KR20200099099A - 역분화줄기세포 유래 조혈모세포의 제조 방법 - Google Patents

역분화줄기세포 유래 조혈모세포의 제조 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 역분화줄기세포 유래 조혈모세포의 제조 방법, 상기 방법으로 제조된 조혈모줄기세포 등에 관한 것으로, 본 발명에 따른 역분화줄기세포 유래 조혈모세포의 제조 방법은 대량 생산이 가능한 역분화줄기세포를 이용하여 용이하게 조혈모세포를 제조할 수 있기 때문에, 조혈모세포의 대량 생산이 가능하다.

Description

역분화줄기세포 유래 조혈모세포의 제조 방법{Method of preparing hematopoietic stem cells derived from induced pluripotent stem cells}
본 발명은 역분화줄기세포 유래 조혈모세포의 제조 방법, 상기 방법으로 제조된 조혈모줄기세포 등에 관한 것이다.
조혈모세포는 제대혈에서 유래되며, 주로 골수에서 존재하면서 증식 및 분화를 통해 적혈구, 백혈구, 혈소판 등의 혈액세포를 만들어낼 수 있으며, 줄기세포의 특징인 자가복제능력, 다세포분열능, 다분화잠재능 등을 지니고 있다. 조혈모세포는 안정된 상태에서 하루에 약 4 X 1011 개의 혈액세포를 생성할 수 있으며, 체내 주입 시 골수로 이동하는 특성이 있어, 급성백혈병, 만성백혈병, 재생불량성 빈혈, 골수이형성 증후군, 다발성 골수종 등의 혈액암 관련 질환, 유방암, 신장암, 난소암 등의 고형암, 불응성 전신성 홍반성 낭창, 불응성 류마티스 관절염 등의 자가 면역 질환 등의 치료에 조혈모세포의 이식 치료가 임상적으로 활성화되어 있다.
그러나 이러한 조혈모세포는 탯줄의 제대혈로부터 적은 양만 획득할 수 있고, 골수의 경우에는 채취가 용이하지 않고, 그 통증이 심하기 때문에 획득이 용이하지 않은 뿐만 아니라, 조직적합성항원(histocompatibility antigen; HLA)가 일치하는 기증자를 찾기가 어렵기 때문에, 치료에 사용 가능한 조혈모세포는 그 수가 매우 한정적이며, 대부분의 수여자는 소아들에게 국한된다.
따라서 다양한 질병의 치료에 조혈모세포 이식을 효과적으로 적용하려면, 제대혈 또는 골수로부터의 채취가 아닌 대량의 조혈모세포를 용이하게 제조할 수 있는 조혈모세포의 제조 방법이 필요한 실정이다.
국내공개특허 10-2007-0113694
본 발명은 상기와 같은 종래 기술상의 문제점을 해결하기 위해 안출된 것으로, 제대혈 또는 골수로부터의 채취가 아닌 역분화줄기세포로부터 유래된 조혈모세포의 제조 방법 등을 제공하는 것을 그 목적으로 한다.
그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 본 발명이 속하는 기술 분야의 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
본 발명은 하기 단계를 포함하는 역분화줄기세포 유래 조혈모세포의 제조 방법을 제공한다: (a) 역분화줄기세포를 골형성단백질4(BMP4)가 첨가된 배지에서 배양하는 단계; (b) 상기 (a) 단계의 배양된 세포를 혈관내피세포성장인자(VEGF) 및 염기성 섬유아세포성장인자(bFGF)가 첨가된 배지로 교체하여 배양하는 단계; (c) 상기 (b) 단계의 배양된 세포를 SB431542, 혈관내피세포성장인자, 및 염기성 섬유아세포성장인자가 첨가된 배지로 교체하여 배양하는 단계; (d) 상기 (c) 단계의 배양된 세포를 줄기세포인자(SCF), 트롬보포이에틴(TPO), 및 인터루킨-3(IL-3)이 첨가된 배지로 교체하여 배양하는 단계; (e) 상기 (d) 단계의 배양된 세포의 배양 상등액을 수거하는 단계; 및 (f) 상기 수거된 상등액에 포함되어 있는 세포를 분리하는 단계; 및 (g) 상기 분리된 세포를 Flt3L(FMS-like tyrosine kinase 3 ligand), 줄기세포인자(SCF), 트롬보포이에틴(TPO), 인터루킨-3(IL-3), 및 인터루킨-6(IL-6)가 첨가된 배지에서 배양하는 단계.
