KR20200105860A - 파지 테일 길이 테이프 메져 단백질로부터의 면역원성 서열, 그를 발현하는 박테리아, 및 암 치료에서의 그의 용도 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 항암 치료의 프로바이오틱 아주반트 첨가 분야에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 암 치료의 효율적인 아주반트로서 확인된, 박테리아에 존재하는 프로파지로부터의 면역원성 서열에 관한 것이다. 본 발명은 항암 의료품을 증가시키기 위한, 상기 프로파지로부터 면역원성 서열을 발현하는 박테리아 조성물, 상기 서열을 포함하는 면역원성 조성물, 및 상기 프로파지로부터의 서열을 이용하는 방법을 제공한다.

Description

파지 테일 길이 테이프 메져 단백질로부터의 면역원성 서열, 그를 발현하는 박테리아, 및 암 치료에서의 그의 용도
본 발명은 항암 치료의 프로바이오틱 아주반트 첨가(adjuvantization) 분야에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 암 치료의 효율적인 아주반트로서 확인된, 박테리아에 존재하는 프로파지로부터의 면역원성 서열에 관한 것이다. 본 발명은 항암 의료품을 증가시키기 위한, 상기 프로파지로부터 면역원성 서열을 발현하는 박테리아 조성물, 및 상기 프로파지의 서열을 이용하는 방법을 제공한다.
암 발생 및 진행은 유전자 조절과 환경 사이의 복잡한 상호작용으로부터 발생하게 된다 (Hanahan and Weinberg, 2011). 종양에 침투하는 면역 세포의 밀도, 조성, 및 기능 상태가 환자 예후 뿐만 아니라, 아주반트 또는 네오아주반트 화학요법 (Ingold Heppner et al., 2016; Palucka and Coussens, 2016)에 대한, 및 면역 체크포인트 차단제 (Hodi et al., 2010; Ribas, 2015; Robert et al., 2015)에 대한 치료 반응을 지배한다고 밝힌 다수의 연구에 의해 제시된 바와 같이, 다수의 상피성 및 조혈 신생물은 강력한 면역감시하에 있는 것으로 간주된다. 면역 이펙터에 의한 암 세포의 인식은 2가지 파라미터, 즉, 항원성 (돌연변이화된 단백질을 생성하는 돌연변이로부터 유래된 종양 연관 항원의 존재, 또는 정상적으로는 오직 배아 발생에만, 또는 고환에만 존재하는 유전자/단백질의 이소성 발현), 및 아주반트성 (선천 면역 이펙터를 활성화시키는 공동 자극 신호의 존재)에 의존한다 (Zitvogel et al., 2016). 장 뿐만 아니라, 신체 다른 위치에 서식하는 공생 미생물 군집은 아직은 특징화된 환경 신호를 제공하지 못하고 있음에 따라 장 및 장외 발암에서의 역할이 진가를 인정받지 못하고 있는 것처럼 보인다 (Zitvogel et al., 2015). 무균, 기지균외 무감염 상태의, 또는 항생제 처리된 설치류에서 수행된 선구적 연구를 통해 염증의 역할과 상관없이, 종양발생에서의 공생생물의 예상치 못한 역할이 밝혀졌다. 결장암 또는 간암종 발생에서, 미생물은 독성 대사산물인 발암성 대사산물을 제공함으로써 또는 염증 환경을 유도하여 결국에는 게놈 불안정 및/또는 DNA 손상 반응 및/또는 면역 회피에 이르게 함으로써 (Garrett, 2015; Gur et al., 2015; Louis et al., 2014) 직접적인 형질전환 작용물질이 될 수 있다 (Abreu and Peek, 2014; Sears and Garrett, 2014). 공생생물은 또한 암 랜드스케이프를 다시 정의하면서, 교차-급식 또는 교차 대사를 촉진시키는 협동 바이오필름을 형성할 수 있다 (Bongers et al., 2014; Dejea et al., 2014). 최근, 장외 (유방 및 난소) 신생물의 발생이 장 미생물에 의해 유발된, TLR5 매개 IL-6 또는 IL-17 유도된 전신 염증과 연관이 있었다 (Rutkowski et al., 2015).
그에 반해, 다른 관찰결과는 암 퇴치에서의 박테리아의 유익한 역할을 뒷받침한다. 프로토온코진 HER2/neu 유도 트랜스제닉 마우스에서 메트로니다졸 및 시프로플록사신의 조합을 이용한 장기간의 항생제 처리는 후속하여 유방암 (BC) 발병률을 3배로 배가 시켰다 (Rossini et al., 2006). 인간에서의 역학 연구는 항생제 사용과 BC 위험 사이의 용량 의존적 방식의 연관을 제안한다 (Blaser, 2011). 장 미생물총의 유익한 역할은, 입양 T 세포 전달의 효능을 촉진시킨 항원 제시 세포의 LPS/TLR4 의존 활성화를 촉진시키는 전신 방사선 조사를 통해 최초로 밝혀졌다 (Paulos et al., 2007). 백금 기반 항암 요법 및 면역조정 요법 동안, 박테리아-연관 TLR4 효능제는 종양 침윤 골수 세포의 ROS 및 TNFα 매개 항종양 효과의 원인이 되었다 (Iida et al., 2013).
알킬화제인 시클로포스파미드 (CTX)의 규칙적인 투약의 항종양 효능은 또한 광범위한 항생제 (ATB)로 처리된 무균 또는 특정 병원체 부재 동물에서 약화되는 것으로 나타났다 (Daillere et al., 2016; Viaud et al., 2013). 실제로, CTX는 장 장벽의 완전성을 변경시켜 독특한 그람+ 박테리아의 이동을 촉진시켰다. 박테리아 이동은 공생 장 미생물이 장 점막을 통해 멸균 상태인 기저 조직 및 기관으로 침범할 때 발생한다. 이러한 현상을 통해 그람+ 박테리아는 이펙터 병원성 CXCR3+CCR6+ (IL-17+IFNg+) Th17 (병원성 pTh17로 약칭) 및 종양 제어와 연관된 기억 Th1 면역 반응을 증가시킬 수 있다. E. 히라에(E. hirae) 및 바르네시엘라 인테스티니호미니스(Barnesiella intestinihominis)는 협력하여 CTX 이후에 종양 미세환경을 재형상화하는 종인 것으로 확인되었다. 소장에 상주하는 그람+ 박테리아 E. 히라에는 종양 항원 특이적, MHC 클래스 I-제한 세포독성 IFNγ+ CD8+ T 세포 (CTL), 종양내 조절 T 세포 (Treg) 감소를 유도하였고, 통상 종양 제어와 연관된 CTL/Treg 비를 증가시켰다. 결장에 상주하는 그람- B. 인테스티니호미니스(B. intestinihominis)는 전신 다기능성 Tc1/Th1 반응을 증강시키고, 종양내 IFNγ 생산 γδT 세포를 부활시키고, 종양 제어와 연관된 특질인, 종양 미세환경내 γδT17 세포를 감소시켰다. 이러한 두 면역원성 공생생물은, (B. 인테스티니호미니스의 경우) 박테리아 축적을, 또는 (E. 히라에의 경우) 제2 림프계 기관으로의 이동을 제한하는 장 NOD2 수용체에 의해 억제된다. 추가로, CTX + 암 백신 (HPV-16 E7 항원과 융합된 쉬가(Shiga) 독소의 B 서브유닛)은 항생제 처리와 조합된 경우, E7-발현 TC-1 종양으로부터 숙주를 더 이상 방어하지 못하였지만, L. 존소니이(L. johnsonii)도 E. 콜라이(E. coli)도 아닌) E. 히라에를 이용한 경구 위관영양이 E7 사량체-결합 CD8+ CTL 축적을 회복시켜 종양 거부를 유도하였다. 상기 모델에서, E. 히라에는 항종양 효과를 매개하였다. 마지막으로, 마우스에서 이들 두 공생생물의 면역조정 역할은 암 보유 환자와 연관이 있다. E. 히라에 또는 B. 인테스티니호미니스 (및 9개의 다른 공생생물 예외)에 대한 기억 MHC 클래스 II-제한 Th1 면역 반응은 이전에 화학요법으로 치료받았던 말기 폐암 및 난소암 환자에서의 무진행 생존기간 연장과 연관이 있었다 (Daillere et al., 2016). 최근, 지트보겔(Zitvogel) 등은 상기 관찰결과를 면역 체크포인트 차단제로 확장시킴으로써 박테로이달레스(Bacteroidales) 목 및 부르크홀데리알레스(Burkholderiales) 목 또는 비피도박테리알레스(Bifidobacteriales) 목에 속하는 독특한 장 박테리아 종이 종양 미세환경에 영향을 줌으로써 각각 항-CTLA4 또는 항-PDL-1 Ab의 효능에 기여하였다는 것을 입증하였다 (Sivan et al., 2015; Vetizou et al., 2015). 그러므로, 장 미생물총 생태계는 장 면역 항상성 뿐만 아니라, 제2 림프계 기관의 염증/면역 조정을 제어함으로써 신체 전역에 걸쳐 종양 미세환경을 형상화하는 것으로 가정된다.
이동된 그람+ 박테리아와 CTX 유도 살종양 활성 사이의 인과 관계를 입증하기 위해, 다일레르(Daillere) 등은 14일 ATB 요법에 의해 디스바이오틱(dysbiotic) MCA205 육종 보유자에서 109 E. 히라에 (클론 13144 및 다른 분리주), L. 존소니이 또는 대조군 박테리아를 이용하여 마우스 장에서 콜로니를 형성하였다. ATB는 CTX에 의해 매개되는 종양 진행 제어를 방해하였다. 그러나, E. 히라에 균주 13144 (EH13144)를 이용한 경구 위관영양은 CTX-매개 항종양 효과를 선택적으로 회복시킨 반면, L. 존소니이, E. 콜라이 또는 L. 플란타룸(L. plantarum) 분리주는 장 콜로니화가 유사함에도 불구하고, 상기와 같이 회복시키지 못했다 (Daillere et al., 2016). 이어서, 다일레르 등은 CTX에 의해 매개되는 항종양 효과를 증강시킬 수 있는 가장 우수한 항암 프로바이오틱을 선택하고, 그가 발생되도록 한 기전을 다루고, 각종 E. 히라에 균주를 시험하여 생체내에서의 그의 차별적인 면역원성 및 그의 "온코마이크로바이오틱(oncomicrobiotic)" (항암 프로바이오틱) 특성에 대해 분석하였다. rep-PCR에 의해 수행된, 상기 E. 히라에 분리주 사이의 클로날 관계에 관한 조사 결과, 인간, 마우스, 또는 환경 생태계로부터 유래된 균주들 사이에 상당한 게놈 다양성이 있는 것으로 밝혀졌다 (Daillere et al., 2016). 분리주 중 절반은 pTh17 및 Th1 면역 반응을 유도하였고; 단 하나의 인간 분리주 (클론 708)만이 일부 온코마이크로바이오틱 특성과 연관된 나이브 마우스에서 IFNg 생산 CD8+ T (Tc1) 세포를 유도하였다. 부착 검정법에서 생체외 바이오필름을 형성할 수 있는 E. 히라에의 유일의 인간 분리주 (클론 EH17)는 면역원성 특성도, 온코마이크로바이오틱 특성도 보유하지 않았다 (Daillere et al., 2016).
문헌 [Daillere et al. (2016)]의 공개 이래로, 본 발명자들은 면역원성이 높고, 인간 대변으로부터 유래된 것으로서, 항종양 효과를 보인, E. 히라에 (EH)의 3개의 신규 클론 (클론 IGR7, 클론 IGR4 및 클론 IGR11)을 단리시켰다.
요약하면, EH13144, EH 클론 IGR7, 및 그보다 정도는 덜하지만, 클론 IGR4 및 클론 IGR11은, 암 항원 특이적 CTL 반응 및 온코마이크로바이오틱 특성과 연관이 있는, CTX로 처리된 동물의 제2 림프계 기관에서 pTh17 세포를 유도할 수 있는 상당한 능력을 발휘한 반면, EH17 균주는 그렇지 못했다. 그러나, 이러한 차이가 나는 이유에 대해서는 알려진 바 없으며, 본 발명자들은 암 치료에서 유용한 새로운 분자 또는 미생물을 얻기 위하여 뮤린 균주 EH13144 및 인간 클론 IGR4, IGR7 및 IGR11의 면역원성 특성을 담당하는 인자(들)를 확인하고자 하는 그들의 연구를 계속 진행하였다.
본 발명자들은 인간 환자의 대변으로부터 배양된 수개의 인간 E. 히라에 분리주를 스크리닝하고, 상기 분리주를 인간 EH708 및 마우스 EH13144와 비교하였다. 본 발명자들은 항-PD1 Ab에 반응한 비소세포 폐암 환자의 대변으로부터 E. 히라에의 11개의 신규한 분리주를 배양하였다. CTX와 함께 MCA205 종양 모델에서 시험된 이들 11개의 신규한 분리주 중 클론 IGR4, 클론 IGR11, 및 클론 IGR7도 어느 정도까지는 단독으로, 또는 최선으로는 조합되었을 때에 CTX와 시너지 효과를 내는 데 효과적이었다.
본 발명자들은 마우스 EH13144가 인간 클론 IGR7과 매우 높은 서열 상동성을 공유하고 (>20 EH 균주의 덴드로그램에서 동일한 클레이드로 분류되고), 이 둘 모두는 그의 게놈 서열 내로 삽입된 파지의 존재와 관련하여 고유의 면역원성을 갖는 매우 특수한 분리주라는 것을 발견하게 되었다. 본 발명자들은 면역원성이 약독성(temperate) 박테리오파지 테일 테이프 메져 단백질(tape measure protein: TMP)에 의존한다는 것을 확인하였다. 추가로, EH13144 + 클론 IGR4 + 클론 IGR7의 조합이 CTX와 조합된 상가적 항종양 효과를 보였다.
제1 측면에 따라, 본 발명은
(i) 2013년 11월 7일에 번호 I-4815 하에 콜렉션 내셔널 드 컬처즈 드 마이크로오가니즘즈(Collection Nationale de Cultures de Microorganismes: CNCM)에 기탁된 엔테로코쿠스 히라에(Enterococcus hirae) 균주 13144 (EHFS001로도 공지),
(ii) 2017년 8월 31일에 번호 I-5224 하에 CNCM에 기탁된 엔테로코쿠스 히라에 균주 IGR7,
(iii) 2017년 11월 27일에 번호 I-5261 하에 CNCM에 기탁된 엔테로코쿠스 히라에 균주 IGR11,
(iv) 서열식별번호 1의 단백질 (즉, 엔테로코쿠스 히라에 균주 13144, CNCM I-4815의 출중한 면역원성 특성을 담당하는 것으로 확인된 프로파지의 TMP)로부터의 적어도 20개, 바람직하게는 적어도 30개 및 더욱 바람직하게는 적어도 40개 뉴클레오티드의 단편과 적어도 65%, 바람직하게는 적어도 80% 및 더욱 바람직하게는 적어도 95%의 동일성을 갖는 단백질을 발현하는 임의의 다른 박테리아 균주, 및
(v) (i) 내지 (iv)에서 언급된 균주들 중 적어도 2개의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 박테리아를 포함하는 박테리아 조성물에 관한 것이다.
본 발명은 또한 암 치료를 위한 상기 박테리아 조성물의 용도에 관한 것이다.
한 실시양태에 따라, 본 발명에 따른 조성물은 암 치료를 위해 항신생물성 약물과 조합하여 사용된다.
또 다른 측면에 따라, 본 발명은 시험관내에서 관심의 대상이 되는 항암 박테리아 균주 내로 면역원성인 것으로 확인된 서열식별번호 1의 단백질, 또는 그의 단편, 예컨대, 적어도 서열식별번호 13 및 14의 펩티드를 포함하는 단편을 코딩하는 뉴클레오티드 서열, 또는 인간 HLA 분자에 의해 제시될 수 있는 가능성이 있는 에피토프, 예컨대, 서열식별번호 53 내지 187로 이루어진 군으로부터 선택되는 에피토프 중 적어도 하나를 포함하는 적어도 9개, 바람직하게는 적어도 20개의 아미노산의 펩티드를 코딩하는 서열을 도입하는 단계를 포함하는, 관심의 대상이 되는 항암 박테리아 균주의 면역원성을 증가시키는 방법에 관한 것이다.
상기 방법에 의해 수득된 박테리아 균주 뿐만 아니라, 암 치료에서의 그의 용도도 또한 본 발명의 일부이다.
본 발명은 또한 항암 백신으로서 사용하기 위한, 서열식별번호 1의 TMP로부터의 적어도 9개의 연속 아미노산의 서열을 포함하는 폴리펩티드 또는 그를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 면역원성 조성물에 관한 것이다.
또 다른 측면에 따라, 본 발명은 생체외에서 본 발명에 따른 박테리아 조성물 또는 면역원성 조성물로 펄싱된 항원 제시 세포 (APC)를 포함하는 세포 조성물에 관한 것이다.
한 실시양태에 따라, 본 발명은 MHC 분자가 서열식별번호 53-187로 이루어진 군으로부터 선택되는 에피토프에 결합하는 것인, 서열식별번호 1의 단백질에 대하여 높은 친화성을 갖는 T 세포를 단리시키기 위한 MHC 다량체에 관한 것이다.
본 발명은 또한 박테리오파지 조성물이며, 여기서 상기 박테리오파지는 서열식별번호 1의 단백질과 적어도 80%, 바람직하게는 적어도 90% 및 더욱 바람직하게는 적어도 95%의 동일성을 갖는 단백질을 발현하는 것인 박테리오파지 조성물, 및 암 치료를 위한 그의 용도에 관한 것이다.
한 실시양태에 따라, 본 발명은 서열식별번호 1의 단백질을 포함하는 파지의 용균 주기를 일으키는 약물 후보의 능력에 대해 평가하기 위해 균주 CNCM I-4815로부터의 박테리아를 사용하는 단계를 포함하는, 항신생물성 약물을 확인하기 위한 스크리닝 방법에 관한 것이다.
본 발명은 또한 환자로부터의 생물학적 샘플 중에 서열식별번호 1의 단백질과 적어도 80%의 동일성을 갖는 서열의 존재에 대해 평가하는 단계를 포함하고, 여기서 상기 서열이 샘플 중에 존재한다면, 상기 환자는 치료에 대하여 반응할 가능성이 있는 것인, 환자가 화학요법 또는 면역 체크포인트 차단에 의한 치료에 대하여 양호한 반응자가 될 가능성이 있는지 여부를 결정하는 방법에 관한 것이다.
본 발명은 또한 화학요법 또는 면역 체크포인트 차단에 의한 치료 동안 순환 CCR9+CXCR3+ CD8+ T 세포의 수준을 측정하는 단계를 포함하고, 여기서 상기 수준이 미리 결정된 임계치를 초과한다면, 환자는 치료에 대하여 반응할 가능성이 있는 것인, 환자가 화학요법 또는 면역 체크포인트 차단에 의한 치료에 대하여 양호한 반응자가 될 가능성이 있는지 여부를 결정하는 방법에 관한 것이다.
도 1. 실험 세팅. (a) 마우스를 대변 미생물총 이식 (FMT)을 수행하기 전 3일 동안 광범위한 항생제 (스트렙토마이신, 콜리스틴, 암피실린 및 반코마이신)로 처리한다. FMT 후 14일 경과하였을 때, MCA-205 육종 세포주를 마우스의 우측 옆구리 (8.105개의 세포/마우스)에 접종한다. 종양 접종 후 5일째를 시작으로 총 3회 주사를 위해 화학요법 (시클로포스파미드, CTX - 100 mg/kg) 또는 염수 용액 (NaCl)을 매주 ip 주사한다. CTX 주사 당일 뿐만 아니라, 그 다음 날, E. 히라에 균주 13144 (1.109개의 박테리아)의 경구 위관영양을 수행한다. (b) 비 FMT-처리 SPF 마우스를 대조군으로서 사용한다.
도 2. FMT BC 환자 1에 의한 디스바이오시스(dysbiosis): CTX에 의해 매개되는 항종양 효과를 회복시키는 E. 히라에 13144의 효과. 3 사이클로 CTX 대 NaCl 주사를 맞은 SPF 마우스 (a) 대 FMT 처리된 마우스 (b)에서의 MCA-205 육종의 종양 성장 곡선. (c) FMT 처리된 마우스에서의 균주 E. 히라에 13144, 또는 대조군으로서 NaCl의 경구 위관영양 이후의 MCA-205 육종의 종양 성장 곡선. 2회의 독립 실험이 도시되어 있다. (d) 균주 E. 히라에 13144의 경구 위관영양 이후의 CTX 또는 NaCl로 처리된 FMT 처리된, MCA-205 육종 보유 마우스의 전체 생존. 각 군당 마우스 6마리에 대한 전형적인 생존 곡선이 도시되어 있다. (e) 2회의 독립 실험으로부터 획득한, CTX 후 21일째 종양 크기의 연결 데이터가 제시되어 있다. Anova & 스튜던츠 t 검정 통계 분석: *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001.
도 3. FMT BC 환자 2에 의한 디스바이오시스를 나타내지 않는 경우: E. 히라에 13144는 CTX에 의해 매개되는 항종양 효과를 호전시킨다. 3 사이클로 CTX 대 NaCl 주사를 맞은 SPF 마우스 (a) 대 FMT 처리된 마우스 (b)에서의 MCA-205 육종의 종양 성장 곡선. (c) FMT 처리된 마우스에서의 균주 E. 히라에 13144, 또는 대조군으로서 NaCl의 경구 위관영양 이후의 MCA-205 육종의 종양 성장 곡선. 2회의 독립 실험이 도시되어 있다. (d) 2회의 독립 실험으로부터 획득한, CTX 후 21일째 종양 크기의 연결 데이터가 제시되어 있다. Anova & 스튜던츠 t 검정 통계 분석: *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001.
도 4. E. 히라에 IGR1, IGR10 및 10815는 디스바이오틱 FMT 세팅에서 CTX 살종양 활성을 효율적으로 증가시키지 못했다. FMT 처리된 마우스에서의 균주 E. 히라에 13144 (a), IGR1 (b) 또는 대조군으로서 NaCl의 경구 위관영양 이후의 MCA-205 육종의 종양 성장 곡선. 각 군당 마우스 6마리에 대한 전형적인 곡선이 도시되어 있다. (c) 1-2회의 독립 실험으로부터 획득한, CTX 후 17일째 종양 크기의 연결 데이터가 제시되어 있다. (d) 다양한 E. 히라에 균주가 종양 성장을 제어할 수 있는 그의 능력에 대한 비교. EH 13144와 유사한 효능을 보이는 2개의 신규 균주 EH IGR 4 및 7 확인 및 발견. EH10815는 TMP2에 의해 야기되는 돌연변이와 관련이 있을 수 있다 (하기 도 13b 참조). 스튜던츠 t 검정 통계 분석: *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001.
도 5. EH13144 + IGR4 + IGR7의 조합이 EH13144 선도 화합물보다 우수하다. (a) 균주 E. 히라에 13144, IGR4, IGR7, 악티노마이세테스 종(Actinomycetes spp: Ao)의 경구 위관영양 이후의, 및 3 사이클로 CTX (c) 대 NaCl (N) 주사를 맞은 FMT 처리된 마우스에서의 MCA-205 육종의 종양 표면적. 각 점이 종양 1개당 마우스 1마리이다. (b) 가장 우수한 군의 SPF 마우스에서의 MCA-205 육종의 종양 성장 곡선, 각 시점에서의 종양 크기의 평균 + SEM 및 희생 시점의 종양 크기 (C: CTX). 각 점이 종양 1개당 마우스 1마리이다. Anova 통계치는 CTX와 삼중 조합 사이의 유의적인 차이를 나타낸다. (c) 균주 EH13144, IGR1, IGR11, 바르네시엘라 또는 아커만시아(Akkermansia)의 경구 위관영양 이후의, 및 3 사이클로 CTX 주사를 맞은 FMT 처리된 마우스에서의 MCA-205 육종의 종양 표면적. 박테리아 균주는 살아있는 것 (V) 또는 저온 살균된 것 (P)이 사용된다. 저온 살균을 위해, 박테리아를 70℃에서 30 min 동안 인큐베이션시키고, -80℃에서 적어도 6시간 동안 냉동시킨다.
도 6. 마우스 E. 히라에 13144는 오직 살아있는 상태로 사용될 때에만 그의 효능을 매개한다. FMT 처리된 마우스에서의 살아있는 균주 E. 히라에 13144 (a), 저온 살균된 균주 E. 히라에 13144 (b) 또는 대조군으로서 NaCl의 경구 위관영양 이후의 MCA-205 육종의 종양 성장 곡선. 각 군당 마우스 6마리에 대한 전형적인 곡선이 도시되어 있다. (c) 3회의 독립 실험으로부터 획득한, CTX 후 17일째 종양 크기의 연결 데이터가 제시되어 있다. 스튜던츠 t 검정 통계 분석: *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001.
도 7. E. 히라에 13144의 경구 위관영양 후, mLN 및 비장 중 CD8+ T 세포 축적 증가. (a) 실험 세팅. 마우스를 E. 히라에 (708 또는 13144)의 경구 위관영양 및 CTX ip 주사를 수행하기 전 3일 동안 광범위한 항생제로 처리한다. CTX 후 1일째, 2차 E. 히라에의 경구 위관영양을 수행한다. CTX 후 72시간째, CD4+ 및 CD8+ T 세포를 장간막 림프절 (mLN)로부터 단리시킨다. E. 히라에(E. hirae) 708 또는 13144의 경구 위관영양 및 CTX 처리 후, mLN 중 CD8+ (b) 및 CD4+ (c) T 세포의 비율(%). (d) 실험 세팅. 마우스를, 총 4회의 위관영양을 위해 매 3일마다 E. 히라에 (708 또는 13144)의 경구 위관영양을 수행하기 전 3일 동안 광범위한 항생제로 처리한다. 1차 경구 위관영양 후 5일째, 마우스를 CTX로 처리한다. CTX 후 1주째, CD8+ T 세포를 비장으로부터 단리시킨다. E. 히라에 708 또는 13144의 경구 위관영양 및 CTX 처리 후, 비장 중 CD8+T 세포 (e) 및 CCR9+CXCR3+CD8 T 세포 (f)의 비율(%). 스튜던츠 t 검정 통계 분석: *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001.
도 8. CD8+CXCR3+CCR9+를 온코백스(OncoBax)를 이용한 지속적인 항암 반응의 종양 연관 바이오마커로서 간주한 상태에서의, EH13144의 경구 위관영양 이후, 종양상 중의 CD8+ CCD9+CXCR3+ T 세포의 지속적인 축적. (a) SPF 마우스를 3일 동안 ATB로 처리한 후, 이어서, CTX 전신 투여 이전 및 이후, 3주 동안 격주로 EH13144의 경구 위관영양을 수행하였다. 1차 CTX 처리 후 7, 14 및 21일째 마우스를 희생시켜 비장, 종양 배수 림프절 (dLN) 및 종양 (MCA205)을 수거하였다. (b) FMT 처리된 마우스에 CTX 전신 투여 이전 및 이후, 3주 동안 격주로 EH13144의 경구 위관영양을 수행하였다. CTX 처리 당일 및 CTX 1, 2, 3 후 72 hr째 (J0일째, J3일째, J7일째, J10일째, J14일째, J17일째) 마우스를 희생시켜 dLN 및 종양 (MCA205)을 수거하였다. CCR9+CXCR3+ 이중 양성 세포의 비율(%)을 분석하는, CD8+CD3+에 대한 CD45+ 세포 게이팅의 유세포 분석법에 의한 분석이 제시되어 있다. 각 군당 마우스 5마리를 포함하는 3개 군의 대표 실험. Anova 통계 분석: *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001.
도 9. EH 펩티드의 면역원성을 입증하기 위한 실험 면역화 프로토콜. 마우스를, 총 4회의 위관영양을 위해 매 3일마다 E. 히라에 (708 또는 13144)의 경구 위관영양을 수행하기 전 3일 동안 광범위한 항생제로 처리한다. 1차 경구 위관영양 후 5일째, 마우스를 CTX로 처리한다. CTX 후 1주째, CD8+ T 세포를 비장으로부터 단리시킨다. 이들 CD8+ T 세포를, (1시간 동안) 20 ㎍/ml 펩티드로, 또는 (6시간 동안) 열-불활성화된 박테리아로 펄싱된 수지상 세포 (DC)와 함께 인큐베이션시킨다. 박테리아의 불활성화는 65℃에서 2시간 인큐베이션시키는 것으로 구성된다. 배양 24시간 후, IFNγ의 ELIspot을 수행한다.
도 10. CTL 비장 반응성에 대한 두 E. 히라에 708 및 13144 종 사이의 교차 반응성. 열-불활성화된 박테리아 (708, 13144, EH17 및 L. 플란타룸)와 함께, 또는 그의 부재하에서 미리 인큐베이션된 DC와의 공동 배양 후, IFNγ 분비 CD8+T 세포를 나타내는 IFNγ 스폿의 개수. 상응하는 실험 세팅은 도 9에 제시되어 있다. 스튜던츠 t 검정 통계 분석: *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001.
도 11. EH가 장 염증, 및 상기 염증에서의 CD8+ T 세포의 역할에 미치는 효과: mLN에서 증폭된 EH 특이적 CTL은 고유판으로 복귀할 수 있다. (a) 실험 세팅. 마우스를 3일 동안 광범위한 항생제로 처리한다. 이어서, 본 발명자들은 총 4회의 위관영양/주사를 위해 매 3일마다 E. 히라에 (708 또는 13144)의 경구 위관영양 및 항-CD8 주사 (200 ㎍/마우스)를 수행하였다. 1차 경구 위관영양 후 5일째, 마우스를 CTX로 처리한다. CTX 후 1주째, 헤마톡실린 에오신 염색 (HES)을 위해 결장을 제거하였다. (b) E. 히라에로 콜로니화되고, 항-CD8 제거 Ab 및 CTX로 처리된 마우스의 결장에서의 염증 침윤 정도. 스튜던츠 t 검정 통계 분석: *p<0.05, **p<0.01.
도 12. EH로부터 MHC 클래스 I 결합 펩티드를 선별하는 데 사용된 필터의 개략적 개요. 본 발명자들은 PSORT 소프트웨어를 이용하여 E. 히라에 (708, 13144 및 EH17)의 전체 박테리아 서열로부터 세포벽 및 세포외 위치하는 단백질을 선별하였다. 이어서, 단백질을 9개의 아미노산의 펩티드로 나누었다. NetMHC 소프트웨어를 이용하여 이들 펩티드를 MHC 클래스 I H-2Kb에 결합할 수 있는 그의 능력에 대해 시험하고, 오직 강력하게 결합하는 결합 물질만을 보유하였다 (IC50 < 50nM).
도 13. TMP1 및 TMP2 에피토프를 함유하는 그룹 7로부터의 펩티드가 E. 히라에 13144에 대해 면역화된 마우스의 비장으로부터의 CD8+ T 세포를 활성화시킨다. 13개의 상이한 그룹의 펩티드로 펄싱된 DC와의 인큐베이션 후, IFNγ 분비 CD8+T 세포를 나타내는 IFNγ 스폿의 개수 (표 6). 그룹 n°1 (a) 및 그룹 n°7 (b)만이 제시되어 있다. (c, e) (표 7에서) 그룹 n°7에 속하는 4개의 펩티드로 펄싱된 DC와의 인큐베이션 후, IFNγ 분비 CD8+T 세포를 나타내는 IFNγ 스폿의 개수. 상응하는 실험 세팅은 도 9에 명시되어 있다. (d) 면역원성 펩티드 수준에서의 EH13144와 비교한, EH10815의 TMP1 및 TMP2의 서열 정렬. (e) 다른 EH 균주를 이용한 생체내 면역화 후 TMP1 및 TMP2 뿐만 아니라, 그룹 7에 대한 회상 반응에서 비장 CTL의 시험관내 반응성. Anova 통계 분석: *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001.
