KR20200072388A - 신규 화합물 및 이를 포함하는 발모 촉진용 조성물 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 발모 촉진용 조성물의 주요 성분으로 활용이 가능한 신규 화합물 9-deoxo-31-O-demethyl-prolyl-FK506, 9-deoxo-36,37-dihydro-FK506, 31-O-demethyl-36,37-dihydro-FK506, 9-deoxo-31-O-demethyl-36,37-dihydro-FK506, 9-deoxo-FK520, 31-O-demethyl-FK520, 9-deoxo-31-O-demethyl-FK520, 9-deoxo-FK523, 또는 9-deoxo-31-O-demethyl-FK523의 제조 및 이의 발모 촉진용도에 관한 것이다.

Description

신규 화합물 및 이를 포함하는 발모 촉진용 조성물 {A novel compound and a composition for promoting hair growth comprising the same}
본 발명은 발모 촉진용 조성물의 주요 성분으로 활용이 가능한 신규 화합물 9-deoxo-31-O-demethyl-prolyl-FK506(9-데옥소-31-O-디메틸-프롤릴-FK506), 9-deoxo-36,37-dihydro-FK506(9-데옥소-36,37-디히드로-FK506), 31-O-demethyl-36,37-dihydro-FK506(31-O-디메틸-36,37-디히드로-FK506), 9-deoxo-31-O-demethyl-36,37-dihydro-FK506(9-데옥소-31-O-디메틸-36,37-디히드로-FK506), 9-deoxo-FK520(9-데옥소-FK520), 31-O-demethyl-FK520(31-O-디메틸-FK520), 9-deoxo-31-O-demethyl-FK520(9-데옥소-31-O-디메틸-FK520), 9-deoxo-FK523(9-데옥소-FK523), 또는 9-deoxo-31-O-demethyl-FK523(9-데옥소-31-O-디메틸-FK523)의 제조 및 활용에 관한 것으로, 구체적으로는 상기 신규 화합물의 제조방법, 및 각 신규 화합물을 유효성분으로 포함하는 발모 촉진용 조성물에 관한 것이다.
현대인의 탈모는 노화나 유전적인 요인뿐 아니라 각종 환경오염, 흡연, 업무 스트레스, 식생활 변화에 따른 호르몬 분비에 이상 등 후천적 요인의 영향으로 증가하고 있다. 탈모 인구는 주로 40~50대 중장년층에서 증가하였지만, 최근에는 청년층 및 여성 탈모 인구도 점점 증가하고 있는 추세이다.
대한탈모치료학회에 따르면 국내탈모인구는 잠재적 탈모질환자를 포함하여 약 1000만 명에 달한다고 통계 분석하였다. 진료비 지출도 2016년 기준으로 355억 정도이며, 국내뿐 아니라 해외 탈모 질환자도 증가하고 있는 추세이다. 시장조사기관 IBIS World에 따르면 미국의 탈모관리 시장 규모는 2016년 36억 달러 규모이며 21년까지 연평균 0.7% 성장할 전망이라 분석하였다.
한편, 한국성인병예방협회의 조사에 따르면 국내의 성인 10명 중 7명은 탈모를 질환으로 인식하고 있으며, 이로 인하여 사회생활에 있어 직간접적으로 손해를 보고 있다고 생각하고 있다고 한다. 또한, 성인의 약 23%가 탈모를 경험하고 있다고 한다.
탈모는 일시적인 탈모인 비반흔성 탈모와 모낭이나 모근이 영구적으로 파괴되어 나타나는 반흔성 탈모로 나뉘며, 흔히 접하는 탈모는 비반흔성 탈모로 감염성, 외상성, 염증성, 선천성, 내분비성, 종양성, 영양결핍성 탈모, 약물에 의한 탈모, 그리고 모발의 구조이상에 의한 탈모로 구분되며, 남성형, 여성형, 원형 탈모도 비반흔성 탈모에 속한다.
경제가 성장하고 사회가 노령화 되어 가면서 탈모는 불가항력적인 것이 아닌 질환으로 여겨지고 있으며, 직장생활이나 사교에 있어서 심리적인 불안감 및 스트레스를 유발하기 때문에 탈모치료에 효과적인 약물 개발이 필요하다 할 수 있다.
그러나 탈모 질환자들이 증가함에도 불구하고, 여전히 탈모의 정확한 원인이 규명되지 않고 있으며, 탈모방지를 위한 효과적인 방안이 제시되고 있지 못한 실정이다. 이러한 상황에서 탈모를 방지하고, 발모를 촉진하는 실효성 있는 기술에 대한 관심이 높아지고 있고, 현재 수많은 종류의 탈모 예방제와 발모제가 시판되고 있다.
현재 FDA의 승인을 받은 약물로는 도포용으로 미녹시딜 (Minoxidil)과 경구용으로 프로페시아 (Propecia)가 있다. 그런데, 이들 약물들을 이용한 치료는 영구적인 치료가 아니고 탈모 진행 단계를 지연시키든가, 아니면 현 모발의 상태를 유지하는 것을 돕는 수준의 효과만 제공한다. 또한, 미녹시딜을 포함한 발모제는 발모효과를 유지하기 위해 매일 꾸준하게 도포해야하기에 번거롭고, 복용 발모제보다 발모 효과가 나타나지 않는 경우가 많다. 또한 프로페시아의 경우 여성 복용 시 태아에 선천적인 기형이 발생할 가능성이 높고, 남성의 경우에는 성기능 장애 등 부작용의 위험성이 있다. 따라서 일시적인 효과 수준을 넘어 근본적인 치료 효과를 제공할 수 있는 약물의 개발이 필요하다. 또한, 이러한 약물이 치료적 활용뿐만 아니라 예방적 활용으로도 이용이 가능하다면 더욱 가치가 있을 것이다.
또한, 한국공개특허 제10-2005-0071491호(발명의 명칭: 천식의 치료를 위한 베타2-작용제와 배합된 타크롤리무스 유도체의 용도)는 급성 또는 만성 천식을 치료 또는 예방하기 위해 동시적, 분리적 또는 순차적으로 사용하기 위한 의약의 제조를 위한 FK506 유도체 및 β2-작용제의 신규한 용도를 개시하고 있으나, FK506 유도체, FK520 유도체 또는 FK523 유도체를 발모 용도에 적용한 사례는 없다.
이에, 본 발명자들은 다양한 노력을 한 결과로 발모 촉진용 조성물의 주요 성분으로 활용이 가능한 신규 화합물 9-deoxo-31-O-demethyl-prolyl-FK506(9-데옥소-31-O-디메틸-프롤릴-FK506), 9-deoxo-36,37-dihydro-FK506(9-데옥소-36,37-디히드로-FK506), 31-O-demethyl-36,37-dihydro-FK506(31-O-디메틸-36,37-디히드로-FK506), 9-deoxo-31-O-demethyl-36,37-dihydro-FK506(9-데옥소-31-O-디메틸-36,37-디히드로-FK506), 9-deoxo-FK520(9-데옥소-FK520), 31-O-demethyl-FK520(31-O-디메틸-FK520), 9-deoxo-31-O-demethyl-FK520(9-데옥소-31-O-디메틸-FK520), 9-deoxo-FK523(9-데옥소-FK523), 및 9-deoxo-31-O-demethyl-FK523(9-데옥소-31-O-디메틸-FK523) (이하 ‘9종 신규 화합물’로 통칭)의 발모촉진 효과를 규명하고, 이들의 제조공정을 개발하고, 더 나아가 이들을 유효성분으로 활용한 발모 촉진용 조성물을 개발하고, 이 조성물이 발모 촉진용 조성물로서 효과적으로 활용될 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 하나의 목적은 상기 9종 신규 화합물, 이의 이성질체, 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 하나의 목적은 9종 신규 화합물 중 선택된 하나 이상을 유효성분으로 포함하는 발모 촉진용 조성물을 제공하는 것이다. 여기서 발모 촉진용 조성물은 탈모의 개선, 예방 또는 치료용 조성물을 의미한다.
본 발명의 또 다른 목적은 9종 신규 화합물의 이성질체 또는 약제학적으로 허용 가능한 염 중 선택된 하나 이상을 유효성분으로 포함하는 발모 촉진용 약학적 조성물을 제공하는 것이다. 여기서 발모 촉진용 약학적 조성물은 탈모의 개선, 예방 또는 치료용 조성물을 의미한다.
본 발명의 또 다른 목적은 9종 신규 화합물 각각의 생물학적 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 9종 신규 화합물의 생물학적 제조공정에 이용될 수 있는 생산 균주인 스트렙토마이세스 카나마이세티쿠스 ΔfkbD-fkbM (수탁번호 KCTC13581BP), 스트렙토마이세스 카나마이세티쿠스 ΔfkbD,tcsD (수탁번호 KCTC13580BP), 스트렙토마이세스 카나마이세티쿠스 ΔfkbM,tcsD (수탁번호 KCTC13584BP), 스트렙토마이세스 카나마이세티쿠스 ΔfkbD-fkbM,tcsD (수탁번호 KCTC13585BP), 스트렙토마이세스 카나마이세티쿠스 ΔfkbD,tcsB (수탁번호 KCTC13579BP), 스트렙토마이세스 카나마이세티쿠스 ΔfkbM,tcsB (수탁번호 KCTC13583BP), 및 스트렙토마이세스 카나마이세티쿠스 ΔfkbD-fkbM,tcsB (수탁번호 KCTC13582BP)를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 하나의 목적은 9종 신규 화합물 중 선택된 하나 이상, 이의 이성질체, 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 발모 촉진용 의약외품 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 하나의 목적은 9종 신규 화합물 중 선택된 하나 이상, 이의 이성질체, 또는 이의 식품학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 발모 촉진용 건강기능식품 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 하나의 목적은 9종 신규 화합물 중 선택된 하나 이상, 이의 이성질체, 또는 이의 화장품학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 발모 촉진용 화장료 조성물을 제공하는 것이다.
이하에서는, 본 발명을 더욱 상세히 설명한다.
한편, 본원에서 개시되는 각각의 설명 및 실시형태는 각각의 다른 설명 및 실시 형태에도 적용될 수 있다. 즉, 본원에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 발명의 범주에 속한다. 또한, 하기 기술되는 구체적인 서술에 의하여 본 발명의 범주가 제한된다고 할 수 없다.
또한, 당해 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 통상의 실험만을 사용하여 본 출원에 기재된 본 발명의 특정 양태에 대한 다수의 등가물을 인지하거나 확인할 수 있다. 또한, 이러한 등가물은 본 발명에 포함되는 것으로 의도된다.
상기와 같은 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 9종 신규 화합물의 제조공정, 제조공정을 이용하여 제조한 각 신규 화합물을 포함하는 발모 촉진용 조성물, 및 이 발모 촉진용 조성물을 이용한 탈모에 대한 개선, 예방 및 치료방법을 제공한다.
상기의 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 9종 신규 화합물, 하기 [화학식 1]로 표시되는 9-deoxo-31-O-demethyl-prolyl-FK506, 하기 [화학식 2]로 표시되는 9-deoxo-36,37-dihydro-FK506, 하기 [화학식 3]으로 표시되는 31-O-demethyl-36,37-dihydro-FK506, 하기 [화학식 4]로 표시되는 9-deoxo-31-O-demethyl-36,37-dihydro-FK506, 하기 [화학식 5]로 표시되는 9-deoxo-FK520, 하기 [화학식 6]으로 표시되는 31-O-demethyl-FK520, 하기 [화학식 7]로 표시되는 9-deoxo-31-O-demethyl-FK520, 하기 [화학식 8]로 표시되는 9-deoxo-FK523, 및 하기 [화학식 9]로 표시되는 9-deoxo-31-O-demethyl-FK523로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 화합물, 그의 이성질체, 또는 약제학적으로 허용 가능한 염을 제공한다.
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하나의 구체예로서, 본 발명의 화합물은 그의 이성질체 또는 약제학적으로 허용 가능한 염을 포함할 수 있다.
이성질체란 화학식은 같으나 동일하지는 않은 화합물의 관계를 의미하며, 예를 들어 구조 이성질체, 기하 이성질체, 광학 이성질체 (거울상 이성질체), 입체 이성질체, 부분 입체 이성질체를 포함할 수 있다.
약제학적으로 허용 가능한 염은 환자에게 비교적 비독성이고 무해한 유효작용을 갖는 농도로서, 이 염에 기인한 부작용이 모체 화합물의 이로운 효능을 저하시키지 않는 임의의 모든 유기 또는 무기 부가염을 의미할 수 있다. 예를 들어 상기 염은 약학적으로 허용 가능한 유리산 (Free acid)에 의해 형성된 산부가염일 수 있다. 산부가염은 통상의 방법, 예를 들어 화합물을 과량의 산 수용액에 용해시키고, 이 염을 수혼화성 유기 용매, 예를 들어 메탄올, 에탄올, 아세톤 또는 아세토니트릴을 사용하여 침전시켜서 제조할 수 있다. 동 몰량의 화합물 및 물중의 산 또는 알코올 (예, 글리콜 모노메틸에테르)을 가열하고, 이어서 상기 혼합물을 증발시켜 건조시키거나, 또는 석출된 염을 흡인 여과시켜 제조된 것일 수 있다. 이때, 유리산으로는 유기산과 무기산을 사용할 수 있다. 상기 염은 염기를 사용하여 제조된 약학적으로 허용 가능한 금속염일 수 있다.
또 하나의 구체예로서, 본 발명의 화합물은 용매화물 또는 전구약물 (Pro-drug) 형태일 수 있으며, 이는 본 발명의 범위 내에 포함된다. 용매화물은 바람직하게는 수화물 및 에탄올화물을 포함할 수 있다.
본 발명의 조성물은 단일제제로도 사용할 수 있고, 공인된 탈모에 대한 예방 또는 치료 효과를 가진다고 알려진 약물을 추가로 포함하여 복합제제로 제조하여 사용할 수 있으며, 약제학적으로 허용되는 담체 또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어, "약학적으로 허용 가능한 담체"란 생물체를 자극하지 않으면서, 주입되는 화합물의 생물학적 활성 및 특성을 저해하지 않는 담체 또는 희석제를 의미할 수 있다. 본 발명에 사용 가능한 상기 담체의 종류는 특별히 제한되지 아니하며 당해 기술 분야에서 통상적으로 사용되고 약학적으로 허용되는 담체라면 어느 것이든 사용할 수 있다. 상기 담체의 비제한적인 예로는, 트란스큐톨 (Transcutol), 폴리에틸렌글리콜 (Polyethylene glycol), 트리아세틴 (Triacetin) 및 이들의 혼합물로 예시할 수 있는 공계면활성제 (Co-surfactant); 크레모포어 (Cremophor), 트윈 (Tween), 미리즈 (Myrj), 폴록사머 (Poloxamer), 플루로닉 (Pluronic), 루트롤 (Lutrol), 임비토르 (Imwitor), 스판 (Span), 라브라필 (Labrafil) 등의 단독 또는 혼합물로 예시할 수 있는 계면활성제 (Surfactant); 미그리올 (Miglyol), 캅텍스 (Captex), 에틸올레이트 (Ethyl oleate) 등의 단독 또는 혼합물로 예시할 수 있는 오일 (Oil); 및, 에리소르빈산 (Erythorobic acid), 구연산 (Citric acid) 등의 단독 또는 혼합물로 예시할 수 있는 유기산류 등을 들 수 있다. 이들은 단독으로 사용되거나 2 종 이상을 혼합하여 사용될 수 있다.
또한, 필요한 경우 항산화제, 완충액 및/또는 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가하여 사용할 수 있으며, 희석제, 분산제, 계면 활성제, 결합제, 윤활제 등을 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제 등으로 제제화하여 사용할 수 있다.
상기의 목적을 달성하기 위한 또 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 탈모 예방 또는 치료 방법을 제공한다.
본 발명에서 사용되는 용어, "개체"란, 탈모가 발생되었거나 발생할 가능성이 있는 모든 동물을 의미할 수 있다.
본 발명의 조성물은 약제학적으로 유효한 양의 9종 신규 화합물 중 선택된 하나 이상, 또는 이것의 이성질체나 염을 포함할 수 있다. 본 발명에서 용어, "약제학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 일반적으로 0.001 내지 1000 mg/kg의 양, 바람직하게는 0.05 내지 200 mg/kg, 보다 바람직하게는 0.1 내지 100 mg/kg의 양을 일일 1회 내지 수회로 나누어 투여할 수 있다. 그러나 본 발명의 목적상, 특정 환자에 대한 구체적인 치료적 유효량은 달성하고자 하는 반응의 종류와 정도, 경우에 따라 다른 제제가 사용되는지의 여부를 비롯한 구체적 조성물, 환자의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여 시간, 투여 경로 및 조성물의 분비율, 치료기간, 구체적 조성물과 함께 사용되거나 동시 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자와 의약 분야에 잘 알려진 유사 인자에 따라 다르게 적용하는 것이 바람직하다.
본 발명의 조성물의 투여빈도는 특별히 이에 제한되지 않으나, 1일 1회 투여하거나 또는 용량을 분할하여 수회 투여할 수 있다.
본 발명의 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고, 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여할 수 있다. 그리고 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기 요소를 모두 고려하여 부작용 유발을 최소화 하면서 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
본 발명에서 사용된 용어, "투여"는 어떠한 적절한 방법으로 환자에게 본 발명의 조성물을 도입하는 것을 의미하며, 본 발명의 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 경구 또는 비경구의 다양한 경로를 통하여 투여될 수 있다.
본 발명에 따른 조성물의 투여 방식은 특별히 제한되지 아니하며, 당해 기술 분야에서 통상적으로 사용하는 방식에 따를 수 있다. 상기 투여 방식의 비제한적인 예로, 조성물을 경구 투여 또는 비경구 투여 방식으로 투여할 수 있다. 본 발명에 따른 조성물은 목적하는 투여 방식에 따라 다양한 제형으로 제작될 수 있다.
본 발명의 발모 촉진용 조성물은 탈모의 개선, 예방 또는 치료 목적으로 사용될 수 있다.
본 발명의 탈모로는 일시적인 탈모인 비반흔성 탈모와 모낭이나 모근이 영구적으로 파괴되어 나타나는 반흔성 탈모를 모두 포함하며, 비반흔성 탈모에는 감염성 탈모, 외상성 탈모, 염증성 탈모, 선천성 탈모, 내분비성 탈모, 종양성 탈모, 영양결핍성 탈모, 약물에 의한 탈모, 그리고 모발의 구조이상에 의한 탈모를 포함하고, 남성형 탈모, 여성형 탈모, 원형 탈모도 포함한다.
본 발명에서 사용되는 용어, "개선"이란, 본 발명에 따른 조성물을 개체에 투여하여 탈모의 진행을 지연시키거나 탈모의 증상을 경감시키는 모든 행위를 의미할 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어, "예방"이란, 본 발명에 따른 조성물을 개체에 투여하여 탈모의 발생을 억제하거나 지연시키는 모든 행위를 의미할 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어, "치료"란, 본 발명의 상기 조성물을 탈모 발생 의심 개체에 투여하여 탈모 증세가 호전되도록 하거나 이롭게 되도록 하는 모든 행위를 의미할 수 있다.본 발명의 일 구체예에서는 상기 9종 신규 화합물의 면역억제활성 효과를 인비트로 T세포 활성분석법으로 확인하여 FK506 보다 감소된 면역억제활성을 확인할 수 있었다.
또한, 본 발명의 다른 구체예에서는 상기 9종 신규화합물의 비모 성장 효과를 확인할 수 있었다.
본 발명의 또 다른 구체예에서는 상기 9종 신규화합물의 비모의 길이 생장 효과 및 조직학적 결과의 세포 성장마커의 확인으로 비모의 생장이 지속적으로 유지됨을 확인할 수 있었다.
상기 결과는 상기 9종 신규화합물이 면역억제활성에 기인한 부작용 없는 발모촉진 효과를 확인한 바, 탈모의 개선, 예방 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있음을 시사하는 것이다.
상기의 목적을 달성하기 위한 또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 9종 신규 화합물인 9-deoxo-31-O-demethyl-prolyl-FK506, 9-deoxo-36,37-dihydro-FK506, 31-O-demethyl-36,37-dihydro-FK506, 9-deoxo-31-O-demethyl-36,37-dihydro-FK506, 9-deoxo-FK520, 31-O-demethyl-FK520, 9-deoxo-31-O-demethyl-FK520, 9-deoxo-FK523, 9-deoxo-31-O-demethyl-FK523의 생물학적 제조공정을 제공한다.
상기 생물학적 제조공정에서는 일반적으로 스트렙토마이세스 속 배양 공정에서 채택되는 배양온도를 사용한다. 본 발명의 구현에 적합한 배양온도로는 바람직하게는 23-30℃를 적용할 수 있고, 보다 바람직하게는 25-28℃의 배양온도를 적용할 수 있다.
또한, 상기 제조공정에서는 배양공정의 pH를 6.5-9 사이로 유지하는데, 바람직하게는 배양 pH를 7-8로 유지한다.
한편, 상기 제조공정에서는 배양액에서의 용존산소 수준을 높게 유지하는 것이 중요한데, 배양 초기의 용존산소 수준을 100%로 하였을 때 배양 종료 시점까지의 용존산소 수준을 30% 이상으로 유지하는 것이 중요하다. 이를 구현하기 위해서는 통상적으로 800-1,500 rpm 수준으로 교반해 주는 것이 바람직하다.
상기 제조공정에서의 배양 세포체로부터의 생산된 9종 신규 화합물의 추출은 1차 추출공정, 2차 추출공정 및 3차 추출 공정의 실시를 통하여 달성되는데, 본 발명에서는 1차 추출공정으로 유기용매 추출법을 사용하는데, 이때 사용할 수 있는 용매로는 에틸아세테이트, 메탄올, 아세톤 등이 있을 수 있으나, 에틸아세테이트 또는 메탄올의 사용이 바람직하다. 그리고 2차 추출공정으로 실리카겔 크로마토그래피 (Silica gel chromatography)를 사용하는데, 이때 사용할 수 있는 용매로는 메탄올 (Methanol), 메틸렌클로라이드 (Methylene chloride)가 바람직하다. 그리고 3차 추출공정으로 크로마토그래피를 사용하는데, 이때 사용할 수 있는 용매로는 아세토니트릴, 아세트산암모늄 버퍼, 아세트산, 개미산 등이 있을 수 있으나, 아세토니트릴의 사용이 바람직하다. 이러한 방법의 적용은 9종 신규 화합물의 회수를 용이하게 하며, 또한 수율도 높게 해 준다.
상기의 목적을 달성하기 위한 또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 9종 신규 화합물의 제조에 이용될 수 있는 생산균주인 스트렙토마이세스 카나마이세티쿠스 ΔfkbD-fkbM (수탁번호 KCTC13581BP), 스트렙토마이세스 카나마이세티쿠스 ΔfkbD,tcsD (수탁번호 KCTC13580BP), 스트렙토마이세스 카나마이세티쿠스 ΔfkbM,tcsD (수탁번호 KCTC13584BP), 스트렙토마이세스 카나마이세티쿠스 ΔfkbD-fkbM,tcsD (수탁번호 KCTC13585BP), 스트렙토마이세스 카나마이세티쿠스 ΔfkbD,tcsB (수탁번호 KCTC13579BP), 스트렙토마이세스 카나마이세티쿠스 ΔfkbM,tcsB (수탁번호 KCTC13583BP), 및 스트렙토마이세스 카나마이세티쿠스 ΔfkbD-fkbM,tcsB (수탁번호 KCTC13582BP)를 제공한다.
본 발명의 또 다른 하나의 목적은 9종 신규 화합물 중 선택된 하나 이상, 이의 이성질체, 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 발모 촉진용 의약외품 조성물을 제공하는 것이다.
9종 신규 화합물 중 선택된 하나 이상을 포함하는 조성물을 발모촉진 목적으로 의약외품 조성물에 첨가할 경우, 상기 화합물을 그대로 첨가하거나 다른 의약외품 성분과 함께 사용할 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용할 수 있다. 유효성분의 혼합량은 사용 목적에 따라 적합하게 결정할 수 있다.
본 발명의 용어, "의약외품 조성물"은 사람이나 동물의 질병을 치료, 경감, 처치 또는 예방할 목적으로 사용되는 섬유, 고무제품 또는 이와 유사한 것, 인체에 대한 작용이 약하거나 인체에 직접 작용하지 않으며, 기구 또는 기계가 아닌 것과 이와 유사한 것, 감염 예방을 위하여 살균, 살충 및 이와 유사한 용도로 사용되는 제제 중 하나에 해당하는 물품으로서, 사람이나 동물의 질병을 진단, 치료, 경감, 처치 또는 예방할 목적으로 사용하는 물품 중 기구, 기계 또는 장치가 아닌 것 및 사람이나 동물의 구조와 기능에 약리학적 영향을 줄 목적으로 사용하는 물품 중 기구, 기계 또는 장치가 아닌 것을 제외한 물품을 의미하며, 구체적으로 피부 외용제 또는 개인위생용품일 수 있다.
상기 피부 외용제는 이에 제한되지 않으나, 예를 들어 연고제, 로션제, 스프레이제, 패취제, 크림제, 산제, 현탁제, 겔제 또는 젤의 형태로 제조되어 사용될 수 있다. 상기 개인위생용품은 이에 제한되지 않으나, 구체적으로는 비누, 화장품, 물티슈, 휴지, 샴푸, 피부 크림, 얼굴 크림, 치약, 립스틱, 향수, 메이크업, 파운데이션, 볼터치, 마스카라, 아이섀도우, 선스크린 로션, 모발 손질 제품, 에어프레쉬너 겔 또는 세정 겔일 수 있다.
또한, 본 발명의 의약외품 조성물의 또 다른 예로 소독 청결제, 샤워폼, 연고액, 물티슈, 코팅제 등을 예시할 수 있으나 이에 제한되는 것이 아니며, 의약외품의 제제화 방법, 용량, 이용방법, 구성성분 등은 기술분야에 공지된 통상의 기술로부터 적절히 선택될 수 있다.
본 발명의 의약외품 조성물에는 상기 성분 외에 필요에 따라 약학적으로 허용 가능한 담체, 부형제 또는 희석제를 더욱 포함할 수 있다. 상기 약학적으로 허용 가능한 담체, 부형제 또는 희석제는 본 발명의 효과를 해하지 않는 한 제한되지 않으며, 예를 들어 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제, 윤활제, 감미제, 방향제, 보존제 등을 포함할 수 있다
