KR20200090873A - 란티오닌 c-유사 단백질 2 리간드 및 이와 함께 제조된 세포를 이용한 치료법 - Google Patents

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KR20200090873A
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disease
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조셉 바사가냐-리에라
앤드류 레버
라켈 혼테칠라스
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란도스 바이오파마, 인크.
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Abstract

란티오닌 합성효소 C- 유사 단백질 2 경로를 표적화하는 화합물 및 상기 화합물과 시험관 내에서 제조된 면역 세포와 같은 세포가 제공된다. 상기 화합물 및 세포는 다른 것들 중에서 감염성 질환, 과증식성 장애, 선천 대사 장애, 만성 면역대사 질환, 자가 면역 질환, 장기 이식 거부, 염증성 장애, 및 만성 통증을 포함하는 다수의 상태를 치료하는 데 사용될 수 있다.

Description

란티오닌 C-유사 단백질 2 리간드 및 이와 함께 제조된 세포를 이용한 치료법
본 발명은 질환 및 장애에 대한 의학적 치료 분야에 관한 것이다. 더 상세하게는, 본 발명은 다른 것들 중에서 감염성 질환, 과증식성 장애, 선천 대사 장애, 만성 면역대사 질환, 자가 면역 질환, 장기 이식 거부, 염증성 장애, 및 만성 통증과 같은 상태를 치료 및 예방하는 데 사용될 수 있는 생물학적 활성 화합물의 부류 및 이와 함께 제조된 세포에 관한 것이다.
란티오닌 합성효소 C-유사 단백질 2(LANCL2)("란티오닌 C-유사 단백질 2" 또는 "란티오닌 합성효소 성분 C-유사 단백질 2")는 신체 전체를 통해서 및 특히 위장관 및 면역 시스템, 신경 시스템 및 내분비 시스템의 세포 내에서 발현되는 신호전달 단백질이다. LANCL2의 활성화는 세포의 대사 과정을 변화시키고 항 염증성 사이토카인을 증가시키면서 사이토카인 및 케모카인과 같은 염증 매개체의 생성을 감소시키는 역할을 한다. 이전에, 이러한 효과는 당뇨병 모델의 포도당 내성에서부터 염증성 장 질환 모델의 장 염증 감소에 이르는 효과를 시험 관내 및 생체 내 시스템에서 조사하였다.
세포 대사는 면역 세포가 염증 서브세트로 분화하고, 증식하며, 염증성 사이토카인 및 매개체를 생산하는 능력을 제어한다(O'Neill, L.A., R.J. Kishton, and J. Rathmell, A guide to immunometabolism for immunologists. Nat Rev Immunol, 2016. 16(9): p. 553-65). 면역과 대사 양쪽 모두를 대상으로 하는 치료법은 암과 같은 질환에 대한 임상 시험에서 성공하고 있다(Mullard, A., Cancer metabolism pipeline breaks new ground. Nat Rev Drug Discov, 2016. 15(11): p. 735-737). BT-11 뒤의 작용 기전인 LANCL2의 활성화는 염증에서 그 역할을 발견하기 전에 천연 및 식이 화합물 ABA에 대한 수용체(Sturla, L., et al., LANCL2 is necessary for abscisic acid binding and signaling in human granulocytes and in rat insulinoma cells. J Biol Chem, 2009. 284(41): p. 28045-57) 및 대사 호르몬의 생성을 위한 신호 변환기(Lu, P., et al., Computational modeling-based discovery of novel classes of anti-inflammatory drugs that target lanthionine synthetase C-like protein 2. PLoS One, 2012. 7(4): p. e34643)로서 비 면역 세포에서 대사 효과를 발휘하는 것으로 처음 밝혀졌다. LANCL2의 대사 작용과 면역 작용 사이의 결합은 BT-11과 LANCL2를 표적으로 하는 다른 새로운 화합물의 중요한 작용 기전이다.
본 발명은 다양한 세포에서 유리한 면역 대사 반응을 유도하기 위해 LANCL2를 표적화, 결합 및 활성화시키는 것으로 확인된 일련의 부류의 화합물의 다른 것들 중에서 감염성 질환, 과증식성 장애, 선천 대사 장애, 만성 면역대사 질환, 자가 면역 질환, 장기 이식 거부, 염증성 장애, 및 만성 통증을 포함하지만 이에 한정되지 않는 질환 상태의 치료에의 용도를 제공한다.
본 발명은 질환 및 장애에 대한 의학적 치료 분야에 관한 것이다. 더 상세하게는, 본 발명은 세포에서 유리한 면역대사 효과의 활성화용 화합물의 부류의 다른 것들 중에서 감염성 질환, 과증식성 장애, 선천 대사 장애, 만성 면역대사 질환, 자가 면역 질환, 장기 이식 거부, 염증성 장애, 및 만성 통증의 치료에의 용도에 관한 것이다.
본원에 기재된 치료에 사용되는 화합물은 화학식 Z-Y-Q-Y'-Z'의 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염 또는 에스테르를 포함하고, 상기 식에서
Z는:
Figure pct00001
이고;
Y는:
Figure pct00002
이고;
Q는 피페라진-1,4-다이일; 2,5-다이아자바이사이클로[2.2.1]헵탄-2,5-다이일; 2,5-다이아자바이사이클로[2.2.2]옥탄-2,5-다이일; 1,4-다이아제판-1,4-다이일; 벤젠-1,4-다이아민-N1,N4-다이일; 에탄-1,2-다이아민-N1,N2-다이일; N1,N2-다이알킬에탄-1,2-다이아민-N1,N2-다이일; 프로판-1,3-다이아민-N1,N3-다이일; N1,N3-다이알킬프로판-1,3-다이아민-N1,N3-다이일; 1,4-다이아미노안트라센-9,10-다이온-1,4-다이일; C6 아렌-1,4-다이아민-N1,N4-다이일로서, 상기 아렌은 2, 3, 5, 또는 6 위치에서 1 내지 4개의 치환기로 치환되고, 그리고 상기 치환기는 ―C(O)O(C1 내지 C6)알킬, OH, O(C1 내지 C6)알킬, (C1 내지 C6)알킬, CF3, F, Cl, 및 Br로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되며; 또는 치환된 피페라진-1,4-다이일이며, 상기 피페라진은 2, 3, 5, 또는 6 위치에서 1 내지 8개의 치환기로 치환되고, 그리고 상기 치환기는 (C1 내지 C6)알킬, 아릴, 아릴(C1 내지 C6)알킬, C(O)OH, 및 C(O)O(C1 내지 C6)알킬이며;
Y′는:
Figure pct00003
또는 단일 결합이고; 및
Z′는:
Figure pct00004
또는 R5이고;
상기 식에서
Y′는 Z′가 R5일 경우에만 단일 결합이고;
존재한다면, A1 및 A1′는 각각 독립적으로 N, N(C1 내지 C6)알킬, O, S, 또는 CR6이고;
존재한다면, A2 및 A2′는 각각 독립적으로 N 또는 CR7이고;
존재한다면, A3 및 A3′는 각각 독립적으로 NR8, O, 또는 S이고;
존재한다면, A4 및 A4′는 각각 독립적으로 N 또는 CR9이고;
존재한다면, A5 및 A5′는 각각 독립적으로 N 또는 CR10이고;
존재한다면, A6 및 A6′는 각각 독립적으로 N 또는 CR11이고;
존재한다면, R1, R1′, R2, R2′, R3, R3′, R4, R4′, R5, R6, R7, R8, R9, R10, 및 R11은, 각각의 경우에 수소; 알킬; 할로; 트라이플루오로메틸; 다이알킬아미노로서, 각각의 알킬은 독립적으로 선택된 다이알킬아미노; ―NH2; 알킬아미노; 아릴알킬; 헤테로아릴알킬.; 헤테로사이클로알킬; ―C(O)OH, ―C(O)O(C1 내지 C6)알킬, (C1 내지 C6)알킬, ―CF3, F, Cl, 및 Br로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된 1 내지 2개의 치환기로 치환되는 치환된 헤테로사이클로알킬; 및 치환된 헤테로아릴알킬로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되고;
상기 치환된 헤테로아릴알킬은 ―NH2; ―NH(C1 내지 C6)알킬; ―N((C1 내지 C6)알킬)2로서, 각각의 알킬은 독립적으로 선택된 ―N((C1 내지 C6)알킬)2; 알킬; 할로; 아릴; ―SO2R12, ―OR13, -할로, ―CN, ―CF3, 아미노알킬-, ―S(O)R14, 및 알킬로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된 1 내지 3개의 치환기로 치환되는 치환된 아릴; 헤테로사이클로알킬; 헤테로아릴; 알킬, ―CF3, F, Cl, 및 Br로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된 1 내지 3개의 치환기로 치환되는 치환된 아릴; 알킬아미노-; 헤테로사이클로알킬-알킬-아미노-; 알킬아미노알킬아미노-; ―NHC(O)OR15; ―NHC(O)NR16R17; ―C(O)NR16R17; 및 알킬, 할로, CN, NH2, ―NH(C1 내지 C6 알킬), ―N(C1 내지 C6 알킬)2로서, 각각의 알킬은 독립적으로 선택된 ―N(C1 내지 C6 알킬)2, ―CF3, 및 ―S(O)2R15 및 ―CN으로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된 1 내지 3개의 치환기로 치환되는 치환된 아릴로 이루어진 군으로부터 선택된 1 내지 3개의 치환기로 치환되는 치환된 헤테로아릴로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된 1 내지 3개의 치환기로 치환되며;
R12, R13, R14, R15, R16, 및 R17은 C1 내지 C6알킬, 독립적으로 선택된 C1 내지 C6 알킬을 포함하는 다이알킬아미노, ―NH2, 알킬아미노, 헤테로사이클로알킬, 및 ―C(O)O(C1 내지 C6 알킬) 및 ―C1 내지 C6 알킬로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된 1 내지 2개의 치환기로 치환되는 치환된 헤테로사이클로알킬로 이루어진 군으로부터 각각 독립적으로 선택된다.
일부 화합물에서, A4는 N이다. 일부 화합물에서, A3는 NR8이며 A4는 N이다. 일부 화합물에서, A3 및 A3′ 중 적어도 하나는 O 또는 S이다. 일부 화합물에서, A1 및 A1′ 중 하나 또는 양쪽 모두는 N이다. 일부 화합물에서, 존재한다면, A5 및 A5'는 각각 독립적으로 CR10이며, 존재한다면, A6 및 A6'는 각각 독립적으로 CR11이다. 일부 화합물에서, A1, A2, A1', 및 A2' 중 적어도 하나는 N이다. 일부 화합물에서, A2 및 A2′ 중 하나 또는 양쪽 모두는 CH이고, A3는 NH이고, A4는 N이고, A5는 CH이며, A6는 CH이다. 일부 화합물에서, A2 및 A2′ 중 하나 또는 양쪽 모두는 CH이고, A3 및 A3′ 중 하나 또는 양쪽 모두는 NH이고, A4 및 A4′ 중 하나 또는 양쪽 모두는 N이고, A5 및 A5′ 중 하나 또는 양쪽 모두는 CH이며, A6 및 A6′ 중 하나 또는 양쪽 모두는 CH이다. 일부 화합물에서, Q는 피페라진-1,4-다이일; 2,5-다이아자바이사이클로[2.2.1.]헵탄-2,5-다이일; 2,5-다이아자바이사이클로[2.2.2]옥탄-2,5-다이일; 1,4-다이아제판-1,4-다이일; N1,N2-다이알킬에탄-1,2-다이아민-N1,N2-다이일; N1,N3-다이알킬프로판-1,3-다이아민-N1,N3-다이일; 1,4-다이아미노안트라센-9,10-다이온-1,4-다이일; C6 아렌-1,4-다이아민-N1,N4-다이일로서, 상기 아렌은 2, 3, 5, 또는 6 위치에서 1 내지 4개의 치환기로 치환되고, 각각의 치환기는 ―C(O)O(C1 내지 C6)알킬, OH, O(C1 내지 C6)알킬, (C1 내지 C6)알킬, CF3, F, Cl, 및 Br로 이루어진 군으로 독립적으로 치환되는, 아렌-1,4-다이아민-N1,N4-다이일; 또는 치환된 피페라진-1,4-다이일로서, 상기 피페라진은 2, 3, 5, 또는 6 위치에서 1 내지 8개의 치환기로 치환되고, 각각의 치환기는 (C1 내지 C6)알킬, 아릴, 아릴(C1 내지 C6)알킬, C(O)OH, 및 C(O)O(C1 내지 C6)알킬로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되는, 치환된 피페라진-1,4-다이일이다. 일부 화합물에서, 존재한다면, R1, R1', R2, R2', R3, R3', R4, R4', R5, R6, R7, R8, R9, R10, 및 R11은 각각의 경우에 수소, 알킬, 할로, 트라이플루오로메틸, 다이알킬아미노로서, 각각의 알킬은 동일하거나 상이한 다이알킬아미노, ―NH2, 알킬아미노, 아릴, 및 아릴알킬로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된다.
본원에 기재된 치료법에서 사용에 적합한 다른 화합물은 화학식 A-B-C를 포함하는 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염 또는 에스테르를 포함하고, 상기 식에서
A는:
Figure pct00005
또는
Figure pct00006
이고;
B는:
Figure pct00007
,
Figure pct00008
, 또는
Figure pct00009
이고; 및
C는:
Figure pct00010
,
Figure pct00011
,
Figure pct00012
, 또는
Figure pct00013
이며,
상기 식에서
A7, A8, A9, A10, A11, A12, A13, 및 A14는 CH, CR18, 및 N으로부터 각각 독립적으로 선택되고;
A15, A16, A17, A18, A19, 및 A20은 CH, CR19, N, NR20, O, 및 S으로부터 각각 독립적으로 선택되며, 단, A15, A16, 및 A17 중 하나만 N, NR20, O, 또는 S일 수 있으며 A18, A19, 및 A20 중 하나만 N, NR20, O, 또는 S일 수 있고;
R18 및 R19는 C1 내지 C6 알킬; C1 내지 C6 다이알킬아미노로서, 각각의 C1 내지 C6 알킬은 독립적으로 선택되는, C1 내지 C6 다이알킬아미노; ―NH2; 알킬아미노; 헤테로사이클로알킬; 및 치환된 헤테로사이클로알킬로서, 상기 치환된 헤테로사이클로알킬은: ―C(O)O(C1 내지 C6 알킬) 및 C1 내지 C6 알킬로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된 1 내지 2개의 치환기로 치환되는, 치환된 헤테로사이클로알킬로부터 각각 독립적으로 선택되며, 상기 식에서 하나 초과의 CR18을 갖는 화합물에서 각각의 R18은 독립적으로 선택되며, 하나 초과의 CR19를 갖는 화합물에서 각각의 R19는 독립적으로 선택되며; 및
R20은 C1 내지 C6 알킬이다.
본원에 기재된 치료법에서 사용에 적합한 다른 화합물은 미국 특허 제9,556,146호에 개시된 임의의 화학식에 기재되거나 포함된 임의의 화합물을 포함한다. 미국 특허 제9,556,146호는 그 전체 내용이 본원에 인용되어 포함된다.
본 발명은 본원에 기재된 임의의 하나 이상의 화합물로 동물의 상태를 치료하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 유효량의 본원에 기재된 하나 이상의 화합물을 상기 동물에게 투여하는 단계를 포함할 수 있다.
본 발명은 또한 본원에 기재된 화합물을 사용하여 전구체 세포로부터 제조된 세포를 생성하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 시험관 내 상기 전구체 세포를 본원에 기재된 하나 이상의 화합물과 접촉시켜 상기 제조된 세포를 생성하는 단계를 포함할 수 있다.
본 발명은 또한 시험관 내 세포를 본원에 기재된 하나 이상의 화합물과 접촉시켜 제조된 세포를 생성함으로써 생성된 단리된 세포를 제공한다.
본 발명은 또한 본원에 기재된 바와 같이 제조된 세포로 동물의 상태를 치료하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 상기 상태를 치료하기에 충분한 양으로 제조된 세포를 상기 동물에게 투여하는 단계를 포함한다.
본원에 기재된 화합물 또는 세포로 치료할 수 있는 상태는 감염성 질환, 과증식성 장애, 선천 대사 장애, 만성 면역대사 질환, 자가 면역 질환, 장기 이식 거부, 염증성 장애, 및 만성 통증을 포함할 수 있다. 일부 버전에서, 상기 감염성 질환은 박테리아성 질환을 포함한다. 일부 버전에서, 상기 박테리아성 질환은 클로스트리디움 디피실(C. Difficile) 감염을 포함한다. 일부 버전에서, 상기 과증식성 장애는 암을 포함한다. 일부 버전에서, 상기 암은 위장관의 암을 포함한다. 일부 버전에서, 상기 위장관의 암은 대장암을 포함한다. 일부 버전에서, 상기 과증식성 장애는 가족성샘종폴립증(familial adenomatous polyposis)을 포함한다. 일부 버전에서, 상기 선천 대사 장애는 글리코겐 축적병(glycogen storage disease)을 포함한다. 일부 버전에서, 상기 당원 축적병은 안데르센병(Andersen disease)을 포함한다. 일부 버전에서, 상기 만성 면역대사 질환은 심혈관 질환을 포함한다. 일부 버전에서, 상기 심혈관 질환은 죽상 동맥 경화증을 포함한다. 일부 버전에서, 상기 만성 면역대사 질환은 고혈압을 포함한다. 일부 버전에서, 상기 자가 면역 질환은 루푸스 및 다발성 경화증 중 적어도 하나를 포함한다. 일부 버전에서, 상기 자가 면역 질환은 암-면역요법-유도된 자가 면역 질환을 포함한다. 일부 버전에서, 상기 암-면역요법-유도된 자가 면역 질환은 암 면역요법-유도된 류마티스성 질환을 포함한다. 일부 버전에서, 상기 염증성 장애는 급성 대장 게실염을 포함한다. 일부 버전에서, 상기 염증성 장애는 위장관의 방사선-유도된 염증을 포함한다. 일부 버전에서, 상기 위장관의 방사선-유도된 염증은 방사선 직장염, 방사선 장염, 및 방사선 직장 S상 결장염 중 적어도 하나를 포함한다. 일부 버전에서, 상기 만성 통증은 섬유근육통을 포함한다. 일부 버전에서, 상기 상태는 크론병 또는 궤양성 대장염과 같은 염증성 장 질환을 포함한다.
본 발명의 목적 및 장점은 첨부 도면과 관련하여 이루어진 본 발명의 바람직한 실시형태에 대한 하기 상세한 설명으로부터 더욱 완전하게 나타날 것이다.
도 1a 내지 1f. BT-11은 대장염의 Mdr1a-/-모델에서 질환 발생을 억제한다. BT-11는 질병 활성 지수를 감소시킨다(도 1a, 패널 A). 비히클(도 1a, 패널 B) 및 BT-11 처리된(도 1a, 패널 C) 동물에서 10 주령에 H&E 염색된 대장 섹션의 대표적인 현미경 사진. 각각 10 주령의 대장 고유판(도 1b, 패널 D 내지 F) 및 장간막 림프절(도 1c, 패널 G 내지 I)에서 Th1(CD3+ CD4+ CD8- NK1.1- Tbet+ IFNγ+), Th17(CD3+ CD4+ CD8- NK1.1- RORγT+ IL17+), 및 Treg(CD3+ CD4+ CD25+ FOXP3+ IL10+) 세포의 면역표현형 검사. β- 액틴으로 정규화된 Ifnγ(도 1d, 패널 J), Il17a(도 1d, 패널 K), Mcp1(도 1e, 패널 L), Tnfa(도 1e, 패널 M), Lancl2(도 1f, 패널 N), 및 Il6(도 1f, 패널 O)의 전체 대장의 qRT-PCR. *(P<0.05) 및 **(P<0.01)로 표시된 처리군(n=10)에 의한 통계적 유의성.
도 2a 내지 2c. CD4+ T 세포에서 Lancl2의 손실은 DSS 모델에서 BT-11 효과를 제거한다. DSS에 의한 7일간의 챌린지 이후에 3일간의 표준수에 걸친 질병 지수(도 2a, 패널 A) 및 중량 변화(도 2a, 패널 B). 비히클 및 BT-11로 처리된 야생형 마우스 및 비히클 및 BT-11로 처리된 Lancl2ΔT 마우스에서 DSS 챌린지 7일째에 H&E 염색된 대장 섹션(도 2b, 패널 C)의 대표적인 현미경 사진. DSS 챌린지 7일째에 대장 고유판(도 2c, 패널 D 내지 F) 각각에서 Th1(CD3+ CD4+ CD8- NK1.1- Tbet+ IFNγ+), Th17(CD3+ CD4+ CD8- NK1.1- RORγT+ IL17+), 및 Treg(CD3+ CD4+ CD25+ FOXP3+ IL10+) 세포의 면역표현형 검사. β- 액틴으로 정규화된 Ifnγ(도 2c, 패널 G), Il17a(도 2c, 패널 H), Tnfa(도 2c, 패널 I), 및 Il6(도 2c, 패널 J)의 전체 대장의 qRT-PCR. *(P<0.05) 및 **(P<0.01)로 표시된 처리군(n=10) 및 #(P<0.05)로 표시된 유전자형(n=10)에 의한 통계적 유의성.
도 3a 내지 3c. BT-11은 조절 CD4+ T 세포를 통해 1차 효과를 발휘한다. 전이일로부터 전이 후 6주까지 무세포(none), WT, 또는 Lancl2-/- 조절 CD4+ T 세포와 조합된 Rag2-/- 마우스 전이된 WT(도 3a, 패널 A) 및 Lancl2-/-(도 3a, 패널 B) 이펙터(effector) CD4+ T 세포로부터의 질병 활성 지수. 조직병리학적 검사에 의해 전이 후 6 주에 대장 절편 내에서 백혈구 침윤의 요약된 점수(도 3b, 패널 C). 대장 고유판에서 각각 Th1 세포(CD3+ CD4+ CD8- NK1.1- Tbet+ IFNγ+) 및 호중구(Gr1hiCD11b+)의 면역표현형 검사(도 3b, 패널 D 및 E; 도 3c, 패널 F 내지 H). *(P<0.05) 및 **(P<0.01)로 표시된 처리군(n=10)에 의한 통계적 유의성.