본 발명의 일 구체예에 있어서, 상기 (a) 단계는 BMP4가 30 내지 70 ng/mL의 농도 또는 40 내지 60 ng/mL의 농도로 첨가되며, 1 내지 3 일 동안 배양될 수 있으며, 상기 (b) 단계는 VEGF가 30 내지 70 ng/mL의 농도 또는 40 내지 60 ng/mL의 농도로 첨가되며, bFGF가 30 내지 70 ng/mL의 농도 또는 40 내지 60 ng/mL의 농도로 첨가되며, 1 내지 3 일 동안 배양될 수 있으며, 상기 (c) 단계는 SB43154가 3 내지 7 μM의 농도 또는 4 내지 6 μM의 농도로 첨가되며, VEGF가 30 내지 70 ng/mL의 농도 또는 40 내지 60 ng/mL의 농도로 첨가되며, bFGF가 30 내지 70 ng/mL의 농도 또는 40 내지 60 ng/mL의 농도로 첨가되며, 1 내지 3 일 동안 배양될 수 있으며, 상기 (d) 단계는 SCF가 30 내지 70 ng/mL의 농도 또는 40 내지 60 ng/mL의 농도로 첨가되며, TPO가 30 내지 70 ng/mL의 농도 또는 40 내지 60 ng/mL의 농도로 첨가되며, IL-3이 30 내지 70 ng/mL의 농도 또는 40 내지 60 ng/mL의 농도로 첨가되며, 4 내지 8 일 동안 배양될 수 있으며, 상기 (g) 단계는 Flt3L이 1 내지 20 ng/mL의 농도 또는 5 내지 15 ng/mL의 농도로 첨가되며, 줄기세포인자가 1 내지 20 ng/mL의 농도 또는 5 내지 15 ng/mL의 농도로 첨가되며, 트롬보포이에틴이 1 내지 20 ng/mL의 농도 또는 5 내지 15 ng/mL의 농도로 첨가되며, 인터루킨-3이 1 내지 20 ng/mL의 농도 또는 5 내지 15 ng/mL의 농도로 첨가되며, 및 인터루킨-6가 1 내지 20 ng/mL의 농도 또는 5 내지 15 ng/mL의 농도로 첨가되며, 5 내지 9 일 동안 배양될 수 있으나, 상기 성분들은 다른 화합물로 교체될 수 있으며, 그 농도 또한 본 발명의 분야에서 이용되고 있는 농도라면 제한되지 않는다.
본 발명의 다른 구체예에 있어서, 상기 배지(culture medium)는 줄기세포 배양용 배지로서, 당업계에 공지되어 있다. 상기 배지에는 일반적으로 염, 비타민, 완충액, 에너지 공급원, 아미노산, 혈청 등의 다른 물질을 포함하고 있으며, 일례로, DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Medium), MEM(Minimal Essential Medium), RPMI 1640, F-10, F-12, a-MEM(a-Mineral Essential Medium), G-MEM(Glasgow's Mineral Essential Medium), IMDM(Iscove's Modified Dulbecco's Medium), mTeSR1, StemSpan-ACF, STEMdiffTM 등이 있으나, 일반적으로 사용되고 있는 줄기세포 배양용 배지라면 제한이 없다.
