KR20200070505A

KR20200070505A - 항비만 바이오 한방 혼합 추출물 제조 방법 및 이에 의해 제조된 항비만 바이오 한방 혼합 추출물

Info

Publication number: KR20200070505A
Application number: KR1020180157320A
Authority: KR
Inventors: 김현숙; 김미자
Original assignee: 주식회사 우리엘바이오; 강원대학교산학협력단
Priority date: 2018-12-07
Filing date: 2018-12-07
Publication date: 2020-06-18
Also published as: KR102198802B1

Abstract

본 발명은, 메밀, 둥굴레, 마테, 의이인, 당귀, 구기자 및 천마를 포함하는 원재료를 준비하는 단계; 상기 원재료 중 일부의 각각 대하여 물을 투입하여 저온 추출하여 원재료 추출물을 제조하는 단계; 상기 원재료 중 나머지 부분을 분쇄하여 원재료 분쇄물을 제조하는 단계; 상기 원재료 추출물을 액상 분리시킨 후 배지를 투입하여 영양 원재료 추출물을 제조하는 단계; 상기 영양 원재료 추출물에, 메밀 종균, 둥굴레 종균, 마테 종균, 의이인 종규, 당귀 종균, 구기자 종균, 천마 종균을 투입한 후 발효시켜 발효추출물을 제조하는 단계; 및 상기 발효 추출물을 상기 원재료 분쇄물에 자연 접종시킨후 배양하여 항비만 바이오 한방 혼합 추출물을 완성하는 단계를 포함하는, 항비만 바이오 한방 혼합 추출물 제조 방법 및 이에 의헤 제조된 항비만 바이오 한방 혼합 추출물에 관한 것이다.

Description

항비만 바이오 한방 혼합 추출물 제조 방법 및 이에 의해 제조된 항비만 바이오 한방 혼합 추출물{METHOD FOR MANUFACTURING ANTIOBESIC BIO ORIENTAL MEDICINE MIXED EXTRACT AND ANTIOBESIC BIO ORIENTAL MEDICINE MIXED EXTRACT PRODUDED BY THE SAME}

본 발명은, 항비만 바이오 한방 혼합 추출물 제조 방법 및 이에 의해 제조된 항비만 바이오 한방 혼합 추출물에 관한 것이다.

최근 기능성 식품에 대한 관심이 높아지고 있으며 특히 비만을 예방하는 기능성 식품에 관심이 많이 쏠리고 있다. 경제 수준의 향상과 함께 소비자들의 기호가 고급화되어 식생활에도 많은 변화를 가져왔으며, 이에 따라 비만환자에 효과가 있는 식품의 제조에 대한 연구가 많이 있었다. 특히 항비만 효과를 가지는 한방 재료를 생산하기 위한 연구들이 진행되어 왔다.

이러한 연구들의 결과로 다음과 같은 특허출원들이 있어 왔다.

[선행문헌]

한국 공개 특허 10-2018-0119940 : 발효차추출물의 제조 방법 및 이로부터 제조된 발효차 추출물

한국 등록 특허 10-1913351 : 항비만 효능의 발효 반죽 제조 방법

한국 공개 특허 10-2018-0104794 : 동백 어린잎 발효차 추출물을 유효 성분으로 포함하는 항산화 또는 항비만 식품용 조성물

하지만 이러한 결과 중 발효를 이용하는 경우, 발효의 환경 조건에 따라 너무 많은 품질 차이가 나타나서 대량 생산을 하는 경우 일정한 품질을 그대로 유지하지 못하는 문제가 있었다.

이에 본 발명은 우수한 항비만 효과를 충분히 가지면서도 일관된 품질을 가지는 항비만 바이오 한방 혼합 추출물 제조 방법 및 이에 의해 제조된 항비만 바이오 한방 혼합 추출물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

상술한 과제를 해결하기 위하여 안출된 본 발명의 일실시예인 항비만 바이오 한방 혼합 추출물 제조 방법은 메밀, 둥굴레, 마테, 의이인, 당귀, 구기자 및 천마를 포함하는 원재료를 준비하는 단계; 상기 원재료 중 일부의 각각 대하여 물을 투입하여 저온 추출하여 원재료 추출물을 제조하는 단계; 상기 원재료 중 나머지 부분을 분쇄하여 원재료 분쇄물을 제조하는 단계; 상기 원재료 추출물을 액상 분리시킨 후 배지를 투입하여 영양 원재료 추출물을 제조하는 단계; 상기 영양 원재료 추출물에, 메밀 종균, 둥굴레 종균, 마테 종균, 의이인 종규, 당귀 종균, 구기자 종균, 천마 종균을 투입한 후 발효시켜 발효추출물을 제조하는 단계; 및 상기 발효 추출물을 상기 원재료 분쇄물에 자연 접종시킨후 배양하여 항비만 바이오 한방 혼합 추출물을 완성하는 단계를 포함할 수 있다.

여기서, 상기 메밀 60 중량부, 둥굴레 10 중량부, 마테 10 중량부, 의이인 5 중량부, 당귀 5 중량부, 구기자 5 중량부, 천마 5 중량부를 포함할 수 있다.

여기서, 상기 메밀 종균, 둥굴레 종균, 마테 종균, 의이인 종규, 당귀 종균, 구기자 종균, 천마 종균은 각각의 재료의 중량부 만큼 포함될 수 있다.