본 발명의 일 실시예에서는 상기 9종 신규화합물의 발모촉진 효과를 확인하여 이를 탈모 방지 및 발모촉진용 의약외품 조성물로 사용할 수 있음을 확인하였다.
본 발명의 또 다른 하나의 목적은 9종 신규 화합물 중 선택된 하나 이상, 이의 이성질체, 또는 이의 식품학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 발모 촉진용 건강기능식품 조성물을 제공하는 것이다.
9종 신규 화합물 중 선택된 하나 이상의 화합물을 포함하는 조성물은 면역억제활성이 감소되며 발모촉진 효과를 확인하여 탈모 관련 질환의 예방 또는 개선을 도모할 수 있는 식품의 형태로 제조되어 섭취할 수 있다.
본 발명의 용어, "건강기능식품(functional food)"은, 특정보건용 식품, 기능성 식품, 건강식품과 동일한 용어로, 양 공급 외에도 생체조절기능이 효율적으로 나타나도록 가공된 의학, 의료효과가 높은 식품을 의미하는데, 상기 식품은 탈모 관련 질환의 예방 또는 개선에 유용한 효과를 얻기 위하여 정제, 캡슐, 분말, 과립, 액상, 환 등의 다양한 형태로 제조될 수 있다.
본 발명의 건강기능식품은 당 업계에서 통상적으로 사용되는 방법에 의하여 제조가능하며, 상기 제조시에는 당 업계에서 통상적으로 첨가하는 원료 및 성분을 첨가하여 제조할 수 있다. 또한 상기 건강기능식품의 제형 또한 건강기능식품으로 인정되는 제형이면 제한 없이 제조될 수 있다. 본 발명의 건강기능식품은 다양한 형태의 제형으로 제조될 수 있으며, 일반 약품과는 달리 식품을 원료로 하여 약품의 장기 복용 시 발생할 수 있는 부작용 등이 없는 장점이 있고, 휴대성이 뛰어나, 본 발명의 건강기능식품은 발모 촉진 효과를 증진시키기 위한 보조제로 섭취가 가능하다.
구체적으로, 상기 식품은 상기 9종 신규 화합물 중 선택된 하나 이상 또는 이의 이성질체를 음료, 차류, 향신료, 껌, 과자류 등의 식품소재에 첨가하거나, 캡슐화, 분말화, 현탁액 등으로 제조한 식품으로, 예를 들어, 각종 식품류, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 건강 기능성 식품류 등으로 사용될 수 있다.
상기 식품은 공지의 제조방법에 따라 정제, 과립, 분말, 캅셀, 액상의 용액 및 환 등의 제형으로 제조할 수 있으며, 본 발명에 따른 조성물의 함량은 제형에 따라 조절할 수 있다. 본 발명에 의한 신규 9종의 화합물 중 선택된 어느 하나 이상을 유효성분으로 함유하는 외에는 다른 성분에는 특별한 제한이 없으며, 통상의 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다.
상기 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당, 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 상술한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제(타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다.
그 밖에 본 발명의 조성물 또는 건강기능식품은, 여러 가지 양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다.
그 밖에 본 발명의 건강기능식품은 천연 과일 주스, 과일 주스 음료, 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용될 수 있다.
본 발명의 제형이 파우더인 경우에는, 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록사이드, 칼슘 실케이트, 폴리아미드 파우더 또는 이들의 혼합물이 이용될 수 있다.
본 발명의 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는, 담체 성분으로서 용매, 용해화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알콜, 벤질 벤조에이트, 프로필렌글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일이 이용될 수 있으며, 특히, 목화씨 오일, 땅콩 오일, 옥수수 배종 오일, 올리브오일, 피마자 오일 및 참깨 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 이용될 수 있다.
본 발명의 제형이 현탁액인 경우에는, 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알콜, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있다.
본 발명의 또 다른 하나의 목적은 9종 신규 화합물 중 선택된 하나 이상, 이의 이성질체, 또는 이의 화장품학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 발모 촉진용 화장료 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 용어, "화장료 조성물"은 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 예를 들어 용액, 유탁액, 현탁액, 페이스트, 크림, 로션, 겔, 파우더, 스프레이, 계면활성제-함유 클린징, 오일, 비누, 액체 세정료, 입욕제, 파운데이션, 메이크업베이스, 에센스, 화장수, 폼, 팩, 유연수, 선 스크린 크림 또는 선오일 등으로 제형화 될 수 있다.
본 발명의 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는, 담체 성분으로서 용매, 용해화제 또는 유탁화제가 이용될 수 있고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 이용될 수 있다.
본 발명의 제형이 현탁액인 경우에는, 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있다.
본 발명의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는, 담체 성분으로서 동물성유, 식물성유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다.
본 발명의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는, 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.
본 발명의 제형이 계면-활성제 함유 클린징인 경우에는, 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르 설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성유, 라놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서는 상기 9종 신규화합물의 발모촉진 효과를 확인한 바 이를 포함하는 조성물을 탈모방지 및 발모촉진용 화장료 조성물로 사용할 수 있음을 확인하였다.
본 발명에 따른 9종 신규 화합물 중 선택된 하나 이상을 유효성분으로 포함하는 발모 촉진용 조성물은 탈모의 개선, 예방 및 치료에 있어 발모를 촉진하는 실효적 효과를 제공할 수 있어 보다 근본적인 예방 및 치료 효과를 제공해 줄 수 있다.
도 1은 9-deoxo-31-O-demethyl-prolyl-FK506에 대한 고성능액체크로마토그래피 분석 결과이다.
도 2는 9-deoxo-31-O-demethyl-prolyl-FK506에 대한 핵자기공명 분석 (1H-NMR) 결과이다.
도 3은 9-deoxo-31-O-demethyl-prolyl-FK506에 대한 핵자기공명 분석 (13C-NMR) 결과이다.
도 4는 9-deoxo-31-O-demethyl-prolyl-FK506에 대한 핵자기공명 분석 (COSY-NMR) 결과이다.
도 5는 9-deoxo-31-O-demethyl-prolyl-FK506에 대한 핵자기공명 분석 (HSQC-NMR) 결과이다.
도 6은 9-deoxo-31-O-demethyl-prolyl-FK506에 대한 핵자기공명 분석 (HMBC-NMR) 결과이다.
도 7은 9-deoxo-36,37-dihydro-FK506에 대한 고성능액체크로마토그래피 분석 결과이다.
도 8은 9-deoxo-36,37-dihydro-FK506에 대한 핵자기공명 분석 (1H-NMR) 결과이다.
도 9는 9-deoxo-36,37-dihydro-FK506에 대한 핵자기공명 분석 (13C-NMR) 결과이다.
도 10은 9-deoxo-36,37-dihydro-FK506에 대한 핵자기공명 분석 (COSY-NMR) 결과이다.
도 11은 9-deoxo-36,37-dihydro-FK506에 대한 핵자기공명 분석 (HSQC-NMR) 결과이다.
도 12는 9-deoxo-36,37-dihydro-FK506에 대한 핵자기공명 분석 (HMBC-NMR) 결과이다.
도 13은 31-O-demethyl-36,37-dihydro-FK506에 대한 고성능액체크로마토그래피 분석 결과이다.
도 14는 31-O-demethyl-36,37-dihydro-FK506에 대한 핵자기공명 분석 (1H-NMR) 결과이다.
도 15는 31-O-demethyl-36,37-dihydro-FK506에 대한 핵자기공명 분석 (13C-NMR) 결과이다.
도 16은 31-O-demethyl-36,37-dihydro-FK506에 대한 핵자기공명 분석 (COSY-NMR) 결과이다.
도 17은 31-O-demethyl-36,37-dihydro-FK506에 대한 핵자기공명 분석 (HSQC-NMR) 결과이다.
도 18은 31-O-demethyl-36,37-dihydro-FK506에 대한 핵자기공명 분석 (HMBC-NMR) 결과이다.
도 19는 9-deoxo-31-O-demethyl-36,37-dihydro-FK506에 대한 고성능액체크로마토그래피 분석 결과이다.
도 20은 9-deoxo-31-O-demethyl-36,37-dihydro-FK506에 대한 핵자기공명 분석 (1H-NMR) 결과이다.
도 21은 9-deoxo-31-O-demethyl-36,37-dihydro-FK506에 대한 핵자기공명 분석 (13C-NMR) 결과이다.
도 22는 9-deoxo-31-O-demethyl-36,37-dihydro-FK506에 대한 핵자기공명 분석 (COSY-NMR) 결과이다.
도 23은 9-deoxo-31-O-demethyl-36,37-dihydro-FK506에 대한 핵자기공명 분석 (HSQC-NMR) 결과이다.
도 24는 9-deoxo-31-O-demethyl-36,37-dihydro-FK506에 대한 핵자기공명 분석 (HMBC-NMR) 결과이다.
도 25는 9-deoxo-FK520에 대한 고성능액체크로마토그래피 분석 결과이다.
도 26은 9-deoxo-FK520에 대한 핵자기공명 분석 (1H-NMR) 결과이다.
도 27은 9-deoxo-FK520에 대한 핵자기공명 분석 (13C-NMR) 결과이다.
도 28은 9-deoxo-FK520에 대한 핵자기공명 분석 (COSY-NMR) 결과이다.
도 29는 9-deoxo-FK520에 대한 핵자기공명 분석 (HSQC-NMR) 결과이다.
도 30은 9-deoxo-FK520에 대한 핵자기공명 분석 (HMBC-NMR) 결과이다.
도 31은 31-O-demethyl-FK520에 대한 고성능액체크로마토그래피 분석 결과이다.
도 32는 31-O-demethyl-FK520에 대한 핵자기공명 분석 (1H-NMR) 결과이다.
도 33은 31-O-demethyl-FK520에 대한 핵자기공명 분석 (13C-NMR) 결과이다.
도 34는 31-O-demethyl-FK520에 대한 핵자기공명 분석 (COSY-NMR) 결과이다.
도 35는 31-O-demethyl-FK520에 대한 핵자기공명 분석 (HSQC-NMR) 결과이다.
도 36은 31-O-demethyl-FK520에 대한 핵자기공명 분석 (HMBC-NMR) 결과이다.
도 37은 9-deoxo-31-O-demethyl-FK520에 대한 고성능액체크로마토그래피 분석 결과이다.
도 38은 9-deoxo-31-O-demethyl-FK520에 대한 핵자기공명 분석 (1H-NMR) 결과이다.
도 39는 9-deoxo-31-O-demethyl-FK520에 대한 핵자기공명 분석 (13C-NMR) 결과이다.
도 40은 9-deoxo-31-O-demethyl-FK520에 대한 핵자기공명 분석 (COSY-NMR) 결과이다.
도 41은 9-deoxo-31-O-demethyl-FK520에 대한 핵자기공명 분석 (HSQC-NMR) 결과이다.
도 42는 9-deoxo-31-O-demethyl-FK520에 대한 핵자기공명 분석 (HMBC-NMR) 결과이다.
도 43은 9-deoxo-FK523에 대한 고성능액체크로마토그래피 분석 결과이다.
도 44는 9-deoxo-FK523에 대한 핵자기공명 분석 (1H-NMR) 결과이다.
도 45는 9-deoxo-FK523에 대한 핵자기공명 분석 (13C-NMR) 결과이다.
도 46은 9-deoxo-FK523에 대한 핵자기공명 분석 (COSY-NMR) 결과이다.
도 47은 9-deoxo-FK523에 대한 핵자기공명 분석 (HSQC-NMR) 결과이다.
도 48은 9-deoxo-FK523에 대한 핵자기공명 분석 (HMBC-NMR) 결과이다.
도 49는 9-deoxo-31-O-demethyl-FK523에 대한 고성능액체크로마토그래피 분석 결과이다.
도 50은 9-deoxo-31-O-demethyl-FK523에 대한 핵자기공명 분석 (1H-NMR) 결과이다.
도 51은 9-deoxo-31-O-demethyl-FK523에 대한 핵자기공명 분석 (13C-NMR) 결과이다.
도 52는 9-deoxo-31-O-demethyl-FK523에 대한 핵자기공명 분석 (COSY-NMR) 결과이다.
도 53은 9-deoxo-31-O-demethyl-FK523에 대한 핵자기공명 분석 (HSQC-NMR) 결과이다.
도 54는 9-deoxo-31-O-demethyl-FK523에 대한 핵자기공명 분석 (HMBC-NMR) 결과이다.
도 55는 본 발명의 신규 화합물 9종의 면역억제활성 감소 정도를 조사한 결과이다.
도 56은 본 발명의 신규 화합물의 발모 활성 조사 결과이다.
도 57은 본 발명의 신규 화합물의 비모의 길이생장 확인을 통한 발모 활성 조사 결과이다.
도 58은 본 발명의 신규 화합물이 처리된 비모의 조직학적 결과를 통한 발모 활성 조사 결과이다.
이하, 하기 실시예에 의하여 본 발명을 보다 상세하게 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐 본 발명의 범위가 이들로 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 9-deoxo-31- O -demethyl-prolyl-FK506 제조
FK506을 생산하는 균주인 스트렙토마이세스 카나마이세티쿠스에 대하여 Ban, Y. H. 외 (J. Nat. Prod. 2013, 76, 1091-1098)에 기재된 방법에 따라 이중교차 상동 재조합 (Double cross-over homologous recombination)에 의한 인-프래임 (In-frame) 결실 방법을 사용하여 fkbD-fkbM 유전자의 비활성화를 초래하여 9-deoxo-31-O-demethyl-prolyl-FK506의 생산균주인 스트렙토마이세스 카나마이세티쿠스 ΔfkbD-fkbM (수탁번호 KCTC13581BP)을 제작하였다.
구체적으로 설명하면, FK506을 생산하는 스트렙토마이세스 카나마이세티쿠스 균주에서 fkbD와 fkbM 유전자의 결손 돌연변이체를 제작하기 위하여 각각의 유전자를 pKC1139 벡터에 클로닝하여 Escherichia coli ET12567/pUZ8002로 옮긴 후, 접합 (Conjugation)을 통해 FK506 생산균주 스트렙토마이세스 카나마이세티쿠스로 형질 전환하였다.
균주제작 방법은 보다 구체적으로 인-프래임(In-frame) 유전자 결실 플라스미드 (Plasmids)의 제작, 유전자 결실 균주 제작으로 설명할 수 있다.
인-프래임(In-frame) 유전자 결실 플라스미드 (Plasmids)의 제작은 대장균-방선균 셔틀 (E. coli-Streptomyces shuttle) 벡터 pKC1139를 인프래임 유전자 결실을 위해서 사용하였다. 플라스미드 (Plasmid) 제작은 스트렙토마이세스 카나마이세티쿠스로부터 유래된 포스미드 (Fosmid) DNA로부터 삭제를 위한 표적 유전자의 왼쪽- 및 오른쪽-인접 절편 (Left- and right-flanking fragments)의 PCR 증폭에 의해 실시하였다. fkbD-fkbM 유전자의 결실을 위해서는 왼쪽-인접 절편의 프라이머 쌍 FkbD-MLF/FkbD-MLR, 오른쪽-인접 절편의 프라이머 쌍 FkbD-MRF/FkbD-MRR을 설계하였다. PCR 절편 모두는 분리하여 HindIII-XbaI 또는 XbaI-EcoRI으로 절단한 후에 pKC1139 벡터에 클로닝 하였다. 본 실시예에서 사용된 균주, 플라스미드 및 프라이머에 대한 정보는 하기 표 1과 표 2에 제시하였다.
유전자 결실 균주 제작을 위해 사용한 플라스미드는 표 1에 요약하였다. C9 수산화효소 (Hydroxylase)와 31-Ｏ-메틸변환효소를 함께 제거하기 위한 플라스미드, p△fkbD-fkbM는 대장균 ET12567/pUZ8002에 옮긴 후 접합에 의해 스트렙토마이세스 카나마이세티쿠스 내로 도입하여 표적 유전자를 상동 재조합으로 결실시켰다. 결실 플라스미드와 스트렙토마이세스 카나마이세티쿠스 염색체 사이에서 단일 교차가 일어난 균주는 아프라마이신 (Apramycin)이 있는 37℃ (pSG5-기본으로 하는 복제단위 (Replicon)를 위한 비-증식 허용온도)에서 아프라마이신-저항성이 있는 피전달접합균주 (Transconjugant)의 배양으로 선택하였다. 이후 확보된 콜로니는 28℃에서 선택 없이 3회 증식을 수행하여 두 번째 교차를 허용하였다. 2개의 달성된 이중 교차 돌연변이, 즉 ΔfkbD-fkbM를 아프라마이신-민감성의 발현형질로 선택하였고, 그 후에 PCR로 확인하였고, 선택적으로 서던 블록 분석으로 확인하였다.
제작한 fkbD-fkbM 유전자 결손 균주인 스트렙토마이세스 카나마이세티쿠스 ΔfkbD-fkbM은 한국생명공학연구원 생물자원센터 (Korean Collection for Type Cultures, KCTC)에 2018년 7월 17일자로 기탁하였다 (수탁번호 KCTC13581BP).
사용한 균주와 플라스미드 정보
Strain/vector Reievant characteristic
Bacterial strains
Escherichia coli
DH5α Host for general cloning
ET12567/pUZ8002 Donor strain for intergeneric conjugation between E.coli and streptomyces
Streptomyces
Streptomyces kanamyceticus Wild-type FK506 producing strain
△fkbD-fkbM Mutant of S. kanamyceticus with an in-frame deletion of fkbD-fkbM
△fkbD-fkbM,tcsB Mutant of S. kanamyceticus with an in-frame deletion of fkbD-fkbM,tcsB
△fkbD-fkbM,tcsD Mutant of S. kanamyceticus with an in-frame deletion of fkbD-fkbM,tcsD
△fkbD,tcsD Mutant of S. kanamyceticus with an in-frame deletion of fkbD,tcsD
△fkbD,tcsB Mutant of S. kanamyceticus with an in-frame deletion of fkbD,tcsB
△fkbM,tcsD Mutant of S. kanamyceticus with an in-frame deletion of fkbM,tcsD
△fkbM,tcsB Mutant of S. kanamyceticus with an in-frame deletion of fkbM,tcsB
Plasmid
pKC1139 High-copy-number temperature-sensitive E. coli -Streptomyces shuttle vector
p△fkbD Deletion plasmid with in-frame deletion of 51-bp internal fkbD fragment
p△fkbM Deletion plasmid with in-frame deletion of 507-bp internal fkbD fragment
p△fkbD-fkbM Deletion plasmid with in-frame deletion of 1100-bp internal fkbDM fragment
p△tcsB Deletion plasmid with in-frame deletion of 2090-bp internal tcsB fragment
p△tcsD Deletion plasmid with in-frame deletion of 1154-bp internal tcsD fragment
사용한 프라이머 정보
Primer Sequence 5’to 3’ (Restriction site underlined) Restriction enzyme
FkbDLF TATAAAGCTTCGGAGCCCCGGTGGACCT HindIII
FkbDLR TTAATCTAGACGTCGCCTCGTCGTCGCT XbaI
FkbDRF GTAATCTAGAGTCGGCTACTGCCTCTAC XbaI
FkbDRR GAATGAATTCCGACGAACAGCGGTTCCT EcoRI
FkbMLF TACGAAGCTTTCTGTTCGGCATCCAGCA HindIII
FkbMLR TAGCTCTAGAGTCACCCGGGAGCAGTTC XbaI
FkbMRF TATATCTAGAGACACCGAAGGCGCGCTC XbaI
FkbMRR TTAAGAATTCGAACACCGAGGCCGTCCA EcoRI
FkbD-MLF TATAAAGCTTCGGAGCCCCGGTGGACCT HindIII
FkbD-MLR TTAATCTAGACGTCGCCTCGTCGTCGCT XbaI
FkbD-MRF TATATCTAGAGACACCGAAGGCGCGCTC XbaI
FkbD-MRR TTAAGAATTCGAACACCGAGGCCGTCCA EcoRI
TcsBLF GACAAGCTTATGCTGGCGGTGAAGGCG HindIII
TcsBLR CCGTCTAGACCAGAAGGAATCGAGCCGGAA XbaI
TcsBRF CAGTCTAGAGTGATCCGTGCCCTGCACTCC XbaI
TcsBRR GCCGAATTCGATGACGATGTCCGGGTCG EcoRI
TcsDLF GCTAAGCTTCTCAGGCGTCTGCGGATGC HidIII
TcsDLR ATCGGATCCTTCGCTCACCGGGGCTGCC BamHI
TcsDRF AGCAGATCTGGCATGTTCTGGTCAGTCC BglI
TcsDRR GTCGAATTCCATGCCACGAACGGGTCGA EcoRI
상기 제작한 생산균주 스트렙토마이세스 카나마이세티쿠스 ΔfkbD-fkbM (수탁번호 KCTC13581BP)의 배양을 통하여 9-deoxo-31-O-demethyl-prolyl-FK506을 제조하였다. 구체적으로 설명하면 다음과 같다. 250 ml의 베플 삼각 플라스크 (Baffled flask)에 50 ml의 R2YE 배지 (수크로오즈 103 g/L, 글루코오즈 10 g/L, 황산칼륨 0.25 g/L, 염화마그네슘 6수화물 10.12 g/L, 카사미노 엑시드 0.1 g/L, 효모 추출물 (10%) 50 ml/L, TES buffer (5.73%, pH 7.2) 100 ml/L, 인산칼륨 (0.5%) 10 ml/L, 염화칼슘 2수화물 (3.68%) 80 ml/L, L-프롤린 (20%) 15 ml/L, 미량 원소 용액 2 ml/L, 수산화나트륨 (1 N) 5 ml/L)를 첨가하고, 여기에 생산균주를 접종한 다음에 회전식 진탕 배양기에서 28℃, 180 rpm 조건에서 이틀 동안 전배양을 실시하였다. 그 다음에 1 L의 R2YE 배지가 첨가되어 있는 3 L 삼각 플라스크 (Erlenmeyer flask)에 이틀 동안 전배양한 배양액 10 ml를 접종하였다. 접종 후에 28℃, 180 rpm 조건에서 6일 동안 배양을 실시하였다. 6일간 배양 후에 1차 회수 공정을 통해 생산된 9-deoxo-31-O-demethyl-prolyl-FK506을 추출하였다. 1차 회수 공정은 다음과 같이 실시하였다. 먼저, 배양액에 동량의 메탄올을 첨가하여 30분 동안 혼합해 준 후 원심분리하여 균체를 제거하였고, 균체를 제거한 추출액에 대해서는 회전 증발기 (Rotary evaporator)를 이용한 농축을 실시해 주었다. 그 다음에 농축한 추출액을 물에 용해시키고, 2배 용량의 에틸아세테이트 (Ethyl acetate)를 첨가 후 잘 혼합해 준 다음 층 분리가 될 때까지 방치하였다. 층이 분리된 다음에 위층의 유기용매층을 회수하고 이를 회전 증발기를 이용하여 농축시키고 농축 후의 무게를 측정하였다. 1차 회수 공정을 실시하여 얻어 진 추출액을 실리카겔이 충진된 칼럼을 통과시켜 주었다. 이때 실리카겔의 양은 1차 회수 공정의 추출액 무게의 15배를 사용하였으며, 이동상은 5가지 비율의 메탄올과 메틸렌클로라이드 (분액 1. 0:100, 분액 2. 1:100, 분액 3. 1:10, 분액 4. 1:1, 분액 5. 100:0)를 사용하였다. 분액 3에서 9-deoxo-31-O-demethyl-prolyl-FK506이 확인되었다. 이렇게 얻어진 분액 3은 회전 증발기를 이용하여 농축하고 HPLC를 이용하여 최종적으로 정제하였다.
이를 동결건조시켜 분말형태의 [화학식 1]로 표시되는 물질인 9-deoxo-31-O-demethyl-prolyl-FK506을 얻을 수 있었다.
제조한 9-deoxo-31-O-demethyl-prolyl-FK506의 확인은 다음과 같이 실시하였다. 구체적으로, 고성능액체크로마토그래피 분석 (High performance liquid chromatography analysis), 질량분석 (Mass spectrometry), 핵자기공명 분석 (Nuclear magnetic resonance analysis)을 실시하였다. 9-deoxo-31-O-demethyl-prolyl-FK506에 대한 분석 결과는 표 3과 도 1 내지 도 6으로 정리되며, 이러한 결과들로부터 제작한 생산균주 스트렙토마이세스 카나마이세티쿠스 ΔfkbD-fkbM으로부터 9-deoxo-31-O-demethyl-prolyl-FK506이 생산됨을 확인할 수 있었다.