본 발명의 또 다른 구체예에 있어서, 상기 조혈모세포는 CD34+, CD43+ 또는 CD45+의 면역학적 특성을 나타내는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 또 다른 구체예에 있어서, 상기 역분화줄기세포는 바람직하게는 인간 말초혈액에서 분리된 세포를 이용하여 제조될 수 있으나, 일반적으로 역분화줄기세포를 제조하는데 이용되는 세포라면 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명은 상기 방법으로 제조된 역분화줄기세포 유래 조혈모세포를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 방법으로 제조된 역분화줄기세포 유래 조혈모세포를 유효성분으로 포함하는 조혈모세포 이식용 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 구체예에 있어서, 상기 조혈모세포 이식용 조성물은 바람직하게는급성 골수성 백혈병, 급성 림프구성 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 만성 림프구성 백혈병, 재생불량성 빈혈, 다발성골수종, 악성 림프종, 골수증식종양, 골수형성이상증후군 등 혈액암 관련 질환; 발작성 야간혈색소뇨증, 면역부전증, 혈색소 이상증, 판코니 빈혈 등; 유방암, 신장암, 난소암 등의 고형암; 및 불응성 전신성 홍반성 낭창, 불응성 류마티스 관절염 등의 자가 면역 질환, 골수부전(bone marrow failure) 등의 치료에 사용될 수 있으나, 조혈모세포의 이식 치료가 사용되는 질환이라면 이에 제한되지 않는다. 상기 골수부전은 정상적 골수의 기능이 어떤 이유로든 상실하게 된 상태를 의미하며, 본 명세서에는 골수부전의 증상을 포함하는 모든 질환을 포함할 수 있다.
또한 본 발명은 상기 방법으로 제조된 역분화줄기세포 유래 조혈모세포를 포함하는 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 상기 질환의 예방 또는 치료 방법을 제공한다.
또한 본 발명은 상기 방법으로 제조된 역분화줄기세포 유래 조혈모세포를 포함하는 조성물의 상기 질환의 예방 또는 치료 용도를 제공한다.
본 발명에 따른 역분화줄기세포 유래 조혈모세포의 제조 방법은 한정적 자원인 골수 또는 제대혈로부터 조혈모세포를 채취하는 방식이 아니라, 대량 생산이 가능한 역분화줄기세포를 이용하여 용이하게 조혈모세포를 제조할 수 있기 때문에, 배아줄기세포가 가지고 있는 윤리적 단점으로부터 자유로울 수 있을 뿐만 아니라 조혈모세포의 대량 생산이 가능하다. 따라서, 본 발명에 따른 역분화줄기세포 유래 조혈모세포는 조혈모세포의 이식 치료가 적용될 수 있는 다양한 질환의 치료에 폭넓게 사용 가능할 것으로 기대된다.
도 1은 본 발명의 역분화줄기세포 유래 조혈모세포의 제조 방법을 간략하게 나타낸 도면이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 역분화줄기세포 유래 조혈모세포의 생성을 광학 현미경을 통하여 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 역분화줄기세포 유래 조혈모세포의 생성을 면역형광염색법으로 확인한 결과를 나타낸 도면이다. *는 P < 0.05, **는 P < 0.01을 나타낸다.
본 발명자들은 용이하게 획득이 가능한 단핵세포로부터 역분화줄기세포를 제조하고, 상기 제조된 역분화줄기세포를 이용하여 용이하게 조혈모세포를 제조할 수 있을 뿐만 아니라, 조혈모세포의 제조 효율이 증가되는 것을 확인하고, 이에 기초하여 본 발명을 완성하였다.
본 명세서에 있어서, "역분화줄기세포(induced pluripotent stem cell)"란 유도만능줄기세포라고도 불리며, 분화가 완료된 체세포로부터 특정 유전자 조작 등을 통하여 인위적으로 분화 이전의 세포 단계로 유도된 세포로서, 배아줄기세포와 같은 다능성을 가지고 있는 세포를 총칭한다. 상기 역분화줄기세포는 바람직하게는 인간의 체세포를 이용하여 제조될 수 있으며, 더욱 바람직하게는 말초 혈액 내의 세포, 즉, 단핵세포 등을 이용하여 제조될 수 있으나, 역분화줄기세포를 제조할 수 있는 세포라면 이에 제한되지 않는다.
