KR20200105711A - 생물학적 샘플에서 분석물 및/또는 단백질을 측정하기 위한 방법 - Google Patents
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Abstract
본 개시는 생물학적 샘플 중의 단독의 또는 총 단백질과 조합된 분석물을 측정하기 위한 방법에 관한 것이다. 더욱 특히, 본 개시는 하나 이상의 비색 시약을 단독으로 또는 단백질 침전 시약과 조합하여 사용하여 분석물 및/또는 총 단백질을 측정하기 위한 방법에 관한 것이다.
Description
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2018년 1월 9일자로 출원된 미국 특허 가출원 제 62/615,242호의 우선권의 이익을 주장하며, 이는 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
분야
본 개시는 일반적으로 생물학적 샘플에서 분석물 및/또는 총 단백질을 측정하기 위한 방법에 관한 것이다. 더욱 특히, 본 개시는 하나 이상의 비색 시약을 단독으로 또는 단백질 침전 시약과 조합하여 사용하여 분석물 및/또는 총 단백질을 측정하기 위한 방법에 관한 것이다.
배경
여러 건강 상태를 검진하기 위해 종종 적혈구 또는 백혈구, 칼슘 이온, 칼륨 이온, 염화물 이온, 나트륨 이온, 글루코스, 락테이트, 크레아티닌, 크레아틴, 우레아, 요산, 에탄올, 알부민, 알칼리 포스파타제, 콜레스테롤, 피루베이트, β-하이드록시부티레이트, 알라닌 아미노트랜스퍼라제, 아스파르테이트 아미노트랜스퍼라제, 세틸콜린에스테라제 등과 같은 하나 이상의 분석물의 양에 대한 생물학적 샘플을 분석해야할 필요가 있다. 특정 분석물(들)을 측정하는 것에 더하여, 샘플 중에 존재하는 총 단백질의 양을 측정하는 것이 또한 도움이 될 수 있다. 예를 들어, 총 단백질 측정은 신장 질환 또는 급성 신장 손상의 진단에 도움이 될 수 있다. 생물학적 샘플에서 특정 분석물(들) 및 총 단백질의 농도 분석은 전형적으로 분석을 위해 샘플을 실험실에 보내야 한다. 이는 증가된 샘플 취급, 실험실 결과의 긴 처리 시간, 특수 배송 요건 및 증가된 저장 시간을 발생시키며, 이는 결국 샘플에서 박테리아 오염 및/또는 박테리아 과성장, 주요 단백질 수준 변화, 캐스트 및 세포 분해, 결정의 용해 또는 형성, 샘플의 pH 변화, 샘플의 악취 증가, 및 샘플에 대한 다른 유해한 효과로 이어질 수 있다.
개요
따라서, 본 발명자들은 생물학적 및 다른 샘플 중의 분석물 농도, 총 단백질 함량, 또는 이의 조합을 측정할 수 있는, 효율적이고 정확하며 비용 효과적인 현장 진료 검정의 필요성을 확인하였다.
본 개시의 한 양태는 샘플 중의 분석물 또는 총 단백질의 농도를 측정하는 방법을 제공한다. 방법은 샘플을 비색 시약과 접촉시켜 처리된 샘플을 수득하는 단계를 포함한다. 방법은 개구를 포함하는 카메라를 처리된 샘플에 포커싱하는 단계, 샘플로부터 소정의 광량을 수집하기에 충분한 기간 동안 개구를 개방하는 단계, 및 개구가 개방되는 기간을 측정하는 단계를 추가로 포함한다. 그 후, 개구가 개방되는 기간은 샘플 중의 분석물 또는 총 단백질의 농도와 상호연관된다. 특정 구현예에서, 이 방법은 분석물의 농도를 측정한다. 특정 구현예에서, 이 방법은 총 단백질의 농도를 측정한다.
본 개시의 샘플 중의 분석물 또는 총 단백질의 농도를 측정하는 방법의 또 다른 양태에서, 방법은 샘플을 비색 시약과 접촉시켜 처리된 샘플을 수득하는 단계를 포함한다. 방법은 개구를 포함하는 카메라를 처리된 샘플에 포커싱하는 단계; 소정의 기간 동안 개구를 개방하는 단계로서, 개구의 크기가 샘플로부터의 소정의 광량을 수집하기에 충분한, 단계; 및 개구의 크기를 측정하는 단계를 추가로 포함한다. 그 후, 개구의 크기를 샘플 중의 분석물 또는 총 단백질의 농도와 상호연관시킨다. 특정 구현예에서, 이 방법은 분석물의 농도를 측정한다. 특정 구현예에서, 이 방법은 총 단백질의 농도를 측정한다.
본 개시의 한 양태는 샘플 중의 총 단백질의 농도를 측정하는 방법을 제공한다. 방법은 샘플을 단백질 침전 시약과 접촉시켜 단백질 침전물을 포함하는 처리된 샘플을 수득하는 단계를 포함한다. 방법은 처리된 샘플의 이미지를 카메라에 의해 생성하는 단계, 및 이미지에서 단백질 침전물과 상호연관되는 픽셀의 수를 측정하는 단계를 추가로 포함한다. 그 후, 픽셀의 수를 표준 곡선과 상호연관시켜 샘플 중의 총 단백질의 농도를 수득한다.
본 개시의 또 다른 양태는 샘플 중의 분석물 또는 총 단백질의 농도를 측정하는 방법을 제공한다. 방법은 샘플을 비색 시약 및 단백질 침전 시약과 접촉시켜 단백질 침전물을 포함하는 처리된 샘플을 수득하는 단계를 포함한다. 방법은 개구를 포함하는 카메라를 처리된 샘플에 포커싱하는 단계; 처리된 샘플로부터 소정의 광량을 수집하기에 충분한 기간 동안 개구를 개방하는 단계; 개구가 개방되는 기간을 측정하는 단계; 및 개구가 개방되는 기간을 샘플 중의 분석물의 농도와 상호연관시키는 단계에 의해, 처리된 샘플 중의 분석물의 농도를 결정하는 단계를 포함한다. 방법은 처리된 샘플의 이미지를 카메라에 의해 생성하는 단계; 이미지에서 단백질 침전물과 상호연관되는 픽셀의 수를 측정하는 단계; 및 픽셀의 수를 표준 곡선과 상호연관시켜 샘플 중의 총 단백질의 농도를 수득하는 단계에 의해, 총 단백질의 농도를 결정하는 단계를 추가로 포함한다.
본 개시의 샘플 중의 분석물 및 총 단백질의 농도를 측정하는 방법의 또 다른 양태에서, 방법은 샘플을 비색 시약 및 단백질 침전 시약과 접촉시켜 단백질 침전물을 포함하는 처리된 샘플을 수득하는 단계를 포함한다. 방법은 개구를 포함하는 카메라를 처리된 샘플에 포커싱하는 단계; 소정의 기간 동안 개구를 개방하는 단계로서, 개구의 크기는 샘플로부터 소정의 광량을 수집하기에 충분한, 단계; 개구의 크기를 측정하는 단계; 및 개구의 크기를 샘플 중의 분석물 농도와 상호연관시키는 단계에 의해, 처리된 샘플 중의 분석물의 농도를 결정하는 단계를 추가로 포함한다. 방법은 처리된 샘플의 이미지를 카메라에 의해 생성하는 단계; 이미지에서 단백질 침전물과 상호연관되는 픽셀의 수를 측정하는 단계; 및 픽셀의 수를 표준 곡선과 상호연관시켜 샘플 중의 총 단백질의 농도를 수득하는 단계에 의해, 총 단백질의 농도를 결정하는 단계를 추가로 포함한다.
본 개시의 샘플 중의 분석물 및 총 단백질의 농도를 측정하는 방법의 또 다른 양태에서, 방법은 샘플을 비색 시약 및 단백질 침전 시약과 접촉시켜 단백질 침전물을 포함하는 처리된 샘플을 수득하는 단계를 포함한다. 방법은 처리된 샘플에 카메라를 포커싱하는 단계; 개구를 개방하여 샘플로부터 광량을 수집하는 단계; 수집된 광량의 강도를 측정하는 단계; 및 수집된 광의 강도를 샘플 중의 분석물의 농도와 상호연관시키는 단계에 의해, 처리된 샘플 중의 분석물의 농도를 결정하는 단계를 추가로 포함한다. 방법은 처리된 샘플의 이미지를 카메라에 의해 생성하는 단계; 이미지에서 단백질 침전물과 상호연관되는 픽셀의 수를 측정하는 단계; 및 픽셀의 수를 표준 곡선과 상호연관시켜 샘플 중의 총 단백질의 농도를 수득하는 단계에 의해, 총 단백질의 농도를 결정하는 단계를 추가로 포함한다.
본 개시의 방법의 특정 구현예에서, 분석물은 칼슘 이온, 칼륨 이온, 염화물 이온, 나트륨 이온, 글루코스, 락테이트, 크레아티닌, 크레아틴, 우레아, 요산, 에탄올, 알부민, 알칼리 포스파타제, 콜레스테롤, 피루베이트, β-하이드록시부티레이트, 알라닌 아미노트랜스퍼라제, 아스파르테이트 아미노트랜스퍼라제 및 세틸콜린에스테라제로부터 선택될 수 있다. 본 개시의 방법의 특정 구현예에서, 분석물은 크레아티닌, 글루코스, 알부민 또는 알칼리 포스파타제일 수 있다.
본 개시의 방법의 특정 구현예에서, 비색 시약은 2,4,6-트리니트로페놀 및 염기일 수 있다. 본 개시의 방법의 특정 구현예에서, 비색 시약은 메틸 3,5-디니트로벤조에이트, 3,5-디니트로벤조산 또는 3,5-디니트로벤조일클로라이드 및 염기 또는 염기성 완충제이다. 본 개시의 방법의 특정 구현예에서, 비색 시약은 구리 이온, 하이드로퍼옥사이드 및 산화성 염료를 포함하는 시약계이다. 본 개시의 방법의 특정 구현예에서, 비색 시약은 3,5-디니트로벤조일클로라이드를 포함한다. 본 개시의 방법의 특정 구현예에서, 비색 시약은 글루코스 옥시다제, 헥소키나제, 알칼리 구리 타르타레이트, 알칼리 페리시아니드 및 홀스래디쉬 퍼옥시다제 중 하나 이상일 수 있다. 본 개시의 방법의 특정 구현예에서, 비색 시약은 브로모크레솔 그린일 수 있다. 본 개시의 방법의 특정 구현예에서, 비색 시약은 5-브로모-4-클로로-3-인돌릴 포스페이트(BCIP) 및 니트로 블루 테트라졸륨(NBT)을 포함하는 시약계일 수 있다. 본 개시의 방법의 특정 구현예에서, 비색 시약은 피로카테콜 바이올렛, 벤제토늄 클로라이드 또는 피로갈롤 레드를 포함할 수 있다. 본 개시의 방법의 특정 구현예에서, 비색 시약은 피로카테콜 바이올렛을 포함할 수 있다.
본 개시의 방법의 특정 구현예에서, 비색 시약은 면역 검정에 적합한 하나 이상의 시약을 포함할 수 있다. 예를 들어, 비색 시약은 효소 결합 면역흡착 분석(ELISA) 또는 효소 다중 면역검정 기술(EIMT)에 적합한 하나 이상의 분석물-특이적 항체 및/또는 효소를 포함할 수 있다.
본 개시의 방법의 특정 구현예에서, 단백질 침전 시약은 하나 이상의 수-혼화성 용매(예컨대, 알콜, 예를 들어, 이소프로판올, 메탄올 또는 에탄올, 케톤, 예를 들어, 아세톤, 메틸 에틸 케톤, 메틸 이소부틸 케톤, 또는 사이클로헥사논, 테트라하이드로푸란)일 수 있거나; 단백질 침전 시약은 염(예컨대, 암모늄 설페이트 또는 다가 금속 이온을 포함하는 염)이거나; 단백질 침전 시약은 트리클로로아세트산, 또는 트리클로로아세트산 및 아세톤이거나; 단백질 침전 시약은 중합체(예를 들어, 비-이온성 친수성 중합체, 예컨대, 폴리에틸렌 글리콜 및 덱스트란)이다. 본 개시의 방법의 특정 구현예에서, 단백질 침전 시약은 수성 계면활성제일 수 있다. 본 개시의 방법의 특정 구현예에서, 수성 계면활성제는 벤즈알코늄 클로라이드 또는 벤제토늄 클로라이드일 수 있다.
본 개시의 방법의 특정 구현예에서, 샘플은 소변 샘플일 수 있다.
특정 구현예에서, 본 개시의 방법은 처리된 샘플로부터 수집된 소정의 광량을 사용하여 처리된 샘플의 이미지를 생성하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 본 개시의 방법의 특정 구현예에서, 처리된 샘플은 처리된 샘플을 포함하는 슬라이드로부터 이미지화될 수 있다. 본 개시의 방법의 특정 구현예에서, 이미지는 흑백 이미지일 수 있다.
특정 구현예에서, 본 개시의 방법은 처리된 샘플의 이미지를 사용자 인터페이스에 디스플레이하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 본 개시의 방법의 구현예에서, 소정의 광량은 처리된 샘플의 이미지로부터 단백질 침전물의 양을 측정하기에 충분할 수 있다. 본 개시의 방법의 특정 구현예에서, 소정의 광량은 일정할 수 있다. 본 개시의 방법의 특정 구현예에서, 소정의 광량은 카메라의 사용자에 의해 선택될 수 있다. 본 개시의 방법의 특정 구현예에서, 카메라는 필터를 포함할 수 있다. 본 개시의 방법의 특정 구현예에서, 필터는 비색 시약과 샘플 사이의 반응으로 발생하는 색상의 파장 범위에 대응하는 파장을 통과시키도록 구성될 수 있다. 본 개시의 방법의 특정 구현예에서, 카메라는 자동 노출 기능을 포함할 수 있고, 개구가 개방된 기간을 측정하는 단계는 자동 노출 기능을 사용하여 기간을 결정하는 단계를 포함한다. 본 개시의 방법의 특정 구현예에서, 결정은 개구 크기 및 소정의 광량 중 적어도 하나에 기초하여 이루어질 수 있다.
본 개시의 방법의 특정 구현예에서, 카메라는 센서를 포함할 수 있고, 샘플로부터 소정의 광량을 수집하기에 충분한 기간 동안 개구를 개방하는 단계는 개구를 개방하는 단계; 카메라에 의해 수집된 광량을 센서에 의해 검출하는 단계; 카메라에 의해 수집된 광량이 소정의 광량과 실질적으로 동일한지의 여부를 결정하는 단계; 및 소정의 광량이 카메라에 의해 수집되었음을 결정한 후 개구를 폐쇄하는 단계를 포함한다.