도 14. TMP 에피토프 1 프로파지 2 특이적 CD8+ T 세포가 EH13144 및 IGR7의 경구 위관영양 후, dLN 및 비장에 축적된다. 마우스를 E. 히라에 13144 (a, b) 또는 10815 또는 EH17 또는 IGR7 (c)의 경구 위관영양 및 CTX ip 주사를 수행하기 전 3일 동안 광범위한 항생제로 처리한다. 상응하는 실험 세팅은 mLN의 경우, 도 7a에, 및 비장의 경우, 도 7d에 도시되어 있다. 사량체를 이용하여 장간막 림프절 (a) 및 비장 (b, c)으로부터 TMP1 특이적 CD8+ T 세포를 단리시킨다. mLN 및 비장에서의 CCR9+ 또는 CCR9- T 세포 중 TMP1 프로파지 2 특이적 CD8+T 세포 및 TMP1 특이적 CD8+T의 유세포 분석법에 의한 분석. 각 점은 1개의 mLN 또는 비장을 나타낸다. 5-6마리 마우스/군. Anova 통계 분석: *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001.
도 15. TMP 에피토프 1 프로파지 2 특이적 CD8+ T 세포는 종양상에 축적된다. (a) SPF 마우스를 3일 동안 ATB로 처리한 후, 이어서, CTX 전신 투여 이전 및 이후, 3주 동안 격주로 EH13144의 경구 위관영양을 수행하였다. 1차 CTX 처리 후 7, 14 및 21일째 마우스를 희생시켜 종양 배수 림프절 (dLN) 및 종양 (MCA205)을 수거하였다. (b) FMT 처리된 마우스를 3일 동안 ATB로 처리한 후, 이어서, CTX 전신 투여 이전 및 이후, 3주 동안 격주로 EH13144의 경구 위관영양을 수행하였다. CTX 처리 당일 및 CTX 1, 2, 3 후 72 hr째 (J0일째, J3일째, J7일째, J10일째, J14일째, J17일째) 마우스를 희생시켜 dLN 및 종양 (MCA205)을 수거하였다. CCR9+CXCR3+ 이중 양성 세포 중 TMP1 특이적 CD8 T 세포 및 TMP1 특이적 CD8 T 세포의 유세포 분석법에 의한 분석이 제시되어 있다. 각 군당 마우스 5마리를 포함하는 3개 군의 대표 실험. Anova 통계 분석: *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001.
도 16. TMP 펩티드로 펄싱된 DC를 이용한 면역화 프로토콜. DC 분화 후 (6일 동안 GM-CSF 및 IL-4 이용), 본 발명자들은 펩티드 (1시간) 또는 열-불활성화된 박테리아 (6시간) 첨가 전 밤새도록 폴리 I:C (10 ㎍/ml)와 함께 DC를 인큐베이션시켰다. 상기 DC를 0일째 및 10일째 우측 옆구리 상에 피하로 주사한다. 2차 주사 후 1개월째에 육종 (MCA205) 또는 결장 (MC38) 종양 세포주를 좌측 옆구리 상에 피하로 주사한다 (각각, 8.105 및 1.106개의 세포/마우스). 본 발명자들은, DC 부재인 1개 군, 20 ㎍/ml의, 비관련 펩티드 (gr1) 또는 TMP 펩티드 또는 13144 열-불활성화된 박테리아로 펄싱된 DC를 이용한 1개 군으로, 4개 군을 만든다. 시간 경과에 따른 평균 종양 크기 (a), 각 군에 대한 각 마우스 종양 키네틱스 (b), 및 MCA205에 대한 희생 전 마지막 2개의 시점에서의 군 간의 상세한 비교 (c)가 제시되어 있고, 각 점은 마우스 1마리를 나타낸다. MC38과 관련된 데이터는 제시되어 있지 않다.
도 17. 13144 및 TMP 펄싱된 DC 백신접종이 MCA205의 종양 성장을 감소시켰다. gr1 펩티드, TMP 펩티드 및 E. 히라에 13144로 펄싱된 DC로 백신접종을 받은 마우스에서의 MCA205의 종양 성장. (a) 상이한 키네틱스에서의 종양 크기의 평균 ± SEM. (b) 5-10마리의 마우스의 각 개별 군에 대한 종양 성장 키네틱스. (c) 희생 시점에 종양 크기 및 통계적 차이. 스튜던츠 t 검정 또는 ANOVA 통계 분석: *p<0.05, ** p<0.1, ***p<0.001.
도 18. 원위부에의 육종 존재가 E. 히라에 13144의 경구 위관영양에 의해 유도된 장 염증성 병변을 막는다. (a) 실험 세팅. 마우스를 우측 옆구리에 MCA205 종양 세포를 피하 주사하기 전 3일 동안 광범위한 항생제로 처리한다. 이어서, 본 발명자들은 총 4회의 위관영양을 위해 매 3일마다 E. 히라에 (708 또는 13144)의 경구 위관영양을 수행하였다. 1차 경구 위관영양 후 5일째, 마우스를 CTX로 처리하였다. CTX 후 1주째, 헤마톡실린, 에오신 및 사프란 염색 (HES)을 위해 결장을 제거고 PPFE 중에 포매시킨다. (b) MCA205 종양을 보유하거나, 또는 보유하지 않고, E. 히라에로 콜로니화되고, CTX로 처리된 마우스의 결장에서의 염증 침윤 정도. 스튜던츠 t 검정 통계 분석: **p<0.01.
도 19. E. 히라에 13144와 4개의 다른 E. 히라에 균주와의 비교 게놈 분석. (a) 5개의 E. 히라에 게놈의 범게놈(pangenomic) 분석. (b) 박테리아 게놈 및 플라스미드 내의 프로파지 서열 확인 및 주석달기 전용의, 서버 PHASTER (PHAge 서치 툴 인핸스드 릴리스(PHAge Search Tool Enhanced Release)로부터의, 13144 게놈 중 프로파지 영역 및 다른 파지와의 상동성에 관한 목록.
도 20. 엔테로코쿠스 히라에 프로파지 비교 분석. (a) 여러 EH 균주의 서열 정렬 및 TMP 서열의 위치. 40.6 kb 프로파지 (a) 및 39.2 kb 프로파지 (b) 유전자 서열의 존재 (검은색) 및 부재 (흰색)의 매트릭스 및 blast 정렬 파라미터 = 80%의 동일성 및 ≥70% 커버리지에 기초한 "히트맵" 클러스터를 통한 비교 분석.
도 21. EH13144 및 다른 E. 히라에 균주의 에피토프 TMP 사이의 상동성. (a) 프로파지 2 EH13144로부터의 TMP는 IGR7로부터의 TMP와 상동성이다 (이는 EH13144 및 EH IGR7 서열, 둘 모두 동일하기 때문이다). (b) EH13144의 에피토프 TMP1은 다른 E. 히라에 균주와 어느 정도의 상동성을 나타낸다: IGR11에서 100%, 및 IGR1 및 10815에서 88.89% (여기서, (c)에 1개의 돌연변이 명시). EH13144의 에피토프 TMP2는 IGR11 및 10815에서 77%의 상동성을 나타낸다 (여기서, (c)에 2개의 돌연변이 명시).
도 22. 화학요법 이전의 진단시 유방암 환자로부터의 혈액 중 공생생물에 대한 T 세포 반응. 유방암 환자로부터 수거된 자기 단핵구를 독특한 박테리아 종으로 자극시킨 후, 이어서, 자기 CD4+ T 세포 또는 CD8+ T 세포와 함께 인큐베이션시켜 IFN-γ 및 IL-10 방출을 모니터링하였다. (a) E. 히라에 13144에 대한 TH1/Tc1/Tr1 면역 반응. 진단시 20% 미만의 유방암 (BC) 환자가 화학요법 이전에 E. 히라에 13144에 대하여 혈액 TH1/Tc1 면역 반응을 보인다. (b) E. 콜라이 또는 TCR 교차 결합에 대한 TH1/Tc1/Tr1 면역 반응. BC 여성은 E. 콜라이에 대하여 기억 T 세포 반응을 보이고, TCR 교차 결합에 대하여 반응한다.
도 23. 인간에서 시험되는 각 HLA 하플로타입에 대한 TMP의 예측 펩티드의 위치. NetMHC 소프트웨어를 사용하여 평가된 MHC 클래스 I 대립유전자에 대해 유의적인 결합 잠재능 (임계치 50 nM)을 갖는 Tmp의 예측 펩티드의 위치. 각 펩티드 및 대립유전자에 대하여, 기호는 MHC 클래스 I 대립유전자에 대하여 그의 결합 친화도를 갖는 길이가 9개의 아미노산 길이인 펩티드에 상응하는 확인된 서열의 첫 번째 아미노산을 나타낸다. 예측 펩티드의 서열은 표 9에 요약되었다.
도 24. 건강한 지원자로부터의 인간 PBMC에서 TMP 펩티드의 항원성. 24 hr 재자극 후 IFNγ 방출을 밝히는 ELISPOT를 이용하여 PBMC로부터 중심 기억 CD8+ T 세포를 입증하기 위한 펩티드 (그룹 또는 개별 펩티드)로 펄싱된 DC에 의한 2 라운드의 자극 후, 간접적 회상 반응에 대한 시험관내 자극 검정법 (a). 각 펩티드는 HLA-A2 제한이고 (b), 6명의 건강한 지원자 "HV" (여섯 자릿수로 개별화)를 그의 HLA-A2.1 유전자형에 대해 선별하였다 (c). (b)에서, 본 발명자들은 하기 그래프에서 면역원성을 나타내는 펩티드로 밑줄로 표시해 두었다. 본 발명자들은 각 HV에 대한 임계치를 결정하고 (d), "양성" 웰 (임계치 초과)의 개수 및 표 b에 열거된 각 펩티드에 대한 반응자의 비율(%)을 계산하였다 (e). 본 발명자들이 상기 결과를 막대 그래프로 나타낼 때, 이들은 5개의 펩티드가 HV의 적어도 50%에서 Tc1 면역 회상 반응을 일으켰기 때문에, 상기 펩티드가 인간에서 TMP의 면역원성과 유의적으로 연관되어 있을 수 있다는 것을 관찰하게 된다 (f). 화살표 표시는 가장 유의적인 에피토프를 나타낸다 (g). 각 그룹에 대한 펩티드 및 가장 유의적인 에피토프 (2, 3, 9, 10, 13)의 목록은 표 b에 제시되어 있다.
도 25. 미토마이신 C에 의한 파지 절제 프로토콜. 기술적 방법의 각 단계가 명시되어 있다.
도 26. E. 히라에 13144의 상청액 중 파지 핵산의 PCR 검출. 다양한 농도의 미토마이신 C (0, 0.2 및 1 μM), 또는 CTX의 활성 대사산물 (마포스파미드 - 25 ㎍/ml)에서, 다양한 온도 (37 또는 42℃)에서 배양된 EH13144의 상청액을 처리하여 (b) 캡시드가 파괴된 상태, 또는 (a) 캡시드가 파괴되지 않은 상태에서, 파지 단백질을 코딩하는 DNA를 수거하였다. PCR을 수행하여 프로파지 1 또는 2의 특정 서열을 검출하였다.
도 27. E. 히라에 13144에서 고유의 항원성 서열로서의 파지 테일 길이 테이프 메져 단백질.
a 및 c. 실험 세팅. 마우스 (나이브 (c), 육종 보유자 (a))를 각각 5 및 6일째 시클로포스파미드 (ip CTX - 100 mg/kg) 또는 염수 용액 (NaCl) 전신 투여 이전 및 이후, 1회 (c) 또는 주 단위로 3회에 걸쳐 (a) E. 히라에 균주 13144 (1.109개의 박테리아)의 경구 위관영양을 수행하기 전 3일 동안 광범위한 항생제 (스트렙토마이신, 콜리스틴, 암피실린, 반코마이신)로 처리하였다. 1주일 후 (c), 정제된 CD8+ T 세포 비장세포를 생체외 회상 검정법에서 염수 또는 독특한 열 사멸된 박테리아 균주가 로딩된 골수 유래 DC로 재자극시켰다. b. 매주 다양한 E. 히라에 균주의 경구 위관영양 이후의, 3 사이클로 CTX 대 NaCl 주사를 맞은 SPF C57BL/6 마우스에서의 25일째 (희생 시점) MCA-205 육종의 종양 크기. d-e. 생체외 회상 검정법. 생체내 노출 후 (c), 비장 CD8+ T 세포를 열-불활성화된 박테리아 (65℃에서 2시간 동) (d) 또는 펩티드 (e)로 펄싱된 수지상 세포 (DC)로 재자극시켰다. 24시간째 IFNγ ELIspot을 수행하여 공동 배양 후 IFNγ 분비 CD8+T 세포 (스폿)를 열거하였다. 각 점은 마우스 1마리를 나타낸다. f, g, h. 나이브 (f, h) 또는 종양 보유자 (g)에서의 요법 (a 및 c의 요법) 후 72시간째 비장 (f, h) 또는 종양 배수 림프절 (g)에서의 H-2Kb/TSLARFANI 사량체 결합 CTL에 관한 유세포 분석법에 의한 분석. 비장 CD8+ T 세포 (f, 좌측 패널, g, h, 상단 패널) 중에서 또는 CCR9+CXCR3+ T 세포 (f, 우측 패널, g, 하단 패널) 또는 CCR9+ CTL (h, 하단 패널) 게이트에서 TMP1 프로파지2 특이적 CD8+ T 세포의 비율이 도시되어 있다. 각 실험은 2-3회의 독립 실험으로부터 마우스 10-15마리의 1개 군을 포함하였다 (b, d, e, f, h). 유사한 결과를 얻은 2개의 실험 중 한 대표 실험이 g의 키네틱스 연구에 제시되어 있다. Anova 또는 스튜던츠 t 검정 통계 분석: *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001.
도 28. 육종에 대한 파지 테일 길이 테이프 메져 단백질을 이용한 예방적 및 치료적 면역화.
a-b. 예방적 백신접종. 10일 간격을 두고, 나이브 마우스의 우측 옆구리에 피하 접종하기 전, TLR3 리간드 노출된 DC를 펩티드 (비관련 그룹, 3번 위치에서 돌연변이화 또는 돌연변이화되지 않은 개별 TMP1) 또는 열-불활성화된 박테리아로 펄싱하였다. 2차 주사 후 1개월째, 육종 (MCA205)을 좌측 옆구리에 피하로 이식하였다. c-d. 치료적 세팅. MCA205 종양 보유자를 CTX로 처리하고, TMP1 (TSLARFANI), TMP1 mut2 (TALARFANI), TMP1 mut3 (TSFARFANI) 또는 EGFP 서열 (ctrl로서)을 발현하도록 유전자 변형된 E. 히라에 13144 또는 E. 콜라이의 위관영양이 수행된 요법에 대해 도 27a를 참조한다. MCA205의 종적 종양 성장 키네틱스 (a, c 상단 패널) 또는 횡단적 종양 크기 (b, c 하단 패널)가 2-3회의 독립 실험으로부터 수집된, 12-18마리의 동물 (a)에 대한 상이한 시점 (a, c 상단 패널) 또는 희생시 (b, c 하단 패널) 종양 크기의 평균±SEM으로서 도시되어 있다. d. 희생시 비장에서의 H-2Kb/TSLARFANI 사량체 결합 CTL의 유세포 분석법에 의한 분석. 비장 CD8+ T 세포 중 TMP1 프로파지2 특이적 CD8+ T 세포의 비율(%)이 도시되어 있다. 스튜던츠 t 검정 또는 ANOVA 통계 분석: *p<0.05, ** p<0.1, ***p<0.001.
도 29. 엔테로파지의 커버리지 범위 (BOC) 및 암 환자에서 그의 분자 모방 GPD1-L의 임상적 관련성.
a. MG 참조 카탈로그에서의 E. 히라에 및 프로파지 게놈의 BOC. 17개의 상이한 데이터세트 (하단에서 언급, 열 중 개별 샘플)로부터의 3027개의 메타게놈을 E. 히라에 균주 및 엔테로코쿠스 파지 게놈 (행에서 피처링)의 존재에 대하여 스크리닝하였다. b-c. 76명의 NSCLC 및 RCC 보유 환자 (문헌 [Routy et al. Science 2018]에 기술된 코호트)에서의 컬쳐로믹스, 이어서, PCR에 의해 평가된, 검출가능한 E. 히라에 및/또는 E. 파에칼리스(E. faecalis) 콜로니를 포함하는 대변의 비율(%) (b, 상단 패널) 및 E. 히라에 및/또는 E. 파에칼리스 (b, 하단 패널) 콜로니 중 TMP 비율(%), 및 진행 시간 (c, 상단 패널) 또는 전체 생존 (c, 하단 패널)을 나타내는 상응하는 카플란 마이어(Kaplan Meier) 곡선. p 값이 명시된, 로그 순위 (만텔-콕스(Mantel-Cox)) 분석. d. 16개의 HLA-A02*01 결합 TMP 에피토프 (표 9, 도 24b 및 도 37)로 펄싱된 (또는 펄싱되지 않은) 자기 단핵구 유래 DC를 이용한, 6명의 HLA-A02*01 건강한 지원자로부터의 나이브 CD8+ T 세포의 프라이밍. IFNγ ELIspot 검정법을 위해 7일째 각각의 16개의 TMP 펩티드로 재자극, 및 양성 스폿 열거. ANOVA 통계 분석: *p<0.05. e. 공개적으로 이용가능한 NCBI BLASTP 스위트 및 TCGA 데이터 세트를 이용하여, >75% 상동성을 탐색하면서, d에서 선별된 면역원성 에피토프의 Blast 서열 정렬. 오직 에피토프 10 (KLAKFASVV, 서열식별번호 63)만이 유의적인 매치 (KLQKFASTV, 서열식별번호 188)를 얻었고, GPD1-L 단백질의 서열에서 확인되었다. f-h. 단변량 분석에서 평균 및 카플란 마이어 생존 곡선에 따라 분리된 TCGA 데이터 세트로부터의 방광암 (f), 폐 선암종 (g), 530명의 신장 세포암 (h, HLA-A02*01 타입핑에 따라, 하단 패널) 환자 중에서의 GPD1-L 유전자 생성물의 발현 수준. i-j. 62명의 IIIC/IV 기의 NSCLC 환자의 제2 코호트 (CGFL 시험 코호트, j)에서 검증된 44명의 IIIC/IV 기의 NSCLC 환자 (CHUM 검증 코호트, i)에서의 제2선의 요법에서 PD-1 차단 이후의 진행 시간. 진행 시간에 대한 카플란 마이어 곡선; 환자를 GPD1L 발현 값의 값에 따라 계층화하였다. 컷오프는 최적의 컷오프 전략법을 이용하여 정의하였다. k. 모든 폐암 유형의 TCGA 검정법 (TCGA), 폐 선암종 (LUAD), 폐 편평 세포 암종 (LUSC), CHUM 및 CGFL 코호트에서의 GPD1-L 발현과 종양 면역 침윤 사이의 피어슨 상관.
도 30. 마우스 암에서의 엔테로파지 TMP와 발암 드라이버 PSMB4 사이의 분자 모방.
a. 공개적으로 이용가능한 TCGA 데이터 세트를 이용하여, >70% 상동성을 탐색하면서, 27e에서 선별된 오직 단 하나의 면역원성 에피토프 TSLARFANI의 Blast 서열 정렬. 오직 하나의 히트 (GSLARFRNI)만이 유의적인 매치를 얻었고, PSMB4 단백질의 서열에서 확인되었다. b. 야생형과 MCA205의 넉인 종양 클론을 비교하는 치료적 세팅. 도 27a에서의 것과 동일하며, 단 마우스에 WT MCA205 세포주, 또는 TSLARFANI의 3번 위치에 넉인 돌연변이를 보유하는 독특한 클론을 접종한 후, 이어서, E. 히라에 13144 (또는 염수)의 위관영양 수행(+)/비수행(-)하에서 CTX로 처리하였다. MCA205의 종적 종양 성장 키네틱스 (b) 또는 횡단적 종양 크기 (b, 우측)는 유사한 결론을 얻은 2개의 실험 중 한 대표 실험에서, 군당 6마리의 동물에 대한 상이한 시점 (상단 및 하단), 또는 희생시 (우측) 종양 크기의 평균±SEM으로 도시되어 있다. ANOVA 통계 분석: *p<0.05, ** p<0.1, ***p<0.001. c-d. E. 히라에 시포비리다에(siphoviridae) 파지의 생체내 절제-감염 사이클. 박테리아 콜로니의 배양 및 단리, MALDI-TOF 확인 및 TMP 특이적 프로브 세트를 사용하는 PCR을 위한, CTX 이전 및 이후의 E. 히라에의 위관영양, 및 이어서, 회장 내용물 수거 (c). 나이브 동물 및 위관영양을 받은 동물에서 각 종에 대한 콜로니의 비율을 도시한 그래프, 여기서 콜로니는 PCR에서 TMP 서열을 보유한다 (d). PCR로 확인되고, 조사된 5마리의 마우스/군 및 >70 콜로니의 결과. 도 39 또한 참조한다. e. E. 갈리나룸(E. gallinarum)의 서열분석 후, PCR에서 TMP 서열을 보유하는 상기 균주를 이용한 파지 게놈 정렬. f-g. 오르가노이드를 E. 히라에 (108) 및 E. 갈리나룸 (108)과 1시간 동안 배양한 후, 마포스파미드 (25 ㎍/ml)로 처리. 박테리아 콜로니의 배양 및 단리 (f), MALDI-TOF 확인 및 TMP 특이적 프로브 세트를 사용하는 PCR (g)을 위하여, 마포스파미드 처리 후 6시간 및 20시간째에 상청액을 수거하였다. h. 국재화된 유방암 샷건 데이터에 대한 MetaPhlAn2 분석 후, 박테리아 및 바이러스 종에 대한 LEfSe 분석을 수행하였고, 포함된 83명으로부터 10명의 환자에 대한 네오아주반트 팔보시클립 치료에 대해 가장 큰 판별성을 나타내는 것들 (LDA 점수 > 2)이 내림 차순으로 보고하였고, 남은 73명은 네오아주반트 CDK4/6 억제제를 받지 않았다. 스튜던츠 t 검정 또는 ANOVA 통계 분석: *p<0.05, ** p<0.1, ***p<0.001.
도 31. E. 히라에 균주의 클래딩 및 게놈 분석. a. 16S 서열 유사성에 기초한, 다양한 균주의 덴드로그램. b. SNP 정렬에 기초한 20개의 E. 히라에 분리주의 필로게노믹 트리(Phylogenomic tree). c. 5개의 완전한 E. 히라에 게놈에 대한 13144 균주의 비교 게놈 분석. 가운데에서부터 바깥 쪽으로: GC 편향, GC 함량, 13144, IGR7, IGR11, ATCC 9790, 708, 13344 균주. 프로파지 위치는 검은색으로 표시되어 있다.
도 32. 유일한 면역원성 펩티드 그룹으로서의 그룹 7의 사전 확인.
나이브 마우스를 각각 5 및 6일째 시클로포스파미드 (ip CTX - 100 mg/kg) 또는 염수 용액 (NaCl) 전신 투여 이전 및 이후, E. 히라에 균주 13144 또는 708 (1.109개의 박테리아)의 경구 위관영양을 수행하기 전 3일 동안 광범위한 항생제 (스트렙토마이신, 콜리스틴, 암피실린, 반코마이신)로 처리하였다. 1주일 후, 정제된 CD8+ T 세포 비장세포를 생체외 회상 검정법에서 염수 또는 독특한 그룹의 펩티드 (표 6의 목록 참조)가 로딩된 골수 유래 DC로 재자극시켰다. 24시간째 IFNγ ELIspot을 수행하여 공동 배양 후 IFNγ 분비 CD8+T 세포 (스폿)를 열거하였다. 각 점은 마우스 1마리를 나타낸다. 통계 분석 결과, 오직 그룹 7만이 유의적인 반응에 도달한 것으로 나타났다: Anova 검정: *p<0.05,** p<0.1.
도 33. TMP 단백질의 서열, 및 E. 히라에 13144 프로파지 2 단백질 서열의 비교 분석.
a. 13144 프로파지 2의 전체 TMP 단백질 서열. b. 13144 프로파지 2 단백질 서열의 존재 (검은색) 및 부재 (흰색)의 매트릭스에 기초한 "히트맵" 클러스터링을 통한 비교 분석.
도 34. E. 히라에 13144의 프로파지 2 내의 면역원성 에피토프 영역의 서열 정렬.
도 27에 도시되어 있고, 상세하게 설명된 실험에서 E. 히라에 13144로부터의 면역원성 펩티드 TSLARFANI가 확인되었다. y축은 본 발명자들의 모델에서 시험된 동일 영역 중의, 6개의 다른 E. 히라에 균주의 서열을 제공한다.
도 35. E. 콜라이에서의 TMP 유전자의 일부분의 서브클로닝 발현.
a. E. 콜라이 DH5α에서 발현된 TMP-FLAG, TMP-mut2-FLAG 및 TMP-mut3-FLAG의 아미노산 서열. 에피토프의 명시된 변이체 (밑줄체로 표시)를 포함하는, TMP 단백질의 N-말단부만이 C-말단 FLAG 태그 (이탤릭체로 표시)를 포함하는 융합 단백질로서 발현되었다는 점에 주의한다. b. 각각 pDL28-P23-EGFP 또는 pDL28-P23-TMP-FLAG로 형질전환된 E. 콜라이 균주에서의 EGFP 및 TMP-FLAG 발현을 입증하는 웨스턴 블롯 분석.
도 36. E. 히라에 중 파지 테일 길이 테이프 메져 단백질의 서열. 전체 TMP 단백질의 유전자 서열, 여기서 PCR 프라이머에 대한 결합 부위는 이탤릭체로 표시되어 있다.
도 37. GPD1-L 단백질 중 HLA-A02*01 결합 및 면역원성 에피토프의 위치 및 그의 친화도 (도 30a 참조).
표 9에서 발견되고, 도 29d에 도시된, HLA-A02*01 결합 및/또는 면역원성 에피토프는 색상 코드 및 아미노산 서열 위치에 의해 명시된 바와 같이, MHC 클래스 I 대립유전자에의 그의 결합 친화도의 함수로서 모두 전체 TMP 단백질의 정확한 부위에 위치한다.
도 38. CRISPR/Cas9 기술에 의한 pmsb4 -돌연변이화된 MCA205 세포주의 생성.
a. Psmb4 cDNA, 및 디자인된 돌연변이 부위의 개략적 다이어그램. sgRNA의 표적 부위 및 점 돌연변이가 표시되어 있다. b. CRISPR/Cas9에 의해 도입된 Pmsb4 돌연변이화 2 및 돌연변이화 3의 검증을 위한 대표적인 서열 전기영동도. 돌연변이화된 아미노산은 회색으로 강조 표시되어 있다.
도 39. CTX + 10 9 cfu E. 히라에 13144의 경구 위관영양으로 구성된 처리를 받은, 또는 그 처리를 받지 않은 회장 박테리아 콜로니의 확인.
그람+ 박테리아를 단리시키기 위해 호기성 조건하에서 회장 내용물을 시딩한 후 성장한 각 콜로니에서의 TMP 서열의 PCR 증폭 (도 36 참조). 각 동물에 대한 각 아가로스 전기영동 겔의 사진이 제시되어 있다. a는 5마리의 나이브 마우스에서의 결과를 도시한 것이고, b는 CTX + 파지 코딩 박테리아의 경구 위관영양 이후의 관찰결과를 도시한 것이다. 각 세로 레인은 MALDI-TOF에서 확인된 한 박테리아에 상응한다. 이니셜은 패널 A의 하단부에 상세히 기재되어 있다. 양성 대조군 (Ctl+)은 E. 히라에 13144의 DNA를 나타낸다.
본 문서에서, 하기의 일반적인 정의가 사용된다:
장 미생물총
"장 미생물총" (기존에 장 플로라 또는 마이크로플로라로 명명됨)은 동물계에 속하는 임의의 유기체 (인간, 동물, 곤충 등)의 장에서 사는 미생물 집단을 가리킨다. 각 개체에 독특한 미생물총 조성물이 있지만 (총 400-500개의 상이한 박테리아 종/개체에서 60 내지 80개의 박테리아 종이 샘플링된 집단의 50% 초과에서 공유됨), 이는 항상 유사한 주요 생리학적 기능을 이행하고, 개체의 건강에 직접적인 영향을 미친다:
· 이는 위 및 소장이 소화할 수 없는 특정 음식 (주로 비-소화성 섬유)의 소화에 기여한다;
· 이는 일부 비타민 (B 및 K)의 생산에 기여한다;
· 이는 다른 미생물로부터의 공격에 대해 보호하여, 장 점막의 완전성을 유지시킨다;
· 적합한 면역계의 발생에서 중요한 역할을 한다;
· 건강하고, 다양하며, 균형잡힌 장 미생물총이 적합한 장 기능화를 확실하게 하는 것의 관건이다.
장 미생물총이 신체의 정상 기능화에서 하는 주요 역할 및 달성하는 상이한 기능들을 고려하여, 이는 오늘날 "기관"으로 간주된다. 그러나, 아기는 무균성으로 태어나기 때문에 이는 "후천적" 기관이다; 즉, 소장 콜로니화는 출생 직후에 시작되어 그 후 진화된다.
장 미생물총의 발달은 출생 시에 시작된다. 자궁 내에서 무균성인 신생아의 소화관에서 모체 (질, 피부, 유방 등), 분만이 일어나는 환경, 공기 등으로부터의 미생물이 신속하게 콜로니화한다. 셋째 날부터, 장 미생물총의 조성은 유아의 급식 방식에 직접적으로 의존하고; 예를 들어, 유아용 조제식으로 영양을 공급받는 아기와 비교하여, 모유 수유 아기의 장 미생물총은 비피도박테리아(Bifidobacteria)가 우세하다.
장 미생물총의 조성은 출생부터 노년기까지 일생에 걸쳐 진화하고, 상이한 환경 영향의 결과이다. 노화 과정동안 장 미생물총의 균형이 영향을 받을 수 있고, 결과적으로, 노인은 더 젊은 성인과 실질적으로 상이한 미생물총을 갖는다.
우세한 장 미생물총의 일반적인 조성은 대부분의 건강한 사람에서 유사하지만 (4개의 주요 문, 즉, 피르미쿠테스(Firmicutes), 박테로이데테스(Bacteroidetes), 악티노박테리아(Actinobacteria) 및 프로테오박테리아(Proteobacteria)), 종 수준에서의 조성은 고도로 개인화되고, 주로 개체의 유전, 환경 및 식이에 의해 결정된다. 장 미생물총의 조성은 일시적 또는 영구적으로 식이 성분에 적응될 수 있다.
