KR20200056429A - 레트로바이러스 벡터 - Google Patents

Abstract

본 발명은 레트로바이러스 패키징 벡터의 생산에서의 용도를 위한 바이러스 유전자 또는 이의 유도체를 포함하는 핵산 분자, 및 레트로바이러스 패키징 및 생산자 세포주에 관한 것이다. 일 구현예에서, 상기 핵산 분자는 env 및 gag-pol 유전자의 코딩 서열이 반대 방향으로 있는 env 및 gag-pol 유전자를 포함한다.

Description

레트로바이러스 벡터

본 발명은 레트로바이러스 패키징 벡터(retroviral packaging vector)의 생산에서의 용도를 위한 바이러스 유전자 또는 이의 유도체를 포함하는 핵산 분자, 및 레트로바이러스 패키징 및 생산자 세포주(producer cell line)에 관한 것이다. 일 구현예에서, 상기 핵산 분자는 env 및 gag-pol 유전자의 코딩(coding) 서열이 반대 방향으로(in opposing orientation) 있는 env 및 gag-pol 유전자를 포함한다.

레트로바이러스(렌티바이러스 포함)는 그의 게놈이 데옥시리보핵산(DNA) 내로 역전사되고 그 후에 바이러스 감염에 이어 숙주 세포 게놈 내로 통합되는 것을 수반하는 복잡한 생활 주기를 겪는 양성 센스(positive sense) RNA 바이러스이다. 이들은 그의 게놈을 DNA로서 표적 세포의 게놈 내의 거의 모든 위치로 삽입할 수 있고 바이러스 유전자의 장기간 발현을 조정할 수 있으며, 감염된 세포가 분열할 때 상기 DNA는 각각의 딸 세포 내로 복제된다. 이들은 전사를 위한 세포의 RNA 폴리머라아제를 이용하는 것에 의해 비-스플라이싱된 mRNA 분자로서 그의 게놈을 생성한다. 이후에 Rev라 불리는 바이러스 단백질을 이용하여 바이러스 게놈이 세포질 내로 이동한다. 이후에 상기 게놈은 바이러스 인코딩된 구조 단백질 외피(Envelope, Env), Gag 및 폴리머라아제(Pol)를 이용하여 시토졸(cytosol)에서 바이러스 입자 내로 패키징된다. 레트로바이러스 게놈은 전형적으로 7 내지 10 kb의 길이이며; 통상 연구되는 HIV 바이러스의 경우에 상기 게놈은 9.7 kb의 길이이다. 이는 각각의 바이러스 입자에서 비리온(virion) 당 2개의 카피(copy)로 존재한다.

레트로바이러스 생활 주기, 및 이들의 구조적 유연성은 포유류 세포의 게놈 내로 DNA 전달과 같은 많은 생명공학적 응용을 제공한다. 게다가, 레트로바이러스는 비-레트로바이러스 당단백질을 그들의 표면에 함유하도록 변형될 수 있는데, 이는 당단백질이 기원된 바이러스의 세포 향성(tropism)을 레트로바이러스 입자에 부여한다. 이것은 천연 레트로바이러스 당단백질이 제한된 세포 향성을 가질 때 특히 중요하다. 이것의 예는 HIV-1의 GP160 당단백질인데, 이는 CD4 수용체에 결합하도록 진화되었으며 그들의 표면 상에 이 단백질을 갖는 세포만을 감염시킨다. HIV-1의 경우에, 바이러스 입자는 슈도타입화(pseudotyping)라 불리는 방법에서 천연 당단백질과 상이한 당단백질을 함유하도록 흔히 변형된다. 가장 일반적으로, 이것은 훨씬 더 광범위한 세포 향성을 제공하기 위해 소수포구내염 바이러스(vesicular stomatitis virus, VSV-G) 유래의 당단백질로 달성된다.

실험실에서 레트로바이러스를 도구(tool)로서 이용하는 경우, 이들은 전형적으로, 1개 이상의 전이유전자(transgene) 또는 shRNA 분자 중 어느 하나를 발현할 수 있는 복제-부적격 벡터(replication-incompetent vector)를 형성하도록 변형되며, 이들 변형된 바이러스는 세포의 전이유전자 발현 및 엔지니어링(engineering)을 위한 다용도 벡터를 제공한다. 레터로바이러스 패키징 방법은 또한 플렉서블하여 수용될 게놈 크기가 다양하게 될 수 있다: 3 kb만큼 작은 게놈 및 18 kb만큼 큰 게놈이 패키징될 수 있으나, 바이러스 역가가 이들 극단(extreme)에서 절충될 수 있다.

유전된 단일-유전자 장애의 치료에서 보완될 전이유전자를 발현시키기 위해 줄기 세포를 환자에게 재도입하기 전에 줄기 세포를 생체외(ex vivo) 감염시키는 레트로바이러스(및 후기에 렌티바이러스)를 이용한 여러 임상 시험이 지금까지 수행되어왔다. 일부 줄기 세포가 또한 이종 이식물로서 적용될 수 있지만, 이것은 일반적으로는 자가조직 기준(autologous basis)으로 이루어진다.

레트로/렌티바이러스는 또한 입양 세포 전달(adoptive cell transfer) 분야에서 중요한 응용을 제공하고 있어, 특히 현저하게는 세포 확장 및 환자로의 재주입 전에 T-세포 내의 하이브리드(hybrid) '키메라적 항원 수용체(chimeric antigen receptors)'(CAR)의 발현을 허용한다. 상기 CAR는 일반적으로 세포외 항체 구조, 및 T-세포 수용체에 기반하지만 (2세대 및 3세대 CAR에서) 항원에 대한 바깥 부분의 결합 이후의 세포 자극의 질을 개선시키도록 변형된 세포내 구조를 갖는다. 이 'CAR T 세포' 접근법은 B 세포 림프종의 임상적 치료에서 CAR 인식 CD19를 인코딩하는 렌티바이러스를 이용하여 인상적인 성공을 보여왔고, CTL109로 알려진 CD19-특이적 CAR T 세포에 대하여 노바티스에게 첫 번째 US 제품 허가가 가까운 미래에 승인될 것으로 예상된다. 다른 분자 표적 및 다른 악성종양을 처리하도록 응용 분야가 현재 확장되고 있다. 이런 이유로, 기존 바이러스 생산 시스템을 이용하여 달성하기 어려운 대규모 렌티바이러스 제조에 대한 필요성이 확장되고 있다.

임상적 이용과 함께, 많은 실험실들이 연구 및 개발을 위해 렌티바이러스 벡터를 흔히 이용하는데, 이때 세포 게놈 내로 외인성 DNA를 삽입하는 것이 필요하다. 렌티바이러스는 다능성(versatility)으로 인해 DNA를 인간 및 마우스 줄기 세포, 암 세포, 1차(primary) 조직 세포(예를 들어, 간, 뉴런, 및 섬유아세포)를 비제한적으로 포함하는 넓은 범위의 세포 유형 내로 도입하기 위해 이용되어 왔다.

이들 세포의 감염은 상기 바이러스를 광범위한 향성 당단백질, 가장 통상적으로 VSV-G 표면 당단백로 코팅 또는 슈도타입화(pseudotype)하는 것에 의해서만 가능하게 된다. 이 단백질은 인간, 마우스, 랫트, 햄스터, 원숭이, 토끼, 당나귀 및 말, 양, 젖소 및 구세계(old world) 유인원을 비제한적으로 포함하는 많은 종들에 걸쳐, 그리고 거의 모든 기관으로부터의 세포의 감염을 가능하게 한다.

야생형 레트로/렌티바이러스가 숙주 세포에서 자기 복제를 할 수 있지만. 전이유전자 및 shRNA 발현을 위해 이용되는 레트로/렌티바이러스 벡터는 전형적으로 그들의 자기 복제하여 질환을 야기하는 능력을 제거하는 다양한 방법으로 손상된다. 이것은, 실험적 또는 임상적 이용을 위해 단일 감염 과정(round)이 가능한 감염성 바이러스 입자의 뱃치(batch)를 성장시키기 위해서는 바이러스 게놈에서 유전적으로 동시에 제거된 여러 바이러스 유전자(및 그에 의한 바이러스 단백질)를, 바이러스 패키징을 위해 이용되는 세포 내로 제공할 필요가 있다는 사실을 의미한다. 이들 유전자는 일반적으로 3개 혹은 4개의 분리된 플라스미드로 제공되고, 세포 내로 동시-형질감염(co-transfection)된다. 중심이 되는 성분은, 대응 RNA를 새로운 바이러스 입자 내에 통합시키도록 조립된 바이러스 입자에게 지시하는 패키징 신호를 함유하는 바이러스 벡터 게놈(임의의 전이유전자 및 표적 세포에서 전사를 조절하기 위한 연관된 프로모터를 포함함)을 인코딩하는 플라스미드이다. Gag-Pol, Tat 및 Rev와 같은 다른 바이러스 단백질에 대한 유전자는 일반적으로 동시-형질감염된 다른 플라스미드로부터 제공되며; 그리고, 추가의 또 다른 플라스미드가, 그들의 감염성 향성을 지시할 새롭게-형성된 바이러스 입자의 외피 내로 통합되도록 당단백질을 제공한다. 상기 gag-pol 발현 카세트(expression cassette)는 바이러스 캡시드 및 내부 구조 단백질 및 폴리머라아제 및 프로테아제 활성을 인코딩한다. 상기 rev 유전자는 Rev 반응 요소(Rev Response Element, RRE)라고 불리는 바이러스 게놈의 특이적 영역(region)에 결합함으로써 레트로/렌티바이러스 게놈의 핵 외수송(nuclear export)을 강화하도록 작용한다.