본 명세서에 있어서, "조혈모세포(hematopoietic stem cell)"란 주로 골수에 존재하면서 증식 및 분화를 통해 백혈구, 적혈구, 혈소판 등의 혈액세포를 만들어내는 능력을 가지고 있는 세포를 총칭하며, 세포 표면에 CD34라고 하는 특이 항원 양성 소견을 보인다.
본 명세서에 있어서, "예방(prevention)"이란 본 발명에 따른 조성물의 투여에 의해 암, 자가면역질환, 골수부종 등의 질환을 억제시키거나 발병을 지연시키는 모든 행위를 의미한다.
본 명세서에 있어서, “치료(treatment)”란 본 발명에 따른 조성물의 투여에 의해 암, 자가면역질환, 골수부종 등의 증세가 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다.
본 명세서에 있어서, "개체(individual)"란 본 발명의 조성물이 투여될 수 있는 대상을 말하며, 그 대상에는 제한이 없다.
본 명세서에 있어서, “조성물(composition)”이란 본 발명의 방법으로 제조된 조혈모세포를 유효성분으로 포함하며, 캡슐, 정제, 과립, 주사제, 연고제, 분말 또는 음료 형태임을 특징으로 할 수 있으며, 상기 조성물은 인간을 대상으로 하는 것을 특징으로 할 수 있다. 상기 조성물은 이들로 한정되는 것은 아니지만, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 캡슐, 정제, 수성 현탁액 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 본 발명의 조성물은 약제적으로 허용가능한 담체를 포함할 수 있다. 약제학적으로 허용되는 담체는 경구투여시에는 결합제, 활탁제, 붕해제, 부형제, 가용화제, 분산제, 안정화제, 현탁화제, 색소, 향료 등을 사용할 수 있으며, 주사제의 경우에는 완충제, 보존제, 무통화제, 가용화제, 등장제, 안정화제 등을 혼합하여 사용할 수 있으며, 국소투여용의 경우에는 기제, 부형제, 윤활제, 보존제 등을 사용할 수 있다. 본 발명의 조성물의 제형은 상술한 바와 같은 약제학적으로 허용되는 담체와 혼합하여 다양하게 제조될 수 있다. 예를 들어, 경구투여시에는 정제, 트로키, 캡슐, 엘릭서(elixir), 서스펜션, 시럽, 웨이퍼 등의 형태로 제조할 수 있으며, 주사제의 경우에는 단위 투약 앰플 또는 다수회 투약 형태로 제조할 수 있다. 기타, 용액, 현탁액, 정제, 캡슐, 서방형 제제 등으로 제형할 수 있다.
한편, 제제화에 적합한 담체, 부형제 및 희석제의 예로는, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말디톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 또는 광물유 등이 사용될 수 있다. 또한, 충진제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제, 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 조성물의 투여 경로는 이들로 한정되는 것은 아니지만 구강, 정맥내, 근육내, 동맥내, 골수내, 경막내, 심장내, 경피, 피하, 복강내, 비강내, 장관, 국소, 설하 또는 직장이 포함된다. 경구 또는 비경구 투하가 바람직하다. 본원에 사용된 용어 "비경구"는 피하, 피내, 정맥내, 근육내, 관절내, 활액낭내, 흉골내, 경막내, 병소내 및 두개골내 주사 또는 주입기술을 포함한다. 본 발명의 약학적 조성물은 또한 직장 투여를 위한 좌제의 형태로 투여될 수 있다.