디스바이오시스
변화에 적응할 수 있고, 회복 역량이 높지만, 장 미생물총 조성의 균형 상실이 일부 특정 상황에서 발생할 수 있다. 이는 장에서의 잠재적으로 "유해한" 박테리아와 "유익한" 박테리아 사이의 불균형, 또는 주요 박테리아 군 조성 및 다양성 면에서 "건강한" 미생물총으로 간주되는 것에 대한 임의의 편차인 "디스바이오시스"로 지칭된다. 디스바이오시스는 건강 문제, 예컨대, 기능성 장 장애, 염증성 장 질환, 알레르기, 비만, 당뇨병 및 또한 암과 연관이 있을 수 있다. 이는 또한 치료, 예컨대, 세포독성 치료 또는 항생제 치료의 결과일 수 있다.
항신생물성 치료
본원에서 "항신생물성 치료"는 수술을 제외한 임의의 암 치료를 지칭한다. 이는 화학요법, 호르몬 및 생물학적 요법, 방사선 요법 및 표적 요법 (예컨대, c-KIT, EGFR 또는 HER2/HER3 또는 MET 또는 ALK 억제제...)을 포함한다.
화학요법
"화학요법"은 본원에서 하나 이상의 화학요법제에 의한 암의 치료로서 정의된다. 화학요법제는 대부분의 암 세포의 주요 특성 중 하나인 빠르게 분열하는 세포를 사멸시킴으로써 작용하는 화학 분자이다. 화학 작용제에는 수개의 카테고리가 존재한다:
- 알킬화제;
- 방추사 독, 예컨대, 메벤다졸, 콜키친과 같은 방추사 독;
- 유사분열 억제제 (탁산 (파클리탁셀 (탁솔(Taxol)®), 도세탁셀 (탁소테레(Taxotere)®)) 및 빈카 알칼로이드 (예컨대: 빈크리스틴, 빈블라스틴, 비노렐빈, 빈데신)를 포함);
- 세포독성/항종양 항생제: 예컨대, 안트라시클린 (예컨대: 독소루비신, 다우노루비신, 아드리아마이신, 이다루비신, 에피루비신, 및 미톡크산트론, 발루비신), 스트렙토마이세스 (예컨대: 악티노마이신, 블레오마이신, 미토마이신, 플리카마이신);
- 항대사물질 (예컨대, 피리미딘 유사체 (예컨대: 플루오로피리미딘 유사체, 5-플루오로우라실 (5-FU), 플록스우리딘 (FUDR), 시토신 아라비노시드 (시타라빈(Cytarabine)), 겜시타빈 (겜자르(Gemzar)®), 카페시타빈; 퓨린 유사체 (예컨대: 아자티오프린, 메르캅토퓨린, 티오구아닌, 플루다라빈, 펜토스타틴, 클라드리빈, 카페시타빈, 클로파라빈); 엽산 유사체 (예컨대: 메토트렉세이트, 엽산, 페메트렉시드, 아미노프테린, 랄티트렉시드, 트리메토프림, 피리메타민);
- 토포이소머라제 억제제 (예컨대: 캄프토테신: 이리노테칸, 토포테칸, 암사크린, 에토포시드, 에토포시드 포스페이트, 테니포시드);
- DNA 메틸트랜스퍼라제 억제제: 2'-데옥시-5-아자시티딘 (DAC), 5-아자시티딘, 5-아자-2'-데옥시시티딘, 1-[베타]-D-아라비노푸라노실-5-아자시토신, 디히드로-5-아자시티딘;
- 혈관 차단제, 예컨대, 플라본 아세트산 유사체, 5,6-디메틸크산테논-4-아세트산 (DMXAA) 및 플라본 아세트산 (FAA);
- 또한, 다른 화학요법 약물, 예컨대, 아프레피탄트, 보르테조밉 (벨케이드(Velcade)®, 밀레니엄 파마슈티칼즈(Millenium Pharmaceuticals)), 이마티닙 메실레이트 (글리벡(Gleevec)®), 카르무스틴 (BCNU), 로무스틴 (CCNU), 타목시펜, 게피티닙, 에를로티닙, 카르복시아미도트리아졸, 에파프록시랄, 티라파자민, 크시트린, 티말파신, 빈플루닌.
면역 체크포인트 차단제
본 문서에서, "면역 체크포인트를 차단하는 약물," 또는 "면역 체크포인트 차단제 (ICB)" 또는 "면역 체크포인트 차단 약물"은 T 림프구의 면역 체크포인트를 차단하는 임의의 약물, 분자 또는 조성물을 지칭한다. 상기 약물은 숙주 면역계를 재활성화시키고, 간접적으로 이펙터 T 림프구에 의해 종양 세포를 사멸시킨다. 특히, 상기 용어는 항-CTLA-4 항체, 항-PD1 항체, 항-PD-L1 항체 (예컨대, 아테졸리주맙(Atezolizumab) 또는 두르발루맙(Durvalumab)) 및 항-PD-L2 항체를 포함한다. 더욱 특히, ICB는 항-PD1 모노클로날 항체, 예컨대, 니볼루맙(Nivolumab) 또는 펨브롤리주맙(Pembrolizumab)일 수 있다. 다른 ICB로는, 이 또한 면역 체크포인트를 억제시키는 것인, 항-Tim3, 항-BTLA, 항-VISTA, 항-CD38, 항-TIGIT, 항-GITR, 항-LAG3, 항-KIR 항체, 항-OX40 항체를 포함한다.
비록 CTLA-4, PD1, PD-L1, PD-L2 등을 길항시키는 약물로서 현재 사용되는 것은 모노클로날 항체이기는 하지만, 상기의 것에 특이적으로 결합하는 다른 분자, 예컨대, 예를 들어, 항체 단편, 또는 특수 디자인된 압타머도 미래 ICB 개발을 위해 사용될 수 있다. 물론, "면역 체크포인트를 차단하는 약물," 또는 "면역 체크포인트 차단제 (ICB)" 또는 "면역 체크포인트 차단 약물"이라는 어구는 면역 체크포인트, 예컨대, CTLA-4, PD1, PD-L1, PD-L2 등을 길항시키는 활성 분자, 예컨대, 항-CTLA4, 항-PD1 또는 PDL1 Ab를 위해 재조합된 종양용해성 바이러스를 이용한 임의의 요법도 포함한다.
수용체를 활성화시키기 위한 면역 표적화 항체
본 문서에서, "면역자극성 수용체를 활성화시키는 약물"은 숙주 면역계를 재활성화시키고, 간접적으로 이펙터 T 림프구에 의해 종양 세포를 사멸시키면서, T 또는 NK 세포 수용체를 활성화시키는 임의의 약물, 분자 또는 조성물을 지칭한다. 특히, 항-ICOS 항체, 항-OX40 항체, 항-CD137, 항-CD28 항체 ...를 포함한다.
CDK4/6 억제제
본 문서에서, "CDK4/6 억제제"는 시클린-의존성 키나제 4 및 6 (CDK4/6) 억제제, 예컨대, 팔보시클립, 리보시클립, 및 아베마시클립을 지칭한다. 이들 약물은 현재 호르몬 수용체 (HR)-양성, 인간 표피 성장 인자 수용체 2 (HER2)-음성 (HR+/HER2-) 진행성 유방암 환자를 치료하는 데 사용될 뿐만 아니라, 다른 암, 예컨대, 난소암 및 급성 골수성 백혈병을 치료하는 데에도 사용될 수 있다.
프로바이오틱스
"프로바이오틱스"는 섭취시에 주장하는 건강상의 이익을 갖는 미생물이다. 통상적으로, 프로바이오틱스는 특별히 활성 살아있는 배양물이 첨가된 발효 식품의 일부로서, 예컨대, 요구르트, 대두 요구르트에서, 또는 식이 보조제로서 섭취된다. 일반적으로, 프로바이오틱스는 장 미생물총이 그의 균형, 완전성 및 다양성을 유지하는 것 (또는 재발견하는 것)을 돕는다. 프로바이오틱스의 효과는 균주-의존적일 수 있다. 본원에서, 본 발명자들은 "항암 프로바이오틱스"라는 어구 또는 "온코백스" 및 온코마이크로바이오틱스"라는 신조어를 사용하여 화학요법, PD1/PD-L1 차단 또는 항-CTLA4+항-PD1 또는 PD-L1 Ab의 조합에 대한 반응을 복원하는 임의의 공생 조성물을 가리킬 것이다. 따라서, 본 발명의 맥락에서, "프로바이오틱 조성물"은 식품 또는 식품 보조제로 제한되는 것이 아니라, 환자에게 이로운 미생물을 포함하는 임의의 박테리아 조성물을 일반적으로 지칭한다. 따라서, 상기 프로바이오틱 조성물은 의약 또는 약물일 수 있다.
암, 치료 등
본원에서 사용되는, "암"은 모든 유형의 암을 의미한다. 특히, 암은 고형 또는 비-고형 암일 수 있다. 암의 비제한적인 예로는 암종 또는 선암종, 예컨대, 유방암, 전립선암, 난소암, 폐암, 췌장암 또는 결장암, 육종, 림프종, 흑색종, 백혈병, 생식세포암 및 모세포종이 있다.
면역계는 암에 대해 이중 역할을 한다: 이는 종양 세포가 성장하는 것을 막고, 또한 종양 세포의 면역원성을 조정한다. 따라서, 면역 체크포인트를 차단하는 약물이 사실상 임의 유형의 암을 치료하는 데 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명에 따른 방법은 부신 피질암, 항문암, 담관암 (예컨대, 간문부 암, 원위부 담관암, 간내 담관암), 방광암, 골암 (예컨대, 골모세포종, 골연골증, 혈관종, 연골점액유사 섬유종, 골육종, 연골육종, 섬유육종, 악성 섬유성 조직구종, 뼈의 거대 세포 종양, 척삭종, 림프종, 다발성 골수종), 뇌 및 중추 신경계 암 (예컨대, 수막종, 성상세포종, 희소돌기아교세포종, 뇌실막종, 신경아교종, 속질모세포종, 신경절신경교종, 신경집종, 종자세포종, 두개인두종), 유방암 (예컨대, 유관 상피내 암종, 침윤성 유관 암종, 침윤성 소엽 암종, 소엽 상피내 암종, 여성형유방증), 캐슬만병 (예컨대, 거대 림프절 과다형성, 혈관여포형 림프절 과다형성), 자궁경부암, 결장직장암, 자궁내막암 (예컨대, 자궁내막 선암종, 선극세포종, 유두상 장액성 선암종, 투명 세포), 식도암, 담낭암 (점액 선암종, 소세포 암종), 위장 카르시노이드 종양 (예컨대, 융모막암종, 파괴성 융모막선종), 호지킨병, 비-호지킨 림프종, 카포시 육종, 신장암 (예컨대, 신장 세포암), 후두암 및 하인두암, 간암 (예컨대, 혈관종, 간 선종, 국소성 결절 과다형성, 간세포 암종), 폐암 (예컨대, 소세포 폐암, 비소세포 폐암), 중피종, 형질세포종, 비강암 및 부비동 암 (예컨대, 감각신경모세포종, 중간선 육아종), 코인두암, 신경모세포종, 구강암 및 구강인두암, 난소암, 췌장암, 음경암, 뇌하수체암, 전립선암, 망막모세포종, 횡문근육종 (예컨대, 배아 횡문근육종, 폐포 횡문근육종, 다형태 횡문근육종), 타액선암, 피부암 (예컨대, 흑색종, 비-흑색종 피부암), 위암, 고환암 (예컨대, 고환종, 비-고환종 생식 세포암), 흉선암, 갑상선암 (예컨대, 소포성 암종, 역형성 암종, 불량하게 분화된 암종, 수질성 갑상선 암종, 갑상선 림프종), 질암, 외음부암, 및 자궁암 (예컨대, 자궁 평활근육종)으로부터 선택된 암을 앓는 환자를 위해 잠재적으로 유용하다. 더욱 특히, 본 발명에 따른 방법은 전이성 흑색종, 비소세포 폐 암종 (NSCLC), 소세포 폐암 (SCLC), 중피종, 방광암, 신장 세포 암종, 두부경부암, 식도암 및 위암, 직장암, 간암종, 육종, 윌름 종양, 호지킨 림프종, ALK-신경모세포종, (호르몬 불응성) 전립선암 및 GIST로 이루어진 군으로부터 선택되는 암을 앓는 환자의, 면역 체크포인트를 표적화하는 의약에 대한 환자의 반응을 예측 및 최적화하는 데 사용될 수 있다.
필요하다면, 다른 정의가 하기에서 상술될 것이다.
제1 측면에 따라, 본 발명은 암을 치료하기 위한 조합 치료에서의 박테리아 조성물의 용도로서, 여기서 박테리아 조성물은 서열식별번호 1의 단백질, 또는 서열식별번호 13, 14, 53 내지 188 및 209로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 에피토프를 포함하는, 적어도 9개, 바람직하게는 적어도 20개의 아미노산의 그의 단편을 발현하는 적어도 하나의 박테리아 균주를 포함하는 것인, 박테리아 조성물의 용도에 관한 것이다.
본 발명의 프레임에서, 조성물 중에 존재하는 적어도 하나의 박테리아 균주는 자연적으로 발생된 균주 또는 유전자 기술 또는 임의의 다른 기법에 의해 수득된 인공, 조작된 균주일 수 있다. 2013년 11월 7일에 번호 I-4815 하에 CNCM에 기탁된 엔테로코쿠스 히라에 균주 13144와 상이한 균주가 본 발명에 따라 사용될 수 있다.
본 문서에서, "박테리아 조성물"은 박테리아, 특히, 살아있는 박테리아를 포함하는 임의의 조성물을 지칭한다. 조성물은 1종의 단일 균주의 순수한 배양물, 수개의 배양된 균주 및/또는 복합 물질, 예컨대, 대변 미생물총 이식 (FMT)을 수행하기 위한 대변 물질의 믹스를 포함할 수 있다. 조성물은 액체 조성물일 수 있다. 대안적으로, 조성물은 냉동 건조 또는 동결건조된 물질을 포함할 수 있고, 이는 식용가능 제품, 또는 잘 부서지는 제품, 예컨대, 비스킷 같은 제품으로서 제제화되거나, 또는 그로 제조될 수 있으며, 이는 예컨대, 분말로 파쇄되어 드링크에 용해되거나, 또는 정제 또는 캡슐 내로 삽입될 수 있다. 대안적으로, 박테리아 조성물은 건식 로젠지 또는 츄잉 검 또는 등가물 형태일 수 있다. 본 발명에 따른 조성물은 또한 분말 형태, 또는 등가물로 제조 및/또는 제제화될 수 있고; 상기 제제는 예컨대, 정제 또는 캡슐로, 또는 예컨대, 결장경 또는 비장관 등의 채널 내로의 삽입, 혼합 또는 주사를 위해 예를 들어 균열 개봉하여 액체 중에 용해시키기 위한 앰플로 보관하는 데 유용할 수 있거나; 또는 바로 첨가될 수 있게 준비가 된 백 내 분제로서, 예를 들어, 비위관 (또는 등가물), 또는 결장경, 또는 위내시경 등 내로 주입될 수 있는 액제로서 보관하는 데 유용할 수 있다. (박테리아를 제외한) 본 발명에 따른 박테리아 조성물에 존재할 수 있는 가능성을 나타내는 성분으로는 염, 완충제, 영양제, 물, 제약상 허용되는 부형제, 동결보호제 등을 포함한다.
암을 치료하기 위한 조합 치료에서 박테리아 조성물을 사용한다는 것은 항신생물성 약물의 효과를 강화시키거나, 또는 그를 증가시키기 위하여 박테리아 조성물을 상기 항신생물성 약물과 조합하여 사용한다는 것을 의미한다. 이롭게는 본 발명에 따른 박테리아 조성물과 조합하여 투여될 수 있는 약물의 비제한적인 예로 화학요법, 특히, 알킬화제 (예컨대, 시클로포스파미드), 면역 체크포인트 차단제 (예컨대, 단독으로 또는 조합하여 사용되는, CTLA-4, PD1, PD-L1 또는 PD-L2 등을 길항시키는 약물), 수용체를 활성화시키기 위한 면역 표적화 항체 (예컨대, 항-ICOS, 항-OX40, 항-CD137, 항-CD28 항체), CDK4/6 억제제 등을 포함한다. 의사는 상황에 따라 환자에게 박테리아 조성물과 조합하여 어떤 약물을 투여할지를 선택할 뿐만 아니라, 치료 프로토콜 (즉, 항신생물성 약물(들) 및 박테리아 조성물의 투여 순서)도 선택할 것이다.
본 발명에 따른 조성물의 바람직한 실시양태에 따라, 적어도 하나의 박테리아 균주는 서열식별번호 1의 단백질과 적어도 80%, 바람직하게는 적어도 90% 및 더욱 바람직하게는 적어도 95%의 동일성을 갖는 단백질을 코딩하는 프로파지 게놈을 포함한다.
본 발명의 특정 실시양태에서, 박테리아 조성물 중 적어도 하나의 균주는 서열식별번호 2의 프로파지 (하기 실험부에서 "프로파지 2"로서 식별되는 E. 히라에 13144의 프로파지)와 적어도 80%, 및 바람직하게는 적어도 90% 또는 95%의 동일성을 갖는 프로파지 게놈을 보유하고, 이에 따라 상기 프로파지에 의해 코딩된 파지는 생체내에서 조성물의 다른 균주 및/또는 조성물을 투여받는 환자의 장 미생물총의 공생 박테리아를 감염시킬 수 있다.
본 발명은 또한
(i) 2013년 11월 7일에 번호 I-4815 하에 콜렉션 내셔널 드 컬처즈 드 마이크로오가니즘즈 (CNCM)에 기탁된 엔테로코쿠스 히라에 균주 13144,
(ii) 2017년 8월 31일에 번호 I-5224 하에 CNCM에 기탁된 엔테로코쿠스 히라에 균주 IGR7,
(iii) 2017년 11월 27일에 번호 I-5261 하에 CNCM에 기탁된 엔테로코쿠스 히라에 균주 IGR11,
(iv) 서열식별번호 1의 테일 테이프 메져 단백질 (TMP) (하기 실험부에서 "프로파지 2의 TMP"로 명명됨)로부터의 적어도 20개, 바람직하게는 적어도 30개 및 더욱 바람직하게는 적어도 40개 뉴클레오티드의 단편과 적어도 65%, 바람직하게는 적어도 80% 및 더욱 바람직하게는 적어도 95%의 동일성을 갖는 단백질을 발현하는 임의의 다른 박테리아 균주, 및
(v) (i) 내지 (iv)에서 언급된 균주들 중 적어도 2개의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 박테리아를 포함하는 박테리아 조성물에 관한 것이다.
한 실시양태에 따라, 본 박테리아 조성물은 암을 치료하는 데 사용된다.
본 발명에 따른 조성물 중에 존재하는 박테리아 균주는 임의의 박테리아 과에 속하는 것일 수 있다. 물론, 박테리아는 암을 앓는 환자에게 투여되기 때문에, 비병원성 박테리아가 우선적으로 사용될 것이다. 그러므로, 엔테로코쿠스 히라에 균주 이외의 다른 박테리아 또한 본 발명에 따라 사용될 수 있다.
이미 언급된 바와 같이, 박테리아 조성물은 전형적으로 그를 필요로 하는 환자에게 항신생물성 약물과 조합하여 투여된다.
한 실시양태에 따라, 본 발명에 따른 박테리아 조성물은 2017년 11월 27일에 번호 I-5260 하에 CNCM에 기탁된 엔테로코쿠스 히라에 균주 IGR4를 추가로 포함한다.
한 실시양태에 따라, 하기 실험부에서 예시되는 바와 같이, 조성물은 엔테로코쿠스 히라에 균주 13144 (CNCM I-4815), 엔테로코쿠스 히라에 균주 IGR7 (CNCM I-5224) 및 엔테로코쿠스 히라에 균주 IGR4 (CNCM I-5260)를 포함한다.
본 발명의 특정 실시양태에 따라, 박테리아 조성물은 프로파지에 의해 코딩된 파지의 용균 주기를 일으킬 수 있는 항신생물성 약물과 조합하여 사용된다. 상기 약물의 비제한적인 예로는 하기 실시예 8에 제시된 바와 같이, 미토마이신 C 뿐만 아니라, 실시예 16에 제시된 바와 같이, CDK4/6 억제제가 있다.
한 실시양태에 따라, 박테리아 조성물은 서열식별번호 2의 프로파지와 적어도 80%, 및 바람직하게는 적어도 95%의 동일성을 갖는 프로파지 게놈을 보유하는 적어도 하나의 균주를 포함하고, 이에 따라 상기 프로파지에 의해 코딩된 파지는 생체내에서 조성물의 다른 균주, 및/또는 가능하게는, 환자의 장 미생물총에 이미 존재하고 있는 다른 박테리아를 감염시킬 수 있다.
본 발명의 또 다른 측면은 시험관내에서 관심의 대상이 되는 항암 프로바이오틱의 박테리아 균주 내로 서열식별번호 1의 TMP, 또는 적어도 서열식별번호 13 및 14의 펩티드를 포함하는 그의 단편을 코딩하는 뉴클레오티드 서열, 또는 서열식별번호 53 내지 187로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 에피토프를 포함하는 적어도 9개, 바람직하게는 적어도 20개의 아미노산의 펩티드를 코딩하는 서열, 또는 서열식별번호 209의 적어도 하나의 에피토프를 포함하는 적어도 9개, 바람직하게는 적어도 20개의 아미노산의 펩티드를 코딩하는 서열을 도입함으로써 관심의 대상이 되는 항암 프로바이오틱의 박테리아 균주의 면역원성을 증가시키는 방법이다. 서열식별번호 13 및 14의 펩티드는 마우스 H-2Kb에 결합하는 면역원성 에피토프에 상응할 뿐만 아니라, 종 간에 공유되는, 상기 서열 중 일부 또는 더 광범위한 서열에 결합할 수 있는 적절한 HLA 클래스 I 하플로타입을 보유하는 인간에서도 면역원성을 띨 수 있다. 서열식별번호 53 내지 187의 서열은 인실리코로 인간 HLA 분자에 의한 결합이 이루어지는, 서열식별번호 1의 TMP로부터의 에피토프인 것으로 확인되었다 (하기 표 9 참조). 서열식별번호 209 (KLX1KFASX2V, 여기서 X1=A 또는 Q 및 X2=V 또는 T)는 서열 KLAKFASVV (서열식별번호 63)의 TMP1 HLA-A*0201-제한 면역원성 에피토프, 서열 KLQKFASTV (서열식별번호 188)의 GPD1L로부터의 인간 HLA-A*0201-제한 에피토프 뿐만 아니라, 상기 두 에피토프의 2개의 하이브리드: KLAKFASTV (서열식별번호 210) 및 KLQKFASVV (서열식별번호 211)에 상응한다. 이롭게는, 관심의 대상이 되는 항암 프로바이오틱의 박테리아 균주는 상이한 HLA 하플로타입에 의해 제공될 수 있는 수개의 에피토프를 포함하는 서열로 형질도입되고, 생성된 박테리아 균주는 상이한 HLA 하플로타입의 환자에서 상기 에피토프에 대하여 면역원성을 나타낸다.
한 실시양태에 따라, 뉴클레오티드 서열은 적어도, HLA-A0201-제한 에피토프인, KMVEILEEI (서열식별번호 55), RLLKYDVGV (서열식별번호 56), LLGIYQSYV (서열식별번호 62), KLAKFASVV (서열식별번호 63) 또는 ILVAITTTI (서열식별번호 66)를 코딩하고, 그의 면역원성은 인간에서 실험을 통해 확인되었다 (하기 실시예 7 및 도 24b 참조). 특정 실시양태에서, 뉴클레오티드 서열은 적어도 KLAKFASVV (서열식별번호 63), KLQKFASTV (서열식별번호 188) 또는 서열 KLX1KFASX2V (여기서, X1=A 또는 Q 및 X2=V 또는 T) (서열식별번호 209)의 임의의 다른 에피토프를 코딩한다.
한 실시양태에 따라, 박테리아 균주는 서열식별번호 1의 TMP와 80%, 90% 또는 95%, 바람직하게는 97.5% 및 더욱 바람직하게는 98.7%의 동일성을 갖는 단백질을 코딩하거나, 또는 상기 기술된 바와 같은 적어도 하나의 에피토프를 포함하는 상기 단백질의 단편을 코딩하는 핵산 (예를 들어, 플라스미드)으로 형질도입된다. 통상의 기술자는 생성된 박테리아 균주가 TMP 또는 그의 단편을 발현하도록 적절한 서열 (프로모터 등)을 선택할 것이다.
한 실시양태에 따라, 박테리아 균주는 서열식별번호 1의 TMP와 적어도 80%, 바람직하게는 적어도 90% 및 더욱 바람직하게는 적어도 95%의 동일성을 갖는 TMP를 코딩하는 박테리오파지로 감염된다.
추가로, 임의의 관심 박테리아 균주는 그가 고병원성을 나타내지 않는다면, 본 방법에서 사용될 수 있다. 특히, 관심의 대상이 되는 그의 프로바이오틱에 대해서 이미 공지된 박테리아 균주는 박테리오파지를 이용하는 시험관내 감염에 의해, 또는 TMP 또는 그의 단편을 코딩하는 플라스미드를 이용한 형질도입에 의해 조작될 수 있다. 상기 박테리아의 비제한적인 예로는 아커만시아 무시니필라(Akkermansia muciniphila), 루미노코카카에(Ruminococcacae ) , 파에칼리박테리움(Faecalibacterium), 클로스트리디움 라모숨(Clostridium ramosum), 클로스트리디움 XVIII, 알리스티페스(Alistipes) 종 (A. 온데르돈키이(A. onderdonkii), (A. 피네골디이(A. finegoldii), A. 샤히이(A. shahii)), 유박테리움(Eubacterium) 종, 박테로이달레스 종 , 메타노브레비박터 스미시이(Methanobrevibacter smithii), 락토바실러스 존소니(Lactobacillus johnsonii), 박테로이데스 프라길리스(Bacteroides fragilis), 박테로이데스 테타이오타오미크론(Bacteroides thetaiotaomicron), 박테로이데스 살리에르시아에(Bacteroides salyersiae), 부르크홀데리아 세파시아(Burkholderia cepacia), 부르크홀데리아 세노세파시아(Burkholderia cenocepacia), 바르네시엘라 인테스티니호미니스, 에리시펠로클로스트리디아(Erysipeloclostridia) 및 에리시펠로트리카세아에(Erysipelotrichaceae), 콜린셀라 인테스티날리스(Colinsella intestinalis), 콜린셀라 타카카에이(Collinsella takakaei), 에그게르텔라 렌타(Eggerthella lenta)/코리오박테리아세아에(Coriobacteriaceae), 비피도박테리아(Bifidobacteria) (롱굼(longum), (브레베(breve), 터모필루스(termophilus), 아돌레센티스(adolescentis)...) 및 E. 콜라이를 포함한다. 더욱 특히, 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli), 엔테로코쿠스 갈리나룸(Enterococcus gallinarum), 엔테로코쿠스 파에칼리스(Enterococcus faecalis) 및 엔테로코쿠스 히라에가 상기 기술된 방법을 통해 면역원성이 증가된 박테리아 균주를 수득하기 위한 출발 물질로서 사용될 수 있다.
상기 방법의 특정 실시양태에 따라, 박테리오파지는 서열식별번호 2의 뉴클레오티드 서열, 또는 그와 적어도 90% 또는 적어도 95%의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 게놈을 갖는다. 바람직한 실시양태에 따라, 박테리오파지는 엔테로코쿠스 히라에 13144 (CNCM I-4815)에 존재하는 39.2 kb의 프로파지와 동일한 게놈을 갖는다.
특정 실시양태에 따라, 본 발명은 상기 기술된 바와 같은 방법에 의해 수득된 박테리아 균주에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 상기 정의된 TMP 단백질을 코딩하는 파지로의 프로바이오틱 균주의 시험관내 감염에 의해 수득된 비자연적으로 발생된 박테리아 균주로서, 여기서 프로바이오틱 균주는 자연상에서는 상기 박테리오파지에 의해 감염되는 것으로 공지되어 있지 않은 것인, 박테리아 균주에 관한 것이다. 또 다른 실시양태에 따라, 본 발명은 유전자 편집에 의해, 또는 임의의 다른 기술에 의해 상기 정의된 TMP 단백질을 코딩하는 핵산, 또는 그의 단편으로의 형질도입에 의해 수득된 비자연적으로 발생된 박테리아 균주에 관한 것이다.
증가된 면역원성 및 개선된 항암 특성을 갖도록 조작된, 본 발명에 따른 박테리아 균주는 이롭게는 암 치료에서 사용된다.
이러한 조작된 박테리아 균주, 특히, 서열식별번호 63, 188 및 209 중에서 선택되는 에피토프를 포함하는 단백질, 폴리펩티드 또는 펩티드를 발현하는 박테리아 균주는 HLA-A*0201 환자에서 암을 치료하는 데 효율적으로 사용될 수 있다.
이미 언급된 바와 같이, 상기 기술된 바와 같이 조작된 박테리아 균주를 포함하는 것을 비롯한, 본 발명의 박테리아 조성물은 이롭게는 박테리아에 존재하는 프로파지에 의해 코딩된 파지의 용균 주기를 일으킬 수 있는 항신생물성 약물과 함께, 및/또는 면역 체크포인트 차단제와 조합하여 사용된다.
본 발명은 또한 서열식별번호 1의 TMP 또는 서열식별번호 209의 서열로부터의 적어도 9개의 연속 아미노산의 서열을 포함하는 폴리펩티드, 또는 그를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 면역원성 조성물에 관한 것이다. 상기 조성물은 이롭게는 뉴클레오티드 서열 (mRNA 또는 cDNA)로, 또는 적어도 9개의 아미노산, 예를 들어, 9 aa (적절한 MHC 클래스 I 그루브에 직접 결합하는 짧은 펩티드) 내지 20 내지 30개의 아미노산 (그의 MHC 클래스 I 및 II 분자에 의해 DC에 의해 교차 제시되는 긴 펩티드)의 펩티드 스트레치로 항암 백신으로서 사용될 수 있다. 수지상 세포 또는 상기 폴리펩티드, 또는 상기 cDNA에 대한 재조합체를 제시하는 인공 항원 제시 세포는 환자 또는 건강한 지원자로부터의 종양 또는 혈액으로부터 나이브 또는 이펙터 기억 T 림프구를 프라이밍 및 증폭시키기 위한 플레이트폼으로써 작용할 수 있다.
본 발명에 따른 면역원성 조성물의 특정 실시양태에 따라, TMP로부터의 적어도 9개의 연속 아미노산의 서열은 MHC I 인간 분자에 의해 제시될 수 있는 가능성이 있는 것으로 확인된 펩티드, 예컨대, 서열식별번호 53-187의 펩티드이다. 본 발명에 따른 구체적인 면역원성 조성물은 HLA-A2 개체에서 면역원성을 나타내는 것으로 입증된, 서열식별번호 55, 56, 62, 63 또는 66의 펩티드 서열을 포함한다 (실시예 7). 또 다른 구체적인 실시양태에 따라, 면역원성 조성물은 서열식별번호 63, 서열식별번호 188 또는 서열식별번호 209의 서열을 포함하는 펩티드, 또는 그를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 상기 면역원성 조성물은 특히 HLA-A*0201 환자에서 항암 백신으로서 유용하고, 상기 환자가 (mRNA 또는 단백질 수준으로 측정된) 높은 GPD1L 발현 수준을 보이는 종양을 앓는다면 특히 그러하다.