도 4. BT-11은 시험관 내 분화된 Treg에서 증가된 안정성 및 억제 기능을 유도한다. BT-11로 처 된 시험관 내 분화된 Treg와 공배양된 CD4+ T 세포의 세포계량 비드 어레이에 의한 CFSE 염색(패널 A) 및 TNFα(패널 B) 및 IFNγ(패널 C) 생성에 의한 24시간 세포 증식의 측정(0, 0.00975, 0.039, 0.625 μM). BT-11로 48시간 처리한 후 Tregs 내에서 Socs2(패널 D), Irf7(패널 E), Ikzf2(패널 F), Capn3(패널 G), Lag3(패널 H), P2rx7(패널 I)의 유전자 발현. *(P<0.05) 및 **(P<0.01)로 표시된 처리군(n=9)에 의한 통계적 유의성.
도 5a 내지 5b. BT-11은 말기 해당(glycolysis)에 영향을 미쳐 Treg 분화에 영향을 준다. BT-11(0, 0.00975, 0.039, 0.625 μM)로 처리된 WT 및 Lancl2-/-Treg에서 Pkm2(도 5a, 패널 A) 및 Eno1(도 5a, 패널 B)의 유전자 발현. BT-11로 처리된 WT Treg에서 피루베이트 키나아제(도 5a, 패널 C) 및 피루베이트 탈수소효소(도 5b, 패널 F)의 효소 활성(0, 0.00975, 0.039, 0.156, 0.625 μM; 왼쪽에서 오른쪽). BT-11로 처리된 WT Treg애서 세포 내 PEP 농도(도 5b, 패널 D)(0, 0.00975, 0.039, 0.156, 0.625 μM; 왼쪽에서 오른쪽). PS-48 처리에 의한 세포 내 PEP 농도(도 5b, 패널 E) 및 피루베이트 탈수소효소 활성(도 5b, 패널 G)(0, 0.00975, 0.156 μM BT-11; 왼쪽에서 오른쪽). PS-48, 탑시가르긴(thapsigargin) 또는 DASA-58 및 BT-11의 존재하에 WT 및 Lancl2-/-CD4+ T 세포를 Treg으로의 분화(도 5b, 패널 H)(0, 0.00975, 0.039, 0.156, 0.625 μM; 왼쪽에서 오른쪽). *(P<0.05) 및 **(P<0.01)로 표시된 처리군(n=9)에 의한 통계적 유의성.
도 6a 내지 6c. BT-11의 면역대사 효과의 생체 내 검증. PS-48 투여의 유무에 관계없이 각각 비히클(도 6a, 패널 A, C) 및 BT-11 처리된(도 6a, 패널 B, D) 마우스에서 10 주령에 H&E 염색된 대장 섹션의 대표적인 현미경 사진. 10 주령에 대장의 조직학적 점수(도 6b, 패널 E 내지 G). 10 주령에 대장 고유판(도 6b, 패널 H 내지 J)에서 각각 총 CD4+, Treg(CD3+ CD4+ CD25+ FOXP3+ IL10+), Th17(CD3+ CD4+ CD8- NK1.1-RORγT+ IL17+) 세포의 면역표현형 검사. 10 주령에 전체 대장 내에서 PEP 농도(도 6c, 패널 K) 및 피루베이트 탈수소효소 활성(도 6c, 패널 L). β- 액틴으로 정규화된 Ifng(도 6c, 패널 M), Tnfa(도 6c, 패널 N), Foxp3-E2(도 6c, 패널 O), Foxp3(도 6c, 패널 P), Socs2(도 6c, 패널 Q), 및 Capn3(도 6c, 패널 R)의 전체 대장의 qRT-PCR. 패널 E 내지 R의 상태는 (왼쪽에서 오른쪽으로) 비히클, BT-11(8 mg/kg), PS-48이 있는 비히클, 및 PS-48이 있는 BT-11(8 mg/kg)이다. *(P<0.05) 및 **(P<0.01)로 표시된 처리군(n=10)에 의한 통계적 유의성.
도 7a 내지 7e. BT-11의 면역대사 효과의 인간 PBMC 검증. BT-11(0, 0.00975, 0.0195, 0.039, 0.156, 0.625 μM)로 24시간 배양 후 크론병 공여자로부터 PBMC 내의 IL10+(도 7a, 패널 A), FOXP3+(도 7a, 패널 B), TNFα+(도 7b, 패널 C), 및 IFNγ+(도 7b, 패널 D) 세포의 백분율. BT-11(0, 0.00975, 0.0195, 0.039, 0.156, 0.625 μM)로 24시간 배양 후 Lancl2의 침묵화 내 IL10+(도 7c, 패널 E) 및 IFNγ+(도 7c, 패널 F) 세포의 백분율. BT-11의 존재 하에 Treg으로 분화된 인간 PBMC로부터 단리된 나이브(naive) CD4+ T 세포 내에서 Lag3(도 7d, 패널 G), Socs2(도 7d, 패널 H), Irf7(도 7d, 패널 I), P2rx7(도 7d, 패널 J), Capn3(도 7d, 패널 K), Ikzf2 (도 7d, 패널 L)의 유전자 발현. 시험관 내 분화된 인간 Treg의 피루베이트 키나아제 활성(도 7e, 패널 M). BT-11(0, 0.00975, 0.0195, 0.039, 0.156, 0.625 μM) 및 탑시가르긴 또는 외부 PEP의 존재 하에 24시간 배양 후 FOXP3+(도 7e, 패널 N) 및 IFNγ+ (도 7e, 패널 O) 세포의 백분율. *(P<0.05) 및 **(P<0.01)로 표시된 처리군(n=9)에 의한 통계적 유의성.
도 8. LANCL2 리간드로서의 BT-11 처리 및 비감염 LANCL2 녹아웃 마우스에서의 클로스트리디움 디피실-감염된 마우스에서의 미생물군유전체(microbiome) 변화.
도 9. 대조군, 반코마이신-처리된, 및 BT-11-처리된 다진 고기 배지에서의 클로스트리디움 디피실 콜로니 형성 단위, 독소 A(TcdA) 및 독소 B(TcdB) 생산, 및 포자 형성.
도 10a 내지 10c. 클로스트리디움 디피실 감염의 염증, 사망률 및 중증도 감소에 있어서 BT-11의 효과.
도 11a 및 11b. IL-2 및 BT-11은 CD25+ FOXP3+ T 세포의 분화를 향상시킨다. 나이브 CD4+ T 세포를 야생형 마우스의 비장으로부터 단리하고 비히클 또는 BT-11(10, 100 nM) 처리의 존재 하에 조절 CD4+ T 세포로 분화시켰다. 유세포 분석법에 의해 표준 분화 배지 또는 IL-2(10 ng/mL)를 함유하는 분화 배지에서 CD25+ FOXP3+(도 11a, 패널 A) 및 CD25+ Tbet+(도 11b, 패널 B) 세포로의 분화. 유세포 분석법에 의해 표준 분화 배지 또는 IL-12(10 ng/mL)를 함유하는 분화 배지에서 CD25+ FOXP3+(도 11a, 패널 C) 및 CD25+ Tbet+(도 11b, 패널 D) 세포로의 분화. 데이터는 SEM이 있는 평균으로 표시된다(n = 8). 처리에 의한 통계적 유의성(P< 0.05)은 별표(*) 및 (#)에 의한 IL-2/IL-12의 존재로 표시된다.
도 12a 내지 12d. BT-11은 STAT5 인산화를 증가시켜 안정한 CD25+ 세포 분화를 확립한다. 활성 질환이 있는 동안 10 주령에서 비히클 및 BT-11 처리된 Mdr1a-/- 마우스의 대장으로부터 단리된 CD4+ T 세포에서 qRT-PCR에 의한 Stat5a(도 12a, 패널 A), Pten(도 12a, 패널 B), Foxo1(도 12a, 패널 C) 및 Phlpp1(도 12a, 패널 D)의 발현. IL-2(10 ng/mL) 또는 IL-12(10 ng/mL)이 있는 비히클 또는 BT-11(10, 100 nM)로 시험관 내 분화된 Treg에서 웨스턴 블롯에 의한 p-STAT5a(도 12b, 패널 E) 및 p-FOXO1(도 12b, 패널 F)의 정규화된 발현. 유세포 분석법에 의해 IL-2(10 ng/mL) 및 억제제 SF1670 또는 STAT5i를 함유하는 분화 배지에서 CD25+ FOXP3+(도 12c, 패널 G) 및 CD25+ Tbet+(도 12c, 패널 H) 세포로의 분화. 유세포 분석법에 의해 IL-12(10 ng/mL) 및 억제제 SF1670 또는 STAT5i를 함유하는 분화 배지에서 CD25+ FOXP3+(도 12d, 패널 I) 및 CD25+ Tbet+(도 12d, 패널 J) 세포로의 분화. 데이터는 SEM이 있는 평균으로 표시된다(n = 8). 처리에 의한 통계적 유의성(P< 0.05)은 별표(*) 및 (#)에 의한 억제제의 존재로 표시된다.
도 13. 조절 CD4+ T 세포의 생체 외 처리는 생체 내에서 증가된 조절 효과를 자극한다. 마우스를 생체 외에서 BT-11 또는 비히클로 12시간 동안 처리한 입양 전이된(adoptively transferred) 이펙터 T 세포(Teff) 및 조절 CD4+ T 세포(Treg)였다. BT-11-처리된 Treg를 받은 마우스는 이전 후 5 주에 대장 CD4+ T 세포 집단에서 더 낮은 누적 질환 활성(장 염증) 및 변이(shift)를 가진다.
그 자체 또는 다른 치환기의 일부로서, 용어 "알킬"은 달리 언급되지 않는 한, 완전히 포화된 직쇄, 분지쇄 또는 환형 탄화수소 라디칼 또는 이들의 조합을 의미하고, 지정된 탄소수를 갖는 2가 및 다가 라디칼을 포함할 수 있다(예를 들어, C1 내지 C10은 1 내지 10개의 탄소 원자를 포함하는 것을 의미한다). 알킬기의 예는 제한 없이 메틸, 에틸, n-프로필, 아이소프로필, n-부틸, t-부틸, 아이소부틸, sec-부틸, 사이클로헥실, (사이클로헥실)에틸, 사이클로프로필메틸, 및 이들의 동족체 및 이성질체, 예를 들어, n-펜틸, n-헥실, n-헵틸, n-옥틸 등을 포함한다. 용어 "알킬"은 달리 언급되지 않는 한, 또한 아래에서 "헤테로알킬" 및 "사이클로알킬"로 더 상세히 정의된 알킬의 이들 유도체를 포함한다.
용어 "알케닐"은 하나 이상의 이중 결합을 함유하는 것을 제외하고는 상기 정의된 바와 같은 알킬기를 의미한다. 알케닐기의 예는 비닐, 2-프로페닐, 크로틸, 2-아이소펜테닐, 2-(부타디에닐), 2,4-펜타디에닐, 3-(1,4-펜타디에닐) 등 및 더 높은 동족체 및 이성질체를 포함한다.
용어 "알키닐"은 하나 이상의 삼중 결합을 함유하는 것을 제외하고는 상기 정의된 바와 같은 알킬 또는 알케닐기를 의미한다. 알키닐기의 예는 더 높은 상동체 및 이성질체를 포함하여 에티닐, 1- 및 3-프로피닐, 3-부티닐 등을 포함한다.
용어 "알킬렌", "알케닐렌" 및 "알키닐렌"은 단독으로 또는 다른 치환기의 일부로서 ―CH2CH2CH2CH2―에 의해 예시되는 바와 같이, 각각 알킬, 알케닐, 또는 알키닐기로부터 유도된 2가 라디칼을 의미한다.
통상적으로, 알킬, 알케닐, 알키닐, 알킬렌, 알케닐렌 및 알키닐렌기는 1 내지 24개의 탄소 원자를 가질 것이다. 10개 이하의 탄소 원자를 갖는 이들 기는 본 발명에서 바람직하다. "저급 알킬" 또는 "저급 알킬렌"에서와 같이, 이들 기 중 임의의 것에 적용될 때, 용어 "저급"은 10 개 이하의 탄소 원자를 갖는 기를 나타낸다.
"치환된"은 하나 이상의 치환기, 예컨대 저급 알킬, 아릴, 아실, 할로겐(예를 들어, CF3와 같은 알킬할로), 하이드록시, 아미노, 알콕시, 알킬아미노, 아실아미노, 티오아미도, 아실옥시, 아릴옥시, 아릴옥시알킬, 머캅토, 티아, 아자, 옥소, 포화 및 불포화 환형 탄화수소, 헤테로사이클 등을 지칭한다. 이들 기는 알킬, 알케닐, 알키닐, 알킬렌, 알케닐렌, 및 알키닐렌 잔기의 임의의 탄소 또는 치환기에 부착될 수 있다. 또한, 이들 기는 탄소 사슬 자체에 펜던트되어 있거나 또는 그 자체에 통합될 수 있다.
용어 "아릴"은 다이아조, 메틸렌 또는 에틸렌 모이어티와 같은 공통기에 함께 융합되고, 공유 결합되거나 또는 연결된 단일 방향족 고리 다중 방향족 고리일 수 있는 방향족 치환기를 지칭하기 위해 본원에서 사용된다. 공통 연결기는 또한 벤조페논에서와 같은 카보닐일 수 있다. 방향족 고리(들)는 다른 것들 중에서, 예를 들어, 페닐, 나프틸, 바이페닐, 다이페닐메틸 및 벤조페논을 포함할 수 있다. 용어 "아릴"은 "아릴알킬" 및 "치환된 아릴"을 포함한다. 페닐기의 경우, 아릴 고리는 모노-, 다이-, 트라이-, 테트라-, 또는 펜타-치환될 수 있다. 더 큰 고리는 비치환되거나 하나 이상의 치환기를 가질 수 있다.
"치환된 아릴"은 저급 알킬, 아실, 할로겐, 알킬할로(예컨대, CF3), 하이드록시, 아미노, 알콕시, 알킬아미노, 아실아미노, 페녹시, 머캅토, 및 방향족 고리(들)에 융합되고, 다이아조, 메틸렌, 또는 에틸렌 모이어티와 같은 공통기에 공유 결합되거나 또는 연결된 포화 및 불포화 환형 탄화수소와 같은 하나 이상의 작용기를 포함하는 것으로 방금 기재된 것과 같은 아릴을 지칭한다. 상기 연결기는 또한 사이클로헥실 페닐 케톤에서와 같이 카르보닐일 수 있다. 용어 "치환된 아릴"은 "치환된 아릴알킬"을 포함한다.
용어 "할로겐" 또는 "할로"는 불소, 브롬, 염소 및 요오드 원자를 지칭하기 위해 본원에서 사용된다.
용어 "하이드록시"는 ―OH기를 지칭하기 위해 본원에서 사용된다.
용어 "아미노"는 NRR '로 상기 식에서, R 및 R'은 독립적으로 H, 알킬, 알케닐, 알키닐, 아릴, 또는 이들의 치환된 유사체인 NRR '를 나타내는 데 사용된다. "아미노"는 2차 및 3차 아민을 나타내는 "알킬아미노" 및 RC(O)NR′기를 나타내는 "아실아미노"를 포함한다.
본 발명의 방법의 과정에서, 치료학적 유효량의 본 발명의 화합물은 많은 방식으로 포유류 및 인간을 포함한 동물에게 투여될 수 있다. 바람직한 실시형태에서, 본 발명의 화합물은 경구적으로 또는 비경구적으로 투여되지만, 의학적 화합물 또는 에어로졸과 같은 다른 형태의 투여가 또한 고찰된다.
경구 투여의 경우, 유효량의 화합물은 예를 들어, 고체, 반고체, 액체, 또는 기체 상태로 투여될 수 있다. 구체적인 예는 정제, 캡슐제, 분말제, 과립제, 용액제, 현탁액제, 시럽제 및 엘릭서제를 포함한다. 그러나, 상기 화합물은 이 형태에 한정되지 않는다.
본 발명의 화합물을 정제, 캡슐제, 분말제, 과립제, 용액제 또는 현탁액제로 제제화하기 위해, 상기 화합물은 바람직하게는 결합제, 붕해제 및/또는 윤활제와 혼합된다. 필요한 경우, 생성된 조성물은 공지된 방법을 사용하여 희석제, 완충제, 침투제, 보존제 및/또는 향미제와 혼합될 수 있다. 상기 결합제의 예는 결정질 셀룰로오스, 셀룰로오스 유도체, 옥수수 전분, 사이클로덱스트린, 및 젤라틴을 포함한다. 상기 붕해제의 예는 옥수수 전분, 감자 전분, 및 나트륨 카르복시메틸셀룰로오스를 포함한다. 상기 윤활제의 예는 활석 및 스테아르산 마그네슘을 포함한다. 또한, 유당 및 만니톨과 같이 종래에 사용된 첨가제가 또한 사용될 수 있다.
본 발명의 화합물은 또한 직장으로 투여될 수 있다. 직장 투여를 위해, 좌약이 사용될 수 있다. 상기 좌약은 본 발명의 화합물을 체온에서 용융되지만 실온에서 고체로 유지되는 약학적으로 적합한 부형제와 혼합함으로써 제조될 수 있다. 예로는 카카오 버터, 카본 왁스, 및 폴리에틸렌 글리콜을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 생성된 조성물은 당해 분야에 공지된 방법을 사용하여 임의의 원하는 형태로 성형될 수 있다.
비경구 투여를 위해, 본 발명의 화합물은 주사로 투여될 수 있다. 주사 투여를 위해, 본 발명의 화합물은 피하, 피내, 정맥 내 또는 근육 내 주사될 수 있다. 이러한 주사용 의약은 본 발명의 화합물을 식물성 오일, 합성 수지산의 글리세라이드, 고급 지방산의 에스테르, 또는 프로필렌 글리콜과 같은 수성 또는 비 수성 용매에 용해, 현탁 또는 유화시켜 공지된 방법으로 제조될 수 있다. 필요하다면, 종래 사용된 가용화제, 삼투압화제, 유화제, 안정화제, 또는 보존제와 같은 첨가제가 또한 첨가될 수 있다. 요구되지는 않지만, 상기 조성물은 멸균 또는 멸균되는 것이 바람직하다.
본 발명의 화합물을 현탁액제, 시럽제 또는 엘릭서제로 제형화하기 위해, 약학적으로 적합한 용매가 사용될 수 있다. 물의 비한정적 예가 이들 중에 포함된다.
본 발명의 화합물은 또한 의약물을 제조하기 위해 다른 약학적으로 적합한 활성을 갖는 추가의 화합물과 함께 사용될 수 있다. 본 발명의 화합물을 독립형 화합물로서 또는 조성물의 일부로서 함유하는 약물은 이를 필요로 하는 대상체의 치료에 사용될 수 있다.
본 발명의 화합물은 또한 기체 또는 액체 분무제, 및 필요하다면 팽창제와 같은 공지된 보조제와 함께 액체 또는 미세 분말 형태의 화합물을 에어로졸 용기 또는 분무기와 같은 비 가압 용기 내로 충전함으로써 제조 된 에어로졸 또는 흡입제의 형태로 투여될 수 있다. 예를 들어, 다이클로로플루오로메탄, 프로판 또는 질소의 가압 가스가 분무제로 사용될 수 있다.
본 발명의 화합물은 이를 필요로 하는 포유류 및 인간을 포함하는 동물에게 정제, 캡슐제, 용액제, 또는 유화제와 같은 약학적 조성물로서 투여될 수 있다. 이의 에스테르, 이의 약학적으로 적합한 염, 이의 대사물, 이의 구조적으로 관련된 화합물, 이의 유사체, 및 이들의 조합을 포함하나 이에 한정되지 않는 본 발명에 기재된 다른 형태의 화합물의 단일 용량 또는 다중 용량 투여는 또한 본 발명에 의해 고찰된다.
본원에 사용된 용어 "예방하는", "치료하는", "보호하는", 또는 "개선하는" 및 유사한 용어는 예방 및 전체 또는 부분 치료를 포함한다. 상기 용어는 또한 치료 결과를 개선하는 환자 상태에서 증상 감소, 증상 개선, 증상 중증도 감소, 질병 발생률 감소, 완화 유도, 완화 유지, 또는 임의의 다른 변화를 포함할 수 있다.
본 발명에 기재된 새로운 화합물은 바람직하게는 조성물의 형태로 사용 및/또는 투여된다. 적합한 조성물은 바람직하게는 약학적 조성물, 식료품, 또는 식품 보충제이다. 이들 조성물은 화합물을 전달하기에 간편한 형태를 제공한다. 본 발명의 조성물은 산화 또는 용해도에 대하여 화합물의 안정성을 증가 시키는데 효과적인 양으로 산화방지제를 포함할 수 있다.
본 발명의 방법으로 투여되거나 본 발명의 용도에서 투여를 위한 화합물의 양은 임의의 적합한 양이다. 바람직하게는 하루에 약 0.00001 g 내지 약 20 g (보다 바람직하게는 0.01 g 내지 1 g, 예컨대 0.05 g 내지 0.5 g)의 화합물이다. 적합한 조성물은 이에 따라 제형화될 수 있다. 생물학적 활성제의 투여 분야의 당업자는 공지되고 잘 이해되는 파라미터에 기초하여 다양한 대상체를 위한 특정 투여 요법을 개발할 수 있을 것이다.
본 발명에 따른 바람직한 조성물은 정제, 환제, 캡슐제, 캐플릿제, 다중미립자제(과립제, 헤드제, 펠릿제 및 미세 캡슐화된 입자 포함), 분말제, 엘릭서제, 시럽제, 현탁액제, 염증 표적화 하이드로겔과 같은 하이드로겔, 및 용액제의 형태와 같은 약학적 조성물이다. 약학적 조성물은 통상적으로 약학적으로 허용 가능한 희석제 또는 담체를 포함할 것이다. 약학적 조성물은 바람직하게는 비경구 또는 경구 투여에 적합하다. 경구로 투여 가능한 조성물은 고체 또는 액체 형태일 수 있고, 다른 것들 중에서 정제, 분말제, 현탁액제, 및 시럽제 형태를 취할 수 있다. 선택적으로, 상기 조성물은 하나 이상의 향미제 및/또는 착색제를 포함한다. 일반적으로, 치료 및 영양 조성물은 대상체에 대한 화합물의 작용을 크게 방해하지 않는 임의의 물질을 포함할 수 있다.
