
상기 숙주는,
상기 박테리오파지의 비결손체의 자연 숙주균;
상기 박테리오파지의 비결손체의 자연 숙주균이 유전자 조작을 거친 후에 취득한 균주;
유전자 조작을 거친 후에 취득한 감수성의 비자연 숙주균 중의 임의의 한 가지이며;
상기 숙주에는 대장간균, 파스퇴렐라균, 이질균, 슈도모나스균, 산토모나스균, 살모넬라균, 황색포도상구균, 및 유전자 조작으로 감수성을 개변시킨 조작 균주가 포함되며;
바람직하게는 상기 숙주는 F인자를 휴대한 대장간균이며;
상기 박테리오파지는 용원성 파지, 독성 파지 또는 만성 감염 파지이며;
상기 박테리오파지에는 사상 파지, T4 파지, T7 파지, λ 파지, P1 파지, P2 파지, P22 파지, φX174 파지와 SP6 파지가 포함되며;
바람직하게는, 상기 사상 파지에는 M13 사상 파지와 f1 사상 파지가 포함되는 것을 특징으로 하는 가시적인 연속 공간 유도 진화 방법. - 제 1 항에 있어서,
상기 목표 유전자는 한 가지 또는 여러 가지 단백질의 암호화 유전자와 비암호화 유전자의 조합이며;
상기 목표 유전자는 T7 RNA 중합효소 유전자, 단백질 분해효소 유전자, 섬유소 분해 효소 유전자, 형광 단백질 유전자, 및 정족수 감지 유전자 중의 한 가지 또는 여러 가지로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 가시적인 연속 공간 유도 진화 방법. - 제 1 항에 있어서,
상기 목표 유전자의 진화를 보조하는 유전자 요소는 돌연변이를 유도하는 플라스미드이고, 상기 돌연변이를 유도하는 플라스미드는 진화 전후의 목표 유전자를 통하여 발현을 프로모트하거나 또는 발현을 유도하는 것을 특징으로 하는 가시적인 연속 공간 유도 진화 방법. - 제 6 항에 있어서,
상기 돌연변이를 유도하는 플라스미드에는 돌연변이 유발 유전자가 포함되고, 상기 돌연변이 유발 유전자는, 제12와 14 자리 아미노산이 Ala로 돌변하는 DNAQ 유전자 돌연변이체 DNAQ926 유전자, 데옥시아데노신 메틸라아제 dam 유전자, 헤미메틸화 GATC 결합 단백질 seqA 유전자, 활성화 유도된 사이토신 디아미나아제 유전자 AID, 박테리오파지 PBS2 중의 우라실 DNA 글리코실라아제 억제 유전자 Ugi, 및 전사 억제 인자 emrR 중의 적어도 한 가지로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 가시적인 연속 공간 유도 진화 방법. - 제 1 항에 있어서,
상기 고체 배양 공간에는 2차원 평면 배양 구조와 3차원 공간 배양 구조가 포함되며;
상기 고체 배양 공간의 수직 방향 위의 이동 진화는 정기적으로 고체 주입 배양 체계를 구성하는 것을 통하여 연속성을 유지하며;
상기 유도 진화는 고효율 진화이며;
상기 고효율 진화는 복수 그룹의 고체 배양 공간을 선택 사용하거나 또는 고체 배양 공간의 서로 다른 위치에서 구현되는 것을 특징으로 하는 가시적인 연속 공간 유도 진화 방법. - 제 4 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 목표 유전자와 상기 숙주 성장 이동은 보조 플라스미드를 통하여 서로 연관되고, 상기 보조 플라스미드에는 적어도 제 1 보조 플라스미드가 포함되며, 상기 제 1 보조 플라스미드는 보조 플라스미드 CCP1 또는 보조 플라스미드 CCP2이고, 상기 보조 플라스미드 CCP1의 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO: 3에 표시된 바와 같고, 상기 보조 플라스미드 CCP2의 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO: 4에 표시된 바와 같으며;
상기 보조 플라스미드에는 제 2 보조 플라스미드가 더 포함되고, 상기 제 2 보조 플라스미드는 보조 플라스미드 CCP3 또는 보조 플라스미드 CCP4이며;
상기 보조 플라스미드 CCP3의 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO: 5에 표시된 바와 같은 것을 특징으로 하는 가시적인 연속 공간 유도 진화 방법. - 제 9 항에 있어서,
상기 유도 진화는 서로 다른 숙주를 사용하여 교체로 진행하고, 다음번 숙주에 포함된 박테리오파지의 증식을 지지하는 유전자 요소에는 진화 후의 박테리오파지의 증식을 지지하는 보조 플라스미드와 진화 전의 박테리오파지의 증식을 억제하는 보조 플라스미드가 포함되는 것을 특징으로 하는 가시적인 연속 공간 유도 진화 방법.