본 개시의 방법의 특정 구현예에서, 카메라는 센서를 포함할 수 있고, 샘플로부터 소정의 광량을 수집하기에 충분한 기간 동안 개구를 개방하는 단계는 일정 기간 동안 개구를 개방하여 처리된 샘플로부터 광량을 수집하는 단계; 개구를 폐쇄하는 단계; 처리된 샘플로부터 수집된 광량을 센서에 의해 측정하는 단계; 처리된 샘플로부터 수집된 광량이 소정의 광량과 실질적으로 동등한지의 여부를 결정하는 단계; 샘플로부터 수집된 광량이 소정의 광량과 실질적으로 동등하지 않은 경우 제2 기간 동안 개구를 개방하는 단계로서, 제2 기간은 제1 기간과 상이한, 단계; 개구가 개방되는 제2 기간을 소정의 광량과 상호연관시켜 샘플 중 분석물 또는 총 단백질의 농도를 수득하는 단계를 포함한다.
본 개시의 방법의 특정 구현예에서, 카메라는 자동 노출 기능을 포함할 수 있고, 개구 크기를 측정하는 것이 자동 노출 기능을 사용하여 개구 크기를 결정하는 것을 포함한다. 본 개시의 방법의 특정 구현예에서, 결정은 기간 및 소정의 광량 중 적어도 하나에 기초하여 이루어질 수 있다.
본 개시의 방법의 특정 구현예에서, 카메라는 센서를 포함할 수 있고, 일정 기간 동안 개구를 개방하는 단계는 개구를 개방하여 샘플로부터 광량을 수집하는 단계로서, 개구는 제1 개구 크기를 포함하는 단계; 개구를 폐쇄하는 단계; 처리된 샘플로부터 수집된 광량을 센서에 의해 측정하는 단계; 샘플로부터 수집된 광량이 소정의 광량과 실질적으로 동등한지의 여부를 결정하는 단계; 샘플로부터 수용된 광량이 소정의 광량과 실질적으로 동등하지 않은 경우 제2 기간 동안 개구를 개방하는 단계로서, 개구는 제2 개구 크기를 가지며, 제2 개구 크기는 제1 개구 크기와 상이한, 단계; 및 개구의 제2 개구 크기를 소정의 광량과 상호연관시켜 샘플 중의 분석물 또는 총 단백질의 농도를 수득하는 단계를 포함한다. 특정 구현예에서, 본 개시의 방법은 적어도 샘플 중 크레아티닌의 농도 및 샘플 중 총 단백질의 농도에 기초하여 샘플의 단백질:크레아티닌 비를 결정하는 것을 추가로 포함할 수 있다.
특정 구현예에서, 본 개시의 방법은 적어도 샘플 중의 분석물 및/또는 총 단백질의 농도에 기초하여 건강을 결정하는 것을 추가로 포함할 수 있다.
전술한 개요는 단지 예시적인 것이며, 어떤 식으로든 제한하려는 것은 아니다. 상기 기술된 예시된 양태, 구현예 및 특징 이외에, 추가의 양태, 구현예 및 특징은 도면 및 하기 상세한 설명을 참조하여 명백해질 것이다.
도 1은 본 개시의 일 구현예에 따른 방법의 흐름도이다.
도 2는 본 개시의 구현예에 따르면 개구를 개방하여 샘플로부터 광을 수집하는 카메라의 부분 개략도이다.
도 3a는 본 개시의 방법에 따라 제조된 6개의 샘플 분취량의 사진이다. 샘플 제조에 사용된 비색 기술은 샘플 분취량 위에 표시된다. 도면에서, Pro = 총 단백질 및 Cre = 크레아티닌.
도 3b는 본 개시의 방법에 따른 카메라에 의해 생성된 일련의 실험 이미지이다. 각 이미지에 상응하는 셔터 속도는 이미지 위에 디스플레이된다.
도 4a는 본 개시의 방법에 따른 일련의 제조된 샘플의 사진을 도시한다.
도 4b는 본 개시의 방법에 따라 측정된 셔터 속도와 실험 샘플 중 크레아티닌의 양 사이의 관계를 보여주는 상관관계 곡선이다.
도 5는 본 개시의 일 구현예에 따른 방법의 흐름도이다.
도 6a는 본 개시의 방법에 따라 카메라에 의해 생성된 일련의 실험 이미지이며 제조된 샘플에서 침전된 단백질의 양을 보여준다.
도 6b는 본 개시의 방법에 따라 측정된 단백질 침전물과 실험 샘플 중의 단백질의 양 사이의 관계를 보여주는 상관관계 곡선이다.
도 7은 본 개시의 구현예에 따른 카메라 및 제조된 샘플을 보여주는 도면이다.
도 8a는 샘플로부터 소정의 광량을 수집하는데 필요한 기간 및 실험 샘플 중의 글루코스의 양 사이의 관계를 보여주는 상관관계 곡선이다.
도 8b는 샘플로부터 소정의 광량을 수집하는데 필요한 기간 및 실험 샘플 중의 알부민의 양 사이의 관계를 보여주는 상관관계 곡선이다.
도 8c는 샘플로부터 소정의 광량을 수집하는데 필요한 기간 및 실험 샘플 중의 알칼리 포스파타제의 양 사이의 관계를 보여주는 상관관계 곡선이다.
도 9는 본 개시의 방법에 따라 처리되는 상이한 크레아티닌 농도를 갖는 샘플의 이미지를 제공한다.
도 10은 본 개시의 방법에 따라 측정된 셔터 속도와 실험 샘플 중의 단백질의 양 사이의 관계를 보여주는 그래프이다.
도 11a는 본 개시의 구현예에 따라 다변수 이차식을 사용하여 샘플 중의 단백질의 양을 결정하는 도면이다. 도 11b는 샘플 중의 단백질의 양과 다수의 장치에서 슬라이딩 윈도우 표준 편차 이미지 특징 사이의 관계의 플롯이다. 도 11c는 샘플 중의 단백질의 양과 다수의 장치에서 평균 윤곽 면적 이미지 특징 사이의 관계의 플롯이다. 도 11d는 단일 장치에서 2개 이미지 특징을 사용하는 본 개시의 구현예에 따른 다변수 이차 회귀의 선형 플롯이다.
도 12a는 본 개시의 구현예에 따라 인공 신경 회로망을 사용하여 샘플 중의 단백질의 양을 결정하는 도면이다. 도 12b는 인공 신경 회로망의 구조의 도면이다. x1은 이미지 특징 1이며, x2는 이미지 특징 2이며, xn은 이미지 특징 n이다. 도 12c는 샘플 중의 단백질의 양과 다수의 장치에서 히스토그램 슬라이딩 윈도우 표준 편차 이미지 특징 사이의 관계의 플롯이다. 도 12d는 다수의 장치에서 이미지 특징을 이용하는 본 개시의 구현예에 따른 신경 회로망 훈련의 선형 플롯이다.
도 2는 본 개시의 구현예에 따르면 개구를 개방하여 샘플로부터 광을 수집하는 카메라의 부분 개략도이다.
도 3a는 본 개시의 방법에 따라 제조된 6개의 샘플 분취량의 사진이다. 샘플 제조에 사용된 비색 기술은 샘플 분취량 위에 표시된다. 도면에서, Pro = 총 단백질 및 Cre = 크레아티닌.
도 3b는 본 개시의 방법에 따른 카메라에 의해 생성된 일련의 실험 이미지이다. 각 이미지에 상응하는 셔터 속도는 이미지 위에 디스플레이된다.
도 4a는 본 개시의 방법에 따른 일련의 제조된 샘플의 사진을 도시한다.
도 4b는 본 개시의 방법에 따라 측정된 셔터 속도와 실험 샘플 중 크레아티닌의 양 사이의 관계를 보여주는 상관관계 곡선이다.
도 5는 본 개시의 일 구현예에 따른 방법의 흐름도이다.
도 6a는 본 개시의 방법에 따라 카메라에 의해 생성된 일련의 실험 이미지이며 제조된 샘플에서 침전된 단백질의 양을 보여준다.
도 6b는 본 개시의 방법에 따라 측정된 단백질 침전물과 실험 샘플 중의 단백질의 양 사이의 관계를 보여주는 상관관계 곡선이다.
도 7은 본 개시의 구현예에 따른 카메라 및 제조된 샘플을 보여주는 도면이다.
도 8a는 샘플로부터 소정의 광량을 수집하는데 필요한 기간 및 실험 샘플 중의 글루코스의 양 사이의 관계를 보여주는 상관관계 곡선이다.
도 8b는 샘플로부터 소정의 광량을 수집하는데 필요한 기간 및 실험 샘플 중의 알부민의 양 사이의 관계를 보여주는 상관관계 곡선이다.
도 8c는 샘플로부터 소정의 광량을 수집하는데 필요한 기간 및 실험 샘플 중의 알칼리 포스파타제의 양 사이의 관계를 보여주는 상관관계 곡선이다.
도 9는 본 개시의 방법에 따라 처리되는 상이한 크레아티닌 농도를 갖는 샘플의 이미지를 제공한다.
도 10은 본 개시의 방법에 따라 측정된 셔터 속도와 실험 샘플 중의 단백질의 양 사이의 관계를 보여주는 그래프이다.
도 11a는 본 개시의 구현예에 따라 다변수 이차식을 사용하여 샘플 중의 단백질의 양을 결정하는 도면이다. 도 11b는 샘플 중의 단백질의 양과 다수의 장치에서 슬라이딩 윈도우 표준 편차 이미지 특징 사이의 관계의 플롯이다. 도 11c는 샘플 중의 단백질의 양과 다수의 장치에서 평균 윤곽 면적 이미지 특징 사이의 관계의 플롯이다. 도 11d는 단일 장치에서 2개 이미지 특징을 사용하는 본 개시의 구현예에 따른 다변수 이차 회귀의 선형 플롯이다.
도 12a는 본 개시의 구현예에 따라 인공 신경 회로망을 사용하여 샘플 중의 단백질의 양을 결정하는 도면이다. 도 12b는 인공 신경 회로망의 구조의 도면이다. x1은 이미지 특징 1이며, x2는 이미지 특징 2이며, xn은 이미지 특징 n이다. 도 12c는 샘플 중의 단백질의 양과 다수의 장치에서 히스토그램 슬라이딩 윈도우 표준 편차 이미지 특징 사이의 관계의 플롯이다. 도 12d는 다수의 장치에서 이미지 특징을 이용하는 본 개시의 구현예에 따른 신경 회로망 훈련의 선형 플롯이다.
설명
일반적으로, 개시된 물질, 방법 및 장치는 생물학적 샘플 중의 분석물 및/또는 총 단백질의 농도를 측정하는데 있어서 개선을 제공한다. 구체적으로, 본 개시의 특정 구현예에서, 생물학적 샘플 중 분석물 및/또는 총 단백질은 다중 시험 방법, 광범위한 샘플 취급, 운송 및 저장을 제거하는 단일 샘플, 단일 이미지 및/또는 단일 검정을 사용하여 측정된다. 클리닉에서 측정이 적시에 수행될 수 있어 전통적인 방법에 비해 샘플 변화가 더 적을 수 있다. 예를 들어, 전통적인 방법에 따라 분석된 샘플과 비교하여, 본 개시의 방법에 따라 분석된 샘플은 더 적은 박테리아 오염 및/또는 박테리아 과성장, 주요 단백질 수준에서의 최소 또는 비 변화, 캐스트 및 세포의 덜한 분해, 결정의 덜한 분해 또는 형성, 및 pH, 외형 및/또는 냄새의 최소 또는 비 변화를 가질 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "생물학적 샘플"은 비제한적으로, 전혈, 혈장, 혈청, 척수액 예컨대, 뇌-척수액; 림프액, 복부 유체(복수), 피부의 외부 절편, 호흡기, 장 및 비뇨생식 관, 눈물, 타액, 소변, 혈액 세포, 종양, 기관, 조직, 및 시험관내 세포 배양 성분의 샘플을 포함하는 인간 또는 동물로부터 조직 또는 유체의 샘플을 일반적으로 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같은, 용어 "총 단백질"은 임의의 크기의 단백질 단편을 포함하는 샘플 중의 모든 단백질을 지칭한다.
본 개시의 방법의 다양한 양태에서, 샘플 부피는 약 10 μL 내지 약 500 μL; 예를 들어, 약 10 μL 내지 약 300 μL, 또는 약 10 μL 내지 약 200 μL, 또는 약 10 μL 내지 약 100 μL, 또는 약 50 μL 내지 약 300 μL, 또는 약 50 μL 내지 약 200 μL, 또는 약 100 μL 내지 약 500 μL, 또는 약 100 μL 내지 약 300 μL, 또는 약 100 μL 내지 약 200 μL이다. 일부 양태에서, 본 개시의 방법은 분석물, 총 단백질 및 이의 조합물을 측정하기 위한 전통적인 방법보다 적은 샘플 부피를 필요로 한다.
본 개시의 방법은 생물학적 샘플을 분석물을 결정하기 위한 비색 시약 및/또는 총 단백질을 결정하기 위한 비색 시약 또는 단백질 침전 시약과 접촉시킴으로써 처리된 샘플을 생성하는 단계를 포함한다. 샘플 중의 분석물 및/또는 총 단백질의 농도에 따라, 비색 시약(들)과 분석물 및/또는 총 단백질 사이의 반응은 용액으로 하여금 다양한 정도로 색을 변화시킬 수 있게 한다. 카메라는 카메라의 개구를 통해 샘플로부터 광량을 수집함으로써 처리된 샘플의 이미지를 촬영하는데 사용될 수 있으며, 여기에서 수집되는 광량은 샘플의 색상을 나타낸다.
특정 구현예에서, 카메라 (또는 카메라와 관련된 센서)는 샘플의 색상과 무관하게 소정의 광량을 수집한다 수집되는 소정의 광량은 예를 들어, 1, 2, 3회 이상의 실증적 실험에 의해 실험적으로 결정되어 샘플 중의 분석물 또는 총 단백질의 농도 또는 농도들을 교정하는 소정의 광량에 대한 값 또는 값들을 수득한다. 소정의 광량은 카메라가 허용할 수 있는 최대의 광량보다 많아서는 안되거나 최소의 광량보다 적어서는 안된다.
카메라에 의해 수집된 광량은 노출 시간, 개구 크기 및 카메라의 다른 특징에 의존적일 수 있다. 예를 들어, CMOS 광 센서, 및 10x 배율과 0.28의 개구수를 갖는 대물 렌즈를 갖는 PL-D725MU-T USB 3.0 카메라(PixelLINK)를 사용하여 얻은 1 mg/mL 농도의 알부민 함유 샘플로부터의 소정의 광량은 약 170 ms 내지 약 180 ms의 노출 시간으로 수집될 수 있다. 이러한 시간은 다른 광 수집 장치의 센서에서 광을 수집하기 위해 카메라의 개구가 개방되는 시간의 양을 나타낸다. 따라서, 소정의 광량은 광량(예를 들어, 광자)을 직접적으로 나타내는 값 대신에 카메라의 노출 시간 또는 셔터 속도에 의해 규정될 수 있다.