여기서, 상기 원재료 추출물을 액상 분리시킨 후 배지를 투입하여 영양 원재료 추출물을 제조하는 단계는, 모스코바도 설탕액 2%, 소이펩톤 0.3%, 혼합미네랄을 포함하는 배지를 투입하여 영양원재료 추출물을 제조하는 단계를 포함할 수 있다.

여기서, 상기 발효 추출물을 상기 원재료 분쇄물에 자연 접종시킨후 배양하여 항비만 바이오 한방 혼합 추출물을 완성하는 단계는, 피라미드 구조물내에서 상기 자연접종을 진행하여 상기 항비만 바이오 한방 혼합 추출물을 완성하는 단계를 포함할 수 있다.

상술한 구성을 가진 본 발명의 일실시예에 따르면, 독성이 없으면서도 항비만 효능이 높은 항비만 바이오 한방 혼합 추출물을 제공할 수 있게 된다.

또한 본 발명의 일실시예에 따르면, 항비만 효과를 천연 원재료 각각에 대하여 종균을 배양하고 그 종균을 접종하여 생산함으로써, 발효물임에도 불구하고 일관성있는 제품을 생산할 수 있게 된다.

도 1은 본 발명의 일실시예인 항비만 바이오 한방 혼합 추출물 제조 방법의 순서도.
도 2는 도 1에서 설명된 방법에 의해 제조된 항비만 바이오 한방 혼합 추출물에 대한 효능을 실험하기 위한 시료화 과정을 설명하기 위한 도면
도 3은 본 발명의 다른 실시예인 항비만 바이오 한방 혼합 추출물의 산화 방지 활성 측정 중 DPPH 라디칼 소거능을 설명하기 위한 도면
도 4는 본 발명의 다른 실시예인 항비만 바이오 한방 혼합 추출물의 산화 방지 활성 측정 중 ABTS 양이온 라디칼 소거능을 설명하기 위한 도면
도 5는, 본 발명의 다른 실시예인 항비만 바이오 한방 혼합 추출물의 산화 방지 활성 측정 중 ORAC ASSAY를 설명하기 위한 도면
도 6은 본 발명의 다른 실시예인 항비만 바이오 한방 혼합 추출물의 유지 산화 안정성 중 유지의 산소 함량(Headspace oxygen contents)의 측정 결과를 나타내는 도면이다.
도 7은 본 발명의 다른 실시예인 항비만 바이오 한방 혼합 추출물의 유지 산화 안정성 중 conjugated dienoic acid가를 설명하기 위한 도면
도 8은 본 발명의 다른 실시예인 항비만 바이오 한방 혼합 추출물의 유지 산화 안정성 중 β-Anisidine value (β-AV법)에 따른 2차 산화물 생성의 측정값을 나타내는 도면.
도 9는 본 발명의 다른 실시예인 항비만 바이오 한방 혼합 추출물의 3T3-L1전지방세포주의 지방세포 분화 억제능 중 세포 독성 결과를 나타내는 도면.
도 10 및 도 11은 본 발명의 다른 실시예인 항비만 바이오 한방 혼합 추출물의 지방세포 분화 억제능 중 중성 지방 축제 억제능에 대한 결과를 나타내는 도면.
도 12는 본 발명의 다른 실시예인 항비만 바이오 한방 혼합 추출물의지방세포 분화 억제능 중 유전자 발현 억제 효과를 나타내는 도면.

첨부된 도면과 관련하여 후술되는 상세한 설명은 다양한 구성의 설명을 위한 것이며 본 명세서에 실시될 수 있도록 설명된 개념들이 유일한 구성임을 나타내기 위한 것은 아니다. 상세한 설명은 본 발명의 다양한 개념들의 철저한 이해를 제공하기 위한 목적을 위해 구체적인 세부사항들을 포함한다. 그러나, 이들 개념이 특정 세부 사항 없이도 실시될 수 있음은 그 기술 분야의 통상의 지식을 가진 자에게 명백할 것이다. 이하 본 발명에 대하여 도면을 참조하여 보다 상세하게 설명하도록 한다. 본 발명에서는 7가지의 천연 원재료가 사용되며, 메밀, 둥굴레, 마테, 의이인, 당귀, 구기자 및 천마이다.

메밀은 성질이 서늘하여 찬 음식에 속하며, 체내에 열을 내려주고 염증을 가라앉히며 배변을 용이하게 하여 주는 기능을 한다. 특히 무더운 여름철이나 체질적으로 열기와 습기가 많은 사람이 메밀을 먹으면 몸속에 쌓여있던 열기와 습기가 빠져나가면서 몸이 가벼워지는 효과를 가지고 올 수 있다.

둥굴레는 구수한 맛을 내며 쉽게 구할 수 있는 한약재이다. 둥굴레는 혈당을 떨어뜨렴 혈관질환에 도움을 주고, 체내 활성 산소를 제거하여 노화 예방이 좋으며 특히 변비에 우수한 효능을 가지고 있는 것으로 알려져 있다.

마테는 잎에 2% 정도의 카페인이 들어 있고 타니, 수지 및 약간의 정유가 있어 향이 좋다. 또한 마테는 근육을 유지하고 제지방응ㄹ 분해해주는 클로로겐산이 많이 들어 있다.

의이인은 율무의 한약재명으로서, 해열 작용을 하고 불필요한 수분을 밖으로 배출하는 이뇨작용을 한다. 또한, 수종, 각기. 설사등에 효능을 가지고 있는 한약재이다.