9-deoxo-31-O-demethyl-prolyl-FK506 (분자식 C41H57NO11, 분자량 749.4714)에 대한 분석 결과를 하기의 표 3에 나타내었다.
분석법 분석결과
고성능액체크로마토그래피 분석 HPLC의 이동상은 45-55% 아세토니트릴수용액을 사용하였고 유량은 1 ml/min이었고 205 nm의 UV 검출기로 분석하였다. 이때의 9-deoxo-31-O-demethyl-prolyl-FK506의 머무름 시간 (Retention time)은 22분이었다.
질량분석 (ESI-HR-MS) Calcd. for C42H67NNaO11 +:784.4606, found: m/z 784.4611
핵자기공명 분석 번호 carbon (ppm) proton (ppm)
1 170.09
2 59.06 4.36 (1H, dd, J=10.5, 3.5 Hz)
3 29.35 1.97 (1H, m)2.19 (1H, m)
4 24.89 1.96 (1H, m)1.98 (1H, m)
5
6 47.61 3.55 (1H, m)3.64 (1H, m)
7 171.99
8 39.34 2.56 (1H, d, J=15.0 Hz)2.63 (1H, d, J=15.0 Hz)
9 98.73
10 38.72 1.59 (1H, m)
11 32.86 1.56 (1H, m)1.99 (1H, m)
12 74.73 3.43 (1H, m)
13 71.14 3.85 (1H, dd, J=10.0, 5.0 Hz)
14 77.39 3.54 (1H, m)
15 36.57 1.34 (1H, m)1.47 (1H, m)
16 25.72 1.61 (1H, m)
17 49.17 1.70 (1H, m)2.35 (1H, m)
18 141.22
19 122.04 4.99 (1H, d, J=5.0 Hz)
20 53.54 3.38 (1H, d, J=5.0 Hz)
21 214.00
22 44.25 2.35 (1H, m)2.67 (1H, m)
23 69.23 4.04 (1H, br d, J=10.0 Hz)
24 41.26 1.83 (1H, dd, J=10.0, 2.0 Hz)
25 78.28 5.18 (1H, d, J=2.0 Hz)
26 132.64
27 129.79 5.01 (1H, d, J=2.0 Hz)
28 35.23 2.35 (1H, m)
29 39.39 1.14 (1H, m)1.90 (1H, m)
30 75.81 3.35 (1H, m)
31 75.28 3.44 (1H, m)
32 32.29 1.36 (1H, m)1.98 (1H, m)
33 31.22 1.06 (1H, m)1.61 (1H, m)
34 35.78 2.25 (1H, m)2.45 (1H, m)
35 135.80 5.72 (1H, m)
36 116.84 5.00 (1H, dd, J=15.0, 10.0 Hz)5.03 (1H, dd,J=15.0,5.0Hz)
37 17.20 0.96 (3H, d, J=5 Hz)
38 19.10 0.77 (3H, d, J=5 Hz)
39 15.90 1.67 (3H, s)
40 10.13 0.90 (3H, d, J=5 Hz)
41 14.41 1.65 (3H, s)
42 56.48 3.38 (3H, s)
43 57.98 3.37 (3H, s)
1H, 13C-NMR로부터 특징적인 작용기로써 1개의 ketone 탄소(δC 214.00)와 2개의 carbonyl 탄소(δC 171.99, 170.09), exomehtylene 골격(δC 116.84, 135.80)과 2개의 olefine 골격(δC 141.22, 122.04;δC 132.64, 129.79)이 확인되었고, dioxygenated 4급탄소 (δC 98.73), oxygenated 메틴탄소 7개(δC 78.28, 77.39, 75.28, 75.81, 74.73, 71.14, 69.23), 2개의 메톡시 탄소 (δC 57.98, 56.48)가 관측되었으며, 5개의 메틸탄소 (δC 19.10, 17.20, 15.90, 14.41, 10.13)가 관측되었으며, 탄소는 모두 42개로 이루어진 FK506 유도체로 관측되었다. 정확한 구조를 확인하기 위하여, 2D-NMR을 확인하였다. gCOSY로부터 proton의 연결을 확인한 결과, H-2~H-4사이의 coupling으로부터 본 화합물은 pipecolyl 골격의 FK506이 아닌, CH2작용기가 없는 prolyl 골격을 가지고 있음을 확인하였다. gHMBC 데이터로부터 H-9 (δH 2.56, 2.63)이 C-8 (δC 171.99), C-10 (δC 98.73)과 correlation으로부터 본 화합물은 C-9에 ketone이 아닌 CH2로 환원된 골격임을 확인하였다. 이와 함께, 2개의 메톡시 작용기가 C-13, C-15에 결합되어 있어, C-31에는 메톡시가 존재하지 않는 구조임을 확인하였다. 이를 종합하여, 본 화합물은 9-deoxo-31-O-demethyl-prolyl-FK506임을 확인하였다.
실시예 2: 9-deoxo-36,37-dihydro-FK506 제조
FK506을 생산하는 균주인 스트렙토마이세스 카나마이세티쿠스에 대하여 Ban, Y. H. 외 (J. Nat. Prod. 2013, 76, 1091-1098)에 기재된 방법에 따라 이중교차 상동 재조합 (Double cross-over homologous recombination)에 의한 인-프래임 (In-frame) 결실 방법을 사용하여 fkbD 및 tcsD 유전자의 비활성화를 초래하여 9-deoxo-36,37-dihydro-FK506의 생산균주인 스트렙토마이세스 카나마이세티쿠스 ΔfkbD,tcsD (수탁번호 KCTC13580BP)를 제작하였다.
구체적으로 설명하면, FK506을 생산하는 스트렙토마이세스 카나마이세티쿠스 균주에서 fkbD 및 tcsD 유전자의 결손 돌연변이체를 제작하기 위하여 각각의 유전자를 pKC1139 벡터에 클로닝하여 Escherichia coli ET12567/pUZ8002로 옮긴 후, 접합 (Conjugation)을 통해 FK506 생산균주 스트렙토마이세스 카나마이세티쿠스로 형질 전환하였다.
균주제작 방법은 보다 구체적으로 인-프래임(In-frame) 유전자 결실 플라스미드 (Plasmids)의 제작, 유전자 결실 균주 제작으로 설명할 수 있다.
인-프래임(In-frame) 유전자 결실 플라스미드 (Plasmids)의 제작은 대장균-방선균 셔틀 (E. coli-Streptomyces shuttle) 벡터 pKC1139를 인-프래임 유전자 결실을 위해서 사용하였다. 플라스미드 (Plasmid) 제작은 스트렙토마이세스 카나마이세티쿠스로부터 유래된 포스미드 (Fosmid) DNA로부터 삭제를 위한 표적 유전자의 왼쪽- 및 오른쪽-인접 절편 (Left- and right-flanking fragments)의 PCR 증폭에 의해 실시하였다. fkbD 유전자의 결실을 위해서는 왼쪽-인접 절편의 프라이머 쌍 FkbDLF/FkbDLR, 오른쪽-인접 절편의 프라이머 쌍 FkbDRF/FkbDRR을 설계하였고, tcsD 유전자의 결실을 위해서는 왼쪽-인접 절편의 프라이머 쌍 TcsDLF/TcsDLR, 오른쪽-인접 절편의 프라이머 쌍 TcsDRF/TcsDRR을 설계하였다. PCR 절편 모두는 분리하여 HindIII-XbaI 또는 XbaI-EcoRI으로 절단한 후에 pKC1139 벡터에 클로닝 하였다. 본 실시예에서 사용된 균주, 플라스미드 및 프라이머에 대한 정보는 표 1과 표 2에 제시하였다.
유전자 결실 균주 제작을 위해 사용한 플라스미드는 표 1에 요약하였다. C9 수산화효소 (Hydroxylase)를 제거하기 위한 플라스미드, p△fkbD는 대장균 ET12567/pUZ8002에 옮긴 후 접합에 의해 스트렙토마이세스 카나마이세티쿠스 내로 도입하여 표적 유전자를 상동 재조합으로 결실시켰다. 결실 플라스미드와 스트렙토마이세스 카나마이세티쿠스 염색체 사이에서 단일 교차가 일어난 균주는 아프라마이신 (Apramycin)이 있는 37℃ (pSG5-기본으로 하는 복제단위 (Replicon)를 위한 비-증식 허용온도)에서 아프라마이신-저항성이 있는 피전달접합균주 (Transconjugant)의 배양으로 선택하였다. 이후 확보된 콜로니는 28℃에서 선택 없이 3회 증식을 수행하여 두 번째 교차를 허용하였다. 2개의 달성된 이중 교차 돌연변이, 즉 ΔfkbD를 아프라마이신-민감성의 발현형질로 선택하였고, 그 후에 PCR로 확인하였고, 선택적으로 서던 블록 분석으로 확인하였다.
제작한 fkbD 유전자가 결손된 스트렙토마이세스 카나마이세티쿠스 ΔfkbD에 p△tcsD를 도입하여 fkbD 유전자 결손 방법과 동일한 방법을 이용하여 tcsD 유전자를 결실시켰다. ΔfkbD,tcsD는 아프라마이신-민감성의 발현형질로 선택하였고, 그 후에 PCR로 확인하였고, 선택적으로 서던 블록 분석으로 확인하였다.
제작한 fkbD, tcsD 유전자 결손 균주인 스트렙토마이세스 카나마이세티쿠스 ΔfkbD,tcsD는 한국생명공학연구원 생물자원센터 (Korean Collection for Type Cultures, KCTC)에 2018년 7월 17일자로 기탁하였다 (수탁번호 KCTC13580BP).
상기 제작한 생산균주 스트렙토마이세스 카나마이세티쿠스 ΔfkbD,tcsD (수탁번호 KCTC13580BP)의 배양을 통하여 9-deoxo-36,37-dihydro-FK506을 제조하였다. 구체적으로 설명하면 다음과 같다. 250 ml의 베플 삼각 플라스크 (Baffled flask)에 50 ml의 R2YE 배지 (수크로오즈 103 g/L, 글루코오즈 10 g/L, 황산칼륨 0.25 g/L, 염화마그네슘 6수화물 10.12 g/L, 카사미노 엑시드 0.1 g/L, 효모 추출물 (10%) 50 ml/L, TES buffer (5.73%, pH 7.2) 100 ml/L, 인산칼륨 (0.5%) 10 ml/L, 염화칼슘 2수화물 (3.68%) 80 ml/L, L-프롤린 (20%) 15 ml/L, 미량 원소 용액 2 ml/L, 수산화나트륨 (1 N) 5 ml/L)를 첨가하고, 여기에 생산균주를 접종한 다음에 회전식 진탕 배양기에서 28℃, 180 rpm 조건에서 이틀 동안 전배양을 실시하였다. 그 다음에 1 L의 R2YE 배지가 첨가되어 있는 3 L 삼각 플라스크 (Erlenmeyer flask)에 이틀 동안 전배양한 배양액 10 ml를 접종하였다. 접종 후에 28℃, 180 rpm 조건에서 6일 동안 배양을 실시하였다. 6일간 배양 후에 1차 회수 공정을 통해 생산된 9-deoxo-36,37-dihydro-FK506을 추출하였다.
1차 회수 공정은 다음과 같이 실시하였다. 먼저, 배양액에 동량의 메탄올을 첨가하여 30분 동안 혼합해 준 후 원심분리하여 균체를 제거하였고, 균체를 제거한 추출액에 대해서는 회전 증발기 (Rotary evaporator)를 이용한 농축을 실시해 주었다. 그 다음에 농축한 추출액을 물에 용해시키고, 2배 용량의 에틸아세테이트 (Ethyl acetate)를 첨가 후 잘 혼합해 준 다음 층 분리가 될 때까지 방치하였다. 층이 분리된 다음에 위층의 유기용매층을 회수하고 이를 회전 증발기를 이용하여 농축시키고 농축 후의 무게를 측정하였다. 1차 회수 공정을 실시하여 얻어 진 추출액을 실리카겔이 충진된 칼럼을 통과시켜 주었다. 이때 실리카겔의 양은 1차 회수 공정의 추출액 무게의 15배를 사용하였으며, 이동상은 5가지 비율의 메탄올과 메틸렌클로라이드 (분액 1. 0:100, 분액 2. 1:100, 분액 3. 1:10, 분액 4. 1:1, 분액 5. 100:0)를 사용하였다. 분액 3에서 9-deoxo-36,37-dihydro-FK506이 확인되었다. 이렇게 얻어진 분액 3은 회전 증발기를 이용하여 농축하고 HPLC를 이용하여 최종적으로 정제하였다.
이를 동결건조시켜 분말형태의 [화학식 2]로 표시되는 물질인 9-deoxo-36,37-dihydro-FK506을 얻을 수 있었다.
제조한 9-deoxo-36,37-dihydro-FK506의 확인은 다음과 같이 실시하였다. 구체적으로, 고성능액체크로마토그래피 분석 (High performance liquid chromatography analysis), 질량분석 (Mass spectrometry), 핵자기공명 분석 (Nuclear magnetic resonance analysis)을 실시하였다. 9-deoxo-36,37-dihydro-FK506에 대한 분석 결과는 표 4와 도 7 내지 도 12로 정리되며, 이러한 결과들로부터 제작한 생산균주 스트렙토마이세스 카나마이세티쿠스 ΔfkbD,tcsD로부터 9-deoxo-36,37-dihydro-FK506이 생산됨을 확인할 수 있었다.
9-deoxo-36,37-dihydro-FK506 (분자식 C44H73NO11, 분자량 792.06)에 대한 분석 결과를 하기의 표 4에 나타내었다.
분석법 분석결과
고성능액체크로마토그래피 분석 HPLC의 이동상은 45-55% 아세토니트릴수용액을 사용하였고 유량은 1 ml/min이었고 205 nm의 UV 검출기로 분석하였다. 이때의 9-deoxo-36,37-dihydro-FK506의 머무름 시간 (Retention time)은 51분이었다.
질량분석 (ESI-HR-MS) Calcd. for C44H73NNaO11 +:814.5076, found: m/z 814.5083
핵자기공명 분석 번호 carbon (ppm) proton (ppm)
1 169.39
2 52.59 4.85 (1H, brd, J=5.0 Hz)
3 26.58 1.70 (1H, m)2.24 (1H, m)
4 20.70 1.31 (1H, m)1.72 (1H, m)
5 24.42 1.51 (1H, m)1.68 (1H, m)
6 42.65 3.19 (1H, m)3.69 (1H, m)
7 173.96
8 36.25 2.49 (1H, d, J=15.0 Hz)2.66 (1H,d,J=15.0 Hz)
9 98.50
10 38.39 1.56 (1H, m)
11 31.12 1.60 (1H, m)1.94 (1H, m)
12 74.33 3.40 (1H, m)
13 70.6 3.84 (1H, dd, J=10.0, 5.0 Hz)
14 77.11 3.53 (1H, m)
15 36.57 1.34 (1H, m)1.47 (1H, m)
16 25.64 1.50 (1H, m)
17 48.49 1.65 (1H, m)2.32 (1H, m)
18 140.82
19 122.20 5.05 (1H, d, J=5.0 Hz)
20 53.45 3.21 (1H, d, J=5.0 Hz)
21 215.35
22 41.74 2.21 (1H, br d, J=15 Hz)2.66 (1H, br d, J=15 Hz)
23 69.64 3.97 (1H, m)
24 40.26 1.87 (1H, m)
25 76.50 5.19 (1H, br s)
26 132.42
27 128.71 4.97 (1H, d, J=5.0 Hz)
28 34.81 2.35 (1H, m)
29 34.84 0.93 (1H, m)2.01 (1H, m)
30 84.13 3.00 (1H, m)
31 73.58 3.39 (1H, m)
32 30.64 1.34 (1H, m)1.98 (1H, m)
33 31.15 1.06 (1H, m)1.61 (1H, m)
34 33.82 1.42 (1H, m)1.65 (1H, m)
35 20.41 1.21 (2H, m)
36 13.91 0.88 (3H, t, J=7.5 Hz)
37 16.87 0.93 (3H, d, J=5 Hz)
38 18.84 0.76 (3H, d, J=5 Hz)
39 15.45 1.63 (3H, s)
40 10.13 0.90 (3H, d, J=5 Hz)
41 13.91 1.66 (3H, s)
42 56.10 3.35 (3H, s)
43 57.64 3.36 (3H, s)
44 56.56 3.39 (3H, s)
1H, 13C-NMR 및 gHSQC로부터 총 탄소수 44개로써, 각각 메톡시 (δH 3.39, δC 56.56)1개와 CH2(δH 2.24, δH 1.70, δC 20.70)1개가 추가 관측되었고, exomethylene의 작용기는 관측되지 않았으며, triplet coupling으로 관측되는 메틸기 (δH 0.88, δC 13.91)와 CH2 (δH 1.21, δC 20.41)가 관측되었다. 정확한 구조를 확인하기 위하여, 2D-NMR을 확인하였다. gCOSY로부터 proton의 연결을 확인한 결과, H-2~H-5사이의 coupling으로부터 본 화합물은 pipecolyl 골격의 FK506인 것을 확인하였고, CH2작용기(δH 2.24, δH 1.70, δC 20.70) 1개 pipecolyl 골격에 위치함을 확인하였다. gHMBC로부터 3개의 메톡시 수소(δH 3.39, 3.36, 3.35)는 각각 C-31 (δC 77.11), C-15 (δC 77.11) 및 C-13 (δC 74.33) correlation된 것을 확인하였고, triplet coupling으로 관측되는 메틸기(δH 0.88, δC 13.91)과 CH2 (δH 1.21, δC 20.41)가 C-21/33과 상호 correlation을 확인할 수 있었다. 따라서, tcsD가 제거된 균주로부터 만들어진 화합물로서, C-36/37 사이에 존재하던 이중결합이 환원된 형태의 9-deoxo-36,37-dihydro-FK506으로 구조 결정되었다.
실시예 3: 31- O -demethyl-36,37-dihydro-FK506 제조
FK506을 생산하는 균주인 스트렙토마이세스 카나마이세티쿠스에 대하여 Ban, Y. H. 외 (J. Nat. Prod. 2013, 76, 1091-1098)에 기재된 방법에 따라 이중교차 상동 재조합 (Double cross-over homologous recombination)에 의한 인-프래임 (In-frame) 결실 방법을 사용하여 fkbM 및 tcsD 유전자의 비활성화를 초래하여 31-O-demethyl-36,37-dihydro-FK506의 생산균주인 스트렙토마이세스 카나마이세티쿠스 ΔfkbM,tcsD (수탁번호 KCTC13584BP)를 제작하였다.
구체적으로 설명하면, FK506을 생산하는 스트렙토마이세스 카나마이세티쿠스 균주에서 fkbM 및 tcsD 유전자의 결손 돌연변이체를 제작하기 위하여 각각의 유전자를 pKC1139 벡터에 클로닝하여 Escherichia coli ET12567/pUZ8002로 옮긴 후, 접합 (Conjugation)을 통해 FK506 생산균주 스트렙토마이세스 카나마이세티쿠스로 형질 전환하였다.
균주제작 방법은 보다 구체적으로 인-프래임(In-frame) 유전자 결실 플라스미드 (Plasmids)의 제작, 유전자 결실 균주 제작으로 설명할 수 있다.
인-프래임(In-frame) 유전자 결실 플라스미드 (Plasmids)의 제작은 대장균-방선균 셔틀 (E. coli-Streptomyces shuttle) 벡터 pKC1139를 인-프래임 유전자 결실을 위해서 사용하였다. 플라스미드 (Plasmid) 제작은 스트렙토마이세스 카나마이세티쿠스로부터 유래된 포스미드 (Fosmid) DNA로부터 삭제를 위한 표적 유전자의 왼쪽- 및 오른쪽-인접 절편 (Left- and right-flanking fragments)의 PCR 증폭에 의해 실시하였다. fkbM 유전자의 결실을 위해서는 왼쪽-인접 절편의 프라이머 쌍 FkbMLF/FkbMLR, 오른쪽-인접 절편의 프라이머 쌍 FkbMRF/FkbMRR을 설계하였고, tcsD 유전자의 결실을 위해서는 왼쪽-인접 절편의 프라이머 쌍 TcsDLF/TcsDLR, 오른쪽-인접 절편의 프라이머 쌍 TcsDRF/TcsDRR을 설계하였다. PCR 절편 모두는 분리하여 HindIII-XbaI 또는 XbaI-EcoRI으로 절단한 후에 pKC1139 벡터에 클로닝 하였다. 본 실시예에서 사용된 균주, 플라스미드 및 프라이머에 대한 정보는 표 1과 표 2에 제시하였다.
유전자 결실 균주 제작을 위해 사용한 플라스미드는 표 1에 요약하였다. 31-Ｏ-메틸변환효소를 제거하기 위한 플라스미드, p△fkbM은 대장균 ET12567/pUZ8002에 옮긴 후 접합에 의해 스트렙토마이세스 카나마이세티쿠스 내로 도입하여 표적 유전자를 상동 재조합으로 결실시켰다. 결실 플라스미드와 스트렙토마이세스 카나마이세티쿠스 염색체 사이에서 단일 교차가 일어난 균주는 아프라마이신 (Apramycin)이 있는 37℃ (pSG5-기본으로 하는 복제단위 (Replicon)를 위한 비-증식 허용온도)에서 아프라마이신-저항성이 있는 피전달접합균주 (Transconjugant)의 배양으로 선택하였다. 이후 확보된 콜로니는 28℃에서 선택 없이 3회 증식을 수행하여 두 번째 교차를 허용하였다. 2개의 달성된 이중 교차 돌연변이, 즉 ΔfkbM을 아프라마이신-민감성의 발현형질로 선택하였고, 그 후에 PCR로 확인하였고, 선택적으로 서던 블록 분석으로 확인하였다.
제작한 fkbM 유전자가 결손된 스트렙토마이세스 카나마이세티쿠스 ΔfkbM에 p△tcsD를 도입하여 fkbM 유전자 결손 방법과 동일한 방법을 이용하여 tcsD 유전자를 결실시켰다. ΔfkbM,tcsD는 아프라마이신-민감성의 발현형질로 선택하였고, 그 후에 PCR로 확인하였고, 선택적으로 서던 블록 분석으로 확인하였다.
제작한 fkbM, tcsD 유전자 결손 균주인 스트렙토마이세스 카나마이세티쿠스 ΔfkbM,tcsD는 한국생명공학연구원 생물자원센터 (Korean Collection for Type Cultures, KCTC)에 2018년 7월 17일자로 기탁하였다 (수탁번호 KCTC13584BP).
상기 제작한 생산균주 스트렙토마이세스 카나마이세티쿠스 ΔfkbM,tcsD (수탁번호 KCTC13584BP)의 배양을 통하여 31-O-demethyl-36,37-dihydro-FK506을 제조하였다. 구체적으로 설명하면 다음과 같다. 250 ml의 베플 삼각 플라스크 (Baffled flask)에 50 ml의 R2YE 배지 (수크로오즈 103 g/L, 글루코오즈 10 g/L, 황산칼륨 0.25 g/L, 염화마그네슘 6수화물 10.12 g/L, 카사미노 엑시드 0.1 g/L, 효모 추출물 (10%) 50 ml/L, TES buffer (5.73%, pH 7.2) 100 ml/L, 인산칼륨 (0.5%) 10 ml/L, 염화칼슘 2수화물 (3.68%) 80 ml/L, L-프롤린 (20%) 15 ml/L, 미량 원소 용액 2 ml/L, 수산화나트륨 (1 N) 5 ml/L)를 첨가하고, 여기에 생산균주를 접종한 다음에 회전식 진탕 배양기에서 28℃, 180 rpm 조건에서 이틀 동안 전배양을 실시하였다. 그 다음에 1 L의 R2YE 배지가 첨가되어 있는 3 L 삼각 플라스크 (Erlenmeyer flask)에 이틀 동안 전배양한 배양액 10 ml를 접종하였다. 접종 후에 28℃, 180 rpm 조건에서 6일 동안 배양을 실시하였다. 6일간 배양 후에 1차 회수 공정을 통해 생산된 31-O-demethyl-36,37-dihydro-FK506을 추출하였다.
1차 회수 공정은 다음과 같이 실시하였다. 먼저, 배양액에 동량의 메탄올을 첨가하여 30분 동안 혼합해 준 후 원심분리하여 균체를 제거하였고, 균체를 제거한 추출액에 대해서는 회전 증발기 (Rotary evaporator)를 이용한 농축을 실시해 주었다. 그 다음에 농축한 추출액을 물에 용해시키고, 2배 용량의 에틸아세테이트 (Ethyl acetate)를 첨가 후 잘 혼합해 준 다음 층 분리가 될 때까지 방치하였다. 층이 분리된 다음에 위층의 유기용매층을 회수하고 이를 회전 증발기를 이용하여 농축시키고 농축 후의 무게를 측정하였다. 1차 회수 공정을 실시하여 얻어 진 추출액을 실리카겔이 충진된 칼럼을 통과시켜 주었다. 이때 실리카겔의 양은 1차 회수 공정의 추출액 무게의 15배를 사용하였으며, 이동상은 5가지 비율의 메탄올과 메틸렌클로라이드 (분액 1. 0:100, 분액 2. 1:100, 분액 3. 1:10, 분액 4. 1:1, 분액 5. 100:0)를 사용하였다. 분액 3에서 31-O-demethyl-36,37-dihydro-FK506이 확인되었다. 이렇게 얻어진 분액 3은 회전 증발기를 이용하여 농축하고 HPLC를 이용하여 최종적으로 정제하였다.
이를 동결건조시켜 분말형태의 [화학식 3]으로 표시되는 물질인 31-O-demethyl-36,37-dihydro-FK506을 얻을 수 있었다.
제조한 31-O-demethyl-36,37-dihydro-FK506의 확인은 다음과 같이 실시하였다. 구체적으로, 고성능액체크로마토그래피 분석 (High performance liquid chromatography analysis), 질량분석 (Mass spectrometry), 핵자기공명 분석 (Nuclear magnetic resonance analysis)을 실시하였다. 31-O-demethyl-36,37-dihydro-FK506에 대한 분석 결과는 표 5와 도 13 내지 도 18로 정리되며, 이러한 결과들로부터 제작한 생산균주 스트렙토마이세스 카나마이세티쿠스 ΔfkbM,tcsD로부터 31-O-demethyl-36,37-dihydro-FK506이 생산됨을 확인할 수 있었다.
31-O-demethyl-36,37-dihydro-FK506 (분자식 C43H69NO12, 분자량 792.02)에 대한 분석 결과를 하기의 표 5에 나타내었다.
분석법 분석결과
고성능액체크로마토그래피 분석 HPLC의 이동상은 45-55% 아세토니트릴수용액을 사용하였고 유량은 1 ml/min이었고 205 nm의 UV 검출기로 분석하였다.
이때의 31-O-demethyl-36,37-dihydro-FK506의 머무름 시간 (Retention time)은 43분이었다.
질량분석 (ESI-HR-MS) Calcd. for C43H69NNaO12 +:814.4712, found: m/z 814.4715
핵자기공명 분석 번호 carbon (ppm) proton (ppm)
1 169.35
2 56.64 4.58 (1H, brd, J=5.0 Hz)
3 27.92 2.05 (1H, m)1.90 (1H, m)
4 21.42 1.38 (1H, m)1.74 (1H, m)
5 24.80 1.51 (1H, m)1.68 (1H, m)
6 39.58 3.03 (1H, m)4.44 (1H, m)
7 165.08
8 196.54
9 97.42
10 35.28 2.32 (1H, m)
11 33.01 1.52 (1H, m)2.16 (1H, m)
12 74.03 3.39 (1H, m)
13 73.22 3.68 (1H, dd, J=10.0, 5.0 Hz)
14 75.21 3.39 (1H, m)
15 35.79 1.35 (1H, m)1.56 (1H, m)
16 26.67 1.66 (1H, m)