또 다른 예에서, CMOS 광 센서, 및 10x 배율과 0.28의 개구수를 갖는 대물 렌즈를 갖는 PL-D725MU-T USB 3.0 카메라(PixelLINK)를 사용하여 얻은 1 mM 농도의 글루코스 함유 샘플로부터의 소정의 광량은 약 130 ms 내지 약 140 ms의 노출 시간으로 수집될 수 있다. 또 다른 예에서, 상술한 PL-D725MU-T USB 3.0 카메라를 사용하여 얻은 1 μg/mL 농도의 알칼리 포스파타제를 함유하는 샘플에 대한 소정의 광량은 약 135 ms 내지 약 145 ms 범위의 노출 시간으로 수집될 수 있다.
각각의 샘플로부터 소정(즉, 개별)의 광량을 수집함으로써, 카메라는 샘플의 색상에 상관없이 실질적으로 동일한 노출 또는 밝기를 갖는 이미지 또는 복수의 이미지를 생성할 수 있다. 따라서, 처리된 샘플의 각각의 이미지에서 소정의 노출 수준을 달성하기 위해 카메라 설정(예를 들어, 셔터 속도 및/또는 개구 크기)이 이미지마다 변경될 수 있다. 이들 카메라 설정은 처리된 샘플의 광학 특성(예를 들어, 처리된 샘플의 비색 강도)을 나타내도록 측정될 수 있다. 예를 들어, 개구 크기가 일정하게 유지되면, 원하는 노출 수준에 도달하는데 요구되는 셔터 속도는 처리된 샘플의 비색 강도에 따라 변할 수 있다. 이어서, 셔터 속도를 측정하고 샘플 중의 분석물 및/또는 총 단백질의 농도와 상호연관시킬 수 있다. 반대로, 셔터 속도가 일정하게 유지되면, 소정의 노출 수준에 도달하는데 요구되는 개구 크기가 측정될 수 있고, 샘플 중의 분석물 및/또는 총 단백질의 농도와 상호연관될 수 있다. 소정의 노출 수준을 갖는 이미지를 생성함으로써, 카메라는 처리된 샘플의 비색 강도에 상관없이 샘플의 임상적으로 유용한 이미지를 생성하도록 구성될 수 있다. 특정 구현예에서, 방법은 분석물의 농도 및/또는 총 단백질의 농도를 측정하는데 사용될 수 있으며, 여기서 분석물의 농도는 제1 비색 시약으로 결정되고, 총 단백질의 농도는 제2 비색 시약으로 결정될 수 있다.
따라서, 본 개시의 방법은 샘플을 비색 시약과 접촉시켜 처리된 샘플을 수득하는 단계; 개구를 포함하는 카메라를 처리된 샘플에 포커싱시키는 단계; 샘플로부터 소정의 광량을 수집하는데 충분한 기간 동안 개구를 개방하는 단계; 기간을 측정하는 단계; 기간을 샘플 중의 분석물 또는 총 단백질의 농도와 상호연관시키는 단계를 포함한다. 본 개시의 또 다른 방법은 샘플을 비색 시약과 접촉시켜 처리된 샘플을 수득하는 단계; 개구를 포함하는 카메라를 처리된 샘플에 포커싱하는 단계; 개구를 소정 기간 동안 개방하는 단계로서, 개구 크기는 소정 기간 동안 샘플로부터의 소정의 광량을 수집하는데 충분한, 단계; 개구 크기를 측정하는 단계; 및 개구의 크기와 샘플 중 분석물 또는 총 단백질의 농도를 상호연관시키는 단계를 포함한다. 개구의 크기 또는 기간을 분석물 또는 총 단백질의 농도와 상호연관시키는 것은 기간 또는 개구 크기를 표준 곡선과 비교함으로써 달성될 수 있다. 표준 곡선은 샘플 중 분석물 또는 총 단백질의 일련의 농도에 대한 카메라의 개구 크기 또는 시간의 양을 나타낼 수 있다.
샘플의 색 강도의 결과로서 분석물 또는 단백질의 농도를 측정하는 것 이외에 또는 이에 더하여, 개시의 방법은 샘플을 단백질 침전 시약과 접촉시켜 단백질 침전물을 포함하는 처리된 샘플을 수득함에 의한 샘플 중의 총 단백질의 농도의 측정을 포함한다. 단백질 침전물은 단백질 침전 시약과의 반응 후 볼 수 있다. 총 단백질 농도는 처리된 샘플의 이미지를 카메라에 의해 생성하고 이러한 이미지를 분석함으로써 측정될 수 있다. 이미지 분석은 예를 들어, 단백질 침전물(예를 들어, 단백질 침전물로 구성되는 이미지의 면적 또는 단백질 침전물 소구체)과 상호연관되는 픽셀의 수를 측정하는 것을 포함할 수 있다. 그 후, 픽셀의 수를 픽셀과 단백질 농도 사이의 상호관계를 반영하는 표준 곡선과 비교하여 샘플 중의 단백질 단백질의 농도를 수득할 수 있다. 이러한 테스트 방법은 전통적인 테스트보다 더욱 신속하게 수행될 수 있으며/거나, 동적 범위가 더 넓고/거나, 분석 비용을 감소시키고/거나 더 적은 시약 및 재료를 사용할 수 있다. 본 개시의 일부 구현예에서, 총 단백질은 또 다른 분석물의 측정 없이 카메라 이미지를 사용하여 측정된다.
본 개시의 방법은 비제한적으로 생물학적 샘플 중에 존재할 수 있는 하기 화합물 중 하나 이상을 포함하는 많은 분석물의 농도를 측정하는데 사용될 수 있다: 칼슘 이온, 칼륨 이온, 염화물 이온, 나트륨 이온, 글루코스, 락테이트, 크레아티닌, 크레아틴, 우레아, 요산, 에탄올, 알부민, 알칼리 포스파타제, 콜레스테롤, 피루베이트, β-하이드록시부티레이트, 알라닌 아미노트랜스퍼라제, 아스파르테이트 아미노트랜스퍼라제 및 세틸콜린에스테라제. 일부 구현예에서, 분석물은 크레아티닌, 글루코스, 알부민 및 알칼리 포스파타제 중 하나 이상으로부터 선택될 수 있다.
상기 논의된 바와 같이, 본 개시의 방법은 도 1의 흐름도에서 방법(100)의 단계(101)로 표시되는 바와 같이 샘플을 비색 시약과 접촉시켜 처리된 샘플을 수득하는 단계를 포함한다. 비색 시약은 요망되는 적용분야 및 측정될 분석물의 유형에 기초하여 선택될 수 있다. 예를 들어, 크레아티닌을 측정하기 위한 비색 시약은 비제한적으로, (1) 2,4,6-트리니트로페놀 및 염기성 완충제의 염기, (2) 메틸 3,5-디니트로벤조에이트, 3,5-디니트로벤조산 또는 3,5-디니트로벤조일클로라이드 및 염기 또는 염기성 완충제, 및 (3) 구리 이온, 하이드로퍼옥사이드 및 산화성 염료를 포함하는 시약계 중 하나 이상을 포함한다. 예를 들어, 글루코스를 측정하기 위한 비색 시약은 비제한적으로, 글루코스 옥시다제, 헥소키나제, 알칼리 구리 타르타레이트, 알칼리 페리시아니드 및 홀스래디쉬 퍼옥시다제 중 하나 이상을 포함한다. 예를 들어, 알부민을 측정하기 위한 비색 시약은 비제한적으로 브로모크레솔 그린을 포함한다. 예를 들어, 알칼리 포스파타제를 측정하기 위한 비색 시약은 비제한적으로, 5-브로모-4-클로로-3-인돌릴 포스페이트(BCIP) 및 니트로 블루 테트라졸륨(NBT) 시스템을 포함한다. 예를 들어, 총 단백질을 측정하기 위한 비색 시약은 비제한적으로, 피로카테콜 바이올렛, 벤제토늄 클로라이드 및 피로갈롤 레드를 포함한다. 본 개시의 방법의 특정 구현예에서, 비색 시약은 면역 검정에 적합한 하나 이상의 시약을 포함할 수 있다. 예를 들어, 비색 시약은 효소 결합 면역흡착 분석(ELISA) 또는 효소 다중 면역검정 기술(EIMT)에 적합한 하나 이상의 분석물-특이적 항체 및/또는 효소를 포함할 수 있다.
본 개시의 특정 구현예에서, 열량 측정 시약은 2개 이상의 성분(예컨대, 2,4,6-트리니트로페놀 이외에 예컨대, 염기 또는 염기성 완충액)을 포함할 수 있다. 특정 구현예에서 이러한 성분은 샘플에 별도로 및 순차적으로 첨가될 수 있다. 예를 들어, 샘플은 먼저 염기와 접촉되고 이어서 2,4,6-트리니트로페놀과 접촉될 수 있다. 특정 구현예에서, 비색 시약의 성분은 샘플과 동시에 접촉될 수 있다. 예를 들어, 3,5-디니트로벤조산 또는 3,5-디니트로벤조일클로라이드는 샘플과 접촉되기 전에 염기성 완충액에 용해될 수 있다.
본 개시의 방법에 사용되는 비색 시약은 요망되는 적용 및 측정할 분석물 유형에 기초하여 특정 부피로 첨가될 수 있다. 예를 들어, 비색 시약 부피는 약 1 μL 내지 약 500 μL; 예를 들어, 약 1 μL 내지 약 300 μL, 또는 약 1 μL 내지 약 200 μL, 또는 약 1 μL 내지 약 100 μL, 또는 약 1 μL 내지 약 50 μL, 또는 약 50 μL 내지 약 300 μL, 또는 약 50 μL 내지 약 200 μL, 또는 약 100 μL 내지 약 500 μL, 또는 약 100 μL 내지 약 300 μL, 또는 약 100 μL 내지 약 200 μL이다.
본 개시의 방법에 사용하기 위한 단백질 침전 시약은 원하는 적용분야에 기초하여 및 단백질 농도에 대해 또한 분석되는 샘플에서 측정될 분석물의 유형에 기초하여 선택될 수 있다(예를 들어, 단백질 침전제는 이 시약과 분석물과 비색 시약의 반응 사이의 간섭을 줄이기 위해 선택될 수 있다). 예를 들어, 단백질 침전 시약은 비제한적으로 수-혼화성 용매(예컨대, 알콜, 예를 들어 이소프로판올, 메탄올 또는 에탄올, 케톤, 예를 들어, 아세톤, 메틸 에틸 케톤, 메틸 이소부틸 케톤, 또는 사이클로헥사논, 테트라하이드로푸란), 염(예를 들어, 암모늄 설페이트 또는 다가 금속 이온을 포함하는 염), 트리클로로아세트산(단독 또는 아세톤과의 조합), 중합체(예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜 및 덱스트란과 같은 비-이온성 친수성 중합체), 수성 계면활성제, 벤즈알코늄 클로라이드, 벤제토늄 클로라이드 및 이들의 임의의 조합물 중 하나 이상을 포함한다.
단백질 침전 시약은 요망되는 적용분야에 기초하여 특정 부피로 첨가될 수 있다. 예를 들어, 본 개시의 방법의 특정 구현예에서, 단백질 침전 시약의 부피는 약 1 μL 내지 약 500 μL; 예를 들어, 약 1 μL 내지 약 300 μL, 또는 약 1 μL 내지 약 200 μL, 또는 약 1 μL 내지 약 100 μL, 또는 약 1 μL 내지 약 50 μL, 또는 약 50 μL 내지 약 300 μL, 또는 약 50 μL 내지 약 200 μL, 또는 약 100 μL 내지 약 500 μL, 또는 약 100 μL 내지 약 300 μL, 또는 약 100 μL 내지 약 200 μL이다.
전술한 바와 같이, 본 개시의 방법은 도 1에 도시된 방법(100)의 단계(102)에 의해 표시되는 바와 같이 개구를 포함하는 카메라를 처리된 샘플에 포커싱하는 단계를 포함한다. 카메라는 개방될 때 (즉, 샘플의 이미지를 촬영하기 위해) 처리된 샘플로부터 광을 수집할 수 있는 개구를 갖는 임의의 장치일 수 있다. 카메라는 다양한 이미징 시스템을 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, 카메라는 카트리지 또는 슬라이드에 현탁된 생물학적 샘플을 이미지화하도록 구성된 벤치탑 이미징 플랫폼을 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, 카메라는 소변 또는 혈액 침강 분석기, 예를 들어 SEDIVUETM DXTM 소변 침강 분석기(IDEXX Laboratories, Inc., Westbrook, ME)와 관련될 수 있다. 이러한 구현예에서, 처리된 샘플은 시스템의 입구에 배치된 카트리지 내로 피펫팅되거나 그렇지 않으면 직접적으로 분배될 수 있다. 다른 구현예에서, 처리된 샘플은 처리된 샘플을 포함하는 슬라이드로부터 이미지화될 수 있고, 방법은 처리된 샘플을 포함하는 슬라이드, 카트리지 또는 다른 용기를 이미징 시스템의 입구에 삽입하는 것을 포함할 수 있다.
특정 다른 구현예에서, 카메라는 디지털 카메라, 카메라 폰 또는 또 다른 휴대용 장치일 수 있고, 처리된 샘플에 카메라를 포커싱하는 단계는 카메라를 샘플에 향하도록 위치시키는 단계를 포함할 수 있다. 휴대용 장치가 사용되는 경우, 스탠드, 삼각대, 전기자 또는 다른 지지대가 처리된 샘플을 기준으로 특정 위치에 카메라를 배치하여 샘플을 이미지화하도록 (즉, 소정의 광량을 수집하도록) 구성될 수 있다. 이러한 카메라를 포커싱하는 단계는 처리된 샘플이 카메라의 초점 범위 내에 있도록 카메라의 사용자 인터페이스를 통해 초점을 수동으로 제어하는 것을 포함할 수 있다. 추가적으로 또는 대안적으로, 카메라를 포커싱하는 단계는 처리된 샘플에 포커싱하기 위해 카메라의 자동 포커스 기능을 이용하는 단계를 포함할 수 있다. 카메라의 이러한 자동 초점 기능은 센서를 사용하여 처리된 샘플과 카메라 사이의 간격을 검출하고, 처리된 샘플이 카메라의 초점 범위 내에 있도록 카메라의 초점을 조정할 수 있다.