본 발명에 따른 특정 면역원성 조성물에 따라, 폴리펩티드는 짧은 폴리펩티드 (9-, 10- 또는 11-량체)이다. 상기 짧은 펩티드가 피하로 주사되었을 때, 이는 주사 부위에 존재하는 모든 세포의 MHC 분자에 직접 결합한다. 본 발명의 본 실시양태에 따라, 수개의 TMP 에피토프를 포함하는 펩티드 칵테일은 이롭게 사용될 수 있다. 동일한 HLA 분자에 대해 특이적인 수개의 에피토프가 함께 사용될 때, 에피토프는 상응하는 HLA 분자에의 결합에 대해 경쟁한다는 점에 주의한다. 이에 반해, 상이한 HLA-제한 에피토프 (예컨대, HLA-A*0201, HLA-A*2402, HLA-B*0702 등)의 믹스를 사용하면, HLA 결합에 대한 경쟁은 없을 것이다. 상기 펩티드 칵테일의 또 다른 이점은 더욱 광범위한 환자에서, 즉 상기 칵테일에 존재하는 에피토프에 상응하는 HLA 분자 중 임의의 것을 발현하는 개체에서 효과적이라는 점이다.
본 발명에 따른 또 다른 특정 면역원성 조성물에 따라, 폴리펩티드는 생체내에서 항원 제시 세포에 의해 내재화되고, 프로세싱되는, 10-20개의 아미노산에 의해 플랭킹되는, 서열식별번호 53 내지 187 중에서 선택되는 적어도 하나의 9-10개의 TMP 면역원성 스트레치를 포함하는, 20 내지 50개의 아미노산, 바람직하게는 25 내지 40개의 아미노산의 긴 폴리펩티드이다. 이어서, 상기 항원 제시 세포는 폴리펩티드의 단편을 제시할 것이며, 이에 따라 TMP 에피토프에 대한 면역원성 반응을 일으키게 된다. 상기의 긴 폴리펩티드는 이롭게는 국소 DC에 의해 숙주의 MHC 클래스 I 분자 뿐만 아니라, MHC 클래스 II 분자 내로 교차 제시될 수 있다. 예를 들어, 키메라 폴리에피토프 폴리펩티드, 즉, 가능하게는 펩티드 링커에 의해 이격되어 있는, 연속된 TMP의 에피토프를 포함하는 폴리펩티드가 사용될 수 있다. 물론, 상기 단락에서 언급된 것과 동일한 이유에서, 긴 폴리펩티드는 이롭게는 상이한 HLA-제한 에피토프를 포함한다. 상기 키메라 폴리에피토프 폴리펩티드는 또한 TMP와 상이한 항원으로부터의 에피토프, 예를 들어, 종양 항원으로부터의 에피토프를 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 면역원성 조성물은 또한 이롭게는 적절한 아주반트를 포함한다. 통상의 기술자는 펩티드 유형 및 적용 유형에 의존하여 가장 적절한 아주반트를 선택하게 될 것이다. 본 발명에 따라 사용될 수 있는 비제한적인 아주반트로는 몬타니드(Montanide), Flt3L, 시클로포스파미드, DC 및 TLR 또는 STING 효능제를 포함한다.
한 실시양태에 따라, 면역원성 조성물은 서열식별번호 1의 TMP로부터의 적어도 9개의 연속 아미노산의 서열을 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 상기 조성물은 이롭게는 항암 백신으로서 사용될 수 있다. 본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드 조성물의 예로는 네이키드 DNA, TMP를 코딩하는 mRNA, RNA 로딩 나노입자 및 재조합 바이러스 (예컨대, 렌티바이러스, 종양용해성 바이러사, 아데노바이러스, 폭스바이러스 등)를 포함한다. 물론, 본 발명에 따른 조성물에 포함시키고자 하는 폴리뉴클레오티드를 디자인할 때, 폴리펩티드 조성물 중 상이한 HLA 분자에 대해 특이적인 에피토프를 혼합하는 것이 갖는 이점에 관하여 상기 언급된 고려 사항이 적용된다. 대안적으로, 에피토프는 환자의 HLA 하플로타입에 따라 선택되고, 개인 맞춤화될 수 있다 (표 9).
또 다른 측면에 따라, 본 발명은 상기 기술된 바와 같은 박테리아 조성물로, 또는 본 발명에 따른 면역원성 조성물로 생체외에서 펄싱된 항원 제시 세포 (APC)를 포함하는 세포 조성물에 관한 것이다. 상기 세포 조성물은 이롭게는 암 환자의 세포 요법을 위해 사용될 수 있다.
그의 또 다른 측면에 따라, 본 발명은 서열식별번호 1의 TMP에 대하여 높은 친화성을 갖는 T 세포를 단리시키기 위한 MHC 다량체에 관한 것이다. 상기 MHC 다량체에서, MHC 분자는 바람직하게는 서열식별번호 53 내지 187로 이루어진 군으로부터 선택되는 펩티드에, 예를 들어, 서열식별번호 55, 56, 62, 63 및 66의 것 중에서 선택되는 적어도 하나의 펩티드에, 또는 서열식별번호 188 또는 209 중 적어도 하나의 펩티드에 결합한다. 본 발명에 따른 MHC 다량체는 크기가 이량체 내지 팔량체 (예컨대, 사량체, 오량체, 육량체) 범위이거나, 또는 심지어는 다량체 1개당 더 많은 양의 MHC로 구성된 것 (예컨대, 덱스트라머)도 사용된다. 본 발명에 따른 특정 MHC 다량체는 HLA-A*0201/KLAKFASVV 다량체, HLA-A*0201/KLQKFASTV 다량체, HLA-A*0201/KLQKFASVV 다량체 및 HLA-A*0201/KLAKFASTV 다량체 (예컨대, 사량체 또는 덱스트라머)이다.
본 발명에 따른 또 다른 세포 조성물은 서열식별번호 1의 TMP에 특이적인 CD4+ 또는 CD8+ T 세포를 포함한다. 상기 조성물에 포함된 세포는 (예를 들어, 상기 기술된 바와 같은 MHC 다량체를 사용하는) 세포 분류, 이어서, 생체외 확장에 의해, 또는 TMP에 대해 결합력이 높은 TCR을 코딩하는 cDNA를 T 림프구에 형질도입함으로써 수득될 수 있다. 상기 조성물을 수득하는 데 사용될 수 있는 프로토콜의 예는 하기 실시예 10 및 11에 개시되어 있다.
이미 언급된 바와 같이, 상기 기술된 면역원성 조성물 및 세포 조성물은 암 치료에 사용될 수 있다. 그러한 암 치료에서, 상기 조성물은 단독으로, 또는 상기 기술된 바와 같은 펩티드 또는 뉴클레오티드 백신과 조합하여 및/또는 항신생물성 치료, 예컨대, 화학요법, 예를 들어, 알킬화제 예컨대, 시클로포스파미드, 또는 면역 체크포인트 차단제, 특히, 항-PD1/PD-L1/PD-L2 항체와 조합하여 사용될 수 있다.
본 발명은 또한 암 치료를 위한, 서열식별번호 1의 TMP과 적어도 90%, 바람직하게는 적어도 95-98.7%의 동일성을 갖는 단백질을 발현하는 박테리오파지의 용도에 관한 것이다. 상기 박테리오파지는 바람직하게는 제약상 허용되는 조성물로 제제화되고, 이는 경구적으로 또는 종양내로 투여될 수 있다.
본 발명의 박테리오파지 조성물의 특정 실시양태에 따라, 박테리오파지는 박테리아 조성물은 서열식별번호 2의 뉴클레오티드 서열, 또는 그와 적어도 90% 또는 95%의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 게놈을 갖는다.
암 환자를 치료할 때, 본 발명에 따른 박테리오파지 조성물은 이롭게는 면역 체크포인트를 차단하는 약물과 조합하여, 예를 들어, 항-PD1/PD-L1/PD-L2 항체와 조합하여 투여될 수 있다.
하기 실험부에서 설명되는 바와 같이, 본 발명자들은 HLA-0201-제한 에피토프 KLAKFASVV (서열식별번호 63)가 글리세롤-3 포스페이트 데히드로게나제 1 유사 단백질 (GPD1L, 3p22.3에서 코딩된 유전자)의 에피토프 (KLQKFASTV, 서열식별번호 188)와 78%의 서열 상동성을 공유한다는 것을 발견하게 되었고, TMP 파지 특이적 TCR 및 자기 조직 또는 (GPD1L을 과다발현하는) 종양 조직 사이의 교차 반응성이 본 발명과 관련하여 전달된 파지의 항암 효과를 설명해 줄 수 있다고도 생각해 볼 수 있다. 그러므로, 본 발명의 박테리아 조성물, 면역원성 조성물, 세포 조성물 및 박테리오파지 조성물은 GPD1L을 과다발현하는 종양, 즉, GPD1L mRNA 수준이 쌍을 이룬 정상 조직에서 발현된 수준보다 더 높은 종양 (예를 들어, 폐암 대 주변의 "건강한" 폐 실질)을 치료하는 데 유용하다. 실제로, GPD1L을 과다발현하는 종양은 TMP 파지-관련 HLA 제한-펩티드 또는 핵산 또는 다른 백신 양식을 이용한 진피내 부스트의 존재 또는 부재하에서, E. 히라에 13144 또는 EH IGR7 또는 EH IGR11 또는 3개 균주 모두의 조합, 또는 서열식별번호 63을 포함하는 서열식별번호 1의 TMP 또는 그의 단편에 대한 임의의 다른 박테리아 재조합체의 경구 요법에 대해 선택적으로 자격이 있는 것으로 간주될 것이다. 이는 폐암, 흑색종, 소화관의 종양, 방광암, RCC 및 유방암 또는 임의의 태아 항원 발현 종양에 적용된다.
본 발명의 또 다른 측면은 약물 후보를 균주 CNCM I-4815로부터의 박테리아 (또는 서열식별번호 2의 프로파지와 적어도 80% 및 바람직하게는 적어도 90% 또는 95%의 동일성을 갖는 프로파지 게놈을 보유하는 임의의 다른 박테리아 균주)와 함께 인큐베이션되었을 때, 서열식별번호 1의 TMP를 포함하는 파지의 용균 주기를 일으키는 약물 후보의 능력에 대해 평가하는 단계를 포함하는, 항신생물성 약물을 확인하기 위한 스크리닝 방법이다. 상기 방법을 수행할 때, 통상의 기술자는 상이한 농도의 약물 후보를 사용할 수 있고, 인큐베이션의 여러 시점에 파지 절제를 측정할 수 있다.
본 발명은 또한 모든 결정은 환자의 화학요법 또는 면역 체크포인트 차단에 의한 치료에 대한 반응에서 균주 CNCM I-4815에 의해 발현된 파지 TMP 단백질의 중요성을 보여주는, 하기 개시되는 결과에 기초하는 것인, 환자가 화학요법 또는 면역 체크포인트 차단에 의한 치료에 대하여 양호한 반응자가 될 가능성이 있는지 여부를 결정하는 진단치료(theranostic) 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 암, 예컨대, NSCLC, RCC, 방광암, 췌장암, 결장직장암 및 유방암을 앓는 환자가 화학요법 또는 면역 체크포인트 차단에 의한 치료에 대하여 양호한 반응자가 될 가능성이 있는지 여부를 결정하는 데 특히 유용하다. 더욱 특히, 상기 방법은 이롭게는 NSCLC 또는 RCC 진단시, ICB를 이용한 면역요법 이전에 환자에 사용될 수 있다.
본 발명의 본 측면의 한 실시양태에 따라, 본 발명의 진단치료 방법은 상기 환자로부터의 생물학적 샘플 중 서열식별번호 1의 TMP와 적어도 80%, 90% 또는 95%의 동일성을 갖는 서열의 존재에 대해 평가하는 단계를 포함한다. 본 방법에 따라, 상기 서열이 샘플 중에 존재한다면, 상기 환자는 치료에 대하여 반응할 가능성이 있는 것으로 간주된다. 본 방법을 수행하는 데 사용될 수 있는 생물학적 샘플의 비제한적인 예로는 종양 게놈, 종양내 박테리아 로드, 대변 파지, 파지를 함유하는 대변 박테리아, 대변 샘플, 기관지폐포 샘플, 협측 샘플 및 객담이 있다.
더욱 구체적으로, 본 방법은 특정 서열의 PCR 증폭에 의해 수행될 수 있고, 하기 단계:
(i) 환자로부터의 대변 샘플을 호기성 조건하에, 엔테로코쿠스 콜로니가 단리될 수 있도록 하는 허용 배지 중에서 배양하는 단계,
(ii) 서열식별번호 1의 단편에 대해 특이적인 한 쌍의 프라이머를 이용하여 수개의 배양가능한 단리된 콜로니에서 PCR을 수행하는 단계, 및
(iii) 증폭된 단편을 검출하는 단계를 포함한다.
더욱 구체적으로, 단계 (ii)에서, PCR은 각각의 E. 갈리나룸, E. 히라에 및 E. 파에칼리스 단리된 대변 콜로니 내에서, 또는 적어도 그 중 3 내지 5개에서 수행될 수 있다. 예를 들어, PCR은 서열식별번호 191 및 192의 프라이머를 사용하여 수행될 수 있고, 이에 따라 1026 bp의 앰플리콘이 생성될 수 있다.
본 발명은 또한 화학요법 또는 면역 체크포인트 차단에 의한 치료 동안 예를 들어, 유세포 분석법 또는 TMP 사량체-결합 T 림프구에 의해 순환 CCR9+ CXCR3+ CD8+ T 세포 수준을 측정하는 단계를 포함하고, 여기서 상기 수준이 미리 결정된 임계치를 초과한다면, 환자는 치료에 대하여 반응할 가능성이 있는 것인, 환자가 화학요법 또는 면역 체크포인트 차단에 의한 치료에 대하여 양호한 반응자가 될 가능성이 있는지 여부를 결정하는 방법에 관한 것이다.
특정 실시양태에 따라, 상기 기술된 바와 같은 MHC 다량체는 암 환자로부터의 생물학적 샘플 중, 서열식별번호 1의 단백질에 특이적인 T 세포의 존재를 평가하는 데 사용된다. 샘플 중에 상기 T 세포가 존재한다는 것은 환자가 치료에 대하여 반응할 가능성이 있다는 것을 시사하는 것이다. 더욱 특히, 본 방법이 HLA-A*0201 환자가 화학요법 또는 면역 체크포인트 차단에 의한 치료에 대하여 양호한 반응자가 될 가능성이 있는지 여부를 평가하기 위해 수행될 때, HLA-A*0201/서열식별번호 209 다량체가 사용될 수 있다.
또 다른 실시양태에 따라, 본 발명의 진단치료 방법은 종양 중 GPD1L mRNA 수준 또는 GPD1L 단백질 수준을 평가하는 단계를 포함하고, 여기서 상기 수준이 미리 결정된 임계치를 초과한다면, 환자는 치료에 대하여 반응할 가능성이 있는 것이다.
물론, 의사 또는 숙련된 기술자는 예를 들어, 종양 중 GPD1L 발현 수준 및 KLAKFASVV (서열식별번호 63)에 특이적인 T 세포의 존재, 또는 GPD1L 발현 수준 및 서열식별번호 1의 TMP과의 동일성(%)이 높은 서열의 존재, 이 둘 모두를 평가함으로써 상기 방법을 조합하여 환자가 치료에 대하여 반응하게 될 예후를 정제할 수 있다.
상기 기술된 진단치료 방법을 수행할 때, 환자가 화학요법 또는 면역 체크포인트 차단에 의한 치료에 대하여 양호한 반응자가 될 가능성이 있는 것으로 확인되지 않는다면, 이롭게는 본 발명에 따른 박테리아 조성물을 이용하는 프로바이오틱 치료를 환자에게 수행하여 남성/여성 환자가 치료에 대해 반응할 수 있는 기회를 증가시킬 수 있다. 환자의 반응을 증가시키기 위한 또 다른 전처리 처치는 상기 기술된 바와 같은 면역원성 조성물을 이용한 백신접종이다.
본 발명의 틀에서 수행되었고, 그의 범주를 제한하지 않으면서, 필요한 실험적 지원을 제공하는 생물학적 검정법이 하기에서 설명되는 과정에서 본 발명의 다른 특징들 또한 명백해질 것이다.
실시예
본 발명을 예시하는 실험 중 일부는 하기 실시예에서, 지난 몇 년간 본 발명자들의 연구 노력을 계속되어 왔고, 그 결과로, E. 히라에 균주 13144, IGR7 및 IGR11의 효과를 설명하는 기전에 관한 더욱 정확한 정보를 얻게 되었고, 항-종양 특성을 갖는 새로 조작된 균주를 디자인할 수 있게 되었음을 보여주면서, 2회에 걸쳐 기술된다.
물질 및 방법
도 1 내지 26에 도시된 각 실험을 위해, 실험을 수행하는 데 사용된 물질 및 방법은 도 범례에 상세하게 설명되어 있다.
하기 표는 하기 실시예 1 내지 11에서 언급된 E. 히라에 균주를 요약한 것이다.
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표 1 : 본 연구에서 사용된 균주. "IGR"로 명명되는 균주는 2017년 프랑스 빌레쥬프 소재의 구스타브 루시(Gustave Roussy)의 U1015 INSERM에 의해, 제2선 요법으로서 니볼루맙을 이용하여 이제 막 치료받을 예정이고, 진단시 비소세포 폐암이었던 환자로부터 익명으로 단리되었다. 708은 INRA로부터 입수한 것이지만, 원래는 10여년 전 스페인 공동 연구자가 보낸 것이다. 다른 모든 균주들은 렌 CHU(CHU de Rennes)-호피탈 폰차일루-서비스 데 박테리오로지-하이지엔느 호스피탈리에(Hoepital Ponchaillou-Service de Bacteriologie-Hygiene hospitaliere: 프랑스 35033 렌느 세덱스 뤼 헨리 레 길록스 2)의 공생 및 병원성 엔테로코쿠스 참조 센터 책임자인 빈센트 카투아르(Vincent Cattoir) 박사로부터 입수한 것이다.
하기 물질 및 방법은 또한 하기 실시예 12 내지 16에 보고된 실험을 수행하는 데에도 사용되었다.
세포 배양물, 시약 및 종양 세포주
MCA-205 WT를 37℃에서 5% CO2 하에 10% FCS, 2 mM L-글루타민, 100 UI/ml 페니실린/스트렙토마이신, 1 mM 피루브산 나트륨 및 MEM 비필수 아미노산을 함유하는 RPMI 1640 (이후 완전 RPMI1640으로 지칭됨) 중에서 배양하였다. 모든 시약은 기브코-인비트로겐(Gibco-Invitrogen: 미국 캘리포니아주 칼즈배드)으로부터 구입하였다.
마우스
모든 동물 실험은 프랑스 및 유럽 법과 규제를 준수하며 수행되었다. 지방 기관 위원회는 모든 마우스 실험을 승인하였다 (허가 번호: 2016-109-7450). 실험은 정부 및 기관 가이드라인 및 규제에 따라 수행되었다. 암컷 C57BL/6은 할란(Harlan: 프랑스)으로부터 구입하였다. 7 내지 12주령된 마우스가 사용되었다. 모든 마우스 실험은 구스타브 루시 캔서 캠퍼스에 있는 동물 시설에서 수행되었으며, 여기서 동물은 특정 병원체 부재 조건하에서 하우징되었다.
항생제 처리
마우스의 멸균 식수에 첨가된, 암피실린 (1 mg/ml), 스트렙토마이신 (5 mg/ml), 콜리스틴 (1 mg/ml) (시그마-알드리치(Sigma-Aldrich)) 및 반코마이신 (0.25 mg/ml)을 함유하는 항생제 용액 (ATB)으로 마우스를 3일 동안 처리하였다. BHI+15% 글리세롤 중에 0.1 g/ml로 재현탁된 대변 펠릿을 호기성 및 혐기성 조건하에 37℃에서 48h 동안 COS (5% 양 혈액을 포함하는 BD 콜롬비아 아가(Columbia Agar)) 플레이트 상에서 배양함으로써 항생제 활성을 확인하였다. 박테리아 이식 실험과 관련하여, 마우스는 박테리아 이식을 받기 전 3일 동안 ATB를 받고, 다음날, 동물 급식용 니들을 이용하여 경구 위관영양을 받았다.
종양 챌린지 및 처리
동계 C57BL/6 마우스에 0.8 x 106개의 MCA-205 WT 육종 세포를 피하로 이식하고, 종양 크기가 20 내지 35 ㎟에 도달하였을 때, CTX (100 mg/kg)를 이용하여 복강내로 (i.p.) 처리하였다. 실험 세팅에 따라, 마우스에 1회 주사, 또는 1주 간격으로 3회 주사하였다. 종양 크기는 통상적으로 매 3일마다 캘리퍼에 의해 모니터링하였다.
전용 공생생물 종을 이용하여 장 콜로니화
엔테로코쿠스 히라에 13144는 원래 본 발명자들의 실험실에서 CTX로 처리된 SPF 마우스의 비장으로부터 단리되었다. E. 히라에 708은 INRA (P. 랭겔라(P. Langella))에 의해 제공받은 반면, E. 히라에 13344, ATCC9790은 프랑스 캉 CHU(CHU de Caen)의 카투아르 교수에 의해 제공받았다. L. 플란타룸은 프랑스 파스퇴르 연구소 균주 저장소(Institut Pasteur strain repository) 이보 곰퍼트 보네카(Ivo Gomperts Boneca) 교수에 의해 제공받았다. 모든 E. 히라에 IGR 균주는 환자 사전 동의 및 지방 IRB 승인 (온코바이오틱스(Oncobiotics) 연구)에 따라 본 발명자들의 실험실에서 NSCLC 환자 대변으로부터 단리되었다. 모든 박테리아를 호기성 조건하에 37℃에서 24h-48h 동안 COS 플레이트 상에서 성장시켰다. ATB로 전처리된 마우스의 콜로니화는 1 x 109개의 박테리아를 함유하는 100 ㎕의 현탁액의 경구 위관영양에 의해 수행하였다. 박테리아 위관영양을 위해, PBS 중 600 nm의 광학 밀도로 형광 분광광도계 (에펜도르프(Eppendorf))를 이용하여 108 CFU/mL의 현탁액을 수득하였다. 실험 세팅에 따라, 각 마우스에 대하여 2 또는 6회의 박테리아 위관영양을 수행하였고: 처음에는 CTX 주사와 같은 날에, 이어서, CTX 주사 후 24h째에 수행하였다. 위관영양 후 48h째에 대변을 배양함으로써 콜로니화의 효능을 확인하였다. 대변 펠릿을 수거하고, BHI+15% 글리세롤 중에 0.1 g/ml로 재현탁시켰다. 대변의 연속 희석액을 COS 플레이트 상에 플레이팅하고, 호기성 및 혐기성 조건하에 37℃에서 48h 동안 인큐베이션시켰다. 48h 후, 매트릭스 보조 레이저 탈착/이온화 비행 시간 (MALDI-TOF) 질량 분석계 (안드로마스(Andromas), 벡크만 쿨터(Beckman Coulter: 프랑스))를 이용하여 특정 박테리아를 확인하였다.
골수 유래 수지상 세포의 배양 및 증식
8 내지 12주령된 암컷 C57Bl/6 WT 마우스의 대퇴골 및 경골로부터의 골수 전구체를 플러싱하여 골수 유래 수지상 세포 (BM-DC)를 생성하였다. 뼈를 멸균 PBS 중에서 수집하고, 알콜 및 이스코브 배지 (IMDM, 시그마-알드리치) 배쓰 중에서 세척하고, 뼈 단부를 커팅하고, 26G 니들을 이용하여 플러싱하였다. 적혈구 용해 후, 세포를 10%의 FCS + 2 mM L-글루타민 + 100 UI/ml 페니실린/스트렙토마이신 + 50 μM 2-메르캅토에탄올 (시그마-알드리치)로 보충된 IMDM (본원에서 완전 IMDM 배지로 지칭됨) 중에서 0.5 x 106/ml로 배양하고, (페프로테크(Peprotech)로부터의) BM-DC를 위해 40 ng/ml의 GM-CSF (GM-CSF 형질감염된 세포 J558의 상청액) 및 10 ng/ml의 재조합 인터루킨-4 (IL-4)로 처리하였다. 3일째, 세포를 나누고, 7 또는 8일째 실험에 사용하였다.
ELISpot IFNγ에 의한 비장 CD8+ T 세포에서의 기억 TC1 면역 반응 및 H2-Kb 제한-펩티드 시험
제조사의 설명서에 따라 IFN-γ ELISPOT 키트 (셀 사이언시스(Cell sciences: 미국 뉴베리포트))를 이용하여 96 웰 PVDF 바닥 멸균 플레이트 (밀리포어 MSIP S4510)에서 IFN-γ ELISPOT 검정법을 수행하였다. 에탄올 35%로 PVDF 막을 활성화시킨 후, 플레이트를 IFN-γ에 대한 포획 항체를 이용하여 밤새도록 코팅시키고, 세척한 후, 2h 동안 차단 완충제 인큐베이션을 수행하였다. BM-DC 세포 (1 x 105/웰)를 1:10 다중도 (MOI)로 열-불활성화된 (65℃에서 2h) 박테리아 균주 (E. 히라에 13144, E. 히라에 708, E. 히라에 13344 및 L.플란타룸)로 감염시키거나, 또는 펩티드 (20 ㎍/ml)로 펄싱하고, CD8+ T 세포 (2 x 105/웰)와 함께 첨가하고, 37℃에서 20h 동안 인큐베이션시켰다. 이어서, 세포를 제거하고, 1h30 동안 (비오티닐화된) IFN-γ에 대한 검출 항체, 및 1h 동안 스트렙트아비딘-알칼리성 포스파타제에 대한 검출 항체를 이용하여 플레이트를 발색시켰다. 마지막으로,스트렙트아비딘의 기질 (BCIP/NBT 완충제)을 5-20 min 동안 인큐베이션시켰다. CTL 이뮤노스폿 애널라이저(Immunospot Analyzer) (독일)를 이용하여 스폿을 계수하였다.
마우스 백신접종
DC 분화 후, 상기 DC를 열-불활성화된 (65℃에서 2h) 박테리아 균주 (MOI 10)로 감염시키거나, 또는 펩티드 (20 ㎍/ml, 펩티드 2.0)로 펄싱하기 전 밤새도록 폴리 I:C (10 ㎍/ml, 인비트로겐)로 활성화시켰다. 박테리아와 함께 6시간 동안 인큐베이션, 또는 펩티드와 함께 1시간 동안 인큐베이션시킨 후, BM-DC를 PBS로 3회에 걸쳐 세척한 후, 마우스의 우측 옆구리에 피하 주사하였다 (1.5 x 105개의 세포/마우스). 10일 간격으로 2회에 걸쳐 마우스에 백신접종하고, 2차 백신접종 후 4주째 좌측 옆구리에 최소 종양형성 용량의 MCA-205 종양 세포로 챌린지하였다.
유세포 분석법에 의한 분석
종양 부재하의 실험에서, CTX 주사 후 7일째에 비장을 수거하였다. 종양 성장 실험에서는, MCA-205 종양을 보유하는 마우스 내로의 CTX 1차 주사 후 상이한 시점, 7, 14 및 21일째에 비장, 종양 및 종양 배수 림프절을 수거하였다. 절제된 종양을 작은 조각으로 커팅하고, 25 ㎍/mL 리버라제(Liberase) TM 및 150 UI/mL DNase1 (로슈(Roche))를 함유하는 RPMI 배지 중 37℃에서 30분 동안 분해시킨 후, 파쇄하고, 100 및 40 ㎛ 세포 스트레이너 (BD)를 사용하여 2회에 걸쳐 여과하였다. RPMI 배지 중에서 림프절 및 비장을 파쇄한 후, 70 ㎛ 세포 스트레이너를 통해 여과하였다. 막 염색 전에, 200만 개의 비장세포, 종양 세포 또는 림프절 세포를 정제된 항마우스 CD16/CD32 (클론 93; e바이오사이언스(eBioscience))와 함께 4℃에서 15분 동안 미리 인큐베이션시켰다. 라이브/데드 필서블 옐로우(Live/Dead Fixable Yellow) 사멸 세포 염색 키트 (라이프 테크놀러지즈(Life Technologies)를 이용하여 사멸 세포를 배제시켰다. CD3 (145-2C11), CD4 (GK1.5), CD8 (eBioH35-17.2), CXCR3 (CXCR3-173), CCR9 (CW-1.2), 및 TMP 특이적 사량체에 대한 항마우스 항체 (BD, 바이오레전드(BioLegend), e바이오사이언스 및 클리니사이언스(Cliniscience))를 이용하였다. 칸토(Canto) II 7 컬러 세포분석기 (BD) 상에서 염색된 샘플을 획득하고, 플로우조(FlowJo) 소프트웨어 (트리스타(Tree Star: 미국 오리건주 애슐랜드))를 이용하여 분석을 수행하였다.
HLA-A02*01 제한-TMP 에피토프에 대한 인간 T 세포 반응
세포성분채집술 콘을 건강한 지원자로부터 수집하고 (EFS, 에타블리스먼트 프랑스와 두 상(Etablissement francais du sang)), 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)를 피콜 하이하크(Ficoll Hypaque) 구배를 이용하여 분리하였다. 본 발명자들은 항-HLA-A2 항체를 이용한 유세포 분석법에 의해 결정된 HLA-A02*01 하플로타입을 갖는 기증자만을 선택하였다. PBMC를 세척하고, 자기 비드 분리를 위해 분리 배지 (PBS, 1 mM EDTA, 2% 인간 AB+ 혈청) 중에 재현탁시켰다. 75 x 106개의 PBMC로부터 CD14+ 단핵구 세포를 강화시키고 (인간 CD14 마이크로비즈(MicroBeads), 밀테니이(Miltenyi)), 10% 인간 AB+ 혈청, 1%의 2 mmol/L 글루타민 (기브코 인비트로겐), 1000 IU/ml GM-CSF 및 1000 IU/ml IL-4 (밀테니이)로 보충된 IMDM 중에서 0.5 x 106/ml로 배양하였다. 3일째, 세포를 나누고, 6 또는 7일째 실험에 사용하였다. 단핵구를 단독으로, 또는 펩티드 (20 ㎍/ml) 존재하에서 96 웰 플레이트 중에 1 x 105개의 세포/웰로 시딩하고, 37℃, 5% CO2에서 2시간 동안 인큐베이션시켰다. 남아있는 자기 PBMC 분획을 CD8+ T 세포에 대해 강화시켰다 (CD8+ T 셀 아이솔레이션 키트(CD8+ T Cell Isolation Kit), 인간, 밀테니이). 강화된 CD8+ T 세포를 세척하고, 계수하고, 10% 인간 AB+ 혈청, 1% 2 mMol/L 글루타민, 1% 페니실린/스트렙토마이신 (기브코 인비트로겐) 및 50 U/mL IL-2 (프로류킨(Proleukin))로 보충된 RPMI-1640 중에 1 x 105개의 세포/웰로 재현탁시켰다. 단핵구-펩티드/T 세포 공동 배양물을 37℃, 5% CO2에서 1주 동안 인큐베이션시켰다 (배지를 매 2일마다 교체하였다). 이어서, 세포 풀을 96 웰 ELIspot 플레이트에 2 x 105개의 세포/웰로 시딩하고, 37℃에서 20h 동안 펩티드 (20 ㎍/ml)로, 또는 그의 부재하에, 또는 양성 대조군으로서 항-CD3/항-CD28 코팅된 비드 (1 ㎕/mL, 다이나비즈 T-액티베이터(Dynabeads T-Activator), 인비트로겐)를 이용하여 재자극시켰다. 제조사의 설명서에 따라 IFN-γ ELISPOT 키트 (셀 사이언시스: 미국 뉴베리포트)를 이용하여 96 웰 PVDF 바닥 멸균 플레이트 (밀리포어 MSIP S4510)에서 IFN-γ ELISPOT 검정법을 수행하였다.