이러한 조성물에 사용하기에 적합한 약학적으로 허용 가능한 담체는 제약 분야에 주지되어 있다. 본 발명의 조성물은 0.01 내지 99 wt%의 본 발명의 화합물을 함유할 수 있다. 본 발명의 조성물은 일반적으로 단위 투여 형태로 제조된다. 바람직하게는 본 발명에 기재된 화합물의 단위 투여량은 1 mg 내지 1000 mg(보다 바람직하게는 50 mg 내지 500 mg)이다. 이들 조성물의 제조에 사용되는 부형제는 당업계에 공지된 부형제이다.
조성물을 위한 제품 형태의 추가의 예는 젤라틴, 전분, 개질된 전분, 포도당, 자당, 유당, 및 과당과 같은 전분 유도체로 이루어진 군으로부터 선택된 캡슐화 물질을 포함하는 연질 겔제 또는 경질 캡슐제의 형태에서와 같은 식품 보충제이다. 상기 캡슐화 물질은 선택적으로 가교제 또는 중합제, 안정화제, 산화방지제, 감광성 충전재 보호용 광 흡수제, 보존제 등을 함유할 수 있다. 바람직하게는, 식품 보조제 중 화합물의 단위 투여량은 1 mg 내지 1000 mg(보다 바람직하게는 50 mg 내지 500 mg)이다.
일반적으로, 용어 담체는 기재된 화합물이 약학적 담체, 식료품, 영양 보충제, 또는 식이 보조제와 같이 혼합될 수 있는 조성물을 나타내기 위해 본 출원 전반에 걸쳐 사용될 수 있다. 상기 기재된 물질은 본 발명의 목적을 위한 담체로 간주될 수 있다. 본 발명의 특정 실시형태에서, 상기 담체는 본 발명의 화합물에 대한 생물학적 활성이 거의 없거나 전혀 없다.
용량: 본 발명의 방법은 치료학적 유효량의 화합물을 이를 필요로 하는 동물에게 투여하는 단계를 포함할 수 있다. 화합물의 유효량은 투여되는 화합물의 형태, 투여 기간, 투여 경로(예를 들어, 경구 또는 비경구), 동물의 연령, 및 포유류 및 인간을 포함한 동물의 상태에 따라 달라진다.
예를 들어, 동물에서 본원에 기재된 상태를 치료 또는 예방하는 데 효과적인 화합물의 양은 0.1 내지 10,000 mg/kg/일의 범위일 수 있다. 화합물의 바람직한 유효량은 1 내지 5,000 mg/kg/일이며, 보다 바람직한 용량은 2 내지 100 mg/kg/일이다. 독성학 데이터가 보여주는 바와 같이 상기 화합물이 비 독성이므로 투여할 유효량의 상한은 중요하지 않다. 유효량의 화합물은 동물에 약 7 내지 100일 범위의 기간 동안, 바람직한 기간은 15 내지 50일, 및 가장 바람직한 기간은 30 내지 42일인 기간 동안 동물에 투여되는 경우 동물에서 본원에 기재된 상태를 치료 또는 예방하는 데 가장 효과적이다.
자가 면역, 염증성 또는 대사성 질환으로 이어지는 면역계의 과활성화 또는 조절 이상을 예방하는 데 가장 효과적인 화합물의 양은 0.1 내지 500 mg/kg/일 범위일 수 있으며, 바람직한 용량은 1 내지 150 mg/kg/일이다.
유효량의 본 발명의 화합물이 치료, 의학적 또는 수의학적 조성물로 투여될 경우, 바람직한 용량은 약 0.01 내지 2.0% wt/wt 대 약물 제품의 범위이다.
특정한 다른 실시형태에서, 본 발명은 LANCL2- 결합 화합물 및 또한 구조적으로 관련된 화합물, 예컨대, 화합물, 이의 에스테르, 이의 약학적으로 적합한 염, 이의 대사물, 이의 구조적으로 관련된 화합물, 또는 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 화합물의 면역대사 질환의 치료 및 예방에의 용도를 제공한다.
또한, 일반적으로, 본 발명은 자가 면역, 염증성, 대사 또는 감염성 질환의 차단을 돕는 면역대사의 경로에 관한 결함의 예방 또는 항상성 회복에 관한 것으로, 여기서 관련 경로는 글루코오스 대사 및 저장, 지방산 대사 및 저장, 아미노산 대사 및 저장, 칼슘 플럭스, 환형 AMP 대사, TLR 및 NLR 신호전달 또는 전 염증성 사이토카인(종양 괴사 인자 알파, 인터페론 감마, 인터루킨-6 및 단핵구 화학유인물질 단백질-1)의 생성을 제어하는 NF-κB 신호전달과 같은 염증성 경로, 및 FOXP3 활성 또는 IL-10 신호전달과 같은 조절 경로를 포함한다. 이 효과는 생물학적 효과를 유도하는 신체에서 다양한 세포 유형에 화합물의 노출로 유래한다. 상기 세포는 위장관 조직, 면역 세포(즉, 대식세포, 단핵구, 림프구), 근육 세포, 내피 세포, 또는 상피 세포로부터의 세포를 포함할 수 있지만, 이에 한정되지 않는다. 특정 실시형태에서, 본 발명은 클로스트리디움 디피실 감염과 같은 감염성 질환과 관련된 염증을 감소시키거나 예방하기 위해, 예를 들어 경구로 투여되는 본 발명의 화합물로 대상체를 치료하는 단계를 제공한다.
실시될 경우, 본 발명의 방법은 상기 기재된 바와 같이 임의의 허용 가능한 형태를 사용하여 임의의 허용 가능한 투여 경로를 통해 대상체에게 상기 화합물을 투여하고, 대상체의 신체가 자연적인 과정을 통해 표적 세포에 상기 화합물을 분배하게 하는 방식에 의한 것일 수 있다. 상기 기재된 바와 같이, 투여는 마찬가지로 표적 세포(즉, 치료될 세포)를 함유하는 부위(예를 들어, 기관, 조직)에 또는 신체에 세포를 다시 되돌려 주사하기 전에 화합물로 세포 요법에 사용될 배양 세포에 직접 주사함으로써 이루어질 수 있다.
또한, 투여는 임의의 수의 요법을 따를 수 있다. 따라서, 이는 실험 화합물의 단일 용량 또는 투여량, 또는 일정 기간에 걸친 다중 용량 또는 투여량을 포함할 수 있다. 따라서, 치료는 원하는 결과가 달성될 때까지 투여 단계를 1회 이상 반복하는 것을 포함할 수 있다. 특정 실시형태에서, 치료는 몇 주, 몇 달, 또는 몇 년과 같이 연장된 기간 동안 계속될 수 있다. 당업자는 충분히 당업계에 공지된 파라미터에 기초하여 개인에게 적합한 투여 요법을 용이하게 개발할 수 있다. 본 발명의 화합물의 투여량은 본 발명의 이들 실시형태의 방법에 사용될 수 있다. 면역대사 질환의 치료를 위해, 상기 화합물은 약 0.001 mg/일 내지 9,000 mg/일의 양으로 투여되는 것이 바람직하다.
투여되는 양은 대상체, 질환 또는 장애의 단계, 대상체의 연령, 대상체의 일반적인 건강, 및 의학 분야의 당업자에 의해 공지되고 통상적으로 고려되는 다양한 다른 파라미터에 따라 달라질 것이다. 일반적으로, 환부 부위에서 염증량 또는 영향을 받는 대사산물 또는 신호 변환기의 농도에서 검출 가능한 변화를 만들기 위해 충분한 양의 화합물이 투여될 것이다. 활동적인 증상을 경험하지 않는 환자의 경우, 찾을 수 있는 변화는 면역 세포에서 TNFα 발현 또는 혈액에서 조절 T 세포의 백분율과 같은 면역 세포 파라미터 또는 세포에 의한 글루코오스 섭취 또는 세포 내의 글리코겐 양과 같은 대사 파라미터와 관련될 수 있다. 적합한 양이 본원에 개시되고, 추가의 적합한 양은 본원에 개시된 양을 기준으로 과도 또는 과다한 실험없이 당업자에 의해 식별될 수 있다.
상기 방법의 관점에서, 본 발명은 대상체의 세포를 치료와 같이 세포를 접촉하는 데 사용하기 위한 LANCL2-결합 화합물을 통한 면역대사 치료를 제공한다는 것이 명백해야 한다. 상기 논의는 일반적으로 약학적 또는 의학적 환경으로 간주될 수 있는 것에 사용하기 위한 조성물의 일부로서 본 발명의 화합물의 용도에 중점을 둔다.
면역대사 질환 및 기재된 다른 병태의 치료를 위해 본 발명에 기재된 화합물은 상기에 보다 상세하게 기재된 바와 같이 약학적, 영양학적 조성물, 기능성 식품 조성물, 식이 보조제로서 또는 세포 요법에서 제형화될 수 있다.
화합물을 직접 투여함으로써 상태를 치료하는 방법에 대한 대안으로 또는 이에 추가하여, 상기 상태는 화합물을 사용하여 전구체 세포로부터 생성된 제조된 세포로 치료될 수 있다. 치료될 수 있는 상태는 본원 또는 미국 특허 제9,556,146호에 기재된 임의의 상태를 포함한다. 치료에 사용된 화합물은 본원에 개시된 또는 본원에 개시된 임의의 화학식에 의해 포함되는 임의의 화합물, 또는 미국 특허 제9,556,146호에 개시된 임의의 화학식에 개시되거나 또는 이에 포함된 임의의 화합물을 포함할 수 있다.
용어 "전구체 세포"는 일반적으로 제조된 세포를 생성하도록 처리된 출발 세포로서 작용하는 임의의 세포를 지칭하기 위해 본원에 사용된다. 세포는 예를 들어, 전능성, 다능성 또는 단능성 특성을 지닌 줄기 세포, 전구 세포, 또는 "전구체 세포"(이 용어는 줄기 세포 및 분화된 세포 사이의 중간체를 지칭하기 위해 본원에 사용됨)와 같이, 제조된 세포로 이어지는 분화 계통에서 상류의 세포일 수 있지만, 반드시 그럴 필요는 없다. 따라서, 일부 버전에서, 전구체 세포로부터 제조된 세포를 생성하는 단계는 전구체 세포를 제조된 세포로 분화시키는 단계를 포함한다. 다른 버전에서, 전구체 세포로부터 제조된 세포를 생성하는 단계는 단지 유전자 발현 변화와 같은 변화를 유도하는 단계를 포함한다.
시험관 내 전구체 세포를 하나 이상의 본 발명의 화합물과 접촉시켜 제조된 세포를 생성시킴으로써 제조된 세포가 전구체 세포로부터 생성될 수 있다. 용어 "시험관 내" 및 "생체 외"는 "생체 내"와 대조적으로 본원에서 상호 교환적으로 사용되며, 살아있는 유기체 외부에 있는 상태를 지칭한다.
본 발명의 전구체 및/또는 제조된 세포는 면역 세포를 포함할 수 있다. 예시적인 면역 세포는 다른 것들 중에서 과립구, 비만 세포, 단핵구, 대식세포, 호중구, 수지상 세포, 자연 살해 세포, T 세포, 및 B 세포를 포함한다. 예시적인 과립구는 호염기구, 호산구, 및 호중구를 포함한다.
본 발명의 전구체 및/또는 제조된 세포는 백색 혈액 세포(백혈구)를 포함할 수 있다. 예시적인 백혈구는 호중구, 에오신 호성 백혈구(호산구), 호염기구, 림프구, 및 단핵구를 포함한다.
본 발명의 전구체 및/또는 제조된 세포는 말초 혈액 단핵 세포(PBMC) 또는 고유판 단핵 세포(LPMC)를 포함할 수 있다. 예시적인 PBMC 및 LPMC는 림프구(T 세포, B 세포, NK 세포) 및 단핵구를 포함한다.
본 발명의 전구체 및/또는 제조된 세포는 T 세포를 포함할 수 있다. T 세포는 세포 표면에 어떤 단백질이 존재하는지에 기초하여 CD8+ T 세포 또는 CD4+ T 세포:의 두 가지 범주로 나뉜다. T 세포는 감염된 세포의 사멸 및 다른 면역 세포의 활성화 또는 동원을 포함하여 다수의 기능을 수행한다. CD8+ T 세포는 또한 세포독성 T 세포 또는 세포독성 림프구(CTL)로 불린다. 이들은 바이러스-감염된 세포와 암 세포를 인식하고 제거하는 데 중요하다. 주요 CD4+ T-세포 서브세트는 나이브 CD4+ T 세포, TH1 세포, TH2 세포, TH17 세포, 및 Treg 세포이며, "TH"는 "T 헬퍼 세포"를 지칭한다. 나이브 CD4+ T 세포는 TH1 세포, TH2 세포, TH17 세포, 및 Treg 세포 중 어느 것으로도 분화되지 않는 T 세포이다. 조절 T 세포(Treg)는 다른 T 세포의 활성을 모니터링하고 억제한다. 이들은 면역 활성화를 예방하고 내성을 유지하거나, 신체의 세포와 항원에 대한 면역 반응을 예방한다. 일부 버전에서, 전구체 세포는 나이브 CD4+ T 세포를 포함하고, 제조된 세포는 Treg 세포를 포함한다.
전구체 세포로부터 제조된 세포를 생성하는 단계는 전구체 세포에 대해 제조된 세포에서 화합물-의존적 차이를 유도하는데 효과적인 시간 동안 일정량의 본 발명의 하나 이상의 화합물을 접촉시키는 단계를 포함할 수 있다. 본원에 사용된 "화합물-의존적 차이"는 전구체 세포를 본 발명의 하나 이상의 화합물과 접촉시킴으로써 발생하는 전구체 세포에 대한 제조된 세포의 차이를 지칭한다. 화합물-의존적 차이는 본 발명의 하나 이상의 화합물의 존재 또는 부재하에 세포를 배지와 접촉시킴으로써 결정될 수 있으며, 여기서 화합물-의존적 차이는 본 발명의 하나 이상의 화합물의 존재 하에 배지와 접촉된 세포만으로 나타나는 특징이다. 화합물-의존적 차이는 종류뿐만 아니라 정도의 차이일 수 있다.
제조된 세포에서의 화합물-의존적 차이는 유전자 발현의 차이를 포함할 수 있다. 명시적으로 달리 언급되지 않는 한, "유전자 발현"은 전사 또는 번역의 일부 또는 전부를 지칭하기 위해 본원에서 광범위하게 사용된다. 따라서, 유전자 발현의 차이는 mRNA 생성의 차이, 단백질 생성의 차이, 또는 양쪽 모두일 수 있다. 명시적으로 달리 언급되지 않는 한, 차등 발현을 갖는 유전자는 유전자로부터 생성된 단백질(예를 들어, FOXP3) 또는 유전자 자체(예를 들어, Lag3)를 참조함으로써 본원에서 식별될 수 있다. 본 발명의 다양한 버전에서, 유전자 발현에서 화합물-의존적 차이는 IL-10 또는 이의 오솔로그(ortholog)의 발현의 증가, FOXP3 또는 이의 오솔로그의 발현의 증가, TNFα 또는 이의 오솔로그의 발현의 감소, IFNγ 또는 이의 오솔로그의 발현의 감소, Tbet 또는 이의 오솔로그의 발현의 감소, Lag3 또는 오솔로그의 발현의 증가, Socs2 또는 이의 오솔로그의 발현의 증가, Irf7 또는 이의 오솔로그의 발현의 증가, P2rx7 또는 이의 오솔로그의 발현의 증가, Capn3 또는 이의 오솔로그의 발현의 증가, Ikzf2 또는 이의 오솔로그의 발현의 증가, Stat5a 또는 이의 오솔로그의 발현의 증가, Pten 또는 이의 오솔로그의 발현의 증가, Foxo1 또는 이의 오솔로그의 발현의 증가, 및/또는 Phlpp1 또는 이의 오솔로그의 발현의 증가 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 상기 오솔로그는 동물 종에서 오솔로그를 포함할 수 있다. 상기 오솔로그는 포유류 종에서 오솔로그를 포함할 수 있다. 오솔로그(예컨대, 상기 명명된 마우스 유전자의 경우)는 영장류의 오솔로그를 포함할 수 있다. (상기 명명된 마우스 유전자와 같은) 오솔로그는 인간에서의 오솔로그를 포함할 수 있다.
상기 제조된 세포에서의 화합물-의존적 차이는 STAT5a 또는 이의 오솔로그의 인산화의 증가, FOXO1 인산화 또는 이의 오솔로로그의 증가, 및/또는 피루베이트 키나아제 활성의 증가와 같은 다른 검출 가능한 차이를 포함할 수 있다.
상기 제조된 세포를 생성함에 있어서, 상기 전구체 세포는 약 100 nM, 약 10 nM, 약 1 nM 이하 내지 약 1 μM, 약 10 μM, 약 100 μM, 약 1 mM 이상의 양의 화합물과 접촉될 수 있다. 상기 전구체 세포는 약 12시간, 6시간, 1시간, 약 30분 이하 내지 약 24시간, 약 48시간, 약 72시간 이상의 시간 동안 화합물과 접촉될 수 있다.
일부 버전에서, 상기 PBMC 또는 LPMC는 대체로 본 발명의 화합물과 접촉된다. 상기 PBMC 또는 LPMC는 동물로부터 단리될 수 있다. 일부 버전에서, T 세포와 같은 PBMC 또는 LPMC의 아형은 PBMC 또는 LPMC로부터 단리된 후 본 발명의 화합물과 접촉될 수 있다. 일부 버전에서, 상기 PBMC 또는 LPMC는 본 발명의 화합물과 접촉된 후, T 세포 또는 특정 유형의 T 세포와 같은 세포의 아형이 단리된다. PBMC, LPMC 및 이들의 아형을 단리하는 방법은 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, Majowicz et al. 2012(Majowicz A, van der Marel S, te Velde AA, Meijer SL, Petry H, van Deventer SJ, Ferreira V. Murine CD4+CD25- cells activated in vitro with PMA/ionomycin and anti-CD3 acquire regulatory function and ameliorate experimental colitis in vivo. BMC Gastroenterol. 2012 Dec 3;12:172) 및 Canavan et al. 20016(Canavan JB, Scotta C, Vossenkamper A, Goldberg R, Elder MJ, Shoval I, Marks E, Stolarczyk E, Lo JW, Powell N, Fazekasova H, Irving PM, Sanderson JD, Howard JK, Yagel S, Afzali B, MacDonald TT, Hernandez-Fuentes MP, Shpigel NY, Lombardi G, Lord GM. Developing in vitro expanded CD45RA+ regulatory T cells as an adoptive cell therapy for Crohn's disease. Gut. 2016 Apr;65(4):584-94)를 참조. 예를 들어, PMBC의 서브세트는 항-CD3 항체 및 항-CD28 항체로 단리될 수 있다. 항-CD3 항체 및 항-CD28 항체는 ThermoFisher Scientific(Waltham, 매사추세츠 주)의 Human T-Activator CD3/CD28 DYNABEADS®와 같은 항-CD3/항-CD28 비드의 형태로 제공될 수 있다.
상기 제조된 세포를 생성하는 단계는 상기 전구체 세포로부터 상기 제조된 세포를 분화하는 단계를 포함할 수 있다. 예를 들어, Treg 세포와 같은 제조된 세포는 나이브 CD4+ T 세포와 같은 전구체 세포로부터 분화될 수 있다. 이러한 분화 단계는 본 발명의 하나 이상의 화합물 이외에 상기 전구체 세포를 분화 인자와 접촉시키는 단계를 포함할 수 있다. 다양한 분화 인자는 올-트랜스-레티노산, TGF-β, 포볼(phorbol) 미리스테이트 아세테이트, 아이오노마이신, 라파마이신, 및/또는 IL-2를 포함할 수 있다. 일부 버전에서, 상기 분화 단계는 상기 전구체 세포에서 일부에 대해 상기 제조된 세포에서 Treg 세포의 비율을 확장시키는 단계를 포함할 수 있다.
본 발명의 전구체 및 제조된 세포는 단리된 세포일 수 있다. 용어 "단리된" 또는 "정제된"은 물질의 본래 환경, 예를 들어 자연 환경으로부터 제거되는 물질을 의미한다. 물질은 정제 단계(들) 이전에 존재하는 농도보다 더 높거나 낮은 농도로 특정 조성물에 존재할 때 "정제된" 것으로 언급된다.
본 발명의 제조된 세포로 상태를 치료하는 단계는 상태를 치료하기에 충분한 양으로 세포를 동물에게 투여하는 단계를 포함할 수 있다. 상기 제조된 세포는 비경구적으로 또는 경장적으로(enterally)을 포함하여 상기 화합물에 대해 상기 기재된 임의의 경로 또는 방법을 사용하여 투여될 수 있다. 비경구 투여의 비 한정적인 형태는 주사 또는 주입을 포함한다. 상기 준비된 세포는 혈류 또는 신체의 다른 부분에 직접 주사 또는 주입될 수 있다. 경장 투여의 비 한정적인 형태는 상기 제조된 세포가 위장관으로 들어가도록 경구 및 직장 투여를 포함한다. 상기 제조된 세포는 치료된 동물에 대해 자가 유래적일 수 있거나(즉, 상기 제조된 세포가 치료하는 데 사용된 것과 동일한 동물로부터 취한 세포로부터 생성된) 또는 치료된 동물에 대해 이종 기원적일 수 있다(즉, 상기 제조된 세포가 치료하는 데 사용된 것과 상이한 동물로부터 생성된). 상기 기재된 바와 같이 제조된 세포는 본원에 기재된 임의의 상태를 치료하는 방법에 사용될 수 있다. 예시적인 상태는 장 염증을 포함한다. 장 염증의 예시적인 유형은 염증성 장 질환을 포함한다. 염증성 장 질환의 예시적인 유형은 크론병 및 궤양성 대장염을 포함한다.
본 발명의 한 실시형태에서, 면역대사 질환을 치료하는 방법은 상당한 체중 증가, 전신 면역 억제, 쿠싱양 외관, 골감소증/골다공증, 세포 독성 또는 현재 이용 가능한 치료법에 공통적인 췌장염과 같은 현저한 부작용을 유발하지 않으면서 치료를 포함한다(즉, 스타틴, 항생제, 코르티코스테로이드, 독소루비신, 메토트렉세이트). 즉, 일부 세포에서 LANCL2 및/또는 다른 면역대사 경로의 발현 및/또는 활성화에 영향을 미침으로써 치료 효과를 적어도 부분적으로 제공하는 본 발명에 따른 치료 방법은 치료를 받지 않은 다른 유사한 대상체와 비교하여, 치료중인 대상체에서 예를 들어, 유체 보유에 의해 상당한 체중 증가를 유발하지 않으면서 유익한 효과를 제공하는 것으로 밝혀졌다.