전술한 바와 같이, 본 개시의 방법은 도 1의 방법(100)의 단계(103)에 의해 표시된 바와 같이 샘플로부터 소정의 광량을 수집하기에 충분한 기간 동안 개구를 개방하는 단계를 포함한다. 도 2는 샘플(290)로부터 광(260)을 수용하기 위한 개구(220) 및 광 센서(230)를 특징으로 하는 예시적인 카메라(210)의 단순화된 개략도를 추가로 예시한다. 개구(220)가 개방되면, 샘플(290)로부터의 광(260)은 카메라(210)로 들어가서 광 센서(230)와 접촉할 수 있다. 센서와 접촉하는 광은 샘플(290)의 시각적 특징을 분석하거나, 샘플의 이미지를 생성하거나, 일부 다른 유형의 처리를 수행하는데 사용될 수 있다.
개구(220)는 카메라(210)가 샘플의 색상 또는 광 강도를 결정하거나 제조된 샘플(290)의 이미지를 생성하기 위해 일정 기간 동안 광(260)을 수집할 수 있는 임의의 구멍을 포함할 수 있다. 예를 들어, 개구(220)는 카메라(210)의 셔터를 포함할 수 있으며, 이는 광 센서(230)를 일정 기간(즉, 셔터 속도에 대응하는 시간) 동안 샘플(290)로부터의 광(360)에 노출시킨다. 개구(220)의 크기는 개구가 개방될 때마다 실질적으로 동일하도록 고정될 수 있는데, 예를 들어, 카메라(210)의 제조사에 의해 설정될 수 있다. 예를 들어, 개구(220)수는 약 0.025 내지 약 0.5, 또는 약 0.03 내지 약 0.5, 또는 약 0.025 내지 약 0.25, 또는 약 0.03 내지 약 0.25, 또는 약 0.03 내지 약 0.5, 또는 약 0.05 내지 약 0.25, 또는 약 0.05 내지 약 0.5, 또는 약 0.1 내지 약 0.25, 또는 약 0.1 내지 약 0.5의 범위일 수 있다.
개구 크기가 일정한 본 개시의 구현예에서, 개구(220)를 통해 카메라(210)에 의해 수집된 광(260)량은 주로 개구가 개방되는 기간에 의존적일 수 있다. 대안적 구현예에서, 개구(220)의 크기는 개구를 통해 카메라(210) 내로 더 높은 또는 더 낮은 유속의 광(260)을 허용하도록 조정될 수 있으며, 개구를 개방하는 것은 개구 크기를 선택하거나 결정하는 것을 포함할 수 있다. 개구 크기는 예를 들어, 카메라의 사용자 인터페이스를 통해 카메라(210)의 사용자에 의해 수동으로 선택될 수 있다. 대안적으로, 개구 크기는 카메라의 자동 노출("자동 노출") 기능에 의해 카메라(210)에 의해 결정될 수 있다.
소정의 광량(260)을 수집하기에 충분한 기간 동안 개구(220)를 개방하는 것은 카메라가 샘플의 이미지를 촬영하게 할 수 있다. 방법은 처리된 샘플로부터 수집된 광량, 예컨대 소정의 광량을 사용하여 준비된 샘플(290)의 이미지를 생성하는 단계를 포함할 수 있다. 카메라(210)에 의해 생성된 이미지는 풀-컬러 이미지, 흑백 이미지, 또는 처리된 샘플에서 분석물 및/또는 단백질의 측정에 적합한 임의의 다른 이미지를 포함할 수 있다. 대안적으로, 이미지는 전하-결합 소자(CCD), 액티브 픽셀 센서(APS), 상보성 금속-산화물 반도체(CMOS), Foveon X3 센서 또는 또 다른 센서와 같은 광 센서(230)에 의해 디지털 방식으로 생성될 수 있다. 이러한 구현예에서, 방법은 광 센서(230)상에서 수집된 광(260)을 검출하고/거나 입사 광을 전기 신호로 변환하는 단계를 포함할 수 있다. 일부 예에서, 이러한 광 센서(230)는 입사 광(260)을 검출하고 이를 이미지화되는 준비된 샘플상의 이산 점들을 나타내는 일련의 픽셀로서 기록할 수 있다. 이러한 픽셀은 특정 파장 또는 파장 범위의 광에 선택적으로 민감할 수 있다. 예를 들어, 픽셀은 각각 녹색, 적색 및 청색에 대응하는 파장의 광을 선택적으로 수집하는 픽셀로 세분될 수 있다. 대안적으로, 이러한 픽셀은 센서가 민감한 (즉, 흑백 이미지를 생성하는) 파장 범위의 모든 수집된 광에 민감할 수 있다. 광 센서(230)는 카메라(210) 각각의 픽셀에 의해 수집된 광의 파장 및/또는 양을 측정하고 이를 카메라의 메모리 또는 데이터 저장에서 값의 어레이로서 저장할 수 있다. 특정 예에서, 각각의 픽셀은 수집된 광(260)량, 평균 강도, 밝기, 컬러레이션 또는 픽셀에서 입사 광의 다른 특성에 대응하는 수치 값을 포함할 수 있다. 방법은 처리된 샘플의 이미지를 카메라와 통신하는 사용자 인터페이스 상에 디스플레이하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 추가적으로 또는 대안적으로, 이미지 및/또는 관련 정보는 서버, 휴대폰, 컴퓨터 또는 다른 외부 장치와 같은 원격 컴퓨팅 장치로 전송될 수 있다.
본원에 기술된 바와 같이, 소정의 광량은 소정의 밝기 또는 노출을 갖는 이미지를 생성하기 위해 카메라에 의해 수집된 광량을 나타낸다. 소정의 광량은 카메라의 광 센서에 대한 입사 광의 양, 입사 광을 전기 신호로 변환시킴으로써 생성된 전압, 생성된 이미지의 밝기 또는 광학 특성에 따라 또는 일부 다른 수단에 의해 특정될 수 있다. 카메라(210)에 의해 수집될 소정의 광량(260)은 균일한 노출 및/또는 밝기의 이미지가 개구(220)가 개방될 때마다 생성되도록 일정할 수 있다. 소정의 광(260)량은 카메라 또는 이미징 시스템의 다양한 요소에 의해 영향을 받을 수 있다. 예를 들어, 소정의 광량은 렌즈, 개구, 광 센서 또는 카메라의 다른 요소와 관련될 수 있다. 소정의 광(260)량은 처리된 샘플(290)의 임상적으로 유용한 이미지를 생성하는데 필요한 광량에 기초하여 선택될 수 있다.
단백질 침전물의 양이 측정되는 구현예에서, 소정의 광(260)량은 (예를 들어, 단백질 침전물로 구성된 이미지의 면적 또는 단백질 침전물 소구체에 대한) 단백질 침전물과 상호연관된 픽셀의 수를 계수함으로써 및/또는 프로그램, 알고리즘 또는 일부 다른 수단을 사용하여 이미지를 처리함으로써 처리된 샘플의 이미지로부터 단백질의 침전물의 양을 측정하는데 (예를 들어, 처리된 샘플의 이미지의 육안 검사에 의해) 충분할 수 있다. 또 다른 구현예에서, 소정의 광(260)량은 요망되는 노출 수준, 밝기, 콘트라스트, 또는 처리된 샘플(290)의 이미지의 밝기 히스토그램에 기초하여 카메라(210)에 의해 생성된 이미지의 강도를 기반으로 하여 결정될 수 있다.
소정의 광(260)량은 카메라(210)의 사용자 인터페이스를 통해 카메라(210)의 사용자에 의해 선택될 수 있으며, 방법은 소정의 광량을 입력하는 것을 포함할 수 있다. 소정의 광(260)량은 이미지의 선명도를 보장하고/거나 이미지의 후-처리를 용이하게 하기 위해 사용자에 의해 선택되거나 조정될 수 있다. 추가적으로 또는 대안적으로, 최적의 또는 다르게는 임상적으로 유용한 노출 수준은 카메라(210)의 자동 노출("자동 노출") 기능을 이용하여 결정될 수 있다. 이러한 자동 노출 기능은 카메라가 임상적으로 유용한 이미지를 생성하기 위해 수집해야 하는 광(260)량을 결정하기 위해 카메라(210)의 설정 및/또는 준비된 샘플(290)에 관한 정보를 이용하는 알고리즘을 사용할 수 있다. 예를 들어, 소정의 광(260)량은 준비된 샘플(290)의 평균 밝기, 준비된 샘플의 밝기 히스토그램, 준비된 샘플의 하이라이트 및 로우라이트의 식별 및/또는 균형, 또는 일부 다른 방법에 기초하여 결정될 수 있다.
주어진 샘플에 있어서, 개구(220)를 통하여 카메라(210)에 의해 수집된 광(260)량(즉, 카메라에 의해 생성된 이미지의 노출 수준)은 2개의 카메라 설정에 의해 일반적으로 영향을 받는다: 개구(220)의 크기 및 개구가 개방되는 기간. 처리된 샘플(290)의 광학 특성에 따라, 더 크거나 작은 개구 크기 및/또는 개구(220)의 더 길거나 짧은 개방은 샘플로부터의 소정의 광량을 수집하는데 필요할 수 있다. 예를 들어, 하나의 샘플이 또 다른 샘플보다 어두우면, 이는 더 밟은 샘플과 비교하여 동일한 양의 광(260)을 수집하기 위해 더 큰 개구 크기 및/또는 더 긴 셔터 속도를 필요로 할 것이다.
일 구현예에서, 본 개시의 방법은 도 1의 방법(100)의 단계(104)에 의해 표시된 바와 같이 소정의 광량을 수집하기 위해 개구가 개방되는 기간을 측정하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 카메라의 자동 노출 기능은 처리된 샘플의 이미지를 생성하기 전에 다양한 카메라 설정을 결정하는데 사용될 수 있다. 자동 노출 기능이 최적의 노출 수준을 결정하기 위해 샘플의 광학 특성을 이용할 수 있는 것과 유사한 방식으로, 자동 노출 기능은 또한 소정의 노출 수준을 달성하기 위해 적절한 카메라 설정을 결정하는데 이용될 수 있다. 일부 구현예에서, 자동 노출 기능은 처리된 샘플의 광학 특성을 평가하고 개구를 개방하기 전에 카메라의 적절한 셔터 속도를 결정하기 위해 카메라의 광 센서를 사용한다. 자동 노출 기능은 또한, 개구가 개방되어야 하는 기간을 결정하는데 있어서 소정의 광량 및/또는 개구 크기에 관한 정보를 이용할 수 있다.
본 개시의 또 다른 구현예에서, 카메라는 수집된 광을 실시간 측정하는 센서를 포함할 수 있어 카메라가 소정의 광량이 수집될 때 개구를 폐쇄함으로써 능동적으로 반응할 수 있다. 따라서, 이러한 구현예는 (i) 개구를 개방하는 단계; (ii) 카메라에 의해 수집된 광량을 센서에 의해 검출하는 단계; (iii) 카메라에 의해 수집된 광량이 소정의 광량과 실질적으로 동일한지의 여부를 결정하는 단계; 및 (iv) 소정의 광량이 카메라에 의해 수집되었는지를 결정한 후 개구를 폐쇄하는 단계를 포함할 수 있다. 또한, 센서는 특정 적용분야에 적용가능한 임의의 파장 범위에 민감하거나 선택적으로 민감할 수 있다. 이러한 센서는 개구로 유입되는 광량을 연속적으로 측정할 수 있거나 수집된 광량의 간헐적인 측정을 취하기 위해 개구를 개방한 후 복수의 개별 시점에서 개구를 통해 수집된 광량을 측정할 수 있다. 센서가 소정의 광량이 개구를 통해 수집되었음을 결정하는 경우, 센서는 제어기, 스위치, 기계 구성 요소, 또는 카메라의 또 다른 요소에 의해 개구를 폐쇄하도록 구성될 수 있다.
추가의 또 다른 구현예에서, 개구는 (즉, 복수의 이미지를 생성하기 위해) 여러번 개방될 수 있다. 이는 카메라가 자동 노출 기능이 결여되어 있거나 그렇지 않으면 개구의 제1 개방 동안 소정의 광량을 수집하는데 필요한 개구 크기 또는 기간을 결정할 수 없는 경우 특히 바람직할 수 있다. 특정 구현예에서, 카메라는 이의 개구를 개방하여 샘플의 예비 제1 이미지를 촬영한 후, 제2 또는 후속 이미지에 대한 카메라 설정을 조정하기 위해 제1 이미지에 대한 정보를 이용할 수 있다. 이러한 구현예에서, 개구를 개방하는 단계는 일정 기간 동안 개구를 개방하여 처리된 샘플로부터 광량을 수집하는 단계; 처리된 샘플로부터 수집된 광량을 측정하는 단계; 처리된 샘플로부터 수집된 광량이 소정의 광량과 실질적으로 동일한지의 여부를 결정하는 단계; 샘플로부터 수용된 광량이 소정의 광량과 실질적으로 동일하지 않은 경우 제2 기간 동안 개구를 개방하는 단계로서, 제2 기간은 제1 기간과 상이한 단계; 및 개구가 개방되는 제2 기간을 소정의 광량과 상호연관시켜 샘플 중 분석물 또는 총 단백질의 농도를 수득하는 단계를 포함할 수 있다. 제2 기간은 개구의 제1 개방 동안 샘플로부터 수집된 광량의 분석에 기초하여 결정될 수 있다. 예를 들어, 카메라는 개구가 개방되는 기간과 처리된 샘플로부터 수집된 광량을 상호연관시키는 알고리즘을 이용할 수 있으며, 방법은 제1 기간 및 제1의 수집된 광량을 기반으로 하여 카메라로 하여금 샘플로부터 소정의 광량을 수집하게 하는 제2 기간을 결정하는 것을 추가로 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 카메라는 반복적 접근법을 이용하여 소정의 광량을 수집할 수 있다. 이러한 경우, 개구는 여러번 개방될 수 있으며, 각각의 잇따른 기간은 이전 기간과 상이하다. 개구가 개방되는 기간은 소정 기간만큼 반복적으로 증가되거나 감소될 수 있다(즉, 반복적인 "단계"). 추가적으로 또는 대안적으로, 알고리즘은 개구가 개방되는 기간의 반복적인 변화의 크기 및/또는 방향을 결정하는데 이용될 수 있다. 이는 카메라에 의해 촬영된 연속 이미지가 소정의 광량에 대해 집중될 수 있게 한다.
추가적으로 또는 대안적으로, 카메라는 다양한 노출 수준에서 이미지를 촬영하기 위해 상이한 기간 동안 여러번 개구를 개방할 수 있다. 카메라에 의해 생성된 복수의 이미지는 어떤 이미지가 소정의 광량으로 생성되었는지를 결정하기 위해 후-처리를 겪을 수 있다. 이러한 구현예에서, 개구가 개방되는 기간을 측정하는 단계는 복수의 이미지의 밝기, 색상 또는 또 다른 특성을 측정하는 단계, 및 복수의 이미지로부터 소정의 노출 수준과 가장 밀접하게 유사한 이미지(예를 들어, 소정의 광량의 수집을 통해 생성된 이미지)를 선택하는 단계를 포함할 수 있다. 그 후, 이러한 이미지와 관련된 개구 개방 기간은 셔터 속도와 샘플 중의 분석물 또는 총 단백질의 농도를 상호연관시키는데 이용될 수 있다.