당귀는 강장 효과가 뛰어나고 혈관에 이로우며 혈액순환에 탁월하기 때문에 이로 인한 고혈압이나 빈혈 등의 각종 성인 질환에 좋을 뿐만 아니라 기관지 질환 및 노폐물 배출 및 항암효과에 대해서도 좋다고 알려져 있다.

구기자는 하수오, 인삼과 함께 3대 명약으로 여겨지며, 콜린대사물질의 하나인 베타인이 풍부해서 간에 지방이 축적되는 것을 억제하는 기능을 가진다.

천마는 진정, 진경의 효능이 있고 경락을 이어준다고 한다. 적용질환은 두통이나 현기증을 비롯해 팔다리의 근육이 굳어지고 감각이 없어지는 증세, 반신불수, 언어장애, 고혈압, 어린아이의 간질병, 유행성 뇌수막염 등의 질환을 치료하는 데 쓴다. 또한 천마는, 고혈압, 신경성 질환, 당뇨, 이뇨, 성기능 장애, 두통, 피로회복,스트레스 해소 등의 효능도 가진다.

이상과 같은 천연 원재료를 이용한 본 발명에 따른 항비만 바이오 혼합 추출물은 도 1에 따른 공정에 따라 제조되게 된다.

도 1은 본 발명의 일실시예인 항비만 바이오 한방 혼합 추출물 제조 방법의 순서도이다. 도 1에 도시된 바와 같이, 우선 메밀, 둥글레, 마테, 의인, 당귀, 구기자 및 천마를 포함하는 원재료를 준비한다(S1). 그 다음, 메밀, 둥글레, 마테, 의인, 당귀, 구기자 및 천마 각각에 대하여 물을 투입하여 저온 추출하여 원재료 추출물을 제조한다(S2).한편, 원재료중 나머지 부분을 분쇄하여 원재료 분쇄물을 제조한다(S3). 여기서 상기 메밀 60 중량부, 둥글레 10 중량부, 마테 10 중량부, 의인 5 중량부, 당귀 5 중량부, 구기자 5 중량부, 천마 5 중량부의 비중으로 분쇄하여 원재료 분쇄물을 제조한다. 그리고, 상기 원재료 추출물을 액상 분리시킨 후 배지를 투입하여 영양 원재료 추출물을 제조한다(S4). 여기서 배지는 모스코바도 설탕액 2%, 소이펩톤 0.3% 혼합미네랄을 포함할 수 있다. 상기 영양 원재료 추출물에, 메밀 종균, 둥글레 종균, 마테 종균, 의인 종규, 당귀 종균, 구기자 종균, 천마 종균을 투입한 후 발효시켜 발효추출물을 제조한다(S5). 이 때, 상기 메밀 종균, 둥글레 종균, 마테 종균, 의인 종규, 당귀 종균, 구기자 종균, 천마 종균은 각각의 재료의 중량부 만큼 포함되게 된다. 상기 발효 추출물을 상기 원재료 분쇄물에 자연 접종시킨후 배양하여 항비만 바이오 한방 혼합 추출물을 완성한다. 이 때. 피라미드 구조물내에서 상기 자연접종 및 배양을 진행하여 상기 항비만 바이오 한방 혼합 추출물을 완성한다(S6). 이와 같이 피라미드 구조물에서 자연 접종 및 배양을 진행하는 경우, 항비만 효능이 강화된다. 이 피라미드 효과에 대해서는 이미 알려져 있으므로 이에 대한 설명은 생략하도록 한다.

이하 상술한 방법에 의해 제조된 본 발명에 따른 항비만 바이오 혼합 추출물의 효능에 대하여 도 2 내지 도 14를 참조하여 보다 상세하게 설명하도록 한다.

도 2는 도 1에서 설명된 방법에 의해 제조된 항비만 바이오 한방 혼합 추출물에 대한 효능을 실험하기 위한 시료화 과정을 설명하기 위한 도면이다. 도 2에 도시된 바와 같이, 본 발명에 따른 일실시예인 항비만 바이오 한방 혼합 추출물의 효능을 검사하기 위해서는 우선 항비만 혼합 추출물을 분말 형태로 분쇄한 후 80%의 에탄올로 추출을 한다(S11~S13). 대략 5배의 에탄올을 혼합하여 5시간 동안 혼합한 후, 여과, 감압 농축 및 동결 건조 단계를 통해 시료를 추출한다(S14~S15).

이와 같은 방식으로 제조된 시료에 대하여 다음의 주요 3가지 성능을 측정하여 항비만 효과를 확인하도록 한다.

1. 산화 방지 활성 측정,

2. 유지 산화 안정성 측정, 및

3. 3T3-L1 전지방 세포의 지방 세포 분화도 측정

이를 위한 실험은 다음과 같이 진행하였다.

A. 산화방지 활성 측정

1) DPPH(2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl) 라디칼 소거능 측정

0.1 mM DPPH 용액이 되도록 메탄올로 제조하여 사용하였으며 제조된 용액 0.75 mL를 각 농도별로 희석한 시료 용액 0.25 mL를 넣어 30분간 암소에서 반응시켰다. : 그 후 UV-VIS spectrophotometer(Mega-U600, Gangnam-gu, Seoul-si, Scinco)를 이용하여 517 nm에서 측정하여 저해율을 다음과 같이 계산하였다.

Inhibition rate(%)

A_c:대조군 흡광도, A_s:시료의 흡광도

2) ABTS (2,2'-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulphonic acid)) 양이온 라디칼 소거능 측정

7 mM ABTS와 2.45 mM potassium persulfate가 되도록 증류수에 용해하여 1:1(v/v)으로 혼합한 용액을 12시간 방치하여 ABTS 양이온 라디칼을 형성하였다.