PCR에 의한 대변에서의 파지 TMP 서열 검출
본 발명자들은 ((Samb-Ba et al., 2014)에 기술된 방법에 따라) 호기성 조건 및 엔테로코쿠스 콜로니가 단리될 수 있도록 하는 허용 배지 중에서 수회에 걸쳐 희석한 후, (환자의) 대변 또는 회장 물질 (마우스)을 배양하였다. 본 발명자들은 각각의 단일 배양가능한 엔테로코쿠스 콜로니에서 TMP 서열의 PCR을 수행하였다. 콜로니 하나를 100 ㎕의 뉴클레아제 무함유 물에 넣어 박테리아 DNA를 유리시키고, 5 ㎕의 DNA, 12.5 ㎕의 PCR 마스터 믹스 (써모사이언티픽(Thermoscientific)), 5 ㎕의 뉴클레아제 무함유 물 및 1.25 ㎕의 각 TMP 프라이머 (20 μM)를 이용하여 PCR을 수행하였다. 에티디움 브로마이드를 함유하는 1.5% 아가로스 겔 상에서 PCR 생성물을 분리하고, UV 노출에 의해 밝혀냈다. 프라이머 서열은 정방향 5'-ACTGCAGCCGTAAAATGGGA-3' (서열식별번호 191) 및 역방향 5'-TCCGTATCGTTTGCCAGCTT-3' (서열식별번호 192)이다 (앰플리콘 1026 bp).
TMP 발현 E. 콜라이 생성
2개의 상보적인 프라이머 (5'-CAATAAAAAATCAGACCTAAGACTGATGACAAAAAGAGCAAATTTTGATAAAATAGTATTAGAATTAAATTAAAAAGGGAGGCCAAATATAG-3' (서열식별번호 193) 및 5'-GATCCTATATTTGGCCTCCCTTTTTAATTTAATTCTAATACTATTTTATCAAAATTTGCTCTTTTTGTCATCAGTCTTAGGTCTGATTTTTTATTGCATG-3' (서열식별번호 194))를 어닐링시켜 P23 프로모터 서열을 함유하는 DNA 단편을 생성하였다. 이어서, 서열을 SphI/BamHI-분해된 벡터 pDL278 (애드진(Addgene) 46882, 개리 더니(Gary Dunny)로부터 기증 (LeBlanc et al., 1992)) 내로 삽입하여 벡터 pDL278-P23을 생성하였다. TMP 유전자의 일부 (C-말단 FLAG-태그에 융합된, 에피토프 TSLARFANI (서열식별번호 13)를 포함하는, TMP의 N-말단의 1185개의 뉴클레오티드)를 E. 히라에 13144 게놈 DNA (5'-TCCGGATCCATGGCACAAAGTAAAACAGTCAAAGCG-3', (서열식별번호 195) 5'-CAGGAATTCTTACTTGTCGTCATCGTCTTTGTAGTCACGTAGTAAACTATCACGTAATCGAACTTC-3' (서열식별번호 196))으로부터 증폭시키고, BamHI/EcoRI-분해된 벡터 pDL278-P23 내로 삽입하여 벡터 pDL278-P23-TMP-FLAG를 생성하였다. 퀵체인지 라이트닝 키트(QuikChange Lightning Kit) (애질런트(Agilent))를 이용하여 에피토프에 돌연변이를 도입하였다. 프라이머 5'-AACGAGCTAAGGCAGTAGCAGCTGTATCTGCAGAC-3' (서열식별번호 197) 및 5'-GTCTGCAGATACAGCTGCTACTGCCTTAGCTCGTT-3' (서열식별번호 198)을 사용하여 2번 위치를 돌연변이화시키고 (S에서 A로 돌연변이, pDL278-P23-TMP-mut2-FLAG), 프라이머 5'-ATTAGCAAAACGAGCGAAGGAAGTAGCAGCTGTATCTG-3' (서열식별번호 199) 및 5'-CAGATACAGCTGCTACTTCCTTCGCTCGTTTTGCTAAT-3' (서열식별번호 200)을 사용하여 3번 위치를 돌연변이화시켰다 (L에서 F로의 돌연변이, pDL278-P23-TMP-mut3-FLAG). 대조군 플라스미드 pDL278-P23-EGFP를 생성하기 위해, 프라이머 5'-CTTGGATCCATGGTGAGCAAGGGCGAG-3' (서열식별번호 201) 및 5'-CAGGAATTCCTACATAATTACACACTTTGTC-3' (서열식별번호 202)을 이용하여 pCIB1(델타NLS)-pmGFP (애드진 28240, 찬드라 터커(Chandra Tucker)로부터 기증 (Kennedy et al., 2010))로부터 EGFP를 증폭시키고, BamHI/EcoRI-분해된 벡터 pDL278-P23 내로 삽입하였다. 플라스미드를 화학적 적격 E. 콜라이 DH5α (NEB)로 형질전환시키고, 올바른 삽입체를 포함하는 플라스미드의 존재를 서열 분석에 의해 확인하였다 (5'-CCCAGTCACGACGTTGTAAAACG-3' (서열식별번호 203) 및 5'-GAGCGGATAACAATTTCACACAGG-3' (서열식별번호 204)). E. 콜라이에서의 EGFP 및 TMP-FLAG 발현은 각각 GFP (셀 시그널링(Cell Signaling), 2956) 또는 FLAG (시그마-알드리치, F7425)를 표적화하는 항체를 이용하여 웨스턴 블롯 분석에 의해 확인하였다.
MCA205 세포에서의 마우스 Psmb4의 CRISPR/Cas9-매개 돌연변이
야생형 MCA205 세포주를 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(American Type Culture Collection) (ATCC: 미국 버지니아주 마나사스)으로부터 구입하였고, 37℃에서, 10% FBS (써모 피셔 사이언티픽, 인크.(Thermo Fisher Scientific, Inc.: 미국 매사추세츠주 월섬)), 100 U/ml 페니실린 및 100 ㎍/ml 스트렙토마이신 (써모 피셔 사이언티픽, 인크.)으로 보충된 RPMI-1640 배지 (써모 피셔 사이언티픽, 인크.) 중에서 유지시켰다. CRISPR 넉인 돌연변이를 위해, 본 발명자들은 장(Zhang) 랩에 의해 개발된 CRISPR 디자인 도구 (http://crispr.mit.edu/)를 이용하여 gRNA (서열 AGATATTGCGGAAACGAGCC (서열식별번호 205))를 디자인하였다. 디자인된 서열을 함유하는 올리고뉴클레오티드를 합성하고 (시그마), CBh 프로모터 하에 (인간 코돈 최적화되고, 선별될 수 있도록 하기 위해 2A-GFP와 융합된) Cas9 유전자를 함유하는 pX458 백본 (애드진 #48138, (Ran et al., 2013))으로 라이게이션시키고, U6 프로모터 하에 클로닝된 sgRNA로 라이게이션시켰다. 돌연변이 부위를 함유하는 상동성 주형 (부착 서열)을 인비트로겐 진아트 진 신테시스(Invitrogen GeneArt Gene Synthesis) (써모 피셔 사이언티픽, 인크.)에 의해 합성하였다. 제조사의 프로토콜에 따라, 클로닝된 pX458 플라스미드 및 합성된 상동성 아암을 리포펙타민 3000 (써모 피셔 사이언티픽, 인크.)에 의해 MCA205 세포 내로 공동으로 형질감염시켰다. 형질감염 후 48시간 경과하였을 때, GFP-양성 세포를 단일 세포로서 96 웰 플레이트로 분류한 후, 생존 클론을, 하나는 -80에서 냉동 보관하기 위한 것, 및 다른 나머지 하나는 게놈 DNA 추출을 위한 것인 이중화된 조건하에서 확장시켰다. 클론으로부터의 게놈 DNA 중 표적화된 영역을 푸존® 하이-피델리티 PCR 마스터 믹스(Phusion® High-Fidelity PCR Master Mix) (뉴 잉글랜드 바이오랩스(New England BioLabs: 미국 매사추세츠주 입시치) 및 프라이머 5'CTCAGGGACCCTTTTCACGA 3' (서열식별번호 206) 및 5'CCCACTCCCTGTTCTACACA 3' (서열식별번호 207)을 이용하여 추가로 증폭시키고, 모나크® DNA 겔 익스트렉션 키트(Monarch ® DNA Gel Extraction Kit) (뉴 잉글랜드 바이오랩스)로 정제한 후, 프라이머 5'GGACCCTTTTCACGATTCAGG 3' (서열식별번호 208)을 이용하여 서열분석을 위해 유로핀즈 게노믹스 게엠베하(Eurofins Genomics GmbH: 독일 에버스버그))로 보냈다. 서열 결과에 따라, 양성 클론을 확장시키고, DNA 추출하여 서열을 확인하였다. 디자인된 돌연변이를 보유하지 않는 형질감염된 단일 세포 클론을 "WT" 클론으로 사용하였다.
게놈 서열분석 및 분석
팍바이오(PacBio) 기술 (GATC 바이오테크(GATC Biotech: 독일 콘스탄츠))을 이용하여 5개의 E. 히라에 (13144, 708, 13152, 13344 및 EH-17) 균주의 전체 게놈 서열을 결정하였다. 제조사의 권고사항에 따라 퀵(Quick)-DNA 진균/박테리아 미니프렙 키트 (자이모 리서치(Zymo Research: 미국 캘리포니아주 어바인))를 이용하여 15개의 다른 E. 히라에 분리주로부터 게놈 DNA를 단리시켰다. DNA 전단 후, 일루미나(Illumina)용 NEB넥스트 울트라 DNA 라이브러리 프렙 키트(NEBNext Ultra DNA library prep kit) (뉴 잉글랜드 바이오랩스: 미국 매사추세츠주 입시치)를 이용하여 DNA 라이브러리를 제조하고, 일루미나 MiSeq 플랫폼 및 MiSeq 시약 키트 버전 3을 이용하여 페어드 엔드 리드(paired-end read) (2 x 300 bp)로서 서열분석하였다. 일루미나 리드를 트리모매틱(Trimmomatic)으로 트리밍하고 (Bolger et al., 2014), Fastx-toolkit (http://hannonlab.cshl.edu/fastx_toolkit/)를 이용하여 품질 필터링을 수행하고, SPAdes를 이용하여 어셈블리하였다 (Bankevich et al., 2012). prokka v1.11 소프트웨어를 이용하여 단백질 서열을 예측하였다 (Seemann, 2014). PHAST 소프트웨어를 이용하여 프로파지 영역을 검출하였다. 미국 국립 생물공학 정보 센터(National Center for Biotechnology Information: NCBI) 비중복 (NR) 데이터베이스에 대해 BLASTp를 이용하여 예측 단백질에 주석을 달았다.
필로게노믹 및 비교 게노믹스
parsnp 프로그램 (Treangen et al., 2014) 및 참조로서 균주 13144 게놈 서열을 이용하여 20개의 E. 히라에 게놈 사이의 단일 뉴클레오티드 다형성을 조사하였다. 20개의 게놈의 코어 게놈에서 유지되는 47,303개의 다형성 부위를 고려함으로써 계통 분석을 수행하였다. Fastree를 이용하여 최대 가능도 계통을 구축하였다 (Guindon et al., 2010). figtree (http://tree.bio.ed.ac.uk/software/figtree/)를 이용하여 계통수를 시각화하였다. BlastP 및 ClustalW를 이용하는 쌍을 이루는 대응 정렬을 사용함으로써 20개의 E. 히라에 균주의 완전 프로테옴 서열을 비교하였다. 본 발명자들은 예측된 모든 유전자의 번역된 단백질 서열에 대해 보존적 파라미터 값을 70%의 아미노산 서열 동일성 및 50%의 서열 커버리지로 하여 orthoMCL (Li et al., 2003)을 이용하여 E. 히라에 상동성 유전자를 클러스터링하였다. orthoMCL에 의해 발견된 상동성 클러스터에 기초하여 상이한 고유의 코어 게놈을 결정하였다.
통계 분석
프리즘 6(Prism 6) (그래프패드(GraphPad: 미국 캘리포니아주 샌디에고))도 이용하여 데이터 분석 및 표시를 수행하였다. 종양 크기차는 Anova 또는 전용 소프트웨어 (https://kroemerlab.shinyapps.io/TumGrowth/)를 이용하여 계산하였다. 간략하면, 종양 성장에 대해 프리-프로세싱된 종양 표면 로그값에 적용된 선형 혼합 효과 모델링을 수행하였다. 두 종양 성장 기울기 및 절편 (로그 값 기준으로) 모두가 관심 처리군들 사이에 상이한지 여부를 공동으로 검정함으로써 p 값을 계산하였다. 카플란 마이어 방법을 이용하여 생존 확률을 추정하였고, 중앙값 또는 최적 컷오프 접근법을 이용하여 연속 변수에 대한 최적 컷오프를 선택하였다. 로그 등급 검정을 이용하여 생존 곡선을 평가하였다. 기록된 검정은 모두 양측 검정이고, P 값이 <0.05일 때, 유의적인 것으로 간주되었다. 정규화된 유전자 발현 값 (FPKM-UQ) 및 상응하는 임상 데이터를 TCGA 데이터 포털로부터 다운로드받았다. 생존 분석을 위해, 암 유형별 데이터세트 간의 GPD1L 발현 중앙값에 의해 및 예측된 HLA-대립유전자에 의해 환자를 군별로 나누었다 (Charoentong et al., 2017). 전체 생존 (OS) 및 무진행 생존 (PFS)에 대한 위험비 (HR) 및 95% 신뢰 구간 (CI)은 콕스 회귀 분석을 이용하여 계산하였다. 종양-침윤 면역 세포 조성은 CIBERTSORT (절대 모드)를 이용하여 측정하고 (Newman et al., 2015), 피어슨 상관을 이용하여 유전자 발현과 비교하였다.
실시예 1: 상이한 E. 히라에 균주는 고유의 면역원성 잠재능 및 항종양 효과를 나타낸다.
본 발명자들은 가장 먼저 광범위한 항생제의 14일 투여에 의해 유발된 것보다 더욱 생리적인 디스바이오시스 세팅에서 본 발명자들의 E. 히라에 분리주를 시험하였다. (유바이오틱 마우스에 제시된 바와 같이) CTX의 완전한 효능을 회복시키기 위한 시도로, 본 발명자들은 실제로, 편향된 레퍼토리의 장 마이크로바이옴 (및 독특한 예후)를 보이거나, 또는 보이지 않는 2명의 유방암 환자로부터의 대변을 ATB로 처리된 수용자 내로 전달하여 (FMT), 상이한 보조 E. 히라에 균주로 그의 디스바이오시스를 보상하였다 (도 1). 유바이오틱 한배새끼와 비교하였을 때, 디스바이오틱 BC 환자로부터의 FMT가 CTX에 대한 내성을 부여하였지만 (도 2a-b), 효능을 회복시키는 데 있어서는 살아있는 EH13144가 매우 효과적이었다 (도 2c-e). (뚜렷한 디스바이오시스를 보이지 않는) 상이한 BC 환자로부터의 FMT의 제2 실시예에서 (도 3a-b), 살아있는 EH13144에 의해 매개되는 효과 또한 유의적이었다 (도 3c-d). 그러나, 유사한 세팅에서, 폐암 환자의 대변으로부터 배양된, 다른 E. 히라에 균주 (IGR1 및 IGR11)는, 비록 BM-DC에 의한 IL-1β 및 IL-12 생산을 유도함에 있어서 EH13144만큼 효과적이지만 (제시되지 않음), 면역원성을 나타내지는 않았다 (도 4a-c).
추가로, EH10815는 항종양 효과를 매개하지 않은 반면, 폐암 환자의 대변으로부터 배양된, E. 히라에 (IGR4 및 IGR7)는 13144 경우에 관찰된 것과 같이, 이 또한 면역원성을 나타내었다 (도 4d). 또한, EH13144, IGR4 및 IGR7의 조합은 EH13144 선도 화합물보다 우수하다 (도 5).
흥미롭게도, 저온 살균된 EH13144는 그의 살아있는 카운터파트보다 훨씬 더 효과가 적었고, 디스바이오틱 FMT에서 CTX 살종양 활성을 회복시키지 못했다 (도 6).
본 발명자들은 EH13144가 ATB 유도된 환자의 디스바이오시스 뿐만 아니라, FMT 유도된 환자의 디스바이오시스에서도 MCA205 육종에 대한 CTX 면역 및 살종양 활성을 증강시키는 독특한 특성을 갖는다고 결론지었다.
실시예 2: EH708과 교차 반응성을 나타내는 E. 히라에 13144는 장간막 림프절 및 비장에서 CD8 + Tc1 세포를 증폭시킨다.
EH13144는 시클로포스파미드와 함께 T 세포 및 IFNγ에 의존하는 방식으로 항종양 면역 반응 및 항암 효과를 증강시키는 아주반트 역할을 한다 (Daillere et al., 2016). 본 발명자들은 장간막 림프절 (mLN) 및 비장으로부터의 제2 림프계 기관에서의 T 세포 면역 반응의 다이나믹스를 분석함으로써 EH13144의 면역원성 기전을 분석하였다 (도 7a 및 7d). EH13144 뿐만 아니라, E. 히라에 708, 둘 모두, 1주 후 mLN, 및 2주 후 비장, 둘 모두에 CD8+ T 세포의 축적을 유도할 수 있었다 (도 7b 및 7e). 그러나, EH13144는 효율적인 항-종양 면역 반응을 유도하지만, E. 히라에 708은 그렇게 유도하지 못한다 (문헌 [Daillere et al., 2016]의 도 1d). EH13144는 또한 mLN에서 CD4+ T 세포 풀을 증폭시켰다 (도 7c). 또한, EH13144는 비장 (도 7f) 및 종양상 (도 8)에서 CD8+ CCR9+ CXCR3+의 축적을 유도한다.
이러한 CD8+ T 세포 확장의 특이성을 분석하기 위해, 본 발명자들은 다양한 EH 분리주 (13144, EH708 및 EH17 또는 L. 플란타룸)로 감염된 골수 유래 수지상 세포 (BM-DC)를 이용하여 비장 CD8+ T 세포를 챌린지하였다. Tc1 면역 반응의 특징적인 IFNγ 양성 스폿을 열거함으로써 24 hr째 ELISPOT 검정법에 의해 공생생물 특이적 기억 CD8+ T 세포 반응을 모니터링하였다 (도 9). 흥미롭게도, 오직 EH708 및 EH13144만이 그들 간의 교차 방어와 함께, 기억 Tc1 면역 반응을 유도할 수 있었고 (도 10), 반면, EH17은 그렇게 유도하지 못했으며, 이는 다일레르 등 (Daillere et al., 2016)에 의해 보고된 EH17의 불량한 방어적 항종양 효과를 확증한다.
본 발명자들은 면역조직화학법으로 중화 항-CD8 항체의 존재 또는 부재하에서 장 염증성 병변을 모니터링함으로써 CD8+ T 세포 침윤에 대해 결장 점막을 조사하였다 (도 11a). 헤마톡실린 에오신으로 염색된 결장 점막은 CTX 후, 공생생물이 부재인 경우에서보다 EH13144 또는 EH708의 경구 위관영양 이후에 침윤 정도는 더 컸지만, 이들 침윤은 중화 항-CD8 Ab의 ip 투여에 의해 동물을 전처리하였을 때에는 크게 감소되었다 (도 11b). 특히, mLN 또는 비장에서 프라이밍된 이들 CD8+ T 세포는 원위 종양 부재하에서 고유판으로 귀소하는 경향을 보이지만, 육종 침착물이 피하로 도입된 경우에는 그러한 경향은 없다 (도 18).
종합해 보면, 상기 관찰결과는 시클로포스파미드와 관련하여 EH13144 또는 EH708의 경구 위관영양은 종양 침착물이 존재하지 않는다면, 결장으로, 또는 종양 발생시에는 종양상으로 다시 수송되는 잠재능을 보이며, (EH17이 아닌) EH708 및 EH13144 서열 둘 모두를 인식하면서, 비장 Th1 (Daillere et al., 2016) 뿐만 아니라, 전신 Tc1 면역 반응을 일으킨다는 것을 제안한다.
실시예 3: EH 특이적 H-2K b 제한 펩티드 스크리닝: E. 히라에 13144 게놈은 TMP 파지 단백질에 면역원성 펩티드 서열을 함유한다.
3개의 E. 히라에 균주 (13144, 708 및 EH17)에 대해 전체 게놈 차등 분석을 수행하여 잠재적 9-량체 MHC 클래스 I-결합 에피토프을 확인하였다. 본 검색은 세포내 위치 (세포벽 및 세포외 단백질에 풍부, PSORT 소프트웨어를 통해 수행), 및 H2-Kb에의 결합 친화도 (<50 nM 결합 친화도, NetMHC 소프트웨어를 통해 수행)에 초점을 맞추고 진행되었다 (도 12, 표 2-5).
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표 2: 다른 균주에는 존재하지 않는 H-2b 제한-EH13144 펩티드
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표 3: 다른 균주에는 존재하지 않는 H-2b 제한-EH708 펩티드
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표 4: 다른 균주에는 존재하지 않는 H-2b 제한-EH17 펩티드
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표 5: H-2b 제한-EH13144/EH708 공통 펩티드
CTX로 처리된 마우스로부터 단리된 CD8+ T 세포 비장세포를 풀링된 9-량체 펩티드 (그룹 1-13, 표 6)로 재자극시켜 생체내에서 잠재적으로 면역원성을 나타내는 에피토프를 확인하였다. 도 9에 개략된 프로토콜과 동일한 것을 사용하여, 본 발명자들은 13144의 면역원성이 다른 그룹의 펩티드 (데이터는 제시되지 않음), 예컨대, 그룹 1 (도 13a)과 달리, 그룹 7 연관 펩티드 (도 13b)에 의존한다는 것을 발견하게 되었다. 이어서, 본 발명자들은 그룹 7을 4개의 H-2Kb 펩티드로 나누었다 (표 7). E. 히라에 13144의 면역원성은 파지 테일 길이 테이프 메져 단백질 (Tmp)에 있을 수 있다 (표 7). 실제로, 본 발명자들은 오직 TMP1 및 TMP2 펩티드만이 (708 및 EH17이 아닌) 기억 EH13144 유도 Tc1 세포에 의해 고도로 인식되었다는 것을 밝혀내었다 (도 13c). 특히, EH13144와 동일하며, 단 TMP1에서는 3번 위치에서, 및 TMP2에서는 2번 및 7번 위치에서 돌연변이화된 2개의 프로파지를 보유한 균주 EH10815 (도 13d)는 회상 반응을 유도하지 않고 (도 13e), 이는 상기 박테리아가 유의적인 항종양 효과를 매개하지 못한 이유를 설명할 수 있다. 그에 반해, EH13144과 매우 높은 서열 상동성을 공유하는 EH 클론 IGR7을 이용하였을 때 얻은 결과는 회상 반응을 유도한다 (도 13e).
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표 6: 생체내 실험에서 사용된 그룹별 H-2b 제한 E. 히라에 펩티드
Figure pct00008
표 7: 면역원성 EH 펩티드 서열에 상응하는 단백질
TMP1 특이적 사량체를 제조함으로써 본 발명자들은 종양 부재하에서, 및 EH13144, EH17, 10815 또는 IGR7의 경구 위관영양 및 CTX 처리 후, 마우스의 mLN (도 14a) 및 비장 (도 14b-c)에서 TMP1 특이적 T 세포를 모니터링할 수 있었다. 본 발명자들은 장으로부터의 T 세포 (CCR9+ T 세포)만이 EH13144 및 IGR7에 대해 TMP1 특이적 T 세포라는 것을 관찰하게 되었다 (도 14). 또한, 종양 보유 마우스에서, 종양 배수 림프절 및 종양에서의 TMP 특이적 사량체 염색 결과, TMP 에피토프 1 프로파지 2 특이적 CD8+ T 세포는 종양상에 축적되고, CCR9+CXCR3+ CTL 중에 함유되어 있는 것으로 나타났다 (도 15).
약독성 박테리오파지는 형질도입을 통해 병독성, 항미생물 내성 유전자, 및 면역원성 서열을 새 박테리아 숙주로 전달하는 박테리아 바이러스이다 (Weinbauer, 2004). 파지 테일 길이 테이프 메져 단백질 (Tmp)은 다수의 파지 및 프로파지에서, 가장 중요하게는, 고정 위치에 고도로 보존되는 트립토판 및 페닐알라닌 아미노산을 포함하는 가변 연쇄 반복부를 함유하는 시포비리다에 과의 파지에서 고도로 보존된다. 시포비리다에 과에 속하는 파지는 그의 Tmp 중에 수개의 모티프를 함유하고 (Belcaid et al., 2011; Piuri and Hatfull, 2006), 그 중 펩티도글리칸 히드롤라제는 주변 박테리아의 그의 감염도를 촉진시키고, 소생 촉진 인자 (Rpf)를 함유한다. Rpf는 휴면 박테리아의 재활성화에 연루되어 있을 뿐만 아니라, 마이코박테리움 튜베르쿨로시스(Mycobacterium tuberculosis)에 대한 선천 반응 (Russell-Goldman et al., 2008) 뿐만 아니라, 동족 장기간 면역 반응 (Commandeur et al., 2011)도 조정한다. 실제로, M. 튜베르쿨로시스(M. tuberculosis) Rpf T 세포 에피토프는 M. 튜베르쿨로시스에 대한 인간 면역 반응에서 중요한 면역원인 것으로 보고되었다 (Commandeur et al., 2011).
실시예 4: E. 히라에 13144 Tmp 펩티드 또는 살아있는 박테리아를 이용한 면역화가 종양 챌린지에 대한 방어를 부여한다.
본 발명자들은 MCA205 육종 또는 동계 MC38 결장암에 대하여 나이브 C57BL/6 동물을 10일 간격을 두고 2회에 걸쳐 면역화시키기 위해, 폴리 I:C로 활성화된 후, TMP 펩티드 또는 살아있는 E. 히라에 13144에 노출된 1.5.105개의 BM-DC를 사용하여 피하 백신접종하였다 (도 16). 비펄싱된 BM-DC 또는 그룹 1 펩티드에 노출된 BM-DC는 MCA205에 의한 치명적 챌린지로부터의 방어를 매개하는 데 있어 효과적이지 못했지만, TMP1-TMP2에 노출된 BM-DC는 살아있는 박테리아만큼 효율적으로 MCA205에 대한 방어 효과를 뚜렷이 전달하였다 (도 17).
본 발명자들은 E. 히라에 13144의 경구 위관영양이 mLN 및 비장에서 장 점막으로 또는 종양 미세환경에 다시 수송될 수 있는 면역 반응을 일으킨다는 가설을 제기하였다. 장 및 종양 면역감시를 연관시키기 위해, 본 발명자들은 나이브 마우스 대비 종양 보유자에서 E. 히라에 13144의 순차적 경구 위관영양에 의해 유도된 상대적 면역 침윤을 비교하였다. 실제로, 본 발명자들은 E. 히라에 13144 유도된 CD8+ T 세포 의존성 결장 염증성 병변 (도 11)이 종양 보유자에서 현저히 감소되었다는 것을 발견하였고, 이는 박테리아의 경구 투여 동안 장과 종양 미세환경 사이의 경쟁을 뒷받침한다 (도 18).
실시예 5: E. 히라에 13144 게놈은 시포비리다에 과의 두 40.6 kb 및 39.2 kb 프로파지 서열을 코딩한다.
프로카(Prokka) 프로그램을 이용하여 균주 EH13144 및 4개의 다른 E. 히라에 게놈 (708, 10815, 13152 및 EH17)에 주석을 달았다. BLASTP 프로그램 및 로리(Roary) 소프트웨어를 이용하고, >80% 아미노산 동일성 컷오프하에 각 상이한 균주의 유전자 사이의 상동성 관계를 평가하였다. PRANK 프로그램을 이용하여 5개의 E. 히라에 게놈의 코어 게놈 정렬을 수행하였다. PHASTER 온라인 프로그램을 이용하여 프로파지 영역을 예측하였다.
E. 히라에 균주 비교 분석을 통해 12,748개의 유전자의 범게놈을 얻었다. 코어 게놈 (모든 균주가 공유하는 유전자 세트)은 2,036개의 이종상동성 유전자 (59%)로 구성되었고, 부속 게놈 (모든 종이 아닌, 일부 종에 존재하는 유전자 세트)은 570개의 이종상동성 유전자 및 923개의 고유 유전자 (개별 종에 독특한 고유 유전자)로 구성되었다. 균주 EH13144는 196개의 고유 유전자를 코딩한 반면, 균주 13144 및 708은 27개의 이종상동성 단백질을 공유하였다 (도 19a).
E. 히라에 13144의 게놈의 특이성은, 각각 엔테로코쿠스 파지 phiEf11 및 스타필로코쿠스(Staphylococcus) 파지 CNPx와 서열 상동성을 보이는 2개의 무손상 프로파지 영역 (40.6 kb 및 39.2 kb)을 코딩한다는 점이다 (도 19b). 40.6 kb 프로파지는 57개의 유전자를 코딩하였는데, 이는 5개의 게놈 사이에 공유되는 12개의 유전자, 균주 13144와 708 사이에 공유되는 16개의 유전자, 및 E. 히라에 13144에 독특한 8개의 고유 유전자를 포함하였다 (도 20a). 39.2 kb 프로파지는 65개의 유전자를 코딩하였는데, 이는 5개의 게놈 사이에 공유되는 7개의 유전자, 균주 13144와 708 사이에 공유되는 3개의 유전자, 및 E. 히라에 13144에 독특한 22개의 고유 유전자를 포함하였다 (도 20b). 상기 두 프로파지 모두, 그의 게놈 구조는 그들이 시포비리다에 과에 속한다는 것을 제안하였다. 실제로, 상기 두 프로파지는 시포비리다에 파지의 특징인, 캡시드, 포털 및 테일 구조를 코딩하는 유전자를 보유한다. 두 프로파지는 38%의 아미노산 상동성을 갖는 테일 테이프 메져 단백질 (TMP)을 코딩하였다. 40.6 kb 프로파지의 TMP는 E. 히라에, 엔테로코쿠스 빌로룸(Enterococcus villorum) 및 엔테로코쿠스 패시움(Enterococcus faecium) 프로파지 TMP와 각각 98.8%, 96.7%, 및 97.7% 아미노산 동일성으로 서열 상동성을 나타내었다. 39.2 kb 프로파지의 TMP는 오직 EH 클론 IGR7 (CNCM I-5224)과 100% 상동성으로 (도 21, 표 8), 그보다 적게 E. 파에칼리스 프로파지 TMP와 89.2% 아미노산 동일성으로 서열 상동성을 보였다. 다른 파지 유전자와의 서열 상동성에도 불구하고, 전체 두 프로파지는 고유하게 균주 13144에서 코딩되었다. 마지막으로, TMP1 및 TMP2 펩티드, 둘 모두, 제2 프로파지 (서열식별번호 2)의 동일한 파지 테일 테이프 메져 단백질 (TMP) 유전자의 일부분이다. 13144의 TMP1은 IGR7 및 IGR11과 100%의 상동성을 보였지만, 10815 및 IGR1 (3번 위치에 1개의 돌연변이)과는 88.89%의 상동성을 보였다. 13144의 TMP2는 오직 IGR7과 100%의 상동성을 보였고, 10815 및 IGR11 (각각 2번 및 7번 위치, 또는 2번 및 4번 위치에 2개의 돌연변이)과는 77.78%의 상동성을 보였다 (도 21, 표 8).