측정 기간은 처리된 샘플 중의 분석물 또는 총 단백질의 농도를 정량화하는데 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 처리 기간은 카메라의 디스플레이 또는 사용자 인터페이스 상에 디스플레이될 수 있다. 다른 구현예에서, 측정된 기간 및/또는 셔터 속도는 컴퓨팅 장치, 메모리, 원격 컴퓨터, 서버 또는 예를 들어, 추가 분석, 처리 또는 상호연관을 위한 또 다른 시스템에 전송될 수 있다.
일부 구현예에서, 본 개시의 방법은 개구가 개방되는 기간을 소정의 광량과 상호연관시켜 샘플 중의 분석물 또는 총 단백질의 농도를 획득하는 것을 추가로 포함한다. 이러한 일 구현예는 도 1의 방법(100)의 단계(105)에 예시되어 있다. 단계 (101)과 관련하여 전술된 바와 같이, 샘플은 비색 시약과 접촉하여 처리된 샘플을 얻을 수 있으며, 이는 샘플에 존재하는 표적 분석물 또는 총 단백질의 농도에 따라 다양한 정도의 컬러레이션을 나타낼 수 있다. 예를 들어, 크레아티닌이 없는 비색 시약을 포함하는 3개의 샘플, 및 비색 시약과 2000 mg/dL의 단백질 및 1000 mg/dL의 크레아티닌을 포함하는 3개의 처리된 샘플을 보여준다. 본 개시의 방법을 사용하여, 처리된 샘플 중의 크레아티닌 또는 총 단백질의 농도는 샘플의 착색, 밝기, 색도, 강도, 불투명도 또는 다른 광학적 특성을 측정함으로써 예를 들어, 처리된 샘플의 이미지를 촬영함으로써 추정될 수 있다.
본 개시의 특정 구현예에서, 생성된 이미지의 광학 특성이 미리 결정되는 경우(예를 들어, 균일한 광량이 각각의 이미지를 생성하기 위해 수집되는 경우), 그러한 이미지를 생성하는 다양한 카메라 설정을 측정하는 것은 사용자로 하여금 샘플 중의 분석물 또는 총 단백질의 농도를 추정하게 할 수 있다. 예를 들어, 동일한 카메라 설정을 사용하여 다양한 컬러레이션의 이미지를 촬영하는 대신(여기에서 이미지의 컬러레이션은 샘플 중의 분석물 또는 총 단백질의 농도를 나타냄), 동일한 이미지가 다양한 샘플에서 촬영되고, 동일한 이미지를 달성하는데 사용된 카메라 설정은 분석물 또는 총 단백질의 농도를 나타낼 수 있다. 한 예에서, 셔터 속도가 측정되는 동안 이미지 노출(즉, 샘플로부터 수집된 광량)은 일정하게 유지될 수 있다. 셔터 속도에 의해 반영되는 바와 같은 개구가 개방되는 기간을 측정하는 것은 처리된 샘플 중의 분석물 또는 총 단백질의 농도를 결정하는데 사용될 수 있다.
도 3b는 도 3a에 도시된 6개 샘플로부터 소정의 광량을 수집함으로써 생성되는 6개 이미지를 보여준다. 도 3a의 샘플을 나타내는 각 이미지는 도 3b의 상응하는 위치에 위치한다(즉, 도 3b의 왼쪽 상단 이미지는 도 3a의 왼쪽 상단 샘플에 해당함, 기타 등등). 도면에 도시된 바와 같이, 카메라에 의해 생성된 6개 이미지는 샘플에서 관찰된 컬러레이션 차이에도 불구하고 실질적으로 동일한 색상, 밝기 및/또는 노출을 나타낸다. 이는 원래의 샘플 색상과 무관하게 동일한 색상 및/또는 노출의 이미지를 생성하기 위해 각 이미지에 대한 상이한 기간(도면에 도시된 바와 같이 568, 436, 252, 782, 1224 및 598 밀리초) 동안 개구를 개방하는 카메라로 인한 것이다.
당업자는 개구가 개방되는 기간이 이미지화될 처리된 샘플 및 카메라의 특성에 따라 변할 것임을 인지할 것이다. 예를 들어, 본 개시의 방법의 특정 구현예에서, 기간은 약 0.1 ms 내지 약 10 초, 예를 들어 약 0.1 ms 내지 약 5 s, 또는 약 0.1 ms 내지 약 1 s, 또는 약 1 ms 내지 약 10 s, 또는 약 1 ms 내지 약 5 s, 또는 약 10 ms 내지 약 10 s, 또는 약 10 ms 내지 약 5 s, 또는 약 100 ms 내지 약 10 s, 또는 약 100 ms 내지 약 1 s의 범위일 수 있다.
도 4a는 0 내지 2000 mg/dL 범위의 공지된 양의 크레아티닌 및 비색 시약을 포함하는 또 다른 일련의 처리된 샘플에 대해 카메라에 의해 생성된 샘플의 이미지를 보여준다. 도 3b의 이미지와 같이, 이들 이미지는 샘플로부터 소정의 광량을 수집하여 실질적으로 동일한 색상 및/또는 노출의 이미지를 생성함으로써 촬영되었다. 이미지에서 명백한 바와 같이, 더 많은 분석물(이 경우, 크레아티닌)을 함유하는 샘플은 더 어두워지며, 따라서 소정의 광량을 수집하기에 더 오랜 기간 동안 개구가 개방되어야 한다. 카메라에 의해 측정된 셔터 속도는 도 4b에 예시된 바와 같이 샘플 중의 크레아티닌의 양과 상호연관될 수 있으며, 이는 샘플 중의 분석물의 양과 카메라가 샘플로부터 소정의 광량을 수집하는 셔터 속도 사이의 관계를 반영하는 표준 곡선을 나타낸다.
일부 구현예에서, 개구가 개방되는 기간을 소정의 광량과 상호연관시키는 것은 회귀 분석을 수행하는 것을 포함할 수 있다. 이러한 구현예에서, 예비 시험은 수행될 수 있으며, 공지된 농도의 분석물과 셔터 속도, 또는 공지된 농도의 총 단백질과 셔터 속도 사이의 실험적 관계가 플롯팅될 수 있다. 회귀선은 두 변수에 관한 회귀 함수를 추정하는데 사용될 수 있어서, 후속 실험 데이터는 회귀 함수에 기초하여 해석될 수 있다. 이러한 구현예에서, 개구가 개방되는 기간을 소정의 광량과 상호연관시켜 샘플 중의 분석물 또는 총 단백질의 농도를 수득하는 것은 회귀 함수를 이용하여 샘플 중의 분석물 또는 총 단백질의 농도를 추정하는 것을 포함할 수 있다.
다른 구현예에서, 컴퓨팅 장치, 제어기, 프로세서, 서버 또는 카메라와 관련된 또 다른 컴퓨팅 유닛의 메모리는 분석물 또는 총 단백질의 농도를 얻기 위해 셔터 속도를 소정의 광량과 관련시키는 데이터를 포함할 수 있다(예를 들어, 저장된 회귀 함수). 이러한 구현예에서, 개구가 개방되는 기간을 소정의 광량과 상호연관시키는 것은 컴퓨팅 장치에 의해 분석물 또는 총 단백질의 농도를 결정하는 것을 포함할 수 있다. 이러한 결정은 분석물의 종, 비색 시약의 종 및/또는 개구가 개방되는 측정된 기간 중 적어도 하나에 기초하여 이루어질 수 있다. 이러한 결정은 또한 단백질 함량, 비색 시약의 종 및 또는 개구가 개방되는 측정된 기간에 기초하여 이루어질 수 있다. 분석물 또는 총 단백질의 농도의 결정 후, 그 양은 카메라와 관련된 디바이스 또는 카메라의 사용자 인터페이스 또는 디스플레이에 디스플레이될 수 있다. 다른 구현예에서, 분석물 또는 총 단백질의 농도는 컴퓨팅 장치, 프로세서, 카메라의 메모리, 컴퓨팅 장치의 메모리, 또는 원격 컴퓨터, 추가의 분석, 처리 또는 진단을 위한 서버 또는 또 다른 시스템에 전송될 수 있다.
도면에 나타낸 방법(100)을 참조하여 상기 설명된 바와 같이, 일부 구현예에서, 카메라 개구의 크기는 일정하게 고정될 수 있으며, 개구 개방은 소정의 광량을 수집하는데 충분한 기간 동안 개구를 개방하는 것을 포함할 수 있다. 그 후, 준비된 샘플 중의 분석물 또는 총 단백질의 농도를 측정하는 것은 소정의 광량을 수집하기 위해 개구가 개방되는 기간을 측정하는 것을 포함할 수 있다. 그 후, 측정된 기간은 소정의 광량과 상호연관되어 샘플 중의 분석물 또는 총 단백질을 농도를 수득할 수 있다.
또 다른 구현예에서, 개구가 개방되는 기간(즉, 셔터 속도)은 일정하게 유지될 수 있다. 이러한 구현예에서, 개구의 크기는 각각의 이미지마다 변할 수 있으며, 개구의 크기는 샘플 중의 분석물 또는 총 단백질의 농도를 결정하기 위해 측정될 수 있다. 예를 들어, 기간은 약 0.1 ms 내지 약 10 초, 예를 들어 약 0.1 ms 내지 약 5 s, 또는 약 0.1 ms 내지 약 1 s, 또는 약 1 ms 내지 약 10 s, 또는 약 1 ms 내지 약 5 s, 또는 약 10 ms 내지 약 10 s, 또는 약 10 ms 내지 약 5 s, 또는 약 100 ms 내지 약 10 s, 또는 약 100 ms 내지 약 1 s의 범위일 수 있다. 이들 구현예에서, 개구수가 예를 들어, 약 0.01 내지 약 0.99, 약 0.055 내지 0.9, 또는 약 0.1 내지 0.5일 경우의 소정의 광량.
도 5는 샘플 중 분석물의 농도 및/또는 총 단백질 농도를 측정하기 위한 이러한 방법(500)의 흐름도를 예시한다.
방법(500)의 단계(501 및 502)는 전술한 바와 같이 방법(100)의 단계(101 및 102)와 유사한 단계를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 샘플을 비색 시약과 접촉시키고(101, 501) 카메라를 포커싱하는 단계(102, 502)는 방법(100)과 실질적으로 동일하게 수행할 수 있다. 방법(500)은 별개의 기간 동안 개구를 개방하는 단계로서, 개구 크기는 샘플 중의 분석물 또는 총 단백질의 농도와 관련이 있는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 예를 들어, 단계(503)는 소정 기간 동안 개구를 개방하는 단계로서, 개구의 크기는 샘플로부터 소정의 광량을 수집하기에 충분한 단계를 포함한다. 그 후, 단계(504)에 나타낸 바와 같이 개구가 개방되는 기간 동안 카메라가 소정의 광량을 수집하게 하는 개구 크기가 측정될 수 있다.
최적의 개구 크기(즉, 카메라가 소정 기간에 소정의 광량을 수집하게 하는 개구 크기)는 셔터 속도와 관련하여 전술한 바와 같이 자동 노출 기능에 의해 결정될 수 있다. 이러한 구현예에서, 일정 기간 동안 개구를 개방하는 것은 개구의 크기가 샘플로부터 소정의 광량을 수집하기에 충분하도록 개구를 개방하기 위해 자동 노출 기능을 사용하는 것을 포함할 수 있다. 따라서, 개구의 크기를 측정하는 단계는 자동 노출 기능을 사용하여 개구의 크기를 결정하는 단계를 포함할 수 있다. 전술한 바와 같이, 이러한 결정은 처리된 샘플의 광학 특성 및/또는 기간 및 소정의 광량 중 적어도 하나에 기초할 수 있다.
추가적으로 또는 대안적으로, 개구 크기 측정과 관련된 방법은 소정의 광량을 수집하기 위해 복수의 이미지를 촬영하는 것을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 카메라는 센서를 포함할 수 있고, 방법은 (i) 개구를 개방하여 샘플로부터 광량을 수집하는 단계로서, 개구는 제1 개구 크기를 포함하는, 단계; (ii) 개구를 폐쇄하는 단계; (iii) 처리된 샘플로부터 수집된 광량을 센서에 의해 측정하는 단계; (iv) 샘플로부터 수집된 광량이 소정의 광량과 실질적으로 동등한지의 여부를 결정하는 단계; (v) 샘플로부터 수용된 광량이 소정의 광량과 실질적으로 동등하지 않은 경우 제2 기간 동안 개구를 개방하는 단계로서, 개구는 제2 개구 크기를 가지며, 제2 개구 크기는 제1 개구 크기와 상이한, 단계; 및 (vi) 개구의 제2 개구 크기를 샘플 중의 분석물 또는 총 단백질의 농도와 상호연관시키는 단계를 포함할 수 있다. 이러한 접근법은 알고리즘, 반복적 접근법, 셔터 속도와 관련하여 설명된 임의의 방법, 또는 일부 다른 공정을 이용하여 제2 또는 후속 개구 개방을 지향하는 개구의 제1 개구를 이용할 수 있다.
방법(500)은 단계(505)에 나타낸 바와 같이 개구의 크기를 샘플 중의 분석물 또는 총 단백질의 농도와 상호연관시키는 단계를 포함할 수 있다. 개구의 크기를 분석물 또는 총 단백질의 양과 상호연관시키는 단계는 측정된 개구 크기를 표준 곡선과 비교하여 분석물 또는 총 단백질의 양을 추정하는 것을 포함할 수 있다. 이러한 표준 곡선은 공지된 양의 분석물 또는 총 단백질을 함유하는 일련의 샘플을 이미지화시키고, 공지된 농도에 대한 각 샘플의 측정된 개구 크기를 플롯팅하여 생성될 수 있다. 전술된 바와 같이, 회귀선은 두 변수에 관한 회귀 함수를 추정하는데 사용될 수 있어서, 후속 실험 데이터는 예를 들어, 측정된 개구 크기 및 분석물 또는 총 단백질의 농도에 관한 회귀 함수에 기초하여 해석될 수 있다.
일부 구현예에서, 방법(100 및 500)은 샘플 중의 분석물 및 총 단백질 둘 모두의 농도를 결정하는 것을 포함할 수 있다. 샘플 중의 총 단백질의 양은 샘플의 이미지 예를 들어, 광이 분석물의 농노 측정을 위해 카메라에 의해 수집될 때 생성되는 이미지의 분석을 통해 추정될 수 있다. 이러한 공정은 처리된 샘플의 이미지를 카메라에 의해 생성하는 단계(단계 106 및 506); 이미지에서 단백질 침전물과 상호연관되는 픽셀의 수를 측정하는 단계(단계 107 및 507); 및 픽셀 수를 표준 곡선과 상호연관시켜 샘플 중의 총 단백질의 농도를 수득하는 단계(단계 108 및 508)를 포함할 수 있다.