레트로바이러스 및 렌티바이러스 패키징 시스템의 복잡성은 수 많은 '세대'를 초래하였으며, 각각은 이전 시스템에 대한 안전성을 증가시킨다. '1세대' 패키징 시스템에서는 3개의 플라스미드를 이용하였다: 외피 유전자를 제외한 HIV 유전자 모두를 인코딩하는 1개의 플라스미드; 표면 당단백질(가장 흔하게는 VSV-G)을 제공하는 2번째 플라스미드; 및 패키징될 바이러스 게놈을 함유하는 플라스미드. 이 시스템은 바이러스 유전자를 함유하는 플라스미드가 상기 바이러스 게놈 플라스미드에 상동성을 갖는 DNA의 넓은 영역을 함유하여, 잠재적으로 플라스미드 사이의 재조합을 허용한다는 결점을 갖는다. 이것은 질환을 야기할 수 있는 감염성 바이러스의 생산을 초래할 수 있었다. 다른 문제점은 VPU, VIF, VPR 및 Nef를 포함하여 바이러스 생산에 필요하지 않은 많은 바이러스 유전자의 존재를 포함하였다.

'2세대' 시스템에서는 9개 HIV-1 유전자 코딩 영역 중 5개가 상기 시스템에서 제거되었다. 이 방법은 또한, 하나의 플라스미드는 상기 gag-pol 유전자 및 Tat 및 Rev 단백질에 대한 보조 유전자(ancillary gene)를 함유하고, 제2 플라스미드는 당단백질(가장 흔하게는 VSV-G)을 인코딩하며, 제3 플라스미드는 패키징될 바이러스 게놈을 인코딩하는 것인 3개-플라스미드 시스템을 초래한다. 이 시스템의 바이러스 게놈은 전형적으로 야생형 5'-긴 말단 반복 순서(Long Terminal Repeat, LTR)를 함유하며 이런 이유로 전사 활성화 및 게놈 생산을 위해 tat 유전자를 필요로 한다. 이 시스템은 상기 바이러스 게놈과 상기 패키징 플라스미드 사이의 상동성(homology)의 감소가 잠재적으로 위험한 복제-적격 레트로바이러스의 형성 가능성을 감소시켰다는 이점을 가졌다.

가장 최근의 '3세대' 렌티바이러스 벡터 시스템에서는 3개 대신 4개의 플라스미드가 이용된다. 상기 시스템을 4개의 플라스미드(3개의 헬퍼 플라스미드 및 벡터 게놈에 더해 전이유전자를 함유하는 1개)로 분할함으로써, 상기 '3세대' 시스템은 (주로 복제-적격 바이러스를 형성하기 위해 필요한 재조합 현상(recombination event)의 횟수를 증가시키는 것에 의해) 많은 이점을 제공한다. 그러나, 상기 '3세대' 시스템은 프로모터를 함유하는 변형된 5-LTR을 갖고 따라서 게놈의 전사가 Tat 단백질에 의한 전사 활성화에 의존하지 않기 때문에 - 그럼으로써 Tat가 상기 시스템 내에서 인코딩될 필요성을 없앴기 때문에, '3세대' 시스템은 또 다른 유의적인 이점을 갖는다. 이들은 이용되는 임의의 플라스미드 상에 Tat 단백질을 함유하지 않는다. 상기 rev 유전자가 또한 개별적인 플라스미드 상에 배치된다. 그러므로, 3세대 시스템에서, 상기 4개의 플라스미드는 1: gag-pol, 2: 당단백질(가장 흔하게는 VSV-G), 3: rev, 및 4: 전이유전자 또는 관심대상 RNA를 함유하는 자가-불활성화 렌티바이러스 게놈을 인코딩하는 플라스미드를 함유한다. 상기 당단백질 플라스미드와 구체적으로 관련하여, 여러 외피 당단백질이 이용가능하고 이용되어 왔지만, VSV-G로 알려진 소수포구내염 바이러스 유래의 당단백질이 가장 널리 이용된다.

이들 렌티바이러스 패키징 유전자의 일부, 특히 VSV-G 및 gag-pol 성분은 포유류 세포에 독성인 것으로 널리 보고된다(Burns et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 90, 8033-8037 (1993); Yee et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 90, 9564-9568 (1994); Hoffman et al., J. Gen. Virol, 91, 2782-2793 (2010)). 이것은 필요한 패키징 단백질 중 다수를 발현시키는 안정한 패키징 세포의 개발에 대한 실질적인 장벽을 제공해 왔다. 따라서, 렌티바이러스의 뱃치는 일시적 형질감염에 의한 세포 내의 모든 플라스미드의 동시적 발현을 필요로 하는 비효율적인 방법으로 제조되어 왔다. 이러한 형질감염 방법은 비싸고, 대규모로 재생하기 어려우며, 종종 플라스미드 및 세포 부스러기로 인한 바이러스 제제의 오염으로 이어진다.

상기 세포 게놈 내에서 신규 바이러스 입자의 생산에 필요한 성분의 일부, 또는 전부를 인코딩하는 레트로바이러스 및 렌티바이러스에 대한 '패키징' 세포주를 만드는 것이 매우 바람직하다. 이것은 바이러스 패키징에 필요한 플라스미드 형질감염의 복잡성을 감소시킬 수 있었으며 모든 세포가 바이러스 생산에 필요한 유전자를 발현하고 있을 것이라는 주요 유익을 갖는다. 서로에 관해 특이적 화학양론을 갖는 바이러스 단백질을 발현하는 세포주를 만드는 능력은 또 다른 유의적인 이점일 것이다. 안정하게, 또는 조건적 또는 유도성 프로모터 하에서 바이러스 단백질을 발현시키는 여러 시도들이 있어왔으며, 예를 들어, 이케다(Ikeda) 등(Nature Biotechnology, 21, 560-572 (2003))에 의해 생산된 STAR 세포는 코돈-최적화된 HIV Gag, Pol 및 Rev의 레트로바이러스 형질도입을 이용하여 패키징 세포 내에서의 지속적인 발현을 달성하였다. 그러나, 이들 세포를 이용하여 생산된 바이러스의 역가는 전형적으로 산업 표준인 1 x 10⁷ 내지 1 x 10⁸/ml 미만이다. 일부 유전자가 또한 유도성이어야만 하거나 또는 독립적인 항생제 선택 제제를 필요로 한다는 필요사항이 상기 시스템의 복잡성에 유의적으로 가중되며, 제조를 위한 규모 확대를 유의적으로 더 어렵게 만든다. 지금까지, 그의 보고된 독성으로 인해, 가장 통상적으로 이용되는 레트로바이러스 및 렌티바이러스 당단백질 VSV-G를 안정하게 그리고 구성적으로(constitutively) 발현하는 생산된 세포주는 없었다.

단일 플라스미드/벡터 상에 Env 단백질 및 Gag/Pol 단백질을 인코딩하는 서열을 갖는 것은 상기 바이러스 입자를 생산하기 위해 필요한 플라스미드의 개수를 감소시키고, 이에 따라 바이러스 생산 시스템의 효율을 증가시키는 이점을 갖는다. 그러나, 이 배열은 잠재적으로 위험한 복제-적격 레트로바이러스의 형성 가능성을 증가시킨다는 유의적인 단점을 겪는다. 이것이 발생할 가능성은, 단일 mRNA가 Env 및 Gag-Pol 코딩 서열 둘다를 동일한 5'에서 3' 방향으로 함유하여, 두 단백질이 동일한 mRNA 분자로부터 생산될 수 있는 세포 내에서 생산되는 경우에 실질적으로 증가한다.

이제 본 발명자들은 동일한 플라스미드/벡터의 1개 가닥 상에 Env 단백질에 대한 코딩 서열을 배치하고 반대 가닥 상에 Gag/Pol 단백질에 대한 코딩 서열을 배치하는 것이, Env 및 Gag-Pol 서열을 코딩하는 단일 mRNA를 생산하는 프로모터로부터의 번역-초과(read-through)의 가능성이 없도록 하여, 이에 따라 복제-적격 바이러스가 생성될 리스크를 감소시킨다는 사실을 발견하였다.

그러므로 본 발명의 목적은, 특히 바이러스 입자를 생산하기 위해 현재 요구되는 플라스미드의 개수를 감소시키고 이에 따라 바이러스 생산 시스템의 전반적인 효율을 증가시키기 위해 이용될 수 있는 핵산 분자 및 레트로바이러스 패키징 벡터를 제공하는 것이다.

일 구현예에서, 본 발명은 이중-가닥 핵산 분자로서,

(a) env 유전자를 포함하는 제1 핵산; 및

(b) gag-pol 유전자를 포함하는 제2 핵산;을 포함하며,

상기 제1 및 제2 핵산의 코딩 서열은 상기 이중 가닥 핵산 분자의 반대 가닥 (opposing strand) 상에 있고, 상기 env 및 gag-pol 유전자는 독립적으로 제1 및 제2 유도성 프로모터와 작동가능하게-연관되고, 상기 제1 및 제2 유도성 프로모터는 그들 사이에 95% 미만의 뉴클레오티드 서열 동일성을 가지며, 상기 이중-가닥 핵산 분자는 아폽토시스 억제제(apoptosis inhibitor)를 인코딩하는 1개 이상의 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 이중-가닥 핵산 분자를 제공한다.

일부 구현예에서, 상기 이중-가닥 핵산 분자는 rev 유전자를 포함하는 핵산을 추가적으로 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 이중-가닥 핵산 분자는 전이유전자를 포함하는 핵산을 추가적으로 포함한다. 바람직하게, 상기 이중-가닥 핵산 분자는 레트로바이러스 벡터이고, 보다 바람직하게는 렌티바이러스 벡터이다.

