KR20200057444A - Erg11 단백질에 특이적으로 결합하는 dna 앱타머 및 이의 용도 - Google Patents

Erg11 단백질에 특이적으로 결합하는 dna 앱타머 및 이의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 ERG11 단백질에 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머 및 이의 용도에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명에 따른 DNA 앱타머는 피부사상균에서 균주의 막투과성을 결정짓는 효소인 ERG11 단백질에 특이적으로 강하게 결합하여 상기 균주의 성장을 억제시킴으로써, 피부사상균의 감염에 의한 질환의 치료, 개선 등의 용도뿐만 아니라, 피부사상균의 검출이나 피부사상균의 감염에 의한 질환의 진단에도 유용하게 사용될 수 있다.

Description

ERG11 단백질에 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머 및 이의 용도{DNA APTAMER SPECIFICALLY BINDING TO ERG11 PROTEIN AND USING THE SAME}
본 발명은 ERG11 단백질에 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머 및 이의 용도에 관한 것이다.
피부사상균(dermatophyte)은 사람을 포함하는 대부분의 동물의 피부, 손발톱, 털, 수염 등 비교적 표층부에 기생하는 진균의 총칭으로 우리나라에서는 피부 진균 또는 피부사상균이라 부른다. 피부사상균은 백선, 무좀, 기계충 등 다양한 증상의 원인균으로서, 서식지에 따라 인간 친화성, 동물 친화성 또는 토양 친화성으로 분류된다. 이중 인간 친화성 사상균은 숙주가 인간으로만 제한되고 가볍고 만성적인 염증을 유발한다. 한편, 동물 친화성 사상균은 주로 동물에서만 발견되며, 동물과 접촉한 사람들에게서 강한 면역반응을 일으킨다. 또한, 토양 친화성 사상균은 보통 토양에서 발견되지만 종종 사람과 동물을 감염시킨다.
이들 피부사상균은 뚜렷한 면역반응을 야기시키지만 감염이 퍼지는 정도가 제한되어 있고, 자발적으로 치료될 수 있다. 불완전균아문(moniliaceae)과의 소포자균(microsporum), 백선균(trichophyton) 및 표피균(epidermophyton)의 3가지 속이 피부사상균에 포함되며, 세계적으로 42종이 상기 3가지 속에 포함되어 있다고 알려져 있다.
피부사상균은 친 케라틴성 진균이라고도 불리는데, 모발, 손발톱 및 표피 각질층 내에 국한하여 침입 및 발육하기 때문이다. 이들 균은 케라틴으로 구성된 부위에서 주로 기생하며, 자신들이 가지고있는 케라틴 분해효소의 작용으로 케라틴을 분해하여 영양원으로 이용한다.
피부사상균이 표피의 각질층, 피부, 손발톱, 털, 수염 등에 기생해서 발생하는 피부질환은, 곰팡이에 의해 발생하는 모든 피부질환을 의미하며 크게 표재성과 심재성으로 나눌 수 있다. 그 종류로는 두부 백선, 안면 백선, 체부 백선, 완선수족부 백선, 손발톱 백선 등이 있다. 수족부 백선은 공중목욕탕이나 수영장 등 사람이 많은 장소에서 환자로부터 떨어져 나온 각질을 통해 감염되고, 완선은 고온다습한 환경과 발한, 비만증, 밀착한 내의와의 기계적 마찰 등이 주요 원인이다.
피부사상균에 의한 감염의 치료는 국소 도포제를 바르는 것이 원칙인데, 손발톱 백선 및 두부 백선 감염부위가 너무 광범위하거나 국소 도포제로 치료가 안되는 경우 항진균제를 복용한다. 현재 톨나프테이트(tolnaftate), 마이코나졸(miconazole), 클로트리마졸(clotrimazole), 테르비나파인(terbinafine) 등이 화합물이 포함된 액제나 크림제가 국소 도포제로서 사용되고 있다. 이와 관련하여, 대한민국 특허등록 제10-0771192호는 티트리 오일의 일종인 렙토스퍼뭄 피터소니 오일(leptospermum petersonii oil)이 피부사상균에 대한 항진균 활성을 나타냄을 개시하고 있다.
한편, 앱타머(aptamer)는 약 1012 내지 1014개 정도의 다양성을 갖는 랜덤 핵산 라이브러리로부터 얻어지는, 특정 표적에 대해 높은 특이성과 친화도를 갖는 단일가닥의 RNA 또는 DNA 분자 구조체를 의미한다. 앱타머는 종래 감지물질로서 사용되는 항체와 달리 열 안정성이 우수하고, 시험관 내(in vitro)에서 합성되어 경제적이며, 표적 물질에 제약이 없어 다양한 표적에 대한 앱타머의 생산이 가능하다는 점에서 유용하다. 따라서, 현재 다양한 표적 물질에 대한 앱타머가 연구 및 제조되고 있으며, 표적 물질과 특이적으로 강한 친화도로 결합하는 앱타머의 특성으로 인해, 신약개발, 약물전달 시스템 및 바이오센서 등에 응용되고 있다.
대한민국 특허등록 제10-0771192호
본 발명의 목적은 ERG11 단백질에 특이적으로 결합하는 특정 염기서열로 구성되는 DNA 앱타머 및 이의 용도를 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1 내지 7로 기재된 염기서열로 구성되는 ERG11(lanosterol 14-α-demethylase) 단백질에 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머를 제공한다.
또한, 본 발명은 본 발명에 따른 DNA 앱타머를 포함하는 약학적 조성물, 피부외용제 및 항균용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 본 발명에 따른 DNA 앱타머를 포함하는 피부사상균의 검출용 조성물 및 키트, 및 상기 조성물을 이용한 피부사상균의 검출방법을 제공한다.
나아가, 본 발명은 본 발명에 따른 DNA 앱타머를 포함하는 피부사상균의 감염에 의한 질환의 진단용 조성물 및 키트, 및 상기 조성물을 이용한 피부사상균의 감염에 의한 질환의 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 DNA 앱타머는 피부사상균에서 균주의 막투과성을 결정짓는 효소인 ERG11 단백질에 특이적으로 강하게 결합하여 상기 균주의 성장을 억제시킴으로써, 피부사상균의 감염에 의한 질환의 치료, 개선 등의 용도뿐만 아니라, 피부사상균의 검출이나 피부사상균의 감염에 의한 질환의 진단에도 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에서 정제된 ERG11 단백질을 SDS-PAGE 방법으로 확인한 결과 도면이다(M: 사이즈 마커, 1: ERG11 단백질을 발현하는 BL21(DE3) 균주의 배양 상층액, 2: ERG11 단백질을 발현하는 BL21(DE3) 균주의 배양 하층액, 3: ERG11 단백질을 발현하는 BL21(DE3) 균주에 0.1 mM의 IPTG를 첨가한 뒤 배양한 배양 상층액, 4: ERG11 단백질을 발현하는 BL21(DE3) 균주에 0.1 mM의 IPTG를 첨가한 뒤 배양한 배양 하층액, 5: ERG11 단백질을 발현하는 BL21(DE3) 균주에 0.5 mM의 IPTG를 첨가한 뒤 배양한 배양 상층액, 6: ERG11 단백질을 발현하는 BL21(DE3) 균주에 0.5 mM의 IPTG를 첨가한 뒤 배양한 배양 하층액, 7: ERG11 단백질을 발현하는 BL21(DE3) 균주에 1 mM의 IPTG를 첨가한 뒤 배양한 배양 상층액, 8: ERG11 단백질을 발현하는 BL21(DE3) 균주에 1 mM의 IPTG를 첨가한 뒤 배양한 배양 하층액).