일 구현예에서, 단백질 침전물의 양을 측정하는 단계는 생성된 처리된 샘플의 이미지의 시각적 분석을 카메라에 의해 수행하는 단계를 포함한다. 처리된 샘플의 이미지는 예를 들어, 카메라의 개구가 개방되어 사전에 결정된 광량을 수집하는 경우 방법의 이전 단계 동안 생성될 수 있다. 이미지는 전술한 바와 같이 광을 수집하고 카메라의 광 센서를 사용하여 이를 이미지로서 기록함으로써 생성될 수 있다.
단백질 침전물의 이미지는 샘플 중 단백질의 농도에 따라 이미지에서 다양한 양으로 나타날 수 있는 침전된 단백질의 소구체를 포함할 수 있다. 도 6a는 0 - 1000 mg/dL의 단백질을 함유하는 처리된 샘플이 실험 이미지를 보여준다. 도 6a에서 볼 수 있는 바와 같이, 단백질은 육안으로 볼 수 있으며, 다른 균일한 노출 또는 컬러레이션의 이미지에서 차단으로서 나타날 수 있다. 일부 구현예에서, 도 6a에서 관찰된 이미지와 같은 단백질 침전물의 이미지는 분석물의 농도를 측정하는데 사용된 동일한 이미지일 수 있다(즉, 샘플로부터 소정의 광량을 수집하는 경우 생성된 이미지). 추가적으로 또는 대안적으로, 단백질 정량을 위해 별도의 이미지가 생성될 수 있으며, 상기 방법은 개구를 개방하여 처리된 샘플로부터 제2의 광량을 수집하고/거나 처리된 샘플의 이미지를 생성하는 것을 포함할 수 있다.
방법은 단백질 침전물의 이미지를 처리하는 것을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 단백질 침전물의 이미지는 이미지의 선명도를 높이거나, 콘트라스트를 증가시키거나, 초점을 증가시키거나 단백질의 정량을 용이하게 하기 위해 후-처리를 겪을 수 있다. 예를 들어, 카메라는 제어기, 프로세서, 메모리 또는 다른 구성 요소를 포함하는 컴퓨팅 장치에 연결되거나 이와 통신할 수 있다. 후-처리는 컴퓨팅 장치에 대한 이미지 처리 프로그램을 사용하거나 컴퓨팅 장치의 메모리에 저장된 명령을 실행하는 것을 포함할 수 있다. 추가적으로 또는 대안적으로, 이미지의 양태는 카메라의 사용자 인터페이스 또는 관련 컴퓨팅 장치와 상호작용함으로써 카메라의 사용자에 의해 수동으로 조정될 수 있다.
일부 경우에, 시각적 분석은 샘플 중의 단백질 침전물의 양을 정량화하기 위해 사용될 수 있다. 일 구현예에서, 방법은 샘플 중의 단백질 침전물의 농도를 측정하기 위해 카메라에 의해 생성된 이미지의 육안 분석을 수행하는 것을 포함할 수 있다. 예를 들어, 방법의 사용자는 이미지를 보고 침전된 단백질의 소구체를 계수하거나, 단백질 침전물을 포함하는 이미지의 면적을 추정하거나, 일부 다른 육안 분석을 수행할 수 있다.
일부 구현예에서, 처리된 샘플에서 단백질 침전물을 정량하기 위해 알고리즘, 프로그램 또는 소프트웨어가 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 카메라에 결합되거나 카메라와 통신하는 컴퓨팅 장치는 처리된 샘플 중의 단백질 침전물의 양을 측정하기 위해 명령(예를 들어, 컴퓨팅 장치의 메모리에 저장된 명령)을 실행한다. 이러한 명령은 육안 기술과 관련하여 상기 설명된 측정의 일부를 자동화하기 위해 컴퓨팅 장치의 프로세서에 의해 실행될 수 있다. 예를 들어, 명령은 처리된 샘플의 이미지에서 단백질 침전물에 상호연관되는 (예를 들어, 단백질 침전물로 구성된 이미지의 면적 또는 단백질 침전물 소구체에 상응하는) 픽셀의 수를 측정하거나 결정함으로써 처리된 샘플 중의 단백질 침전물의 양을 측정하도록 구성될 수 있다. 추가적으로 또는 대안적으로, 명령은 컴퓨팅 장치로 하여금 단백질 침전물을 포함하는 처리된 샘플의 이미지의 면적을 측정함으로써 처리된 샘플에서 단백질 침전물의 양을 측정하게 할 수 있다. 단백질 침전물을 포함하는 면적을 측정하는 것은 단백질 침전물과 관련된 이미지의 픽셀의 수를 결정하는 것을 포함할 수 있다. 이미지의 배경으로부터 단백질 침전물을 구별하는 것은 픽셀과 관련된 수치 값을 분석하는 것을 포함할 수 있다. 예를 들어, 이미지에서 각 픽셀은 수집된 광량, 강도 수준, 밝기, 컬러레이션, 그레이스케일 또는 픽셀의 또 다른 광학 특성에 상응하는 값을 포함할 수 있다(예를 들어, 8-비트 이미지의 픽셀은 0 내지 255의 숫자로 표시될 수 있으며, 여기에서 0은 검은색에 상응하며, 0은 흰색에 상응한다). 특정 예에서, 임계 값은 임계 값보다 높은 값을 갖는 픽셀이 단백질 침전물을 포함하는 것으로 간주되는 반면, 임계 값보다 낮은 값을 갖는 픽셀은 배경으로 간주되도록 설정될 수 있다. 이러한 경우, 단백질 침전물과 관련된 픽셀의 수를 결정하는 것은 일부 임계값 위 또는 아래에 있는 픽셀의 수를 결정하는 것을 포함할 수 있다.
추가적으로 또는 대안적으로, 침전된 단백질은 생성된 이미지의 균일성을 결정함으로써 측정될 수 있다. 더욱 비균질적인(즉, 덜 균질한) 이미지는 더 많은 양의 침전된 단백질을 나타낼 수 있는 반면, 균질한 이미지는 더 적은 양의 단백질을 나타낼 수 있다. 이러한 예에서, 이미지의 균질성은 이미지의 각 픽셀과 관련된 수치 값(예를 들어, 전술한 바와 같이 수집된 광과 관련된 값)을 분석함으로써 결정될 수 있다. 특정 예에서, 이미지의 균질성을 결정하는 것은 이미지에서 각 픽셀과 관련된 값의 표준 편차를 계산하는 것을 포함할 수 있으며, 여기에서 더 높은 표준 편차는 더 많은 양의 침전된 단백질의 결과일 수 있다(그 반대일 수 있음).
도 6b는 처리된 샘플의 이미지에서 측정된 단백질 침전물의 양과 샘플 중의 단백질의 농도 사이의 관계의 플롯을 보여준다. 도 6b에 언급된 바와 같은 "반응"은 전술된 공정에 의해 결정된 바와 같은 이미지의 균질성에 관한 것이다. 처리된 샘플에서 단백질 침전물의 양은 이미지의 균질성(즉, 반응)을 계산하고, 균질성을 이미지화된 샘플에서 단백질의 양과 상호연관시키는 이미지 분석 소프트웨어를 사용하여 결정되었다. 일부 경우에, 처리된 샘플에서 단백질 침전물의 양을 샘플 중의 단백질의 농도와 상호연관시키는 것은 회귀 분석을 수행하는 것을 포함할 수 있다. 이러한 경우, 예비 시험이 수행될 수 있고, 샘플의 이미지에서 침전물과 단백질의 공지된 농도 사이의 실험 관계가 플롯팅될 수 있다. 회귀선은 두 변수에 관한 회귀 함수를 추정하는데 사용될 수 있어서, 후속 실험 데이터는 회귀 함수에 기초하여 해석될 수 있다. 이러한 구현예에서, 처리된 샘플에서 단백질 침전물의 양을 샘플에서 단백질의 양과 상호연관시키는 것은 샘플 중의 단백질의 양을 추정하기 위해 회귀 함수를 사용하는 것을 포함할 수 있다.
본 개시의 일부 구현예에서, 처리된 샘플에서 단백질 침전물의 양을 샘플 중의 단백질의 양과 상호연관시키는 것은 도 11a에 제공된 바와 같이 다변수 이차 방정식을 사용한다. 단백질 침전물의 다수의 이미지는 단계 1에서 샘플 내의 상이한 위치로부터 수득된다. 그 후, 단계 2에서, 이미지는 이미지 내의 단백질 침전물의 특징을 추출하는 다수의 이미지 처리 파이프라인을 통해 처리된다. 특정 구현예에서, 이미지 처리 파이프라인은 센서 노이즈 보정, 콘트라스트 및 엣지 향상, 엣지 및 윤곽 검출, 윤곽 면적, 푸리에 변환 및/또는 표준 편차를 포함할 수 있다. 이미지 처리 파이프라인을 통해 추출된 특징은 하기와 같은 다변수 이차 방정식을 사용하여 단계 3에서 단백질과 상호연관된다:
상기 식에서, x1은 이미지 특징 1이며; x2는 이미지 특징 2이며; xn은 이미지 특징 n이다.
도 11b는 다수 장치에서 샘플 중의 단백질의 농도와 슬라이딩 윈도우 표준 편차 이미지 특징 사이의 관계의 플롯을 보여주며; 도 11c는 다수 장치에서 샘플 중의 단백질의 농도와 평균 윤곽 면적 이미지 특징 사이의 관계의 플롯을 보여준다. 도 11d는 2개의 이미지 특징에 대해 다변수 이차 회귀를 수행한 후 단일 장치에 대한 선형 플롯을 보여준다.
본 개시의 일부 구현예에서, 처리된 샘플에서 단백질 침전물의 양을 샘플 중의 단백질의 양과 상호연관시키는 것은 도 12a에 제공된 바와 같은 인공 신경망을 사용한다. 단백질 침전물의 다수의 이미지는 단계 1의 샘플 내의 다양한 위치로부터 수득된다. 그 후, 단계 2에서, 이미지는 이미지 내의 단백질 침전물의 특징을 추출하는 다수의 이미지 처리 파이프라인을 통해 처리된다. 특정 구현예에서, 이미지 처리 파이프라인은 센서 노이즈 보정, 콘트라스트 향상 및/또는 푸리에 변환의 히스토그램 및/또는 표준 편차를 포함할 수 있다. 이미지 처리 파이프라인을 통해 추출된 특징은 인공 신경망을 사용하여 단계 3에서 단백질과 상호연관된다. 인공 신경망의 구조는 도 12b에 제공된다(여기서 x1은 이미지 특징 1이며, x2는 이미지 특징 2이며, xn은 이미지 특징 n이다). 도 12c는 다수의 장치에서 샘플 중의 단백질의 농도와 히스토그램 슬라이딩 윈도우 표준 편차 이미지 특징 사이의 관계의 플롯을 보여주고; 도 12d는 이미지 특징에 대해 신경망을 훈련시킨 후 다수 장치에 대한 선형 플롯을 보여준다.
다른 경우에, 카메라와 관련된 컴퓨팅 장치, 제어기, 프로세서, 서버 또는 또 다른 컴퓨팅 유닛은 처리된 샘플에서 단백질 침전물의 농도와 샘플 중의 단백질의 양을 관련시키는 데이터를 포함할 수 있다. 이러한 구현예에서, 이미지에서 단백질 침전물의 양을 샘플 중의 단백질의 양과 상호연관시키는 것은 컴퓨팅 장치에 의해 단백질의 양을 결정하는 것을 포함할 수 있다. 이러한 결정은 이미지에서 계수된 단백질 침전물과 상호연관되는 픽셀의 수, 이미지에서 침전된 단백질로 구성되는 측정된 면적 중 적어도 하나에 기초하여 이루어질 수 있다. 단백질의 농도를 결정한 후, 방법(100 및 500)은 카메라의 디스플레이 또는 사용자 인터페이스 또는 카메라와 연관된 장치에 농도를 디스플레이하는 것을 포함할 수 있다. 다른 구현예에서, 단백질의 농도는 컴퓨팅 장치, 프로세서, 카메라의 메모리, 또는 원격 컴퓨터, 예를 들어 추가 분석, 처리 또는 진단을 위한 서버 또는 또 다른 시스템에 전송될 수 있다.
일부 구현예에서, 방법(100 및 500)은 적어도 샘플 중의 분석물 및/또는 단백질의 결정된 농도에 기초하여 사용자의 건강 상태에 대한 결정을 수행하는 것을 추가로 포함한다. 일부 경우에, 카메라와 통신하는 컴퓨팅 장치(예를 들어, 컴퓨터, 서버, 프로세서 또는 제어기)는 건강 상태를 결정하거나, 질병을 진단하거나, 위험 인자를 표현하거나, 환자의 건강에 대한 일부 다른 정보를 제공하기 위해 결정된 분석물 및/또는 단백질의 농도를 사용할 수 있다. 한 구현예에서, 단백질 및 분석물의 양의 관계(예를 들어, 비율)는 건강 상태를 나타낼 수 있으며, 건강 상태를 결정하는 것은 분석물과 크레아티닌의 관계가 임계 값보다 높거나 낮은지를 결정하는 것을 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, 분석물은 크레아티닌일 수 있고, 방법(100 및 500)은 샘플의 소변 단백질:크레아티닌 비("UPC 비")를 결정하는 것을 포함할 수 있다. 이러한 경우에, 건강 상태(예를 들어, 단백뇨)를 진단하는 것은 UPC 비율이 임계 값을 초과하거나 그 미만인지를 결정하는 것을 포함할 수 있다. 다른 건강 상태 및 분석은 당업자에 의해 구상된다.
도 1 및 6에 예시된 예시적인 방법(100 및 500)은 예시적이고 비제한적인 예를 의미한다. 본원에 설명된 단계들 및 단계들은 순차적으로 또는 동시에 수행될 수 있다. 또한, 다양한 단계 및 단계들은 본원에 기술된 것과 다른 순서로 수행될 수 있으며, 일부 단계들 및 단계들은 생략, 스킵 및/또는 반복될 수 있다. 당업자에게 명백한 바와 같이, 방법의 추가적 또는 대안적 요소 및 시스템의 추가적 또는 대안적 구성 요소가 예상된다.
도 7은 본 개시의 예시적인 구현예에 따른 시스템(700), 예를 들어 방법(100 또는 500) 중 어느 하나에서 사용되는 시스템의 예시이다. 시스템(700)은 카메라(710), 다중-웰 샘플 플레이트(720), 컴퓨팅 장치(730)(프로세서(740) 및 메모리(750)를 포함함) 및 서버(760)를 포함할 수 있다. 다중-웰 플레이트(720)는 다중 웰(722)을 포함할 수 있다.