상기 이중-가닥 핵산 분자 중의 핵산은 DNA 또는 RNA, 바람직하게는 DNA일 수 있다.

바람직하게, 상기 이중-가닥 핵산 분자는 레트로바이러스 벡터이다. 본원에서 이용될 때 용어 "레트로바이러스 벡터"는 레트로바이러스의 생산에서 유용한 벡터 또는 플라스미드를 지칭한다. 레트로바이러스 벡터의 예는 감마-레트로바이러스 벡터(예를 들어, 뮤린(murine) 백혈병 바이러스로부터 유래된 벡터) 및 렌티바이러스 벡터를 포함한다.

바람직하게, 상기 레트로바이러스 벡터는 렌티바이러스 벡터이다. 본원에서 이용될 때 용어 "렌티바이러스 벡터"는 렌티바이러스의 생산에서 유용한 벡터 또는 플라스미드를 지칭한다. 예를 들어, 상기 렌티바이러스 벡터는 패키징 벡터, 외피 벡터 또는 패키징/외피 벡터일 수 있다.

상기 env, gag, pol 및 rev 유전자는 바람직하게는 바이러스 유전자이거나 또는 바이러스 유전자로부터 유래된다. 보다 바람직하게, 이들은 레트로바이러스 유전자이거나 또는 레트로바이러스 유전자로부터 유래된다. 레트로바이러스의 예는 렌티바이러스, 알파-레트로바이러스, 감마-레트로바이러스(예를 들어, 뮤린 백혈병 바이러스) 및 포움형(foamy)-레트로바이러스를 포함한다. 바람직하게는, 상기 레트로바이러스는 렌티바이러스이다.

렌티바이러스는, 특히 간세포(progenitor cell) 모집단, 예컨대 조혈 줄기세포(haematopoietic stem cell) 및 T 세포에서, 전이유전자 전달 및 단백질 발현을 위해 이용이 증가되고 있는 레트로바이러스 과의 서브세트이다. 대부분의 레트로바이러스와 달리, 렌티바이러스는 세포 주기와 독립적으로 그의 게놈 또는 그의 변형된 형태를 전달할 수 있으며, 종종 더 짧은 시간 틀에서 더 높은 세포 감염 효율을 달성한다. 이것은 그들이 연구 및 임상적 이용 둘 다를 위한 보다 더 효과적인 바이러스 벡터가 되게 한다.

상기 렌티바이러스 과는 현재 10개 바이러스로 이루어진다. 이들 종은 다음을 포함하는 5개 군(group)으로 나누어진다: 소(bovine) 렌티바이러스 군(소 면역결핍 바이러스 및 젬브라나 병 바이러스), 말(equine) 렌티바이러스 군(말 전염성 빈혈 바이러스, 고양이 렌티바이러스 군, 고양이 면역결핍 바이러스, 퓨마 렌티바이러스), 양/염소 렌티바이러스 군(염소 관절염 뇌염 바이러스, 비스나/메디 바이러스), 영장류 렌티바이러스 군,(인간 면역결핍 바이러스 1, 인간 면역결핍 바이러스 2, 진원류 면역결핍 바이러스).

바람직한 구현예에서, 상기 렌티바이러스는 인간 면역결핍 바이러스 1, 진원류 면역결핍 바이러스 또는 말 전염성 빈혈 바이러스이다. 보다 바람직한 구현예에서, 상기 렌티바이러스는 인간 면역결핍 바이러스 1 또는 말 전염성 빈혈 바이러스이다.

상기 env, gag, pol 및 rev 유전자는 1개 이상의 상이한 바이러스(예를 들어, 2개, 3개 또는 4개의 상이한 바이러스) 유래일 수 있다. 예를 들어, 상기 env 유전자가 랍도바이러스과(Rhabdoviridae)(예를 들어, VSV-G) 유래일 수 있으면서, 다른 상기 gal, pol 및 rev 유전자는 HIV-1 유래일 수 있다.

레트로바이러스의 env, gag, pol 및 rev 유전자는 완계통(clade) 및 격리부(isolate)에 의해 달라진다는 사실이 당업자에 의해 인식되고 있다. 모든 이러한 완계통 및 격리부로부터 이들 유전자의 서열 뿐만 아니라 이의 유도체가 본원에 포괄된다.

상기 제1 핵산은 env 유전자를 포함한다. env는 바이러스 외피를 형성하는 단백질을 인코딩하는 유전자이다. 상기 env 유전자의 발현은 레트로바이러스가 특이적인 세포 유형을 표적화하고 이에 부착하도록 할 수 있고, 상기 표적 세포막에 침투하도록 할 수 있다. 상기 env 유전자의 예는 HIV-1 env 유전자 및 이의 유도체를 함유한다.

HIV에서, 상기 env 유전자는 동형삼량체(homotrimer)를 형성하며 숙주 세포 프로테아제, 퓨린(Furin)에 의해 gp120 및 gp41로 절단되는 gp160 단백질을 코딩한다. 상기 HIV-1 env 뉴클레오티드 및 아미노산 서열이 각각 서열번호 1 및 2로 제공된다.

본원에서 이용될 때 용어 "HIV-1 env 유전자"는 바람직하게는 서열번호 1로 제공되는 서열을 갖는 뉴클레오티드 서열 또는 서열번호 2를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열, 또는 이에 대해 적어도 80%, 85% 90%, 95% 또는 99% 서열 동일성을 가지며 동형삼량체를 형성할 수 있고 HIV-1 프로테아제에 의해 gp120 및 gp41 폴리펩티드로 절단될 수 있는 gp160 단백질을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 지칭한다.

상기 바이러스 외피는 바이러스, 예컨대 소수포구내염 바이러스(VSV) 유래의 env 유전자, 예를 들어, VGV-G 유전자, 또는 이의 유도체를 이용하는 것에 의해 슈도타입화(pseudotyped)될 수 있다.

상기 VSV-G 단백질은 단일-통과(single-pass) 막 당단백질이다. 이것은 광범위한 감염성 향성을 조정한다. 상기 유전자는 1536 bp 개방형 해독틀(open reading frame)에 의해 인코딩되며 511개 아미노산으로 이루어진 단백질을 생산한다. 상기 단백질은 분비 경로를 통해 세포 표면까지 외수송되는 동안에 성숙 단백질로부터 절단된 16개 아미노 신호 펩티드(아미노산 서열: MLSYLIFALAVSPILG, 서열번호 14)를 N-말단에 함유한다. 상기 당단백질은 458개 아미노산의 세포외 영역 및 21개 아미노산의 막 스패닝(spanning) 영역(막횡단 영역)에 이어서 22개 아미노산의 세포내(시토졸) C-말단 영역을 함유한다. 소포체로부터 VSV-G 단백질의 왕복수송(shuttling)은 신속하며, 이것은, DxE 모티프를 함유하는 더 광범위한 이동 신호 Tyr-Thr-Asp-Ile-Glu-Met 내의 DxE 모티프(여기서 x는 임의의 아미노산임)를 포함하는, C-말단 꼬리 내의 특이적인 이동(trafficking) 신호에 의해 달성된다(Sevier et al., Mol. Biol. Cell. 2000 Jan; 11(1): 13-22). VSV-G 단백질의 외수송 효율은 레트로바이러스 및 렌티바이러스 생산에 대한 그의 유효성에 부분적으로 기여할 수 있다. 상기 VSV-G 수용체는 흔히 비-특이적인 융합(fusogenic) 단백질로서 기재되지만; 그러나, 최근에는 상기 VSV-G가 저-밀도 지질 수용체(LDL-R)에 결합하는 것으로 결정되었으며(Finkelstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2013;110(18):7306-7311), 이는 레트로바이러스 및 렌티바이러스 슈도타입화에서 이의 광범위한 세포 향성 및 광범위한 응용을 설명한다.

본원에서 이용될 때 용어 "VGV-G 유전자"는 바람직하게는 서열번호 3에서 제공되는 서열을 갖는 뉴클레오티드 서열 또는 서열번호 4를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열, 또는 이에 대해 적어도 80%, 85% 90%, 95% 또는 99%의 서열 동일성을 가지며 LDL 수용체에 부착할 수 있는 폴리펩티드를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 지칭한다.

상기 제2 핵산은 gag-pol 유전자를 포함한다. 본원에서 이용될 때 용어 "gag-pol"은 인접하는/중첩되는(contiguous/overlapping) gag-pol 유전자 및 독립적인 gag 및 pol 유전자를 함유한다.

렌티바이러스의 Gag-Pol 단백질은, 상기 Gag-Pol 단백질을 많은 바이러스 기능을 제공하는 많은 더 작은 단백질로 단백분해 절단할 수 있는 프로테아제를 인코딩하는 단일 다단백질(polyprotein)로서 생산된다. HIV-1 Gag 단백질은 상기 바이러스 게놈의 5'-말단에서 첫 번째로 번역된 개방형 해독으로부터 생산되며 틀이동(frame-shift) 서열로 공지된 서열을 함유한다. 이 신호는 번역 리보좀이 번역 동안 대략 20회 번역 진행 중 1회마다 mRNA 분자 상에서 1개 염기 뒤로 이동하는 것을 야기한다. 이 과정이 상기 Gag-Pol 단백질을 생산한다. 이 결과는 렌티바이러스가 대략 1:20의 비율로 Gag 및 Gag-Pol을 생산한다는 것이다. 상기 Gag 단백질은 3개의 주요 구조 단백질: p18, p24 및 p15를 인코딩한다. 상기 Pol 단백질 세그먼트(segment)는 또한 p10(프로테아제), p66/55(역전사효소) 및 p32(인테그라아제)로 불리는 3개의 주요 단백질을 인코딩한다. 상기 프로테아제는 단백분해 절단에 의해 이들 단백질의 각각을 생산하기 위해 필요한 모든 절단 현상을 담당한다. 그러나, 이들 절단 현상을 정의하는 프로테아제 인식 서열은 불충분하게 정의되어 있는데, 이는 상기 프로테아제가 광범위한 특이성을 가짐을 시사한다. 그러므로 이것은 바이러스 관련되지 않은 단백질의 절단을 초래하는 경향이 있다. 실제로, Gag-Pol 단백질의 발현은 이것 때문에 세포에 매우 독성인 것으로 보고된다(Blanco et al., The Journal of Biochemistry, 278, 2, 1086-1093, 2003).