그 후 UV-VIS spectrophotometer(Mega-U600, Scinco)를 이용하여 734 nm 파장에서 흡광도가 0.800±0.050이 되도록 에탄올을 이용하여 적정농도로 희석하였다.

이 용액 0.95 mL와 각 농도별로 희석한 시료 0.05 mL를 넣어 암실에서 6분간 반응 시켰다. 그 후 저해율은 다음과 같이 계산하였다.

Inhibition rate(%)

A_c:대조군 흡광도, A_s:시료의 흡광도

3) FRAP 환원력

300 mM sodium acetate를 증류수에 용해시켜 acetic acid로 pH 3.6으로 제조하였다. 10 mM 2,4,6-tripyridyl-S-triazine은 40 mM HCl로 용해하였다. 또한 20 mM FeCl₃은 증류수에 용해하여 사용하였으며, 제조한 각각의 용액을 10:1:1(v/v/v)의 비율로 혼합한 후 37℃에서 15분간 평형시켜 FRAP reagent를 제조하였다. 제조한 용액 0.9 mL와 각 농도별로 희석한 시료 0.03 mL를 넣어 준 후 암실에서 30분간 반응시켰다.

그 후 593 nm 파장에서 UV-VIS spectrophotometer(Mega-U600, Scinco)로 흡광도를 측정하였다. 이는 표준물질로 아스코브산을 이용하여 농도별로 증류수에 녹인 후 검량곡선을 작성하여 정량하였다.

4) 총 플라보노이드함량

시료 0.1 mL와 에탄올 0.3 mL, 10% aluminum chloride 0.02 mL, 증류수 0.56 mL를 혼합한 후 1 M potassium acetate 0.02 mL를 넣어 30분간 반응시켰다. 이때 10% aluminum chloride와 1 M potassium acetate는 증류수에 용해하였고, 그 후 UV-VIS spectrophotometer(Mega-U600, Scinco)를 이용하여 415 nm 파장에서 측정하였으며, 표준물질로 퀘르세틴을 이용하여 농도별로 증류수에 희석하여 검량곡선을 작성하여 정량하였다.

5) 총 페놀함량

적정 농도로 희석한 시료 용액 0.05 mL와 증류수 0.8 mL를 섞은 후 Folin-Denis’ 시약 0.5 mL를 첨가하여 혼합한 후 5분간 반응시켜 포화된 sodium carbonate 0.1 mL를 첨가하여 30분간 정치하였으며, 그 후 UV-VIS spectrophotometer(Mega-U600, Scinco)를 이용하여 725 nm 파장에서 흡광도를 측정하였다. 표준물질로 탄닌산을 이용하여 증류수에 각 농도별로 희석하여 사용하였으며 이를 검량곡선을 작성하여 정량하였다.

6) ORAC(Oxygen radical absorbance capacity) assay

시료를 75 mM phosphate buffer에 일정 농도로 용해하여 사용하였으며 100 nM fluorescein salt를 시료와 동일한 buffer에 녹여 37℃ 항온수조에서 평형시켜 사용하였다. 2,2′-azobis(2-methylpropionamidine) dihychloride(AAPH)는 300 mM이 되도록 동일한 완충용액을 이용하여 용해하였고, 이들을 순서대로 50, 150, 50 μL를 넣은 후 37℃ 온도에서 493 nm에서 전자가 여기되며, 515 nm 파장에서 방출되게 측정하였다. 표준물질로 trolox(Sigma)를 75 mM phosphate buffer에 녹여 fluorescence microplate reader(Gemini XPS, Molecular devices, California, USA)에서 측정하였다.

B. 유지 산화안정성

1) 추출물 첨가 유지제조

발효된 7가지 혼합물로부터 얻은 80% 에탄올 추출물을 소량의 dimethyl sulfoxide(DMSO)에 녹인 후 옥수수유에 200, 1000 ppm이 되도록 첨가하였다. 대조군으로는 동량의 DMSO가 처리된 옥수수유를 사용하였으며 이를 건조오븐(GISICO, Seoul, Korea)에서 3, 6, 9시간 동안 100±5℃의 열로 산화시켰고 잔열로 산화되는 것을 방지하기 위해 산화된 후에 -20℃에서 보관하며 실험하였다. Headspace oxygen contents의 경우 6, 12, 18 시간 동안 산화시켰다.

2) Headspace oxygen contents

Head space oxygen 함량을 측정하기 위해 GC-TCD를 사용하였으며, 제조한 유지 시료의 headspace gas를 60/80 packed column과 thermal conductivity detector(TCD)가 장착되어 있는 GC에 주입하였다. 이동상으로는 20 mL/min의 속도로 헬륨 가스를 주입하였고, GC의 오븐, 주입구, 검출기의 온도는 각각 60, 180, 180℃로 설정하여 산소 함량 %로 나타내었다.

3) Conjugated dienoic acid (CDA)가

산화된 시료 100 mg을 isooctane 25 mL에 분산시켜 흡광도 값이 적정범위로 들어오도록 isooctane을 이용하여 희석하였고, 그 후 UV/VIS-spectrometer(Mega-U600, Scinco)로 233 nm파장에서 석영셀을 이용하여 흡광도를 측정하였다.