Figure pct00009
표 8: 균주의 특징 요약
실시예 6: E. 히라에 13144 박테리아 및 파지 서열은 인간에서의 >3,000개의 메타게놈을 함유하는 MG 참조 카탈로그에서 가끔 발견되었다.
17개의 상이한 데이터세트로부터의 총 3027개의 메타게놈을 스크리닝하였다 (도 29a). 대다수는 장 마이크로바이옴 (대변)이었지만, 이는 또한 구강, 피부, 질, 및 객담의 것이기도 하였다. 대부분의 데이터세트는 공개적으로 이용가능하며, 이는 수개의 비서구화된 인구 집단을 비롯한, 모든 대륙을 커버한다. 본 발명자들은 또한 니콜라 세가타(Nicola Segata)의 비공개 데이터 중 일부 (그 중에서도 특히 종적으로 진행된 25쌍의 모체/유아 대상체의 데이터)를 포함하였다. 본 발명자들은 각 샘플에서 E. 히라에 게놈 및 그의 파지의 커버리지 범위 (BOC)를 평가하였다. BOC는 메타게놈에서 리드에 의해 커버되는 게놈의 분율을 측정하였다. BOC가 1.0이라는 것은 참조 균주의 전체 게놈이 메타게놈에서 발견된다는 것을 의미한다. 상기 점수에 기초하여, 본 발명자들은 E. 히라에가 확실하게 두 샘플에 존재한다는 확신을 갖고 결론지을 수 있었다. 한 샘플은 몽골인 대상체로부터의 것이고, 나머지 다른 한 샘플은 스웨덴인 대상체로부터의 것이다 (BOC는 각각 0.9 및 0.75). 다른 5개의 샘플은 확률상 E. 히라에의 존재를 나타내는 0.1 내지 0.37의 BOC를 나타낸다. BOC가 0.1 미만인 경우, 본 발명자들은 E. 히라에 균주의 존재를 특징화하지 못했다. 파지 서열의 경우, E. 히라에에 대해 양성인 몽골인 대상체는 또한 서열식별번호 2의 13144로부터 프로파지 2를 갖는 반면, 스웨덴인 대상체는 708로부터의 프로파지 2를 갖는 것으로 보인다. 파지는 박테리아 게놈보다 더 많은 샘플 존재하는 것으로 보인다. 한가지 흥미로운 사례는 생후 1, 3 및 7일째인 유아로부터인 3개의 샘플 (샘플 CA_C10006IS2084FE_t1M15,CA_C10006IS2087FE_t2M15,CA_C10006IS2091FE_t3M15) 중에 파지 13144가 0.66 BOC로 존재한다는 점이다. 이들 3개의 샘플은 E. 히라에를 가지지 않지만, 또 다른 엔테로코쿠스 종으로부터의 또 다른 균주는 가지는 것으로 보인다. 이는 상기 파지가 오직 E. 히라에에만 특이적인 것은 아님을 제안하는 것일 수 있다.
실시예 7: E. 히라에 13144는 마우스 뿐만 아니라, 인간 (정상 지원자 및 유방암 환자)에서도 면역원성을 나타내고: 이는 인간에서 고면역원성의 TMP 특이적 펩티드를 정의한다.
E. 히라에 13144는 마우스 균주이지만, 그의 서열이 연구 중 인간 대변 메타게노믹스를 이용한 정렬을 통해 회수되었기 때문에, 본 발명자들은 (Daillere et al., 2016)에서 보고된 바와 같이, 인간 (정상 지원자 또는 유방암 환자)이 상기 균주에 의해 제공되는 에피토프 중 일부에 대한 면역 반응을 발생시킬 수 있다고 가정하였다. 도 22a는 12 내지 19%의 CD4 및 CD8+ T 세포가 E. 히라에 13144에 대해 기억 IFNγ-준비된 T 세포 반응을 나타낼 수 있다는 것을 보여주는 것이며, 이는 실제로, 상기 EH 균주가 인간 세포에 의해 인식될 수 있다는 것을 제안하는 것이다. 도 22a는 또한 32%의 BC 환자는 EH13144로 펄싱된 단핵구에 대해서는 반응성을 보이지 않는 CD4+ T 세포를 갖는 반면, 52%에서는 기억 CD4+ T 세포 반응을 생성하는 IL-10이 발생되었다는 것을 강조한다. 이는 E. 콜라이에 대한 기억 CD4+ TH1 세포의 반응성 및 TCR 교차 결합에 대한 반응성과 극명한 대조를 이룬다 (도 22b). 인간 PBMC 또는 TIL에서 시험하고자 하는 Tmp의 예측 펩티드는 하기 표 9에 열거되어 있고, 그의 위치는 도 23에서 설명되었다. NetMHC 소프트웨어를 이용하여 평가된 그의 MHC 클래스 I 대립유전자에 대한 결합 잠재능이 제시되어 있다 (임계치 < 50 nM으로 설정, Y축). 각 펩티드 및 대립유전자에 대해, 기호는 길이가 9개의 아미노산 길이 (~량체)인 펩티드에 상응하는 확인된 서열의 첫 번째 아미노산을 나타낸다. 이어서, 본 발명자들은 6명의 HLA-A2+ 건강한 지원자 (HV)로부터의 회상 반응의 시험관내 자극 검정법 (도 24a)에 의해 PBMC에서 모든 HLA-A2-제한 Tmp 에피토프를 시험하였고 (도 24c), (도 24b에 표시된) 5개의 펩티드가 HV 중 적어도 50%에서 유의적인 반응을 보였다는 것을 발견하였다 (도 24d-e). 화살표 표시는 가장 유의적인 에피토프를 나타낸다 (도 24f-g).
Figure pct00010
Figure pct00011
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표 9: 각 HLA 하플로타입에 대한 Tmp의 예측 펩티드
실시예 8: 시험관내에서 EH13144에서의 파지 절제
E. 히라에의 상청액 중에서 파지를 절제하고, 그를 수거하는 고전적 방법을 이용하여 (도 25) (Duerkop et al., 2014), 본 발명자들은 박테리아의 확장 단계와 상관없이 상이한 온도 (37℃ 및 42℃)에서 EH13144를 CTX가 아닌 미토마이신 C (1㎍/ml)와 함께 인큐베이션시킨 후에 프로파지 1 및 2 절제를 관찰할 수 있었다 (도 26a). (파지 DNA 검출의 감수성을 증강시키는) 상청액의 캡시드 용해 후, 프로파지 DNA가 자발적 조건에서 시각화되었으며, 이는 파지 또한 절제 스트레스 없이 방출될 수 있다는 것을 제안한다 (도 26b).
실시예 9: 서열식별번호 1의 TMP를 코딩하는 유전자를 보유하는 신규 균주 확인
20개의 상이한 E. 히라에 균주의 게놈 (하기 표 10)을 서열분석하고, 정렬하였다. 특히, 균주 IGR7의 게놈에서, 면역원성이 입증된 (상기 실시예 1 참조) 3개의 프로파지 영역이 확인되었고, 그 중 2개 영역은 무손상이며, 상기 게놈은 E. 히라에 13144에 의해 코딩된 서열식별번호 1의 TMP (표 9)와 동일한 TMP를 코딩하는 것으로 밝혀졌다. 상기 균주는 2017년 10월 12일에 번호 I-5224 하에 CNCM에 기탁되었다. 또한, CTX에 의한 일부 살종양 활성을 매개하는 데 효율적인 것으로 입증된 IGR11 또한 13144에 의해 코딩된 동일한 TMP1 에피토프를 갖는다 (표 9). 상기 균주는 2017년 11월 27일에 번호 CNCM I-5261 하에 CNCM에 기탁되었다.
Figure pct00014
표 10
실시예 10: 세포 분류 및 TMP에 특이적인 TIL 또는 혈액 T 세포의 확장
서열식별번호 1의 TMP에 특이적인 TIL 또는 T 세포를 수득하는 데 여러 프로토콜이 사용될 수 있다.
프로토콜 1: 면역자기성 세포 분류 및 T 세포 분류 집단의 확장
HLA-A*0201/TMP 단량체 (20 ㎍/ml)를 실온에서 1 h 동안 6.7·106개의 스트렙트아비딘 코팅된 비드 (다이나비즈(Dynabeads) M-280 스트렙트아비딘, DYNAL: 프랑스 콩피에뉴)와 함께 인큐베이션시키고, PBS/0.1% BSA 중에서 세척한다. 5·106개의 PBMC를 4℃에서 4 h 동안 단량체 코팅된 비드와 함께 회전시킨다 (Bodinier et al., 2000). 10회 세척 후, 폴리클로날 T 세포 자극 프로토콜을 이용하여 비드로 코팅된 세포를 확장시킨다 (Jotereau et al., 1991). 이어서, 온화하게 회전시키면서, 세포를 1:1 비율로 양 항-마우스 IgG 코팅된 다이나비즈 (다이날 바이오테크(Dynal Biotec: 프랑스 콩피에뉴))와 함께 4℃에서 4 h 동안 인큐베이션시킨다. 세포/비드 현탁액을 6 웰 플레이트 중 배양 배지에서 37℃에서 밤새도록 인큐베이션시켜 비드를 탈착시킨다. 밤새도록 인큐베이션시킨 후, 자석으로 비드를 추출하고, (Jotereau et al., 1991)에 앞서 기술된 바와 같이, 분류된 림프구를 피더 세포로 옮겨 놓는다. 간략하면, IL-2 (150 U/ml) 및 PHA (15 ㎍/ml)로 보충된 150 ㎕의 배양 배지 중에서 2,000개의 비드 코팅된 T 세포/웰을 방사선 조사된 피더 세포 [LAZ EBV-B 세포 (2·104/웰) 및 동족이계 PBMC (105/웰)]와 혼합된 96 웰 플레이트에 분포시킨다.
프로토콜 2
암 표본으로부터의 종양 샘플을 시토카인 (IL-2, IL-15, 및 IL-21) 과 함께 배양하여 TIL을 확장시킨다. 10일 배양 후, (문헌 [Meng et al., 2016]에 기술된 바와 같이) TIL을 항-CD3 항체 (OKT3)로 자극시키고, 동족이계 말초 혈액 단핵 세포에 방사선 조사한다.
실시예 11: T 림프구 형질도입에 의한 TMP에 특이적인 T 세포 획득
(HLA-A2 또는 다른 하플로타입에 상응하는 TMP 프로파지 2 에피토프에 대해) 결합력이 높은 TCR의 베타 쇄를 코딩하는 cDNA 및/또는 (HLA-A2 또는 다른 하플로타입에 상응하는 TMP 프로파지 2 에피토프에 대해) 결합력이 높은 TCR의 알파 쇄를 코딩하는 cDNA 및 (HLA-A2 또는 다른 하플로타입에 상응하는 TMP 프로파지 2 에피토프를 위해) 상기 TCR의 CDR3 영역을 코딩하는 cDNA를 발현하도록 조작된 레트로바이러스 벡터 또는 렌티바이러스 벡터에 노출시키기 전에 자가 또는 동족이계 T 세포를 항-CD3/CD28 코팅된 비드 또는 저용량 IL-2 (및 IL-7, IL-15, IL-21)를 이용하여 확장 단계에 배치한다. 이어서, 폴리클로날 T 세포를 클로닝시키고, 96 웰 플레이트에서 그의 특이성 (TMP 에피토프에의 노출시 IFNg 또는 TNFa 방출)에 대해 시험한다. 이어서, 시토카인 생산 T 세포를 선별하고, GMP 세포 공장에서 1010 내지 1012개의 세포로 확장될 때까지, 주 단위로 2 내지 3주 동안 T 세포 성장 인자 (IL-2; IL-7, IL-15, IL-21)를 이용하여 재확장시킨다.
고찰
본 발명자들의 관찰결과, 마우스 EH 13144 및 새로 클로닝된 인간 EH IGR7 (CNCM I-5224) 또는 EH IGR11 (둘 모두 그 서열이 100% 상동성)의 항원성은 주로, 5개의 게놈 사이에 공유되는 7개의 유전자, 균주 13144와 708 사이에 공유되는 3개의 유전자, 및 E. 히라에 13144에 독특한 22개의 고유 유전자를 포함하는, 39.2 kb 프로파지 코딩 65개의 유전자에서 시포비리다에 파지의 파지 테일 길이 테이프 메져 단백질 (Tmp) (락토코쿠스 박테리오파지 테일 테이프 메져 단백질 TP901 패밀리)에 의존한다는 것이 밝혀졌다. 엔테로코쿠스 종 사이의 유전 물질의 전달이 보고된 바 있다 (Mazaheri Nezhad Fard et al., 2010, 2011). 특히, 그람 양성 박테리아를 감염시키는 파지는 대개 시포비리다에 파지의 테이프 메져 단백질 내에 위치하는, 펩티다제 및 트랜스글리코실라제 활성에 상응하는 펩티도글리칸 가수분해 모티프를 함유한다 (Piuri and Hatfull, 2006). 이제, 본 발명자들은 비면역원성 E. 히라에 균주 (EH17, 10815)에 시포비리다에 과에 속하는 박테리오파지로, 또는 전체 파지 테일 길이 테이프 메져 단백질 (Tmp) 또는 TMP 프로파지 2로부터 선택되는 에피토프를 코딩하는 유전자 변형된 플라스미드로, 및 음성 대조군 (MHC 결합 그루브에서 돌연변이화된 단백질 또는 에피토프)을 형질도입시킴으로써 상기 균주의 면역원성을 회복시키는 시도를 할 것이다. 특히, M. 튜베르쿨로시스 Rpf T 세포 항원은 M. 튜베르쿨로시스에 대한 인간 면역 반응에서 중요한 표적인 되는 것으로 보고되었다 (Commandeur et al., 2011)
이러한 마우스 데이터는 임상적 관련성을 갖는다. 선별의 제1 단계로, 인 실리코 예측 (수개의 E. 히라에 균주의 서열 정렬, 단백질 세포내 위치, 및 MHC 결합 친화도 예측 알고리즘)에 기초하여, 추정 면역원성을 보유하는 후보 에피토프 목록을 확립하였다 (도 23). 제2 단계에서, 4개의 9량체-TMP 특이적 에피토프의 4개 군과 함께, HLA-A0201+ 정상 지원자로부터의 말초 혈액 단핵 세포를 사용하는 시험관내 자극 검정법, 이어서, 6명의 건강한 지원자에서 수행된, 단일 9량체 에피토프를 이용하는 회상 반응을 통해, 5개의 에피토프가 면역원성인 것으로 간주될 수 있는 것으로 밝혀졌다 (도 24). 상기 5개의 인간 면역원성 TMP 에피토프와 정상적인 인간 프로테옴 사이의 서열 상동성을 조사하는, >350개의 종양 세포주에서 상기 프로테옴 및 유전자 발현의 생물정보 스크리닝인 제3 단계를 통해 상기 HLA-0201 에피토프 KLAKFASVV (서열식별번호 63) 중 하나는 글리세롤-3 포스페이트 데히드로게나제 1 유사 단백질 (GPD1L, 3p22.3에서 코딩된 유전자)과 78%의 서열 상동성을 공유한다는 결론을 얻었다. GPD1L은 원형질막에서 나트륨 채널, 전압 개폐, 타입 V 알파 서브유닛 (SCN5A)과 회합되어 있는 시토졸 단백질이다. GPD1L은 miR-210에 의해 음성적으로 조절되는 저산소증 연관 단백질이고, 다수의 조직 (뇌, 배아발생 미 태아발생 동안)에서 과다발현되고, 저산소증 유도 인자 1-알파 (HIF-1α)의 프로테오솜 분해에 기여한다. 실제로, MiR-210은 글리세롤-3-포스페이트 데히드로게나제 1 유사 (GPD1L) 효소의 수준을 억제시켜 프롤릴 히드록실라제 (PHD) 활성 억제에 기여한다. 정상적인 생리적 조건하에서, PHD는 저산소증 유도 인자 1-알파 (HIF-1α)에서 프롤린을 히드록실화하여 그의 프로테아솜에 의한 분해를 유도한다. miR-210에 의한 GPD1L의 하향조절에 기인하여 PHD 활성이 억제된 경우, HIF-1α는 프로테아솜에 의해 분해되지 않고, 핵으로 이동하여, 여기서 저산소증 유도 인자 1-베타 (HIF-1β)와 이종이량체를 형성하고; HIF-1α와 HIF-1β의 이량체화는 암 전이의 원인이 되는 전사 반응을 활성화시킨다 (Costales et al., 2017). 따라서, 건강한 주변 조직과 비교하였을 때, 두부경부 편평 세포 암종에서의 GPD1L의 더 높은 mRNA 수준 및/또는 단백질 발현은 장기간 동안 다변량 콕스 회귀 분석에서 국소 재발 및 원위 전이에 대한 독립적인 예후 파라미터 및 바람직한 예측 인자였다 (Feng et al., 2014).
상기 파지 펩티드의 HLA-A0201에 대한 결합 친화도가 정상 조직 펩티드 중 하나와 유사하기 때문에, 파지 펩티드는 정상 펩티드의 면역원성 분자 모방체로 간주될 수 있다. 그러므로, TMP 파지 특이적 TCR 및 자기 조직 또는 (GPD1L을 과다발현하는) 종양 조직, 대개는 태아 조직 또는 줄기 세포 사이의 교차 반응성이 상기 EH 박테리아와 관련하여 전달된 파지의 항암 효과를 설명해 줄 수 있다고도 생각해 볼 수 있다. 특히, 종양 세포주는 웹에서 이용가능한 유전자 발현 atlas로부터 알 수 있는 바와 같이, 다양한 수준으로 GPD1L 단백질을 발현할 수 있다.
지금까지, 종양 보유자 (인간 환자 또는 마우스), 및 구조적 및 기능적 특징화에서 사량체 생산, T 세포 포획을 가능하게 하는, HLA-A0201 제한-에피토프 TMP 2 (KMVEILEEI, 서열식별번호 55), 에피토프 3 (RLLKYDVGV, 서열식별번호 56), 에피토프 9 (LLGIYQSYV, 서열식별번호 62), 에피토프 10 (KLAKFASVV, 서열식별번호 63, GPD1L로부터의 서열과 상동성) 및 에피토프 TMP 13 (ILVAITTTI, 서열식별번호 66)이 발견되었다 (도 24). 미생물과 종양 항원 사이의 분자 모방의 개념을 증명하기 위해, 다양한 동계 종양 세포주에 대하여 종양 침윤 림프구로부터의 E. 히라에 특이적 CTL 클론의 반응성을 시험하였다.
이러한 자산이 암 백신 및 T 세포 전달을 위해 이용가능한 E. 히라에 13144의 준-고유의 항원성을 설명해 줄 수 있고, 전용 종의 니칭을 가능하게 하고/거나, 상기 파지의 절제를 강조할 수 있는, 시클로포스파미드와 동일하거나, 또는 상이한 임의의 약물과 조합되는 항암 프로바이오틱스 또는 온코백스로서 사용하기 위해 다른 박테리아 균주를 감염시키는 데 상기 파지 사용을 유도한다. 예를 들어, 시클로포스파미드는 E. 히라에가 그의 경쟁자인 E. 갈리나룸보다 더 많이 과다로 나타낼 수 있게 하며, 동시에 이들 두 균주 사이의 경쟁은 그 자체가 파지 절제를 촉진시켰다.
실시예 12: E. 히라에 13144에서 고유의 항원성 서열로서의 파지 테일 길이 테이프 메져 단백질.
화학요법, 방사선요법, 표적화 요법 또는 면역 체크포인트 억제제를 통해 종양 연관 항원에 대한 면역 반응을 일으키는 것이 성공적인 암 치료의 주축이 되어 왔다 (Galluzzi et al., 2015; Sharma and Allison, 2015). 장 미생물총이 암-면역 설정점을 결정짓고, 이에 따라 항암 요법의 임상 결과에 영향을 준다는 최근 발견이 미생물 또는 그의 생성물이 장 면역 뿐만 아니라, 전신 면역도 조정한다는 개념을 다시 불러일으켰다 (Zitvogel et al., 2018). 실제로, 엔테로코쿠스 히라에, 박테로이데스 프라길리스, 및 아커만시아 무시니필라에 대한 기억 IFNγ 생산 CD4+ (TH1) 및 CD8+ (TC1) T 세포 반응은 암 환자에서의 바람직한 임상 결과와 연관이 있으며 (Daillere et al., 2016; Rong et al., 2017; Routy et al., 2018; Vetizou et al., 2015), 이는 기존의 미생물 특이적 T 세포가 항암 면역 반응에 기여할 수 있다는 것을 제안한다. 그러나, 미생물이 전신 자가면역 질환 또는 국소 장 만성 염증 발생에 어떻게 영향을 줄 수 있는지에 관한 의문은 아직 해소되지 못한 상태이다 (Rose, 2017). 분자 모방 이론에서는 박테리아 또는 바이러스에 의해 유도된 T 세포는 그가 자기 내성 유도 기전 (예컨대, 클로날 결실 또는 불활성화)으로부터 '회피'하며, 잘못하여 자기항원을 인식할 수 있다고 가정한다. 박테리아 게놈으로부터의 MHC 클래스 I 및 클래스 II 결합 에피토프가 시험관내 또는 생체내에서 면역원성을 매개한다고 확인되었지만 (Chai et al., 2017; Perez-Munoz et al., 2015; Rubio-Godoy et al., 2002; Vujanovic et al., 2007; Yang et al., 2014), 정상 또는 신생물성 조직에 대한 면역 반응에 대한 미생물 특이적 CD4+ 또는 CD8+ T 림프구의 기능적 관련성을 의심할 여지 없이 분명하게 입증한 보고는 극소수이다 (Balachandran et al., 2017; Bradley et al., 2017; Ji et al., 2010).
시클로포스파미드 (CTX)는 E. 히라에의 장 루멘에서 장간막 비장 면역 조직으로의 이동을 유도하여 CD4+ 및 CD8+ T 림프구가, 치료상 효과적인 항암 면역 반응과 상관관계를 갖는 IL-17 및 IFNγ를 생산하도록 유도한다 (Daillere et al., 2016; Viaud et al., 2013). 광범위한 항생제는, E. 히라에가 경구 위관영양에 의해 공급되지 않은 경우에는 CTX의 치료 효능을 폐기시켰다 (Daillere et al., 2016). E. 히라에 균주 패널 (표 11, 도 31a)을 항생제에 의해 동요된 CTX의 항암 효과를 회복시킬 수 있는 그의 능력에 대하여 비교하였을 때, 본 발명자들은 오직 일부 E. 히라에 분리주 (예컨대, 13144, IGR7, 및 IGR11)만이 효과적이었다는 것을 발견하게 되었다 (도 27a-b, (Daillere et al., 2016)). CTX 및 E. 히라에 13144의 조합의 치료 효능이 CD8+ T 세포 고갈 또는 IFNγ의 중화에 의해 제거된다는 점을 고려하여 (Daillere et al., 2016), 본 발명자들은 숙주의 프라임-부스트 노출 (도 27c), 및 수지상 세포 (DC)에 로딩된 다양한 E. 히라에 균주로 비장 CD8+ T 세포를 생체외 재자극한 후, 기억 TC1 면역 반응을 유도할 수 있는 E. 히라에 균주의 차별적 능력에 대해 스크리닝하였다. E. 히라에 13144는 (비관련 엔테로코쿠스에 대하여 교차 반응성을 나타내지 않은) 특이적인 TC1 면역 반응을 일으켰지만, E. 히라에 708 (프로토타입인 비효과적인 균주)은 상기 면역 반응을 일으키지 못했다 (도 27d). 20개의 E. 히라에 균주에 대한 범게놈 분석을 통해 1,677개의 이종상동성 유전자 (59%) 코어 게놈을 얻었고, 부속 게놈은 각각 946개의 이종상동성 유전자 및 477개의 고유 유전자로 구성되었다 (도 31b). 이러한 필로게노믹 분석 결과, 균주 13144는 균주 IGR7과 100% 상동성이고, 86개의 이종상동성 고유 유전자을 포함하는 것으로 나타났다 (도 31b).
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표 11: E. 히라에 균주 설명
이어서, 본 발명자들은 비면역원성 박테리아 균주 (708 및 13344) 대비 면역원성 박테리아 균주 (13144)에 대하여 세포벽을 코딩하는 박테리아 유전자 및 분비된 단백질의 서열 정렬을 수행한 후 (PSORT 소프트웨어), 이어서, MHC 클래스 I H-2Kb 단백질에 대해 강력한 결합 친화도 (<50 nM 결합 친화도, NetMHC 소프트웨어)를 갖는 노나펩티드를 확인하였다 (실시예 3에서 표 6). 이어서, 본 발명자들은 E. 히라에 13144 및 CTX에 반복적으로 노출된 마우스로부터 비장 CD8+ T 세포를 회수하였다 (도 27c). 이들 T 세포를 시험관내에서 E. 히라에 13144로부터의 잠재적으로 면역원성을 나타내는 노나펩티드의 풀 (표 6)로 재자극시켜 IFNγ 생산을 측정한 후 (도 32), 가장 효율적인 그룹 7을 개별 펩티드로 나누었다 (도 27e). 이러한 접근법을 통해 E. 히라에 13144의 39.2 kb (1506 aa)의 프로파지로부터 파지 테일 길이 테이프 메져 단백질 (TMP)의 아미노산 서열의 197번 내지 187번 위치에서 하나의 우세한 에피토프 (1문자 아미노산 코드: TSLARFANI (서열식별번호 25), 약어 TMP1)를 확인하게 되었다 (도 33a). 실제로, E. 히라에 13144의 특정의 게놈 특질은 가장 공통적인 엔테로코쿠스 파지 phiEf11 vB_EfaS_IME197과 약한 서열 상동성을 보이는 2개의 무손상 프로파지 영역 (40.6 kb 및 39.2 kb) (각각 14% 및 11%의 공유 유전자)을 코딩한다는 점이다 (도 31c, 표 12). E. 히라에 13144의 39.2 kb 프로파지와 19개의 다른 서열분석된 E. 히라에 게놈의 비교 분석 결과, IGR7 프로파지 단백질과 100%로 단백질이 동일한 것으로 나타났다. 39.2 kb 프로파지는 65개의 유전자를 코딩하는데, 이는 모든 게놈 사이에 공유되는 1개의 유전자, E. 히라에 13144 및 IGR7에 독특한 38개의 고유 유전자를 포함하고 (도 33b), 시포비리다에 파지의 특징인, 캡시드, 포털 및 테일 구조를 코딩한다. 중요하게는, E. 히라에 13144, E. 히라에 IGR7 및 E. 히라에 IGR11로부터의 39.2 kb 프로파지의 TMP1 에피토프는 100%의 서열 상동성을 보였다 (도 34). 사실상, E. 히라에 IGR7 및 E. 히라에 IGR11은 CTX로 치료된 MCA205 섬유육종의 성장을 감소시키는 데 있어 E. 히라에 13144만큼 효율적이었다 (도 27b). 그에 반해, (E. 히라에 708 및 13344에서 관찰되는) 비상동성 및 TSLARFANI 펩티드의 3번 위치의 돌연변이 (E. 히라에 ATCC9790에서 관찰되는 L→F, 도 34)는 상기 E. 히라에 균주의 항암 효과 감소와 상관관계가 있었다 (도 27b 및 문헌 [Daillere et al., 2016]). 펩티드 특이적 IFNγ 생산 T 세포를 검출하도록 디자인된 Elispot 검정법 결과, E. 히라에 13144 (또는 균주 E. 히라에 IGR7 및 IGR11)의 위관영양을 받은 마우스는 (대조군 펩티드 TMP2 및 TMP3이 아닌) TMP1에 대한 TC1 반응을 시작한 반면, 항암 활성이 전혀 없고, TMP1 (균주 708, 13344, ATCC9790)가 결핍된 E. 히라에 균주는 상기와 같이 작용하지 못한 것으로 밝혀졌다 (도 27e). 본 발명자들은 나이브 및 MCA205 섬유육종 보유 C57BL/6 마우스에서 TMP1 특이적 세포독성 T 림프구 (CTL)의 빈도 및 분포를 검출하기 위해 형광성 H-2Kb/TSLARFANI 사량체 복합체를 이용하였다. CTX/E. 히라에 13144 요법 후 12일째, 최대 1%의 비장 CD8+ T가 TMP1 펩티드를 인식하였고 (도 27f, 좌측 패널), 나이브 (도 27f, 우측 패널) 및 종양 보유자로부터의 비장에서 뿐만 아니라, 종양 배수 림프절 (도 27g)에서 회장 케모카인 수용체 CCR9를 보유하는 TC1 서브세트에서는 TMP1 특이적 CTL이 3-5배 강화된 것으로 나타났다. 특히, H-2Kb/TSLARFANI 사량체는 또한 E. 히라에 균주 IGR7 또는 IGR11로 면역화가 진행된 후에는 높은 비율의 비장 TMP1 특이적 CTL을 보였지만, ATCC9790도, E. 히라에 13344도, 그로 이루어진 면역화 후에는 그렇지 않았다 (도 27h).
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표 12: E. 히라에 13144 게놈 중 프로파지 서열 탐색
실시예 13: 마우스 모델에서 파지 테일 길이 테이프 메져 단백질을 이용한 예방적 및 치료적 면역화
MCA205 암의 성장을 제어할 수 있는 TMP1 특이적 H-2Kb 제한 TC1 세포의 능력을 조사하기 위해, 본 발명자들은 열-불활성화된 E. 히라에 (양성 대조군), 자연적으로 발생된, 13144, IGR7 또는 IGR11로부터의 TSLARFANI 펩티드, E. 히라에 ATCC9790으로부터의, 그의 L→F 돌연변이체 ('mut3', 도 34) 또는 다른 비면역원성 박테리아 펩티드 (그룹 1, 도 32)이 로딩된 수지상 세포 (DC)로 나이브 C57BL/6 마우스를 피하 (s.c.)로 면역화시켰다. 이러한 예방적 세팅에서, (mut3 TSFARFANI가 아닌) TSLARFANI로 펄싱된 DC는 종양 증식을 예방하거나, 또는 억제시키는 데 있어서 전체 E. 히라에 추출물로서 효율적이었다 (도 28a-b). 이어서, 본 발명자들은, 항생제 치료 후, 이어서, 상이한 박테리아 균주의 위관영양 및 CTX 기반 화학요법이 진행되는 (도 27a, (Daillere et al., 2016)) 치료적 세팅에서 TMP1 펩티드가 일반적으로 비효율적인 박테리아인 에스케리키아 콜라이 균주 DH5α에 면역원성을 부여할 수 있는지 여부를 조사하였다. TSLARFANI (서열식별번호 13) 펩티드 (도 35)를 발현하도록 조작된 E. 콜라이는 MCA205 종양 성장을 억제시키는 데 (도 28c) 및 비장에서 사량체 결합 CTL의 생성을 유도하는 데 (도 28d) E. 히라에 13144만큼 효율적이었다. 그에 반해, (마우스 EGFP 단백질을 코딩하는) 비관련 서열, 또는 앵커 위치 2에 S→A 교환을 보유하는 돌연변이체 펩티드 ('mut2', TALARFANI) 또는 'mut3' TMP1 펩티드를 발현하는 E. 콜라이는 암 방어 면역 반응을 유도하는 데 실패하였다 (도 28c-d).