카메라(710)는 전하-결합 소자(CCD), 액티브 픽셀 센서(APS), 상보적 금속-산화물 반도체(CMOS), Foveon X3® 센서 또는 또 다른 센서와 같은 하나 이상의 광 센서를 포함할 수 있다. 이러한 광 센서는 당업자에 의해 이해되는 바와 같이 주어진 적용에 대해 임의의 관심 파장 범위에 민감할 수 있다. 일 구현예에서, 광 센서는 시각적 스펙트럼 또는 시각적 스펙트럼의 일부에 상응하는 파장 범위(즉, 약 190 nm 내지 700 nm의 파장)에 민감할 수 있다. 추가적으로 또는 대안적으로, 광 센서는 적외선 및/또는 자외선 범위의 파장에 민감하거나 선택적으로 민감할 수 있다. 일 구현예에서, 광 센서는 준비된 샘플로부터 반사, 방출 또는 투과된 파장에 상응하는 파장, 예를 들어 비색 시약과 반응한 후 준비된 샘플의 색상에 상응하는 파장, 형광단의 방출 스펙트럼에 상응하는 파장의 범위, 또는 파장의 또 다른 범위에 선택적으로 민감할 수 있다. 이러한 광 센서는 또한 흑/백 광 센서일 수 있어, 실질적으로 모든 입사 광이 파장에 관계 없이 센서가 민감한 범위에서 동일하게 검출되고 기록된다.
카메라(710)는 또한 개구(712) 및 하나 이상의 광학 필터(714)를 포함할 수 있다. 광학 필터는 단지 특정 파장 범위 내에서 개구(712)로 광을 통과시킬 수 있다. 이러한 필터(714)는 특정 파장 또는 파장 범위의 광을 선택적으로 통과시키거나 차단하여 특정 파장 또는 파장 범위의 광만이 카메라(710)에 의해 수집되도록 구성될 수 있다. 예를 들어, 필터(714)에 의해 통과된 파장 범위는 처리된 샘플의 반사, 방출 또는 투과 스펙트럼과 관련될 수 있다. 이러한 파장 범위는 샘플과 비색 시약 사이의 반응에 의해 생성된 생성물 또는 비색 시약의 색상에 상응할 수 있다. 이러한 방식으로, 단지 요망되는 파장만이 카메라(710)에 의해 기록될 수 있어 노이즈 또는 불필요한 이미지 컨텐츠를 감소시킬 수 있다. 광학 필터(714)에 대한 추가적인 또는 대안적인 사용이 또한 고려된다.
또 다른 예시적인 구현예에서, 분석물 또는 총 단백질은 시약 중의 하나 이상의 형광단에 의해 표적화될 수 있다. 형광단은 제2 파장 범위 내의 방사선에 의해 여기될 때 제1 특정 파장 범위 내에서 광을 방출할 수 있다. 따라서, 이러한 구현예에서, 시스템(700)은 제2 파장 범위 내에서 광을 방출하여 형광단을 여기하는 여기 소스(예를 들어, 레이저)를 추가로 포함할 수 있다. 이러한 경우, 필터는 처리된 샘플의 방출 스펙트럼 외부의 모든 파장을 차단하도록 구성될 수 있다.
예시된 바와 같이, 카메라(710)는 컴퓨팅 장치(730)에 통신가능하게 결합된다. 이러한 통신 결합은 다양한 구현예에서 WiFi를 이용하여, BLUETOOTH®를 통해, 또는 유선 인터페이스(예를 들어, USB 케이블)를 통해 구현될 수 있다. 대안적으로, 일부 구현예에서, 카메라(710)는 유선 연결 예컨대, 이더넷 인터페이스를 통해 컴퓨팅 장치(730)에 연결될 수 있다. 일부 구현예에서, 카메라(710)는 모바일 컴퓨팅 장치(예를 들어, 휴대폰)에 부착되거나 통합된 카메라일 수 있다. 모바일 컴퓨팅 장치는 공개 인터넷에 접근하여 이미지(예를 들어, 생물학적 세포의 후보 이미지 또는 표적 이미지)를 컴퓨팅 장치(730)에 전송할 수 있다. 일부 구현예에서, 카메라(710)는 추가적으로 또는 대안적으로 서버(760)에 통신가능하게 결합될 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 카메라(710)는 이미지를 서버(760)에 전송할 수 있고, 서버(760)는 이미지 처리 또는 분석(예를 들어, 이미지의 후 처리, 샘플 중의 분석물 또는 총 단백질의 농도에 대한 결정)을 수행할 수 있으며, 그 후 서버(760)는 결과 정보를 컴퓨팅 장치(730)에 전송할 수 있다.
예시된 바와 같이, 컴퓨팅 장치(730)는 프로세서(740) 및 메모리(750)를 포함한다. 메모리(750)는 저장된 명령(752)을 포함한다. 메모리(750)는 휘발성 메모리(예를 들어, RAM) 및/또는 비-휘발성 메모리(예를 들어, 하드 드라이브)를 포함할 수있다. 메모리(750)는 또한 프로세서(740)에 내부적으로 통신가능하게 결합될 수 있다. 프로세서(740)는 메모리(750)에 저장된 명령(752)을 실행하도록(예를 들어, 다양한 컴퓨팅 작업을 수행하도록) 구성될 수 있다. 추가적으로 또는 대안적으로, 메모리(750)는 이미지들(예를 들어, 카메라(710)에 의해 기록된) 및 이미지들에 관한 정보를 저장할 수 있다. 메모리(750)는 측정된 샘플 중의 분석물 또는 단백질의 농도에 관한 정보를 추가로 저장할 수 있다.
컴퓨팅 장치의 메모리(750)에 저장된 명령(752)은 본원에 설명된 방법을 실행하는 것에 관한 명령을 포함할 수 있다. 예를 들어, 명령(725)은 처리된 샘플에 포커싱하고/거나 개구(712)를 개방 및/또는 폐쇄하고/거나, 샘플(예를 들어, 다중-웰 플레이트의 웰(722) 내에 위치한 샘플)의 이미지를 생성하고/거나, 개구(712)가 개방되는 기간을 측정하고/거나 개구의 크기를 측정하도록 카메라에 지시할 수 있다. 이러한 명령(725)은 또한 컴퓨팅 장치(730)로 하여금 결정된 기간 및/또는 개구 크기를 샘플 중의 분석물 또는 총 단백질의 농도와 상호연관시키게 할 수 있다. 또한, 명령(725)은 카메라(710)에 의한 생성된 이미지의 처리에 관한 것일 수 있다. 예를 들어, 명령(725)은 컴퓨팅 장치(730)로 하여금 샘플의 이미지를 처리하고/거나 처리된 샘플 중의 단백질 침전물의 농도를 측정하고/거나 처리된 샘플 중의 단백질 침전물의 농도를 샘플 중의 단백질의 농도와 상호연관시키게 할 수 있다.
실시예 1
공지된 양의 글루코스, 알부민 및 알칼리 포스파타제를 포함하는 처리된 샘플은 균일한 밝기를 갖도록 이미지화하였다. 이미지의 노출 시간(즉, 개구가 개방되는 기간, 셔터 속도)은 샘플 중의 분석물의 양과 노출 시간 사이의 관계(즉, 표준 곡선)를 보여주기 위해 플롯팅하였다.
처리된 샘플의 이미지는 CMOS 광 센서 및 단색 색 공간을 갖는 PL-D725MU-T USB 3.0 카메라(PixelLINK)에 의해 촬영하였다. 카메라는 10x의 배율 및 0.28의 개구수를 갖는 대물 렌즈를 포함하였다. 대물 렌즈의 초점 길이는 20 mm이며, 초점 깊이는 약 3.5 μm이다. 카메라의 확대 및 포커싱을 용이하게 하기 위해 더 긴 초점 길이를 갖는 튜브 렌즈를 대물 렌즈에 결합시켰다. 튜브 렌즈의 초점 길이는 200 mm이다. 어댑터를 사용하여 이미지를 카메라의 이미지 센서에 포커싱하기 위한 최적의 거리로 렌즈(들)를 카메라에 연결하였다.
상기 기술된 방법에 따라 수행된 측정은 도 8a-c에 도시되어 있다. 도 8a는 실험 샘플 중 글루코스의 양과 소정 기간 사이의 관계를 보여주는 표준 곡선을 예시한다. 이 곡선은 음성 대조군 샘플, 1 mM 글루코스 샘플 및 20 mM 글루코스 샘플을 제조함으로써 수득되었다. 음성 대조군 샘플을 고정시키기 위해, 다음 시약을 사용하였다: 590 μL의 탈이온수, 10 μL의 홀스래디쉬 퍼옥시다제(HRP), 10 μL의 글루코스 옥시다제, 100 μL의 4-아미노안티피린 및 100 μL의 95% 에탄올 중 1,7-디하이드록시나프탈렌. 1 mM 글루코스 샘플을 고정시키기 위해, 다음 시약을 사용하였다: 580 μL의 탈이온수, 10 μL의 홀스래디쉬 퍼옥시다제, 10 μL의 글루코스 옥시다제, 100 μL의 4-아미노안티피린, 100 μL의 95% 에탄올 중 1,7-디하이드록시나프탈렌 및 10 μL의 글루코스. 20 mM 글루코스 샘플을 고정시키기 위해, 다음 시약을 사용하였다: 380 μL의 탈이온수, 10 μL의 홀스래디쉬 퍼옥시다제, 10 μL의 글루코스 옥시다제, 100 μL의 4-아미노안티피린, 100 μL의 95% 에탄올 중 1,7-디하이드록시나프탈렌 및 200 μL의 글루코스. 각각의 슬라이드에, 600 μL의 샘플(음성, 1 mM 및 20 mM)을 첨가하고 이미지화하여 도 8a에 예시된 곡선을 얻었다.
도 8b는 실험 샘플 중의 알부민의 양과 소정 기간 사이의 관계를 보여주는 상호연관 곡선을 예시한다. 이 곡선은 음성 대조군 샘플, 1 mg/mL 알부민 샘플 및 5 mg/mL 알부민 샘플을 제조함으로써 수득되었다. 음성 대조군 샘플을 고정시키기 위해, 다음 시약을 사용하였다: 880 μL의 PBS 완충액(pH 4.2) 및 120 μL의 브로모크레솔 그린(pH 4.2). 1 mg/mL 알부민 샘플을 고정하기 위해, 다음 시약을 사용하였다: 870 μL의 PBS 완충액(pH 4.2), 120 μL의 브로모크레솔 그린(pH 4.2) 및 10 μL의 알부민. 5 mg/mL 알부민 샘플을 고정하기 위해, 다음 시약을 사용하였다: 830 μL의 PBS 완충액(pH 4.2), 120 μL의 브로모크레솔 그린(pH 4.2) 및 50 μL의 알부민. 각각의 슬라이드에, 600 μL의 샘플(음성, 1 mg/mL 및 5 mg/mL)을 첨가하고 이미지화하여 도 8b에 예시된 곡선을 얻었다.
도 8c는 실험 샘플 중 알칼리 포스파타제의 양과 소정 기간 사이의 관계를 보여주는 상호연관 곡선을 예시한다. 이 곡선은 음성 대조군 샘플, 1 μg/mL 알칼리 포스파타제 샘플 및 10 μg/mL 알칼리 포스파타제 샘플을 제조함으로써 얻어졌다. 음성 대조군 샘플을 고정시키기 위해, 다음 시약을 사용하였다: 1 mL의 BCIP/NBT 기질(5-브로모-4-클로로-3-인돌릴 포스페이트/니트로 블루 테트라졸륨) 및 1 mL의 1 M HCl. 1 μg/mL 알칼리 포스파타제 샘플을 고정시키기 위해, 다음 시약을 사용하였다: 990 μL의 BCIP/NBT 기질, 10 μL의 알칼리 포스파타제 및 반응을 중지시키기 위한 1 mL의 1 M HCl. 10 μg/mL 알칼리 포스파타제 샘플을 고정시키기 위해, 다음 시약을 사용하였다: 900 μL의 BCIP/NBT 기질, 100 μL의 알칼리 포스파타제 및 반응을 중지시키기 위한 1 mL의 1 M HCl. 각각의 슬라이드에, 600 μL의 샘플(음성, 1 μg/mL 및 10 μg/mL)을 첨가하고 이미지화하여 도 8c에 예시된 곡선을 얻었다.
실시예 2
165 μL의 소변 샘플을 300 mM의 포스페이트 완충액(pH 12.4) 중 3,5-디니트로벤조일클로라이드 용액 1485 μL에 첨가하여 처리된 샘플을 수득하였다. 처리된 샘플의 165 μL의 이미지를 실시예 1에 설명된 카메라로 촬영하였다.
도 9는 카메라에 의해 생성된 샘플의 이미지를 제공하며 이는 예를 들어, 0 내지 1000 mg/dL 범위의 크레아티닌 양을 보여준다.
또 다른 165 μL의 소변 샘플을 2475 μL의 피로카테콜 바이올렛 시약(탈이온수 중의 0.28 mM 피로카테콜 바이올렛, 0.16 mM 소듐 몰리브데이트, 120 mM 숙신산 및 1mM 소듐 옥살레이트) 용액에 첨가하여 처리된 샘플을 수득하였다. 처리된 샘플 165 μL를 상기 기술된 바와 같이 이미지화하였다. 처리된 샘플의 셔터 속도는 공지된 단백질 농도에 대한 셔터 속도를 플로팅하여 얻은 표준 곡선과 비교하였다. 공지된 양의 단백질(예를 들어, 0 내지 500 mg/dL의 범위)과 본 개시의 방법에 따라 측정된 셔터 속도 사이의 관계의 예시적인 상호관계는 도 10에 제공된다.
본 명세서 전반에서, 문맥 상 달리 요구되지 않는 한, 단어 "포함하다(comprise)" 및 "포함하다(include)" 및 변형(예를 들어, "포함하다(comprises)", "포함하는(comprising)", "포함하다(includes)", "포함하는(including)")은 언급된 구성 요소, 특징, 요소 또는 단계, 또는 구성 요소, 특징, 요소 또는 단계의 군을 포함함을 의미하는 것으로 이해 될 것이나, 임의의 다른 정수 또는 단계 또는 정수 또는 단계의 군을 배제하지는 않는다.
본 명세서 및 첨부된 청구범위에 사용된 바와 같이, 단수 형태("a", "an" 및 "the")는 문맥상 명백하게 다르게 지시되지 않는 한 복수 지시 대상을 포함한다.
상기 상세한 설명은 첨부된 도면을 참조하여 개시된 시스템, 장치 및 방법의 다양한 특징 및 기능을 설명한다. 다양한 양태 및 구현예가 본원에 개시되었지만, 다른 양태 및 구현예가 명백할 것이다. 본원에 개시된 다양한 양태 및 구현예는 단지 예시를 위한 것이며 제한하려는 것이 아니며, 진정한 범위는 다음의 청구 범위에 의해 지시된다.