17 49.02 1.80 (1H, m)2.17 (1H, m)
18 138.80
19 123.64 5.03 (1H, d, J=5.0 Hz)
20 53.34 3.28 (1H, d, J=5.0 Hz)
21 213.76
22 43.64 2.10 (1H, br d, J=15 Hz)2.77 (1H, br d, J=15 Hz)
23 70.36 3.92 (1H, m)
24 39.97 1.89 (1H, m)
25 77.82 5.33 (1H, br s)
26 132.63
27 130.03 5.09 (1H, d, J=5.0 Hz)
28 34.93 2.18 (1H, m)
29 39.36 1.14 (1H, m)1.91 (1H, m)
30 75.79 3.59 (1H, m)
31 75.58 3.36 (1H, m)
32 32.36 1.35 (1H, m)1.98 (1H, m)
33 31.23 1.06 (1H, m)1.61 (1H, m)
34 33.34 1.42 (1H, m)1.66 (1H, m)
35 20.76 1.27 (2H, m)
36 14.37 0.90 (3H, t, J=7.5 Hz)
37 16.54 1.00 (3H, d, J=5 Hz)
38 20.75 0.93 (3H, d, J=5 Hz)
39 16.18 1.59 (3H, s)
40 9.79 0.87 (3H, d, J=5 Hz)
41 14.43 1.62 (3H, s)
42 56.64 3.40 (3H, s)
43 57.32 3.30 (3H, s)
1H, 13C-NMR 및 gHSQC로부터, 총 탄소수 43개로써, ketone 탄소 (δC 196.54)가 추가 관측되었고, 2개의 메톡시가 관측되어, ΔfkbM 유전자로부터 만들어진 31-O-demethyl에서 기인한 것임을 유추할 수 있었다. gHMBC로부터 2개의 메톡시 수소(δH 3.40, 3.30)는 각각 C-15 (δC 75.21) 및 C-13 (δC 74.03) correlation된 것을 확인되어, 본 화합물 역시 tcsD가 제거된 균주로부터 만들어진 화합물로서, C-36/37 사이에 존재하던 이중결합이 환원된 형태의 31-O-demethyl-35,37-dihydro-FK506으로 구조 결정되었다.
실시예 4: 9-deoxo-31- O -demethyl-36,37-dihydro-FK506 제조
FK506을 생산하는 균주인 스트렙토마이세스 카나마이세티쿠스에 대하여 Ban, Y. H. 외 (J. Nat. Prod. 2013, 76, 1091-1098)에 기재된 방법에 따라 이중교차 상동 재조합 (Double cross-over homologous recombination)에 의한 인-프래임 (In-frame) 결실 방법을 사용하여 fkbD-fkbM 및 tcsD 유전자의 비활성화를 초래하여 9-deoxo-31-O-demethyl-36,37-dihydro-FK506의 생산균주인 스트렙토마이세스 카나마이세티쿠스 ΔfkbD-fkbM,tcsD (수탁번호 KCTC13585BP)을 제작하였다.
구체적으로 설명하면, FK506을 생산하는 스트렙토마이세스 카나마이세티쿠스 균주에서 fkbD-fkbM 및 tcsD 유전자의 결손 돌연변이체를 제작하기 위하여 각각의 유전자를 pKC1139 벡터에 클로닝하여 Escherichia coli ET12567/pUZ8002로 옮긴 후, 접합 (Conjugation)을 통해 FK506 생산균주 스트렙토마이세스 카나마이세티쿠스로 형질 전환하였다.
균주제작 방법은 보다 구체적으로 인-프래임(In-frame) 유전자 결실 플라스미드 (Plasmids)의 제작, 유전자 결실 균주 제작으로 설명할 수 있다.
인-프래임(In-frame) 유전자 결실 플라스미드 (Plasmids)의 제작은 대장균-방선균 셔틀 (E. coli-Streptomyces shuttle) 벡터 pKC1139를 인-프래임 유전자 결실을 위해서 사용하였다. 플라스미드 (Plasmid) 제작은 스트렙토마이세스 카나마이세티쿠스로부터 유래된 포스미드 (Fosmid) DNA로부터 삭제를 위한 표적 유전자의 왼쪽- 및 오른쪽-인접 절편 (Left- and right-flanking fragments)의 PCR 증폭에 의해 실시하였다. fkbD-fkbM 유전자의 결실을 위해서는 왼쪽-인접 절편의 프라이머 쌍 FkbD-MLF/FkbD-MLR, 오른쪽-인접 절편의 프라이머 쌍 FkbD-MRF/FkbD-MRR을 설계하였고, tcsD 유전자의 결실을 위해서는 왼쪽-인접 절편의 프라이머 쌍 TcsDLF/TcsDLR, 오른쪽-인접 절편의 프라이머 쌍 TcsDRF/TcsDRR을 설계하였다. PCR 절편 모두는 분리하여 HindIII-XbaI 또는 XbaI-EcoRI으로 절단한 후에 pKC1139 벡터에 클로닝 하였다. 본 실시예에서 사용된 균주, 플라스미드 및 프라이머에 대한 정보는 표 1과 표 2에 제시하였다.
유전자 결실 균주 제작을 위해 사용한 플라스미드는 표 1에 요약하였다. C9 수산화효소 (Hydroxylase)와 31-Ｏ-메틸변환효소를 함께 제거하기 위한 플라스미드, p△fkbD-fkbM는 대장균 ET12567/pUZ8002에 옮긴 후 접합에 의해 스트렙토마이세스 카나마이세티쿠스 내로 도입하여 표적 유전자를 상동 재조합으로 결실시켰다. 결실 플라스미드와 스트렙토마이세스 카나마이세티쿠스 염색체 사이에서 단일 교차가 일어난 균주는 아프라마이신 (Apramycin)이 있는 37℃ (pSG5-기본으로 하는 복제단위 (Replicon)를 위한 비-증식 허용온도)에서 아프라마이신-저항성이 있는 피전달접합균주 (Transconjugant)의 배양으로 선택하였다. 이후 확보된 콜로니는 28℃에서 선택 없이 3회 증식을 수행하여 두 번째 교차를 허용하였다. 2개의 달성된 이중 교차 돌연변이, 즉 ΔfkbD-fkbM을 아프라마이신-민감성의 발현형질로 선택하였고, 그 후에 PCR로 확인하였고, 선택적으로 서던 블록 분석으로 확인하였다.
제작한 fkbD-fkbM 유전자가 결손된 스트렙토마이세스 카나마이세티쿠스 ΔfkbD-fkbM에 p△tcsD를 도입하여 fkbD-fkbM 유전자 결손 방법과 동일한 방법을 이용하여 tcsD 유전자를 결실시켰다. ΔfkbD-fkbM,tcsD는 아프라마이신-민감성의 발현형질로 선택하였고, 그 후에 PCR로 확인하였고, 선택적으로 서던 블록 분석으로 확인하였다.
제작한 fkbD-fkbM 및 tcsD 유전자 결손 균주인 스트렙토마이세스 카나마이세티쿠스 ΔfkbD-fkbM,tcsD는 한국생명공학연구원 생물자원센터 (Korean Collection for Type Cultures, KCTC)에 2018년 7월 17일자로 기탁하였다 (수탁번호 KCTC13585BP).
상기 제작한 생산균주 스트렙토마이세스 카나마이세티쿠스 ΔfkbD-fkbM,tcsD (수탁번호 KCTC13585BP)의 배양을 통하여 9-deoxo-31-O-demethyl-36,37-dihydro-FK506을 제조하였다. 구체적으로 설명하면 다음과 같다. 250 ml의 베플 삼각 플라스크 (Baffled flask)에 50 ml의 R2YE 배지 (수크로오즈 103 g/L, 글루코오즈 10 g/L, 황산칼륨 0.25 g/L, 염화마그네슘 6수화물 10.12 g/L, 카사미노 엑시드 0.1 g/L, 효모 추출물 (10%) 50 ml/L, TES buffer (5.73%, pH 7.2) 100 ml/L, 인산칼륨 (0.5%) 10 ml/L, 염화칼슘 2수화물 (3.68%) 80 ml/L, L-프롤린 (20%) 15 ml/L, 미량 원소 용액 2 ml/L, 수산화나트륨 (1 N) 5 ml/L)를 첨가하고, 여기에 생산균주를 접종한 다음에 회전식 진탕 배양기에서 28℃, 180 rpm 조건에서 이틀 동안 전배양을 실시하였다. 그 다음에 1 L의 R2YE 배지가 첨가되어 있는 3 L 삼각 플라스크 (Erlenmeyer flask)에 이틀 동안 전배양한 배양액 10 ml를 접종하였다. 접종 후에 28℃, 180 rpm 조건에서 6일 동안 배양을 실시하였다. 6일간 배양 후에 1차 회수 공정을 통해 생산된 9-deoxo-31-O-demethyl-36,37-dihydro-FK506을 추출하였다.
1차 회수 공정은 다음과 같이 실시하였다. 먼저, 배양액에 동량의 메탄올을 첨가하여 30분 동안 혼합해 준 후 원심분리하여 균체를 제거하였고, 균체를 제거한 추출액에 대해서는 회전 증발기 (Rotary evaporator)를 이용한 농축을 실시해 주었다. 그 다음에 농축한 추출액을 물에 용해시키고, 2배 용량의 에틸아세테이트 (Ethyl acetate)를 첨가 후 잘 혼합해 준 다음 층 분리가 될 때까지 방치하였다. 층이 분리된 다음에 위층의 유기용매층을 회수하고 이를 회전 증발기를 이용하여 농축시키고 농축 후의 무게를 측정하였다. 1차 회수 공정을 실시하여 얻어 진 추출액을 실리카겔이 충진된 칼럼을 통과시켜 주었다. 이때 실리카겔의 양은 1차 회수 공정의 추출액 무게의 15배를 사용하였으며, 이동상은 5가지 비율의 메탄올과 메틸렌클로라이드 (분액 1. 0:100, 분액 2. 1:100, 분액 3. 1:10, 분액 4. 1:1, 분액 5. 100:0)를 사용하였다. 분액 3에서 9-deoxo-31-O-demethyl-36,37-dihydro-FK506이 확인되었다. 이렇게 얻어진 분액 3은 회전 증발기를 이용하여 농축하고 HPLC를 이용하여 최종적으로 정제하였다.
이를 동결건조시켜 분말형태의 [화학식 4]로 표시되는 물질인 9-deoxo-31-O-demethyl-36,37-dihydro-FK506을 얻을 수 있었다.
제조한 9-deoxo-31-O-demethyl-36,37-dihydro-FK506의 확인은 다음과 같이 실시하였다. 구체적으로, 고성능액체크로마토그래피 분석 (High performance liquid chromatography analysis), 질량분석 (Mass spectrometry), 핵자기공명 분석 (Nuclear magnetic resonance analysis)을 실시하였다. 9-deoxo-31-O-demethyl-36,37-dihydro-FK506에 대한 분석 결과는 표 6과 도 19 내지 도 24로 정리되며, 이러한 결과들로부터 제작한 생산균주 스트렙토마이세스 카나마이세티쿠스 ΔfkbD-fkbM,tcsD로부터 9-deoxo-31-O-demethyl-36,37-dihydro-FK506이 생산됨을 확인할 수 있었다.
9-deoxo-31-O-demethyl-36,37-dihydro-FK506 (분자식 C43H71NO11, 분자량 778.04)에 대한 분석 결과를 하기의 표 6에 나타내었다.
분석법 분석결과
고성능액체크로마토그래피 분석 HPLC의 이동상은 45-55% 아세토니트릴수용액을 사용하였고 유량은 1 ml/min이었고 205 nm의 UV 검출기로 분석하였다.
이때의 9-deoxo-31-O-demethyl-36,37-dihydro-FK506의 머무름 시간 (Retention time)은 34분이었다.
질량분석 (ESI-HR-MS) Calcd. for C43H71NNaO11 +:800.4919, found: m/z 800.4924
핵자기공명 분석 번호 carbon (ppm) proton (ppm)
1 169.73
2 52.59 4.85 (1H, brd, J=5.0 Hz)
3 26.94 1.70 (1H, m)2.23 (1H, m)
4 21.03 1.32 (1H, m)1.72 (1H, m)
5 24.77 1.52 (1H, m)1.68 (1H, m)
6 42.97 3.19 (1H, m)3.70 (1H, m)
7 174.37
8 37.54 2.49 (1H, d, J=15.0 Hz)2.67 (1H, d, J=15.0 Hz)
9 98.85
10 38.78 1.56 (1H, m)
11 32.86 1.60 (1H, m)1.94 (1H,m)
12 74.69 3.40 (1H, m)
13 70.99 3.84 (1H, dd, J=10.0, 5.0 Hz)
14 77.21 3.53 (1H, m)
15 36.57 1.34 (1H, m)1.47 (1H,m)
16 26.94 1.63 (1H, m)
17 48.49 1.64 (1H, m)2.33 (1H,m)
18 141.15
19 122.53 5.05 (1H, d, J=5.0 Hz)
20 53.84 3.20 (1H, d, J=5.0 Hz)
21 215.35
22 42.20 2.20 (1H, br d, J=15 Hz)2.64 (1H, br d, J=15 Hz)
23 69.96 3.97 (1H, m)
24 40.05 1.85 (1H, m)
25 76.90 5.20 (1H, br s)
26 132.82
27 129 4.97 (1H, d, J=5.0 Hz)
28 35.29 2.32 (1H, m)
29 39.45 1.12 (1H, m)1.88 (1H, m)
30 75.22 3.53 (1H, m)
31 75.22 3.40 (1H, m)
32 32.32 1.33 (1H, m)1.95 (1H, m)
33 31.19 1.04 (1H, m)1.59 (1H, m)
34 34.14 1.46 (1H, m)1.62 (1H, m)
35 20.73 1.22 (2H, m)
36 14.25 0.88 (3H, t, J=7.5 Hz)
37 17.22 0.94 (3H, d, J=5 Hz)
38 19.17 0.76 (3H, d, J=5 Hz)
39 15.82 1.63 (3H, s)
40 10.07 0.85 (3H, d, J=5 Hz)
41 14.77 1.65 (3H, s)
42 56.45 3.35 (3H, s)
43 57.99 3.35 (3H, s)
1H, 13C-NMR 및 gHSQC로부터, 총 탄소수 43개로 동일한 개수로 이뤄져 있으나, ΔfkbD의 영향으로 인해, 1번, 2번 물질과 같이, ketone대신에 나타나는 CH2 작용기 (δH 2.67, 2.49, δC 37.54)가 관측되었다. 2D-NMR data를 분석한 결과, 4번 화합물은 ΔfkbD-fkbM 유전자로부터 만들어진 9-deoxo-31-O-demethyl-35,37-dihydro-FK506로 구조 결정하였다.
실시예 5: 9-deoxo-FK520 제조
FK506을 생산하는 균주인 스트렙토마이세스 카나마이세티쿠스에 대하여 Ban, Y. H. 외 (J. Nat. Prod. 2013, 76, 1091-1098)에 기재된 방법에 따라 이중교차 상동 재조합 (Double cross-over homologous recombination)에 의한 인-프래임 (In-frame) 결실 방법을 사용하여 fkbD 및 tcsB 유전자 또는 fkbD 및 tcsD 유전자의 비활성화를 초래하여 9-deoxo-FK520의 생산균주인 스트렙토마이세스 카나마이세티쿠스 ΔfkbD,tcsB (수탁번호 KCTC13579BP) 또는 스트렙토마이세스 카나마이세티쿠스 ΔfkbD,tcsD (수탁번호 KCTC13580BP)을 제작하였다.
구체적으로 설명하면, FK506을 생산하는 스트렙토마이세스 카나마이세티쿠스 균주에서 fkbD 및 tcsB 유전자의 결손 돌연변이체 또는 fkbD 및 tcsD 유전자의 결손 돌연변이체를 제작하기 위하여 각각의 유전자를 pKC1139 벡터에 클로닝하여 Escherichia coli ET12567/pUZ8002로 옮긴 후, 접합 (Conjugation)을 통해 FK506 생산균주 스트렙토마이세스 카나마이세티쿠스로 형질 전환하였다.
균주제작 방법은 보다 구체적으로 인-프래임(In-frame) 유전자 결실 플라스미드 (Plasmids)의 제작, 유전자 결실 균주 제작으로 설명할 수 있다.
인-프래임(In-frame) 유전자 결실 플라스미드 (Plasmids)의 제작은 대장균-방선균 셔틀 (E. coli-Streptomyces shuttle) 벡터 pKC1139를 인-프래임 유전자 결실을 위해서 사용하였다. 플라스미드 (Plasmid) 제작은 스트렙토마이세스 카나마이세티쿠스로부터 유래된 포스미드 (Fosmid) DNA로부터 삭제를 위한 표적 유전자의 왼쪽- 및 오른쪽-인접 절편 (Left- and right-flanking fragments)의 PCR 증폭에 의해 실시하였다. fkbD 유전자의 결실을 위해서는 왼쪽-인접 절편의 프라이머 쌍 FkbDLF/FkbDLR, 오른쪽-인접 절편의 프라이머 쌍 FkbDRF/FkbDRR을 설계하였고, tcsB 유전자의 결실을 위해서는 왼쪽-인접 절편의 프라이머 쌍 TcsBLF/TcsBLR, 오른쪽-인접 절편의 프라이머 쌍 TcsBRF/TcsBRR을 설계하였다. tcsD 유전자의 결실을 위해서는 왼쪽-인접 절편의 프라이머 쌍 TcsDLF/TcsDLR, 오른쪽-인접 절편의 프라이머 쌍 TcsDRF/TcsDRR을 설계하였다. PCR 절편 모두는 분리하여 HindIII-XbaI 또는 XbaI-EcoRI으로 절단한 후에 pKC1139 벡터에 클로닝 하였다. 본 실시예에서 사용된 균주, 플라스미드 및 프라이머에 대한 정보는 표 1과 표 2에 제시하였다.
유전자 결실 균주 제작을 위해 사용한 플라스미드는 표 1에 요약하였다. C9 수산화효소 (Hydroxylase)를 제거하기 위한 플라스미드, p△fkbD는 대장균 ET12567/pUZ8002에 옮긴 후 접합에 의해 스트렙토마이세스 카나마이세티쿠스 내로 도입하여 표적 유전자를 상동 재조합으로 결실시켰다. 결실 플라스미드와 스트렙토마이세스 카나마이세티쿠스 염색체 사이에서 단일 교차가 일어난 균주는 아프라마이신 (Apramycin)이 있는 37℃ (pSG5-기본으로 하는 복제단위 (Replicon)를 위한 비-증식 허용온도)에서 아프라마이신-저항성이 있는 피전달접합균주 (Transconjugant)의 배양으로 선택하였다. 이후 확보된 콜로니는 28℃에서 선택 없이 3회 증식을 수행하여 두 번째 교차를 허용하였다. 2개의 달성된 이중 교차 돌연변이, 즉 ΔfkbD를 아프라마이신-민감성의 발현형질로 선택하였고, 그 후에 PCR로 확인하였고, 선택적으로 서던 블록 분석으로 확인하였다.
제작한 fkbD 유전자가 결손된 스트렙토마이세스 카나마이세티쿠스 ΔfkbD에 p△tcsB 또는 p△tcsD를 도입하여 fkbD 유전자 결손 방법과 동일한 방법을 이용하여 tcsB 유전자 또는 tcsD 유전자를 결실시켰다. ΔfkbD,tcsB 또는 ΔfkbD,tcsD는 아프라마이신-민감성의 발현형질로 선택하였고, 그 후에 PCR로 확인하였고, 선택적으로 서던 블록 분석으로 확인하였다.
제작한 fkbD, tcsB 유전자 결손 균주인 스트렙토마이세스 카나마이세티쿠스 ΔfkbD,tcsB는 한국생명공학연구원 생물자원센터 (Korean Collection for Type Cultures, KCTC)에 2018년 7월 17일자로 기탁하였고 (수탁번호 KCTC13579BP), fkbD, tcsD 유전자 결손 균주인 스트렙토마이세스 카나마이세티쿠스 ΔfkbD,tcsD도 한국생명공학연구원 생물자원센터 (Korean Collection for Type Cultures, KCTC)에 2018년 7월 17일자로 기탁하였다 (수탁번호 KCTC13580BP).
상기 제작한 생산균주 스트렙토마이세스 카나마이세티쿠스 ΔfkbD,tcsB (수탁번호 KCTC13579BP) 또는 스트렙토마이세스 카나마이세티쿠스 ΔfkbD,tcsD (수탁번호 KCTC13580BP)의 배양을 통하여 9-deoxo-FK520을 제조하였다. 구체적으로 설명하면 다음과 같다. 250 ml의 베플 삼각 플라스크 (Baffled flask)에 50 ml의 R2YE 배지 (수크로오즈 103 g/L, 글루코오즈 10 g/L, 황산칼륨 0.25 g/L, 염화마그네슘 6수화물 10.12 g/L, 카사미노 엑시드 0.1 g/L, 효모 추출물 (10%) 50 ml/L, TES buffer (5.73%, pH 7.2) 100 ml/L, 인산칼륨 (0.5%) 10 ml/L, 염화칼슘 2수화물 (3.68%) 80 ml/L, L-프롤린 (20%) 15 ml/L, 미량 원소 용액 2 ml/L, 수산화나트륨 (1 N) 5 ml/L)를 첨가하고, 여기에 생산균주를 접종한 다음에 회전식 진탕 배양기에서 28℃, 180 rpm 조건에서 이틀 동안 전배양을 실시하였다. 그 다음에 1 L의 R2YE 배지가 첨가되어 있는 3 L 삼각 플라스크 (Erlenmeyer flask)에 이틀 동안 전배양한 배양액 10 ml를 접종하였다. 접종 후에 28℃, 180 rpm 조건에서 6일 동안 배양을 실시하였다. 6일간 배양 후에 1차 회수 공정을 통해 생산된 9-deoxo-FK520을 추출하였다.
1차 회수 공정은 다음과 같이 실시하였다. 먼저, 배양액에 동량의 메탄올을 첨가하여 30분 동안 혼합해 준 후 원심분리하여 균체를 제거하였고, 균체를 제거한 추출액에 대해서는 회전 증발기 (Rotary evaporator)를 이용한 농축을 실시해 주었다. 그 다음에 농축한 추출액을 물에 용해시키고, 2배 용량의 에틸아세테이트 (Ethyl acetate)를 첨가 후 잘 혼합해 준 다음 층 분리가 될 때까지 방치하였다. 층이 분리된 다음에 위층의 유기용매층을 회수하고 이를 회전 증발기를 이용하여 농축시키고 농축 후의 무게를 측정하였다. 1차 회수 공정을 실시하여 얻어 진 추출액을 실리카겔이 충진된 칼럼을 통과시켜 주었다. 이때 실리카겔의 양은 1차 회수 공정의 추출액 무게의 15배를 사용하였으며, 이동상은 5가지 비율의 메탄올과 메틸렌클로라이드 (분액 1. 0:100, 분액 2. 1:100, 분액 3. 1:10, 분액 4. 1:1, 분액 5. 100:0)를 사용하였다. 분액 3에서 9-deoxo-FK520이 확인되었다. 이렇게 얻어진 분액 3은 회전 증발기를 이용하여 농축하고 HPLC를 이용하여 최종적으로 정제하였다.
이를 동결건조시켜 분말형태의 [화학식 5]로 표시되는 물질인 9-deoxo-FK520을 얻을 수 있었다.
제조한 9-deoxo-FK520의 확인은 다음과 같이 실시하였다. 구체적으로, 고성능액체크로마토그래피 분석 (High performance liquid chromatography analysis), 질량분석 (Mass spectrometry), 핵자기공명 분석 (Nuclear magnetic resonance analysis)을 실시하였다. 9-deoxo-FK520에 대한 분석 결과는 표 7과 도 25 내지 도 30으로 정리되며, 이러한 결과들로부터 제작한 생산균주 스트렙토마이세스 카나마이세티쿠스 ΔfkbD,tcsB 또는 스트렙토마이세스 카나마이세티쿠스 ΔfkbD,tcsD로부터 9-deoxo-FK520이 생산됨을 확인할 수 있었다.
9-deoxo-FK520 (분자식 C43H71NO11, 분자량 778.04)에 대한 분석 결과를 하기의 표 7에 나타내었다.
분석법 분석결과
고성능액체크로마토그래피 분석 HPLC의 이동상은 45-55% 아세토니트릴수용액을 사용하였고 유량은 1 ml/min이었고 205 nm의 UV 검출기로 분석하였다.
이때의 9-deoxo-FK520의 머무름 시간 (Retention time)은 35분이었다.
질량분석 (ESI-HR-MS) Calcd. for C43H71NNaO11 +:800.4919, found: m/z 800.4927
핵자기공명 분석 번호 carbon (ppm) proton (ppm)
1 169.62
2 52.84 4.87 (1H, brd, J=5.0 Hz)
3 26.85 1.71 (1H, m)2.25 (1H, m)
4 20.97 1.24 (1H, m)1.73 (1H, m)
5 24.69 1.52 (1H, m)1.71 (1H, m)
6 42.86 3.19 (1H, m)3.69 (1H, m)
7 174.25
8 36.25 2.49 (1H, d, J=15.0 Hz)2.66 (1H, d, J=15.0 Hz)
9 98.75
10 38.72 1.58 (1H, m)
11 31.12 1.60 (1H, m)1.94 (1H, m)
12 74.62 3.40 (1H, m)
13 70.92 3.84 (1H, dd, J=10.0, 5.0 Hz)
14 77.32 3.53 (1H, m)
15 36.57 1.34 (1H, m)1.47 (1H, m)
16 25.93 1.63 (1H, m)
17 48.75 1.68 (1H, m)2.35 (1H, m)
18 141.35
19 122.25 5.05 (1H, d, J=5.0 Hz)
20 55.65 3.21 (1H, d, J=5.0 Hz)
21 215.46
22 42.11 2.21 (1H, br d, J=15 Hz)2.66 (1H, br d, J=15 Hz)
23 69.83 3.97 (1H, m)
24 40.59 1.87 (1H, m)
25 76.77 5.19 (1H, br s)
26 132.68
27 128.99 4.97 (1H, d, J=5.0 Hz)
28 35.12 2.27 (1H, m)
29 35.12 0.95 (1H, m)2.02 (1H, m)
30 84.44 3.00 (1H, m)
31 73.62 3.39 (1H, m)
32 31.44 1.34 (1H, m)1.98 (1H, m)
33 30.92 1.03 (1H, m)1.61 (1H, m)
34 25.12 1.52 (1H, m)1.72 (1H, m)
35 12.01 0.88 (3H, t, J=7.5 Hz)
36 17.14 0.93 (3H, d, J=5 Hz)
37 19.09 0.78 (3H, d, J=5 Hz)
38 15.76 1.66 (3H, s)
39 10.02 0.89 (3H, d, J=5 Hz)
40 14.75 1.69 (3H, s)
41 56.37 3.37 (3H, s)
42 57.91 3.37 (3H, s)
43 56.81 3.41 (3H, s)
1H, 13C-NMR 및 gHSQC 데이터로부터, 탄소수가 총 43개로 매우 유사한 형태로 확인되었으나, 메톡시 (δH 3.41, δC 56.81)가 추가 관측되었고, CH2 작용기가 한 개가 덜 관측되는 구조 이성질체임을 확인할 수 있었다. gCOSY로부터 proton의 연결을 확인한 결과, H-2~H-5사이의 coupling으로부터 본 화합물은 pipecolyl 골격이 확인되었고, gHMBC로부터 triplet coupling으로 관측되는 메틸기(δH 0.88, δC 12.01)와 CH2 (δH 1.72, 1.52, δC 20.41)가 C-21 (δH 1.72, 1.52, δC 20.41) 사이에 상호 correlation이 이뤄지는 것으로부터, FK506의 propyl기가 아닌 FK520 형태를 이루는 ethyl가 C-21에 존재함을 확인하였다. 이로부터 5번 화합물은 9-deoxo-FK520으로 구조결정하였다.
실시예 6: 31- O -demethyl-FK520 제조