본 발명의 조성물은 사용된 특정 화합물의 활성, 연령, 체중, 일반적인 건강, 성별, 정식, 투여시간, 투여경로, 배출율, 약물 배합 및 예방 또는 치료될 특정 질환의 중증을 포함한 여러 요인에 따라 다양하게 변할 수 있고, 상기 조성물의 투여량은 환자의 상태, 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있고, 1일 0.0001 내지 500 mg/kg 또는 0.001 내지 500 mg/kg으로 투여할 수 있다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다. 본 발명에 따른 의약 조성물은 환제, 당의정, 캡슐, 액제, 겔, 시럽, 슬러리, 현탁제로 제형화될 수 있다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
[ 실시예 ]
실시예 1: 역분화줄기세포 유래 조혈모세포의 제조
1.1. 역분화줄기세포의 제조
역분화줄기세포(Induced Pluripotent Stem Cell; iPS)를 제조하기 위하여, 기관 IRB의 승인을 받아 질병을 가지고 있지 않은 정상인 기부자 두 명의 말초 혈액으로부터 각각 단핵세포를 분리하였다. 단핵세포를 분리하기 위하여, 혈액을 Ficoll Paque-PLUS(GE Healthcare)를 이용하여 2,000 rpm에서 30 분간 원심분리하여 단핵세포를 분리하고, 분리된 단핵세포는 StemSpan cc110이 첨가된 StemSpan-ACF(Stem Cell Technologies)에서 4 일 동안 배양하였다. 그리고 vitronectin이 코팅된 24-웰 플레이트에 단핵구 세포를 다시 재접종하고, CytoTune®2.0 Reprogramming kit(Invitrogen)을 이용하여 역분화줄기세포를 제조하였다. 형질도입 후 12 일이 경과하고 역분화줄기세포 콜로니가 형성된 후에, 수동 피킹 방식으로 콜로니를 개별적으로 vitronectin이 코팅된 플레이트에 역분화줄기세포를 접종하고, mTeSR1 배지(Stem Cell Technologies)를 이용하여 배양하며 특성화를 위해 확대시켰다. 이를 통하여, 정상인 기부자 두 명으로부터 각각 KW 군(KW, c1, p-27)과 BM 군(BM, No-2, c1, P-14) 두 종류의 역분화줄기세포를 획득하였다.
1.2. 역분화줄기세포 유래 조혈모세포의 제조
역분화줄기세포 유래 조혈모세포(iPS derived Hematopoietic stem cell; iPS-HSC)를 제조하기 위하여, vitronectin이 코팅된 24-웰 플레이트에 mTeSR1 배지를 첨가하고 실시예 1.1과 동일한 방법으로 제조된 역분화줄기세포 KW 군과 BM 군을 각각 1 X 104 cells의 농도로 접종하고 24 시간 동안 배양하였다. 그리고 24 시간 후에 50 ng/mL의 골형성단백질4(Bone morphogenetic protein 4; BMP4)가 첨가된 STEMdiffTM APELTM 2 배지(Stem cell Technologies, Cat# 05270)로 교체하고 2 일 동안 배양하였다. 그리고 50 ng/mL의 혈관내피성장인자(vascular endothelial growth factor; VEGF) 및 50 ng/mL의 염기성 섬유아세포성장인자(Basic fibroblast growth factor; bFGF)가 첨가된 STEMdiffTM APELTM 2 배지로 교체하여 2 일 동안 다시 배양하였다. 그리고 5 μM의 SB431542, 50 ng/mL의 VEGF, 및 50 ng/mL의 bFGF가 첨가된 STEMdiffTM APELTM 2 배지로 교체하여 2 일 동안 추가로 배양한 후에, 50 ng/mL의 줄기세포인자(Stem cell factor; SCF), 50 ng/mL의 트롬보포이에틴(Thrombopoietin; TPO), 및 50 ng/mL의 인터루킨-3(Interleukin-3; IL-3)이 첨가된 STEMdiffTM APELTM 2 배지로 교체하여 2 일 동안 배양하였다. 그리고 이틀 간격으로 50 ng/mL의 SCF, 50 ng/mL의 TPO, 및 50 ng/mL의 IL-3이 첨가된 새로운 STEMdiffTM APELTM 2 배지로 교체하며 13 일 동안 배양하였다. 그리고 상등액을 수거하고 300 x g에서 10 분간 원심분리하여 상등액으로 방출된 세포를 획득한 후, StemSpanTM SFEM Ⅱ 배지(Stem Cell Technologies, Cat# 09605)를 기본으로 하여, StemSpan™CC110(Stem cell Technologies, Cat# 02697)를 첨가하거나, 또는 10 ng/mL의 Flt3L(FMS-like tyrosine kinase 3 ligand), 10 ng/mL의 SCF, 10 ng/mL의 TPO, 10 ng/mL의 IL-3, 및 10 ng/mL의 인터루킨-6(Interleukin-6; IL-6)의 조합을 첨가하고, 각각의 배지에 재접종하고 6 일 동안 추가 배양하였다. 배양하는 동안 이틀 간격으로 새로운 배지로 교체하였다. 전반적인 실험방법은 도 1에 나타내었다. 역분화줄기세포 유래 조혈모세포의 생성은 광학 현미경을 통하여 매일 관찰하였으며, 그 결과는 도 2에 나타내었다.