실시예 14: 암 환자에서의 엔테로파지 효과의 임상적 관련성
이어서, 본 발명자들은 이러한 관찰결과에 대해 가능한 병태생리적 관련성에 대해 연구하였다. 본 발명자들은 E. 히라에 게놈 및 그의 파지의 커버리지 범위 (BOC)를 평가하기 위해 17개의 공개적으로 이용가능한 데이터세트로부터 총 3,027개의 성인 및 모체-유아 메타게놈 (대개는 인간 대변으로부터의 것이지만, 다양한 점막으로부터의 것도 포함)을 스크리닝하였다 (도 29a). E. 히라에는 서로 다른 지리, 연령 및 데이터세트로부터의 13개의 샘플 중에 100% 신뢰도로 존재하였다. 다른 ~40개의 사례에서, E. 히라에와 밀접한 관계가 있는 균주가 검출가능하였다. E. 히라에가 발견된 샘플 중 90%에서, (E. 히라에 13144, 708 또는 13344로부터의) 3개의 파지 서열 중 하나가 상호 배타적 방식으로 게놈에 삽입되었다 (도 29a). 그러나, E. 히라에 13144 파지는 E. 히라에 코어 게놈이 존재하지 않는 다수의 샘플에서 검출가능하였고, 이는 E. 히라에 이외의 다른 박테리아 또한 상기 파지의 숙주가 될 수 있다는 것을 제안하는 것이다. 본 발명자들은 3개의 모체-유아 쌍을 이루는 대응 대변 표본에서 및 생후 1, 3, 및 7일된 유아에서 0.66 BOC로 파지 13144의 존재를 검출할 수 있었다. 존재비가 낮은 종은 검출하지 못하는 메타게노믹스 분석과 달리, 컬쳐로믹스, 이어서, 매트릭스 보조 레이저 탈착 이온화 비행 시간 질량 분석법 (MALDI-TOF)은 건강한 개체 (Samb-Ba et al., 2014) 또는 암 환자 (Routy et al., 2018)의 대변 중의 심지어 희귀한 E. 히라에 콜로니도 검출할 수 있는 기술을 제공한다. 76명의 암 환자로부터의 각 단일의 엔테로코쿠스 콜로니 (종 및 개체당 최대 5개, E. 히라에, E. 갈리나룸, E. 듀란스(E. durans), 엔테로코쿠스 패시움(Enterococcus faecium), E. 파에칼리스, E. 카셀리풀라부스(E. casseliflavus) 또는 E. 아비움(E. avium)으로부터의 콜로니를 나타냄)의 PCR 분석은 환자의 34%에서 대개는 E. 파에칼리스 (도 29b) 내부에서 TMP1 펩티드를 포함하는 TMP 서열 (도 36)이 검출될 수 있도록 하였다. 진단시 검출가능한 대변 TMP를 포함한 신장암 및 폐암 환자는 면역 체크포인트 억제제를 이용한 요법 후 연장된 전체 생존을 보였다 (도 29c). 그러므로, 본 발명자들은 높은 친화도로 인간 MHC 클래스 I HLA-A02*01에 결합할 것으로 예측되는 16개의 TMP 유래 노나펩티드 (서열식별번호 54-69)를 시험관내에서 6명의 건강한 지원자로부터의 나이브 CD8+ T 세포를 프라이밍할 수 있는 그의 능력에 대하여 스크리닝하였다. 본 발명자들은 16개의 에피토프 중, TMP 단백질의 2개의 독특한 영역에 위치하고, 유의적인 펩티드 특이적 IFNγ 방출을 일으킬 수 있는 에피토프 6개를 발견하게 되었다 (504-708 및 1397-1462, 도 29d, 도 37, 도 24b, 표 9). 본 발명자들은 NCBI BLASTP 스위트를 이용하여, 인간 암 생검 (TCGA 데이터베이스)에서 유의적인 발현 수준과 연관된 인간 펩티돔을 이들 6개의 HLA-A02*01-제한 면역원성 노나펩티드와의 고도의 상동성에 대하여 검색하였다. 본 발명자들은 오직 펩티드 KLAKFASVV (631-639, 서열식별번호 63)만이, 단백질 글리세롤-3-포스페이트 데히드로게나제 1 유사 GPD1-L에 함유되어 있는 펩티드와 78%의 상동성 (아홉 (9)개의 위치 중 7개, MHC 앵커링 위치 2번 및 9번 위치에 동일한 아미노산 포함)을 공유하였다는 것을 발견하게 되었다 (도 29e). GPD1-L은 보고에 따르면, 저산소증에의 발암성 HIF1α 의존성 적응을 방해하고, 두부경부 편평 세포 암종에서의 바람직한 예후와 연관이 있다 (Feng et al., 2014; Kelly et al., 2011; Liu et al., 2014). 본 발명자들이 알고 있는 한, 암에서 GPD-1L 유전자 중 어떤 돌연변이도 보고된 바 없다. TCGA 트랜스크립토믹스 데이터베이스를 통해 GPD1-L의 높은 발현이 방광암, 폐 선암종에서 및 >500 신장암의 큰 코호트에서의 전체 생존 개선과 연관이 있다는 것 (여기서, HLA-02*01을 발현하지 않는 저 GPD-1L의 경우, 종양에서 더욱 불량한 예후를 보이는 경향으로 진행된다)이 밝혀졌다 (도 29f-h).
또한, 진단시 종양에 의한 GPD1-L mRNA의 높은 발현은 항-PD1/PDL-1 Ab로 치료받은 비소세포 폐암 (NSCLC) 환자의 두 독립 코호트에서 무진행 생존 개선과 연관이 있었다 (도 29i, j). 흥미롭게도, GPD-1L의 발현 수준은 폐암 (LUAD, LUSC 및 TCGA)의 TCGA 데이터세트에서, 및 NSCLC 환자의 두 코호트 (CHUM 및 CGFL)에서 세포독성 림프구, 골수성 수지상 세포, 호중구 및 내피 세포 유전자 시그니처와 상관관계가 있었다 (도 29k).
실시예 15: 마우스 암에서의 엔테로파지 TMP와 발암 드라이버 PSMB4 사이의 분자 모방.
마우스 모델에서 TMP1이 그의 항암 활성을 발휘할 수 있게 하는 기전을 확인하기 위해 (C57/B6 마우스에서 MCA205 종양, 도 27-28), 본 발명자들은 TMP1 펩티드 (TSLARFANI, 서열식별번호 13)와 높은 상동성을 갖는 임의의 H-2Kb-제한 마우스 종양 항원이 존재하는지 여부를 조사하였다. 본 발명자들은 NCBI BLASTP 스위트를 이용하여, 아미노산 위치 76-84 사이의 프로테아솜 서브유닛 베타 타입 4 (PSMB4)에 속하는 펩티드 (GSLARFRNI, 서열식별번호 189)는 78%의 상동성 (9개의 아미노산 중 7개, MHC 앵커링 위치 2번 및 9번 위치에 동일한 아미노산 포함)을 공유하였다는 것을 발견하게 되었다 (도 30a). 본 발명자들은 MCA205의 잠재적 네오에피토프에 질의하였지만, 본 발명자들의 결과를 설명할 수 있을 정도의 유의적인 상동성은 발견하지 못하였으며, 본 발명자들은 비-돌연변이화된 PSMB4 펩티드에 초점을 맞추었다. PSMB4는 불량한 예후와 연관이 있는 (Cheng et al., 2018; Lee et al., 2014; Wang et al., 2018), 다양한 악성 종양, 예컨대, 교모세포종 (Cheng et al., 2018), 흑색종 (Zhang et al., 2017) 및 유방암 (Wang et al., 2018)에서 증식 및 침윤 (Lee et al., 2014)에 관여하는 발암 드라이버이다. MCA205 세포에서 GSLARFRNI (서열식별번호 189)를 GSFARFRNI (서열식별번호 190)로 대체 (TSLARFANI의 mut 3과 등가인, 3번 위치에서의 L→F 교환)하는 PSMB4 서열의 CRISPR/Cas9-매개 게놈 넉인 (도 38) 결과, 자발적 종양 성장 키네틱스의 속도는 감소하였지만, CTX 처리 단독을 방해하지 않으면서, E. 히라에 13144의 항암 효과는 대폭 둔화되었다 (도 30b). 이러한 결과는 E. 히라에 13144에 의해 코딩된 TSLARFANI TMP1 펩티드가 실제로 PSMB4 유래 GSLARFRNI 펩티드에 대한 요법 관련 반응을 유도한다는 견해를 뒷받침한다.
실시예 16: 파지 TMP 서열을 전염적으로 전파시킬 수 있는 E. 히라에 13144의 능력
약독성 박테리오파지는 병독성, 항미생물 내성 유전자, 및 면역원성 서열을 새 박테리아 숙주로 전달하는 박테리아 바이러스이다 (Weinbauer, 2004). 고정 위치에 고도로 보존되는 트립토판 및 페닐알라닌 잔기를 포함하는 가변 연쇄 반복부를 함유하는 TMP 단백질은 시포비리다에 파지의 게놈에 의해 코딩된다 (Belcaid et al., 2011; Piuri and Hatfull, 2006). 파지 TMP 서열을 전염적으로 전파시킬 수 있는 E. 히라에 13144의 능력을 분석하기 위해, 본 발명자들은 E. 히라에 13144의 경구 위관영양 및 전신 CTX 요법을 받은 C57BL/6 마우스로부터의 회장 내용물의 컬쳐로믹 분석을 수행하였다 (도 30c). 본 발명자들은 파지 게놈의 서열분석에 의해 입증되는 바와 같이, 각 동물로부터 7 내지 18개의 박테리아 콜로니를 시험하여 76개의 콜로니 중 E. 갈리나룸이 생체내에서 E. 히라에 유래의 파지에 의해 형질도입된 유일의 방관자 엔테로코쿠스였다는 것을 발견하게 되었다 (도 30d, e 및 도 39). 특히, 나이브 마우스로부터 단리된 90개의 콜로니 (대개는 E. 갈리나룸) 중 어느 것도 TMP 서열을 보유하지 않았다 (도 39). 또한, CTX는, 시험관내 엔테로이드 시스템에서, 또는 회장 내용물의 PCR에서 나타난 바와 같이 (도 30g에 제시 및 제시되지 않음), 소장에서 E. 히라에의 니칭 및/또는 콜로니화를 허용하면서, E. 갈리나룸을 제거하는 데 중요한 역할을 한다. 중요하게는, 소장 엔테로이드를 각각 파지를 보유하거나, 또는 보유하지 않는 E. 히라에 또는 E. 갈리나룸과 균형잡힌 1:1 비율로 함께 인큐베이션시키면, 감염성/용균 파지는 E. 히라에에 의해 6 hr에서는 콜로니 9%, 및 20 hr에서는 26%를 E. 갈리나룸으로 전파한다 (도 30g).
시클로포스파미드와 달리, CDK4/6 억제제 (예컨대, 팔보시클립)는 유방암 환자에서 파지 절제를 일으키는 것으로 보인다. 실제로, 73명의 비치료 환자 대비, 3주 팔보시클립에 의해 치료받은 10명의 환자에서 수술 전에 수거된 환자 대변에 대한 샷건 메타게노믹스 분석 결과, LefSe 다이어그램에 제시되어 있는 바와 같이 (도 30h), (락토코쿠스, 살모넬라(Salmonella), 소달리스(Sodalis), 에스케리키아(Escherichia), 엔테로박테리아로부터의) 파지 서열이 대폭 강화되고, 과다하게 나타난 것으로 밝혀졌다.
이러한 관찰결과는 인간에서의 E. 파에칼리스에서 그가 검출된 것과 일관되게, 암 항원과 이러한 분자 모방을 보이는 펩티드 코딩 파지가 감염성이라는 것을 제안한다.
본 발명자들이 알고 있는 한, 상기 결과는 3가지 주요 증거 라인에 따르면, 엔테로코쿠스 파지는, 기억 TC1 면역 반응을 유도한 후, 암 항원과 교차 반응하는 MHC 클래스 I-제한 항원인 TMP1을 코딩한다는 것을 최초로 입증한 결과임을 나타낸다. 첫째, MHC 클래스 I-결합 TMP1 에피토프 내로 도입된, 자연적으로 발생된 ('mut3') 또는 인공 돌연변이 ('mut2' 또는 'mut3')는 파지 보유 E. 히라에 균주의 종양 예방 잠재능 및 치료 잠재능을 억제시켰다. 둘째, TMP1 코딩 유전자의 E. 콜라이 내로의 전달이 이러한 프로테오박테리아에 면역원성 능력을 부여하였고, 프로테오박테리아는 TMP1 발현 E. 히라에와 동일한 항종양 특성을 획득하였다. 세째, 암 세포가 PSMB4 단백질 내 TMP1 교차반응성 펩티드를 제거하도록 유전자 변형되었을 때, 암 세포는 TMP1 발현 E. 히라에의 경구 위관영양시 더 이상 제어되지 못하는 종양을 형성하였다.
고찰 2
파지는 지구상에서 가장 풍부한 생물학적 엔티티 중 하나이다. 그 개수는 매초 1025개의 파지 감염 발생의 잠재능을 보이는 1031개의 입자 정도로 높은 수치에 달하는 것으로 추정된다 (Pedulla et al., 2003; Wommack and Colwell, 2000). 본원에서 연구된 '엔테로파지'의 항원성은 TMP 단백질의 핫 스폿에 있다. 파지 테일의 길이를 측정하는 데 있어서의 그의 구조적 역할을 넘어서서, 시포비리다에 과로부터의 파지에 의해 코딩된 TMP는 여러 기능적 도메인을 함유하는데, 그 중 하나는 박테리아의 효율적인 감염을 촉진시키는 펩티도글리칸 히드롤라제 활성을 갖고, 리소자임 활성을 갖는 또 다른 것은 소생 촉진 인자, Rpf로서 작용한다 (Duerkop et al., 2014). Rpf는 휴면 박테리아의 재활성화에 연루되어 있을 뿐만 아니라, 마이코박테리움 튜베르쿨로시스에 대한 선천 반응 (Russell-Goldman et al., 2008) 뿐만 아니라, 동족 장기간 면역 반응 (Commandeur et al., 2011)도 조정한다. 실제로, M. 튜베르쿨로시스 Rpf에 함유된 T 세포 에피토프는 상기 병원체에 대한 인간 면역 반응에서 중요하다 (Commandeur et al., 2011). 그의 특이적인 항원성 특성을 넘어서서, 파지는 섬유상 박테리오파지 코트 단백질 III 도메인 I를 통해 DNA 백신에 광범위한 아주반트성을 전달한다 (Cuesta et al., 2006; Larsen et al., 2008). 따라서, 이러한 시각을 통해 박테리오파지가 항암 면역 반응을 자극시키기 위한 치료적 의료품에 강화될 수 있다는 가능성이 열린다.
본 문서에서 사용된 약칭:
ATB: 항생제
BHI: 뇌 심장 침출액
BM-DC: 골수 수지상 세포
cDNA: 상보성 데옥시핵산
CGFL: 조르주 프랑수아 레클레르크 센터(Centre Georges Francois Leclerc)
CHUM: 몬트리올 대학 병원 센터(Centre Hospitalier Universitaire de Montreal)
CTL: 세포독성 T 세포
Ctrl: 대조군
CTX: 시클로포스파미드
DC: 수지상 세포
DNA: 데옥시리보핵산
GM-CSF: 과립구-대식세포 콜로니-자극 인자
GPD1-L: 글리세롤-3-포스페이트 데히드로게나제 1 유사
IFNγ: 인터페론 감마
IMDM: 이스코브 변형된 둘베코 배지
Ip: 복강내
MALDI-TOF: 매트릭스 보조 레이저 탈착 이온화 비행 시간
MHC: 주조직 적합성 복합체
NaCl: 염화나트륨
NSCLC: 비소세포 폐암
PBMC: 말초 혈액 단핵 세포
PCR: 중합효소 연쇄 반응
PSMB4: 프로테아솜 서브유닛 베타 타입-4
PVDF: 폴리비닐리덴 디플루오라이드
RCC: 신장 세포 암종
Rpf: 소생 촉진 인자
RPMI: 로스웰 파크 메모리얼 인스티튜트(Roswell Park Memorial Institute)
Sc: 피하
SEM: 평균의 표준 오차
Tc1: T 세포독성 세포 타입 1
Th1: T 헬퍼 세포 타입 1
TLR3: 톨 유사 수용체 3
TMP: 테이프 메져 단백질
참고문헌
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acagcatcca gcaaattttt ttccataaaa 38580 tccccccttt cttcttctca ctaataagat acgaaaaaag gggggagcta tttttatttt 38640 tttagatatc ctggtacttc gtgtagagaa gataaaactg ctaacgtttt ttgttgcaag 38700 tcttctgaag gagccaacaa atctgggatc atgatcactg ggatctccgc acttgctgct 38760 gcaagtatcc cgtttttaga atcttccaga accaatgttt cttgtttttt cgttcctaga 38820 tattcatggg caagcaaaaa gatttctgga tcaggtttag cacgtttgac attttctgct 38880 gaaacaatcg tttcaaaata gtttgtcagt tggttctttt ccaataatag ctcaataata 38940 tgacgttggt tactagaagc gacaacttta ggtattcggt gttcttctaa aaagtccagt 39000 aattcgatta ctcctggttt taattgcact gcacctaagg aaaaccgtct gatcgtttct 39060 tcataagcat cattaatgaa tttttgaaca ttgtttttcc caaaacttgc aaagatctga 39120 tgataatttg cccaaacctc ttcatctgat acacctagat attttaaata caattctttg 39180 tcgtaaggaa agcccatttg atcagcaacc atttgcgagg cttcatagta gacgatttct 39240 gtgtcaaaga gtaacccatc catgtcaaaa atgacagctt tataattcat 39290 <210> 3 <211> 9 <212> PRT <213> Enterococcus hirae <400> 3 Ser Ala Phe Pro Tyr Glu Gln Glu Leu 1 5 <210> 4 <211> 9 <212> PRT <213> Enterococcus hirae <400> 4 Tyr Asn Tyr Ser Lys Ser Tyr Pro Val 1 5 <210> 5 <211> 9 <212> PRT <213> Enterococcus hirae <400> 5 Val Ser Phe Ser His Tyr Arg Pro Gly 1 5 <210> 6 <211> 9 <212> PRT <213> Enterococcus hirae <400> 6 Val Thr Phe Leu Gly Tyr Asn Ala Phe 1 5 <210> 7 <211> 9 <212> PRT <213> Enterococcus hirae <400> 7 Thr Val Tyr Thr Phe His Val Asn Ile 1 5 <210> 8 <211> 9 <212> PRT <213> Enterococcus hirae <400> 8 Thr Ser Tyr Ser Pro Leu Phe Leu Leu 1 5 <210> 9 <211> 9 <212> PRT <213> Enterococcus hirae <400> 9 Thr Asn Tyr Ile Tyr Pro Asn Ile Leu 1 5 <210> 10 <211> 9 <212> PRT <213> Enterococcus hirae <400> 10 Val Val Pro Ile Leu Phe Leu Gly Leu 1 5 <210> 11 <211> 9 <212> PRT <213> Enterococcus hirae <400> 11 Lys Asn Tyr Lys Ala Tyr Val Glu Leu 1 5 <210> 12 <211> 9 <212> PRT <213> Enterococcus hirae <400> 12 Ser Ala Met Lys Tyr Gly Ile Pro Leu 1 5 <210> 13 <211> 9 <212> PRT <213> Enterococcus hirae <400> 13 Thr Ser Leu Ala Arg Phe Ala Asn Ile 1 5 <210> 14 <211> 9 <212> PRT <213> Enterococcus hirae <400> 14 Ala Met Ile Glu Phe Ile Gln Gly Leu 1 5 <210> 15 <211> 9 <212> PRT <213> Enterococcus hirae <400> 15 Val Ala Ile Thr Phe Gly Gly Pro Leu 1 5 <210> 16 <211> 9 <212> PRT <213> Enterococcus hirae <400> 16 Val Ser Thr Asn His Tyr Gly Leu Leu 1 5 <210> 17 <211> 9 <212> PRT <213> Enterococcus hirae <400> 17 Val Met Phe Gly Leu Phe Ile Thr Ile 1 5 <210> 18 <211> 9 <212> PRT <213> Enterococcus hirae <400> 18 Thr Val Phe Ser Leu Val Ser Leu Leu 1 5 <210> 19 <211> 9 <212> PRT <213> Enterococcus hirae <400> 19 Ser Ile Tyr Asn Leu Glu Lys Pro Leu 1 5 <210> 20 <211> 9 <212> PRT <213> Enterococcus hirae <400> 20 Tyr Thr Ile Ile Arg Tyr Gly Asn Leu 1 5 <210> 21 <211> 9 <212> PRT <213> Enterococcus hirae <400> 21 Ser Asn Gly Leu Leu Tyr Thr Pro Met 1 5 <210> 22 <211> 9 <212> PRT <213> Enterococcus hirae <400> 22 Asn Asn Tyr His Tyr Val Gly Gly Leu 1 5 <210> 23 <211> 9 <212> PRT <213> Enterococcus hirae <400> 23 Ser Met Phe Leu Asn Cys Asn Asn Leu 1 5 <210> 24 <211> 9 <212> PRT <213> Enterococcus hirae <400> 24 Ile Ala Phe Gln Gly Tyr Ser Ser Leu 1 5 <210> 25 <211> 9 <212> PRT <213> Enterococcus hirae <400> 25 Gln Val Thr Asn Phe Phe Asn Met Phe 1 5 <210> 26 <211> 9 <212> PRT <213> Enterococcus hirae <400> 26 Ile Met Leu Gly Leu Phe Met Thr Met 1 5 <210> 27 <211> 9 <212> PRT <213> Enterococcus hirae <400> 27 Ile Asn Ala Lys Phe Ser Ser Gln Leu 1 5 <210> 28 <211> 9 <212> PRT <213> Enterococcus hirae <400> 28 Tyr Ile Tyr Asn His Tyr Lys Asp Met 1 5 <210> 29 <211> 9 <212> PRT <213> Enterococcus hirae <400> 29 Tyr Val Tyr Gly Lys Ser Arg Thr Met 1 5 <210> 30 <211> 9 <212> PRT <213> Enterococcus hirae <400> 30 Ile Ala Phe Leu Ser Tyr Lys Leu Phe 1 5 <210> 31 <211> 9 <212> PRT <213> Enterococcus hirae <400> 31 Ile Met Tyr Glu Tyr Met Tyr Pro Val 1 5 <210> 32 <211> 9 <212> PRT <213> Enterococcus hirae <400> 32 Ser Ser Met Glu Tyr Phe Leu Lys Val 1 5 <210> 33 <211> 9 <212> PRT <213> Enterococcus hirae <400> 33 Ile Ser Phe Phe Gln Glu Asn Gln Leu 1 5 <210> 34 <211> 9 <212> PRT <213> Enterococcus hirae <400> 34 Thr Asn Leu Leu Phe Met Thr Ser Leu 1 5 <210> 35 <211> 9 <212> PRT <213> Enterococcus hirae <400> 35 Lys Ile Phe Ser Ile Phe Met Leu Leu 1 5 <210> 36 <211> 9 <212> PRT <213> Enterococcus hirae <400> 36 Leu Asn Ile Phe Lys Phe Asn Arg Phe 1 5 <210> 37 <211> 9 <212> PRT <213> Enterococcus hirae <400> 37 Met Thr Tyr Asp Tyr Arg Gly Gly Phe 1 5 <210> 38 <211> 9 <212> PRT <213> Enterococcus hirae <400> 38 Pro Ser Tyr Met Phe Arg Thr Ser Phe 1 5 <210> 39 <211> 9 <212> PRT <213> Enterococcus hirae <400> 39 Gln Ser Tyr Thr Tyr Tyr Met Thr Ala 1 5 <210> 40 <211> 9 <212> PRT <213> Enterococcus hirae <400> 40 Ile Thr Phe Ser His Tyr Glu Pro Thr 1 5 <210> 41 <211> 9 <212> PRT <213> Enterococcus hirae <400> 41 Met Ser Phe Thr Phe Phe Ser Ser Thr 1 5 <210> 42 <211> 9 <212> PRT <213> Enterococcus hirae <400> 42 Ile Ala Phe Gln Asn Phe Val Asn Leu 1 5 <210> 43 <211> 9 <212> PRT <213> Enterococcus hirae <400> 43 Ser Met Phe Ile Ala Phe Gln Asn Phe 1 5 <210> 44 <211> 9 <212> PRT <213> Enterococcus hirae <400> 44 Leu Asn Tyr Asp Tyr Gly Asn Arg Ile 1 5 <210> 45 <211> 9 <212> PRT <213> Enterococcus hirae <400> 45 Ala Gly Ile Cys Phe Phe Thr Gly Val 1 5 <210> 46 <211> 9 <212> PRT <213> Enterococcus hirae <400> 46 Val Glu Tyr Thr Tyr Phe Pro Thr Leu 1 5 <210> 47 <211> 9 <212> PRT <213> Enterococcus hirae <400> 47 Ala Ala Tyr Val Phe Glu Met Asn Phe 1 5 <210> 48 <211> 9 <212> PRT <213> Enterococcus hirae <400> 48 Glu Met Tyr Arg Lys Leu Ser Thr Leu 1 5 <210> 49 <211> 9 <212> PRT <213> Enterococcus hirae <400> 49 Tyr Asn Tyr Gly Tyr Lys Ser Val Leu 1 5 <210> 50 <211> 9 <212> PRT <213> Enterococcus hirae <400> 50 Val Ile His Glu Leu Tyr Asn Ser Leu 1 5 <210> 51 <211> 9 <212> PRT <213> Enterococcus hirae <400> 51 Thr Asn Tyr Val Lys Leu Arg Pro Leu 1 5 <210> 52 <211> 9 <212> PRT <213> Enterococcus hirae <400> 52 Gln Ala Val Asn His Phe Thr Gly Ile 1 5 <210> 53 <211> 9 <212> PRT <213> Enterococcus hirae <400> 53 Tyr Thr Asp Tyr Ser Asn Gln Leu Lys 1 5 <210> 54 <211> 9 <212> PRT <213> Enterococcus hirae <400> 54 Ala Met Ile Glu Phe Ile Gln Gly Leu 1 5 <210> 55 <211> 9 <212> PRT <213> Enterococcus hirae <400> 55 Lys Met Val Glu Ile Leu Glu Glu Ile 1 5 <210> 56 <211> 9 <212> PRT <213> Enterococcus hirae <400> 56 Arg Leu Leu Lys Tyr Asp Val Gly Val 1 5 <210> 57 <211> 9 <212> PRT <213> Enterococcus hirae <400> 57 Thr Leu Val Gly Val Thr Phe Ala Ile 1 5 <210> 58 <211> 9 <212> PRT <213> Enterococcus hirae <400> 58 Ala Met Gln Asn Leu Val Ala Ala Val 1 5 <210> 59 <211> 9 <212> PRT <213> Enterococcus hirae <400> 59 Ala Ile Met Ala Ile Ala Asn Gly Val 1 5 <210> 60 <211> 9 <212> PRT <213> Enterococcus hirae <400> 60 Ala Met Ser Met Asn Met Glu Glu Val 1 5 <210> 61 <211> 9 <212> PRT <213> Enterococcus hirae <400> 61 Lys Val Phe Gly Lys Met Thr Ser Val 1 5 <210> 62 <211> 9 <212> PRT <213> Enterococcus hirae <400> 62 Leu Leu Gly Ile Tyr Gln Ser Tyr Val 1 5 <210> 63 <211> 9 <212> PRT <213> Enterococcus hirae <400> 63 Lys Leu Ala Lys Phe Ala Ser Val Val 1 5 <210> 64 <211> 9 <212> PRT <213> Enterococcus hirae <400> 64 Lys Leu Trp Ala Asn Met Ser Lys Ala 1 5 <210> 65 <211> 9 <212> PRT <213> Enterococcus hirae <400> 65 Met Leu Ser Asn Pro Ile Thr Ala Ile 1 5 <210> 66 <211> 9 <212> PRT <213> Enterococcus hirae <400> 66 Ile Leu Val Ala Ile Thr Thr Thr Ile 1 5 <210> 67 <211> 9 <212> PRT <213> Enterococcus hirae <400> 67 Lys Met Ala Ala Leu Ala Ala Ser Ala 1 5 <210> 68 <211> 9 <212> PRT <213> Enterococcus hirae <400> 68 Ala Met Leu Ser Asn Pro Ile Thr Ala 1 5 <210> 69 <211> 9 <212> PRT <213> Enterococcus hirae <400> 69 Asn Met Ala Glu Ala Phe Ala Ser Ala 1 5 <210> 70 <211> 9 <212> PRT <213> Enterococcus hirae <400> 70 Thr Met Phe Ser Asp Ser Ala Leu Lys 1 5 <210> 71 <211> 9 <212> PRT <213> Enterococcus hirae <400> 71 Leu Leu Thr Arg Phe Thr Thr Leu Lys 1 5 <210> 72 <211> 9 <212> PRT <213> Enterococcus hirae <400> 72 Lys Thr Ala Phe Ser Gly Ile Val Lys 1 5 <210> 73 <211> 9 <212> PRT <213> Enterococcus hirae <400> 73 Lys Thr Ile Ser Thr Met Phe Glu Lys 1 5 <210> 74 <211> 9 <212> PRT <213> Enterococcus hirae <400> 74 Val Phe Gly Lys Met Thr Ser Val Phe 1 5 <210> 75 <211> 9 <212> PRT <213> Enterococcus hirae <400> 75 Ala Tyr Phe Asn His Thr Leu Asp Leu 1 5 <210> 76 <211> 9 <212> PRT <213> Enterococcus hirae <400> 76 Ala Trp Lys Ser Asn Phe Met Asn Ile 1 5 <210> 77 <211> 9 <212> PRT <213> Enterococcus hirae <400> 77 Arg Tyr Gly Thr Thr Glu Ser Gln Leu 1 5 <210> 78 <211> 9 <212> PRT <213> Enterococcus hirae <400> 78 Ser Tyr Val Asn Asn Gly Ala Ser Ile 1 5 <210> 79 <211> 9 <212> PRT <213> Enterococcus hirae <400> 79 Lys Tyr Lys Ser Asn Leu Ala Gly Leu 1 5 <210> 80 <211> 9 <212> PRT <213> Enterococcus hirae <400> 80 Val Phe Gly Lys Met Thr Ser Val Phe 1 5 <210> 81 <211> 9 <212> PRT <213> Enterococcus hirae <400> 81 Ala Phe Ser Gly Ile Val Lys Ser Phe 1 5 <210> 82 <211> 9 <212> PRT <213> Enterococcus hirae <400> 82 Val Tyr Thr Asp Tyr Ser Asn Gln Leu 1 5 <210> 83 <211> 9 <212> PRT <213> Enterococcus hirae <400> 83 Ala Phe Gln Asn Gln Ile Thr Gln Leu 1 5 <210> 84 <211> 9 <212> PRT <213> Enterococcus hirae <400> 84 Val Ile Asn Pro Ile Gly Ser Leu Arg 1 5 <210> 85 <211> 9 <212> PRT <213> Enterococcus hirae <400> 85 Lys Ala Lys Ile Lys Ser Pro Ser Arg 1 5 <210> 86 <211> 9 <212> PRT <213> Enterococcus hirae <400> 86 Lys Thr Ile Ser Thr Met Phe Glu Lys 1 5 <210> 87 <211> 9 <212> PRT <213> Enterococcus hirae <400> 87 Ala Ser Lys Ala Gly Gly Gly Phe Arg 1 5 <210> 88 <211> 9 <212> PRT <213> Enterococcus hirae <400> 88 Arg Thr Phe Ala Ala Thr Gly Ile Arg 1 5 <210> 89 <211> 9 <212> PRT <213> Enterococcus hirae <400> 89 Gly Asn Lys Val Thr Asn Phe Phe Arg 1 5 <210> 90 <211> 9 <212> PRT <213> Enterococcus hirae <400> 90 Ile Thr Gly Ser Arg Leu Ile Lys Arg 1 5 <210> 91 <211> 9 <212> PRT <213> Enterococcus hirae <400> 91 Asp Val Phe Glu Gly Ala Val Lys Arg 1 5 <210> 92 <211> 9 <212> PRT <213> Enterococcus hirae <400> 92 Glu Ala Phe Ala Ser Ala Asp Pro Lys 1 5 <210> 93 <211> 9 <212> PRT <213> Enterococcus hirae <400> 93 Asp Val Phe Glu Gly Ala Val Lys Arg 1 5 <210> 94 <211> 9 <212> PRT <213> Enterococcus hirae <400> 94 Thr Met Phe Ser Asp Ser Ala Leu Lys 1 5 <210> 95 <211> 