일부 바이러스에서, 상기 gag 및 pol 유전자의 코딩 서열은 중첩된다. 본 발명의 gag 및 pol 유전자의 코딩 서열은 인접하거나, 비인접하거나, 중첩되거나 또는 비중첩될 수 있다.

바람직하게, 상기 gag-pol 서열은 렌티바이러스 유래일 수 있다. 상기 gag, pol 및 gag-pol 유전자의 예는 HIV-1 gag-pol 유전자 및 이의 유도체를 포함한다.

HIV-1에서, 상기 gag 및 pol 유전자의 번역 프레임이 중첩된다, 즉 gag-pol 유전자에서 중첩된다. 상기 HIV-1 gag-pol 뉴클레오티드 서열은 서열번호 5에서 제공된다.

본원에서 이용될 때 용어 "HIV-1 gag-pol 유전자"는 바람직하게는 서열번호 5에서 제공되는 서열을 갖는 뉴클레오티드 서열, 또는 이에 대해 적어도 80%, 85% 90%, 95% 또는 99%의 서열 동일성을 갖고 매트릭스(matrix), 캡시드 및 뉴클레오캡시드 단백질, 및 역전사효소, 인테그라아제, 및 프로테아제를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 지칭한다.

본 발명의 이중-가닥 핵산 분자에서, 상기 제1 및 제2 핵산의 폴리펩티드-코딩 서열은 상기 이중-가닥 핵산 분자의 반대 가닥 상에 있다. 이중-가닥 핵산 분자의 2개 가닥은 종종 센스/안티-센스 가닥 또는 양성/음성 가닥으로서 지칭된다. 그러므로, 상기 env 유전자의 코딩 서열을 포함하는 핵산 가닥을 센스 또는 양성 가닥으로서 정의하는 경우에, 상기 gag 및 pol 유전자의 코딩 서열은 안티센스 또는 음성 가닥 상에 있을 것이다.

일부 구현예에서, 상기 이중-가닥 핵산 분자는 rev 유전자를 포함하는 핵산을 추가적으로 포함한다. Rev는 HIV-1 단백질 발현의 조절에 필수적인 트랜스-활성화 단백질이다. 핵 국재화 신호(nuclear localization signal)가 상기 rev 유전자 내에서 인코딩되는데, 이는 Rev 단백질이 핵에 국재화되도록 허용하며 비-스플라이싱된 및 불완전 스플라이싱된 mRNA의 외수송과 관련된다. Rev는 비-스플라이싱된, 전장(full length) 게놈의 핵 외수송을 허용하는 Rev 반응 요소라고 불리는 렌티바이러스 게놈 내의 영역에 결합하는데, 이는 렌티바이러스의 생산에 필수적이다. 상기 rev 유전자의 예는 상기 HIV-1 rev 유전자 및 이의 유도체를 함유한다. 상기 HIV-1 rev 뉴클레오티드 및 Rev 아미노산 서열은 각각 서열번호 6 및 7에서 제공된다.

본원에서 이용될 때 용어 "HIV-1 rev 유전자"는 바람직하게는 서열번호 6에서 제공되는 서열을 갖는 뉴클레오티드 서열 또는 서열번호 7을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열, 또는 이에 대해 적어도 80%, 85% 90%, 95% 또는 99% 서열 동일성을 갖고 Rev 반응 요소(RRE)에 결합할 수 있는 단백질을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 지칭한다.

일부 다른 구현예에서, 상기 이중-가닥 핵산 분자는 rev 유전자를 포함하는 핵산을 포함하지 않는다.

VSV-G는 일반적으로 세포에 세포독성이다. 이것은 세포 융합 및 융합체(syncytia) 형성을 유도할 수 있다. 상기 gag-pol 유전자 생산물의 일부가 또한 세포독성이다. 특히, 상기 pol 유전자는 상기 세포 내의 단백질을 절단하여 세포사(cell death)를 초래하는 프로테아제를 인코딩한다.

1개 이상의 아폽토시스 억제제의 발현은 상기 세포의 아폽토시스를 완화하거나 방지하며, 그렇지 않다면 세포의 아폽토시스가 세포독성 폴리펩티드(들)의 세포독성에 의해 개시되었을 것이다. 그러므로, 본 발명의 이중-가닥 핵산은 아폽토시스 억제제를 인코딩하는 1개 이상의 뉴클레오티드 서열을 추가적으로 포함한다. 상기 1개 이상의 아폽토시스 억제제는 독립적으로, 예를 들어, 폴리펩티드 또는 RNA일 수 있다.

바람직하게, 본 발명의 이중-가닥 핵산은 아폽토시스 억제제를 인코딩하는 1개, 2개, 3개, 4개 또는 5개, 보다 바람직하게는 1개 또는 2개의 뉴클레오티드 서열을 추가적으로 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 아폽토시스 억제제는 APAF-1(예를 들어, AVEN), 카스파아제 9(예를 들어, IAP 또는 XIAP), BAK, BAX, BOK 또는 BAD(예를 들어, BCL2, E1B-19K 또는 BCL-XL) 경로의 억제제이다. 바람직하게, 아폽토시스에 대한 개선된 내성을 제공하는 1개보다 많은 아폽토시스 경로 또는 단계(예를 들어, E1B-19K와 조합된 AVEN)을 억제하는 1개보다 많은 유전자가 이용된다.

일부 구현예에서, 상기 아폽토시스 억제제 중 1개 이상은 세포 막 무결성(integrity)의 손실에 의해, 세포-세포 융합에 의해 또는 융합체 형성에 의해 그 생산이 자극되는 아폽토시스성 단백질을 억제하는 것 또는 상기 세포 내의 단백질을 절단하는 프로테아제에 의해 자극되는 것이다.

아폽토시스-억제 폴리펩티드의 예는 셀로바이러스(Celovirus) GAM1, 아데노바이러스(Adenovirus) E4 Orf6, 아데노바이러스 E1B 55K, 아데노바이러스 E1B 19K, 점액종바이러스(Myxomavirus) M11L, 거대세포바이러스(Cytomegalovirus) IE1, 거대세포바이러스 IE2, 바큐로바이러스(Baculovirus) p35, 바큐로바이러스 IAP-1, 헤르페스바이러스(Herpesvirus) US3, 헤르페스바이러스 사이미리(Saimiri) ORF16, 단순 헤르페스 2 LAT ORF 1, 인간 XIAP, 아프리카 돼지열(African Swine Fever) ASFV-5-HL(LMW-5-HL/A179L), 카포시 육종 바이러스(Kaposi's Sarcoma virus) KSbcl2, 백시니아 바이러스(Vaccinia virus) SPI-2, 우두바이러스(Cowpoxvirus) CrmA, 앱스타인 바 바이러스(Epstein Barr virus) BHRF1, 앱스타인 바 바이러스 EBNA-5, 앱스타인 바 바이러스 BZLF-1, 유두종바이러스(Papillomavirus) E6, 인간 Aven, 인간 BCL2 및 인간 BCL-XL를 포함한다.

일부 구현예에서, 상기 아폽토시스 억제제 중 1개 이상은 RNA, 바람직하게는 안티센스 또는 shRNA이다. RNA 아폽토시스 억제제의 다른 예는 헤르페스바이러스 LAT 및 아데노바이러스 VA1을 함유한다.

바람직하게, 상기 아폽토시스 억제제는 IAP1, EBNA5 및 BCL-XL로 이루어진 군으로부터 선택된다. 아폽토시스 억제제의 특히-바람직한 조합은: IAP1 + EBNA5; IAP1 + BCL-XL; 및 EBNA5 + BCL-XL을 함유한다. 아폽토시스 억제제 IAP1, EBNA5 및 BCL-XL의 뉴클레오티드 서열은 각각 서열번호 11, 12 및 13으로 본원에서 제공된다.

서열번호 11, 12 또는 13을 포함하는 아폽토시스 억제제를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열, 또는 이에 대해 적어도 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 추가적으로 포함하는 본 발명의 이중-가닥 핵산이 특히 바람직하다.

포유류 배양에서 안정한 세포주의 생산은 전형적으로, 임의의 외인성으로-첨가된 DNA를 함유하는 세포의 성장을 촉진하는 선택 방법을 필요로 한다. 바람직하게, 본 발명의 이중-가닥 핵산 분자는 선택 유전자 또는 항생제 내성 유전자를 추가적으로 포함한다. 이를 위하여, 그들을 인코딩하는 DNA가 포유류 세포 게놈 내로 삽입될 때 특이적 화합물에 대하여 내성을 제공하는 다양한 유전자가 공지되어 있다.