FK506을 생산하는 균주인 스트렙토마이세스 카나마이세티쿠스에 대하여 Ban, Y. H. 외 (J. Nat. Prod. 2013, 76, 1091-1098)에 기재된 방법에 따라 이중교차 상동 재조합 (Double cross-over homologous recombination)에 의한 인-프래임 (In-frame) 결실 방법을 사용하여 fkbM 및 tcsB 유전자 또는 fkbM 및 tcsD 유전자의 비활성화를 초래하여 31-O-demethyl-FK520의 생산균주인 스트렙토마이세스 카나마이세티쿠스 ΔfkbM,tcsB (수탁번호 KCTC13583BP) 또는 스트렙토마이세스 카나마이세티쿠스 ΔfkbM,tcsD (수탁번호 KCTC13584BP)을 제작하였다.
구체적으로 설명하면, FK506을 생산하는 스트렙토마이세스 카나마이세티쿠스 균주에서 fkbM 및 tcsB 유전자의 결손 돌연변이체 또는 fkbM 및 tcsD 유전자의 결손 돌연변이체를 제작하기 위하여 각각의 유전자를 pKC1139 벡터에 클로닝하여 Escherichia coli ET12567/pUZ8002로 옮긴 후, 접합 (Conjugation)을 통해 FK506 생산균주 스트렙토마이세스 카나마이세티쿠스로 형질 전환하였다.
균주제작 방법은 보다 구체적으로 인-프래임 (In-frame) 유전자 결실 플라스미드 (Plasmids)의 제작, 유전자 결실 균주 제작으로 설명할 수 있다.
인-프래임 (In-frame) 유전자 결실 플라스미드 (Plasmids)의 제작은 대장균-방선균 셔틀 (E. coli-Streptomyces shuttle) 벡터 pKC1139를 인-프래임 유전자 결실을 위해서 사용하였다. 플라스미드 (Plasmid) 제작은 스트렙토마이세스 카나마이세티쿠스로부터 유래된 포스미드 (Fosmid) DNA로부터 삭제를 위한 표적 유전자의 왼쪽- 및 오른쪽-인접 절편 (Left- and right-flanking fragments)의 PCR 증폭에 의해 실시하였다. fkbM 유전자의 결실을 위해서는 왼쪽-인접 절편의 프라이머 쌍 FkbMLF/FkbMLR, 오른쪽-인접 절편의 프라이머 쌍 FkbMRF/FkbMRR을 설계하였고, tcsB 유전자의 결실을 위해서는 왼쪽-인접 절편의 프라이머 쌍 TcsBLF/TcsBLR, 오른쪽-인접 절편의 프라이머 쌍 TcsBRF/TcsBRR을 설계하였다. tcsD 유전자의 결실을 위해서는 왼쪽-인접 절편의 프라이머 쌍 TcsDLF/TcsDLR, 오른쪽-인접 절편의 프라이머 쌍 TcsDRF/TcsDRR을 설계하였다. PCR 절편 모두는 분리하여 HindIII-XbaI 또는 XbaI-EcoRI으로 절단한 후에 pKC1139 벡터에 클로닝 하였다. 본 실시예에서 사용된 균주, 플라스미드 및 프라이머에 대한 정보는 표 1과 표 2에 제시하였다.
유전자 결실 균주 제작을 위해 사용한 플라스미드는 표 1에 요약하였다. 31-Ｏ-메틸변환효소를 제거하기 위한 플라스미드, p△fkbM은 대장균 ET12567/pUZ8002에 옮긴 후 접합에 의해 스트렙토마이세스 카나마이세티쿠스 내로 도입하여 표적 유전자를 상동 재조합으로 결실시켰다. 결실 플라스미드와 스트렙토마이세스 카나마이세티쿠스 염색체 사이에서 단일 교차가 일어난 균주는 아프라마이신 (Apramycin)이 있는 37℃ (pSG5-기본으로 하는 복제단위 (Replicon)를 위한 비-증식 허용온도)에서 아프라마이신-저항성이 있는 피전달접합균주 (Transconjugant)의 배양으로 선택하였다. 이후 확보된 콜로니는 28℃에서 선택 없이 3회 증식을 수행하여 두 번째 교차를 허용하였다. 2개의 달성된 이중 교차 돌연변이, 즉 ΔfkbM을 아프라마이신-민감성의 발현형질로 선택하였고, 그 후에 PCR로 확인하였고, 선택적으로 서던 블록 분석으로 확인하였다.
제작한 fkbM 유전자가 결손된 스트렙토마이세스 카나마이세티쿠스 ΔfkbM에 p△tcsB 또는 p△tcsD를 도입하여 fkbM 유전자 결손 방법과 동일한 방법을 이용하여 tcsB 유전자 또는 tcsD 유전자를 결실시켰다. ΔfkbM,tcsB 또는 ΔfkbM,tcsD는 아프라마이신-민감성의 발현형질로 선택하였고, 그 후에 PCR로 확인하였고, 선택적으로 서던 블록 분석으로 확인하였다.
제작한 fkbM, tcsB 유전자 결손 균주인 스트렙토마이세스 카나마이세티쿠스 ΔfkbM,tcsB는 한국생명공학연구원 생물자원센터 (Korean Collection for Type Cultures, KCTC)에 2018년 7월 17일자로 기탁하였고 (수탁번호 KCTC13583BP), fkbM, tcsD 유전자 결손 균주인 스트렙토마이세스 카나마이세티쿠스 ΔfkbM,tcsD도 한국생명공학연구원 생물자원센터 (Korean Collection for Type Cultures, KCTC)에 2018년 7월 17일자로 기탁하였다 (수탁번호 KCTC13584BP).
상기 제작한 생산균주 스트렙토마이세스 카나마이세티쿠스 ΔfkbM,tcsB (수탁번호 KCTC13583BP) 또는 스트렙토마이세스 카나마이세티쿠스 ΔfkbM,tcsD (수탁번호 KCTC13584BP)의 배양을 통하여 31-O-demethyl-FK520을 제조하였다. 구체적으로 설명하면 다음과 같다. 250 ml의 베플 삼각 플라스크 (Baffled flask)에 50 ml의 R2YE 배지 (수크로오즈 103 g/L, 글루코오즈 10 g/L, 황산칼륨 0.25 g/L, 염화마그네슘 6수화물 10.12 g/L, 카사미노 엑시드 0.1 g/L, 효모 추출물 (10%) 50 ml/L, TES buffer (5.73%, pH 7.2) 100 ml/L, 인산칼륨 (0.5%) 10 ml/L, 염화칼슘 2수화물 (3.68%) 80 ml/L, L-프롤린 (20%) 15 ml/L, 미량 원소 용액 2 ml/L, 수산화나트륨 (1 N) 5 ml/L)를 첨가하고, 여기에 생산균주를 접종한 다음에 회전식 진탕 배양기에서 28℃, 180 rpm 조건에서 이틀 동안 전배양을 실시하였다. 그 다음에 1 L의 R2YE 배지가 첨가되어 있는 3 L 삼각 플라스크 (Erlenmeyer flask)에 이틀 동안 전배양한 배양액 10 ml를 접종하였다. 접종 후에 28℃, 180 rpm 조건에서 6일 동안 배양을 실시하였다. 6일간 배양 후에 1차 회수 공정을 통해 생산된 31-O-demethyl-FK520을 추출하였다.
1차 회수 공정은 다음과 같이 실시하였다. 먼저, 배양액에 동량의 메탄올을 첨가하여 30분 동안 혼합해 준 후 원심분리하여 균체를 제거하였고, 균체를 제거한 추출액에 대해서는 회전 증발기 (Rotary evaporator)를 이용한 농축을 실시해 주었다. 그 다음에 농축한 추출액을 물에 용해시키고, 2배 용량의 에틸아세테이트 (Ethyl acetate)를 첨가 후 잘 혼합해 준 다음 층 분리가 될 때까지 방치하였다. 층이 분리된 다음에 위층의 유기용매층을 회수하고 이를 회전 증발기를 이용하여 농축시키고 농축 후의 무게를 측정하였다. 1차 회수 공정을 실시하여 얻어 진 추출액을 실리카겔이 충진된 칼럼을 통과시켜 주었다. 이때 실리카겔의 양은 1차 회수 공정의 추출액 무게의 15배를 사용하였으며, 이동상은 5가지 비율의 메탄올과 메틸렌클로라이드 (분액 1. 0:100, 분액 2. 1:100, 분액 3. 1:10, 분액 4. 1:1, 분액 5. 100:0)를 사용하였다. 분액 3에서 31-O-demethyl-FK520이 확인되었다. 이렇게 얻어진 분액 3은 회전 증발기를 이용하여 농축하고 HPLC를 이용하여 최종적으로 정제하였다.
이를 동결건조시켜 분말형태의 [화학식 6]으로 표시되는 물질인 31-O-demethyl-FK520을 얻을 수 있었다.
제조한 31-O-demethyl-FK520의 확인은 다음과 같이 실시하였다. 구체적으로, 고성능액체크로마토그래피 분석 (High performance liquid chromatography analysis), 질량분석 (Mass spectrometry), 핵자기공명 분석 (Nuclear magnetic resonance analysis)을 실시하였다. 31-O-demethyl-FK520에 대한 분석 결과는 표 8과 도 31 내지 도 36으로 정리되며, 이러한 결과들로부터 제작한 생산균주 스트렙토마이세스 카나마이세티쿠스 ΔfkbM,tcsB 또는 스트렙토마이세스 카나마이세티쿠스 ΔfkbM,tcsD로부터 31-O-demethyl-FK520이 생산됨을 확인할 수 있었다.
31-O-demethyl-FK520 (분자식 C42H67NO12, 분자량 777.99)에 대한 분석 결과를 하기의 표 8에 나타내었다.
분석법 분석결과
고성능액체크로마토그래피 분석 HPLC의 이동상은 45-55% 아세토니트릴수용액을 사용하였고 유량은 1 ml/min이었고 205 nm의 UV 검출기로 분석하였다.
이때의 31-O-demethyl-FK520의 머무름 시간 (Retention time)은 34분이었다.
질량분석 (ESI-HR-MS) Calcd. for C42H67NNaO12 +:800.4555, found: m/z 800.4561
핵자기공명 분석 번호 carbon (ppm) proton (ppm)
1 169.30
2 56.64 4.58 (1H, brd, J=5.0 Hz)
3 27.92 2.05 (1H, m)1.90 (1H, m)
4 21.42 1.38 (1H, m)1.74 (1H, m)
5 24.54 1.51 (1H, m)1.68 (1H, m)
6 39.58 3.03 (1H, m)4.42 (1H, m)
7 165.03
8 196.50
9 97.36
10 35.28 2.32 (1H, m)
11 33.01 1.52 (1H, m)2.16 (1H, m)
12 73.92 3.39 (1H, m)
13 73.09 3.68 (1H, dd, J=10.0, 5.0 Hz)
14 75.06 3.42 (1H, m)
15 35.79 1.35 (1H, m)1.56 (1H, m)
16 26.67 1.66 (1H, m)
17 49.02 1.80 (1H, m)2.17 (1H, m)
18 138.99
19 123.33 5.01 (1H, d, J=5.0 Hz)
20 53.34 3.28 (1H, d, J=5.0 Hz)
21 213.69
22 43.64 2.10 (1H, br d, J=15 Hz)2.77 (1H, br d, J=15 Hz)
23 70.22 3.92 (1H, m)
24 39.97 1.89 (1H, m)
25 77.80 5.33 (1H, br s)
26 132.47
27 130.07 5.09 (1H, d, J=5.0 Hz)
28 34.93 2.18 (1H, m)
29 39.36 1.14 (1H, m)1.91 (1H, m)
30 75.64 3.57 (1H, m)
31 75.50 3.36 (1H, m)
32 32.36 1.35 (1H, m)1.98 (1H, m)
33 31.23 1.06 (1H, m)1.61 (1H, m)
34 24.78 1.45 (1H, m)1.72 (1H, m)
35 11.91 0.86 (3H, t, J=7.5 Hz)
36 16.41 0.99(3H, d, J=5 Hz)
37 20.66 0.93 (3H, d, J=5 Hz)
38 16.02 1.59 (3H, s)
39 9.71 0.90 (3H, d, J=5 Hz)
40 14.20 1.62 (3H, s)
41 56.55 3.38 (3H, s)
분자량 800.4563으로 확인된 6번 화합물은 분자량 800.4924 및 800.4927 매우 유사한 분자량을 보였으나, 1H, 13C-NMR 및 gHSQC 데이터로부터, 탄소수가 총 42개로, 메톡시기가 적은 것이 탄소 1개의 차이임을 확인할 수 있었고, ketone 탄소 (δC 196.50) 관측되었다. 2D-NMR 데이터를 종합한 결과, 31-O-demethyl-FK520으로 구조결정되었다.
실시예 7: 9-deoxo-31- O -demethyl-FK520 제조
FK506을 생산하는 균주인 스트렙토마이세스 카나마이세티쿠스에 대하여 Ban, Y. H. 외 (J. Nat. Prod. 2013, 76, 1091-1098)에 기재된 방법에 따라 이중교차 상동 재조합 (Double cross-over homologous recombination)에 의한 인-프래임 (In-frame) 결실 방법을 사용하여 fkbD-fkbM 및 tcsB 유전자 또는 fkbD-fkbM 및 tcsD 유전자의 비활성화를 초래하여 9-deoxo-31-O-demethyl-FK520의 생산균주인 스트렙토마이세스 카나마이세티쿠스 ΔfkbD-fkbM,tcsB (수탁번호 KCTC13582BP) 또는 스트렙토마이세스 카나마이세티쿠스 ΔfkbD-fkbM,tcsD (수탁번호 KCTC13585BP)를 제작하였다.
구체적으로 설명하면, FK506을 생산하는 스트렙토마이세스 카나마이세티쿠스 균주에서 fkbD-fkbM 및 tcsB 유전자의 결손 또는 fkbD-fkbM 및 tcsD 유전자의 결손 돌연변이체를 제작하기 위하여 각각의 유전자를 pKC1139 벡터에 클로닝하여 Escherichia coli ET12567/pUZ8002로 옮긴 후, 접합 (Conjugation)을 통해 FK506 생산균주 스트렙토마이세스 카나마이세티쿠스로 형질 전환하였다.
균주제작 방법은 보다 구체적으로 인-프래임 (In-frame) 유전자 결실 플라스미드 (Plasmids)의 제작, 유전자 결실 균주 제작으로 설명할 수 있다.
인-프래임 (In-frame) 유전자 결실 플라스미드 (Plasmids)의 제작은 대장균-방선균 셔틀 (E. coli-Streptomyces shuttle) 벡터 pKC1139를 인-프래임 유전자 결실을 위해서 사용하였다. 플라스미드 (Plasmid) 제작은 스트렙토마이세스 카나마이세티쿠스로부터 유래된 포스미드 (Fosmid) DNA로부터 삭제를 위한 표적 유전자의 왼쪽- 및 오른쪽-인접 절편 (Left- and right-flanking fragments)의 PCR 증폭에 의해 실시하였다. fkbD-fkbM 유전자의 결실을 위해서는 왼쪽-인접 절편의 프라이머 쌍 FkbD-MLF/FkbD-MLR, 오른쪽-인접 절편의 프라이머 쌍 FkbD-MRF/FkbD-MRR을 설계하였다. tcsB 유전자의 결실을 위해서는 왼쪽-인접 절편의 프라이머 쌍 TcsBLF/TcsBLR, 오른쪽-인접 절편의 프라이머 쌍 TcsBRF/TcsBRR을 설계하였고, tcsD 유전자의 결실을 위해서는 왼쪽-인접 절편의 프라이머 쌍 TcsDLF/TcsDLR, 오른쪽-인접 절편의 프라이머 쌍 TcsDRF/TcsDRR을 설계하였다. PCR 절편 모두는 분리하여 HindIII-XbaI 또는 XbaI-EcoRI으로 절단한 후에 pKC1139 벡터에 클로닝 하였다. 본 실시예에서 사용된 균주, 플라스미드 및 프라이머에 대한 정보는 표 1과 표 2에 제시하였다.
유전자 결실 균주 제작을 위해 사용한 플라스미드는 표 1에 요약하였다. C9 수산화효소 (Hydroxylase)와 31-Ｏ-메틸변환효소를 함께 제거하기 위한 플라스미드, p△fkbD-fkbM는 대장균 ET12567/pUZ8002에 옮긴 후 접합에 의해 스트렙토마이세스 카나마이세티쿠스 내로 도입하여 표적 유전자를 상동 재조합으로 결실시켰다. 결실 플라스미드와 스트렙토마이세스 카나마이세티쿠스 염색체 사이에서 단일 교차가 일어난 균주는 아프라마이신 (Apramycin)이 있는 37℃ (pSG5-기본으로 하는 복제단위 (Replicon)를 위한 비-증식 허용온도)에서 아프라마이신-저항성이 있는 피전달접합균주 (Transconjugant)의 배양으로 선택하였다. 이후 확보된 콜로니는 28℃에서 선택 없이 3회 증식을 수행하여 두 번째 교차를 허용하였다. 2개의 달성된 이중 교차 돌연변이, 즉 ΔfkbD-fkbM을 아프라마이신-민감성의 발현형질로 선택하였고, 그 후에 PCR로 확인하였고, 선택적으로 서던 블록 분석으로 확인하였다.
제작한 fkbD-fkbM 유전자가 결손된 스트렙토마이세스 카나마이세티쿠스 ΔfkbD-fkbM에 p△tcsB 또는 p△tcsD를 도입하여 fkbD-fkbM 유전자 결손 방법과 동일한 방법을 이용하여 tcsB 유전자 또는 tcsD 유전자를 결실시켰다. ΔfkbD-fkbM,tcsB 또는 ΔfkbD-fkbM,tcsD는 아프라마이신-민감성의 발현형질로 선택하였고, 그 후에 PCR로 확인하였고, 선택적으로 서던 블록 분석으로 확인하였다.
제작한 fkbD-fkbM 및 tcsB 유전자 결손 균주인 스트렙토마이세스 카나마이세티쿠스 ΔfkbD-fkbM,tcsB는 한국생명공학연구원 생물자원센터 (Korean Collection for Type Cultures, KCTC)에 2018년 7월 17일자로 기탁하였고 (수탁번호 KCTC13582BP), fkbD-fkbM 및 tcsD 유전자 결손 균주인 스트렙토마이세스 카나마이세티쿠스 ΔfkbD-fkbM,tcsD도 한국생명공학연구원 생물자원센터 (Korean Collection for Type Cultures, KCTC)에 2018년 7월 17일자로 기탁하였다 (수탁번호 KCTC13585BP).
상기 제작한 생산균주 스트렙토마이세스 카나마이세티쿠스 ΔfkbD-fkbM,tcsB (수탁번호 KCTC13582BP) 또는 스트렙토마이세스 카나마이세티쿠스 ΔfkbD-fkbM,tcsD (수탁번호 KCTC13585BP)의 배양을 통하여 9-deoxo-31-O-demethyl-FK520을 제조하였다. 구체적으로 설명하면 다음과 같다. 250 ml의 베플 삼각 플라스크 (Baffled flask)에 50 ml의 R2YE 배지 (수크로오즈 103 g/L, 글루코오즈 10 g/L, 황산칼륨 0.25 g/L, 염화마그네슘 6수화물 10.12 g/L, 카사미노 엑시드 0.1 g/L, 효모 추출물 (10%) 50 ml/L, TES buffer (5.73%, pH 7.2) 100 ml/L, 인산칼륨 (0.5%) 10 ml/L, 염화칼슘 2수화물 (3.68%) 80 ml/L, L-프롤린 (20%) 15 ml/L, 미량 원소 용액 2 ml/L, 수산화나트륨 (1 N) 5 ml/L)를 첨가하고, 여기에 생산균주를 접종한 다음에 회전식 진탕 배양기에서 28℃, 180 rpm 조건에서 이틀 동안 전배양을 실시하였다. 그 다음에 1 L의 R2YE 배지가 첨가되어 있는 3 L 삼각 플라스크 (Erlenmeyer flask)에 이틀 동안 전배양한 배양액 10 ml를 접종하였다. 접종 후에 28℃, 180 rpm 조건에서 6일 동안 배양을 실시하였다. 6일간 배양 후에 1차 회수 공정을 통해 생산된 9-deoxo-31-O-demethyl-FK520을 추출하였다.
1차 회수 공정은 다음과 같이 실시하였다. 먼저, 배양액에 동량의 메탄올을 첨가하여 30분 동안 혼합해 준 후 원심분리하여 균체를 제거하였고, 균체를 제거한 추출액에 대해서는 회전 증발기 (Rotary evaporator)를 이용한 농축을 실시해 주었다. 그 다음에 농축한 추출액을 물에 용해시키고, 2배 용량의 에틸아세테이트 (Ethyl acetate)를 첨가 후 잘 혼합해 준 다음 층 분리가 될 때까지 방치하였다. 층이 분리된 다음에 위층의 유기용매층을 회수하고 이를 회전 증발기를 이용하여 농축시키고 농축 후의 무게를 측정하였다. 1차 회수 공정을 실시하여 얻어 진 추출액을 실리카겔이 충진된 칼럼을 통과시켜 주었다. 이때 실리카겔의 양은 1차 회수 공정의 추출액 무게의 15배를 사용하였으며, 이동상은 5가지 비율의 메탄올과 메틸렌클로라이드 (분액 1. 0:100, 분액 2. 1:100, 분액 3. 1:10, 분액 4. 1:1, 분액 5. 100:0)를 사용하였다. 분액 3에서 9-deoxo-31-O-demethyl-FK520이 확인되었다. 이렇게 얻어진 분액 3은 회전 증발기를 이용하여 농축하고 HPLC를 이용하여 최종적으로 정제하였다.
이를 동결건조시켜 분말형태의 [화학식 7]로 표시되는 물질인 9-deoxo-31-O-demethyl-FK520을 얻을 수 있었다.
제조한 9-deoxo-31-O-demethyl-FK520의 확인은 다음과 같이 실시하였다. 구체적으로, 고성능액체크로마토그래피 분석 (High performance liquid chromatography analysis), 질량분석 (Mass spectrometry), 핵자기공명 분석 (Nuclear magnetic resonance analysis)을 실시하였다. 9-deoxo-31-O-demethyl-FK520에 대한 분석 결과는 표 9와 도 37 내지 도 42로 정리되며, 이러한 결과들로부터 제작한 생산균주 스트렙토마이세스 카나마이세티쿠스 ΔfkbD-fkbM,tcsB 또는 스트렙토마이세스 카나마이세티쿠스 ΔfkbD-fkbM,tcsD로부터 9-deoxo-31-O-demethyl-FK520이 생산됨을 확인할 수 있었다.
9-deoxo-31-O-demethyl-FK520 (분자식 C42H69NO11, 분자량 764.01)에 대한 분석 결과를 하기의 표 9에 나타내었다.
분석법 분석결과
고성능액체크로마토그래피 분석 HPLC의 이동상은 45-55% 아세토니트릴수용액을 사용하였고 유량은 1 ml/min이었고 205 nm의 UV 검출기로 분석하였다. 이때의 9-deoxo-31-O-demethyl-FK520의 머무름 시간 (Retention time)은 24분이었다.
질량분석 (ESI-HR-MS) Calcd. for C42H69NNaO11 +:786.4763, found: m/z 786.4769
핵자기공명 분석 번호 carbon (ppm) proton (ppm)
1 169.65
2 52.86 4.87 (1H, brd, J=5.0 Hz)
3 26.86 1.70 (1H, m)2.23 (1H, m)
4 20.95 1.32 (1H, m)1.72 (1H, m)
5 24.69 1.52 (1H, m)1.68 (1H, m)
6 42.97 3.19 (1H, m)3.70 (1H, m)
7 174.27
8 37.54 2.49 (1H, d, J=15.0 Hz)2.67 (1H, d, J=15.0 Hz)
9 98.76
10 38.78 1.56 (1H, m)
11 32.86 1.60 (1H, m)1.94 (1H, m)
12 74.61 3.41 (1H, m)
13 70.92 3.86 (1H, dd, J=10.0, 5.0 Hz)
14 77.21 3.53 (1H, m)
15 36.57 1.34 (1H, m)1.47 (1H, m)
16 25.93 1.63 (1H, m)
17 48.49 1.64 (1H, m)2.33 (1H, m)
18 141.30
19 122.26 5.05 (1H, d, J=5.0 Hz)
20 55.66 3.20 (1H, d, J=5.0 Hz)
21 215.35
22 42.20 2.20 (1H, br d, J=15 Hz)2.64 (1H, br d, J=15 Hz)
23 69.82 3.98 (1H, m)
24 40.05 1.85 (1H, m)
25 76.90 5.20 (1H, br s)
26 132.76
27 128.90 4.97 (1H, d, J=5.0 Hz)
28 35.29 2.32 (1H, m)
29 39.45 1.12 (1H, m)1.88 (1H, m)
30 75.22 3.53 (1H, m)
31 75.22 3.40 (1H, m)
32 32.32 1.33 (1H, m)1.95 (1H, m)
33 31.19 1.04 (1H, m)1.59 (1H, m)
34 25.13 1.52 (1H, m)1.68 (1H, m)
35 12.00 0.88 (3H, t, J=7.5 Hz)
36 17.14 0.95 (3H, d, J=5 Hz)
37 19.09 0.77 (3H, d, J=5 Hz)
38 15.77 1.65 (3H, s)
39 9.98 0.86 (3H, d, J=5 Hz)
40 14.68 1.67 (3H, s)
41 56.37 3.38 (3H, s)
1H, 13C-NMR 및 gHSQC 데이터로부터, 탄소수가 총 42개로 31-O-demethyl-FK520와 유사한 결과를 보였으나, ΔfkbD-fkbM 유전자로부터 만들어진 CH2 작용기 (δH 2.67, 2.49, δC 37.54)가 관측되었다. 7번 화합물은 2D-NMR 데이터를 종합한 결과, 9-deoxo-31-O-demethyl-FK520으로 구조결정되었다.
실시예 8: 9-deoxo-FK523 제조
FK506을 생산하는 균주인 스트렙토마이세스 카나마이세티쿠스에 대하여 Ban, Y. H. 외 (J. Nat. Prod. 2013, 76, 1091-1098)에 기재된 방법에 따라 이중교차 상동 재조합 (Double cross-over homologous recombination)에 의한 인-프래임 (In-frame) 결실 방법을 사용하여 fkbD 및 tcsB 유전자 의 비활성화를 초래하여 9-deoxo-FK523의 생산균주인 스트렙토마이세스 카나마이세티쿠스 ΔfkbD,tcsB (수탁번호 KCTC13579BP)를 제작하였다.
구체적으로 설명하면, FK506을 생산하는 스트렙토마이세스 카나마이세티쿠스 균주에서 fkbD 및 tcsB 유전자의 결손 돌연변이체를 제작하기 위하여 각각의 유전자를 pKC1139 벡터에 클로닝하여 Escherichia coli ET12567/pUZ8002로 옮긴 후, 접합 (Conjugation)을 통해 FK506 생산균주 스트렙토마이세스 카나마이세티쿠스로 형질 전환하였다.
균주제작 방법은 보다 구체적으로 인-프래임 (In-frame) 유전자 결실 플라스미드 (Plasmids)의 제작, 유전자 결실 균주 제작으로 설명할 수 있다.
인-프래임 (In-frame) 유전자 결실 플라스미드 (Plasmids)의 제작은 대장균-방선균 셔틀 (E. coli-Streptomyces shuttle) 벡터 pKC1139를 인-프래임 유전자 결실을 위해서 사용하였다. 플라스미드 (Plasmid) 제작은 스트렙토마이세스 카나마이세티쿠스로부터 유래된 포스미드 (Fosmid) DNA로부터 삭제를 위한 표적 유전자의 왼쪽- 및 오른쪽-인접 절편 (Left- and right-flanking fragments)의 PCR 증폭에 의해 실시하였다. fkbD 유전자의 결실을 위해서는 왼쪽-인접 절편의 프라이머 쌍 FkbDLF/FkbDLR, 오른쪽-인접 절편의 프라이머 쌍 FkbDRF/FkbDRR을 설계하였고, tcsB 유전자의 결실을 위해서는 왼쪽-인접 절편의 프라이머 쌍 TcsBLF/TcsBLR, 오른쪽-인접 절편의 프라이머 쌍 TcsBRF/TcsBRR을 설계하였다. PCR 절편 모두는 분리하여 HindIII-XbaI 또는 XbaI-EcoRI으로 절단한 후에 pKC1139 벡터에 클로닝 하였다. 본 실시예에서 사용된 균주, 플라스미드 및 프라이머에 대한 정보는 표 1과 표 2에 제시하였다.
유전자 결실 균주 제작을 위해 사용한 플라스미드는 표 1에 요약하였다. C9 수산화효소 (Hydroxylase)를 제거하기 위한 플라스미드, p△fkbD는 대장균 ET12567/pUZ8002에 옮긴 후 접합에 의해 스트렙토마이세스 카나마이세티쿠스 내로 도입하여 표적 유전자를 상동 재조합으로 결실시켰다. 결실 플라스미드와 스트렙토마이세스 카나마이세티쿠스 염색체 사이에서 단일 교차가 일어난 균주는 아프라마이신 (Apramycin)이 있는 37℃ (pSG5-기본으로 하는 복제단위 (Replicon)를 위한 비-증식 허용온도)에서 아프라마이신-저항성이 있는 피전달접합균주 (Transconjugant)의 배양으로 선택하였다. 이후 확보된 콜로니는 28℃에서 선택 없이 3회 증식을 수행하여 두 번째 교차를 허용하였다. 2개의 달성된 이중 교차 돌연변이, 즉 ΔfkbD를 아프라마이신-민감성의 발현형질로 선택하였고, 그 후에 PCR로 확인하였고, 선택적으로 서던 블록 분석으로 확인하였다.