4) ρ-Anisidine value (ρ-AV) 법

ρ-AV는 산화된 시료 100 mg을 25 mL의 isooctane에 분산시켜 준비하였고, 0.25% ρ-anisidine(Kanto chemical, Tokyo, Japan)이 되도록 acetic acid에 제조하여 시료 1 mL와 제조된 용액 0.2 mL를 넣어 암실에서 15분간 반응시켜 UV/VIS-spectrometer(Mega-U600, Scinco)로 350 nm 파장에서 석영 셀을 이용하여 흡광도를 측정하였으며 이때 시약을 넣지 않은 공실험도 함께 진행하였다.

C. 3T3-L1 전지방세포의 지방세포분화

1) 3T3-L1 전지방세포주에서의 7종 약재 발효 혼합물의 세포독성 측정

① 3T3-L1전지방세포주 배양

3T3-L1전지방세포주는 10% FBS이 첨가된 DMEM배지에 배양하여 96well plate에 적당양의 세포를 seeding하였다.

② Methylthiazoletetrazolium(MTT) assay

96well plate에 seeding된 3T3-L1전지방세포주를 하루 배양한 후, 각각의 시료를 25, 50, 100, 150 μg/mL 농도를 처리하여 24시간 배양하였고, 배양 후 MTT 시약을 10μL 처리하여 배양기에 빛을 차단 한 후 4시간 동안 반응시킨 후 DMSO 90μL를 첨가하여 분광광도계 540nm에서 흡광도를 측정하였다.

2) 3T3-L1 전지방세포주의 지방세포 분화

3T3-L1 전지방세포주는 dulbecco’s modified eagle’s medium (DMEM) 배지에 10% fetal bovine serum (FBS), 1% penicillin/streptomycin을 첨가하여 48 시간동안 37℃ CO₂배양기에서 배양하였다.

Confluent한 상태가 된 세포에 분화배지로 교체하여 48시간동안 동일한 조건에서 배양하였으며, 7종 약재 발효 혼합물 추출물 시료도 50, 100, 150, 200 μg/mL의 농도로 처리하였다.

그 후 분화를 촉진시키기 위해 48시간 간격으로 insulin이 첨가된 배지로 교체하면서 분화시켰고, 이때 분화배지는 배양한 동일한 배지에 1 μM dexamethasone, 10 μg/mL insulin, 0.5 mM 3-isobutyl-1-methylxanthine(IBMX)를 사용하였으며, insulin 배지 역시 배양한 동일한 배지에 10 μg/mL insulin이 첨가되었다.

3) 3T3-L1 지방세포의 Oil red O 염색

분화시킨 세포에 배지를 제거한 후 10% 포르말린으로 1시간 정도 세포를 고정시켰고, 그 후 고정액을 제거한 후 Oil red O 시약을 처리하여 1시간 정도 중성지방구를 염색하여 지방분화 정도를 현미경으로 관찰하였다.

그 후 isopropanol을 이용하여 염색된 시약을 추출 후 96well plate에 100 μL씩 옮긴 후 ELISA reader로 510 nm 파장에서 흡광도를 측정하였다.

4) 유전자 발현 분석

지방세포 분화 측정 방법과 동일한 방법으로 분화된 3T3-L1 세포에 TRIzol 시약을 이용하여 총 RNA를 추출 및 분리하였다.

추출된 RNA는 이용하여 cDNA를 합성하여 SYBR green과 <표 1>에 제시된 aP2(adipocyte protein 2), FAS(fatty acid synthase), C/EBPα(CCAAT-enhancer-binding protein α) primer를 이용하여 real-time PCR을 40회 반응하였고, 3회 반복하였다.

House keeping 유전자로는 β-actin을 사용하였으며, △CT값은 각 샘플의 CT값과 β-actin간의 차이에 대하여 계산하였음. △CT=CT(target)-CT(β-actin), 상대적인 발현수준은 2^-△CT으로 계산하였음.

D. 자료 분석

모든 실험은 3번 이상 반복 실시하였으며 얻어진 결과는 SPSS program (SPSS Inc., Chicago, IL, USA)을 이용하여 평균±표준편차로 나타내었다. 또한, 유의성 검정은 t-test 및 one-way ANOVA로 분석하여 p<0.05수준에서 Duncan’s multiple range test를 이용하였다.

이하, 상술한 방식으로 실험한 결과를 도 3 내지 도 14를 참조하여 보다 상세하게 설명하도록 한다.

도 3은 본 발명의 다른 실시예인 항비만 바이오 한방 혼합 추출물의 산화 방지 활성 측정 중 DPPH 라디칼 소거능을 설명하기 위한 도면이다. 도3 에 도시된 바와 같이, 항산화물질로 알려진 ascorbic acid 0.1 mM의 경우 37.1%의 DPPH 라디칼 소거능을 보였으며, 본 발명에 따른 실시예인 항비만 바이오 한방 혼합 추출물의 DPPH 라디칼 소거능의 결과는 다음 도 3과 같이, 0.25, 0.5, 1.0, 2.0 mg/mL의 농도에서 각각 34.1, 57.2, 89.2, 90.1%의 소거능을 나타내었으며 농도 의존적으로 유의적인 라디칼 소거능을 나타내었다.

도 4는 본 발명의 다른 실시예인 항비만 바이오 한방 혼합 추출물의 산화 방지 활성 측정 중 ABTS 양이온 라디칼 소거능을 설명하기 위한 도면이다. ABTS 양이온 라디칼 소거능의 결과는, 도 4에서와 같이, 항산화물질로 알려진 ascorbic acid 0.5 mM는 38.2% 소거능을 보였으며, 0.0625, 0.125, 0.25, 0.5 mg/mL에서 항비만 바이오 한방 혼합 추출물은 각각 39.96, 49.70, 67.41, 95.70%의 소거능을 농도 의존적으로 통계적으로 유의적인 소거능을 보였다.