9 <212> PRT <213> Enterococcus hirae <400> 95 Glu Ser Ala Phe Thr Gly Val Lys Lys 1 5 <210> 96 <211> 9 <212> PRT <213> Enterococcus hirae <400> 96 Thr Ser Val Ala Val Gln Ser Ala Lys 1 5 <210> 97 <211> 9 <212> PRT <213> Enterococcus hirae <400> 97 Asp Thr Ala Ala Thr Ser Leu Ala Arg 1 5 <210> 98 <211> 9 <212> PRT <213> Enterococcus hirae <400> 98 Met Ile Glu Phe Ile Gln Gly Leu Lys 1 5 <210> 99 <211> 9 <212> PRT <213> Enterococcus hirae <400> 99 Met Ala Leu Leu Ala Gly Met Leu Arg 1 5 <210> 100 <211> 9 <212> PRT <213> Enterococcus hirae <400> 100 Arg Thr Phe Ala Ala Thr Gly Ile Arg 1 5 <210> 101 <211> 9 <212> PRT <213> Enterococcus hirae <400> 101 Phe Ser Gly Ile Val Lys Ser Phe Lys 1 5 <210> 102 <211> 9 <212> PRT <213> Enterococcus hirae <400> 102 Glu Ala Gly Gly Ser Ala Phe Ser Arg 1 5 <210> 103 <211> 9 <212> PRT <213> Enterococcus hirae <400> 103 Thr Ser Val Gly Ser Asn Met Ala Lys 1 5 <210> 104 <211> 9 <212> PRT <213> Enterococcus hirae <400> 104 Lys Thr Ile Ser Thr Met Phe Glu Lys 1 5 <210> 105 <211> 9 <212> PRT <213> Enterococcus hirae <400> 105 Tyr Thr Asp Tyr Ser Asn Gln Leu Lys 1 5 <210> 106 <211> 9 <212> PRT <213> Enterococcus hirae <400> 106 Met Val Glu Ile Leu Glu Glu Ile Arg 1 5 <210> 107 <211> 9 <212> PRT <213> Enterococcus hirae <400> 107 Val Ile Asn Pro Ile Gly Ser Leu Arg 1 5 <210> 108 <211> 9 <212> PRT <213> Enterococcus hirae <400> 108 Glu Asp Phe Ala Asn Val Thr Gly Arg 1 5 <210> 109 <211> 9 <212> PRT <213> Enterococcus hirae <400> 109 Ile Ala Gly Phe Val Asp Gly Leu Arg 1 5 <210> 110 <211> 9 <212> PRT <213> Enterococcus hirae <400> 110 Thr Pro Met Gly Lys Met Val Glu Ile 1 5 <210> 111 <211> 9 <212> PRT <213> Enterococcus hirae <400> 111 Asn Leu Leu Thr Arg Phe Thr Thr Leu 1 5 <210> 112 <211> 9 <212> PRT <213> Enterococcus hirae <400> 112 Arg Leu Ile Lys Arg Ser Asn Ala Ile 1 5 <210> 113 <211> 9 <212> PRT <213> Enterococcus hirae <400> 113 Ala Arg Phe Ala Asn Ile Thr Gln Met 1 5 <210> 114 <211> 9 <212> PRT <213> Enterococcus hirae <400> 114 Phe Arg Thr Phe Ala Ala Thr Gly Ile 1 5 <210> 115 <211> 9 <212> PRT <213> Enterococcus hirae <400> 115 Leu Arg Ala Ile Ile Thr Val Gly Lys 1 5 <210> 116 <211> 9 <212> PRT <213> Enterococcus hirae <400> 116 Ala Arg Phe Ala Asn Ile Thr Gln Met 1 5 <210> 117 <211> 9 <212> PRT <213> Enterococcus hirae <400> 117 Gln Gln Met Ala Leu Leu Ala Gly Met 1 5 <210> 118 <211> 9 <212> PRT <213> Enterococcus hirae <400> 118 Arg Leu Ile Lys Arg Ser Asn Ala Ile 1 5 <210> 119 <211> 9 <212> PRT <213> Enterococcus hirae <400> 119 Asn Pro Ser Gln Ala Met Ile Glu Phe 1 5 <210> 120 <211> 9 <212> PRT <213> Enterococcus hirae <400> 120 Phe Ala Asn Ala Ser Thr Glu Tyr Met 1 5 <210> 121 <211> 9 <212> PRT <213> Enterococcus hirae <400> 121 Glu Ala Glu Ala Gly Gly Ser Ala Phe 1 5 <210> 122 <211> 9 <212> PRT <213> Enterococcus hirae <400> 122 Met Ala Ala Leu Ala Ala Ser Ala Gly 1 5 <210> 123 <211> 9 <212> PRT <213> Enterococcus hirae <400> 123 Phe Ala Ala Ala Leu Ser Ser Val Gly 1 5 <210> 124 <211> 9 <212> PRT <213> Enterococcus hirae <400> 124 Leu Ala Ala Ser Ala Gly Pro Val Leu 1 5 <210> 125 <211> 9 <212> PRT <213> Enterococcus hirae <400> 125 Ala Ala Val Lys Trp Glu Ser Ala Phe 1 5 <210> 126 <211> 9 <212> PRT <213> Enterococcus hirae <400> 126 Ser Lys Ala Asp Ile Val Asn Thr Leu 1 5 <210> 127 <211> 9 <212> PRT <213> Enterococcus hirae <400> 127 Ile Lys Asn Gly Ser Ser Ser Ala Leu 1 5 <210> 128 <211> 9 <212> PRT <213> Enterococcus hirae <400> 128 Asn Lys Leu Asn Asn Asn Gln Ala Leu 1 5 <210> 129 <211> 9 <212> PRT <213> Enterococcus hirae <400> 129 Val Glu Ala Tyr Phe Asn His Thr Leu 1 5 <210> 130 <211> 9 <212> PRT <213> Enterococcus hirae <400> 130 Thr Glu Val Arg Leu Arg Asp Ser Leu 1 5 <210> 131 <211> 9 <212> PRT <213> Enterococcus hirae <400> 131 Ser Glu Leu Glu Gln Gly Ala Gln Leu 1 5 <210> 132 <211> 9 <212> PRT <213> Enterococcus hirae <400> 132 Thr Glu Val Arg Leu Arg Asp Ser Leu 1 5 <210> 133 <211> 9 <212> PRT <213> Enterococcus hirae <400> 133 Ala Glu Ala Ala Gly Gln Leu Gly Ile 1 5 <210> 134 <211> 9 <212> PRT <213> Enterococcus hirae <400> 134 Lys Gly Leu Gly Asn Ile Phe Lys Trp 1 5 <210> 135 <211> 9 <212> PRT <213> Enterococcus hirae <400> 135 Ile Ala Asn Gly Val Lys Gly Leu Trp 1 5 <210> 136 <211> 9 <212> PRT <213> Enterococcus hirae <400> 136 Lys Ala Gly Asn Ile Asp Ser Lys Trp 1 5 <210> 137 <211> 9 <212> PRT <213> Enterococcus hirae <400> 137 Lys Ser Asn Pro Ser Gln Ala Met Ile 1 5 <210> 138 <211> 9 <212> PRT <213> Enterococcus hirae <400> 138 Arg Ser Phe Ser Ala Ser Leu Gln Leu 1 5 <210> 139 <211> 9 <212> PRT <213> Enterococcus hirae <400> 139 Arg Ala Ala Asn Ala Ser Asp Val Phe 1 5 <210> 140 <211> 9 <212> PRT <213> Enterococcus hirae <400> 140 Ser Thr Ala Gly Val Glu Ala Tyr Phe 1 5 <210> 141 <211> 9 <212> PRT <213> Enterococcus hirae <400> 141 Leu Ser Asn Pro Ile Thr Ala Ile Leu 1 5 <210> 142 <211> 9 <212> PRT <213> Enterococcus hirae <400> 142 Leu Ser Asn Ser Lys Leu Ala Lys Phe 1 5 <210> 143 <211> 9 <212> PRT <213> Enterococcus hirae <400> 143 Phe Ala Asn Ala Ser Thr Glu Tyr Met 1 5 <210> 144 <211> 9 <212> PRT <213> Enterococcus hirae <400> 144 Phe Lys Ser Asn Pro Ser Gln Ala Met 1 5 <210> 145 <211> 9 <212> PRT <213> Enterococcus hirae <400> 145 Leu Ala Ala Ser Ala Gly Pro Val Leu 1 5 <210> 146 <211> 9 <212> PRT <213> Enterococcus hirae <400> 146 Glu Ala Ser Lys Ala Ser Gly Ser Leu 1 5 <210> 147 <211> 9 <212> PRT <213> Enterococcus hirae <400> 147 Val Ala Ile Thr Phe Gly Gly Pro Leu 1 5 <210> 148 <211> 9 <212> PRT <213> Enterococcus hirae <400> 148 Ser Ala Ile Ser Ala Ala Lys Pro Met 1 5 <210> 149 <211> 9 <212> PRT <213> Enterococcus hirae <400> 149 Glu Ala Phe Asn Glu Asn Thr Ala Leu 1 5 <210> 150 <211> 9 <212> PRT <213> Enterococcus hirae <400> 150 Ser Ala Asn Asn Ala Gly Arg Glu Leu 1 5 <210> 151 <211> 9 <212> PRT <213> Enterococcus hirae <400> 151 Ala Ala Gly Lys Ser Gly Thr Val Leu 1 5 <210> 152 <211> 9 <212> PRT <213> Enterococcus hirae <400> 152 Lys Ala Ala Lys Ser Thr Glu Glu Leu 1 5 <210> 153 <211> 9 <212> PRT <213> Enterococcus hirae <400> 153 Phe Ala Ser Val Val Ile Asn Pro Ile 1 5 <210> 154 <211> 9 <212> PRT <213> Enterococcus hirae <400> 154 Phe Ala Ala Thr Gly Ile Arg Ser Ile 1 5 <210> 155 <211> 9 <212> PRT <213> Enterococcus hirae <400> 155 Arg Ala Ala Asn Ala Ser Asp Val Phe 1 5 <210> 156 <211> 9 <212> PRT <213> Enterococcus hirae <400> 156 Ala Ser Ile Asp Gln Gln Met Ala Leu 1 5 <210> 157 <211> 9 <212> PRT <213> Enterococcus hirae <400> 157 Ala Ala Lys Pro Met Ile Glu Ala Leu 1 5 <210> 158 <211> 9 <212> PRT <213> Enterococcus hirae <400> 158 Asn Ala Lys Gln Lys Gly Ala Glu Leu 1 5 <210> 159 <211> 9 <212> PRT <213> Enterococcus hirae <400> 159 Thr Ala Val Asn Ala Ile Met Ala Ile 1 5 <210> 160 <211> 9 <212> PRT <213> Enterococcus hirae <400> 160 Ser Ala Asp Pro Lys Thr Gln Glu Phe 1 5 <210> 161 <211> 9 <212> PRT <213> Enterococcus hirae <400> 161 Asn Ala Ser Asp Ile Pro Ser Asn Leu 1 5 <210> 162 <211> 9 <212> PRT <213> Enterococcus hirae <400> 162 Ser Ala Asp Thr Ala Ala Thr Ser Leu 1 5 <210> 163 <211> 9 <212> PRT <213> Enterococcus hirae <400> 163 Phe Ala Ser Ala Asp Pro Lys Thr Gln 1 5 <210> 164 <211> 9 <212> PRT <213> Enterococcus hirae <400> 164 Glu Ala Glu Ala Gly Gly Ser Ala Phe 1 5 <210> 165 <211> 9 <212> PRT <213> Enterococcus hirae <400> 165 Phe Val Ser Lys Tyr Lys Ser Asn Leu 1 5 <210> 166 <211> 9 <212> PRT <213> Enterococcus hirae <400> 166 Ala Ala Val Lys Trp Glu Ser Ala Phe 1 5 <210> 167 <211> 9 <212> PRT <213> Enterococcus hirae <400> 167 Ile Ala Ser Leu Thr Gly Ala Met Leu 1 5 <210> 168 <211> 9 <212> PRT <213> Enterococcus hirae <400> 168 Ser Ala Ala Gly Lys Ser Gly Thr Val 1 5 <210> 169 <211> 9 <212> PRT <213> Enterococcus hirae <400> 169 Phe Gly Gly Pro Leu Val Ala Ala Leu 1 5 <210> 170 <211> 9 <212> PRT <213> Enterococcus hirae <400> 170 Ile Lys Asn Gly Ser Ser Ser Ala Leu 1 5 <210> 171 <211> 9 <212> PRT <213> Enterococcus hirae <400> 171 Ser Ala Asp Pro Lys Thr Gln Glu Phe 1 5 <210> 172 <211> 9 <212> PRT <213> Enterococcus hirae <400> 172 Met Val Asp Ser Asn Gly Lys Val Ile 1 5 <210> 173 <211> 9 <212> PRT <213> Enterococcus hirae <400> 173 Ser Ala Asp Thr Ala Ala Thr Ser Leu 1 5 <210> 174 <211> 9 <212> PRT <213> Enterococcus hirae <400> 174 Leu Lys Asp Thr Ile Val Gly Leu Phe 1 5 <210> 175 <211> 9 <212> PRT <213> Enterococcus hirae <400> 175 Ala Arg Phe Ala Asn Ile Thr Gln Met 1 5 <210> 176 <211> 9 <212> PRT <213> Enterococcus hirae <400> 176 Ala Arg Phe Ala Asn Ile Thr Gln Met 1 5 <210> 177 <211> 9 <212> PRT <213> Enterococcus hirae <400> 177 Phe Ala Ala Thr Gly Ile Arg Ser Ile 1 5 <210> 178 <211> 9 <212> PRT <213> Enterococcus hirae <400> 178 Phe Ala Ser Val Val Ile Asn Pro Ile 1 5 <210> 179 <211> 9 <212> PRT <213> Enterococcus hirae <400> 179 Phe Val Glu Ala Gly Val Asn Lys Leu 1 5 <210> 180 <211> 9 <212> PRT <213> Enterococcus hirae <400> 180 Phe Ala Asn Ala Ser Thr Glu Tyr Met 1 5 <210> 181 <211> 9 <212> PRT <213> Enterococcus hirae <400> 181 Val Val Met Asp Thr Gly Gln Val Val 1 5 <210> 182 <211> 9 <212> PRT <213> Enterococcus hirae <400> 182 Lys Val Phe Gly Lys Met Thr Ser Val 1 5 <210> 183 <211> 9 <212> PRT <213> Enterococcus hirae <400> 183 Ala Tyr Phe Asn His Thr Leu Asp Leu 1 5 <210> 184 <211> 9 <212> PRT <213> Enterococcus hirae <400> 184 Ser Tyr Val Asn Asn Gly Ala Ser Ile 1 5 <210> 185 <211> 9 <212> PRT <213> Enterococcus hirae <400> 185 Val Tyr Thr Asp Tyr Ser Asn Gln Leu 1 5 <210> 186 <211> 9 <212> PRT <213> Enterococcus hirae <400> 186 Phe Phe Arg Ser Phe Ser Ala Ser Leu 1 5 <210> 187 <211> 9 <212> PRT <213> Enterococcus hirae <400> 187 Arg Ser Phe Ser Ala Ser Leu Gln Leu 1 5 <210> 188 <211> 9 <212> PRT <213> human <400> 188 Lys Leu Gln Lys Phe Ala Ser Thr Val 1 5 <210> 189 <211> 9 <212> PRT <213> mouse <400> 189 Gly Ser Leu Ala Arg Phe Arg Asn Ile 1 5 <210> 190 <211> 9 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> mutated peptide <400> 190 Gly Ser Phe Ala Arg Phe Arg Asn Ile 1 5 <210> 191 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 191 actgcagccg taaaatggga 20 <210> 192 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 192 tccgtatcgt ttgccagctt 20 <210> 193 <211> 92 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 193 caataaaaaa tcagacctaa gactgatgac aaaaagagca aattttgata aaatagtatt 60 agaattaaat taaaaaggga ggccaaatat ag 92 <210> 194 <211> 100 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 194 gatcctatat ttggcctccc tttttaattt aattctaata ctattttatc aaaatttgct 60 ctttttgtca tcagtcttag gtctgatttt ttattgcatg 100 <210> 195 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 195 tccggatcca tggcacaaag taaaacagtc aaagcg 36 <210> 196 <211> 66 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 196 caggaattct tacttgtcgt catcgtcttt gtagtcacgt agtaaactat cacgtaatcg 60 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Claims (32)

  1. 항신생물성 약물과 조합되는, 암을 치료하는 데 사용하기 위한 적어도 하나의 자연적으로 발생된 또는 조작된 박테리아 균주를 포함하는 박테리아 조성물이며, 여기서 상기 적어도 하나의 박테리아 균주는 서열식별번호(SEQ ID No:) 1의 단백질, 또는 서열식별번호 13, 14, 53 내지 188 및 209로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 에피토프를 포함하는 적어도 9개, 바람직하게는 적어도 20개의 아미노산의 그의 단편을 발현하며, 단 상기 적어도 하나의 박테리아 균주는 2013년 11월 7일에 번호 I-4815 하에 CNCM에 기탁된 엔테로코쿠스 히라에(Enterococcus hirae) 균주 13144와 상이한 것인 박테리아 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 적어도 하나의 박테리아 균주가 서열식별번호 1의 단백질과 적어도 80%, 바람직하게는 적어도 90% 및 더욱 바람직하게는 적어도 95%의 동일성을 갖는 단백질을 코딩하는 프로파지 게놈을 포함하는 것인 박테리아 조성물.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 조성물이 서열식별번호 2의 프로파지와 적어도 80%, 및 바람직하게는 적어도 95%의 동일성을 갖는 프로파지 게놈을 보유하는 적어도 하나의 균주를 포함하고, 이에 따라 상기 프로파지에 의해 코딩된 파지는 생체내에서 조성물의 다른 균주 및/또는 그를 필요로 하는 대상체의 장 미생물총의 공생 박테리아를 감염시킬 수 있는 것인 박테리아 조성물.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물이
    (i) 2017년 8월 31일에 번호 I-5224 하에 CNCM에 기탁된 엔테로코쿠스 히라에 균주 IGR7,
    (ii) 2017년 11월 27일에 번호 I-5261 하에 CNCM에 기탁된 엔테로코쿠스 히라에 균주 IGR11,
    (iii) 서열식별번호 1의 단백질로부터의 적어도 20개, 바람직하게는 적어도 30개 및 더욱 바람직하게는 적어도 40개 뉴클레오티드의 단편과 적어도 65%, 바람직하게는 적어도 80% 및 더욱 바람직하게는 적어도 95%의 동일성을 갖는 단백질을 발현하는 임의의 다른 박테리아 균주, 및
    (iv) (i) 내지 (iii)에서 언급된 균주로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 2개의 균주 및 엔테로코쿠스 히라에 균주 CNCM I-4815의 혼합물, 바람직하게는 균주 I-4815 및 (i)에서 언급된 균주의 혼합물
    로 이루어진 군으로부터 선택되는 박테리아를 포함하는 것인 박테리아 조성물.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물이 2017년 11월 27일에 번호 I-5260 하에 CNCM에 기탁된 엔테로코쿠스 히라에 균주 IGR4를 추가로 포함하는 것인 박테리아 조성물.
  6. 시험관내에서 박테리아 균주 내로 서열식별번호 1의 단백질, 또는 적어도 서열식별번호 13 및 14의 펩티드를 포함하는 그의 단편을 코딩하는 뉴클레오티드 서열, 또는 서열식별번호 53 내지 187로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 에피토프를 포함하는 적어도 9개, 바람직하게는 적어도 20개의 아미노산의 펩티드를 코딩하는 서열, 또는 서열식별번호 209의 적어도 하나의 에피토프를 포함하는 적어도 9개, 바람직하게는 적어도 20개의 아미노산의 펩티드를 코딩하는 서열을 도입하는 단계를 포함하는, 박테리아 균주의 면역원성을 증가시키는 방법.
  7. 제6항에 있어서, 시험관내에서 상기 균주의 박테리아를 서열식별번호 1의 단백질과 적어도 80%, 바람직하게는 적어도 90% 및 더욱 바람직하게는 적어도 95%의 동일성을 갖는 단백질을 코딩하는 박테리오파지로 감염시키는 단계를 포함하는 방법.
  8. 제7항에 있어서, 상기 박테리오파지가 서열식별번호 2의 뉴클레오티드 서열, 또는 그와 적어도 90% 또는 적어도 95%의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 게놈을 갖는 것인 방법.
  9. 암을 치료하는 데 사용하기 위한, 제6항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따른 방법에 의해 수득된 조작된 박테리아 균주를 포함하는 박테리아 조성물.
  10. 제9항에 있어서, 상기 박테리아 균주가 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli), 엔테로코쿠스 갈리나룸(Enterococcus gallinarum), 엔테로코쿠스 파에칼리스(Enterococcus faecalis) 및 엔테로코쿠스 히라에로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 박테리아 조성물.
  11. 제9항 또는 제10항에 있어서, HLA-A*0201 환자에서 암을 치료하는 데 사용하기 위한 박테리아 조성물.
  12. 암을 치료하는 데 사용하기 위한, 엔테로코쿠스 히라에 CNCM I-4815를 포함하는 박테리아 조성물 및 제1항 내지 제5항 및 제9항 내지 제11항 중 어느 한 항의 박테리아 조성물로 이루어진 군으로부터 선택되는 박테리아 조성물이며, 여기서 상기 박테리아 조성물은 조성물의 적어도 일부 박테리아에 존재하는 프로파지에 의해 코딩된 파지의 용균 주기를 일으킬 수 있는 항신생물성 약물과 조합하여 사용되는 것인 박테리아 조성물.
  13. 제12항에 있어서, 상기 박테리아 조성물이 CDK4/6 억제제와 조합하여 사용되는 것인 박테리아 조성물.
  14. 제12항에 있어서, 상기 박테리아 조성물이 면역 체크포인트 차단제와 조합하여 사용되는 것인 박테리아 조성물.
  15. 항암 백신으로서 사용하기 위한, 서열식별번호 1의 단백질로부터의 적어도 9개의 연속 아미노산의 서열, 또는 서열식별번호 209의 서열을 포함하는 폴리펩티드, 또는 그를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 면역원성 조성물.
  16. 제15항에 있어서, 서열식별번호 1의 단백질로부터의 적어도 9개의 연속 아미노산의 서열이 서열식별번호 53-187로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 면역원성 조성물.
  17. 제15항 또는 제16항에 있어서, HLA-A*0201 환자에서 항암 백신으로서 사용하기 위한, 서열식별번호 63, 서열식별번호 188 및 서열식별번호 209로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열을 포함하는 펩티드, 또는 그를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 면역원성 조성물.
  18. 생체외에서 제1항 내지 제5항 및 제9항 내지 제12항 중 어느 한 항에 따른 박테리아 조성물, 또는 제15항 내지 제17항 중 어느 한 항에 따른 면역원성 조성물로 펄싱된 항원 제시 세포 (APC)를 포함하는 세포 조성물.
  19. MHC 분자가 서열식별번호 53-188 및 서열식별번호 209로 이루어진 군으로부터 선택되는 에피토프에 결합되는 것을 특징으로 하는, 서열식별번호 1의 단백질에 대하여 높은 친화성을 갖는 T 세포를 단리시키기 위한 MHC 다량체.
  20. 제19항에 있어서, 서열식별번호 63, 서열식별번호 188 또는 서열식별번호 209의 또 다른 서열을 포함하는 항원성 펩티드가 로딩된 HLA-A*0201 다량체인 MHC 다량체.
  21. 암을 치료하는 데 사용하기 위한 박테리오파지 조성물이며, 여기서 상기 박테리오파지는 서열식별번호 1의 단백질과 적어도 80%, 바람직하게는 적어도 90% 및 더욱 바람직하게는 적어도 95%의 동일성을 갖는 단백질을 발현하는 것인 박테리오파지 조성물.
  22. 제21항에 있어서, 상기 박테리오파지가 서열식별번호 2의 뉴클레오티드 서열, 또는 그와 적어도 90% 또는 적어도 95%의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 게놈을 갖는 것인 박테리오파지 조성물.
  23. 암을 치료하는 데 사용하기 위한, 제15항 내지 제17항 중 어느 한 항의 면역원성 조성물, 또는 제18항의 세포 조성물, 또는 제19항 또는 제20항의 MHC 다량체로 단리된 T 세포, 또는 제21항 또는 제22항의 박테리오파지 조성물이며, 여기서 상기 조성물은 면역 체크포인트를 차단하는 약물과 조합하여 투여되는 것인, 면역원성 조성물, 또는 세포 조성물, 또는 T 세포, 또는 박테리오파지 조성물.
  24. 쌍을 이루는 대응 정상 조직에서 발현되는 수준보다 우수한 GPD1L의 mRNA 수준을 발현하는 종양을 치료하는 데 사용하기 위한, 제1항 내지 제5항 및 제9항 내지 제12항 중 어느 한 항의 박테리아 조성물, 또는 제15항 내지 제17항 중 어느 한 항의 면역원성 조성물, 또는 제18항의 세포 조성물, 또는 제19항 또는 제20항의 MHC 다량체로 단리된 T 세포, 또는 제21항 또는 제22항의 박테리오파지 조성물.
  25. 서열식별번호 1의 단백질을 포함하는 파지의 용균 주기를 일으키는 약물 후보의 능력에 대해 평가하기 위해 균주 CNCM I-4815, 또는 서열식별번호 2의 프로파지와 적어도 80% 및 바람직하게는 적어도 90% 또는 95%의 동일성을 갖는 프로파지 게놈을 보유하는 임의의 다른 박테리아 균주로부터의 박테리아를 사용하는 단계를 포함하는, 항신생물성 약물을 확인하기 위한 스크리닝 방법.
  26. 암을 앓는 환자가 화학요법 또는 면역 체크포인트 차단에 의한 치료에 대하여 양호한 반응자가 될 가능성이 있는지 여부를 결정하는 방법이며, 상기 환자로부터의 생물학적 샘플 중에 서열식별번호 1의 단백질과 적어도 80%의 동일성을 갖는 서열의 존재에 대해 평가하는 단계를 포함하고, 여기서 상기 서열이 샘플 중에 존재한다면, 환자는 치료에 대하여 반응할 가능성이 있는 것인 방법.
  27. 제27항에 있어서,
    (i) 상기 환자로부터의 대변 샘플을 호기성 조건하에, 엔테로코쿠스 콜로니가 단리될 수 있도록 하는 허용 배지 중에서 배양하는 단계,
    (ii) 서열식별번호 1의 단편에 대해 특이적인 한 쌍의 프라이머를 이용하여 수개의 배양가능한 단리된 콜로니에서 PCR을 수행하는 단계, 및
    (iii) 증폭된 단편을 검출하는 단계를 포함하는 방법.
  28. 환자가 화학요법 또는 면역 체크포인트 차단에 의한 치료에 대하여 양호한 반응자가 될 가능성이 있는지 여부를 결정하는 방법이며, 진단시 및/또는 상기 치료 동안 제19항 또는 제20항의 MHC 다량체를 사용하여 서열식별번호 1의 단백질에 대해 특이적인 순환 CCR9+ CXCR3+ CD8+ T 세포 수준을 측정하는 단계를 포함하고, 여기서 상기 수준이 미리 결정된 임계치를 초과한다면, 환자는 치료에 대하여 반응할 가능성이 있는 것인 방법.
  29. 제28항에 있어서, 환자가 HLA-A*0201이고, MHC 다량체가 제20항에 따른 것인 방법.
  30. 제26항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 종양 중 GPD1L mRNA 수준 또는 GPD1L 단백질 수준을 평가하는 단계를 추가로 포함하고, 여기서 상기 수준이 미리 결정된 임계치를 초과한다면, 환자는 치료에 대하여 반응할 가능성이 있는 것인 방법.
  31. 종양을 앓는 환자가 면역 체크포인트 차단에 의한 치료에 대하여 양호한 반응자가 될 가능성이 있는지 여부를 결정하는 방법이며, 종양 중 GPD1L mRNA 수준 또는 GPD1L 단백질 수준을 평가하는 단계를 포함하고, 여기서 상기 수준이 미리 결정된 임계치를 초과한다면, 환자는 치료에 대하여 반응할 가능성이 있고, 여기서 환자가 화학요법 또는 면역 체크포인트 차단에 의한 치료에 대하여 양호한 반응자가 될 가능성이 있는 것으로 확인되지 않는다면, 제1항 내지 제5항 및 제9항 내지 제12항 중 어느 한 항에 따른 박테리아 조성물, 또는 제15항 내지 제17항 중 어느 한 항에 따른 면역원성 조성물을 환자에게 투여하여 화학요법 또는 면역 체크포인트 차단에 의한 치료에 대한 남성/여성 환자의 반응을 증가시키는 것인 방법.
  32. 제26항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 환자가 화학요법 또는 면역 체크포인트 차단에 의한 치료에 대하여 양호한 반응자가 될 가능성이 있는 것으로 확인되지 않는다면, 제1항 내지 제5항 및 제9항 내지 제12항 중 어느 한 항에 따른 박테리아 조성물, 또는 제15항 내지 제17항 중 어느 한 항에 따른 면역원성 조성물을 환자에게 투여하여 화학요법 또는 면역 체크포인트 차단에 의한 치료에 대한 남성/여성 환자의 반응을 증가시키는 것인 방법.
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