제작한 fkbD 유전자가 결손된 스트렙토마이세스 카나마이세티쿠스 ΔfkbD에 p△tcsB를 도입하여 fkbD 유전자 결손 방법과 동일한 방법을 이용하여 tcsB 유전자를 결실시켰다. ΔfkbD,tcsB는 아프라마이신-민감성의 발현형질로 선택하였고, 그 후에 PCR로 확인하였고, 선택적으로 서던 블록 분석으로 확인하였다.
제작한 fkbD, tcsB 유전자 결손 균주인 스트렙토마이세스 카나마이세티쿠스 ΔfkbD,tcsB는 한국생명공학연구원 생물자원센터 (Korean Collection for Type Cultures, KCTC)에 2018년 7월 17일자로 기탁하였다 (수탁번호 KCTC13579BP).
상기 제작한 생산균주 스트렙토마이세스 카나마이세티쿠스 ΔfkbD,tcsB (수탁번호 KCTC13579BP)의 배양을 통하여 9-deoxo-FK523을 제조하였다. 구체적으로 설명하면 다음과 같다. 250 ml의 베플 삼각 플라스크 (Baffled flask)에 50 ml의 R2YE 배지 (수크로오즈 103 g/L, 글루코오즈 10 g/L, 황산칼륨 0.25 g/L, 염화마그네슘 6수화물 10.12 g/L, 카사미노 엑시드 0.1 g/L, 효모 추출물 (10%) 50 ml/L, TES buffer (5.73%, pH 7.2) 100 ml/L, 인산칼륨 (0.5%) 10 ml/L, 염화칼슘 2수화물 (3.68%) 80 ml/L, L-프롤린 (20%) 15 ml/L, 미량 원소 용액 2 ml/L, 수산화나트륨 (1 N) 5 ml/L)를 첨가하고, 여기에 생산균주를 접종한 다음에 회전식 진탕 배양기에서 28℃, 180 rpm 조건에서 이틀 동안 전배양을 실시하였다. 그 다음에 1 L의 R2YE 배지가 첨가되어 있는 3 L 삼각 플라스크 (Erlenmeyer flask)에 이틀 동안 전배양한 배양액 10 ml를 접종하였다. 접종 후에 28℃, 180 rpm 조건에서 6일 동안 배양을 실시하였다. 6일간 배양 후에 1차 회수 공정을 통해 생산된 9-deoxo-FK523을 추출하였다.
1차 회수 공정은 다음과 같이 실시하였다. 먼저, 배양액에 동량의 메탄올을 첨가하여 30분 동안 혼합해 준 후 원심분리하여 균체를 제거하였고, 균체를 제거한 추출액에 대해서는 회전 증발기 (Rotary evaporator)를 이용한 농축을 실시해 주었다. 그 다음에 농축한 추출액을 물에 용해시키고, 2배 용량의 에틸아세테이트 (Ethyl acetate)를 첨가 후 잘 혼합해 준 다음 층 분리가 될 때까지 방치하였다. 층이 분리된 다음에 위층의 유기용매층을 회수하고 이를 회전 증발기를 이용하여 농축시키고 농축 후의 무게를 측정하였다. 1차 회수 공정을 실시하여 얻어 진 추출액을 실리카겔이 충진된 칼럼을 통과시켜 주었다. 이때 실리카겔의 양은 1차 회수 공정의 추출액 무게의 15배를 사용하였으며, 이동상은 5가지 비율의 메탄올과 메틸렌클로라이드 (분액 1. 0:100, 분액 2. 1:100, 분액 3. 1:10, 분액 4. 1:1, 분액 5. 100:0)를 사용하였다. 분액 3에서 9-deoxo-FK523이 확인되었다. 이렇게 얻어진 분액 3은 회전 증발기를 이용하여 농축하고 HPLC를 이용하여 최종적으로 정제하였다.
이를 동결건조시켜 분말형태의 [화학식 8]로 표시되는 물질인 9-deoxo-FK523을 얻을 수 있었다.
제조한 9-deoxo-FK523의 확인은 다음과 같이 실시하였다. 구체적으로, 고성능액체크로마토그래피 분석 (High performance liquid chromatography analysis), 질량분석 (Mass spectrometry), 핵자기공명 분석 (Nuclear magnetic resonance analysis)을 실시하였다. 9-deoxo-FK523에 대한 분석 결과는 표 10과 도 43 내지 도 48로 정리되며, 이러한 결과들로부터 제작한 생산균주 스트렙토마이세스 카나마이세티쿠스 ΔfkbD,tcsB로부터 9-deoxo-FK523이 생산됨을 확인할 수 있었다.
9-deoxo-FK523 (분자식 C42H69NO11, 분자량 764.01)에 대한 분석 결과를 하기의 표 10에 나타내었다.
분석법 분석결과
고성능액체크로마토그래피 분석 HPLC의 이동상은 45-55% 아세토니트릴수용액을 사용하였고 유량은 1 ml/min이었고 205 nm의 UV 검출기로 분석하였다. 이때의 9-deoxo-FK523의 머무름 시간 (Retention time)은 24분이었다.
질량분석 (ESI-HR-MS) Calcd. for C42H69NNaO11 +:786.4763, found: m/z 786.4769
핵자기공명 분석 번호 carbon (ppm) proton (ppm)
1 169.61
2 52.59 4.85 (1H, brd, J=5.0 Hz)
3 26.87 1.70 (1H, m)2.24 (1H, m)
4 20.70 1.31 (1H, m)1.72 (1H, m)
5 24.42 1.51 (1H, m)1.68 (1H, m)
6 42.65 3.19 (1H, m)3.69 (1H, m)
7 174.23
8 36.25 2.51 (1H, d, J=15.0 Hz)2.70 (1H, d, J=15.0 Hz)
9 98.70
10 38.72 1.58 (1H, m)
11 32.84 1.60 (1H, m)1.94 (1H, m)
12 74.60 3.40 (1H, m)
13 70.90 3.86 (1H, dd, J=10.0, 5.0 Hz)
14 77.11 3.53 (1H, m)
15 36.48 1.34 (1H, m)1.47 (1H, m)
16 26.30 1.50 (1H, m)
17 48.49 1.65 (1H, m)
2.32 (1H, m)
18 140.43
19 123.48 5.17 (1H, d, J=5.0 Hz)
20 53.45 3.21 (1H, d, J=5.0 Hz)
21 215.35
22 41.74 2.21 (1H, br d, J=15 Hz)2.66 (1H, br d, J=15 Hz)
23 69.99 4.01 (1H, m)
24 40.68 1.90 (1H, m)
25 76.62 5.22 (1H, br s)
26 132.71
27 128.92 4.98 (1H, d, J=5.0 Hz)
28 35.13 2.35 (1H, m)
29 35.13 0.93 (1H, m)2.01 (1H,m)
30 84.43 3.00 (1H, m)
31 73.80 3.39 (1H, m)
32 32.87 1.34 (1H, m)1.98 (1H, m)
33 31.44 1.06 (1H, m)1.61 (1H,m)
34 17.13 1.18 (3H, d, J=5 Hz)
35 17.13 0.96 (3H, d, J=5 Hz)
36 18.87 0.78 (3H, d, J=5 Hz)
37 16.08 1.63 (3H, s)
38 10.12 0.90 (3H, d, J=5 Hz)
39 14.79 1.66 (3H, s)
40 56.38 3.37 (3H, s)
41 57.90 3.37 (3H, s)
9-deoxo-31-O-demethyl-FK520 분자량과 동일한 분자량을 갖고 있으며, 1H, 13C-NMR 및 gHSQC 데이터로부터, 탄소수가 총 42개로 매우 유사한 형태로 확인되었으나, 9-deoxo-31-O-demethyl-FK520과 달리 메톡시 (δH 3.41, δC 56.81)가 추가 관측되었고, CH2 작용기가 한 개가 덜 관측되는 구조 이성질체임을 확인할 수 있었다. gCOSY로부터 proton의 연결을 확인한 결과, H-2~H-5사이의 coupling으로부터 본 화합물은 pipecolyl 골격이 확인되었고, gHMBC로부터 doublet coupling으로 관측되는 메틸기(δH 1.18, δC 17.13)가 C-21 (δH 3.21, δC 53.45) 사이에 상호 correlation이 이뤄지는 것으로부터, FK523 형태를 이루는 methyl가 C-21에 존재함을 확인하였다. 이로부터 9-deoxo-FK523으로 구조결정하였다.
실시예 9: 9-deoxo-31- O -demethyl-FK523 제조
FK506을 생산하는 균주인 스트렙토마이세스 카나마이세티쿠스에 대하여 Ban, Y. H. 외 (J. Nat. Prod. 2013, 76, 1091-1098)에 기재된 방법에 따라 이중교차 상동 재조합 (Double cross-over homologous recombination)에 의한 인-프래임 (In-frame) 결실 방법을 사용하여 fkbD-fkbM 및 tcsB 유전자의 비활성화를 초래하여 9-deoxo-31-O-demethyl-FK523의 생산균주인 스트렙토마이세스 카나마이세티쿠스 ΔfkbD-fkbM,tcsB (수탁번호 KCTC13582BP)를 제작하였다.
구체적으로 설명하면, FK506을 생산하는 스트렙토마이세스 카나마이세티쿠스 균주에서 fkbD-fkbM 및 tcsB 유전자의 결손 돌연변이체를 제작하기 위하여 각각의 유전자를 pKC1139 벡터에 클로닝하여 Escherichia coli ET12567/pUZ8002로 옮긴 후, 접합 (Conjugation)을 통해 FK506 생산균주 스트렙토마이세스 카나마이세티쿠스로 형질 전환하였다.
균주제작 방법은 보다 구체적으로 인-프래임 (In-frame) 유전자 결실 플라스미드 (Plasmids)의 제작, 유전자 결실 균주 제작으로 설명할 수 있다.
인-프래임 (In-frame) 유전자 결실 플라스미드 (Plasmids)의 제작은 대장균-방선균 셔틀 (E. coli-Streptomyces shuttle) 벡터 pKC1139를 인-프래임 유전자 결실을 위해서 사용하였다. 플라스미드 (Plasmid) 제작은 스트렙토마이세스 카나마이세티쿠스로부터 유래된 포스미드 (Fosmid) DNA로부터 삭제를 위한 표적 유전자의 왼쪽- 및 오른쪽-인접 절편 (Left- and right-flanking fragments)의 PCR 증폭에 의해 실시하였다. fkbD-fkbM 유전자의 결실을 위해서는 왼쪽-인접 절편의 프라이머 쌍 FkbD-MLF/FkbD-MLR, 오른쪽-인접 절편의 프라이머 쌍 FkbD-MRF/FkbD-MRR을 설계하였다. tcsB 유전자의 결실을 위해서는 왼쪽-인접 절편의 프라이머 쌍 TcsBLF/TcsBLR, 오른쪽-인접 절편의 프라이머 쌍 TcsBRF/TcsBRR을 설계하였다. PCR 절편 모두는 분리하여 HindIII-XbaI 또는 XbaI-EcoRI으로 절단한 후에 pKC1139 벡터에 클로닝 하였다. 본 실시예에서 사용된 균주, 플라스미드 및 프라이머에 대한 정보는 표 1과 표 2에 제시하였다.
유전자 결실 균주 제작을 위해 사용한 플라스미드는 표 1에 요약하였다. C9 수산화효소 (Hydroxylase)와 31-Ｏ-메틸변환효소를 함께 제거하기 위한 플라스미드, p△fkbD-fkbM은 대장균 ET12567/pUZ8002에 옮긴 후 접합에 의해 스트렙토마이세스 카나마이세티쿠스 내로 도입하여 표적 유전자를 상동 재조합으로 결실시켰다. 결실 플라스미드와 스트렙토마이세스 카나마이세티쿠스 염색체 사이에서 단일 교차가 일어난 균주는 아프라마이신 (Apramycin)이 있는 37℃ (pSG5-기본으로 하는 복제단위 (Replicon)를 위한 비-증식 허용온도)에서 아프라마이신-저항성이 있는 피전달접합균주 (Transconjugant)의 배양으로 선택하였다. 이후 확보된 콜로니는 28℃에서 선택 없이 3회 증식을 수행하여 두 번째 교차를 허용하였다. 2개의 달성된 이중 교차 돌연변이, 즉 ΔfkbD-fkbM을 아프라마이신-민감성의 발현형질로 선택하였고, 그 후에 PCR로 확인하였고, 선택적으로 서던 블록 분석으로 확인하였다.
제작한 fkbD-fkbM 유전자가 결손된 스트렙토마이세스 카나마이세티쿠스 ΔfkbD-fkbM에 p△tcsB를 도입하여 fkbD-fkbM 유전자 결손 방법과 동일한 방법을 이용하여 tcsB 유전자를 결실시켰다. ΔfkbD-fkbM,tcsB는 아프라마이신-민감성의 발현형질로 선택하였고, 그 후에 PCR로 확인하였고, 선택적으로 서던 블록 분석으로 확인하였다.
제작한 fkbD-fkbM 및 tcsB 유전자 결손 균주인 스트렙토마이세스 카나마이세티쿠스 ΔfkbD-fkbM,tcsB는 한국생명공학연구원 생물자원센터 (Korean Collection for Type Cultures, KCTC)에 2018년 7월 17일자로 기탁하였다 (수탁번호 KCTC13582BP).
상기 제작한 생산균주 스트렙토마이세스 카나마이세티쿠스 ΔfkbD-fkbM,tcsB (수탁번호 KCTC13582BP)의 배양을 통하여 9-deoxo-31-O-demethyl-FK523을 제조하였다. 구체적으로 설명하면 다음과 같다. 250 ml의 베플 삼각 플라스크 (Baffled flask)에 50 ml의 R2YE 배지 (수크로오즈 103 g/L, 글루코오즈 10 g/L, 황산칼륨 0.25 g/L, 염화마그네슘 6수화물 10.12 g/L, 카사미노 엑시드 0.1 g/L, 효모 추출물 (10%) 50 ml/L, TES buffer (5.73%, pH 7.2) 100 ml/L, 인산칼륨 (0.5%) 10 ml/L, 염화칼슘 2수화물 (3.68%) 80 ml/L, L-프롤린 (20%) 15 ml/L, 미량 원소 용액 2 ml/L, 수산화나트륨 (1 N) 5 ml/L)를 첨가하고, 여기에 생산균주를 접종한 다음에 회전식 진탕 배양기에서 28℃, 180 rpm 조건에서 이틀 동안 전배양을 실시하였다. 그 다음에 1 L의 R2YE 배지가 첨가되어 있는 3 L 삼각 플라스크 (Erlenmeyer flask)에 이틀 동안 전배양한 배양액 10 ml를 접종하였다. 접종 후에 28℃, 180 rpm 조건에서 6일 동안 배양을 실시하였다. 6일간 배양 후에 1차 회수 공정을 통해 생산된 9-deoxo-31-O-demethyl-FK523을 추출하였다.
1차 회수 공정은 다음과 같이 실시하였다. 먼저, 배양액에 동량의 메탄올을 첨가하여 30분 동안 혼합해 준 후 원심분리하여 균체를 제거하였고, 균체를 제거한 추출액에 대해서는 회전 증발기 (Rotary evaporator)를 이용한 농축을 실시해 주었다. 그 다음에 농축한 추출액을 물에 용해시키고, 2배 용량의 에틸아세테이트 (Ethyl acetate)를 첨가 후 잘 혼합해 준 다음 층 분리가 될 때까지 방치하였다. 층이 분리된 다음에 위층의 유기용매층을 회수하고 이를 회전 증발기를 이용하여 농축시키고 농축 후의 무게를 측정하였다. 1차 회수 공정을 실시하여 얻어 진 추출액을 실리카겔이 충진된 칼럼을 통과시켜 주었다. 이때 실리카겔의 양은 1차 회수 공정의 추출액 무게의 15배를 사용하였으며, 이동상은 5가지 비율의 메탄올과 메틸렌클로라이드 (분액 1. 0:100, 분액 2. 1:100, 분액 3. 1:10, 분액 4. 1:1, 분액 5. 100:0)를 사용하였다. 분액 3에서 9-deoxo-31-O-demethyl-FK523이 확인되었다. 이렇게 얻어진 분액 3은 회전 증발기를 이용하여 농축하고 HPLC를 이용하여 최종적으로 정제하였다.
이를 동결건조시켜 분말형태의 [화학식 9]로 표시되는 물질인 9-deoxo-31-O-demethyl-FK523을 얻을 수 있었다.
제조한 9-deoxo-31-O-demethyl-FK523의 확인은 다음과 같이 실시하였다. 구체적으로, 고성능액체크로마토그래피 분석 (High performance liquid chromatography analysis), 질량분석 (Mass spectrometry), 핵자기공명 분석 (Nuclear magnetic resonance analysis)을 실시하였다. 9-deoxo-31-O-demethyl-FK523에 대한 분석 결과는 표 11과 도 49 내지 도 54로 정리되며, 이러한 결과들로부터 제작한 생산균주 스트렙토마이세스 카나마이세티쿠스 ΔfkbD-fkbM,tcsB로부터 9-deoxo-31-O-demethyl-FK523이 생산됨을 확인할 수 있었다.
9-deoxo-31-O-demethyl-FK523 (분자식 C41H67NO11, 분자량 752.01)에 대한 분석 결과를 하기의 표 11에 나타내었다.
분석법 분석결과
고성능액체크로마토그래피 분석 HPLC의 이동상은 45-55% 아세토니트릴수용액을 사용하였고 유량은 1 ml/min이었고 205 nm의 UV 검출기로 분석하였다. 이때의 9-deoxo-31-O-demethyl-FK523의 머무름 시간 (Retention time)은 17분이었다.
질량분석 (ESI-HR-MS) Calcd. for C41H67NNaO11 +:772.4606, found: m/z 772.4612
핵자기공명 분석 번호 carbon (ppm) proton (ppm)
1 169.63
2 52.83 4.90 (1H, brd, J=5.0 Hz)
3 26.88 1.70 (1H, m)2.24(1H,m)
4 20.70 1.31 (1H, m)1.72(1H,m)
5 24.70 1.51 (1H, m)1.68(1H,m)
6 42.89 3.21 (1H, m)3.72(1H,m)
7 174.26
8 36.25 2.51 (1H, d, J=15.0 Hz)2.70(1H,d,J=15.0 Hz)
9 98.70
10 38.72 1.58 (1H, m)
11 32.86 1.60 (1H, m)1.94(1H,m)
12 74.59 3.40 (1H, m)
13 70.90 3.86 (1H, dd, J=10.0, 5.0 Hz)
14 77.11 3.53 (1H, m)
15 36.48 1.34 (1H, m)1.47(1H,m)
16 26.30 1.50 (1H, m)
17 48.37 1.65 (1H, m)2.32(1H,m)
18 140.38
19 123.50 5.17 (1H, d, J=5.0 Hz)
20 48.04 3.21 (1H, d, J=5.0 Hz)
21 215.35
22 41.79 2.21 (1H, br d, J=15 Hz)2.66(1H,brd,J=15 Hz)
23 69.99 4.01 (1H, m)
24 40.60 1.90 (1H, m)
25 76.70 5.22 (1H, br s)
26 132.80
27 128.83 4.98 (1H, d, J=5.0 Hz)
28 35.21 2.35 (1H, m)
29 39.38 1.17 (1H, m)1.91(1H,m)
30 75.71 3.43 (1H, m)
31 75.17 3.36 (1H, m)
32 32.24 1.34 (1H, m)1.98(1H,m)
33 31.20 1.06 (1H, m)1.61(1H,m)
34 17.09 1.18 (3H, d, J=5 Hz)
35 17.13 0.96 (3H, d, J=5 Hz)
36 18.86 0.78 (3H, d, J=5 Hz)
37 16.09 1.66 (3H, s)
38 10.08 0.88 (3H, d, J=5 Hz)
39 14.73 1.67 (3H, s)
40 56.38 3.37 (3H, s)
41 57.90 3.37 (3H, s)
1H, 13C-NMR 및 gHSQC 데이터로부터, 탄소수가 총 41개로 9-deoxo-FK523와 달리, 메톡시 1개가 부족함을 알 수 있었다. 이와 함께, ΔfkbD-fkbM 유전자로부터 만들어진 CH2 작용기 (δH 2.70, 2.51, δC 36.25)가 관측되었다. 2D-NMR 데이터를 종합한 결과, 9-deoxo-31-O-demethyl-FK523으로 구조결정되었다.
실시예 10: 9종 신규 화합물의 면역억제활성 조사
9종 신규 화합물의 면역억제활성 감소 정도를 통상의 인비트로 (In vitro) T-세포 활성 분석법 (J. Immunol. 143: 718-726, 1989)을 이용하여 조사하였다. CD4+ T 세포가 분열되는 것은 면역반응이 일어나고 있음을 보여주는 지표로 CD4+ T 세포를 Cell TraceTM Violet (CTV)으로 염색하여 세포가 면역반응에 따른 분열을 하여 T 세포가 증식하는 경우에 각 세포의 CTV 보유량이 감소되는 현상이 나타나므로 이를 지표로 이용하여 면역억제활성 정도를 조사하였다.
6~8주령의 B6J 실험용 쥐의 지라 (Spleen)로부터 단세포 (Single cell)를 박리하고 MagniSortⓡ Mouse CD4 T cell Enrichment Kit (eBioscience)를 사용하여 CD4+ T 세포를 분리하였다. CD4+ T 세포를 Cell TraceTM Violet (CTV) Cell Proliferation Kit (Molecular Probes)로 염색하고 FK506 또는 9종 신규 화합물을 0.01 ng/ml, 0.1 ng/ml, 1 ng/ml, 10 ng/ml, 100 ng/ml, 1000 ng/ml 농도가 되게 첨가한 다음에 72시간 동안 배양하였다. T 세포의 활성화를 위해 Dynabeadsⓡ Mouse T-Activator CD3/CD28 (Gibco)를 사용하였다. 대조구로는 활성화되지 않은 T 세포를 사용하였다. 배양 후에 유세포 분석기 (flow cytometry)로 CTV 강도 (intensity)를 분석하였다.
하기 표 12와 도 55는 유세포 분석기를 이용하여 CTV 강도를 측정한 것으로 T 세포 증식 정도를 보여주어, FK506 및 9종 신규 화합물의 면역억제활성 정도를 보여준다. 하기 표 12와 도 55에 나타난 바와 같이 본원발명에서 제시하고 있는 모든 신규화합물들은 FK506보다 감소된 면역억제활성을 나타내었다.
Structural analogs Immunosuppression
IC50 (ng/ml)
FK506 0.027
9-deoxo-prolyl-FK506 268.3
9-deoxo-FK506 0.513
31-O-demethyl-FK506 0.246
9-deoxo-31-O-demethyl-FK506 15.09
9-deoxo-31-O-demethyl-prolyl-FK506 886.5
9-deoxo-36,37-dihydro-FK506 14.1
31-O-demethyl-36,37-dihydro-FK506 1.723
9-deoxo-31-O-demethyl-36,37-dihydro-FK506 45.87
9-deoxo-FK520 24.98
31-O-demethyl-FK520 3.273
9-deoxo-31-O-demethyl-FK520 258.1
9-deoxo-FK523 1985
9-deoxo-31-O-demethyl-FK523 3378
이러한 결과로부터, 본 발명에 따른 9종 신규 화합물들이 FK506에 비교하여 면역억제활성이 크게 감소되었음을 확인할 수 있었으며, 이로부터 9종 신규 화합물 중 선택된 하나 이상을 유효성분으로 포함하는 발모촉진용 조성물이 면역억제활성에 기인한 부작용에 대한 염려 없이 사용할 수 있다고 판단하였다.
실시예 11: 9종 신규 화합물의 발모 활성 조사
본 발명의 신규 화합물 9종의 모체 약물 (FK506) 대비 상대적인 발모 활성은 쥐의 비모 조직을 이용하여 평가하였다. 6-8주령의 실험용 검정색 쥐 (C57BL/6 mouse)로부터 입과 그 주위에 두꺼운 수염이 박혀 자라는 부위인 입 조직 (Whisker Pads)을 박리하고 70% 에탄올을 수 초간 짧게 처리하였다. 처리된 입 조직은 얼음 위에 준비된 1% 페니실린/스트렙토마이신 (P/S)이 포함된 인산완충 생리식염수 (Phosphate-buffered saline, PBS)에 넣어 준비하였다. 준비된 입 조직을 해부 현미경으로 보면서 주변 피하지방 조직과 연결 조직을 포셉과 블레이드를 이용해 제거하였고, 비모 (Vibrissae) 조직이 노출되도록 하였다. 그리고 모공 (Hair follicle)을 기준으로 각각의 비모를 포셉과 블레이드를 이용하여 입 조직으로부터 분리하였고, 그 비모를 1% P/S가 포함된 PBS에 넣어 놓았다. 그 뒤에 37℃의 비모 배양 배지 [1% P/S와 12.5 μg/ml 겐타마이신이 포함된 serum-free Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)]를 well plate에 채워 놓고, 분리된 각각의 비모를 각기 다른 well에 한 개씩 옮겨 넣어주었다. 또한 37℃, 5% CO2 공기 조건의 인큐베이터에서 2일에 한 번씩 신선한 배양 배지로 갈아주며 배양하였다. 분리된 비모의 성장에 대한 9종 신규 화합물의 약물 효과를 평가하기 위해, 9종 신규 화합물을 배양 배지에 섞어 처리해준 뒤에 기준점으로부터 자란 비모의 길이, 넓이, 부피 등을 측정하여 평가하였다.
결과로, 본 발명의 신규 화합물 9종 모두가 모체 약물인 FK506과 비교하여 동등 수준의 발모 활성을 제공할 수 있음을 확인할 수 있었다. 대표적 예시 결과로 일부 신규 화합물에 대한 결과를 도 56에 제시하였다. 이는 특정화합물을 강조하기 위한 목적이 아니라 본 발명에 대한 이해를 돕기 위한 예시로 제공한 것이다. 추가적으로, 신규 화합물에 의한 비모의 길이 생장 측정 결과를 도 57에 제시하였다. 도 57에서 볼 수 있듯이, 신규화합물 및 FK506에서 모두 비모의 길이가 생장함을 확인할 수 있었다.
또한, 일부 신규 화합물이 처리된 상태에서 배양된 비모의 조직학 결과를 도 58에 제시하였다. 신규화합물인 9-deoxo-31-O-demethyl-FK520의 비처리군에 비하여 세포의 성장 마커(Ki67)가 과발현됨을 확인할 수 있었는 바, 일부 신규 화합물이 처리된 비모의 경우에는 생장이 지속적으로 유지되고 있음을 확인하였다. 이 결과로부터 본 발명의 9종 신규 화합물 중 선택된 하나 이상을 유효성분으로 포함하는 발모 촉진용 조성물이 목적한대로 발모촉진효과를 가짐을 확인하여 탈모 예방 및 치료에 효과적으로 활용될 수 있다고 판단하였다.
이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시 예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로서 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
한국생명공학연구원(KCTC) KCTC13581BP 20180717 한국생명공학연구원(KCTC) KCTC13580BP 20180717 한국생명공학연구원(KCTC) KCTC13584BP 20180717 한국생명공학연구원(KCTC) KCTC13585BP 20180717 한국생명공학연구원(KCTC) KCTC13579BP 20180717 한국생명공학연구원(KCTC) KCTC13583BP 20180717 한국생명공학연구원(KCTC) KCTC13582BP 20180717