항비만 바이오 한방 혼합 추출물의 에탄올 추출물의 FRAP 환원력 측정한 바, 철 이온 환원력 측정법의 결과로서, 표준물질 아스코브산으로 환산한 결과 분말형태 추출물은 455.78 μM ascorbic acid equivalent/g extract로 나타났다..

또한, 본 발명의 일실시예인 항비만 바이오 한방 혼합 추출물의 총 플라보노이드 함량 및 총 페놀함량의 결과는, 표준물질로 각각 퀘르세틴과 탄닌산을 사용하여 검량곡선으로 정량한 결과, 7가지 약재 발효 혼합물의 80% 에탄올 추출물은 각각 32.43 μM quercetin equivalent/g extract, 40.2 μM tannic acid equivalent/g extract로 나타났다.

도 5은, 본 발명의 다른 실시예인 항비만 바이오 한방 혼합 추출물의 산화 방지 활성 측정 중 ORAC ASSAY를 설명하기 위한 도면이다. ORAC(Oxygen radical absorbance capacity) assay의 결과는 도 5와 같다. 도 5A는 시간에 따른 fluorescein의 감소된 양을 나타낸 그래프이며, 도 5B는 blank area under the curve(AUC)에 본 발명에 따른 항비만 바이오 한방 혼합 추출물의 처리에 따른 AUC를 나타낸 것으로 대조군에 비해 trolox 0.1 μM은 2.13배, 추출물은 12.5 μg/mL 농도에서는 1.77배, 25 12.5 μg/mL 농도에서는 2.33배, 50 μg/mL 농도에서는 4.65배, 100 μg/mL 농도에서는 4.65배로 fluorescein이 농도 의존적으로 유의하게 유지되었음을 확인할 수 있다..

도 6은 본 발명의 다른 실시예인 항비만 바이오 한방 혼합 추출물의 유지 산화 안정성 중 유지의 산소 함량(Headspace oxygen contents)의 측정 결과를 나타내는 도면이다. 도 6과 같이. 유지 시료에 500 ppm의 농도로 첨가하여 0, 6, 12, 18 시간 산화시킨 결과 산소 함량은 시료가 첨가되지 않은 대조군의 경우 각각 20.6, 19.4, 16.3, 13.3%로 나타났으며, 본 발명의 일실시예인 항비만 바이오 한방 혼합 추출물을 첨가한 경우 20.6, 20.2, 16.9, 15.6%로 나타났다. 대조군과 비교하여 7FM을 500 ppm농도로 처리한 결과 6시간 산화시 0.95배, 12시간 산화시 0.96배, 18시간 산화시 0.85배 산소를 소모하였음을 알 수 있다. 이러한 결과로, 유지 열산화시에 산소 소모를 하는데 이를 본 발명의 일실시예인 항비만 바이오 한방 혼합 추출물이 억제한 것으로 예상된다.

도 7은 본 발명의 다른 실시예인 항비만 바이오 한방 혼합 추출물의 유지 산화 안정성 중 conjugated dienoic acid가를 설명하기 위한 도면이다.

본 발명의 실시예인 항비만 바이오 한방 혼합 추출물을 첨가한 유지시료의 초기 산화생성물을 측정한 결과는 도 7과 같이, 200, 1000 ppm의 농도로 첨가한 결과로 3, 6, 9 시간 산화시킨 CDA의 양은 대조군의 경우 0.21, 0.43, 0.58%로 나타났으며, 시료 처리군은 200 ppm 농도에서 0.29, 0.32, 0.66%로, 1000 ppm의 농도에서는 0.29, 0.29, 0.68%로 나타났다.

추출물을 200 ppm 농도로 처리하여 3 시간 열산화 시킨 결과 대조군에 비해 0.40배 증가하였으며, 6시간에서는 0.25배 감소, 9시간에서는 0.13배 증가하였다.

1000 ppm의 농도에서 3시간 열산화 시킨 결과 대조군에 비해 0.40배 증가하였으며, 6시간에서는 0.32배 감소, 9시간에서는 0.17배 증가하였고, 두 농도 모두 6시간에서 산화생성물의 생성량이 감소하였다.

이와 같은 결과로, 유지산화시 생성되는 생성물인 CDA이 본 발명의 일실시예에 따라 감소함을 알 수 있었다.

도 8은 본 발명의 다른 실시예인 항비만 바이오 한방 혼합 추출물의 유지 산화 안정성 중 β-Anisidine value (β-AV법)에 따른 2차 산화물 생성의 측정값을 나타내는 도면이다.

본 발명의 일실시예인 항비만 바이오 한방 혼합 추출물을 첨가한 유지시료의 이차 산화생성물을 측정한 결과는, 도 8과 같이, 200, 1000 ppm의 농도로 첨가한 결과로 3, 6, 9 시간 산화시킨 ρ-AV는 대조군의 경우 16.56, 24.92, 26.50으로 나타났으며, 시료 처리군은 200 ppm 농도에서 16.63, 18.23, 19.40으로, 1000 ppm의 농도에서는 19.60, 23.27, 25.38로 나타났다. 이는 200 ppm 농도에서 3 시간 열산화 시킨 결과 대조군과 차이가 없었으며, 6시간에서는 0.27배 감소, 9시간에서는 0.27배 증가하였다. 1000 ppm의 농도에서 3시간 열산화 시킨 결과 대조군에 비해 0.18배 증가하였으며, 6 시간에서는 0.07배 감소, 9시간에서는 0.04배 감소하였다

이와 같은 결과로, 유지열산화가 진행되면서 증가된 ρ-AV가 본 발명의 일실시예인 항비만 바이오 한방 혼합 추출물에 의해 감소하였는데 그 감소는 농도 의존적이지는 않음을 확인할 수 있었다.