도 2는 본 발명의 일 실시예에서 증폭 및 정제된 DNA 라이브러리를 아가로스 겔 전기영동으로 확인한 결과 도면이다(M: 사이즈 마커, 1 및 2: PCR 산물, 3 및 4: 정제된 PCR 산물).
도 3은 본 발명의 일 실시예에서 수득된 DNA 앱타머와 ERG11 단백질의 결합력을 SELEX 수행 횟수에 따라 나노드랍 방법으로 확인한 결과 그래프이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에서 선별된 27개의 DNA 앱타머를 이용하여 SELEX를 재수행하고, 수득된 DNA 앱타머와 ERG11 단백질의 결합력을 나노드랍 방법으로 확인한 결과 그래프이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에서 선별된 7개의 DNA 앱타머 구조를 이미지화한 결과 도면이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에서 ERG11 단백질이 코팅된 센서칩 CM5을 이용하여 SPR을 수행하는 과정을 나타내는 모식도이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 서열번호 1 내지 7로 기재된 염기서열로 구성되는 ERG11(lanosterol 14-α-demethylase) 단백질에 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머를 제공한다.
본 명세서에 사용된 용어, "ERG11(lanosterol 14-α-demethylase) 단백질"은 진균의 막투과성을 결정하는데 중요한 역할을 하는 단백질을 의미한다. 상기 ERG11 단백질은 통상의 기술분야에 ERG11 단백질이라고 알려진 모든 서열을 포함할 수 있고, 본 발명의 일 실시예에서, 상기 ERG11 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 8로 기재된 염기서열로 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드일 수 있다. ERG11 단백질은 이의 활성이 억제되면 진균에 존재하는 란노스테롤(lanosterol)이 에르고스테롤(ergosterol)로 전환되는 것을 막음으로써, 진균의 세포막을 파괴시켜 항진균 활성을 나타낼 수 있다.
상기 ERG11 단백질은 피부사상균 유래의 단백질일 수 있고, 구체적으로, 소포자균(microsporum), 백선균(trichophyton) 또는 표피균(epidermophyton) 속의 균주로부터 유래된 단백질일 수 있다. 일례로, 상기 소포자균은 마이크로스포럼 카니스(microsporum canis), 마이크로스포럼 집세움(microsporum gypseum) 및 마이크로스포럼 오두앵(microsporum audouinii) 등을 포함할 수 있다. 또한, 상기 백선균은 트리코피톤 루브럼(trichophyton rubrum), 트리코피톤 멘타그로파이트(trichophyton mentagrophytes), 트리코피톤 인터디지탈리스(trichophyton interdigitalis) 등을 포함할 수 있다. 나아가, 상기 표피균은 에피더모파이톤 플로코섬(epidermophyton floccosum) 등을 포함할 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서, 상기 피부사상균은 트리코피톤 루브럼일 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어, "앱타머(aptamer)"는 특정 물질에 고친화성 및 특이성으로 결합할 수 있는 DNA 핵산분자를 의미한다. 상기 앱타머는 통상의 기술분야에 잘 알려진 방법으로 제조될 수 있고, 상기 방법은 필요에 따라 적절히 변형될 수 있다.
본 발명에 따른 DNA 앱타머는 서열번호 1 내지 7로 기재된 염기서열로 구성될 수 있다. 상기 DNA 앱타머는 ERG11 단백질에 특이적으로 결합하는 특성을 유지하는 한, 상기 서열번호 1 내지 7로 기재된 염기서열과 80% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 97% 이상 또는 99% 이상 상동성을 가질 수 있다.
상기 DNA 앱타머는 표적 물질에 대한 결합성 및 안정성을 높이기 위해, 각 뉴클레오티드의 당 잔기, 구체적으로 리보오스 또는 디옥시리보스가 수식될 수 있다. 상기 수식은 당 잔기의 2'위치, 3'위치 및 4'위치로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 산소 원자를 다른 원자로 치환한 것일 수 있다. 수식의 예로는 플루오로화, O-알킬화, O-알릴화, S-알킬화, S-알릴화, 아미노화 등이 포함될 수 있다. 상기와 같은 당 잔기의 변형은 통상적인 방법으로 수행될 수 있다.
또한, 상기 DNA 앱타머는 표적 물질에 대한 결합성을 높이기 위해, 핵산염기가 변형될 수 있다. 상기 핵산염기의 변형은 5위치의 피리미딘 변형, 6위치의 푸린 변형, 8위치의 푸린 변형, 환외(環外) 아민에서의 변형, 4-티오우리딘으로의 치환, 5-브로모로의 치환 또는 5-요오드-우리실로의 치환 등을 포함할 수 있다.
또한, 상기 DNA 앱타머는 뉴클레아제 및 가수분해효소 등에 대해 내성을 갖도록 인산기가 변형될 수 있다. 예를 들면, 상기 인산기는 티오에이트, 디티오에이트, 아미데이트, 포름아세탈, 3'-아민 등으로 치환될 수 있다. 나아가, 상기 DNA 앱타머는 3' 말단 또는 5' 말단의 변형을 포함할 수 있고, 상기 변형은 캡핑이나, 바이오티닐, 폴리에틸글리콜, 아미노산, 펩티드, 핵산, 뉴클레오시드, 미리스토일(myristoyl), 리소콜릭-올레일(lithocolic-oleyl), 도코사닐(docosanyl), 라우로일(lauroyl), 스테아로일(stearoyl), 팔미토일(palmitoyl), 올레오일(oleoyl), 리놀레오일(linoleoyl), 지질, 스테로이드, 콜레스테롤, 카페인, 비타민, 색소, 형광물질, 항암제, 독소, 효소, 방사성 물질, 비오틴 등이 부가된 것일 수 있다.
또한, 본 발명은 본 발명에 따른 DNA 앱타머를 유효성분으로 함유하는 피부사상균 감염에 의한 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명에 따른 약학적 조성물에 유효성분으로 함유되는 DNA 앱타머는 상술한 바와 같은 특징을 가질 수 있다.