Claims (15)

  1. 하기의 화학식 1로 표시되는 9-deoxo-31-O-demethyl-prolyl-FK506(9-데옥소-31-O-디메틸-프롤릴-FK506), 하기의 화학식 2로 표시되는 9-deoxo-36,37-dihydro-FK506(9-데옥소-36,37-디히드로-FK506), 하기의 화학식 3으로 표시되는 31-O-demethyl-36,37-dihydro-FK506(31-O-디메틸-36,37-디히드로-FK506), 하기의 화학식 4로 표시되는 9-deoxo-31-O-demethyl-36,37-dihydro-FK506(9-데옥소-31-O-디메틸-36,37-디히드로-FK506), 하기의 화학식 5로 표시되는 9-deoxo-FK520(9-데옥소-FK520), 하기의 화학식 6으로 표시되는 31-O-demethyl-FK520(31-O-디메틸-FK520), 하기의 화학식 7로 표시되는 9-deoxo-31-O-demethyl-FK520(9-데옥소-31-O-디메틸-FK520), 하기의 화학식 8로 표시되는 9-deoxo-FK523(9-데옥소-FK523), 및 하기의 화학식 9로 표시되는 9-deoxo-31-O-demethyl-FK523(9-데옥소-31-O-디메틸-FK523)로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 화합물, 이의 이성질체, 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 발모 촉진용 약학적 조성물:
    [화학식 1]
    Figure pat00010