도 9는 본 발명의 다른 실시예인 항비만 바이오 한방 혼합 추출물의 3T3-L1전지방세포주의 지방세포 분화 억제능 중 세포 독성 결과를 나타내는 도면이다.

3T3-L1의 전지방세포주의 본 발명에 따른 일실시예인 항비만 바이오 한방 혼합 추출물의 세포독성은 도 9와 같다. 대조군의 세포 생존율을 100%로 보았을 때 80% 에탄올 추출물 처리군의 경우 25 μg/mL 농도에서는 89.75% 생존율을 보였으며, 50 μg/mL 농도에서는 88.49%, 100 μg/mL 농도에서는 83.60%, 200 μg/mL 농도에서는 93.75%, 400 μg/mL 농도에서는 101.05%로 나타나 모든 농도에서 80% 이상의 세포 생존율을 나타내어 세포독성이 없는 것으로 나타났다.

도 10 및 도 11은 본 발명의 다른 실시예인 항비만 바이오 한방 혼합 추출물의 지방세포 분화 억제능 중 중성 지방 축제 억제능에 대한 결과를 나타내는 도면이다.

항비만 바이오 한방 혼합 추출물에 따른 3T3-L1 전지방세포주로부터 지방세포로의 분화 억제능을 살펴본 결과는 도 10과 같다. 이는 현미경으로 200배 확대한 지방세포로의 분화를 관찰한 사진으로 대조군인 지방세포의 경우 지방세포로 분화되어 세포모양이 둥글고 큰 지방구를 관찰할 수 있었고 oil red o 염색에 의해 붉게 염색된 것을 관찰할 수 있었다.

반면에 양성대조군인 퀘르세틴 처리군은 지방세포로의 분화가 억제됨을 관찰할 수 있었고, 본 발명에 따른 항비만 바이오 한방 혼합물의 12.5, 25, 50, 100 μg/mL 처리함에 지방세포분화를 억제함을 관찰할 수 있었다.

이러한 지방세포로 분화된 세포를 Oil red O 염색을 한 결과는, 도 11와 같이, adipocyte의 경우와 비교시 preadipocyte의 경우는 10.8%, 퀘르세틴의 경우는 18.1% 지방 축적을 보였다. 본 발명에 따른 항비만 바이오 한방 혼합 추출물의 경우 12.5, 25, 50, 100 μg/mL로 처리한 농도에서는 각각 85.7, 70.1, 75.1, 99.5%의 지방 축적을 보였다. 따라서 12.5, 25, 50 μg/mL 농도에서 농도 의존적이지는 않지만 지방축적 억제효과를 확인할 수 있다.

도 12는 본 발명의 다른 실시예인 항비만 바이오 한방 혼합 추출물의 지방세포 분화 억제능 중 유전자 발현 억제 효과를 나타내는 도면이다.

항비만 바이오 한방 혼합 추출물에 의한 지방 축적 억제 효과가 어떠한 유전자 발현과 관계가 있는지 살펴보기 위해 지방축적 관련 유전자 발현량을 확인하였다. 그 결과는 real-time PCR을 이용하여 aP2, FAS, C/EBPα 유전자 발현량을 측정하여 그 결과는 도 12와 같이 나타났다. aP2의 경우 adipocyte와 비교하였을 때, preadipocyte의 경우는 0.04%, quercetin 처리군의 경우는 12.66%로 나타났으며. 항비만 바이오 한방 혼합 추출물의 경우 25, 50 μg/mL 농도에서 각각 114.0, 59.38%로 나타났음. 따라서 50 μg/mL 농도에서 우수한 aP2 유전자 발현량을 억제하였다.

FAS의 경우 adipocyte와 비교하였을 때, preadipocyte의 경우는 4.9%, quercetin 처리군의 경우는 7.1%로 나타났으며. 7가지 약재 발효 혼합물 에탄올 추출물의 경우 25, 50 μg/mL 농도에서 각각 97.4, 70.7%로 나타났다. 따라서 50 μg/mL 농도에서 우수한 FAS 유전자 발현량을 억제하였음을 알 수 있다.

C/EBPα의 경우 adipocyte와 비교하였을 때, preadipocyte의 경우는 56.6%, quercetin 처리군의 경우는 70.8%로 나타났다. 항비만 바이오 한방 혼합 추출물의 경우 25, 50 μg/mL 농도에서 각각 85.1, 83.0%로 나타났으며. 따라서 50 μg/mL 농도에서 우수한 C/EBPα 유전자 발현량을 억제하였다.

이와 같이 지방축적과 관련된 유전자 즉 aP2, FAS, C/EBPα 유전자 발현량을 비교해 본 결과 항비만 바이오 한방 혼합 추출물 25, 50 μg/mL 농도 처리군 중 50 μg/mL 농도에서 가장 우수한 유전자 발현량 억제를 보였다.

이와 같은 실험결과의 결론으로 본 발명의 일실시예인 항비만 바이오 한방 혼합 추출물은 비만에 대하여 다음과 같은 효능을 확인할 수 있었다.