이와 같이, 본 발명의 면역대사 방법은 면역 세포의 대사에 영향을 줌으로써 염증을 감소시키기 위한 치료법을 제공할 수 있다. 상기 방법은 전신적으로(즉, 대상체의 신체 전체에 걸쳐) 또는 국소적으로(예를 들어, T 세포 및 대식세포를 포함하지만 이에 한정되지 않는 투여 부위 또는 염증성 세포 부위에서) 염증을 감소시킬 수 있다. 면역대사를 통한 염증의 치료 또는 예방에서 관찰될 수 있는 하나의 효과는 포도당 대사의 변이이다. 특히, 상기 변이는 피루베이트로부터 면역염증 작용과 관련된 트라이카르복실산 사이클로의 진입을 향한 락테이트의 생성으로부터의 것일 수 있다. 보다 구체적으로, 대사에서의 이러한 변이는 IL17+ Th17 세포 또는 IFNγ+ Th1 세포와 같은 이펙터 CD4+ T-세포에 비해 CD4+CD25+FOXP3+ 또는 다른 조절 CD4+ T-세포의 비율의 증가와 연관될 수 있다. 다른 관찰된 효과는 감소된 혐기성 대사 및 증가된 면역 체크 포인트 경로의 조합으로 인한 감소된 세포 증식일 수 있다. 치료적으로 유발되는 대사 변이의 다른 효과는 지방산의 변경된 처리 및 저장으로 인한 MCP-1, IL-8, 또는 CXCL9와 같은 염증성 케모카인의 감소된 발현일 수 있다. 따라서, 상기 방법은 또한 요법이 투여되는 대상체의 면역 반응에 영향을 미치거나 변경함으로써 염증, 질환 및 병리를 차단하는 고려된 방법일 수 있다.
본 발명은 관련 성분이 위, 소장, 대장, 및 직장을 포함하는 위장관에서 염증을 억제하는 방법을 제공한다.
본 발명은 IBD를 앓고 있는 대상체, 또는 아마도 크론병 또는 궤양성 대장염에 대한 유전적 소인이 있는 건강한 개인을 대상으로 IBD가 발생하는 것을 치료 또는 예방하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 또한 완화형 IBD로 이들을 치료하는 단계를 포함할 수 있다. 본 발명에 따르면, 용어 "IBD를 앓고 있는 대상체"는 IBD의 통상적인 하나 이상의 임상 징후를 나타내는 질환 또는 장애를 갖는 대상체(예를 들어, 동물, 인간)를 의미하는 데 사용된다. 일반적으로, 본 발명의 이러한 양태에 따른 치료 또는 예방 방법은 IBD의 하나 이상의 증상 또는 임상 징후의 치료 또는 그러한 증상(들) 또는 징후(들) 예방에 효과적인 양의 화합물 또는 세포 요법을 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.
따라서, 본 발명의 방법에 따르면, 본 발명은 IBD, 장 감염과 연관된 염증 및 자가 면역 질환과 연관된 염증을 제공할 수 있다. 상기 치료 방법은 예방적 방법일 수 있다. 특정 실시형태에서, 상기 방법은 IBD, 장 감염과 연관된 염증 및 자가 면역 질환과 연관된 염증을 치료하는 방법이다. 다른 실시형태에서, 상기 방법은 IBD를 치료하는 방법이다. 실시형태에서, 상기 방법은 IBD의 완화형이 활성화되는 것을 방지하는 방법이다. 또 다른 실시형태에서, 상기 방법은 IBD, 장 감염과 연관된 염증 및 자가 면역 질환과 연관된 염증을 앓고 있는 대상체의 건강 상태를 개선시키는 방법이다. 위장 감염을 유발하는 유기체는 대장균, 시겔라(Shigella), 살모넬라균, 병원성 비브리오균, 캄필로박터 제주니(Campylobacter jejuni), 여시니아 엔테로콜리티카(Yersina enterocolitica), 톡소포자충, 적리아메바 및 람블편모충을 포함하지만, 여기에 한정되지 않는다. 따라서, 특정 실시형태에서, 본 발명은 IBD, 장 감염과 연관된 염증 및 자가 면역 질환과 연관된 염증을 앓고 있거나 위험이 있는 대상체의 건강, 기관, 및/또는 조직이 IBD, 장 감염과 연관된 염증 및 자가 면역 질환과 연관된 염증 발생으로부터 보호하는 방법을 제공한다.
본 발명의 한 실시형태에서, IBD를 치료하는 방법은 현재 이용 가능한 IBD 치료(즉, 코르티코스테로이드, 종양 괴사 인자 알파 억제제)에 공통적인 상당한 체중 증가, 전신 면역 억제, 쿠싱양 외관, 골감소증/골다공증, 또는 췌장염과 같은 현저한 부작용을 유발하지 않으면서 IBD를 치료하는 단계를 포함한다. 즉, 일부 세포에서 LANCL2의 발현 및/또는 활성화에 영향을 미침으로써 치료 효과를 적어도 부분적으로 제공하는 본 발명에 따른 치료 방법은 치료를 받지 않은 다른 유사한 대상체와 비교하여, 치료중인 대상체에서 예를 들어, 유체 보유에 의해 상당한 체중 증가를 유발하지 않으면서 유익한 효과를 제공하는 것으로 밝혀졌다.
이와 같이, 본 발명의 방법은 염증을 감소시키는 방법을 제공할 수 있다. 상기 방법은 전신적으로(즉, 대상체의 신체 전체에 걸쳐) 또는 국소적으로(예를 들어, T 세포 및 대식세포를 포함하지만 이에 한정되지 않는 투여 부위 또는 염증성 세포 부위에서) 염증을 감소시킬 수 있다. 본 발명의 방법에 따른 염증의 치료 또는 예방에서, 볼 수 있는 하나의 효과는 혈액 단핵구 또는 장을 침윤시키는 대식세포 및 림프구의 수의 감소이다. 다른 하나는 CD4+CD25+FoxP3+ 조절 T-세포와 같은 조절 면역 세포 집단의 증가, 또는 림프구 또는 대식세포의 조절 특성 증가(예를 들어, 증가된 인터루킨 4(IL-4) 또는 IL-10 또는 감소된 TNF-α 및 IL-6)일 수 있다. 다른 하나는 염증성 유전자 및/또는 부착 분자의 감소된 존재일 수 있다. 따라서, 상기 방법은 요법이 투여되는 대상체의 면역 반응에 영향을 주거나 변경시키는 고려되는 방법일 수 있다. 상기 대상체는 염증성 장 질환 또는 T 세포의 면역조절 또는 세포 부착 분자의 하향 조절이 바람직한 결과인 다른 상태를 가질 수 있다.
상기 방법은 또한 본원에 기재된 화합물 또는 세포로 감염성 질환을 치료하는 방법을 제공한다. 이러한 감염성 질환의 비 한정적인 예는 바이러스 감염, 박테리아 감염, 및 진균 감염을 포함한다.
바이러스 감염의 비 한정적인 예는 다른 것들 중에서, 아데노바이러스와 같은 아데노바이러스과의 바이러스; 단순 포진, 유형 1, 단순 포진, 유형 2, 수두 대상 포진 바이러스, 엡스타인-바 바이러스, 인간 세포거대바이러스, 인간 헤르페스 바이러스, 및 유형 8과 같은 헤르페스바이러스과의 바이러스; 인간 유두종 바이러스와 같은 유두종 바이러스과의 바이러스; BK 바이러스 및 JC 바이러스와 같은 폴리오마바이러스과의 바이러스; 천연두와 같은 폭스바이러스과의 바이러스; B 형 간염 바이러스와 같은 B 형 간염바이러스과의 바이러스; 인간 보카바이러스 및 파보바이러스 B19와 같은 파보바이러스과의 바이러스; 인간 아스트로바이러스와 같은 아스트로바이러스과의 바이러스; 노워크 바이러스와 같은 칼리시바이러스과의 바이러스; 콕사키바이러스, A 형 간염 바이러스, 소아마비바이러스, 및 리노바이러스와 같은 피코르나바이러스과의 바이러스; 급성 호흡기 증후군 바이러스와 같은 코로나바이러스과의 바이러스; C 형 간염 바이러스, 황열병 바이러스, 뎅기열 바이러스, 및 웨스트 나일 바이러스와 같은 플라비바이러스과의 바이러스; 풍진 바이러스와 같은 토가바이러스과의 바이러스; E 형 간염 바이러스와 같은 헤페바이러스과의 바이러스; 인간 면역 결핍 바이러스(HIV)와 같은 레트로바이러스과의 바이러스; 인플루엔자 바이러스와 같은 오소믹스바이러스과의 바이러스; 구아나리토 바이러스, 후닌 바이러스, 라사 바이러스, 마추포 바이러스, 및 사비아 바이러스와 같은 아라네바이러스과의 바이러스; 크림-콩고 출혈열 바이러스와 같은 분야바이러스과의 바이러스; 에볼라 바이러스 및 마르부르크 바이러스와 같은 필로바이러스과의 바이러스; 홍역 바이러스, 유행성 이하선염 바이러스, 파라인플루엔자 바이러스, 호흡기 세포융합 바이러스, 인간 메타뉴모바이러스, 헨드라 바이러스, 및 니파 바이러스와 같은 파라믹소바이러스과의 바이러스; 광견병 바이러스와 같은 랍도바이러스과의 바이러스; D 형 간염 바이러스와 같은 미할당(unassigned) 바이러스; 및 로타 바이러스, 오르비 바이러스, 콜티 바이러스, 및 반나 바이러스와 같은 리오바이러스과로부터의 감염을 포함한다.
박테리아 감염의 비 한정적인 예는 바실러스 안트라시스(Bacillus anthracis), 바실러스 세레우스(Bacillus cereus), 보르데텔라 백일해균(Bordetella pertussis), 보렐리아 부르그도르페리(Borrelia burgdorferi), 브루셀라 아보르투스(Brucella abortus), 브루셀라 카니스(Brucella canis), 브루셀라 멜리텐시스(Brucella melitensis), 브루셀라 수이스(Brucella suis), 캄필로박터 제주니(Campylobacter jejuni), 클라미디아 폐렴(Chlamydia pneumoniae), 클라미디아 트라코마티스(Chlamydia trachomatis), 클라미디아 시타시(Chlamydophila psittaci), 클로스트리디움 보툴리눔(Clostridium botulinum), 클로스트리디움 디피실(Clostridium difficile), 클로스트리디움 퍼프린젠스(Clostridium perfringens), 클로스트리디움 테타니(Clostridium tetani), 코리네박테리움 디프테리아(Corynebacterium diphtheriae), 엔테로코쿠스 페칼리스(Enterococcus faecalis), 엔테로코쿠스 패슘(Enterococcus faecium), 대장균(Escherichia coli), 프란시셀라 툴라렌시스(Francisella tularensis), 헤모필루스 인플루엔자(Haemophilus influenzae), 헬리코박터 파일로리(Helicobacter pylori), 레지오넬라 뉴모필리아(Legionella pneumophila), 렙토스피라 인테로간스(Leptospira interrogans), 리스테리아 모노사이토제니즈(Listeria monocytogenes), 마이코박테리움 레프레(Mycobacterium leprae), 마이코박테리움 튜버쿨로시스(Mycobacterium tuberculosis), 마이코박테리움 울서란스(Mycobacterium ulcerans), 마이코플라스마 뉴모니에(Mycoplasma pneumoniae), 나이세리아 고노로이에(Neisseria gonorrhoeae), 나이세리아 메닌지티디스(Neisseria meningitidis), 슈도모나스 애루지노사(Pseudomonas aeruginosa), 리케차 리케치(Rickettsia rickettsii), 살모넬라 타이피(Salmonella typhi), 살모넬라 타이피뮤리움(Salmonella typhimurium), 시겔라 손네이(Shigella sonnei), 스타필로코커스 오레우스(Staphylococcus aureus), 스타필로코커스 에피더미디스(Staphylococcus epidermidis), 스타필로코커스 사프로파이티커스(Staphylococcus saprophyticus), 스트렙토코커스 아갈락티아(Streptococcus agalactiae), 스트렙토코커스 뉴모니에(Streptococcus pneumoniae), 스트렙토코커스 피오게네스(Streptococcus pyogenes), 트레포네마 팔리듐(Treponema pallidum), 비브리오 콜레라(Vibrio cholerae), 예르시니아 페스티스(Yersinia pestis), 예르시니아 엔테로콜리티카(Yersinia enterocolitica), 예르시니아 슈도튜베르큘로시스(Yersinia pseudotuberculosis), 및 상기 언급된 유기체의 속에서 다른 종에 더하여 상기 기재된 박테리아로 감염을 포함한다.
진균 감염의 비 한정적인 예는 아스페르길루스증을 유발하는 아스페르길루스 푸미가투스(Aspergillus fumigatus)와 같은 아스페르길루스속의 진균; 분아균증을 유발하는 블라스토마이세스 더마티티디스(Blastomyces dermatitidis)와 같은 블라스토마이세스속의 진균; 칸디다증을 유발하는 칸디다 알비칸스(Candida albicans)와 같은 칸디다속의 진균; 콕시디오이데스진균증(밸리열(valley fever))을 유발하는 콕시디오이데스속의 진균; 크립토코쿠스증을 유발하는 크립토코쿠스 네오포르만스(Cryptococcus neoformans) 및 크립토코쿠스 가티(Cryptococcus gattii)와 같은 크립토코쿠스속의 진균; 백선증을 유발하는 더마토파이테스(dermatophytes) 진균; 푸사리움(Fusarium) 종, 아스페르길루스 종, 및 칸디다 종과 같은 진균성 각막염을 유발하는 진균; 히스토플라스마증을 유발하는 히스토플라스마 캡슐라툼(Histoplasma capsulatum)과 같은 히스토플라스마속의 진균; 털곰팡이증을 유발하는 무코랄레스(Mucorales)속의 진균; 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae)와 같은 사카로마이세스종의 진균; 뉴모시스티스 폐렴(pneumocystis pneumonia)을 유발하는 뉴모시스티스 지베로치(Pneumocystis jirovecii)와 같은 뉴모시스티스속의 진균; 및 스포로트릭스증(sporotrichosis)을 유발하는 스포로트릭스 쉔키(Sporothrix schenckii)와 같은 스포로트릭스속의 진균;으로 감염을 포함한다.
본 발명은 또한 본원에 기재된 화합물 또는 세포로 과증식성 장애를 치료하는 방법을 제공한다. 과증식성 장애는 암과 같은 세포의 제어되지 않은 성장과 관련된 상태 또는 종양, 선종 또는 용종의 성장과 관련된 상태를 포함한다. 과증식성 장애의 비 한정적인 예는 다른 것들 중에서 대장암, 가족성샘종폴립증(PAP), 인후암, 갑상선암, 위암, 위장관암, 췌장암, 호지킨 림프종, 비 호지킨 림프종, 급성 골수성 백혈병, 간세포암, 위장관 기질 종양, 급성 림프모구 백혈병, 만성 골수증식성 장애, 과다호산구 증후군, 비만세포증을 포함한다.
본 발명은 또한 본원에 기재된 화합물 또는 세포로 선천 대사 장애를 치료하는 방법을 제공한다. 선천 대사 장애의 비 한정적인 예는 다른 것들 중에서 윌슨병, 안데르센병 또는 다른 글리코겐 축적병, 시스틴뇨증, 파브리병(Fabry disease), 성인-발생 시트룰린혈증 II형, 젤웨거(Zellweger) 증후군, 곁사슬 키토산뇨증, 레쉬-니한(Lesch-Nyhan) 증후군, 니만-피크병(Niemann-Pick disease), 판코니-비켈병(Fanconi-Bickel disease), 폰기에르케병(von Gierke's disease), 유전성 과당 불내증, 페닐케톤뇨증, 중쇄 아실-CoA 탈수소효소 결핍증을 포함한다.
본 발명은 또한 본원에 기재된 화합물 또는 세포로 만성 면역대사 질환을 치료하는 방법을 제공한다. 만성 면역대사 질환의 비 한정적인 예는 동맥 경화증, 관상 동맥 질환, 말초 동맥 질환, 폐 심장 질환, 심내막염, 심근염, 및 고혈압과 같은 심혈관 질환을 포함한다.
본 발명은 또한 본원에 기재된 화합물 또는 세포로 염증성 자가 면역 질환과 같은 자가 면역 질환을 치료하는 방법을 제공한다. 자가 면역 질환의 비 한정적인 예는 다른 것들 중에서 염증성 장 질환(IBD) (예를 들어, 크론병 및 궤양성 대장염), 루푸스, 전신성 루푸스, 류마티스 관절염, 1형 당뇨병, 건선, 다발성 경화증, 및 암-면역요법-유도된 자가 면역 질환을 포함한다. 암-면역요법-유도된 자가 면역 질환의 비 한정적인 예는 암 면역요법-유도된 류마티스성 질환을 포함한다.
본 발명은 또한 본원에 기재된 화합물 또는 세포로 만성 염증성 질환을 치료하는 방법을 제공한다. 만성 염증성 질환의 비 한정적인 예는 다른 것들 중에서 대사 증후군, 비만, 당뇨병 전증, 심혈관 질환 및 2형 당뇨병을 포함한다.
본 발명은 또한 본원에 기재된 화합물 또는 세포로 급성 대장 게실염 및 위장관의 방사선-유도된 염증과 같은 염증성 장애를 치료하는 방법을 제공한다. 위장관의 방사선-유도된 염증의 비 한정적인 예는 방사선 직장염, 방사선 장염, 및 방사선 직장 S상 결장염을 포함한다.
본 발명은 또한 1형 당뇨병, 2형 당뇨병, 및 다른 유형의 당뇨병을 포함하여 본원에 기재된 화합물 또는 세포로 당뇨병을 치료하는 방법을 제공한다. 용어 "당뇨병" 또는 "당뇨"는 대상체가 고혈당(즉, 고혈당증)을 갖는 대사 장애를 포함하는 데 사용된다. 고혈당 상태는 췌장이 충분한 인슐린을 생성하지 않거나 세포가 생성된 인슐린에 반응하지 않는 등의 다양한 병인을 갖는다. 당뇨병의 여러 하위 유형이 있다. 1형 당뇨병은 신체가 인슐린을 전혀 생산하지 못하거나 신체가 충분한 인슐린을 생산하지 못하는 것이 특징이다. 2형 당뇨병은 일반적으로 세포가 인슐린을 제대로 사용하지 못하는 상태 인 인슐린 저항성에서 비롯된다. 2형 당뇨병은 때때로 인슐린 결핍과 함께 나타난다. 임신성 당뇨병은 당뇨병의 사전 진단이 없는 임산부가 고혈당증을 일으킬 때 발생한다. 덜 흔한 형태의 당뇨병은 (인슐린 분비와 관련된 유전적 결함으로 인한) 선천성 당뇨병, 낭포성 섬유증 관련 당뇨병, 고용량의 글루코코르티코이드에 의해 유도되는 스테로이드 당뇨병, 및 여러 형태의 단일 유전성 당뇨병(청년의 성숙 발병 당뇨병 포함)을 포함한다. 단일 유전성 당뇨병은 단일 상염색체 우성 유전자에서 돌연변이에 의해 유발되는 여러 유전성 형태의 당뇨병을 포괄한다(고혈당증을 유발하는 보다 복잡한 다형성 병인과 대조됨).
본 발명은 또한 본원에 기재된 화합물 또는 세포로 만성 통증을 치료하는 방법을 제공한다. 만성 통증 질환의 비 한정적인 예는 다른 것들 중에서 섬유근육통, 신경 손상, 편두통, 요통, 복통을 포함한다.
본 발명은 또한 본원에 기재된 화합물 또는 세포로 추가적인 상태를 치료하는 방법을 제공한다. 이들은 만성 육아종병, 이식편대숙주 질환, 및 종양 괴사 인자 수용체 연관 주기적 증후군과 같은 만성 염증성 질환; 근위축 측삭 경화증, 뒤센형 근이영양증, 척추 측만증, 및 진행성 근위축증과 같은 근육 소모; 등을 포함한다.
본원에 기재된 요소 및 방법 단계는 명시적으로 기재되든 아니든 임의의 조합으로 사용될 수 있다.
본원에 사용된 방법 단계의 모든 조합은 달리 언급되지 않거나 참조된 조합이 이루어지는 문맥에 의해 달리 명확하게 암시되지 않는 한 임의의 순서로 수행될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 단수 형태 "하나", "하나의" 및 "상기"는 내용이 명확하게 달리 지시하지 않는 한 복수의 지시물을 포함한다.
본원에 사용된 바와 같은 수치 범위는 구체적으로 개시되어 있든 없든, 그 범위 내에 포함된 모든 수 및 수의 서브세트를 포함하는 것으로 의도된다. 또한, 이들 수치 범위는 그 범위 내의 임의의 수 또는 수의 서브세트에 관한 청구항을 지원하는 것으로 해석되어야 한다. 예를 들어, 1 내지 10의 개시는 2 내지 8, 3 내지 7, 5 내지 6, 1 내지 9, 3.6 내지 4.6, 3.5 내지 9.9 등의 범위를 지원하는 것으로 해석되어야 한다.
본원에 인용된 모든 특허, 특허 공보, 및 동료-검토된 공보(즉, "참고문헌")은 각각의 개별 참고문헌이 본원에 인용되어 포함된 것으로 구체적이고 개별적으로 표시되는 것과 동일한 정도로 인용되어 명시적으로 포함된다. 본 개시 내용과 포함된 참고문헌 사이에 상충되는 경우, 본 개시내용이 우선한다.
본 발명은 본원에 도시되고 설명된 부분의 특정 구성 및 배열에 국한되지 않고 청구 범위의 범주 내에 있는 이의 그러한 변형된 형태를 포함하는 것으로 이해된다.
분자 모델링 및 LANCL2 결합예
LANCL2에 대한 BT-11 및 관련 화합물의 결합을 나타내는 예는 미국 특허 제9,556,146호에 의해 제공되며, 이는 그 전체 내용이 본원에 인용되어 포함된다. BT-11 및 다른 관련 화합물의 (표면 플라즈몬 공명 (SPR)을 통한) 예측 및 실제 결합 은 표 1A 및 표 1B에 제시되어 있다.