바람직하게, 상기 선택 유전자는 퓨로마이신 N-아세틸-전이효소(퓨로(Puro)), 히그로마이신 인산전이효소(히그로(Hygro)), 블라스티시딘(Blasticidin) s 탈아미노효소(블라스트(Blast)), 네오마이신 인산전이효소(네오(Neo)), 글루타티온 S-전이효소(GS), 제오신 내성 유전자(Shble), 또는 디히드로엽산 환원효소(DHFR)이다. 이들 유전자의 각각은 포유류 세포에 독성인 것으로 알려진 소분자에 대한 내성을 제공하거나, 또는 GS의 경우에 성장 배지 중 글루타티온의 부재 하에서 세포가 글루타티온을 생성할 수 있는 방법을 제공한다.

본 발명의 바람직한 구현예에서, 상기 내성 유전자는 퓨로이다. 이 유전자는, 일반적인 조직 배양에 이용되는 세포주의 다수가 내성이 없기 때문에 특히 효과적이다; 이는 Neo의 경우에는 해당될 수 없는데, 다수, 특히 HEK293 유도체는 연구자들에 의한 이전 유전자 조작으로 인해 이미 Neo 내성이다(예를 들어, HEK 293T 세포). 퓨로 선택은 또한 짧은 시간 윈도우(<72시간)에 걸쳐 독성인 이점을 가지며, 이런 이유로 변이가 신속하게 시험될 수 있고 상기 게놈 내로 삽입될 외인성 DNA를 갖지 않은 세포가 상기 배양 시스템에서 신속하게 제거될 수 있다. 이것은 독성이 훨씬 느리게 개시되는 히그로와 같은 일부 다른 선택 방법에서는 해당될 수 없다.

선택 유전자(예를 들어, 퓨로)를 이용한 안정한 세포주의 개발은 상기 내성 유전자가 상기 세포 내에서 발현되어야 함을 필요로 한다. 이것은 내부 리보좀 유입점(internal ribosome entry sites, IRES), 2A 절단 시스템, 선택적 스플라이싱, 및 전용 프로모터(dedicated promoter)를 비제한적으로 포함하는 여러 방법을 통해 달성될 수 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에서, 상기 선택 유전자는 전용 프로모터로부터 발현될 것이다. 이 프로모터는 바람직하게는, 상기 VSV-G 또는 gag-pol 유전자를 구동(driving)하는 전용 프로모터보다 더 낮은 수준으로 인간 세포에서 전사할 것이다.

폴리펩티드 또는 RNA를 인코딩하는 이중-가닥 핵산 분자에서 유전자 각각은 바람직하게는 1개 이상의 조절 요소와 작동가능하게-연관된다. 이것은 폴리펩티드 또는 RNA가 목적하는 수준으로 그리고 목적하는 시간에 확실하게 발현되도록 한다.

이 맥락에서, 상기 용어 "조절 요소"는 인핸서(enhancer), 프로모터, 인트론, 폴리A, 절연인자(insulator) 또는 종결인자(terminator) 중 1개 이상을 함유한다.

다른 유전자에 대한 전사적 번역-초과(transcriptional read-through)를 최소로 유지하고 또한 정상 환경에서 발현되는 것이 바람직한 유전자(예를 들어, TetR 및 아폽토시스 억제제)로부터, 억제되는 것이 바람직한 유전자(VSV-G 및 gag-pol)의 유전자를 격리시키려는 노력으로 본원에서 벡터 내에 이용되는 유전자는 바람직하게 폴리A 신호 및/또는 절연인자에 의해 분리된다.

1개보다 많은 폴리펩티드 또는 RNA-인코딩 뉴클레오티드 서열과 동일한 조절 요소(예를 들어, 프로모터 서열)의 카피를 이용함으로써 (이들의 조정된 발현 측면에서) 일부 이점을 얻을 수 있지만, 본 발명의 이 맥락에서 각각의 폴리펩티드 또는 RNA-인코딩 뉴클레오티드 서열과 상이한 조절 요소를 이용하는 것이 매우 바람직하다.

그러므로, 바람직하게, 상기 env 및 gag-pol 유전자는 상이한 조절 요소, 예를 들어, 상이한 프로모터, 상이한 인트론, 상이한 폴리A, 상이한 절연인자 및/또는 상이한 종결인자 서열과 작동가능하게 연관된다.

보다 바람직하게는, 상기 env 프로모터와 gag-pol 프로모터 사이의 뉴클레오티드 서열 동일성의 정도는 95% 미만, 또는 90% 미만, 보다 바람직하게는 85%, 80%, 70% 또는 60% 미만이다. 보다 바람직하게는, 상기 env 종결인자와 상기 gag-pol 종결인자 사이의 뉴클레오티드 서열 동일성의 정도는 95% 미만 또는 90% 미만, 보다 바람직하게는 85%, 80%, 70% 또는 60% 미만이다. 이렇게 하여, 이들 조절 요소 사이의 상동 재조합의 리스크가 감소된다.

상기 env 및 gag-pol 유전자는 유도성 프로모터 서열과 독립적으로 작동가능하게 연관된다. 상기 아폽토시스 억제제 유전자는, 존재하는 경우, 또한 1개 이상의 프로모터와 작동가능하게 연관될 수 있다; 이들은 유도성, 억제성(repressible) 또는 구성적일 수 있다.

상기 유도성 프로모터는 독시사이클린, 테트라사이클린, IPTG 또는 젖산으로 유도가능한 것일 수 있다. 바람직하게, 상기 유도성 프로모터 요소는, Tet 억제자 단백질(TetR)이 결합할 수 있는 복수개의 Tet 작동자(operator) 서열을 포함한다. 결합된 상태에서, 전사의 단단한 억압이 얻어진다. 그러나, 독시사이클린(또는 덜 바람직하게는 테트라사이클린)의 존재하에 억압이 완화되고, 이에 따라 상기 프로모터가 완전한 전사 활성을 얻을 수 있다. 이러한 유도성 프로모터 요소는 바람직하게는 또 다른 프로모터, 예를 들어, CMV 프로모터의 하류(downstream)에 배치된다.

상기 TetR 결합 부위는 야생형 서열을 가질 수 있는데, 이 중 다수는 당해 기술 분야에 공지되어 있다. 바람직하게, 상기 TetR 결합 부위는 중요하지 않은 서열 변화를 포함함으로써 1개 이상의 개선을 거쳐왔다. 본 발명의 구현예에서 이용될 수 수 있는 바람직한 버전은 서열: tccctatcagtgatagaga(서열번호 8)를 갖는다. 상기 TetR 억제자 단백질이 이용된 TetR 결합 서열 변이체(variant)에 결합하면, 상기 TetR 단백질 또는 상기 TetR 단백질의 유도체에 결합하는 억제자 요소의 대안적인 버전이 또한 본 발명의 구현예에서 이용될 수 있다. 일부 억제자/결합 부위 변이체는 서로에 대해 야생형 친화력보다 높은 친화력을 가질 수 있다; 본 발명의 일 구현예에서 이들이 바람직하다.

상기 TetR 유전자는 인간(숙주) 세포의 염색체 내로 통합될 것이다. 상기 유전자는 상기 env 또는 gag-pol 유전자와 인접하게, 또는 이와 함께, 통합되거나 통합되지 않을 수 있다.

바람직한 구현예에서, 상기 TetR 유전자의 코딩 가닥은 env 또는 gag-pol 유전자에 인접하게 배치될 때, 상기 Gag-Pol 단백질의 코딩 서열에 대해 역 방향 5'에서 3'으로 DNA의 반대 가닥 중에 있다. 일부 구현예에서, 상기 TetR 유전자는 상기 gag-pol 유전자와 동시-발현된다.

본 발명의 일 구현예에서, 상기 TetR 단백질의 뉴클레오티드 서열은 서열번호 9로 제공된 것이거나, 또는 이에 대해 적어도 80%, 보다 바람직하게는 적어도 85%, 90% 또는 95% 서열 동일성을 가지고 TetR 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열이다.

본 발명의 또 다른 구현예에서, 상기 TetR 단백질의 아미노산 서열은 서열번호 10으로 제공된 것이거나, 또는 이에 대해 적어도 80%, 보다 바람직하게는 적어도 85%, 90% 또는 95% 서열 동일성을 가지고 TetR 단백질을 인코딩하는 아미노산 서열이다.

일부 바람직한 구현예에서, 상기 env 유전자(바람직하게는 VSV-G 유전자) 및 상기 gag-pol 유전자와 작동가능하게 연관된 프로모터는 통상적으로 유도성인(즉, 함께 유도성인) 유도성 프로모터이다.

보다 바람직하게, 상기 env 유전자(바람직하게는 VSV-G 유전자) 및 상기 gag-pol 유전자와 작동가능하게 연관된 프로모터는 둘 다 상기 env 유전자(바람직하게는 VSV-G 유전자) 및 상기 gag-pol 유전자의 동시적 억제 및 동시-발현을 허용하는 TetR 결합 부위를 포함한다.

바람직하게, 상기 아폽토시스 억제제 프로모터는 RSV, CMV, SV40, PGK 및 유비퀴틴 프로모터로 이루어진 군으로부터 선택된다.

1개보다 많은 아폽토시스 억제제가 이용되는 본 발명의 구현예에서, 각각의 아폽토시스 억제제는 바람직하게는 상이한 프로모터에 의해 독립적으로 구동되며; 각각의 프로모터는 바람직하게는 상이한 유형의 것이다(예를 들어, CMV, SV40 등).

아폽토시스 억제제를 인코딩하는 각각의 핵산은, 상기 세포에 최적의 아폽토시스 억제를 제공하는 프로모터의 제어 하에서 발현되는 것이 바람직하다.