1) DPPH 라디칼 소거능은 농도 의존적으로 0.25, 0.5, 1.0, 2.0 mg/mL의 농도에서 각각 34.13, 57.19, 89.18, 90.08% 유의적으로 우수한 라디칼 소거능을 보였다.

2) ABTS 양이온 라디칼 소거능은 농도 의존적으로 0.0625, 0.125, 0.25, 0.5 mg/mL의 농도에서 각각 39.96, 49.70, 67.41, 95.70% 유의적으로 우수한 라디칼 소거능을 보였다.

3) FRAP 환원력은 455.78 μM ascorbic acid equivalent/g extract로 나타났다.

4) 총 플라보노이드 함량 및 총폴리페놀 함량은 각각 32.43 μM Quercetin equivalent/g extract, 40.17 μM tannic acid equivalent/g extract로 나타났다.

5) ORAC 가의 경우 대조군에 비해 trolox 0.1 μM은 2.13배, 12.5 μg/mL 농도의 추출물은 1.77배, 25 μg/mL 농도에서는 2.33배, 50 μg/mL 농도에서는 3.49배, 100 μg/mL 농도에서는 4.65배로 fluorescein이 유지되어서 농도 의존적으로 유의적인 산화방지의 효과가 있는 것으로 나타났다.

6) CDA 및 ρ-AV를 분석해본 결과 유지 산화의 안정성이 있는 것으로 나타났다.

7) 따라서 산화방지능이 우수한 추출물의 경우 3T3-L1전지방세포의 지방세포로의 분화를 억제하는 것으로 관찰되었다.

8) Oil red o staining의 결과 adipocyte의 경우와 비교 시 7가지 약재 발효 혼합물 에탄올 추출물의 12.5, 25, 50, 100 μg/mL로 처리한 농도에서는 각각 85.7, 70.1, 75.1, 99.5%의 지방 축적을 보였다. 따라서 12.5, 25, 50 μg/mL 농도에서 지방축적 억제효과를 보였다.

9) aP2, FAS, C/EBPα 유전자 발현량을 비교해본 결과 7가지 약재 발효 혼합물 에탄올 추출물 25, 50, 100 μg/mL 농도 처리군 중 50 μg/mL 농도에서 가장 우수한 유전자 발현량 억제를 보였다. Adipocyte와 비교시 50 μg/mL 농도에서 aP2, FAS, C/EBP 유전자 발현량은 59.4, 70.7 83.%를 보였다.

이와 같은 결과로, 7가지 약재 발효 혼합물 에탄올 추출물은 산화 방지능과 유지 산화 안정성이 우수하였으며, 지방세포분화 억제에 있어서도 지방축적 관련 유전자 감소를 통해 지방축적관련 유용한 소재로써 과학적으로 검증되었고, 항산화 및 비만소재로서의 가능성을 타진할 수 있었다.

Claims

메밀, 둥굴레, 마테, 의이인, 당귀, 구기자 및 천마를 포함하는 원재료를 준비하는 단계;
상기 원재료 중 일부의 각각 대하여 물을 투입하여 저온 추출하여 원재료 추출물을 제조하는 단계;
상기 원재료 중 나머지 부분을 분쇄하여 원재료 분쇄물을 제조하는 단계;
상기 원재료 추출물을 액상 분리시킨 후 배지를 투입하여 영양 원재료 추출물을 제조하는 단계;
상기 영양 원재료 추출물에, 메밀 종균, 둥굴레 종균, 마테 종균, 의이인 종규, 당귀 종균, 구기자 종균, 천마 종균을 투입한 후 발효시켜 발효추출물을 제조하는 단계; 및
상기 발효 추출물을 상기 원재료 분쇄물에 자연 접종시킨후 배양하여 항비만 바이오 한방 혼합 추출물을 완성하는 단계를 포함하는, 항비만 바이오 한방 혼합 추출물 제조 방법.
제 1 항에 있어서,
상기 메밀 60 중량부, 둥굴레 10 중량부, 마테 10 중량부, 의이인 5 중량부, 당귀 5 중량부, 구기자 5 중량부, 천마 5 중량부를 포함하는, 항비만 바이오 한방 혼합 추출물 제조 방법.
제 2 항에 있어서,
상기 메밀 종균, 둥굴레 종균, 마테 종균, 의이인 종규, 당귀 종균, 구기자 종균, 천마 종균은 각각의 재료의 중량부 만큼 포함되는, 항비만 바이오 한방 혼합 추출물 제조 방법.
제 1 항에 있어서,
상기 원재료 추출물을 액상 분리시킨 후 배지를 투입하여 영양 원재료 추출물을 제조하는 단계는,
모스코바도 설탕액 2%, 소이펩톤 0.3%, 혼합미네랄을 포함하는 배지를 투입하여 영양원재료 추출물을 제조하는 단계를 포함하는, 항비만 바이오 한방 혼합 추출물 제조 방법.
제 1 항에 있어서,
상기 발효 추출물을 상기 원재료 분쇄물에 자연 접종시킨후 배양하여 항비만 바이오 한방 혼합 추출물을 완성하는 단계는,
피라미드 구조물내에서 상기 자연접종을 진행하여 상기 항비만 바이오 한방 혼합 추출물을 완성하는 단계를 포함하는, 항비만 바이오 한방 혼합 추출물 제조 방법.
제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 의해 기재된 방법에 의해 제조된 항비민 바이오 한방 혼합 추출물.