Figure pct00014
Figure pct00015
LANCL2를 AutoDock Vina와 결합시키기 위해 추가의 화합물을 가상으로 스크리닝 하였다(Trott et al. J Comput Chem, 2010, 31(2):455-61.). 상단 결합 포즈(pose)의 결합 에너지를 각 화합물에 대해 결정하였다. 이전에 보고된 프로토콜 및 파라미터(Lu et al. J Mol Model, 2011, 17 (3):543-53)가 본 분석에 적합하였다. 표 2는 시험된 화합물 및 이들의 예측된 LANCL2 결합 에너지 중 일부를 보여준다.
Figure pct00016
Figure pct00017
표 3은 BT-11 변이체의 예측된 LANCL2 친화도(kcal/mol 단위의 상단 결합 포즈의 결합 에너지)를 보여준다. 표 2에서 각 화합물에 대한 BT-11 기본 구조로부터의 변이는 본원의 화학식 Z-Y-Q-Y'-Z'에 제공된 변수에 따라 정의된다.
Figure pct00018
표 1a, 1b, 2 및 3에 나타낸 바와 같이, BT-11은 광범위한 변형을 수용할 수 있고 여전히 높은 친화력으로 LANCL2에 결합할 수 있다.
의약 화학예
BT-11 및 관련 화합물의 합성을 보여주는 예는 미국 특허 제9,556,146호에 의해 제공되며, 이는 그 전체 내용이 본원에 인용되어 포함된다.
실험 연구예
BT-11은 염증이 있는 동안 면역대사 경로를 변경한다
도입
크론병(CD)과 궤양성 대장염(UC)을 포함하는 염증성 장 질환(IBD)은 160만의 북미인 및 전 세계적으로 4 백만 명을 괴롭히고 있으며, 지난 5 년간 거의 15%의 성장을 보였다[1,2]. 증상, 위험 요소 및 심각도가 스펙트럼이 변하는 IBD의 복잡하고 다원적 특성으로 인해, 효과적인 치료법의 개발은 느리고 힘든 과정이다[3]. 현재, 시장의 지배적인 치료제는 전체 인구의 작은 부분에만 혜택을 주거나[4], 높은 반응 손실률을 갖거나[5], 또는 암, 감염 및 사망을 포함한 높은 비율의 부작용을 유발한다[6,7]. 그러므로, IBD를위한 보다 안전하고 효과적인 치료제에 대한 임상적 요구가 충족되지 않은 상태이다.
IBD의 발생과 연결된 여러 요인들 중에는 염증성 CD4+ T 세포의 불균형과 확장이 있다[8]. 다른 사이토카인 중에서 IFNγ, TNFα, 및 IL17의 자발적인 고수준 생산은 염증의 무작위 발적의 주요 동인이다[9]. 이에 반하여, 조절 CD4+ T(Treg) 세포의 주요 역할은 이러한 확장, 활성화 및 사이토카인 생성을 방지하는 것이다. 이러한 명백한 이점에도 불구하고, Treg 세포는 IBD 환자의 GI에서 예상되는 보상 증가를 경험하고[10], 건강한 대조군과 비교하여 시험관 내에서 정상적인 억제 기능을 나타내어[11], 질병에서 이들의 명백한 영향에 대한 논쟁을 제기한다. 최근의 증거에 따르면 전통적인 마커에 의해 특징되는 Treg의 수가 증가하는 반면, 이들 세포는 염증성 사이토 카인 또는 FOXP3를 원위치에서 불안정하게 발현하는 세포의 공동 생산자일 수 있음을 시사한다[12-14]. 이러한 공동 생산은 통상적인 Treg 세포보다는 이펙터/염증성 CD4+ T 세포와 더 밀접하게 연관되는 중간 표현형을 생성한다. 또한, Treg의 확장은 현재 IBD 치료에 대한 반응성과 연결된다[15]. 잠재적으로, 완전히 기울어진(committed) Treg 프로파일의 안정성을 표적으로 하는 것은 GI 점막 내에서 천연 및 유도된 Treg 세포 기능에 대한 효능을 회복시킬 수 있다.
최근에, 세포 대사 및 면역의 얽힌 성질은 인간 질병의 연구 및 면역 표적 치료제의 개발에서 더욱 두드러졌다[16]. 특히, IBD 등과 같은 염증성 및 자가 면역 질환은 면역대사 조절제의 효능에 대한 주요한 예로서 확인되었다[17]. 이펙터 및 조절 CD4+ T 세포는 락테이트 생산 및 포도당 이용을 선호하는 이펙터 세포와의 대사 기능에서 현저한 차이를 보인 반면[18], 조절 세포 유형은 지방산과 포도당 산화 사이에 균형 잡힌 대사 프로파일을 유지한다[19]. 면역대사로 알려진 면역과 대사 사이의 인터페이스는 새로운 대사 효소와 기질이 헥소키나아제[20] 및 GAPDH[21]에서 에놀라아제[22] 및 포스포엔올피루베이트[23]에 면역 거동에 영향을 미치는 달빛 기능을 갖는 것으로 확인됨에 따라 더 높은 해상도와 신뢰성을 얻는다. IL-1β 및 IFNγ 생산, FOXP3 발현 및 칼슘 신호전달에 대한 영향으로, 에너지를 생산하는 것으로 일단 생각된 이들 요소는 면역 기능에 대해 다수의 강력한 효과를 갖는다. 면역 세포의 대사를 조절함으로써 면역대사 치료제는 염증 서브세트로의 분화 및 분극을 효과적으로 방지할 수 있다[24-27].
장 내분비 및 근육 세포에서의 대사의 이전에 확인된 LANCL2-매개 조절[28]은 LANCL2 및 BT-11 치료 효능의 중요한 측면이 위장관에서 BT-11의 작용의 잠재적인 면역대사 메커니즘에 있을 수 있음을 시사한다. 즉, BT-11의 효능 뒤에 중요한 첫 단계인 LANCL2의 활성화는 염증에서 그 역할을 발견하기 전에 비 면역 세포에서 ABA인 천연 및 식이 화합물에 대한 수용체[28] 및 대사 호르몬의 생성을 위한 신호 변환기로서 대사 효과를 발휘하는 것으로 처음 나타났다[29]. 그러나, LANCL2 경로의 대사 작용과 면역 작용 사이의 결합은 아직 입증되지 않았다. 이와 같이, LANCL2 및 다른 면역대사 표적은 염증성 및 자가 면역 질환에 걸친 혁신적인 면역조절 방법론으로서의 기계적 평가를 수행한다.
BT-11은 LANCL2를 표적으로 하기 위해 표면 플라즈몬 공명을 통해 나타났으며 IBD에서 치료 작용을 갖는 질병의 DSS 모델과 시험관 평가를 통해 나타났다[30,31]. 경구 투여 후 BT-11의 작용은 전신 생체 이용률 <10% 및 혈장 반감기 3.1시간으로 GI 점막에 고도로 국한된다. 또한, 생쥐의 예비 안전성 연구에 따르면 한계 선량은 1,000 mg/kg p.o까지의 깨끗한 안전성 프로파일을 나타낸다[32]. 효능의 초기 평가는 DSS로 공격받은(challenged) 마우스의 대장에서 질환 활성 점수의 개선 및 염증 마커의 감소를 정의한다. LANCL2의 활성화 이외에, BT-11이 IBD에서 질병 심각도를 감소시키는 기본 작용 기전은 현재 정의되지 않았다.
하기 실시예는 BT-11에 의한 LANCL2의 활성화가 면역대사 메커니즘을 통해 조절 CD4+ T 세포 내에서 안정성을 확장시키고 유도하여 GI 점막에서의 과도한 염증을 억제하는 것을 보여준다.하기 실시예는 또한 LANCL2를 활성화시킴으로써 BT-11의 면역대사 효과의 제1 증거를 제공한다. 이들 데이터는 다수의 질환 또는 상태, 특히 이와 연관된 염증의 면역대사 치료에서 BT-11의 사용을 시사한다.
재료 및 방법
마우스.
C57BL/6 배경의 Rag2-/-는 Jackson Laboratories로부터 입수하였다. FVB 배경의 Mdr1a-/-는 Taconic biosciences로부터 입수하였다. C57BL/6 배경의 Lancl2-/- 및 Lancl2fl/fl을 상용 소스와의 협업을 통해 생성하였다. Lancl2fl/fl 마우스를 CD4-cre 트랜스제닉(transgenic) 마우스로 사육하여 T 세포 특이적 Lancl2 녹아웃 동물(Lancl2ΔT)을 생성하였다. 안락사는 CO2 마약에 이어 2차 자궁경부 탈구로 시행하였다. 실험 동물은 실험에 진입시 연령, 성별 및 체중이 일치하였다. 모든 연구를 IACUC의 승인으로 수행하였다.
실험적 IBD의 유도.
Mdr1a-/- 모델. Mdr1a-/- 마우스는 자발적인 대장염을 발생시킨다. 4 주령에, Mdr1a-/- 마우스는 입위관 섭식법을 통해 BT-11(8 mg/kg)으로 매일 치료를 받기 시작하였다. 대장염의 발병을 모니터링하기 위하여 매주 마우스의 체중을 재고 점수를 매겼다. 10 주령에, Mdr1a-/-를 다운스트림 분석을 위한 조직 수집을 위해 희생하였다. DSS 모델. Lancl2ΔT 및 Lancl2-발현 대조군에 7일 동안 식수 중 덱스트란 설페이트 나트륨을 제공하였다. 7일 후에, 표준 식수를 반환하였다. 매일 마우스의 체중을 재고 점수를 매겼다. 실험 타임라인의 7일 및 10일에 조직 수집을 위해 마우스를 안락사시켰다. 입양 전이 모델. WT 및 Lancl2-/- 공여자 비장을 분쇄하고 자기 분류(magnetic sorting)에 의해 CD4+ 분획에 대해 농축시켰다. CD4+CD45RBhiCD25-(Teff) 및 CD4+CD45RBloCD25+(Treg) 세포를 FACSAria 세포 분류기로 분류하였다. 지시된 실험군에 기초하여, Rag2-/- 수혜자 마우스는 복강 내 주사에 의해 WT 또는 Lancl2-/-기원으로부터 4x105개의 Teff 세포 및 1x105개의 Treg 세포를 받았다. 전이 후, 마우스는 매일 BT-11의 치료를 받았다. 전이 후 8 주에 안락사 될 때까지 매주 마우스의 체중을 재고 점수를 매겼다.
유세포 분석법.
대장 및 장간막 림프절(MLN)을 콜라게나제(300 U/mL) 및 DNA 분해효소(50 U/mL)를 포함하는 RPMI/FBS 완충액에 수집하여 소화시켰다. 생성된 단일 세포 현탁액의 여과 후, 면역 세포를 퍼콜(Percoll) 구배로 정제하였다. 96-웰 플레이트에서 순차적 라이브 염색으로 세포 외(CD45, CD3, CD4, CD8, CD19, NK1.1, CD25, F4/80, CD11b, CX3CR1, CD64) 및 세포 내(Tbet, RORγT, FOXP3, IFNγ, IL17, IL10) 항체의 혼합물로 세포를 표지하였다. FACSDiva 소프트웨어와 함께 FACS Celesta 유세포 분석기를 사용하여 데이터를 획득하였다.
유전자 발현.
Qiagen RNeasy 미니 키트를 사용하여 대장 및 세포의 총 RNA를 생성하였다. BioRad iScript cDNA 합성 키트를 사용하여 cDNA를 생성하였다. Taq DNA 중합효소와의 표준 PCR 반응으로부터 정제된 생성물의 연속 희석에 이어 Qiagen MinElute PCR 정제 키트를 사용하여 정제함으로써 표준 곡선을 생성하였다. BioRad CFX96 열순환 소자(Thermal cycler)에서 SybrGreen supermix를 사용한 정량적 실시간 PCR으로부터 발현 수준을 획득한 후 앞에서 설명한바와 같이 β-actin의 발현을 정규화하였다[33].
조직병리학.
H&E 염색된 대장 섹션을 10% 완충 포르말린으로 수집하고 파라핀에 포매된 대장의 일부로부터 제조하였다. 올림푸스 현미경을 통해 보드-인증된(board-certified) 수의 병리학자에 의해 슬라이드를 검사하고 이미지-프로 소프트웨어로 이미지를 수집 하였다. 백혈구 침윤, 상피 침식 및 점막 비후에 대해 샘플을 스코어링하였다(0 내지 4).
대사 분석.
대장 및 세포를 분석 특이적 완충액 내에 현탁시키고 10초 동안 균질화시켰다. 균질물을 10,000 x g에서 10분 동안 원심분리 하였다. 효소 활성 분석을 위해, 상청액을 수집하고 플레이팅 하였다. 샘플을 효소 현상액 및 기질과 혼합하였다. NADH 생성의 비색 검출을 Gen5 소프트웨어와 조합하여 BioTek μQuant 플레이트 리더를 사용하여 측정하였다. PEP 검정을 위해, 상청액을 과염소산 매개 정제를 사용하여 탈단백질화하였다. 샘플을 플레이팅하고 프로브, 변환기, 현상액 혼합물과 혼합하였다. PEP 농도를 플레이트 리더상에서 흡광도 정량화에 의해 측정하였다.
시험관 내 CD4+ T 세포 배양.
WT 및 Lancl2-/-마우스로부터의 비장을 절제하고 분쇄하여 단일 세포 현탁액을 생성하였다. CD4+ T 세포 분획을 BD IMag 시스템에 의한 자기 분류를 통한 음성 선택에 의해 농축하였다. 나이브 CD4 + T 세포를 비오티닐화된 CD62L 항체와 함께 인큐베이션 한 후 스트렙타비딘 코팅된 자성 비드에 컨쥬게이션함으로써 수득하였다. 나이브 세포를 전-트랜스 레티노산 및 정제된 TGF-β를 함유하는 완전한 IMDM 배지에서 항-CD3 코팅된 조직 배양 플레이트 내에서 48시간 동안 인큐베이션하여 Treg로의 분화를 자극하였다[18]. 0 내지 48시간의 지시된 농도의 BT-11을 함유하는 배지에서 세포를 플레이팅하였다. 대사 조절제, PS-48(5 μM), DASA-58(10 μM), 및 탑시가르긴(10 nM)을 0시간에 첨가하였다. 공동-검정을 위해, CD4+ 분획 및 Treg를 기재된 바와 같이 생성하고 동일한 웰 내에서 BT-11없이 각각 2x105 세포의 1:1 비율로 플레이팅하고 24시간 동안 함께 인큐베이션하였다. 검정 6시간 전에, 세포를 PMA 및 아이오노마이신으로 자극하였다. 유세포 분석법, 유전자 발현 및 대사 분석에 의한 다운스트림 분석을 위해 플레이트로부터 세포를 수집하였다.
인간 PBMC의 단리 및 배양.
신선한 비 식별(de-identified) 전혈을 상업적 공급 업체로부터 수득하였다. LeukoSep 튜브에 의해 혈액을 희석하고 PBMC 분획에 대해 정제하였다. 나머지 적혈구를 저장성 용해(hypotonic lysis)로 용해하였다. 세포를 완전한 RPMI 배지에서 항-CD3 코팅된 웰에 플레이팅하고 24시간 동안 BT-11과 함께 인큐베이션하였다. siRNA 실험을 위해, 세포를 먼저 ViromerGreen 형질감염 시약 내에 현탁된 OriGene 3-mer LANCL2 siRNA 또는 스크램블된 대조군과 함께 6시간 동안 인큐베이션하였다. 6시간 후, 세포를 세척하고 BT-11을 함유하는 새로운 배지에 재현탁시켰다. 검정 6시간 전에 세포를 PMA 및 아이오노마이신으로 자극하였다. BT-11 처리 48시간 후, 유세포 분석법, 유전자 발현 및 대사 분석을 위해 세포를 수집하였다.
통계 분석.
데이터를 평균 및 SEM으로 표현한다. ANOVA를 사용하여 파라메트릭 데이터를 분석한 후 Scheffe' 다중-비교 테스트를 수행하였다. SAS(SAS Institute, 노스캐롤라이나주 캐리 소재)의 일반적인 선형 모델 절차를 사용하여 ANOVA를 수행하였다. 유전자형과 치료를 비교하는 2 x 2 인자 배열을 사용하였다. 통계적 유의성을 P < 0.05에서 측정하였다.
결과
BT-11은 IBD의 Mdr1a-/-모델에서 염증의 조직병리학적, 세포성 및 분자 마커를 감소시킨다.
Mdr1a-/-마우스를 8 mg/kg BT-11 또는 비히클을 4 주령부터 시작하여 6 주 기간에 걸쳐 매일 경구로 위관섭식하였다. BT-11로의 구강 치료는 6 주 기간에 걸쳐 질병의 발병을 방지하고(도 1a, 패널 A), 10 주령에 대장 백혈구 침윤, 상피 침식 및 점막 비후를 감소시켰다(도 1a, 패널 B 및 C). 유세포 분석법에 의해, Th1(CD4+Tbet+IFNγ+) 및 Th17(CD4 RORγT+IL17+) 세포에서의 유의한(P <0.05) 감소는 BT-11 처리로 대장 고유판(LP)(도 1b, 패널 D 및 E) 및 장간막 림프절(MLN)(도 1c, 패널 G 및 H) 내에서 발생 하였다. 이에 반하여 BT-11은 대장 LP에서 CX3CR1+ 대식세포 (CX3CR1+F4/80hiCD11b+CD64+) 및 대장 LP 및 MLN에서 유도된 Treg 세포(CD4+FOXP3+IL10+)를 포함한 IL-10-생성 세포 서브세트의 백분율을 증가시켰다(도 1b, 패널 F; 도 1c, 패널 I). 염증성 사이토카인, IFNγ(도 1d, 패널 J), IL17A(도 1d, 패널 K), IL6(도 1f, 패널 O), TNFα(도 1e, 패널 M), 및 MCP1(도 1e, 패널 L)의 하향조절을 대장 유전자 발현 및 세포계량 비드 어레이에 의해 검증하였다. 또한, BT-11 상향조절된 전체 대장 Lancl2를 사용한 경구 치료(도 1f, 패널 N). 예방적으로 기능하는 것 외에도, BT-11은 7 주령에 증상이 나타난 후 시작하여 치료적으로 제공될 때 효능을 나타낸다.
CD4+ T 세포에서 LANCL2의 발현은 BT-11의 치료 효능에 필요하다.
LANCL2의 CD4-특이적 결실을 갖는 마우스(Lancl2fl/flCD4cre+; Lancl2ΔT)를 cre-lox 기술을 사용하여 생성하였다. Lancl2ΔT 및 Lancl2-발현 대조군을 7일의 DSS 기간에 노출시키고 경구 BT-11 또는 비히클 대조군으로 처리하였다. CD4+ T 세포에서 LANCL2의 손실은 BT-11의 효능을 제거하였다(도 2a 내지 2c). Lancl2ΔT는 증가된 질환 활성, 체중 손실 및 대장 조직병리학적 병변의 증가된 중증도를 나타냈다(도 2a, 패널 A 및 B; 도 2b, 패널 C). 세포 수준에서, BT-11로 처리된 Lancl2ΔT는 대장 LP에서 Th1 및 Th17 세포에서 특징적인 감소를 유도하지 않았을뿐만 아니라 IL-10-생성 CX3CR1+ 대식세포를 확장시키지 못했다(도 2c, 패널 D 내지 F). BT-11-처리 및 미처리 Lancl2ΔT 마우스는 대장 내에서 더 큰 수준의 염증성 사이토카인을 발현시켰다(도 2c, 패널 G 내지 J).
BT-11로의 경구 치료는 Treg-의존적 메카니즘에서 염증을 억제한다.
BT-11의 작용의 세포 기전 및 이의 치료 효능의 T 세포-의존성을 더 특성화하기 위해, 본 발명자들은 야생형(WT) 또는 Lancl2-/- (KO) 공여자로부터 이펙터(Teff) 및 조절(Treg) CD4+ T 세포의 Rag2-/- 마우스로의 공동-전이를 사용 하였다(도 3a 내지 3c). 전이된 WT Teff 실험군 중에서, 공동-전이된 WT Treg 군만이 질병 활성(도 3a, 패널 A 및 B), 조직병리학적 평가(도 3b, 패널 C), 직장 LP에서의 Th1(도 3b, 패널 D) 및 호중구(도 3b, 패널 E) 집단 및 염증성 사이토카인(도 3c, 패널 F 내지 H)의 발현을 포함하는 모든 측정에 걸쳐 BT-11 처리로부터 염증의 일관된 감소를 경험하였다. 특히, WT Teff/KO Treg 군은 염증의 세포 또는 조직병리학적 특성에서 BT-11 처리의 이점을 나타내지 않았다. 유사하게, 경구 BT-11 처리는 KO Teff의 공동-전이에도 불구하고 WT Treg 세포의 수혜자에서 효능을 나타냈다. 이들 마우스는 WT Teff/WT Treg 군과 동등한 질병 활성, 백혈구 침윤, Th1 및 호중구 측정을 가졌다. DSS로 챌린지된 Lancl2ΔT 마우스에서의 효능 손실과 조합된 이러한 발견은 BT-11 작용 기전이 Treg 세포 내에서 LANCL2 활성화를 통한 것임을 더 검증한다.
BT-11로 Treg를 처리하면 억제 능력과 표현형 안정성을 증가시킨다.
입양 전이 모델에서 발견한 사실을 직접 검증하기 위해, CD4+ 및 Treg 세포의 공동-검정을 수행하였다. WT 및 KO 공여자로부터의 Treg 세포를 Treg 분화 배지(ATRA, TGFβ) 내에서 배양하고 2일 기간 동안 BT-11로 처리하기 위해 단리하였다. 2일 후, 세포를 수집하고 새로 수집된 CFSE-표지된 CD4+ T 세포로 플레이팅하였다. BT-11로 처리된 WT Treg는 세포계량 비드 어레이에 의해 측정된 바와 같이 TNFα 및 IFNγ의 발현에 더하여 WT 및 KO 세포 양쪽 모두의 증식 지수를 낮췄다(도 4, 패널 A 내지 C). 이에 반하여, BT-11을 사용한 KO Treg의 전처리는 어느 측정에서도 변화를 유도하지 않았다. BT-11로 전처리된 WT Treg는 또한 24시간 공동-검정 기간 후 Treg(FOXP3+IL10+) 표현형의 더 큰 보유를 나타냈다. 현상을 조사하기 위해, 본 발명자들은 Socs2, Capn3, Irf7, Lag3, Ikzf2, 및 P2rx7을 포함하여 Treg 표현형[34]의 안정성을 정의하는 유전자의 패널의 발현을 검정하였다(도 4, 패널 D 내지 I). Socs2, Capn3, Irf7, 및 Lag3은 48시간의 BT-11 처리 후 WT Treg의 용량-의존적 증가를 나타내어, 0.625 μM BT-11의 투여량에서 발현의 유의한 상향조절을 초래하였다. P2rx7은 저용량에서는 효과가 없었지만, 0.625 μM BT-11 용량에서는 유의하게 상향조절되었다(P <0.05). 한편, Ikzf2는 유의한 유전자형 차이를 나타내는 유일한 유전자였다. Treg 세포 표현형 보유의 관찰과 조합되어, 이러한 표현 결과는 BT-11에 의해 LANCL2의 활성화는 Treg-연관된 유전자의 안정적인 표현을 유도한다는 것을 시사한다.