상기 피부사상균 감염에 의한 질환은 두부백선(tinea capitis), 무좀, 손톱진균증 또는 발톱진균증일 수 있고, 본 발명의 일 실시예에서, 상기 질환은 무좀일 수 있다.
상기 약학적 조성물은 약학적 조성물 전체 중량에 대하여 유효성분인 본 발명에 따른 DNA 앱타머를 10 내지 95 중량%로 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 약학적 조성물은 상기 유효성분 외에 추가로 동일 또는 유사한 기능을 나타내는 유효성분을 1종 이상 추가로 함유할 수 있다.
본 발명의 조성물은 또한 생물학적 제제에 통상적으로 사용되는 담체, 희석제, 부형제 또는 둘 이상의 이들의 조합을 포함할 수 있다. 약제학적으로 허용 가능한 담체는 조성물을 생체 내에 전달하는데 적합한 것이면 특별히 제한되지 않으며, 예로서, Merck Index, 13th ed., Merck & Co. Inc. 에 기재된 화합물, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 덱스트로스 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 또는 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합한 것일 수 있다. 이때, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다.
상기 조성물을 제제화할 경우, 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 제조될 수 있다.
본 발명의 조성물은 경구제제 또는 비경구제제로 제형화 될 수 있다. 경구 투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제, 트로키제 등이 포함되며, 이러한 고형 제제는 하나 이상의 조성물에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로스, 락토오스 및 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한, 마그네슘 스티레이트, 탈크 같은 윤활제들도 첨가될 수 있다. 한편, 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제 또는 시럽제 등이 해당되는데, 여기에는 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등과 같은 부형제가 포함될 수 있다.
비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁용제, 유제 등의 주사제가 포함될 수 있다.
비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 조성물은 목적하는 방법에 따라 경구 투여하거나 비경구 투여될수 있으며, 비경구 투여는 피부 외용 또는 복강내 주사, 직장내 주사, 피하주사, 정맥주사, 근육내 주사 또는 흉부내 주사 주입방식중 선택될 수 있다.
본 발명에 따른 조성물은 약제학적으로 유효한 양으로 투여된다. 이는 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물 등에 따라 달라질 수 있다. 본 발명의 조성물은 단독 또는 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있다. 병용 투여시, 투여는 순차적 또는 동시일 수 있다.
그러나, 바람직한 효과를 위해서, 본 발명에 따른 약학적 조성물에 포함되는 유효성분의 양은 0.001 ~ 10,000 mg/㎏, 구체적으로는 0.1 g ~ 5 g/kg 일 수 있다. 상기 투여는 하루에 1회일 수 있고, 수회로 나뉠 수도 있다.
또한, 본 발명은 본 발명에 따른 DNA 앱타머를 유효성분으로 함유하는 피부사상균 감염에 의한 질환의 예방 또는 개선용 피부외용제를 제공한다.
본 발명에 따른 피부외용제에 유효성분으로 함유되는 DNA 앱타머는 상술한 바와 같은 특징을 가질 수 있다. 상기 피부사상균 감염에 의한 질환은 두부백선(tinea capitis), 무좀, 손톱진균증 또는 발톱진균증일 수 있고, 본 발명의 일 실시예에서, 상기 질환은 무좀일 수 있다.
본 발명의 피부외용제는 약학적으로 허용가능한 담체 및 부형제를 포함할 수 있다. 상기 담체 및 부형제는 방부제, 안정화제, 수화제, 유화 촉진제 및 완충제 등을 포함할 수 있다. 구체적으로, 상기 부형제는 유당, 덱스트린, 전분, 만니톨, 소르비톨, 글루코스, 사카로스, 미세결정 셀룰로스, 젤라틴, 폴리비닐피롤리돈 또는 이의 혼합물일 수 있다. 상기 피부외용제는 당업계에 잘 알려진 방법에 따라 적절히 제조될 수 있다. 상기 피부외용제는 파우더, 젤, 연고, 크림, 액체 및 에어로졸의 형태로 제조될 수 있다.
또한, 본 발명은 본 발명에 따른 DNA 앱타머를 유효성분으로 함유하는 피부사상균에 대한 항균용 조성물을 제공한다.
본 발명에 따른 항균용 조성물에 유효성분으로 함유되는 DNA 앱타머는 상술한 바와 같은 특징을 가질 수 있다. 상기 피부사상균 감염에 의한 질환은 두부백선(tinea capitis), 무좀, 손톱진균증 또는 발톱진균증일 수 있고, 본 발명의 일 실시예에서, 상기 질환은 무좀일 수 있다.
또한, 본 발명은 본 발명에 따른 DNA 앱타머를 포함하는 피부사상균의 검출용 조성물 및 상기 검출용 조성물을 포함하는 키트를 제공한다.
상기 DNA 앱타머 및 피부사상균은 상술한 바와 같은 특징을 가질 수 있다.
본 발명에 따른 피부사상균의 검출용 조성물에 포함되는 DNA 앱타머는 발색효소, 형광물질, 방사성 동위원소 또는 콜로이드 등의 검출체로 표지된 접합체일 수 있다. 발색효소는 퍼록시다제, 알칼라인 포스파타제 또는 산성 포스파타제일 수 있고, 형광물질은 티오우레아(FTH), 7-아세톡시쿠마린-3-일, 플루오레신-5-일, 플루오레신-6-일, 2',7'-디클로로플루오레신-5-일, 2',7'-디클로로플루오레신-6-일, 디하이드로 테트라메틸로사민-4-일, 테트라메틸로다민-5-일, 테트라메틸로다민-6-일, 4,4-디플루오로-5,7-디메틸-4-보라-3a,4a-디아자-s-인다센-3-에틸 또는 4,4-디플루오로-5,7-디페닐-4-보라-3a,4a-디아자-s-인다센-3-에틸, Cy3, Cy5, 폴리 L-라이신-플루오레세인 이소티오시아네이트(FITC), 로다민-B-이소티오시아네이트(RITC), PE(Phycoerythrin) 또는 로다민일 수 있다.
또한, 상기 DNA 앱타머는 상기 DNA 앱타머에 특이적으로 결합할 수 있는 리간드를 포함할 수 있다. 상기 리간드는 발색효소, 형광물질, 방사성 동위원소 또는 콜로이드 등의 검출체로 표지된 접합체, 및 스트렙타비딘 또는 아비딘이 처리된 리간드일 수 있다. 본 발명의 검출용 조성물은 상기 서술한 바와 같은 시약 외에도 이들의 구조를 안정하게 유지시키는 증류수 또는 완충액을 더 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 검출용 조성물을 포함하는 키트는 이에 포함되는 DNA 앱타머의 세척이나 복합체의 분리 등과 같은 이후 단계를 용이하게 하기 위해 고형 기질에 결합될 수 있다. 이때, 고형 기질로는 합성수지, 니트로셀룰로오스, 유리기판, 금속기판, 유리섬유, 미세구체 또는 미세비드가 사용될 수 있다. 또한, 합성수지로는 폴리에스터, 폴리염화비닐, 폴리스티렌, 폴리프로필렌, PVDF 또는 나일론 등이 사용될 수 있다.