일부 바람직한 구현예에서, 본 발명의 이중-가닥 핵산 분자는 다음의 프로모터-아폽토시스 억제제 조합의 이용을 포함한다:

RSV - 인간 아폽토시스 억제제(Human Inhibitor of Apoptosis, IAP) 1

RSV - 앱스타인 바 EBNA5

RSV - BCL - XL

SV40 - 인간 아폽토시스 억제제(IAP) 1

SV40 - 앱스타인 바 EBNA5

SV40 - BCL - XL

PGK - 인간 아폽토시스 억제제(IAP) 1

PGK - 앱스타인 바 EBNA5

PGK - BCL - XL

유비퀴틴 - 인간 아폽토시스 억제제(IAP) 1

유비퀴틴 - 앱스타인 바 EBNA5

유비퀴틴 - BCL- XL.

바람직하게, 상기 이중-가닥 핵산 분자는 IAP1, EBNA5 및 BCL-XL 중 적어도 2개의 조합을 포함하며, IAP1, EBNA5 및 BCL-XL의 발현은 바람직하게는 RSV, CMV, SV40, PGK, GRP78, EF1-알파, SFFV, CHEF-1, 아데노바이러스 E1A, 닭 베타 액틴, CAG, CMV-베타-글로빈, 및 유비퀴틴 프로모터로부터 선택되는 임의의 프로모터에 의해 구동된다.

본 발명의 이중-가닥 핵산 분자는 적어도 1개의 전이유전자를 추가적으로 포함할 수 있다. 다른 구현예에서, 본 발명의 이중-가닥 핵산 분자 및 전이유전자를 포함하는 벡터 또는 플라스미드를 포함하는 키트가 제공된다.

일부 구현예에서, 상기 env 및 gag-pol 유전자는 부위-특이적인 재조합 부위, 바람직하게는 LoxP 또는 FRT 부위, 보다 바람직하게는 LoxP 부위에 의해 플랭킹(flaking)된다.

본 발명은 특히 본 발명의 이중-가닥 핵산을 포함하는 레트로바이러스 패키징 플라스미드를 제공한다.

본 발명의 바람직한 구현예의 예는 다음의 요소를 이 순서로 포함하는 이중-가닥 핵산 분자를 함유한다:

TetR 유전자(역 방향) - (유도성, 예를 들어, Tet 억제성 프로모터) VSV-G 유전자 - (구성적, 예를 들어 EF1a, 프로모터) 퓨로마이신 내성 - gag-pol 유전자(역 방향; 유도성, 예를 들어, Tet 억제성, 프로모터) - 아폽토시스 억제제 1 - 아폽토시스 억제제 2.

TetR 유전자(역 방향) - (유도성, 예를 들어, Tet 억제성 프로모터) VSV-G 유전자 - (IRES, 프로모터) 퓨로마이신 내성 - gag-pol 유전자 (역 방향; 유도성, 예를 들어, Tet 억제성, 프로모터) - 아폽토시스 억제제 1 - 아폽토시스 억제제 2.

(구성적 프로모터) VSV-G 유전자 - (구성적 프로모터) 퓨로마이신 내성 - gag-pol 유전자(역 방향; 구성적 프로모터) - 아폽토시스 억제제 1 - 아폽토시스 억제제 2.

(구성적 프로모터) VSV-G 유전자 - IRES - 퓨로마이신 내성 - gag-pol 유전자(역 방향; 구성적 프로모터) - 아폽토시스 억제제 1 - 아폽토시스 억제제 2.

2개 아미노산 또는 핵산 서열을 정렬하기 위해 이용가능한 많은 기존 알고리즘이 있다. 전형적으로, 1개 서열은 참조 서열로서 작용하여, 이것과 시험 서열이 비교될 수 있다. 상기 서열 비교 알고리즘은, 지정된 프로그램 매개변수(parameter)에 기반하여, 참조 서열에 대한 시험 서열(들)의 백분율 서열 동일성을 계산한다. 비교를 위한 아미노산 또는 핵산 서열의 정렬이, 예를 들어, 컴퓨터-구현 알고리즘(예를 들어, GAP, BESTFIT, FASTA 또는 TFASTA), 또는 BLAST 및 BLAST 2.0 알고리즘에 의해 수행될 수 있다.

백분율 아미노산 서열 동일성 및 뉴클레오티드 서열 동일성은 정렬의 BLAST 방법을 이용하여 얻어질 수 있다(Altschul et al. (1997), "Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs", Nucleic Acids Res. 25:3389-3402; 및 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST). 바람직하게 표준 또는 디폴트(default) 정렬 매개변수가 이용된다.

단백질 데이터베이스에서 유사한 서열을 찾기 위해 표준 단백질-단백질 BLAST(blastp)가 이용될 수 있다. 다른 BLAST 프로그램처럼, blastp는 유사성이 있는 국소적 영역을 찾기 위해 설계되었다. 서열 유사성이 전체 서열에 이를 경우, blastp는 또한 전체적인 정렬을 보고할 것이며, 이는 단백질 동정 목적을 위한 바람직한 결과이다. 바람직하게 표준 또는 디폴트 정렬 매개변수가 이용된다. 일부 경우에, "저복잡도 필터(low complexity filter)"가 제외(take off)될 수 있다.

BLAST 단백질 검색은 또한 BLASTX 프로그램, 점수(score)=50, 단어 길이(wordlength)=3으로 수행될 수 있다. 비교 목적의 갭핑된(gapped) 정렬을 얻기 위해, Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25: 3389에 기재된 바와 같이, (BLAST 2.0에서) 갭핑된 BLAST가 사용될 수 있다. 대안적으로, 분자들 사이의 연원 관계(distant relationship)를 검출하는 반복 탐색을 수행하기 위해 (BLAST 2.0에서) PSI-BLAST가 이용될 수 있다(Altschul et al. (1997) 참조). BLAST, 갭핑된 BLAST, PSI-BLAST를 이용할 때, 각 프로그램의 디폴트 매개변수가 이용될 수 있다.

뉴클레오티드 서열 비교와 관련하여, MEGABLAST, 불연속-메가블라스트(discontiguous-megablast), 및 blastn이 이 목표를 달성하기 위해 이용될 수 있다. 바람직하게 표준 또는 디폴트 정렬 매개변수가 이용된다. MEGABLAST는 매우 유사한 서열 사이에서 긴 정렬을 효과적으로 찾도록 특별히 설계되어 있다. 불연속-MEGABLAST는, 본 발명의 핵산과 유사하지만 동일하지는 않은 뉴클레오티드 서열을 찾기 위해 이용될 수 있다.

상기 BLAST 뉴클레오티드 알고리즘은 질의(query)를 단어(word)라고 불리는 짧은 서브서열(subsequence)로 분할함으로써 유사한 서열을 찾는다. 상기 프로그램은 먼저 질의 단어에 대한 정확한 매칭(단어 히트(hit))을 동정(identify)한다. 이후에, 상기 BLAST 프로그램은 다수의 단계에서 이들 단어 히트를 확장하여 최종 갭핑된 정렬을 생성한다. 일부 구현예에서, 상기 BLAST 뉴클레오티드 검색은 BLASTN 프로그램, 점수=100, 단어길이=12로 수행될 수 있다.

BLAST 검색의 민감도를 좌우하는 중요 매개변수 중 하나는 단어 크기이다. blastn이 MEGABLAST보다 더욱 민감한 가장 중요한 이유는, 이것이 더 짧은 디폴트 단어 크기(11)를 이용한다는 것이다. 이 때문에, 다른 유기체로부터의 관련 뉴클레오티드 서열에 대한 정렬을 찾는데 있어 blastn이 MEGABLAST보다 더 우수하다. 상기 단어 크기는 blastn에서 조절가능하며, 검색 민감도를 증가시키기 위해 디폴트 값에서 최소 7까지 낮출 수 있다.

새롭게-도입된 불연속 메가블라스트 페이지(www.ncbi.nlm.nih.gov/Web/Newsltr/FallWinter02/blastlab.html)를 이용함으로써 보다 민감한 검색이 달성될 수 있다. 이 페이지는 Ma et al. (Bioinformatics. 2002 Mar; 18(3): 440-5)에 의해 보고된 것과 유사한 알고리즘을 이용한다. 불연속 메가블라스트는 정렬 확장을 위한 시드(seed)로서 정확한 단어 매칭을 필요로 하기보다는, 주형의 더 긴 창(window) 내의 비-인접 단어를 이용한다. 코딩 모드에서, 3번째 위치에서의 미스매칭을 무시하면서 1번째 및 2번째 코돈 위치에서의 매칭을 찾는데 초점을 맞추는 것에 의한 3번째 염기의 워블링(wobbling)이 고려된다. 동일한 단어 크기를 이용한 불연속 MEGABLAST에서의 검색은, 동일한 단어 크기를 이용한 표준 blastn보다 더 민감하고 효율적이다.

불연속 메가블라스트의 고유한 매개 변수는 다음과 같다:

단어 크기: 11 또는 12; 주형: 16, 18, 또는 21; 주형 유형: 코딩(0), 비-코딩(1), 또는 둘 다(2).

일부 구현예에서, 상기 디폴트 매개변수를 이용한 BLASTP 2.5.0+ 알고리즘(예컨대, NCBI로부터 이용가능한 것)이 이용될 수 있다.

다른 구현예에서, 갭 코스트(gap cost): 존재(Existence) 11 및 확장(Extension) 1을 갖는 2개의 단백질 서열의 니들만-브니쉬 정렬(Needleman-Wunsch alignment)을 이용한 BLAST 글로벌 정렬(BLAST Global Alignment) 프로그램(예컨대, NCBI로부터 이용가능한 것)이 이용될 수 있다.