    [화학식 2]
    Figure pat00011

    [화학식 3]
    Figure pat00012

    [화학식 4]
    Figure pat00013

    [화학식 5]
    Figure pat00014

    [화학식 6]
    Figure pat00015

    [화학식 7]
    Figure pat00016

    [화학식 8]
    Figure pat00017

    [화학식 9]
    Figure pat00018

  2. 제1항에 있어서, 상기 9-deoxo-31-O-demethyl-prolyl-FK506은 스트렙토마이세스 카나마이세티쿠스 ΔfkbD-fkbM (수탁번호 KCTC13581BP)을 생산균주로 이용한 배양을 통해 제조되는 것을 특징으로 하는 발모 촉진용 약학적 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 9-deoxo-36,37-dihydro-FK506이 스트렙토마이세스 카나마이세티쿠스 ΔfkbD,tcsD (수탁번호 KCTC13580BP)를 생산균주로 이용한 배양을 통해 제조되는 것을 특징으로 하는 발모 촉진용 약학적 조성물.
  4. 제1항에 있어서, 상기 31-O-demethyl-36,37-dihydro-FK506이 스트렙토마이세스 카나마이세티쿠스 ΔfkbM,tcsD (수탁번호 KCTC13584BP)를 생산균주로 이용한 배양을 통해 제조되는 것을 특징으로 하는 발모 촉진용 약학적 조성물.
  5. 제1항에 있어서, 상기 9-deoxo-31-O-demethyl-36,37-dihydro-FK506이 스트렙토마이세스 카나마이세티쿠스 ΔfkbD-fkbM,tcsD (수탁번호 KCTC13585BP)를 생산균주로 이용한 배양을 통해 제조되는 것을 특징으로 하는 발모 촉진용 약학적 조성물.
  6. 제1항에 있어서, 상기 9-deoxo-FK520이 스트렙토마이세스 카나마이세티쿠스 ΔfkbD,tcsB (수탁번호 KCTC13579BP) 또는 스트렙토마이세스 카나마이세티쿠스 ΔfkbD,tcsD (수탁번호 KCTC13580BP)를 생산균주로 이용한 배양을 통해 제조되는 것을 특징으로 하는 발모 촉진용 약학적 조성물.
  7. 제1항에 있어서, 상기 31-O-demethyl-FK520이 스트렙토마이세스 카나마이세티쿠스 ΔfkbM,tcsB (수탁번호 KCTC13583BP) 또는 스트렙토마이세스 카나마이세티쿠스 ΔfkbM,tcsD (수탁번호 KCTC13584BP)를 생산균주로 이용한 배양을 통해 제조되는 것을 특징으로 하는 발모 촉진용 약학적 조성물.
  8. 제1항에 있어서, 상기 9-deoxo-31-O-demethyl-FK520이 스트렙토마이세스 카나마이세티쿠스 ΔfkbD-fkbM,tcsB (수탁번호 KCTC13582BP) 또는 스트렙토마이세스 카나마이세티쿠스 ΔfkbD-fkbM,tcsD (수탁번호 KCTC13585BP)를 생산균주로 이용한 배양을 통해 제조되는 것을 특징으로 하는 발모 촉진용 약학적 조성물.
  9. 제1항에 있어서, 상기 9-deoxo-FK523이 스트렙토마이세스 카나마이세티쿠스 ΔfkbD,tcsB (수탁번호 KCTC13579BP)를 생산균주로 이용한 배양을 통해 제조되는 것을 특징으로 하는 발모 촉진용 약학적 조성물.
  10. 제1항에 있어서, 상기 9-deoxo-31-O-demethyl-FK523이 스트렙토마이세스 카나마이세티쿠스 ΔfkbD-fkbM,tcsB (수탁번호 KCTC13582BP)를 생산균주로 이용한 배양을 통해 제조되는 것을 특징으로 하는 발모 촉진용 약학적 조성물.
  11. 하기의 화학식 1로 표시되는 9-deoxo-31-O-demethyl-prolyl-FK506, 하기의 화학식 2로 표시되는 9-deoxo-36,37-dihydro-FK506, 하기의 화학식 3으로 표시되는 31-O-demethyl-36,37-dihydro-FK506, 하기의 화학식 4로 표시되는 9-deoxo-31-O-demethyl-36,37-dihydro-FK506, 하기의 화학식 5로 표시되는 9-deoxo-FK520, 하기의 화학식 6으로 표시되는 31-O-demethyl-FK520, 하기의 화학식 7로 표시되는 9-deoxo-31-O-demethyl-FK520, 하기의 화학식 8로 표시되는 9-deoxo-FK523, 및 하기의 화학식 9로 표시되는 9-deoxo-31-O-demethyl-FK523로 이루어진 군으로부터 선택되는 화합물, 이의 이성질체, 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 발모 촉진용 조성물을 인간을 제외한 개체에게 투여하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 탈모 개선, 예방 또는 치료 방법:
    [화학식 1]
    Figure pat00019

    [화학식 2]
    Figure pat00020

    [화학식 3]
    Figure pat00021

    [화학식 4]
    Figure pat00022

    [화학식 5]
    Figure pat00023

    [화학식 6]
    Figure pat00024

    [화학식 7]
    Figure pat00025

    [화학식 8]
    Figure pat00026

    [화학식 9]
    Figure pat00027
    .
  12. 제11항에 있어서, 상기 탈모는 반흔성 탈모; 또는 감염성 탈모, 외상성 탈모, 염증성 탈모, 선천성 탈모, 내분비성 탈모, 종양성 탈모, 영양결핍성 탈모, 약물에 의한 탈모, 모발의 구조이상에 의한 탈모, 남성형 탈모, 여성형 탈모, 및 원형 탈모로부터 선택되는 하나 이상의 비반흔성 탈모인 것을 특징으로 하는, 탈모 개선, 예방 또는 치료 방법.
  13. 하기의 화학식 1로 표시되는 9-deoxo-31-O-demethyl-prolyl-FK506, 하기의 화학식 2로 표시되는 9-deoxo-36,37-dihydro-FK506, 하기의 화학식 3으로 표시되는 31-O-demethyl-36,37-dihydro-FK506, 하기의 화학식 4로 표시되는 9-deoxo-31-O-demethyl-36,37-dihydro-FK506, 하기의 화학식 5로 표시되는 9-deoxo-FK520, 하기의 화학식 6으로 표시되는 31-O-demethyl-FK520, 하기의 화학식 7로 표시되는 9-deoxo-31-O-demethyl-FK520, 하기의 화학식 8로 표시되는 9-deoxo-FK523, 및 하기의 화학식 9로 표시되는 9-deoxo-31-O-demethyl-FK523로 이루어진 군으로부터 선택되는 화합물, 이의 이성질체, 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 발모 촉진용 의약외품 조성물:
    [화학식 1]
    Figure pat00028


    [화학식 2]
    Figure pat00029

    [화학식 3]
    Figure pat00030

    [화학식 4]
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    [화학식 5]
    Figure pat00032

    [화학식 6]
    Figure pat00033

    [화학식 7]
    [화학식 1]
    Figure pat00034

    [화학식 2]
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    [화학식 3]
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    [화학식 4]
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    [화학식 5]
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    [화학식 6]
    Figure pat00039

    [화학식 7]
    Figure pat00040

    [화학식 8]
    Figure pat00041

    [화학식 9]
    Figure pat00042
    .
  14. 하기의 화학식 1로 표시되는 9-deoxo-31-O-demethyl-prolyl-FK506, 하기의 화학식 2로 표시되는 9-deoxo-36,37-dihydro-FK506, 하기의 화학식 3으로 표시되는 31-O-demethyl-36,37-dihydro-FK506, 하기의 화학식 4로 표시되는 9-deoxo-31-O-demethyl-36,37-dihydro-FK506, 하기의 화학식 5로 표시되는 9-deoxo-FK520, 하기의 화학식 6으로 표시되는 31-O-demethyl-FK520, 하기의 화학식 7로 표시되는 9-deoxo-31-O-demethyl-FK520, 하기의 화학식 8로 표시되는 9-deoxo-FK523, 및 하기의 화학식 9로 표시되는 9-deoxo-31-O-demethyl-FK523로 이루어진 군으로부터 선택되는 화합물, 이의 이성질체, 또는 이의 식품학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 발모 촉진용 건강기능식품 조성물:
    [화학식 1]
    Figure pat00043

    [화학식 2]
    Figure pat00044

    [화학식 3]
    Figure pat00045

    [화학식 4]
    Figure pat00046

    [화학식 5]
    Figure pat00047

    [화학식 6]
    Figure pat00048

    [화학식 7]
    Figure pat00049

    [화학식 8]
    Figure pat00050

    [화학식 9]
    Figure pat00051
    .
  15. 하기의 화학식 1로 표시되는 9-deoxo-31-O-demethyl-prolyl-FK506, 하기의 화학식 2로 표시되는 9-deoxo-36,37-dihydro-FK506, 하기의 화학식 3으로 표시되는 31-O-demethyl-36,37-dihydro-FK506, 하기의 화학식 4로 표시되는 9-deoxo-31-O-demethyl-36,37-dihydro-FK506, 하기의 화학식 5로 표시되는 9-deoxo-FK520, 하기의 화학식 6으로 표시되는 31-O-demethyl-FK520, 하기의 화학식 7로 표시되는 9-deoxo-31-O-demethyl-FK520, 하기의 화학식 8로 표시되는 9-deoxo-FK523, 및 하기의 화학식 9로 표시되는 9-deoxo-31-O-demethyl-FK523로 이루어진 군으로부터 선택되는 화합물, 이의 이성질체, 또는 이의 화장품학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 발모 촉진용 화장료 조성물:
    [화학식 1]
    Figure pat00052

    [화학식 2]
    Figure pat00053

    [화학식 3]
    Figure pat00054

    [화학식 4]
    Figure pat00055

    [화학식 5]
    Figure pat00056

    [화학식 6]
    Figure pat00057

    [화학식 7]
    Figure pat00058

    [화학식 8]
    Figure pat00059

    [화학식 9]
    Figure pat00060
    .
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WO2022139524A1 (ko) * 2020-12-24 2022-06-30 서울대학교산학협력단 신규 fk506 유도체 및 이를 포함하는 발모 촉진용 조성물

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