또한, 상기 키트는 당업자에게 알려진 종래의 제조방법에 의해 제조될 수 있으며, 버퍼, 안정화제, 불활성 단백질 등을 더 포함할 수 있다. 상기 키트는 시약의 양을 탐색하기 위해 검출체로서 부착된 형광물질의 형광을 검출함으로써 수행되는 형광법 또는 검출체로서 부착된 방사선 동위원소의 방사선을 검출함으로써 수행되는 방사선법을 통한 초고속 스크리닝(high throughput screening, HTS) 시스템, 검출체의 표지 없이 표면의 플라즈몬 공명 변화를 실시간으로 측정하는 SPR(surface plasmon resonance) 방법 또는 SPR 시스템을 영상화하여 확인하는 SPRI(surface plasmon resonance imaging) 방법을 이용할 수 있다.
또한, 본 발명은 본 발명에 따른 검출용 조성물을 시료와 반응시키는 단계를 포함하는 피부사상균의 검출방법을 제공한다.
상기 DNA 앱타머 및 피부사상균은 상술한 바와 같은 특징을 가질 수 있다. 또한, 상기 시료는 피부사상균을 검출하고자 하는 시료라면 모든 시료를 포함할 수 있다. 또한, 상기 시료는 음이온 교환 크로마토그래피, 친화도 크로마토그래피, 크기별 배제 크로마토그래피, 액체 크로마토그래피, 연속추출, 원심분리 또는 젤 전기영동 등의 방법을 이용하여 전처리될 수 있다.
또한, 본 발명은 본 발명에 따른 DNA 앱타머를 포함하는 피부사상균 감염에 의한 질환 진단용 조성물 및 상기 진단용 조성물을 포함하는 키트를 제공한다.
상기 DNA 앱타머 및 피부사상균은 상술한 바와 같은 특징을 가질 수 있다. 또한, 상기 DNA 앱타머를 포함하는 진단용 조성물 및 키트는 상술한 바와 같은 특징을 가질 수 있다.
나아가, 본 발명은 본 발명에 따른 진단용 조성물을 시료와 반응시키는 단계를 포함하는 피부사상균 감염에 의한 질환의 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.
상기 DNA 앱타머 및 피부사상균은 상술한 바와 같은 특징을 가질 수 있다. 또한, 상기 시료는 피부사상균을 검출하고자 하는 생체 시료라면 모든 시료를 포함할 수 있고, 구체적으로 모발, 손발톱 및 표피 각질층 등일 수 있다.
이하, 본 발명을 하기 실시예에 의해 상세히 설명한다, 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 이들에 의해 본 발명이 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 청구범위에 기재된 기술적 사상과 실질적으로 동일한 구성을 갖고 동일한 작용 효과를 이루는 것은 어떠한 것이라도 본 발명의 기술적 범위에 포함된다.
실시예 1. 트리코피톤 루브럼 균주의 ERG11 단백질 정제
트리코피톤 루브럼(trichophyton rubrum) 균주의 ERG11(lanosterol 14-α-demethylase) 단백질에 대한 앱타머를 제작하기 위해, NCBI 웹페이지(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)에서 얻은 서열정보를 기초로 ERG11 단백질(서열번호 8)을 다음과 같은 방법으로 정제하였다.
1-1. ERG11 유전자의 클로닝
먼저, ERG11 유전자에 대한 정방향 프라이머(서열번호 9: 5'-CGGGAATTCGTCGCCGCCAAGATGA-3') 및 역방향 프라이머(서열번호 10: 5'-CCGCTCGAGTCAGAAATAGGGCAGC-3')를 바이오니아 사(한국)에 의뢰하여 제작하였다. 1 ㎕의 주형 DNA, 5 ㎕의 10x PCR 완충용액, 4 ㎕의 2.5 mM dNTP 혼합물, 2 ㎕의 25 μM 정방향 프라이머, 2 ㎕의 25 μM 역방향 프라이머, 0.3 ㎕의 ExTaq 중합효소(Takara, 일본)(1 unit/㎕) 및 35.7 ㎕의 증류수를 혼합하여 PCR 반응물을 준비하였다. 준비된 반응물을 하기 표 1에 기재된 바와 같은 조건으로 PCR을 수행하였다. 수득된 PCR 산물을 EcoRI 및 XhoI 제한효소로 절단하여 pET21a 발현벡터에 클로닝하였다.
초기 변성 단계 94℃, 5분 1회
변성 단계 94℃, 30초 30회
어닐링(annealing) 단계 64℃, 30초
연신(elongation) 단계 72℃, 30초
후기 연신 단계 72℃, 5분 1회
1-2. ERG11 단백질의 발현 및 정제
실시예 1-1에서 제조된 ERG11 단백질을 발현하는 pET21a 발현벡터를 BL21(DE3) 균주에 전기천공법(electroporation)을 이용하여 형질전환하고, 암피실린(ampicillin)이 포함된 배지에서 성장하는 콜로니를 선별하였다.
선별된 콜로니를 50 ㎍/㎖의 암피실린이 포함된 LB 배지(0.5% 효모 추출물, 1% 박토-트립톤, 1% NaCl)에 접종하여 12시간 이상 종균 배양하였다. 상기 종균 배양액을 전체 배양 배지 부피의 1%가 되도록 접종하고, 18℃에서 180 rpm의 조건으로 OD600 값이 0.6에 도달할때까지 배양하였다. 배양 후, 0.1, 0.5 또는 1 mM의 IPTG(isopropylthio-β-D-galactoside)를 첨가하고, 18℃에서 200 rpm의 조건으로 더 배양하였다. 20시간 후, 세포 배양액을 4℃에서 8,000 rpm으로 10분 동안 원심분리하여 펠렛을 취하고, 이를 1x PBS에 재현탁하여 동일한 조건으로 원심분리하였다. 수득된 펠렛에 1x PBS를 첨가하여 세포를 재현탁하고, 초음파 분쇄기를 사용하여 세포를 용해시켰다. 용해된 세포를 4℃에서 8,000 rpm으로 10분 동안 원심분리하여 상층액 및 펠렛을 각각 수득하였다. 수득된 상층액 및 펠렛을 이용하여 12% SDS-PAGE 분석을 수행한 결과를 도 1에 나타내었다.