도 2에 나타난 바와 같이, KW 군과 BM 군 모두 5 일까지는 역분화줄기세포의 콜로니 형태로 자라다가, 7 일 이후로 형태가 변하기 시작하였다. 그리고 14 일까지는 미분화된 endothelial spread 형태가 보이나, 17 일 이후에는 모두 단일 세포 형태의 조혈모세포로 분화된 것을 확인할 수 있었으며, 특별히, Flt3L, SCF, TPO, IL-3, 및 IL-6를 첨가한 배지에서 배양한 경우에 더 높은 조혈모세포로의 분화 효율을 보이는 것을 확인할 수 있었다.
1.3. 제조된 역분화줄기세포 유래 조혈모세포의 확인
실시예 1.2와 동일한 방법으로 제조된 역분화줄기세포 유래 조혈모세포의 특성을 확인하기 위하여, 조혈모세포의 마커로 알려져 있는 CD34, CD43, 및 CD45의 발현 여부를 면역형광염색법으로 확인하였다. 보다 자세하게는, 단일클론항체인 anti-CD34-PE(eBioscience), anti-CD43-APC(eBioscience), anti-CD45-FITC(eBioscience), anti-CD33-percp cy5.5(eBioscience), 및 anti-CD10-Briliant violet 510(eBioscience)을 세포에 처리하고 반응시킨 후에, 인산염완충용액(phosphate buffered saline; PBS)을 이용하여 결합되지 않은 항체를 제거하고 유세포분석기(FACS Calibur)를 이용하여 형광을 측정하였다. 마커의 확인은 분화 13 일째와 19 일째의 세포를 획득하여 확인하였다. 그리고 13 일째와 비교하여 19 일째, 각각의 분화 비율의 평균을 확인하였다. 통계적 유의성은 Student's t-test로 확인하였고, P < 0.05이면, 통계적으로 유의성이 있다고 판단하였다. 그 결과는 표 1 및 도 3에 나타내었다.
CD34+CD45+/ total cells CD43+CD45+/total cells CD33+/CD45+ CD10+/CD45+
Control(Day 13) 1 1 1 1
CC110 1.44 1.12 1.2 0.36
Flt3L+SCF+IL-3+TPO+IL-6 2.01 1.32 0.58 0.16
표 1 및 도 3에 나타난 바와 같이, CC110을 첨가한 배지에서 배양한 경우와 비교하여, Flt3L+SCF+IL3+TPO+IL6를 첨가한 배지에서 배양한 경우에 조혈모세포의 마커인 CD34 양성 및 CD45 양성인 세포와 CD43 양성 및 CD45 양성인 세포의 수가 전체 세포 수 중에서 유의성있게 증가된 것을 확인하였다. 또한, CC110이 첨가된 배지에서는 CD45 양성 세포 중에서 CD33 양성 세포의 비율이 증가되었으나, Flt3L+SCF+IL3+TPO+IL6를 첨가한 배지에서 배양한 경우에는 CD45 양성 세포 중에서 CD33 양성 세포의 비율 및 CD10 양성 세포의 비율이 현저히 감소된 것을 확인하였다. 상기 결과를 통하여, 본원 발명의 방법으로 역분화줄기세포를 이용하여 조혈모세포를 분화시키는 경우, 역분화줄기세포 유래 조혈모세포를 높은 효율로 제조할 수 있다는 것을 확인할 수 있었다.
전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.