본 발명은 또한 키트로서,

(i) 본 발명의 이중-가닥 핵산을 포함하는 레트로바이러스 패키징 벡터를 포함하되, 다음 중 1개 이상과 함께 포함하는 키트를 제공한다:

(ii) 전이유전자 및 레트로바이러스 rev 유전자를 포함하는 레트로바이러스 전송 벡터(Transfer Vector);

(iii) 바이러스 입자의 생산에 적합한 세포주의 세포.

본 발명은 또한 키트로서,

(i) rev 유전자를 추가적으로 포함하는, 본 발명의 이중-가닥 핵산을 포함하는 레트로바이러스 패키징 벡터를 포함하되, 다음 중 1개 이상과 함께 포함하는 키트를 제공한다:

(ii) 전이유전자를 포함하는 레트로바이러스 전송 벡터;

(iii) 바이러스 입자의 생산에 적합한 세포주의 세포.

상기 레트로바이러스 전송 벡터는 세포 게놈 내로 전이유전자를 삽입하기 위한 부위(예를 들어, LTR)을 함유한다. 바람직하게, 상기 5'-LTR은 상기 전송 벡터 내에 프로모터를 함유하고, 이렇게 하여 상기 Tat 단백질의 필요성을 제거한다.

상기 키트는 또한 바이러스 입자의 정제를 위한 물질, 예컨대, 바이러스 입자의 밀도 밴드화(banding) 및 정제에 수반되는 것, 예를 들어, 원심분리 튜브, 이오딕사놀, 투석 완충액 및 투석 카세트 중 1개 이상을 함유할 수 있다.

본 발명은 또한 본 발명의 이중-가닥 핵산을 포함하는 포유류 세포를 제공한다. 본 발명의 이중-가닥 핵산은 상기 포유류 세포의 핵 게놈 내로 안정하게 통합될 수 있거나 또는 상기 세포 내의 벡터 또는 플라스미드 내에 존재할 수 있다. 바람직하게, 본 발명의 이중-가닥 핵산은 상기 포유류 세포의 핵 게놈 내로 안정하게 통합된다.

상기 세포는 단리된 세포일 수 있고, 예를 들어, 이들은 살아있는 동물에 위치하지 않는다. 포유류 세포의 예는 인간, 마우스, 랫트, 햄스터, 원숭이, 토끼, 당나귀, 말, 양, 젖소 및 유인원으로부터의 임의의 기관 또는 조직의 것을 함유한다. 바람직하게 상기 세포는 인간 세포이다. 상기 세포는 1차 또는 무한증식 세포(immortalised cell)일 수 있다. 바람직한 세포는 HEK-293, HEK 293T, HEK-293E, HEK-293FT, HEK-293S, HEK-293SG, HEK-293FTM, HEK-293SGGD, HEK-293A, MDCK, C127, A549, HeLa, CHO, 마우스 골수종, PerC6, 911, 및 Vero 세포주를 함유한다. HEK-293 세포는 E1A 및 E2B 단백질을 함유하도록 변형되었으며, 이는 트랜스-상보성에 의해 이 세포주에서 성장할 E1A 및 E1B 영역의 결실을 갖는 바이러스가 생성되는 것을 가능하게 한다. 유사하게, PerC6 및 911 세포는 유사한 변형을 함유하며 또한 이용될 수 있다. 가장 바람직하게, 상기 인간 세포는 HEK293, HEK293T, HEK293A, PerC6 또는 911이다. 다른 바람직한 세포는 CHO 및 VERO 세포를 함유한다. 바람직하게, 본 발명의 세포는 상기 env 및 gag-pol 유전자를 유도적으로 발현할 수 있다.

본 발명은 또한 본 발명의 이중-가닥 핵산 분자를 포함하는, 레트로바이러스 패키징 세포, 바람직하게는 포유류 세포, 보다 바람직하게는 인간 세포)를 제공한다.

그러므로, 추가의 구현예에서, 레트로바이러스 패키징 세포의 생산 방법이 제공되되, 상기 방법은 다음 단계를 포함한다:

(i) 본 발명의 이중-가닥 핵산 분자를 포유류 세포 내로 안정하게 통합시키고,

그에 의해 레트로바이러스의 env 및 gag-pol 유전자 및 임의로 상기 rev 유전자를 발현하는 포유류 세포를 생산하는 단계.

본 발명은 또한 레트로바이러스 입자의 생산에 있어서 본 발명의 레트로바이러스 패키징 세포의 용도를 제공한다.

본 발명은 또한 레트로바이러스의 생산 방법을 제공하되, 상기 방법은 다음 단계를 포함한다:

(a) 5' 및 3' 레트로바이러스 LTR을 포함하는 레트로바이러스 전송 벡터 및 레트로바이러스 패키징 신호 및 레트로바이러스 rev 유전자를 본 발명의 레트로바이러스 패키징 세포 내로 도입시키는 단계로서, 상기 레트로바이러스 패키징 세포는 그의 게놈 내로 안정하게 통합된 레트로바이러스의 env 및 gag-pol 유전자를 포함하는 단계;

(b) 레트로바이러스가 조립되고 상기 세포에 의해 분비되는 조건 하에서 상기 세포를 배양하는 단계; 및

(c) 패키징된 레트로바이러스를 상층액으로부터 수확하는 단계.

본 발명은 또한 레트로바이러스의 생산 방법을 제공하되, 상기 방법은 다음 단계를 포함한다:

(a) 전이유전자를 포함하는 레트로바이러스 전송 벡터를 본 발명의 레트로바이러스 패키징 세포 내로 도입시키는 단계로서, 상기 레트로바이러스 패키징 세포는 그의 게놈 내로 안정하게 통합된 레트로바이러스의 env, gag-pol 및 rev 유전자를 포함하는 단계;

(b) 레트로바이러스가 조립되고 상기 세포에 의해 분비되는 조건 하에서 상기 세포를 배양하는 단계; 및

(c) 패키징된 레트로바이러스를 상층액으로부터 수확하는 단계.

바람직하게, 상기 바이러스 벡터는 복제-결함(replication-defective) 또는 복제-부적격(replication-incompetent)이다.

본원에서 이용될 때 용어, 1개 이상의 벡터를 상기 세포 내로 "도입하는"이라 함은 형질전환, 및 특히 전기천공, 접합(conjugation), 감염, 형질도입 또는 형질감염 중 임의의 형태를 포함한다. 이러한 도입을 위한 방법은 당해 기술 분야에 널리 공지되어 있다(예를 들어, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1995 Aug 1;92 (16):7297-301). 바람직하게, 수확된 레트로바이러스는 그 후에 정제된다.

본원에 제시된 각각의 참조 문헌의 개시사항은 명시적으로 그 전체가 참조로서 본원에 포함된다.

도 1: VSV-G + 아폽토시스 억제제를 발현하는 안정한 세포주의 생성.
도 2: VSV-G 안정한 세포주로부터 렌티바이러스 입자의 발현.
도 3: VSV-G 및 gag-pol 유전자를 발현하는 벡터에서 주요 발현 카세트의 배열의 개략적인 예시. 유도성 프로모터는 i로 지칭되고 구성적 프로모터는 c로 지칭된다. A.I.는 아폽토시스 억제제를 나타낸다.
도 4: 주요 발현 카세트의 배열을 예시하는 개략적인 다이어그램. LTR은 긴 말단 반복을 표시하며, RSV는 라우스 육종 바이러스 프로모터를 표시하고, PGK는 인간 포스포글리세레이트 키나제 프로모터를 표시하고, G418은 G418(제네티신) 내성 유전자를 표시하며 블라스트(Blast)는 블라스티시딘 내성 유전자를 표시한다.
도 5: 패키징 및 생산자 세포주 생성을 위한 렌티바이러스 벡터의 일시적 평가.
도 6: 퓨로마이신 선택 동안 상이한 패키징 세포주의 생존도(viability).
도 7: % FITC 양성 모집단에 의해 평가될 때 관심대상인 동정된 클론에서 유도에 이어 표면 VSV-G 발현.
도 8: 전사적 번역-초과 평가를 위한 VSV-G 발현 작제물.
도 9: AMBR 생물반응기 시스템에서 상이한 공정 조건을 이용한 바람직한 패키징 계통(CV170)의 분석.
도 10: 비-유도된 생산자 세포주부터, 유도된 생산자 세포주까지의 바이러스 역가의 배수 변화.

실시예

본 발명은 다음의 실시예에 의해 추가로 예시되며, 달리 언급되지 않는 한 부분(part) 및 백분율은 중량 기준이고, 도(degree)는 섭씨이다. 이들 실시예는, 본 발명의 바람직한 구현예를 나타내지만, 단지 예시로서 제공되는 것임을 이해해야 한다. 상기한 논의 및 이들 실시예로부터, 당업자는 본 발명의 본질적인 특징을 확인할 수 있으며, 이의 사상 및 범위를 벗어나지 않고, 본 발명을 다양한 이용 및 조건에 적응시키기 위해 본 발명의 다양한 변화 및 변형을 만들 수 있다. 이에 따라, 본원에 나타나고 기술된 것들에 추가하여 본 발명의 다양한 변형이 앞의 상세한 설명으로부터 당업자에게 명백할 것이다. 이러한 변형은 또한 첨부된 청구 범위의 범위 내에 속하는 것으로 의도된다.

실시예 1: 바이러스 단백질 발현을 지원하는 인자의 동정

소수포구내염 바이러스 유래의 바이러스 당단백질, VSV-G을 아폽토시스 억제제의 패널(panel)과 함께 동시-발현시켰다. 본 발명자들은 VSV-G의 구성적 발현을 지원하는 여러 분자를 동정할 수 있었으며, 항생제 선택을 통해 안정한 세포주를 확립할 수 있었다. 그 후에, 후반의 실시예에 기재된 바와 같이, 최종 렌티바이러스 패키징 및 생산자 세포주에 함유될 바람직한 아폽토시스 억제제를 선택하기 위해 이 데이터를 이용하였다.