도 1에 나타난 바와 같이, 1 mM의 IPTG를 첨가한 경우가 가장 ERG11 단백질의 발현이 높았으며, 상기 조건으로 세포를 배양하여 ERG11 단백질을 정제하였다. 정제는 상기 기재된 바와 동일한 방법 및 조건으로 배양된 세포를 원심분리하고, 수득된 상층액으로부터 Ni-NTA 아가로스 레진을 이용하여 ERG11 단백질을 통상적인 방법으로 정제하였다. 정제된 ERG11 단백질을 1x PBS 완충액으로 3회 투석하고 단백질 농축키트(Sartorius stedim, 독일)로 농축하여 보관하였다.
실시예 2. DNA 앱타머의 제작
EGR11 단백질에 특이적으로 결합하는 앱타머를 선별하기 위해, 먼저 하기 기재된 바와 같이 DNA 앱타머를 제작하였다.
2-1. 랜덤 DNA 라이브러리의 증폭
먼저, dA:dG:dC:dT가 1.5:1.15:1.25:1의 비율로 포함된 40개의 랜덤 염기서열(N40)을 포함하는 76 bp 크기의 주형 DNA(서열번호 11: 5'-ATACCAGCTTATTCAATTN40AGATTGCACTTACTATCT-3')와 이에 대한 정방향 프라이머(서열번호 12: 5'-ATACCAGCTTATTCAATT-3') 및 5'-말단에 바이오티닐화된(biotinylated) 역방향 프라이머(서열번호 13: 5'-AGATTGCACTTACTATCT-3')를 바이오니아 사(한국)에 주문제작하였다. 1 ㎕의 주형 DNA, 5 ㎕의 10x PCR 완충용액, 4 ㎕의 2.5 mM dNTP 혼합물, 2 ㎕의 25 μM 정방향 프라이머, 2 ㎕의 25 μM 역방향 프라이머 또는 바이오티닐화된 역방향 프라이머, 0.3 ㎕의 ExTaq 중합효소(Takara, 일본)(1 unit/㎕), 및 35.7 ㎕의 증류수를 혼합하여 PCR 반응물을 준비하였다. 준비된 반응물을 하기 표 2에 기재된 바와 같은 조건으로 PCR을 수행하였다. 수득된 PCR 산물을 2% 아가로스 겔 전기영동을 통해 확인하고, 그 결과를 도 2A에 나타내었다. 또한, 상기 PCR 산물을 PCR 정제키트(Qiagen, 미국)를 사용하여 수득된 결과를 도 2B에 나타내었다.
초기 변성 단계 94℃, 5분 1회
변성 단계 94℃, 30초 20회
어닐링(annealing) 단계 52℃, 30초
연신(elongation) 단계 72℃, 30초
후기 연신 단계 72℃, 5분 1회
도 2에 나타난 바와 같이, 76 bp 크기의 PCR 산물이 증폭 및 정제된 것을 확인하였다.
2-2. 단일가닥 DNA의 준비
상기 수득된 76 bp 크기의 PCR 산물로부터 DNA 앱타머를 제조하기 위해 단일가닥 DNA(single-strand DNA, ssDNA)를 다음과 같은 방법으로 준비하였다.
먼저, 실시예 2-1에서 정제된 PCR 산물의 총 부피가 100 ㎕가 되도록 증류수를 첨가하였다. 증류수가 첨가된 PCR 산물을 85℃에서 5분 동안 반응시켜 이중가닥 DNA(double-strand DNA, dsDNA)를 ssDNA로 변성시킨 후, 이를 4℃로 냉각하여 ssDNA를 수득하였다. 수득된 ssDNA로부터 비오틴(biotin)이 결합된 ssDNA 및 프라이머를 제거하고, 정방향의 ssDNA를 수득하였다.
구체적으로, 수득된 100 ㎕의 ssDNA에 50 ㎕의 스트렙타비딘(streptavidin, Pierce, 미국)을 첨가하여 상온에서 1시간 동안 반응시켰다. 이후, 상기 반응액을 4℃, 13,000 rpm의 조건하에서 15분 동안 원심분리하고, 상층액만을 취하였다. 상층액에 동일 부피의 PCI(페놀:클로로폼:이소아밀알콜=25:24:1) 용액을 첨가하고, 다시 4℃, 13,000 rpm의 조건하에서 15분 동안 원심분리하였다. 원심분리 후, 상층액을 취하여, 여기에 상층액의 1/100 부피에 해당하는 tRNA(sigma aldrich, 미국), 상층액의 1/10 부피에 해당하는 3 M 소듐 아세테이트(sodium acetate, pH 4.5), 및 상층액의 3배 부피에 해당하는 100% 에탄올을 첨가하였다. 이를 -70℃에서 1시간 이상 반응시키고, 다시 4℃, 13,000 rpm의 조건하에서 20분 동안 원심분리하였다. 원심분리 후, 펠렛을 65℃에서 건조시키고, 건조된 펠렛에 50 ㎕의 증류수를 첨가하여 ssDNA를 수득하였다. 수득된 ssDNA를 10% 아크릴아마이드 겔에 전기영동하여 76 bp 크기의 ssDNA가 수득된 것을 확인하였다.
2-3. 3차원 구조의 DNA 앱타머 제작
실시예 2-2에서 수득된 50 ㎕의 ssDNA에 50 ㎕의 20 mM PBS 완충액(pH 7.4)을 첨가하였다. 상기 혼합물을 85℃에서 5분 동안 끓여 변성시킨 후, 상온에서 1시간 이상 방치하여 서서히 식힘으로써, ssDNA로부터 3차원 구조의 DNA 앱타머를 제작하였다.
실시예 3. ERG11 단백질에 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머의 선별
3-1. ERG11 단백질에 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머의 선별
ERG11 단백질과 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머를 SELEX 기법을 이용하여 선별하였다.
구체적으로, 실시예 2-3에서 제작된 DNA 앱타머에 10 ㎕의 실시예 1-2에서 정제된 ERG11 단백질을 첨가하여 4℃에서 12시간 동안 반응시켜 준비하였다. 한편, 200 ㎕의 Ni-NTA 아가로즈 레진에 1x His 결합 완충액(5 mM 이미다졸, 500 mM NaCl, 20 mM Tris-HCl(pH7.9))을 첨가하고 교반하였다. 상기 교반물을 4℃에서 13,000 rpm의 조건하에서 10분 동안 원심분리하여 상층액을 제거하고, 활성화된 Ni-NTA 아가로즈 레진을 얻었다. 활성화된 Ni-NTA 아가로즈 레진에 상기 준비된 DNA 앱타머 및 ERG11 단백질 반응물을 첨가하고, 4℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 1시간 후, 결합하지 않은 DNA 앱타머를 1x His 결합 완충액으로 3회 세척하고, 200 ㎕의 1x DNA 앱타머 용출 완충액(1 M 이미다졸, 500 mM NaCl, 20 mM Tris-HCl(pH 7.9))을 첨가한 뒤, 이를 85℃에서 5분 동안 끓여 변성시켰다. 4℃에서 13,000 rpm의 조건 하에서 10분 동안 원심분리하여 변성된 DNA 앱타머를 수득하였고, 이는 2회 수행되었다. 이후, 얻어진 펠렛에 PCI 용액 및 에탄올 침전법을 수행하여 최종적으로 50 ㎕의 증류수에 현탁된 DNA 앱타머를 회수하였다.