도면에서, 문맥 상 달리 지시하지 않는 한, 유사한 기호는 전형적으로 유사한 구성 요소를 나타낸다. 본원 및 도면에 설명된 예시적인 구현예는 제한적인 것으로 의도되지 않는다. 본원에 제시된 주제의 범위를 벗어나지 않으면서 다른 구현예가 이용될 수 있고 다른 변경이 이루어질 수 있다. 본원에 일반적으로 설명되고 도면에 예시된 바와 같이 본 개시의 양태는 매우 다양하고 상이한 구성으로 배열, 대체, 조합, 분리 및 설계될 수 있으며, 이들 모두는 본원에서 명시적으로 고려됨이 용이하게 이해될 것이다.
Claims (37)
- 샘플 중의 분석물 또는 총 단백질의 농도를 측정하는 방법으로서,
샘플을 비색 시약과 접촉시켜 처리된 샘플을 수득하는 단계;
개구를 포함하는 카메라를 처리된 샘플에 포커싱하는 단계;
샘플로부터 소정의 광량을 수집하기에 충분한 기간 동안 개구를 개방하는 단계;
기간을 측정하는 단계; 및
기간을 샘플 중의 분석물 또는 총 단백질의 농도와 상호연관시키는 단계를 포함하는 방법. - 샘플 중의 분석물 또는 총 단백질의 농도를 측정하는 방법으로서,
샘플을 비색 시약과 접촉시켜 처리된 샘플을 수득하는 단계;
개구를 포함하는 카메라를 처리된 샘플에 포커싱하는 단계;
소정 기간 동안 개구를 개방하는 단계로서, 개구의 크기는 소정 기간 동안 샘플로부터 소정의 광량을 수집하기에 충분한, 단계;
개구의 크기를 측정하는 단계; 및
개구의 크기를 샘플 중의 분석물 또는 총 단백질의 농도와 상호연관시키는 단계를 포함하는 방법. - 샘플 중의 분석물 및 총 단백질의 농도를 측정하는 방법으로서,
샘플을 비색 시약 및 단백질 침전 시약과 접촉시켜 단백질 침전물을 포함하는 처리된 샘플을 수득하는 단계;
개구를 포함하는 카메라를 처리된 샘플에 포커싱하는 단계;
처리된 샘플로부터 소정의 광량을 수집하기에 충분한 기간 동안 개구를 개방하는 단계;
기간을 측정하는 단계; 및
기간을 샘플 중의 분석물의 농도와 상호연관시키는 단계에 의해
처리된 샘플 중의 분석물의 농도를 결정하는 단계; 및
처리된 샘플의 이미지를 카메라에 의해 생성하는 단계;
이미지에서 단백질 침전물과 상호연관되는 픽셀의 수를 측정하는 단계; 및
픽셀의 수를 표준 곡선과 상호연관시켜 샘플 중의 총 단백질의 농도를 수득하는 단계에 의해
총 단백질의 농도를 결정하는 단계를 포함하는 방법. - 샘플 중의 분석물 및 총 단백질의 농도를 측정하는 방법으로서,
샘플을 비색 시약 및 단백질 침전 시약과 접촉시켜 단백질 침전물을 포함하는 처리된 샘플을 수득하는 단계;
개구를 포함하는 카메라를 처리된 샘플에 포커싱하는 단계;
소정 기간 동안 개구를 개방하는 단계로서, 개구의 크기는 샘플로부터 소정의 광량을 수집하기에 충분한, 단계;
개구의 크기를 측정하는 단계; 및
개구의 크기를 샘플 중의 분석물의 농도와 상호연관시키는 단계에 의해
처리된 샘플 중의 분석물의 농도를 결정하는 단계; 및
처리된 샘플의 이미지를 카메라에 의해 생성하는 단계;
이미지에서 단백질 침전물과 상호연관되는 픽셀의 수를 측정하는 단계; 및
픽셀의 수를 표준 곡선과 상호연관시켜 샘플 중의 총 단백질의 농도를 수득하는 단계에 의해
총 단백질의 농도를 결정하는 단계를 포함하는 방법. - 샘플 중의 분석물 및 총 단백질의 농도를 측정하는 방법으로서,
샘플을 비색 시약 및 단백질 침전 시약과 접촉시켜 단백질 침전물을 포함하는 처리된 샘플을 수득하는 단계;
카메라를 처리된 샘플에 포커싱하는 단계;
개구를 개방하여 처리된 샘플로부터 광량을 수집하는 단계;
수집된 광량의 강도를 측정하는 단계; 및
수집된 광의 강도를 샘플 중의 분석물의 농도와 상호연관시키는 단계에 의해
처리된 샘플 중의 분석물의 농도를 결정하는 단계; 및
처리된 샘플의 이미지를 카메라에 의해 생성하는 단계;
이미지에서 단백질 침전물과 상호연관되는 픽셀의 수를 측정하는 단계; 및
픽셀의 수를 표준 곡선과 상호연관시켜 샘플 중의 총 단백질의 농도를 수득하는 단계에 의해
총 단백질의 농도를 결정하는 단계를 포함하는 방법. - 샘플 중의 총 단백질의 농도를 측정하는 방법으로서,
샘플을 단백질 침전 시약과 접촉시켜 단백질 침전물을 포함하는 처리된 샘플을 수득하는 단계;
처리된 샘플의 이미지를 카메라에 의해 생성하는 단계;
이미지에서 단백질 침전물과 상호연관되는 픽셀의 수를 측정하는 단계; 및
픽셀의 수를 표준 곡선과 상호연관시켜 샘플 중의 총 단백질의 농도를 수득하는 단계를 포함하는 방법. - 제1항 내지 제5항 중의 어느 한 항에 있어서, 분석물이 칼슘 이온, 칼륨 이온, 염화물 이온, 나트륨 이온, 글루코스, 락테이트, 크레아티닌, 크레아틴, 우레아, 요산, 에탄올, 알부민, 알칼리 포스파타제, 콜레스테롤, 피루베이트, β-하이드록시부티레이트, 알라닌 아미노트랜스퍼라제, 아스파르테이트 아미노트랜스퍼라제 및 세틸콜린에스테라제로부터 선택되는, 방법.
- 제1항 내지 제5항 중의 어느 한 항에 있어서, 분석물이 크레아티닌, 글루코스, 알부민 또는 알칼리 포스파타제인, 방법.
- 제1항 내지 제5항, 제7항 또는 제8항 중의 어느 한 항에 있어서, 비색 시약이 2,4,6-트리니트로페놀 및 염기이거나; 비색 시약이 메틸 3,5-디니트로벤조에이트, 3,5-디니트로벤조산 또는 3,5-디니트로벤조일클로라이드, 및 염기 또는 염기성 완충제이거나; 비색 시약이 3,5-디니트로벤조일클로라이드를 포함하거나; 비색 시약이 구리 이온, 하이드로퍼옥사이드 및 산화성 염료를 포함하는 시약계인, 방법.
- 제1항 내지 제5항, 제7항 또는 제8항 중의 어느 한 항에 있어서, 비색 시약이 글루코스 옥시다제, 헥소키나제, 알칼리 구리 타르타레이트, 알칼리 페리시아니드 및 홀스래디쉬 퍼옥시다제 중 하나 이상인, 방법.
- 제1항 내지 제5항, 제7항 또는 제8항 중의 어느 한 항에 있어서, 비색 시약이 브로모크레솔 그린인, 방법.
- 제1항 내지 제5항, 제7항 또는 제8항 중의 어느 한 항에 있어서, 비색 시약이 5-브로모-4-클로로-3-인돌릴 포스페이트(BCIP) 및 니트로 블루 테트라졸륨(NBT)을 포함하는 시약계인, 방법.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 비색 시약이 피로카테콜 바이올렛, 벤제토늄 클로라이드 및 피로갈롤 레드를 포함하는, 방법.
- 제3항 내지 제12항 중의 어느 한 항에 있어서, 단백질 침전 시약이 하나 이상의 수-혼화성 용매(예컨대, 알콜, 예를 들어, 이소프로판올, 메탄올 또는 에탄올, 케톤, 예를 들어, 아세톤, 메틸 에틸 케톤, 메틸 이소부틸 케톤, 또는 사이클로헥사논, 테트라하이드로푸란)이거나; 단백질 침전 시약이 염(예컨대, 암모늄 설페이트 또는 다가 금속 이온을 포함하는 염)이거나; 단백질 침전 시약이 트리클로로아세트산 또는 트리클로로아세트산 및 아세톤이거나; 단백질 침전 시약이 중합체(예를 들어, 비-이온성 친수성 중합체, 예컨대, 폴리에틸렌 글리콜 및 덱스트란)인, 방법.
- 제3항 내지 제12항 중의 어느 한 항에 있어서, 단백질 침전 시약이 수성 계면활성제인, 방법.
- 제15항에 있어서, 수성 계면활성제가 벤즈알코늄 클로라이드 또는 벤제토늄 클로라이드인, 방법.
- 제1항 내지 제16항 중의 어느 한 항에 있어서, 샘플이 소변 샘플인, 방법.
- 제3항 내지 제17항 중의 어느 한 항에 있어서, 처리된 샘플로부터 수집된 소정의 광량을 사용하여 처리된 샘플의 이미지를 생성하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
- 제18항에 있어서, 처리된 샘플이 처리된 샘플을 포함하는 슬라이드로부터 이미지화되는, 방법.
- 제18항 또는 제19항에 있어서, 이미지가 흑백 이미지인, 방법.
- 제18항 내지 제20항 중의 어느 한 항에 있어서, 처리된 샘플의 이미지를 사용자 인터페이스에 디스플레이하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
- 제3항 내지 제12항 또는 제14항 내지 제21항 중의 어느 한 항에 있어서, 소정의 광량이 처리된 샘플의 이미지로부터 단백질 침전물의 양을 측정하기에 충분한, 방법.
- 제1항 내지 제22항 중의 어느 한 항에 있어서, 소정의 광량이 공지된 농도의 분석물 또는 총 단백질을 갖는 표준 샘플을 사용하여 1, 2 또는 3회의 실증적 실험을 독립적으로 수행함으로써 수득될 수 있는, 방법.
- 제1항 내지 제23항 중의 어느 한 항에 있어서, 소정의 광량이 일정한, 방법.
- 제1항 내지 제24항 중의 어느 한 항에 있어서, 소정의 광량이 카메라의 사용자에 의해 선택되는, 방법.
- 제1항 내지 제25항 중의 어느 한 항에 있어서, 카메라가 필터를 포함하는, 방법.
- 제25항에 있어서, 필터가 비색 시약과 샘플 사이의 반응으로부터 발생한 색상의 파장 범위에 상응하는 파장을 통과하도록 구성되는, 방법.
- 제1항, 제3항 또는 제7항 내지 제27항 중의 어느 한 항에 있어서, 카메라가 자동 노출 기능을 포함하고, 개구가 개방되는 기간을 측정하는 단계가 자동 노출 기능을 사용하여 기간을 결정하는 것을 포함하는, 방법.
- 제28항에 있어서, 결정이 개구 크기 및 소정의 광량 중 적어도 하나에 기초하여 이루어지는, 방법.
- 제1항, 제3항 또는 제7항 내지 제27항 중의 어느 한 항에 있어서, 카메라가 센서를 포함하고, 샘플로부터 소정의 광량을 수집하기에 충분한 기간 동안 개구를 개방하는 단계가
개구를 개방하는 단계;
카메라에 의해 수집된 광량을 센서에 의해 검출하는 단계;
카메라에 의해 수집된 광량이 소정의 광량과 실질적으로 동일한지의 여부를 결정하는 단계; 및
소정의 광량이 카메라에 의해 수집되었음이 결정된 후 개구를 폐쇄하는 단계를 포함하는, 방법. - 제1항, 제3항 또는 제7항 내지 제27항 중의 어느 한 항에 있어서, 카메라가 센서를 포함하고, 샘플로부터 소정의 광량을 수집하기에 충분한 기간 동안 개구를 개방하는 단계가
일정 기간 동안 개구를 개방하여 처리된 샘플로부터 광량을 수집하는 단계;
개구를 폐쇄하는 단계;
처리된 샘플로부터 수집된 광량을 센서에 의해 측정하는 단계;
처리된 샘플로부터 수집된 광량이 소정의 광량과 실질적으로 동일한지의 여부를 결정하는 단계;
샘플로부터 수용된 광량이 소정의 광량과 실질적으로 동일하지 않은 경우, 제2 기간 동안 개구를 개방하는 단계로서, 제2 기간은 제1 기간과 상이한 단계; 및
개구가 개방되는 제2 기간을 소정의 광량과 상호연관시켜 샘플 중의 분석물 또는 총 단백질의 농도를 수득하는 단계를 포함하는, 방법. - 제2항, 제4항 또는 제7항 내지 제27항 중의 어느 한 항에 있어서, 카메라가 자동 노출 기능을 포함하고, 개구의 크기를 측정하는 단계가 자동 노출 기능을 사용하여 개구의 크기를 결정하는 것을 포함하는, 방법.
- 제32항에 있어서, 결정이 기간 및 소정의 광량 중 적어도 하나에 기초하여 이루어지는, 방법.
- 제2항, 제4항 또는 제7항 내지 제27항 중의 어느 한 항에 있어서, 카메라가 센서를 포함하고, 일정 기간 동안 개구를 개방하는 단계가
개구를 개방하여 샘플로부터 광량을 수집하는 단계로서, 개구가 제1 개구 크기를 포함하는, 단계;
개구를 폐쇄하는 단계;
처리된 샘플로부터 수집된 광량을 센서에 의해 측정하는 단계;
샘플로부터 수집된 광량이 소정의 광량과 실질적으로 동일한지의 여부를 결정하는 단계;
샘플로부터 수용된 광량이 소정의 광량과 실질적으로 동일하지 않은 경우, 제2 기간 동안 개구를 개방하는 단계로서, 개구는 제2 개구 크기를 가지며, 제2 개구 크기는 제1 개구 크기와 상이한, 단계; 및
개구의 제2 개구 크기를 소정의 광량과 상호연관시켜 샘플 중의 분석물 또는 총 단백질의 농도를 수득하는 단계를 포함하는, 방법. - 제1항 내지 제34항 중의 어느 한 항에 있어서, 분석물이 크레아티닌인, 방법.
- 제35항에 있어서, 적어도 샘플 중의 크레아티닌의 농도 및 샘플 중의 총 단백질의 농도에 기초하여 샘플의 단백질:크레아티닌 비를 결정하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
- 제1항 내지 제36항 중의 어느 한 항에 있어서, 적어도 샘플 중의 분석물, 총 단백질 또는 이의 조합물의 농도에 기초하여 건강 결정을 수행하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
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Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
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|---|---|---|---|---|
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