BT-11은 포도당 플럭스 제어의 면역대사 메커니즘을 통해 Treg 세포 안정성을 유도한다.
CD4+ T 세포의 분화에 대한 포도당 대사에 LANCL2의 이전의 함축적 의미[35,36] 대사 프로파일의 중요성으로 인해, BT-11의 해당에 대한 영향을 조사하였다. 2개의 해당 효소인 Pkm2 및 Eno1의 발현을 시험관 내 Treg 세포에서 LANCL2의 손실에 의해 유의하게 변경하였다(도 5a, 패널 A 및 B). 기능적 효소 활성은 BT-11 처리에 의한 중대한 변화를 제공하였다. 효소 활성에 대해 검정된 경우, 0.625 μM로 처리된 WT Treg는 피루베이트 키나아제 활성의 증가를 나타냈다(도 5a, 패널 C). 피루베이트 키나아제의 기질, 포스포에놀피루베이트(PEP), 농도는 비히클-처리된 대조군과 비교하여 BT-11-처리된 Treg에서 유의하게 낮았다(도 5b, 패널 E). 또한, 피루베이트 탈수소효소(PDH)의 활성에 의해 입증되는 바와 같이, 트라이카르복실산(TCA) 사이클로의 진입을 특히 0.156 μM 및 0.625 μM의 용량에서 BT-11 처리에 의해 자극하였다(도 5b, 패널 F). PEP 및 PDH 활성에서 BT-11 유도된 감소를 PDH의 소분자 억제제인 PS-48로 처리함으로써 제거하였다(도 5b, 패널 G 및 H). 이는 해당 경로에 대한 BT-11 매개 효과가 TCA 사이클을 향한 기질의 효율적인 진행에 의존함을 시사한다. PS-48에 의한 처리는 BT-11에 의해 생성된 Treg의 증가된 분화를 제거한다(도 5b, 패널 D). 또한, 탑시가르긴에 의한 SERCA 신호전달의 억제는 Treg 세포 분화에서 BT-11 유도된 증가를 감소시키는 반면, DASA-58에 의한 피루베이트 키나아제 활성의 자극은 처리된 세포와 미처리 세포 양쪽 모두에서 높은 수준의 분화를 촉진하여, CD4+ T 세포 분화에 대한 말기 해당 과정의 중요성을 보여주고 있다.
BT-11의 대사 효과의 억제는 IBD로 Mdr1a-/-마우스에서 효능을 제거한다.
시험관 내 면역대사 발견을 검증하기 위해, Mdr1a-/-마우스에 PS-48 또는 비히클 대조군의 매주 복강 내 주사를 제공하였다. BT-11로 경구 처리되고 제공된 비히클 주사된 마우스는 이전에 관찰된 바와 같이 질병 활성, 조직병리학(도 6a, 패널 A 내지 D), 및 CD4+ T 세포 집단(도 6b, 패널 E 내지 G)에서 예상되는 경향을 나타냈다. 시험관 내 대사 변화는 BT-11 처리로 PEP 농도가 감소하고 PDH 활성이 증가된 10 주령의 결장 내에서 검증되었다(도 6b, 패널 H 및 I). 또한, Treg 세포-안정성 연관된 유전자의 발현을 BT-11 처리로 상향조절하였다(도 6b, 패널 J; 도 6c, 패널 K 내지 O). 임상, 세포 및 대사 측정 전반에 걸쳐, PS-48은 BT-11-유도된 변화를 효과적으로 차단하였다. PS-48 주사로, 비-BT-11 및 BT-11 처리된 마우스는 조직학, CD4+ T 세포 집단, 및 대사 측정에서 관찰 가능한 차이가 없었다. DSS 모델 내에서 유사한 패턴을 관찰하였다.
BT-11은 크론병 공여자로부터 단리된 PBMC에서 항 염증성 효과를 유도한다.
전혈을 임상적으로 경증 내지 중등도 질환으로 분류된 크론병 환자로부터 수득하였다. BT-11로 처리될 경우, 단리된 PBMC는 더 높은 백분율의 IL-10+ 및 FOXP3+ 세포 및 더 낮은 백분율의 TNFα+ 및 IFNγ+ 세포를 가졌다(도 7a, 패널 A 및 B;도 7b, 패널 C 및 D). 인간 세포에서 BT-11의 LANCL2 특이성을 보여주기 위해, PBMC를 Lancl2 siRNA 또는 스크램블된 대조군으로 형질감염시켰다. siRNA 형질감염 후, IL10+ 및 IFNγ+ 세포에 대한 BT-11 효과는 소실되었다(도 7c, 패널 E 및 F). PBMC 분획으로부터, 순수한 CD4+ T 세포를 수득하였고 BT-11의 존재 하에 Tregs로 분화시켰다. 마우스 세포 내에서 관찰된 바와 같이, BT-11은 용량 의존 분획에서 안정성-연관된 Treg 마커의 상향조절을 유도하였다(도 7d, 패널 G 내지 L). 또한, 피루베이트 키나아제 및 피루베이트 탈수소효소 활성에서의 대사 패턴을 인간 Treg 내에서 관찰하였다(도 7e, 패널 M). 탑시가르긴은 BT-11로 처리된 PBMC에서 FOXP3+ 세포의 증가된 유도를 방지하였다(도 7e, 패널 N). 한편, BT-11은 증강된 PEP 농도의 존재 하에서 세포가 이펙터 표현형에 대한 증가된 경향(commitment)을 방지하였다(도 7e, 패널 O). 이들 결과는 BT-11 효능이 인간에로의 전환 가능성을 보여준다.
고찰
BT-11은 IBD 및 다른 염증성 상태에 대한 경구 활성의 국소-작용하는 최초의(first-in-class) 치료제이다. 이 연구를 통해, 본 발명자들은 IBD의 세 가지 별도의 마우스 모델에서 치료 효능을 보여주고 LANCL2를 통해 BT-11의 새로운 면역대사 작용 기전을 정의한다. BT-11은 GI 내에서 국소화된 작용을 위해 설계되고 최적화된 물리화학적 특성을 갖는 소분자 치료제로서, 전신 부작용에 대한 위험을 최소화한다. 1,000 mg BT-11/kg의 한계 선량까지 생쥐의 양성 안전성 프로파일[32]은 잠재적 부작용에 대한 위험이 낮음을 더 나타낸다. BT-11은 이의 활성화를 헛된 것으로 만들어 버릴 임의의 유전자 돌연변이를 보유하는 것으로 알려져 있지 않은 LANCL2 경로를 표적으로 하므로, 상피 및 면역 세포에서 GI 점막 내에서 강하게 발현되는 신규한 면역조절 메커니즘을 이용한다. 이 원고에서, 본 발명자들은 IBD, 이펙터 및 조절 CD4+ T 세포의 불균형에서 근원적 문제에 영향을 미침으로써 BT-11 기능을 식별한다. 또한, 본 발명자들은 BT-11 위장관에서 LANCL2의 낮은 수준의 발현을 높이고 구출할 수 있어서, IBD에서 염증에 의해 유도된 임의의 기능적 이상을 복원할 수 있음을 보여준다.
결정적인 동물 모델의 부재는 IBD와 같은 다원적 질환에서 신규 치료제의 개발에 특징적인 문제이다. 이 목적을 위해, 본 발명자들은 유도의 화학, 세포 및 유전적 방법을 포함하는 양호하게 확립된 모델에서 BT-11의 효능을 검증하였다. BT-11은 DSS 모델에서 상피 세포 장벽 기능의 상실 및 박테리아의 전좌에서도 활발한 염증을 억제하여 일시적인 상피 손상의 존재 하에서 점막 항상성을 유지할 수 있는 능력을 시사한다. 한편, 입양 전이 모델에서, BT-11은 인식되지 않은 환경에서 T-세포 구동 염증을 차단하는 능력을 나타낸다. 비 유해 항원에 대한 인식 상실로 인해 IBD 병인에 대해 일반적으로 제안되는 요소인 이 능력은 성공적인 치료에 중요하다.
Mdr1a-/-모델은 구체적으로 인간 번역 가능성의 유망한 모델이다. 면역 손상된 마우스를 생성하는 다른 유전적 질병 모델과는 달리, Mdr1a-/- 마우스는 면역적격이며[37], 그 결실은 대신 분자를 유출시키고 세포 스트레스를 방지하는 세포 능력에 영향을 미치게 된다. 폐기물 및 부산물의 축적은 상피 세포 수명의 조절곤란 및 염증성 사이토카인 및 케모카인의 증가된 분비로 이어진다. 따라서, 그것은 상피 내에서 발생하는 1차적인 개시 사건과 함께 질병의 만성적이고 자발적인 발병을 제공한다. 또한, MDR1 유전자는 IBD에 대한 새로운 위험 대립 유전자이며 글루코코르티코이드 기반 치료에 대한 반응성에 영향을 준다[38,39]. MDR1 유전자인 1236T 내의 특정 다형성(polymorphism)은 또한 CD 환자의 절제 수술 위험 증가와 연관이 있다[40]. 이 유전자의 부재 하에서 치료 효능을 제공하는 BT-11의 능력은 유전자 이상의 존재 하에 견고성을 나타내는 중요한 표시이며 인간 번역에서 효능을 시사한다.
면역대사의 학제간(interdisciplinary) 분야에서 발전은 자가 면역 질환, 소화 장애 및 암의 발달에 대한 이해와 점점 더 연결되고 치료제 개발을 위한 새로운 미개척 기회를 제공한다. 말기 해당에서 BT-11의 작용 기전의 관여는 Treg 세포의 분화 및 안정성 및 완화의 유도에서 특히 3배 중요하다. 첫째, Eno1의 증가된 전사는 더 큰 억제 능력과 연관된 FOXP3의 아이소형인 FOXP3-E2의 발현을 감소시킨다[22]. 유리 에놀라아제 자체가 변경된 FOXP3 발현에 연결될 수 있지만, FOXP3 프로모터의 전사 억제자인 MBP1은 Eno1 유전자로부터 전사된 대안적인 아이소형이다[41]. 해당 내에서 효소 아이소형의 감소된 전체 Eno1 전사 및 점유는 MBP1 발현을 감소시키고 FOXP3 발현의 억제를 방지한다. 둘째, 락테이트 생성과 TCA 사이클로의 진입 사이의 균형은 Teff(자가 면역 질환에 기여)와 Treg(자가 면역 질환 치료 또는 예방) CD4 + T 세포 서브세트 사이의 중요한 분할이며, 이 분할을 제어하는 다중 요인이 자가 면역 또는 염증성 질환에 의해 영향을 받는 조직에서 Treg 집단 및 내성을 생성 및 유지하는 능력과 연결되어 있다. 셋째, 피루베이트로 PEP를 효율적으로 처리하는 능력은 방해받지 않는 SERCA 신호전달에 대한 요구 사항이다[19,23]. SERCA 경로를 통한 적절한 신호전달은 FOXP3의 전사 활성자의 활성에 대한 체크 포인트로서, STAT3가 히스톤 아세틸화를 통해 침묵인자(silencer) 부위인 CNS2 영역에 결합하는 능력에 영향을 미친다[42]. 이들 히스톤 변형은 Treg 세포 분열에서 FOXP3의 지속적인 발현에 필수적이며, 이들의 손실은 장 염증 억제에 실패하게 된다[43,44]. 변경된 메틸화 패턴으로, Treg는 염증성 사이토카인과 IBD와 연관된 중간 표현형의 공동 생산에 더 민감하다[45]. 세포 내 PEP의 축적은 락테이트 생성에서 소포체 스트레스의 생성에 이르는 다중 염증 경로를 촉진할 수 있으며[46,47], 염증성 면역 세포의 생성과 상피 세포의 생존에 기여하게 된다. CD4+ T 세포에서 SERCA 신호전달의 영향은 현재 IBD에서 밝혀지지 않았지만, 억제된 SERCA 기능은 이전에 대장 및 소장의 수축 감소와 관련되어 있어 기계감각(mechanosensory) 거동이 변경되었다[48].
Treg 세포 안정성-연관된 유전자의 전체 패널의 증가된 발현은 FOXP3 활성 또는 전사 인자의 상류 제어에 직접 BT-11의 효과를 시사한다. 유전자는 함께 더 큰 억제 능력 및 안정성을 나타내지만, 이들 하류 표적은 질병에 중요한 개별 영향을 미친다. Irf7은 FOXP3 발현을 증가시킬 수 있으며[49], 이의 부재는 대장염의 중증도를 악화시킨다[50]. Lag3은 억제 능력을 위한 중요한 표면 분자이며, 이의 발현은 IBD에서 Treg-기반 처리의 효능을 크게 향상시킨다[51]. Socs2는 IFNγ 발현[52] 및 항원 제시 세포의 활성화[53]를 하향조절할 수 있다. 전반적으로, BT-11은 보다 안정적이고 항 염증성 Treg 세포 집단의 확립을 촉진하는 조절 및 항 염증성 거동의 증가를 제공한다.
본 발명자들은 BT-11 처리가 공동 검정에서 CD4+ 증식의 증가된 억제를 통해 그들의 분화에 더하여 Treg 세포의 거동에 이득이 된다는 증거를 제공한다. 이 원고 내의 결과는 주로 iTreg의 작용에 중점을 두지만, 자연 발생적 Treg의 집단에 대한 BT-11의 평가는 치료제에 대한 추가적인 통찰력을 제공한다. 특히, Ikzf2 유전자에 의해 인코딩되고 nTreg 및 iTreg의 구별에 대한 후보 마커인[54,55]에 의해 인코딩된 Helios는 LANCL2의 발현에 의해 영향을 받아 nTreg 세포의 생성에서 LANCL2 활성화에 대한 잠재적인 역할을 시사한다. 질병 중증도에서 IBD 및 플레어-업의 발병은 식이 섭취의 작은 변화 및 전통적으로 비 유해성 항원에 대한 반응성의 자발적인 발달과 함께 공생 창자 미생물군유전체와 연결되어 있다. 현재의 지식으로 BT-11을 이용한 구강 치료는 이러한 상황에서 국소 내성을 유도하고 회복시킬 것으로 예상된다.
BT-11은 검증된 마우스 세포 및 IBD의 모델에서 치료 효과뿐만 아니라 인간 번역에 대한 잠재성을 지원하여 인간 PBMC에서 강력한 효과를 촉진한다. BT-11은 중등도 내지 중증의 질병을 앓고 있는 크론병 환자로부터 얻은 세포에서 2개의 현저한 염증성 사이토카인인 TNFα 및 IFNγ의 생성을 감소시킨다. TNFα 발현에서 자연적 감소를 유도하는 능력은 중등도 내지 중증 크론병 환자 내에서 항-TNFα 생물학적 제제로서 유사한 치료 공간을 점유할 가능성을 시사한다. 사이토카인 생성 및 세포 분화의 급격한 변화 외에도, 본 발명자들은 식별된 작용 기전이 LANCL2 특이성 및 면역대사 경로 측면에서 뮤린에서 인간 세포로 번역된다는 것을 보여준다. 공유된 작용 기전은 질병 및 병리의 전임상 모델로부터 임상 시험으로의 치료 효능의 번역에 대한 타당성을 확립한다. 이 연구와 이전의 노력을 통해[31,32], BT-11은 크론병, 궤양성 대장염, 및 다른 상태를 치료하기 위한 보다 안전하고, 보다 효과적인 구강 치료제에 대한 충족되지 않은 임상 요구를 해결하기 위한 유망한 치료제로 부상하였다. LANCL2를 통한 새로운 면역대사 메커니즘을 활용하여 BT-11은 치료를 위한 독특한 공간을 차지한다.
데이터는 클로스트리디움 디피실과 같은 감염성 질환, 다른 박테리아성 질환, 및 다른 감염성 질환; 가족성샘종폴립증, 대장암, 위장관의 다른 암, 및 다른 암과 같은 과증식성 장애; 안데르센병, 다른 글리코겐 축적병, 및 다른 대사 장애와 같은 선천 대사 장애; 죽상 동맥 경화증, 다른 심혈관 질환, 고혈압, 및 다른 면역대사 질환과 같은 만성 면역대사 질환; 루프스, 다발성 경화증, 암 면역요법-유도된 류마티스성 질환, 다른 암-면역요법-유도된 자가 면역 질환, 및 다른 자가 면역 질환과 같은 자가 면역 질환; 장기 이식 거부; 급성 대장 게실염 및 방사선 직장염, 방사선 장염, 및 방사선 직장 S상 결장염과 같은 위장관의 방사선-유도된 염증, 및 다른 염증성 장애와 같은 염증성 장애; 및 섬유근육통 및 다른 유형의 만성 통증과 같은 만성 통증을 치료하기 위해 본원에 기재된 B-11 또는 다른 LANCL2-결합 화합물, 또는 본원에 기재된 BT-11 또는 다른 LANCL2-결합 화합물로 활성화된 세포의 효능을 나타낸다.
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BT-11의 경구 투여를 통한 면역대사 메커니즘을 이용한 클로스트리디움 디피실 의 치료
도입
클로스트리디움 디피실 감염(CDI) 비율을 높이면 항생제 선택 요인, 감염 -제어 조치 실패, 및 현재 치료요법에서의 결함을 강조한다. 반코마이신과 메트로니다졸을 이용한 항균 요법은 85 내지90%의 예상 반응률을 생성하며 두 작용제 모두에 대해 20 내지 25%의 재발 위험이 동반된다[1-3]. 메트로니다졸은 반코마이신 내성에 대한 저비용 및 감소된 선택성 압력으로 인해 바람직한 제1선 요법이다. 그러나, 두 처리 양쪽 모두는 클로스트리디움 디피실에 대한 집락 저항성을 제공하는 정상적인 대장 미생물 총을 완전히 파괴한다[4, 5]. 최근의 연구는 차선의 1차 반응과 예상보다 높은 재발률의 관점 양쪽 모두에서 CDI를 치료하기 위한 메트로니다졸의 효능에 의문을 제기하였다[6, 7]. 따라서, 항생제가 없고 항생제 관리 및 미생물군유전체 보존을 촉진하는 화합물의 최적화는 신규하고, 시의 적절하며 시급히 필요하다. 하기 실시예는 클로스트리디움 디피실 감염을 치료하기 위해 면역대사 작용을 활용한다.
방법
클로스트리디움 디피실 동물 모델.
이 연구는 클로스트리디움 디피실 감염의 이전에 보고된 모델을 따랐다[11,13,14]. 박테리아 챌린지 전에, 마우스를 식수 중에 항생제의 혼합물로 처리하였다: 콜리스틴 850 U/mL(4.2 mg/kg), 젠타마이신 0.035 mg/mL(3.5 mg/kg), 메트로니다졸 0.215 mg/mL(21.5 mg/kg), 및 반코마이신 0.045 mg/mL(4.5 mg/kg)에 이어서 감염 하루 전, 클린다마이신 32 mg/kg을 복강 내 주사하였다. 감염성 챌린지는 위관섭식을 통한 브루셀라 브로스(broth)에서 클로스트리디움 디피실 균주 VPI 10463(ATCC 43255) 107 cfu/마우스에 의한 것이었다.
유세포 분석법.
대장 및 장간막 림프절(MLN)을 콜라게나제(300 U/mL) 및 DNA 분해효소(50 U/mL)를 포함하는 RPMI/FBS 완충액에 수집하여 소화시켰다. 생성된 단일 세포 현탁액의 여과 후, 면역 세포를 퍼콜(Percoll) 구배로 정제하였다. 96-웰 플레이트에서 순차적 라이브 염색으로 세포 외(CD45, CD3, CD4, CD8, CD19, NK1.1, CD25, F4/80, CD11b, CX3CR1, CD64) 및 세포 내(Tbet, RORγT, FOXP3, IFNγ, IL17, IL10) 항체의 혼합물로 세포를 표지하였다. FACSDiva 소프트웨어와 함께 FACS Celesta 유세포 분석기를 사용하여 데이터를 획득하였다.
유전자 발현.
Qiagen RNeasy 미니 키트를 사용하여 대장 및 세포의 총 RNA를 생성하였다. BioRad iScript cDNA 합성 키트를 사용하여 cDNA를 생성하였다. Taq DNA 중합효소와의 표준 PCR 반응으로부터 정제된 생성물의 연속 희석에 이어 Qiagen MinElute PCR 정제 키트를 사용하여 정제함으로써 표준 곡선을 생성하였다. BioRad CFX96 열순환 소자(Thermal cycler)에서 SybrGreen supermix를 사용한 정량적 실시간 PCR으로부터 발현 수준을 획득한 후 앞에서 설명한바와 같이 β-actin의 발현을 정규화하였다[12].
조직병리학.
H&E 염색된 대장 섹션을 10% 완충 포르말린으로 수집하고 파라핀에 포매된 대장의 일부로부터 제조하였다. 올림푸스 현미경을 통해 보드-인증된(board-certified) 수의 병리학자에 의해 슬라이드를 검사하고 이미지-프로 소프트웨어로 이미지를 수집 하였다. 백혈구 침윤, 상피 침식 및 점막 비후에 대해 샘플을 스코어링하였다(0 내지 4).
박테리아 재-단리.
절제된 대장에서 대장 내용물을 수집하였다. 샘플을 브루셀라 브로스에서 균질화하고 1시간 동안 68℃에서 인큐베이션하였다. 샘플을 10,000 rpm에서 30초 동안 원심분리하고 상청액을 수집하였다. 상청액을 연속 희석하고 (1:10, 1:100, 1:1000), 클로스트리디움 디피실 선택적 보충제를 함유하는 옥소이드 클로스트리디움 디피실 한천 플레이트에 플레이팅하였다. 플레이트를 37℃에서 2일 동안 BD EZ 혐기성 용기 시스템 키트를 사용하여 혐기성 조건에서 인큐베이션하였다. 콜로니를 계수하고 표준화를 위해 샘플 중량과 비교하였다.