3-2. 비특이적으로 결합하는 DNA 앱타머의 제거
ERG11 단백질이 아닌 Ni-NTA 아가로즈 레진에 결합하는 비특이적 DNA 앱타머를 제거하는 동시에 ERG11 단백질에 결합하는 DNA 앱타머의 특이성을 향상시키기 위해 다음과 같은 실험을 수행하였다.
먼저, 실시예 3-1에서 수득된 DNA 앱타머를 이용하여, 실시예 3-1의 과정을 6회 반복하여 특이성이 향상된 DNA 앱타머를 선별하였다. 선별된 DNA 앱타머를 이용하여 ERG11 단백질이 결합되지 않은 Ni-NTA 아가로즈 레진에 결합하는 DNA 앱타머를 선별하는 네가티브 SELEX(negative SELEX)을 수행하였다. 실험은 ERG11 단백질 및 Ni-NTA 아가로즈 레진을 함께 첨가하는 것 대신 활성화된 Ni-NTA 아가로즈 레진만을 사용한 것을 제외하고는 실시예 3-1과 동일한 조건 및 방법으로 수행되었다. 이때, DNA 앱타머는 Ni-NTA 아가로즈 레진에 결합하지 않는 앱타머만을 수득하였다. 수득된 앱타머를 이용하여, 실시예 3-1의 과정을 4회 더 반복하여 총 10회의 SELEX를 수행함으로써 최종적으로 ERG11 단백질에 특이적으로 결합하는 앱타머를 수득하였다.
실시예 4. DNA 앱타머의 친화성 확인
4-1. 나노드랍 방법을 이용한 친화성 확인
10회의 SELEX를 통해 각 라운드에서 수득된 DNA 앱타머의 ERG11 단백질에 대한 친화성을 나노드랍 방법으로 확인하였다.
구체적으로, 실시예 3에서 각 회별로 수득된 DNA 앱타머 샘플의 농도를 나노드롭(Nanodrop 2000 Micro spectrophotometer, Thermo scientific)을 이용하여 제조사의 프로토콜에 따라 측정하였다.
그 결과, 도 3에 나타난 바와 같이, 9회에 수득된 DNA 앱타머의 농도가 812.7 ng/㎕로 가장 높았으며, 8회 및 10회에 수득된 DNA 앱타머의 농도는 각각 775.7 ng/㎕와 754.2 ng/㎕였다. 따라서, 상기로부터 SELEX를 9회 수행한 뒤 수득된 DNA 앱타머 풀(pool)이 ERG11 단백질과 가장 특이적으로 결합함을 알 수 있었다.
4-2. 실시간 PCR 방법을 이용한 친화성 확인
10회의 SELEX를 통해 각 라운드에서 수득된 DNA 앱타머의 ERG11 단백질에 대한 친화성을 실시간 PCR 방법으로 확인하였다.
먼저, 실시예 2-2에서 준비된 ssDNA와 8회, 9회 및 10회 SELEX를 수행한 뒤 수득된 ssDNA 형태의 DNA 앱타머를 실시예 2-1에 기재된 바와 같은 방법 및 조건으로 PCR을 수행하였다. 수득된 PCR 산물을 이용하여 실시예 2-2에 기재된 바와 같은 방법 및 조건으로 ssDNA를 수득하고, 이의 농도를 통상적인 방법으로 측정하여 동일한 농도로 준비하였다. 실시예 2-3에서 제작된 DNA 앱타머 대신 상기 준비된 ssDNA를 사용한 것을 제외하고는, 실시예 3-1과 동일한 조건 및 방법으로 SELEX를 1회 수행하였다. 수득된 DNA 앱타머에, 이의 1/100 부피의 tRNA, 이의 1/10 부피의 3 M 소듐 아세테이트(pH 4.5) 및 이의 3 부피의 100% 에탄올을 첨가하여 -70℃에서 1시간 이상 반응시켰다. 반응이 끝난 후, 반응물을 원심분리하여 수득된 펠렛을 85℃에서 건조시키고, 50 ㎕의 증류수에 현탁하고, 100, 10-1 및 10-2로 단계희석하여 실시간 PCR을 위한 주형으로서 준비하였다. 준비된 주형을 이용하여 iQ SYBR 그린 수퍼믹스(iQ SYBR Green Supermix, Bio-rad, 미국)를 사용하여 제조사의 프로토콜에 따라 실시간 PCR을 하기 표 3에 기재된 바와 같이 수행하였다.
초기 변성 단계 94℃, 5분 1회
변성 단계 94℃, 20초 30회
어닐링(annealing) 단계 52℃, 20초
연신(elongation) 단계 72℃, 20초
후기 연신 단계 72℃, 5분 1회
그 결과, 주형 DNA를 10-2로 희석한 샘플에서 PCR 산물이 검출되었으며, SELEX를 8회, 9회 및 10회 수행하여 수득된 DNA 앱타머에 대한 PCR 효율은 각각 78.77%, 86.88% 및 81.06%였다. 즉, 상기로부터 SELEX를 9회 수행한 뒤 수득된 DNA 앱타머 풀(pool)이 ERG11 단백질과 가장 특이적으로 결합함을 알 수 있었다.
실시예 5. DNA 앱타머의 서열 확인
상기에서 ERG11 단백질과 가장 친화성을 높은것으로 확인된 9회의 SELEX 수득을 통해 얻은 DNA 앱타머의 서열을 다음과 같은 방법으로 확인하였다.
먼저, 상기 실시예 3에서 SELEX를 9회 수행하여 수득된 DNA 앱타머를 주형으로 정방향 프라이머(서열번호 14: 5'-ATACCAGCTTATTCAATT-3') 및 역방향 프라이머(서열번호 15: 5'-AGATTGCACTTACTATCT-3')를 이용하여 PCR을 수행하였다. PCR 결과 이중가닥 형태의 DNA를 수득하였고, 수득된 dsDNA는 T-블런트 클로닝 키트(SolGent, 한국)를 이용하여 제조사의 프로토콜에 따라 T-벡터에 클로닝되었다.