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201711446362.3 | 2017-12-27 | ||
| CN201711446362.3A CN109971693A (zh) | 2017-12-27 | 2017-12-27 | 一种可视的连续空间定向进化方法 |
| PCT/CN2017/120164 WO2019127474A1 (zh) | 2017-12-27 | 2017-12-29 | 一种可视的连续空间定向进化方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR20200107967A true KR20200107967A (ko) | 2020-09-16 |
Family
ID=67064229
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1020207020013A KR20200107967A (ko) | 2017-12-27 | 2017-12-29 | 가시적인 연속 공간 유도 진화 방법 |
Country Status (6)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US11702764B2 (ko) |
| EP (1) | EP3733853A4 (ko) |
| JP (2) | JP7275141B2 (ko) |
| KR (1) | KR20200107967A (ko) |
| CN (1) | CN109971693A (ko) |
| WO (1) | WO2019127474A1 (ko) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN115029363B (zh) * | 2021-03-05 | 2023-10-03 | 江南大学 | 一种体内连续定向进化系统及其应用 |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP5530347B2 (ja) | 2010-12-20 | 2014-06-25 | 富士フイルム株式会社 | 印刷用液体容器、印刷用液体充填済み容器、画像形成装置及び印刷用液体充填済み容器の製造方法 |
| EP2655614B1 (en) | 2010-12-22 | 2017-03-15 | President and Fellows of Harvard College | Continuous directed evolution |
| CN107418964B (zh) * | 2016-05-24 | 2021-04-20 | 中国科学院深圳先进技术研究院 | 一种噬菌体辅助的多细菌连续定向进化系统和方法 |
-
2017
- 2017-12-27 CN CN201711446362.3A patent/CN109971693A/zh active Pending
- 2017-12-29 EP EP17936940.0A patent/EP3733853A4/en active Pending
- 2017-12-29 WO PCT/CN2017/120164 patent/WO2019127474A1/zh unknown
- 2017-12-29 KR KR1020207020013A patent/KR20200107967A/ko active IP Right Grant
- 2017-12-29 JP JP2020535029A patent/JP7275141B2/ja active Active
-
2020
- 2020-06-17 US US16/904,549 patent/US11702764B2/en active Active
-
2023
- 2023-05-02 JP JP2023076039A patent/JP2023123415A/ja active Pending
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP2023123415A (ja) | 2023-09-05 |
| WO2019127474A1 (zh) | 2019-07-04 |
| JP2021508461A (ja) | 2021-03-11 |
| EP3733853A1 (en) | 2020-11-04 |
| US11702764B2 (en) | 2023-07-18 |
| US20200332282A1 (en) | 2020-10-22 |
| CN109971693A (zh) | 2019-07-05 |
| JP7275141B2 (ja) | 2023-05-17 |
| EP3733853A4 (en) | 2021-10-13 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| DK3108014T3 (en) | Methods and systems for rapid detection of microorganisms using recombinant bacteriophage | |
| AU684524B2 (en) | Tight control of gene expression in eucaryotic cells by tetracycline-responsive promoters | |
| US6252136B1 (en) | Transgenic organisms having tetracycline-regulated transcriptional regulatory systems | |
| DK2718440T3 (en) | NUCLEASE ACTIVITY PROTEIN, FUSION PROTEINS AND APPLICATIONS THEREOF | |
| US6783756B2 (en) | Methods for regulating gene expression | |
| WO2017165859A1 (en) | Modified viral capsid proteins | |
| CN107429241A (zh) | Dna敲入系统 | |
| US6197502B1 (en) | Expression cloning processes for the discovery characterization, and isolation of genes encoding polypeptides with a predetermined property | |
| CN109563505A (zh) | 用于真核细胞的组装系统 | |
| WO2018226602A1 (en) | Enhanced modified viral capsid proteins | |
| CN114127274A (zh) | 新型omni-50 crispr核酸酶 | |
| KR20190050991A (ko) | 정의된 서열 및 길이의 dna 단일 가닥 분자의 확장 가능한 생명공학적 생산 | |
| CN110628761A (zh) | 一种基于细菌內源末端连接系统的基因组编辑方法 | |
| CN110669779A (zh) | 一种基于细菌內源同源重组系统的基因组编辑方法 | |
| CN103314105B (zh) | 具有增强的稳定性和增强的保留催化活性的变体重组β-葡萄糖脑苷脂酶蛋白 | |
| Schachtner et al. | Tissue inducible Lifeact expression allows visualization of actin dynamics in vivo and ex vivo | |
| KR20200107967A (ko) | 가시적인 연속 공간 유도 진화 방법 | |
| Nandadasa et al. | A new mouse mutant with cleavage-resistant versican and isoform-specific versican mutants demonstrate that proteolysis at the Glu441-Ala442 peptide bond in the V1 isoform is essential for interdigital web regression | |
| CA2055500A1 (en) | Expression of polypeptides | |
| US20040087029A1 (en) | Production of viral vectors | |
| CN107287236B (zh) | 一种人急性胰腺炎小鼠模型的构建方法 | |
| CA2539262C (en) | Promoter for the epidermis-specific transgenic expression in plants | |
| WO2002038613A2 (en) | Modified recombinase | |
| KR20140043890A (ko) | 조절된 유전자 발현 시스템 및 그의 작제물 | |
| US6090629A (en) | Efficient construction of gene targeting using phage-plasmid recombination |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A201 | Request for examination | ||
| E902 | Notification of reason for refusal | ||
| AMND | Amendment | ||
| E902 | Notification of reason for refusal | ||
| AMND | Amendment | ||
| E601 | Decision to refuse application | ||
| AMND | Amendment | ||
| E902 | Notification of reason for refusal | ||
| AMND | Amendment | ||
| X701 | Decision to grant (after re-examination) |