결과
LANCL2는 위장관 미생물군유전체에 영향을 미친다.
클로스트리디움 디피실-감염된 마우스에서 LANCL2의 활성화는 비히클과 비교하여 dpi 4에서 baiCD 함량을 유의하게 증가시킨다(도 8, 패널 A). 지배적 부티로제닉 패밀리인 라크노스피라세(Lachnospiraceae) 및 루미노코카세(Ruminococcaceae)는 감염되지 않은 마우스에서 LANCL2의 손실에 따라 감소된다(도 8, 패널 B). 또한, 항균성 펩티드 DefB1 및 S100A8의 발현은 CDI로 상향조절되는 것으로 밝혀졌다[11]. ㄹ그러므로, 공생 미생물군유전체 역학은 클로스트리디움 디피실에 대한 반응으로 존재하는 염증에 의해 방해받으며, 이는 면역조절-기반 치료제가 클로스트리디움 디피실 확장 및 집락의 미생물총(microbiota)-매개 억제에 긍정적인 영향을 미친다는 것을 나타낸다[9].
BT-11은 클로스트리디움 디피실에 대한 항균 특성을 가지고 있지 않다.
클로스트리디움 디피실을 다진 고기 배지 내에서 및 양성 대조군으로서 BT-11, 비히클 또는 반코마이신을 함유하는 혐기성 조건에서 인큐베이션하였다. BT-11을 1 ug/mL, 10 ug/mL 및 100 ug/mL에서 시험하였다. 결과는 도 9에 도시되어 있다. 시험된 BT-11의 농도는 접종 24시간 후 콜로니 형성 단위의 감소를 유도하지 않았다. 한편, 반코마이신 10 ug/mL는 콜로니 형성 단위를 4 백만에서 200,000 미만으로 95% 감소시켰다. BT-11에 대한 노출은 독소 A 또는 독소 B의 생성 또는 포자 형성을 위한 클로스트리디움 디피실의 능력을 변화시키지 않았다.
BT-11은 질병의 심각도를 줄이고 사망률을 방지한다.
클로스트리디움 디피실-감염된 마우스에 감염 후 8 mg/kg/d BT-11을 투여하였다. 결과는 도 10a 내지 10c에 도시되어 있다. 2일 이후부터, BT-11 처리된 마우스는 더 낮은 수준의 증상을 나타내어 더 낮은 질병 활성도 점수를 초래하였다. BT-11은 비히클 처리된 대조군에서 60% 생존율로 관찰되는 사망률에 대한 완전한 보호를 제공하였다. 그러나, BT-11은 대장 내에서 클로스트리디움 디피실의 부담을 감소시키지 않았다. BT-11은 대장 내의 백혈구의 침윤 감소를 포함하여 대장 병리를 감소시켰다. 고유판 내에서, BT-11은 조절 T 세포의 증가를 제공하면서 호중구, Th1 및 Th17 세포를 감소시켰다.
고찰
LANCL2는 면역 매개[8] 및 감염성[9] 질병에 대한 치료제 표적으로 부상하였다. LANCL2는 위장관(GI)에서 상피 및 면역 세포에서 발현된다. LANCL2 활성화 및 BT-11 처리는 면역 및 대사의 인터페이스에서 반응을 조절하고 이러한 면역대사 메커니즘은 치료 작용을 발휘한다. 이러한 데이터는 CDI를 개선하기 위해 BT-11로 면역대사 메커니즘을 활성화시키는 타당성을 보여준다. CDI에서의 질환 병인이 부분적으로 그의 독소에 의해서뿐만 아니라 이상조절된 전 염증성 면역 반응으로 인해 유발된다는 것을 고려하여, 본 발명자들은 항 염증성 클로스트리디움 디피실 요법으로서 BT-11을 이용한 LANCL2를 표적화하는 효능을 평가하였다. 데이터는 BT-11로의 경구 치료가 CDI를 갖는 마우스에서 사망률, 감소된 질병 활성, 및 감소된 염증에 대해 완전한 보호를 제공한다는 것을 나타낸다.
CDI에서 질환 병인에 대한 면역학적 기여 중 가장 중요한 것은 염증성, 조직-손상 Th17 세포 및 조절 Treg 세포 사이의 불균형이다. 중요하게도, 본 발명자들은 BT-11이 CD4+ T 세포 내의 면역대사 경로에 영향을 미쳐 조절 세포 유형의 분화 및 안정성을 증진시키는 것을 본원에서 보였다. FOXP3 발현의 안정성을 증가시키는 이들 면역대사 경로는 CDI 동안 치료 작용을 제공하는데 결정적으로 중요하다. 고도로 강력한 박테리아 유래 독소 때문에, GI 점막은 점점 염증성 환경이 된다. 이러한 환경 변화는 항상성 및 미생물군유전체에 대한 내성에 관여하는 세포가 이러한 능력을 상실하게 하는데, 이는 공생 미생물군유전체의 이상을 악화시킨다. BT-11 및 면역대사 메커니즘을 통해, BT-11 처리는 염증 상태의 존재 하에서 억제 기능을 유지하고 질병을 예방하는 조절 세포를 촉진시킨다. 공생 식물체 후 항생제의 보충이 가속화됨에 따라, 미생물군유전체 자체는 경쟁에서 벗어나 클로스트리디움 디피실 성장을 억제할 수 있다.
본 발명자들은 본 발명의 제조된 세포를 동물에게 투여하는 것이 본 실시예에 도시된 BT-11을 직접 투여하는 효과를 모방할 것으로 예상한다.
참고문헌
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대장암 치료에 있어 BT-11의 치료 작용
대장암은 전 세계에서 세 번째로 많이 발생하는 암으로 2015 년 940 만 명 이상에게 영향을 미친다. 암 진행에서의 대사는 종양 세포 자체의 거동 및 종양 세포와 면역계 사이의 상호 작용 양쪽 모두에 기여한다. 종양 세포의 주지된 특징은 Warburg 효과인데, 산소가 존재하는 경우에도 혐기성 해당 작용을 선호한다. 포도당에서 락테이트로의 이러한 대사는 세포 성장 및 증식을 위한 빠른 에너지 공급원을 제공하고, 미세 환경을 산성화하고 세포독성 면역 세포에 필요한 대사 기질을 소비하는: 암 세포에 대한 다면적인 이점을 갖는다. 최근에, 이 과정을 표적으로 하는 것이 종양 진행, 성장 및 전이를 제어하는 효과적인 수단이라는 것이 밝혀졌다. 암 세포는 면역 세포에서 에너지 및 세포자살을 유도할 수 있으며, 인식 후 암 세포의 제거를 돕는 산화적 인산화로의 전환을 방지한다. 대사 프로파일에서 이러한 전환은 CD8+ 세포로부터 항 종양 반응을 향상시킬 수 있는 메모리 T 세포의 개발을 가능하게 한다. 그러므로, 면역대사를 표적화하는 것은 암 세포의 면역-매개 제거를 가능하게 하면서 종양 세포 성장을 제한하기 위한 치료를 나타낸다.
BT-11은 대장암 및 다른 암 치료를 위한 안전하고 비 독성 옵션을 제공한다. 암세포를 죽이는 것을 직접 목적으로 하는 다른 치료와 달리, BT-11은 면역계로부터 메모리 반응을 자극하면서 세포 증식을 제한하는 강력한 면역대사 효과를 유도할 수 있다. 세포에 BT-11의 투여하면 산화적 인산화 경로를 증가시키면서 락테이트 탈수소 효소의 활성 및 락테이트의 생성을 감소시킨다. 락테이트 대사의 BT-11-매개 억제는 세포 증식의 감소와 더 연결되어 있으며, 이는 종양 세포의 진행의 확장을 제한한다. 또한, 이러한 대사 영향은 완전히 확립된 면역회피 전략의 가능성을 감소시키는 종양 미세환경의 조절을 방지한다. 또한, 면역 세포 대사에 대한 BT-11의 직접적인 영향은 산화 적 인산화를 증가시키고 세포를 메모리 상태로 전이하도록 한다. BT-11은 메모리 CD4+ T 세포 개발을 유도하는 것으로 나타났다. BT-11은 종양과 면역 세포의 효능이 조합되어 대장암 및 다른 암 치료에 실행 가능한 화학요법 대안입니다. 본 발명자들은 본 발명의 제조된 세포를 동물에게 투여하는 것이 본 실시예에 기재된 BT-11의 효과를 모방할 것이라고 예상한다.
죽상 동맥 경화증에서 플라크 형성 및 동맥 염증의 예방
죽상 동맥 경화증은 동맥 벽 내의 섬유질 플라크에 의해 동맥이 좁아지는 것을 특징으로 하는 심혈관 질환이다. 죽상 동맥 경화증은 비만, 고혈압 및 부실한 식사로 기인하고 심장 마비, 뇌졸중 및 신부전의 발생에 기여하는 미국의 주요 사망 원인이다. 죽상 동맥 경화증은 내피 세포에 의해 분비되는 염증 매개체 및 고농도의 저밀도 지단백질로 인한 백혈구 세포의 활성화에 의해 유발되는 가장 중요한 면역대사 질환이다. 시간이 지남에 따라, 이 활성화는 동맥벽에 혈소판, 콜레스테롤 및 결정화된 칼슘의 침착으로 이어진다. 고지혈증 상태에서 변형된 지단백질에 지속적으로 노출되면 세포 내 스트레스의 만성적 증가로 인해 염증성 대식세포가 분극으로 이어진다. SREBP, LXR, 및 PPAR과 같은 주요 전사 인자의 변경된 자극은 NF-κB, NLR 및 다른 염증 경로의 활성화로 이어진다. 심혈관 질환에서 면역 대사의 또다른 주요 조절제는 AMPK이다. 2차 면역 세포에 의한 염증 매개체의 증가된 발현은 면역 세포에서 AMPK 활성을 감소시키고 지질 산화의 속도를 낮춘다. 감소된 AMPK 활성은 CREB 전사 인자 활성의 활성화 및 항 염증성 IL-10 생성과 같은 유리한 면역 반응의 직접적인 파괴로 이어진다. 신호전달의 파괴는 또한 에너지에 대한 지방산의 활용을 감소시키고 세포 칼슘 플럭스를 이상조절시킴으로써 플라크의 형성에 직접적으로 기여한다.
LANCL2는 IL-10의 생성 및 칼슘 신호의 조절뿐만 아니라 AMPK 및 CREB 활성에 연결된 상류 신호조절 요소이다. 이의 자연 발생 리간드인 아브시스산은 높은 지방 공급 동안 PPAR 활성 및 항 염증 반응의 조절과 연결되어 있다. BT-11은 인간 말초 혈액 단핵 세포에 투여될 때 전 염증성 죽상 동맥 경화증-연관된 사이토 카인, IFNγ 및 TNFα의 발현을 가능하게 감소시키고 또한 IL-10 생성을 증가시킨다. 이러한 효과와 밀접하게 관련되어 BT-11은 면역 세포에서 산화 능력을 증가시켜 칼로리 초과의 환경에서 대사 항상성을 유지할 수 있는 능력을 시사한다. 죽상 동맥 경화증에 의해 영향을 받는 면역 및 대사 경로 양쪽 모두에 영향을 미침으로써, BT-11은 죽상 동맥 경화증의 병리 및 질병을 치료하며 동맥벽에서 세포, 세포 단편 및 대사물의 지속적인 모집 및 침착을 방지한다. 본 발명자들은 본 발명의 제조된 세포를 동물에게 투여하는 것이 본 실시예에 기재된 BT-11의 효과를 모방할 것이라고 예상한다.
안데르센병에서 글리코겐 대사의 조절
안데르센병은 글리코겐 저장의 결함과 연결된 대사의 선천적 오류이다. 이는 글리코겐 분지를 담당하는 효소를 인코딩하는 GBE1 유전자의 결핍과 돌연변이에 의해 유발된다. 비 분지 글리코겐은 용해도가 낮아서 심장과 간에서 침전과 축적으로 이어진다. 추가 증거는 면역 세포가 이 비정상적인 글리코겐에 반응하기 시작한다는 것을 나타낸다. 폴리글루코산에 반응성인 항체는 안데르센병 및 라포라병 환자의 심장 및 간 조직으로부터 단리되었다. 면역 세포에 의한 폴리글루코산의 섭취 및 반응성은 심장 및 간 조직에의 손상을 악화시켜 환자 건강의 악화를 가속화시킬 수 있다. 이는 안데르센병 환자 내 키토트리오시다아제(chitotriosidase)의 상승에 의해 더 뒷받침된다. 키토트리오시다아제는 방어 반응 및 만성 간 질환 동안 대식세포에 의해 생성된 효소 및 염증 마커이다.
BT-11 및 다른 관련된 LANCL2 리간드는 포도당의 효율적이고 제어된 산화와 정렬되는 반면, LANCL2 활성화는 포도당의 항상성과 연결된다. BT-11 또는 다른 리간드에 의한 LANCL2의 활성화는 안데르센병 환자에서 글리코겐의 축적을 완화시킨다. 또한 BT-11 또는 다른 관련된 리간드의 이점에 기여하는 것은 방어 반응의 조절이다. 항체와 키토트리오시다아제의 생성은 면역계가 비 분지 글리코겐을 외래로 인식하여 염증을 증가시킨다는 것을 시사한다. BT-11 및 다른 관련된 리간드는 통상적인 항원에 대한 내성을 유도할 수 있다. 면역 내성을 유지함으로써, 비 분지 글리코겐은 분비되고 신체에서 제거될 수 있다. 본 발명자들은 본 발명의 제조된 세포를 동물에게 투여하는 것이 본 실시예에 기재된 BT-11의 효과를 모방할 것이라고 예상한다.
섬유근육통에서 대사 및 염증 이상의 회복
섬유근육통은 몸 전체에 광범위한 통증을 유발하는 장애이다. 상기 질환은 미국 내 3 백만 명 이상에 고통을 주고 있고 치료법이 없다. 현재 치료는 세로토닌 섭취 억제제, 진통제, 및 상기 질환으로 인한 만성 통증, 피로 및 기분 변화를 줄이는 것을 목적으로 하는 비 스테로이드성 항염증제를 포함한다. 최근에, 섬유근육통 환자는 호중구-유도 케모카인, IL-8, 및 광범위한 염증성 마커 C- 반응성 단백질과 같은 염증성 마커의 수준이 높은 것으로 확인되었다. 특히, 섬유근육통 환자의 아교 세포는 변경된 케모카인 및 사이토카인 프로파일을 생성하여, 상기 질환의 증상 및 발병기 내에 면역계의 관여를 나타낸다. 또한, 섬유근육통 환자 내의 면역 세포의 대사는 건강한 대조군과 비교하여 전이된다. 섬유근육통 단핵 세포는 증가된 과산화물 형성 및 지질 과산화와 함께 미토콘드리아 막 전위 및 코엔자임 Q10의 감소를 가졌다. 이들 변화는 염증성이 강한 면역 세포와 전반적인 산화 스트레스를 상징한다. 또한, 통증 및 다른 증상의 중증도는 조절 반응과 연관된 단핵구 하위집단을 갖는 섬유근육통 환자에서 역의 상관 관계가 있다.
LANCL2 또는 다른 면역 대사 경로를 표적으로 하는 BT-11 및 다른 관련된 화합물은 면역 세포 내에서 특정 대사 경로에 의해 유발된 산화 스트레스를 감소시킨다. 산화 스트레스의 감소 및 과산화물의 생성은 신경 세포의 과활성화 및 아교 세포의 자극을 감소시켜 염증성 케모카인을 생성할 수 있다. 또한, LANCL2의 활성화는 조절 서브세트를 향한 단핵구 및 다른 단핵 세포의 분극에 영향을 줄 수 있다. 이들 세포 서브세트는 항 염증 반응, 조직 항상성 및 상처 치유와 연관된다. 면역 세포의 대사 프로파일 및 조절 단핵구 서브세트의 분극에 대한 조합된 효과는 BT-11을 섬유근육통 및 다른 만성 통증 장애의 치료를 위한 신규하고 이상적인 후보로 만든다. 본 발명자들은 본 발명의 제조된 세포를 동물에게 투여하는 것이 본 실시예에 기재된 BT-11의 효과를 모방할 것이라고 예상한다.
염증성 질환의 치료를 위한 CD4+ T 세포의 생체 외 치료
면역대사 신호전달을 통한 BT-11은 시험관 내 세포 및 생체 내 면역 반응의 표현형 프로파일을 변화시킨다. 특히, BT-11은 염증 조건에서 FOXP3의 발현을 증가시키고, 억제 용량을 증가시키며, 이들 조절 세포의 안정성을 증가시키기 위해 CD4+ T 세포를 형성한다. 그러므로, BT-11로 생체 외에서 처리된 세포의 입양 전이는 염증성 장 질환, 이식편대숙주 질환, 및 본원에 기재된 다른 것들과 같은 부적절한 CD4+ T 세포 반응으로 염증성 질환 및 장애를 치료하는 데 유리하다.
방법
나이브 CD4+ T 세포를 자기 분류에 의해 마우스의 비장으로부터 단리하였다. 단리된 세포를 Treg 분화 배지에서 항-CD3/항-CD28 코팅된 96 웰 플레이트에서 인큐베이션하였다. Treg 분화 배지는 우 태아 혈청, HEPES, 페니실린/스트렙토마이신, L-글루타민 및 분화제가 보충된 Iscove 's Modified Dulbecco 's Medium(IMDM) 배지(ThermoFisher Scientific)였다. 상기 Treg 분화제는 10 nM 전-트랜스-레티노산 및 5 ng/mL TGF-β였다. Treg 분화 배지에서의 분화를 10 ng/mL IL-2 또는 IL-12의 첨가의 존재 및 부재 하에 비교하여 추가 실험을 수행 하였다. 세포를 검정 전에 48시간 동안 분화 배지에서 비히클, 10 nM 또는 100 nM BT-11과 함께 인큐베이션하였다. 검정 전에, 세포를 PMA 및 아이오노마이신으로 6시간 동안 자극하였다.
전이 실험에서, 공여자 비장을 분쇄하고 자기 분류에 의해 CD4+ 분획에 대해 농축시켰다. CD4+CD45RBhiCD25- (Teff) 및 CD4+CD45RBloCD25+ (Tregg) 세포를 FACSAria 세포 분류기로 분류하였다. 비히클 또는 BT-11(100 nM)의 존재 하에 단리된 Treg를 12시간 동안 배양하였다. 단리된 Teff를 비히클에서 12시간 동안 배양하였다. 지시된 실험군에 기초하여, Rag2-/- 수혜자 마우스는 복강 내 주사에 의해 비히클 또는 BT-11 처리군으로부터 4x105 Teff 및 1x105 Treg 세포를 받았다. 전이 후 5 주에 안락사 될 때까지 매주 마우스의 체중을 재고 점수를 매겼다.
대장 고유판 림프구 및 배양된 세포를 96 웰 플레이트(6x105 세포/웰)에 플레이팅하고, 전술한 바와 같이 유세포 분석법에 의한 면역 표현형 검사를 위해 처리하였다. 간략하게, 세포를 세포외 마커: CD45, CD4, CD3, CD25, CD8에 대한 형광 색소 접합된 항체와 함께 인큐베이션하였다. 2차 염색이 필요한 샘플을 2차 항체 또는 스트렙타비딘-접합된 형광 색소와 함께 인큐베이션하였다. 이어서, 상기 샘플을 고정시키고 투과화시켰다. 세포를 세포 내 마커: Tbet, IFNγ, IL10, FOXP3, IL17, RORγT에 대한 항체와 함께 인큐베이션하였다. 데이터를 BD FACS Celesta 유세포 분석기로 획득하고 FACS Diva 소프트웨어(BD Pharmingen)를 사용하여 분석하였다.
결과
BT-11의 효능에 CD25+ FOXP3+ 조절 CD4+ T 세포의 중요성으로, 본 발명자들은 그들의 분화 및 염증 상태에서 표현형을 유지하는 능력에 대한 BT-11의 직접적인 효과를 결정하는 것을 목표로 하였다. 나이브 CD4+ T 세포를 상기 기재된 방법에 따라 IL-2의 존재 또는 부재 하에 시험관 내 Treg로 분화시켰다. BT-11 처리(100 nM)는 IL-2의 부재 하에서 CD25+ FOXP3+ 서브타입의 확립을 유의적으로 증가시켰으며, 그 차이는 IL-2의 첨가에 의해 더욱 강조되었다(도 11a, 패널 A). 10 nM의 낮은 농도에서, BT-11은 IL-2의 존재 하에서 훨씬 더 많은 CD25+ FOXP3+ 세포를 유도하였다. 이들 분화 조건 하에서 혼합된 CD25+ Tbet+ 아형의 낮은 수준 만이 관찰되었으며, 이는 BT-11에 의해 통계적으로 변경되지 않았다(도 11b, 패널 B). 주목할 점은, BT-11의 존재 하에 부재한 IL-2의 첨가로 비히클 처리된 대조군에서 약간의 수치 증가가 발생하였다. 한편, BT-11은 IL-12-처리된 샘플에서 유의하게 더 높은 수준의 CD25+ FOXP3+ 세포를 유지하였다(도 11a, 패널 C). 이는 BT-11의 부재 하에서 IL-12-처리된 샘플에서 CD25+ FOXP3+ 세포의 억제와 대조된다(도 11a, 패널 C). BT-11은 이러한 혼합된 서브세트에 대해 용량-의존적 보호를 제공하였음에도 불구하고, IL-12의 첨가는 또한 모든 그룹에서 CD25+ Tbet+ 세포의 증가를 유도하였다(도 11b, 패널 D).