구체적으로, 1 ㎕의 T-벡터(10 ng/㎕), 4 ㎕의 PCR 산물(20 ng/㎕) 및 1 ㎕의 6x T-블런트 완충액을 25℃에서 5분 동안 반응시켰다. 반응 후, 6 ㎕의 반응물을 100 ㎕의 DH5α 수용성 균주와 혼합하고, 42℃에서 30초 동안 열충격을 가해 형질전환시켰다. 이를 2분 동안 얼음에 방치하고, 900 ㎕의 SOC 배지(2% 트립톤, 0.5% 효모 추출물, 10 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 10 mM MgCl2, 10 mM MgSO4 및 20 mM 글루코스)를 첨가하여 37℃에서 1시간 동안 배양하였다. 200 ㎕의 배양액을 암피실린(Sigma Aldrich, 미국), 카나마이신(Sigma Aldrich, 미국), X-갈(X-gal, Sigma Aldrich, 미국) 및 IPTG(Thermo Scientific, 미국)가 포함된 LB 배양 플레이트에 스프레딩하였다. 이를 37℃에서 15시간 배양한 뒤, 생성된 콜로니 중 흰색 콜로니만 50개 선별하여 통상적인 방법으로 DNA를 추출하고, 그 염기서열을 Solgent(한국) 사에 의뢰하여 확인하였다. 그 결과, 중복되지 않은 27개의 DNA 앱타머를 수득하였다.
실시예 6. ERG11 단백질에 대한 DNA 앱타머의 친화성 확인
27개의 DNA 앱타머의 ERG11 단백질에 대한 친화성을 나노드랍 방법으로 확인하였다. 구체적으로, 실시예 5에서 서열이 확인된 27개의 DNA 앱타머를 실시예 2-3과 동일한 조건 및 방법으로 3차원 구조로 제작한 뒤, 실시예 3-1과 동일한 조건 및 방법으로 SELEX를 수행하여 DNA 앱타머를 수득하였다. 수득된 DNA 앱타머를 실시예 4-1과 동일한 조건 및 방법으로 나노드랍을 수행하였고, 그 결과를 도 4에 나타내었다.
도 4에 나타낸 바와 같이, 총 27개의 DNA 앱타머 중 ERG11 단백질에 높은 친화력으로 결합하는 7개의 앱타머를 최종적으로 선별하였고, 선별된 DNA 앱타머의 서열을 하기 표 4에 나타내었다.
클론 서열 서열번호
Tr1 TCGACTATTGACTAAGAACGGCCGTTCCGGCTGGTAGTTC 서열번호 1
Tr4 TCGGAAACTAACTAGTGAGGGGATACCGTTGGAGCAATTT 서열번호 2
Tr7 CCAGTGACATTATAAGGAGAACGTTCTGTATCTATAGGCA 서열번호 3
Tr12 CGGTCATTCGGTAGGAATTATGACGCTTATCTCGTCTTTC 서열번호 4
Tr15 ACATTCGACAGTGTAAATTTACATCAGGGGTCTTTAGATG 서열번호 5
Tr20 CGGAACATGTTTTTCAGATATGGAGTTAACCTACAAGGAG 서열번호 6
Tr25 CGTGCCCCGTGCTTGTAATTGCTCGGAGGTAATATGTGCG 서열번호 7
실시예 7. DNA 앱타머의 구조 확인
실시예 6에서 최종 선별된 DNA 앱타머의 구조를 DNA mfold 프로그램(Rensselear polytechnic institute)을 이용하여 이미지화한 결과를 도 5에 나타내었다.
실험예 1. ERG11 단백질에 대한 DNA 앱타머의 친화력 확인
1-1. ERG11 단백질 코팅 센서 칩의 제작
표면 플라즈마 공명(surface plasmon resonance, SPR) 실험을 통해 선별된 DNA 앱타머의 결합력을 정량적으로 확인하기 위해 ERG11 단백질이 코팅된 센서 칩을 다음과 같은 방법으로 제작하였다.
먼저, 카르복실기로 표면이 코팅된 센서 칩 CM5(GE healthcare, 영국)에 0.1 M NHS(Nhydroxysuccinimide) 및 0.4 M EDC(N-ethyl-N'(dimethylaminopropyl) carbodiimide)가 혼합된 혼합액을 5 ㎕/min의 속도로 흘려주어 표면의 카르복실기를 활성화시켰다. 카르복실기가 활성화된 센서 칩 CM5의 표면에, 60 ㎍/㎖ 농도의 ERG11 단백질을 포함하는 10 mM 아세트산 나트륨(pH 4.5) 용액을 5 ㎕/min의 속도로 10분 동안 처리하였다. ERG11 단백질이 코팅된 센서 칩 CM5에 1 M 에탄올아민 하이드로클로라이드(pH 8.5)를 5 ㎕/min의 속도로 10분 동안 흘려주어 표면의 활성화된 카르복실기를 불활성화시켰다. 그 결과, 표면에 ERG11 단백질이 코팅된 센서 칩 CM5를 제작하였다.
1-2. DNA 앱타머의 친화력 확인
상기 선별된 DNA 앱타머의 ERG11 단백질에 대한 친화력을 SPR 방법을 이용하여 정량적으로 확인하였다(도 6).
먼저, 실시예 6에서 선별된 서열번호 1 내지 7로 기재되는 염기서열로 구성된 DNA 앱타머를 HBS-EP 완충액(GE Healthcare, BR-1001-88)에 100, 300 또는 500 nM의 농도가 되도록 희석하여 준비하였다. 실험은 BIAcore 3000(BIACORE)을 사용하여 제조사의 프로토콜에 따라 수행되었으며, 실험예 1-1에서 제작된 ERG11 단백질이 코팅된 센서 칩 CM5에 대한 DNA 앱타머의 결합력과 아무것도 코팅되지 않은 센서 칩 CM5에 대한 DNA 앱타머의 결합력 차이를 확인하였다. 이때, 속도 변수는 BIA 평가프로그램(BIACORE)을 이용하여 수득 및 정량하였고, 각 실험 후, 센서 칩은 1 M NaCl 및 50 mM NaOH 완충액을 이용하여 재생시켰다. 그 결과, DNA 앱타머의 ERG11 단백질에 대한 친화력을 하기 표 5에 해리 상수(KD) 값으로 나타내었다.
클론 KD(M)
Tr1 5.11×10-9
Tr4 8.15×10-11
Tr7 1.02×10-11
Tr12 2.15×10-10
Tr15 3.72×10-10
Tr20 9.38×10-9
Tr25 1.20×10-10
상기 표 5에 나타난 바와 같이, 선별된 7개의 DNA 앱타머는 모두 ERG11 단백질과 높은 결합력으로 결합하였고, 특히 Tr7의 앱타머의 해리상수가 1.02×10-11 M으로 가장 높았다.