Claims (11)

  1. 하기 단계를 포함하는 역분화줄기세포 유래 조혈모세포의 제조 방법:
    (a) 역분화줄기세포를 골형성단백질4(BMP4)가 첨가된 배지에서 배양하는 단계;
    (b) 상기 (a) 단계의 배양된 세포를 혈관내피성장인자(VEGF) 및 염기성 섬유아세포성장인자(bFGF)가 첨가된 배지로 교체하여 배양하는 단계;
    (c) 상기 (b) 단계의 배양된 세포를 SB431542, 혈관내피성장인자, 및 염기성 섬유아세포성장인자가 첨가된 배지로 교체하여 배양하는 단계;
    (d) 상기 (c) 단계의 배양된 세포를 줄기세포인자(SCF), 트롬보포이에틴(TPO), 및 인터루킨-3(IL-3)이 첨가된 배지로 교체하여 배양하는 단계;
    (e) 상기 (d) 단계의 배양된 세포의 배양 상등액을 수거하는 단계;
    (f) 상기 수거된 상등액에 포함되어 있는 세포를 분리하는 단계; 및
    (g) 상기 분리된 세포를 Flt3L(FMS-like tyrosine kinase 3 ligand), 줄기세포인자(SCF), 트롬보포이에틴(TPO), 인터루킨-3(IL-3), 및 인터루킨-6(IL-6)가 첨가된 배지에서 배양하는 단계.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 (a) 단계는 골형성단백질4가 30 내지 70 ng/mL의 농도로 첨가되며, 1 내지 3 일 동안 배양하는 것을 특징으로 하는, 방법.
  3. 제 1 항에 있어서,
    상기 (b) 단계는 혈관내피성장인자가 30 내지 70 ng/mL의 농도로 첨가되며, 염기성 섬유아세포성장인자가 30 내지 70 ng/mL의 농도로 첨가되며, 1 내지 3 일 동안 배양하는 것을 특징으로 하는, 방법.
  4. 제 1 항에 있어서,
    상기 (c) 단계는 SB43154가 3 내지 7 μM의 농도로 첨가되며, 혈관내피성장인자가 30 내지 70 ng/mL의 농도로 첨가되며, 염기성 섬유아세포성장인자가 30 내지 70 ng/mL의 농도로 첨가되며, 1 내지 3 일 동안 배양하는 것을 특징으로 하는, 방법.
  5. 제 1 항에 있어서,
    상기 (d) 단계는 줄기세포인자가 30 내지 70 ng/mL의 농도로 첨가되며, 트롬보포이에틴이 30 내지 70 ng/mL의 농도로 첨가되며, 인터루킨-3이 30 내지 70 ng/mL의 농도로 첨가되며, 4 내지 8 일 동안 배양하는 것을 특징으로 하는, 방법.
  6. 제 1 항에 있어서,
    상기 (g) 단계는 Flt3L이 1 내지 20 ng/mL의 농도로 첨가되며, 줄기세포인자가 1 내지 20 ng/mL의 농도로 첨가되며, 트롬보포이에틴이 1 내지 20 ng/mL의 농도로 첨가되며, 인터루킨-3이 1 내지 20 ng/mL의 농도로 첨가되며, 및 인터루킨-6가 1 내지 20 ng/mL의 농도로 첨가되며, 5 내지 9 일 동안 배양하는 것을 특징으로 하는, 방법.
  7. 제 1 항에 있어서,
    상기 배지는 줄기세포 배양용 배지인 것을 특징으로 하는, 방법.
  8. 제 1 항에 있어서,
    상기 조혈모세포는 CD34+, CD43+ 또는 CD45+의 면역학적 특성을 나타내는 것을 특징으로 하는, 방법.
  9. 제 1 항에 있어서,
    상기 역분화줄기세포는 인간 말초혈액에서 분리된 세포로부터 제조되는 것을 특징으로 하는, 방법.
  10. 제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항의 방법으로 제조된, 역분화줄기세포 유래 조혈모세포.
  11. 제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항의 방법으로 제조된 역분화줄기세포 유래 조혈모세포를 유효성분으로 포함하는, 조혈모세포 이식용 조성물.
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