생체 내 BT-11에 의해 조절되는 신호전달 경로를 확인하기 위해, 본 발명자들은 10 주령에서 대장염 증세를 보일 시 비히클- 및 BT-11-처리된 Mdr1a-/- 마우스로부터 대장 CD4+ T 세포를 단리하였다. CD4+ T 세포에서, 경구 BT-11 처리는 IL-2 신호전달 경로의 두 구성원인 Stat5a(도 12a, 패널 A) 및 Foxo1(도 12a, 패널 C)의 유의하게 더 높은 발현을 초래하였다. 한편, Pten(도 12a, 패널 B) 및 Phlpp1(도 12a, 패널 D)의 발현은 약간 증가하였으나 유의하지는 않았다. 시험관 내에서, STAT5a는 기본 Treg 분화 배지 및 또한 IL-2 또는 IL-12가 보충된 Treg 분화 배지에서 BT-11-처리된 샘플에서 더 큰 비율로 인산화된다(도 12b, 패널 E). FOXO1은 기본 Treg 분화 배지 및 IL-2를 함유하는 Treg 분화 배지 양쪽 모두에서 유사하게 영향을 받지만, IL-12를 함유하는 Treg 분화 배지에서는 영향을 받지 않는다(도 12b, 패널 F). 세포는 또한 PTEN(SF1670) 또는 STAT5(STAT5i)에 대한 억제제의 존재 하에서 분화되었다. IL-2(도 12c, 패널 G, H) 또는 IL-12(도 12d, 패널 I, J)를 양쪽 모두 함유하는 Treg 분화 배지에서, STAT5i의 첨가는 CD25+ FOXP3+ 및 CD25+ Tbet+ 세포에 미치는 BT-11의 효과를 방지하였다. 이에 반하여, SF1670은 IL-2 함유 배지에서 CD25+ Tbet+ 세포에 미치는 BT-11의 효과만을 방지 하였다(도 12c, 패널 H).
Rag2-/- 마우스는 성숙한 T 및 B 림프구가 부족하다. 그러므로, 이들 마우스는 자기 내성, 미생물 항상성, 및 전반적인 면역 조절 메커니즘을 개발하지 못한다. 나이브 CD4+ T 세포의 Rag2-/- 마우스로의 전이는 염증성 장 질환을 포함하지만 여기에 한정되지 않는 활성인 염증성 자가 면역 질환에서 경험된 것들과 유사한 방식으로 전이된 세포의 생체 내 확장 및 염증성 표현형으로의 분화를 통한 이들 메카니즘의 부재로 인한 장 염증을 유도한다. 본 발명자들은 본 발명자들이 사례(case)인 것으로 발견한, 생체 외에서 BT-11로 처리된 조절 세포의 전이는 항상성 및 면역조절의 메커니즘을 수혜자 동물에게 부여할 것이라는 가설을 세웠다.
생체 외에서 BT-11(100 nM)로 처리된 Treg의 입양 전이는 전체 질환 중증도를 감소시켰고, 전이 후 5 주 동안 시험된 한계 기간까지 면역 이익의 유지를 제공하였다(도 13). 질환의 전반적인 개선에 더하여, BT-11로 Treg의 생체 외 처리는 대장 고유판 세포의 표현형을 변화시켰다. BT-11-처리된 Treg 군에서, IFNγ- 생성 및 IL-17+ RORγT+ CD4 + T 세포가 감소되었다. 한편, CD25+ Treg는 증가하였고, 이는 안정성 증가 및 조절 세포의 설립자(founder) 집단으로서 작용하는 능력을 증가시키는 것을 나타낸다. 또한, IL-2/STAT5 신호전달 축과의 상호작용은 전이된 세포의 효과를 증폭시키는 사이토카인 및 케모카인 미세환경에서의 중요한 변화를 촉진시킨다.
이들 결과는 생체 내 투여시 면역 세포에 대한 BT-11의 효과가 생체 외 면역 세포를 치료할 때 복제될 수 있음을 보여준다. 본 발명자들은 본 발명의 제조된 세포를 동물에게 투여하는 것이 IBD와 같은 염증성 질환 이외의 본원에 기재된 임의의 상태를 치료하는 데 효과적일 것으로 예상한다.
본 발명의 양태의 예시적인 실시형태
1. 화합물 또는 전구체 세포를 상기 화합물과 접촉시킴으로써 생성된 제조된 세포로 동물에서 상태를 치료하는 방법으로서, 상기 방법은 유효량의 상기 화합물 또는 상기 제조된 세포를 상기 동물에게 투여하는 단계를 포함하며, 상기 상태는 감염성 질환, 과증식성 장애, 선천 대사 장애, 만성 면역대사 질환, 자가 면역 질환, 장기 이식 거부, 염증성 장애, 및 만성 통증 중 적어도 하나를 포함하며, 상기 화합물은:
화학식 Z-Y-Q-Y'-Z'의 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염 또는 에스테르를 포함하고, 상기 식에서
Z는:
Figure pct00019
이고;
Y는:
Figure pct00020
이고;
Q는 피페라진-1,4-다이일; 2,5-다이아자바이사이클로[2.2.1]헵탄-2,5-다이일; 2,5-다이아자바이사이클로[2.2.2]옥탄-2,5-다이일; 1,4-다이아제판-1,4-다이일; 벤젠-1,4-다이아민-N1,N4-다이일; 에탄-1,2-다이아민-N1,N2-다이일; N1,N2-다이알킬에탄-1,2-다이아민-N1,N2-다이일; 프로판-1,3-다이아민-N1,N3-다이일; N1,N3-다이알킬프로판-1,3-다이아민-N1,N3-다이일; 1,4-다이아미노안트라센-9,10-다이온-1,4-다이일; C6 아렌-1,4-다이아민-N1,N4-다이일로서, 상기 아렌은 2, 3, 5, 또는 6 위치에서 1 내지 4개의 치환기로 치환되고, 그리고 상기 치환기는 ―C(O)O(C1 내지 C6)알킬, OH, O(C1 내지 C6)알킬, (C1 내지 C6)알킬, CF3, F, Cl, 및 Br로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되며; 또는 치환된 피페라진-1,4-다이일이며, 상기 피페라진은 2, 3, 5, 또는 6 위치에서 1 내지 8개의 치환기로 치환되고, 그리고 상기 치환기는 (C1 내지 C6)알킬, 아릴, 아릴(C1 내지 C6)알킬, C(O)OH, 및 C(O)O(C1 내지 C6)알킬이며;
Y′는:
Figure pct00021
또는 단일 결합이고; 및
Z′는:
Figure pct00022
또는 R5이고;
상기 식에서
Y′는 Z′가 R5일 경우에만 단일 결합이고;
존재한다면, A1 및 A1′는 각각 독립적으로 N, N(C1 내지 C6)알킬, O, S, 또는 CR6이고;
존재한다면, A2 및 A2′는 각각 독립적으로 N 또는 CR7이고;
존재한다면, A3 및 A3′는 각각 독립적으로 NR8, O, 또는 S이고;
존재한다면, A4 및 A4′는 각각 독립적으로 N 또는 CR9이고;
존재한다면, A5 및 A5′는 각각 독립적으로 N 또는 CR10이고;
존재한다면, A6 및 A6′는 각각 독립적으로 N 또는 CR11이고;
존재한다면, R1, R1′, R2, R2′, R3, R3′, R4, R4′, R5, R6, R7, R8, R9, R10, 및 R11은, 각각의 경우에 수소; 알킬; 할로; 트라이플루오로메틸; 다이알킬아미노로서, 각각의 알킬은 독립적으로 선택된 다이알킬아미노; ―NH2; 알킬아미노; 아릴알킬; 헤테로아릴알킬.; 헤테로사이클로알킬; ―C(O)OH, ―C(O)O(C1 내지 C6)알킬, (C1 내지 C6)알킬, ―CF3, F, Cl, 및 Br로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된 1 내지 2개의 치환기로 치환되는 치환된 헤테로사이클로알킬; 및 치환된 헤테로아릴알킬로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되고;
상기 치환된 헤테로아릴알킬은 ―NH2; ―NH(C1 내지 C6)알킬; ―N((C1 내지 C6)알킬)2로서, 각각의 알킬은 독립적으로 선택된 ―N((C1 내지 C6)알킬)2; 알킬; 할로; 아릴; ―SO2R12, ―OR13, -할로, ―CN, ―CF3, 아미노알킬-, ―S(O)R14, 및 알킬로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된 1 내지 3개의 치환기로 치환되는 치환된 아릴; 헤테로사이클로알킬; 헤테로아릴; 알킬, ―CF3, F, Cl, 및 Br로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된 1 내지 3개의 치환기로 치환되는 치환된 아릴; 알킬아미노-; 헤테로사이클로알킬-알킬-아미노-; 알킬아미노알킬아미노-; ―NHC(O)OR15; ―NHC(O)NR16R17; ―C(O)NR16R17; 및 알킬, 할로, CN, NH2, ―NH(C1 내지 C6 알킬), ―N(C1 내지 C6 알킬)2로서, 각각의 알킬은 독립적으로 선택된 ―N(C1 내지 C6 알킬)2, ―CF3, 및 ―S(O)2R15 및 ―CN으로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된 1 내지 3개의 치환기로 치환되는 치환된 아릴로 이루어진 군으로부터 선택된 1 내지 3개의 치환기로 치환되는 치환된 헤테로아릴로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된 1 내지 3개의 치환기로 치환되며;
R12, R13, R14, R15, R16, 및 R17은 C1 내지 C6알킬, 독립적으로 선택된 C1 내지 C6 알킬을 포함하는 다이알킬아미노, ―NH2, 알킬아미노, 헤테로사이클로알킬, 및 ―C(O)O(C1 내지 C6 알킬) 및 ―C1 내지 C6 알킬로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된 1 내지 2개의 치환기로 치환되는 치환된 헤테로사이클로알킬로 이루어진 군으로부터 각각 독립적으로 선택되며; 또는
화학식 A-B-C를 포함하는 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염 또는 에스테르를 포함하고, 상기 식에서
A는:
Figure pct00023
또는
Figure pct00024
이고;
B는:
Figure pct00025
,
Figure pct00026
, 또는
Figure pct00027
이고; 및
C는:
Figure pct00028
,
Figure pct00029
,
Figure pct00030
, 또는
Figure pct00031
이며,
상기 식에서
A7, A8, A9, A10, A11, A12, A13, 및 A14는 CH, CR18, 및 N으로부터 각각 독립적으로 선택되고;
A15, A16, A17, A18, A19, 및 A20은 CH, CR19, N, NR20, O, 및 S으로부터 각각 독립적으로 선택되며, 단, A15, A16, 및 A17 중 하나만 N, NR20, O, 또는 S일 수 있으며 A18, A19, 및 A20 중 하나만 N, NR20, O, 또는 S일 수 있고;
R18 및 R19는 C1 내지 C6 알킬; C1 내지 C6 다이알킬아미노로서, 각각의 C1 내지 C6 알킬은 독립적으로 선택되는, C1 내지 C6 다이알킬아미노; ―NH2; 알킬아미노; 헤테로사이클로알킬; 및 치환된 헤테로사이클로알킬로서, 상기 치환된 헤테로사이클로알킬은: ―C(O)O(C1 내지 C6 알킬) 및 C1 내지 C6 알킬로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된 1 내지 2개의 치환기로 치환되는, 치환된 헤테로사이클로알킬로부터 각각 독립적으로 선택되며, 상기 식에서 하나 초과의 CR18을 갖는 화합물에서 각각의 R18은 독립적으로 선택되며, 하나 초과의 CR19를 갖는 화합물에서 각각의 R19는 독립적으로 선택되며; 및
R20은 C1 내지 C6 알킬인, 방법.
2. 실시형태 1에 있어서, 상기 감염성 질환은 박테리아성 질환을 포함하는 방법.
3. 실시형태 2에 있어서, 상기 박테리아성 질환은 클로스트리디움 디피실(C. difficile) 감염을 포함하는 방법.
4. 실시형태 1에 있어서, 상기 과증식성 장애는 암을 포함하는 방법.
5. 실시형태 4에 있어서, 상기 암은 위장관의 암을 포함하는 방법.
6. 실시형태 5에 있어서, 상기 위장관의 암은 대장암을 포함하는 방법.
7. 실시형태 1에 있어서, 상기 과증식성 장애는 가족성샘종폴립증을 포함하는 방법.
8. 실시형태 1에 있어서, 상기 선천 대사 장애는 글리코겐 축적병을 포함하는 방법.
9. 실시형태 8에 있어서, 상기 글리코겐 축적병은 안데르센병을 포함하는 방법.
10. 실시형태 1에 있어서, 상기 만성 면역대사 질환은 심혈관 질환을 포함하는 방법.
11. 실시형태 10에 있어서, 상기 심혈관 질환은 죽상 동맥 경화증을 포함하는 방법.
12. 실시형태 1에 있어서, 상기 만성 면역대사 질환은 고혈압을 포함하는 방법.
13. 실시형태 1에 있어서, 상기 자가 면역은 전신 홍반 루프스 및 다발성 경화증 중 적어도 하나를 포함하는 방법.
14. 실시형태 1에 있어서, 상기 자가 면역 질환은 암-면역요법-유도된 자가 면역 질환을 포함하는 방법.
15. 실시형태 14에 있어서, 상기 암-면역요법-유도된 자가 면역 질환은 암 면역요법-유도된 류마티스성 질환을 포함하는 방법.
16. 실시형태 1에 있어서, 상기 염증성 장애는 급성 대장 게실염을 포함하는 방법.
17. 실시형태 1에 있어서, 상기 염증성 장애는 위장관의 방사선-유도된 염증을 포함하는 방법.
18. 실시형태 17에 있어서, 상기 위장관의 방사선-유도된 염증은 방사선 직장염, 방사선 장염, 및 방사선 직장 S상 결장염 중 적어도 하나를 포함하는 방법.
19. 실시형태 1에 있어서, 상기 만성 통증은 섬유근육통을 포함하는 방법.
20. 실시형태 1에 있어서, 상기 상태는 염증성 장 질환을 포함하는 방법.
21. 실시형태 1에 있어서, 상기 상태는 크론병을 포함하는 방법.
22. 실시형태 1에 있어서, 상기 상태는 궤양성 대장염을 포함하는 방법.

Claims (19)

  1. 전구체 세포로부터 제조된 세포를 생성하는 시험관 내 방법으로서, 상기 전구체 세포를 상기 전구체 세포에 대하여 상기 제조된 세포에서 화합물-의존적 차이를 유도하기에 효과적인 양 및 시간 동안 화합물과 시험관 내에서 접촉시키는 단계를 포함하며,
    상기 전구체 세포는 면역 세포를 포함하고; 및
    상기 화합물은 화학식 Z-Y-Q-Y'-Z'의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염 또는 에스테르이며, 상기 식에서
    Z는:
    Figure pct00032
    이고;
    Y는:
    Figure pct00033
    이고;
    Q는 피페라진-1,4-다이일; 2,5-다이아자바이사이클로[2.2.1]헵탄-2,5-다이일; 2,5-다이아자바이사이클로[2.2.2]옥탄-2,5-다이일; 1,4-다이아제판-1,4-다이일; 벤젠-1,4-다이아민-N1,N4-다이일; 에탄-1,2-다이아민-N1,N2-다이일; N1,N2-다이알킬에탄-1,2-다이아민-N1,N2-다이일; 프로판-1,3-다이아민-N1,N3-다이일; N1,N3-다이알킬프로판-1,3-다이아민-N1,N3-다이일; 1,4-다이아미노안트라센-9,10-다이온-1,4-다이일; C6 아렌-1,4-다이아민-N1,N4-다이일로서, 상기 아렌은 2, 3, 5, 또는 6 위치에서 1 내지 4개의 치환기로 치환되고, 그리고 상기 치환기는 ―C(O)O(C1 내지 C6)알킬, OH, O(C1 내지 C6)알킬, (C1 내지 C6)알킬, CF3, F, Cl, 및 Br로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되며; 또는 치환된 피페라진-1,4-다이일이며, 상기 피페라진은 2, 3, 5, 또는 6 위치에서 1 내지 8개의 치환기로 치환되고, 그리고 상기 치환기는 (C1 내지 C6)알킬, 아릴, 아릴(C1 내지 C6)알킬, C(O)OH, 및 C(O)O(C1 내지 C6)알킬이며;
    Y′는:
    Figure pct00034

    또는 단일 결합이고;
    Z′는:
    Figure pct00035

    또는 R5이고;
    Y′는 Z′가 R5일 경우에만 단일 결합이고;
    존재한다면, A1 및 A1′는 각각 독립적으로 N, N(C1 내지 C6)알킬, O, S, 또는 CR6이고;
    존재한다면, A2 및 A2′는 각각 독립적으로 N 또는 CR7이고;
    존재한다면, A3 및 A3′는 각각 독립적으로 NR8, O, 또는 S이고;
    존재한다면, A4 및 A4′는 각각 독립적으로 N 또는 CR9이고;
    존재한다면, A5 및 A5′는 각각 독립적으로 N 또는 CR10이고;
    존재한다면, A6 및 A6′은 각각 독립적으로 N 또는 CR11이고; 및
    존재한다면, R1, R1′, R2, R2′, R3, R3′, R4, R4′, R5, R6, R7, R8, R9, R10, 및 R11은, 각각의 경우에 수소; 알킬; 할로; 트라이플루오로메틸; 다이알킬아미노로서, 각각의 알킬은 독립적으로 선택된 다이알킬아미노; ―NH2; 알킬아미노; 아릴알킬; 헤테로아릴알킬.; 헤테로사이클로알킬; ―C(O)OH, ―C(O)O(C1 내지 C6)알킬, (C1 내지 C6)알킬, ―CF3, F, Cl, 및 Br로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된 1 내지 2개의 치환기로 치환되는 치환된 헤테로사이클로알킬; 및 치환된 헤테로아릴알킬로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되고; 또는
    상기 화합물은 화학식 A-B-C의 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염 또는 에스테르이며, 상기 식에서
    A는:
    Figure pct00036
    또는
    Figure pct00037
    이고;
    B는:
    Figure pct00038
    ,
    Figure pct00039
    , 또는
    Figure pct00040
    이고; 및
    C는:
    Figure pct00041
    ,
    Figure pct00042
    ,
    Figure pct00043
    , 또는
    Figure pct00044
    ,
    A7, A8, A9, A10, A11, A12, A13, 및 A14는 CH, CR18, 및 N으로부터 각각 독립적으로 선택되고;
    A15, A16, A17, A18, A19, 및 A20은 CH, CR19, N, NR20, O, 및 S으로부터 각각 독립적으로 선택되며, 단, A15, A16, 및 A17 중 하나만 N, NR20, O, 또는 S일 수 있으며 A18, A19, 및 A20 중 하나만 N, NR20, O, 또는 S일 수 있고;
    R18 및 R19는 C1 내지 C6 알킬; C1 내지 C6 다이알킬아미노로서, 각각의 C1 내지 C6 알킬은 독립적으로 선택되는, C1 내지 C6 다이알킬아미노; ―NH2; 알킬아미노; 헤테로사이클로알킬; 및 치환된 헤테로사이클로알킬로서, 상기 치환된 헤테로사이클로알킬은: ―C(O)O(C1 내지 C6 알킬) 및 C1 내지 C6 알킬로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된 1 내지 2개의 치환기로 치환되는, 치환된 헤테로사이클로알킬로부터 각각 독립적으로 선택되며, 상기 식에서 하나 초과의 CR18을 갖는 화합물에서 각각의 R18은 독립적으로 선택되며, 하나 초과의 CR19를 갖는 화합물에서 각각의 R19는 독립적으로 선택되며; 및
    R20은 C1 내지 C6 알킬인, 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 화합물은 화학식 Z-Y-Q-Y'-Z'의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염 또는 에스테르인, 방법.
  3. 제1항 및 제2항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 접촉하는 단계는 상기 전구체 세포를 상기 화합물 및 올-트랜스-레티노산, TGF-β, 포볼(phorbol) 미리스테이트 아세테이트, 아이오노마이신, 라파마이신, 및 IL-2 중 하나 이상을 포함하는 작용제와 접촉시키는 단계를 포함하는, 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 접촉하는 단계는 상기 전구체 세포를 상기 화합물 및 IL-2과 접촉시키는 단계를 포함하는, 방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 전구체 세포는 백혈구 세포를 포함하는, 방법.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 전구체 세포는 말초 혈액 단핵 세포 및 고유판 단핵 세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 세포를 포함하는, 방법.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 전구체 세포는 T 세포를 포함하는, 방법.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 전구체 세포는 나이브(naive) CD4+ T 세포를 포함하는, 방법.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제조된 세포는 Treg 세포를 포함하는, 방법.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제조된 세포는 상기 전구체 세포로부터 분화되는, 방법.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 화합물-의존적 차이는 상기 전구체 세포에 대하여 상기 제조된 세포에서 유전자 발현의 차이를 포함하는, 방법.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 화합물-의존적 차이는 IL-10 또는 이의 오솔로그(ortholog)의 발현의 증가, FOXP3 또는 이의 오솔로그의 발현의 증가, TNFα 또는 이의 오솔로그의 발현의 감소, IFNγ 또는 이의 오솔로그의 발현의 감소, Tbet 또는 이의 오솔로그의 발현의 감소, Lag3 또는 오솔로그의 발현의 증가, Socs2 또는 이의 오솔로그의 발현의 증가, Irf7 또는 이의 오솔로그의 발현의 증가, P2rx7 또는 이의 오솔로그의 발현의 증가, Capn3 또는 이의 오솔로그의 발현의 증가, Ikzf2 또는 이의 오솔로그의 발현의 증가, Stat5a 또는 이의 오솔로그의 발현의 증가, Pten 또는 이의 오솔로그의 발현의 증가, Foxo1 또는 이의 오솔로그의 발현의 증가, Phlpp1 또는 이의 오솔로그의 발현의 증가, STAT5a 또는 이의 오솔로그의 인산화의 증가, FOXO1 인산화 또는 이의 오솔로그의 증가, 및 피루베이트 키나아제 활성의 증가 중 적어도 하나 이상을 포함하는, 방법.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항의 제조된 세포를 포함하는 단리된 세포.
  14. 제13항의 단리된 세포로 동물의 상태를 치료하는 방법에 있어서, 상기 상태를 치료하기에 충분한 양으로 상기 세포를 상기 동물에게 투여하는 단계를 포함하며, 상기 상태는 염증성 장애, 감염성 질환, 과증식성 장애, 선천 대사 장애, 만성 면역대사 질환, 자가 면역 질환, 장기 이식 거부, 및 만성 통증을 포함하는, 방법.
  15. 제14항에 있어서, 상기 상태는 염증성 장 질환을 포함하는, 방법.
  16. 제14항 및 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 투여하는 단계는 상기 세포를 상기 동물에게 비경구적으로 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  17. 제16항에 있어서, 상기 비경구적으로 투여하는 단계는 상기 세포를 상기 동물에 혈류에 주사하거나 주입하는 단계를 포함하는, 방법.
  18. 제14항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 투여하는 단계는 상기 세포를 상기 동물에게 경장적으로(enterally) 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  19. 제14항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포는 상기 동물로부터 수득된 자가유래적(autologous) 전구체 세포로부터 생성된 제조된 세포를 포함하는, 방법.
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