<110> Chungbuk National University Industry-Academic Cooperation Foundation <120> DNA APTAMER SPECIFICALLY BINDING TO ERG11 PROTEIN AND USING THE SAME <130> DP-2018-0320-KR <160> 15 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Tr1 DNA aptamer <400> 1 tcgactattg actaagaacg gccgttccgg ctggtagttc 40 <210> 2 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Tr4 DNA aptamer <400> 2 tcggaaacta actagtgagg ggataccgtt ggagcaattt 40 <210> 3 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Tr7 DNA aptamer <400> 3 ccagtgacat tataaggaga acgttctgta tctataggca 40 <210> 4 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Tr12 DNA aptamer <400> 4 cggtcattcg gtaggaatta tgacgcttat ctcgtctttc 40 <210> 5 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Tr15 DNA aptamer <400> 5 acattcgaca gtgtaaattt acatcagggg tctttagatg 40 <210> 6 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Tr20 DNA aptamer <400> 6 cggaacatgt ttttcagata tggagttaac ctacaaggag 40 <210> 7 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Tr25 DNA aptamer <400> 7 cgtgccccgt gcttgtaatt gctcggaggt aatatgtgcg 40 <210> 8 <211> 1785 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ERG11 gene <400> 8 atgggcctct tagccgacat tgtctctcgt ttctgcgaga actgctcgac cctgtccacc 60 gccgcgctcg tcgcaagtgc catatcggct tttatcgtcc tctccattgt tatcaacgtc 120 ctgcagcagc tcctgttcaa ggaccctaca aagcctccgg tggtcttcca ctggtttccg 180 ataattggaa gcacgatctc ctatggaatt gacccataca agttctttga cgactgcaag 240 gagaaggttg gtggtggaaa tcaactagct ataccagaag aatgcgcaaa gctaacatat 300 agataattac ggtattctag tatggagata tcttcacatt catactcctg ggcaagaaga 360 cgactgtttt ccttggtaca aagggaaacg atttcatttt gaacggcaag ctcaaggatg 420 tttgcgcaga ggatgtctac tcccctctca ccaccccagt gttcggacga catgtggtgt 480 atgattgccc aaattccaag ctcatggagc agaagaaggt gtgtacggca atttattttt 540 gtctcaacct cctggctgtc cattgctaat ttaatcgcct gctagttcgt caagttcggc 600 ctcacctctg aagctcttcg atcctatgtc accctgatca ccaaagaagt cgagcagttc 660 ttcgagtcct ctcccatctt caagggcgac tccggagttt tcaatgtcag caaggttatg 720 gctgaaatca ccatctacac cgcctctcga tctctacagg gcaaggaagt gcgcggaaag 780 ttcgattcca gctttgcaga actctactcc gatctcgaca tgggcttcgc tgccatcaac 840 ttcatgttcc catggttccc cttcccacac aaccgcaagc gcgaccgtgc tcaaaggaag 900 atggcccagg tttacaccga catcatccgt cagcgacgtg cggctggcgg agagaaagac 960 tccgaggaca tggtatggaa cttgatgtcg tccgtgtaca agaatggaac gccaattcca 1020 gatatcgagg ttgcccacat gatgattgcc ctacttatgg ccggccaaca ctcttcttcc 1080 tccaccggct cctggatcgt tctccgcctt gccagccgtc cagatattct cgaggagctc 1140 tacgaggaac agaaacgtgt tctcggcgag gatcttccac cactcaccta cgaagctctt 1200 cagaaactcg accttcacaa caatgtaatc aaggagactc tccgccttca cgctccaatc 1260 cactccatcc tccgtgctgt caaatcccct atgcccgttg aagggaccaa ctatgttgtc 1320 ccaacctctc acaacctcct tgccgctcct ggtgttccct cacgagaccc tcagtacttc 1380 cctgaccccc tggtctggaa ccctcaccga tgggagaaca acgttggtgt caccgtagtc 1440 gaggccagtg aagaaaagac agattacgga tacggtttgg ttagcaaggg tgccaacagt 1500 ccttacctcc cattcggctc aggcagacac agatgtatcg gtgaacaatt tgcatatgtt 1560 cagcttggaa ccgtaacagc tacgctagcc agactaatga gatggaagca agttgaaggc 1620 accaaagatg ttgtgccgcc aactgactat tcggtaagtt tggcatatta cgctccttta 1680 tcccgctcga ttttactaac tttccattaa tagtccctct tctcgaagcc atttggcaac 1740 ccaatggtct cgtgggagaa acgaaagcag gcttctcaga aatga 1785 <210> 9 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for ERG11 gene <400> 9 cgggaattcg tcgccgccaa gatga 25 <210> 10 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for ERG11 gene <400> 10 ccgctcgagt cagaaatagg gcagc 25 <210> 11 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> template DNA <400> 11 ataccagctt attcaattna gattgcactt actatct 37 <210> 12 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for template DNA <400> 12 ataccagctt attcaatt 18 <210> 13 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for template DNA <400> 13 agattgcact tactatct 18 <210> 14 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for SELEX <400> 14 ataccagctt attcaatt 18 <210> 15 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for SELEX <400> 15 agattgcact tactatct 18

Claims (13)

  1. 서열번호 1 내지 7로 기재된 염기서열로 구성되는 ERG11(lanosterol 14-α-demethylase) 단백질에 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머.
  2. 제1항에 있어서, 상기 ERG11 단백질은 피부사상균(dermatophyte) 유래 단백질인, DNA 앱타머.
  3. 제2항에 있어서, 상기 피부사상균은 트리코피톤 루브럼(trichophyton rubrum)인, DNA 앱타머.
  4. 제1항의 DNA 앱타머를 유효성분으로 함유하는 피부사상균 감염에 의한 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  5. 제4항에 있어서, 상기 피부사상균 감염에 의한 질환은 두부백선(tinea capitis), 무좀, 손톱진균증 또는 발톱진균증인, 피부사상균 감염에 의한 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  6. 제1항의 DNA 앱타머를 유효성분으로 함유하는 피부사상균 감염에 의한 질환의 예방 또는 개선용 피부외용제.
  7. 제1항의 DNA 앱타머를 유효성분으로 함유하는 피부사상균에 대한 항균용 조성물.
  8. 제1항의 DNA 앱타머를 포함하는 피부사상균의 검출용 조성물.
  9. 제8항의 검출용 조성물을 포함하는 피부사상균의 검출용 키트.
  10. 제8항의 검출용 조성물을 시료와 반응시키는 단계를 포함하는 피부사상균의 검출방법.
  11. 제1항의 DNA 앱타머를 포함하는 피부사상균 감염에 의한 질환 진단용 조성물.
  12. 제11항의 진단용 조성물을 포함하는 피부사상균 감염에 의한 질환 진단용 키트.
  13. 제11항의 진단용 조성물을 시료와 반응시키는 단계를 포함하는 피부사상균 감염에 의한 질환의 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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EP1235935B1 (en) * 1999-12-03 2007-03-21 Rosetta Inpharmactis LLC. Targeted methods of drug screening using co-culture methods
KR100771192B1 (ko) 2005-07-29 2007-10-30 재단법인서울대학교산학협력재단 티트리 오일을 함유하는 피부사상균용 항진균제

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