IRES를 통해 퓨로마이신 선택 마커에 작동가능하게(operatively) 연결된 VSV-G 및 많은 아폽토시스 억제제 유전자를 인코딩하는 다양한 발현 벡터와 함께 PEI 시약을 이용하여 HEK293 현탁 세포를 형질감염시켰다. 선택적 배지에서 3 내지 4일마다 배지 교환하여 안정한 풀(pool)을 확립하였다. 구성적으로 발현되는 VSV-G 유전자의 독성으로 인해, 안정한 풀을 확립하기까지 오랜 기간이 걸렸다. 그 결과가 도 1에 나타나있다. 예시된 바와 같이, 선택된 아폽토시스 억제제는 VSV-G 단독 작제물에 비해 안정한 풀 회복 비율을 증가시켰다.

안정적으로-통합된 카피들에서 발현된 VSV-G를 제외한, 렌티바이러스 발현에 필요한 인자(GagPol, Rev, 게놈) 모두를 인코딩하는 3개 벡터와 함께 PEI 시약을 이용하여 안정한 풀을 형질감염시켰다. 제어 목적을 위해, 모(parental) HEK293 계통을, VSV-G 벡터를 함유하는 것을 제외하고 동일한 플라스미드 세트로 형질감염시켰다. 상기 게놈은 eGFP 유전자를 함유하였고 이것은 부착 HEK293 세포에서 (바이러스 감염 역가를 평가하기 위한) 역가측정(titration)을 위해 이용되었다. 결과가 도 2에 나타나있다. 이 실험은, 구성적 세포주가 아폽토시스 억제제의 동시-발현에 의해 지원될 때 기능적 VSV-G 발현을 제공할 수 있다는 사실을 입증하였다. 이러한 발현은, 패키징 세포주의 안정한 생산자의 환경에서 높은-수준의 바이러스 입자 생산을 지원하기에 충분할 것으로 여겨진다.

실시예 2: 렌티바이러스 패키징 및 생산자 세포주 작제를 위한 작제물의 생산

4개의 작제물을 도 3에 예시된 바와 같이 생산하였다. 상기 작제물은 퓨로마이신 선택 마커를 이용하여 VSV-G 및 gag-pol 유전자를 짝지었고 G419 또는 블라스티시딘 선택 마커 중 어느 하나를 이용하여 rev 및 게놈을 짝지었다.

각각의 카세트는 다음과 같은 기능적 성분으로 나뉘어질 수 있다:

VSV-G 카세트

ㆍ 유도성 프로모터(전략적 위치에 2개의 TetO 부위를 부가하는 것에 의해 유도성 프로모터로 전환되는 PGK CMV 융합 프로모터) 또는 구성적 프로모터(PGK CMV 융합 프로모터)

ㆍ 5'UTR = 인간 3탄당 인산 이소머라제(triose phosphate isomerase, TPI) 인트론

ㆍ CDS(HEK293 세포에서의 발현을 위해 최적화된 VSV-G 코돈)

ㆍ 토끼 베타-글로빈 폴리A 신호

GagPol 카세트

ㆍ 유도성 프로모터(전략적 위치에 2개의 TetO 부위를 부가하는 것에 의해 유도성 프로모터로 전환되는 CMV) 또는 구성적 프로모터(CMV)

ㆍ 5'UTR(인간 베타-글로빈 인트론)

ㆍ CDS(야생형 HIV GagPol)

ㆍ HIV-1 유래의 RRE

ㆍ 인간 베타-글로빈 폴리A 신호

TetR 단백질 발현 카세트(오직 유도성 벡터에만 존재함)

ㆍ 프로모터(CMV)

ㆍ TetR 서열(HEK293 세포에서의 발현을 위해 최적화된 코돈)

ㆍ 폴리A

항생제 내성 마커

ㆍ 퓨로(IRES-퓨로 또는 EF1-알파-퓨로 중 어느 하나)

아폽토시스 억제제 카세트

ㆍ IAP1 및 EBNA5

Rev/게놈 벡터

렌티바이러스 입자 생산에 필요한 모든 인자를 함유하는 생산자 세포주를 생성하기 위해, 상기 Rev/게놈 벡터가 상기 VSV-G/GagPol 안정한 세포주 내로 안정하게 통합되도록 설계하였다. 상기 Rev/게놈 작제물을 나타내는 개략도가 도 4에 나타나있다.

상기 Rev/게놈 벡터 카세트의 각각은 다음과 같은 기능적 성분으로 나뉘어질 수 있다:

게놈

ㆍ 3세대 렌티바이러스 게놈

ㆍ 상기 렌티바이러스 게놈의 전사를 구동하는 이종 CMV 프로모터에 융합된 키메라적 5'LTR

전이유전자 카세트

ㆍ 상기 전이유전자는 녹색 형광 단백질(GFP) 또는 항-CD19 키메라적 항원 수용체(CAR)이다.

ㆍ 상기 전이유전자는 비장 병소 형성 바이러스(Spleen focus forming virus, SFFV) 프로모터로부터 발현된다.

Rev 카세트

ㆍ 구성적 RSV 프로모터

ㆍ Rev CDS

항생제 내성 마커

ㆍ PGK-G418 또는 PGK-블라스트

실시예 3: 일시적 환경에서 렌티바이러스 패키징 및 생산자 세포주 작제를 위한 작제물의 분석

안정한 세포주에서 이용될 벡터의 기능성을 평가하기 위해, 이들을 먼저 이용하여 부착 세포에서 일시적 실험으로 렌티바이러스 입자를 생성하였다. 이것은 표준 4-벡터 일시적 발현 벡터에 대한 벤치마킹을 허용하였다.

안정한 렌티바이러스 생산자 세포주 작제의 목적을 위해 생성된 (구성적 또는 유도성) 작제물을 함유하는 2, 3 또는 4-플라스미드 렌티바이러스 패키징 시스템으로 부착 293T 세포를 형질감염시켰다. 처음부터 끝까지, eGFP를 게놈 벡터 내의 전이유전자로서 이용하였다.

72시간 후에 렌티바이러스 함유 상층액을 수집하고, DMEM으로 연속 희석하고 이용하여 부착 293 세포를 감염시켰다. 72시간 후에, 상기 세포를 트립신화하고 eGFP 신호에 대해 유세포 분석기에서 분석하였다.

그 후에 감염성 입자 농도를 계산하기 위해 10 내지 20% eGFP 양성인(즉, 형질도입된) 세포가 달성된 연속 희석물로부터의 데이터를 이용하였다. 평가 중인 상이한 패키징/생산자 작제물의 성능을 측정하기 위해 이것을 이용하였다.

0일: 293T 세포를 10% 포에탈 소 혈청(Foetal Bovine serum)으로 보충된 DMEM 중의 6-웰 플레이트(well plate) 내로 사전-정의된 밀도로 시딩(seeding)하여, 다음 날의 형질감염을 준비하였다. 세포를 가습 인큐베이터에서 37℃, 5% CO₂로 밤새도록 인큐베이션하였다.

1일: 평가 중인 작제물이 구성적인지 또는 유도성인지와는 상관없이, 독시사이클린과 함께 또는 독시사이클린 없이, 표 1에 상세히 설명된 바와 같이 플라스미드의 조합과 함께 분지형 PEI을 이용하여 세포를 형질감염시켰다.

3일: 293 세포를 DMEM + 10% FBS 중의 48-웰 플레이트 내로 사전-정의된 밀도로 시딩하여, 다음 날의 감염을 준비하였다. 세포를 가습 인큐베이터에서 37℃, 5% CO₂로 밤새도록 인큐베이션하였다.

4일: 렌티바이러스 상층액의 수확 후에 세포 부스러기를 제거하기 위한 원심분리. 렌티바이러스를 연속 희석하고 293 세포를 감염시키기 위해 이용하였다.

7일: 형질도입된 세포의 수확 및 유세포 분석기에 의한 분석. 그 후에 10 내지 20% eGFP 양성(즉, 형질도입된) 세포가 달성된 희석물을 이용하여, 감염성 입자 농도를 계산하였다.

부착 293T 세포에서 일시적 렌티바이러스의 생산에 대해 4, 3 및 2 플라스미드 시스템 작제물의 조합을 시험하였다. 상기 조합을 하기의 표 1에 나타낸다.

표 1:

많은 결론들이 이 데이터로부터 이끌어졌다:

ㆍ 상기 렌티바이러스 벡터 내의 모든 성분은 완전히 기능적이다.

ㆍ 2 플라스미드 시스템은 높은 렌티바이러스 역가를 제공할 수 있으며, 많은 경우에 3 또는 4-플라스미드 시스템을 능가하거나 또는 이와 동등하다.

ㆍ 상기 2-플라스미드 시스템에서 아폽토시스 억제제를 또한 인코딩하는 구성적 VSV-G/GagPol 작제물은, 이들 카세트가 결여된 동일 작제물과 비교했을 때, 높아진 렌티바이러스 생산을 나타내었다(도 5, 박스 A 대 박스 B).

ㆍ 아폽토시스 억제제를 갖거나 또는 갖지 않는 유도성 VSV-G/GagPol 작제물은 구성적 작제물보다 단지 약간 아래인, 높은-수준의 바이러스 입자 발현을 나타내었다(도 5, 박스 C 대 박스 B).

ㆍ 독스(Dox) 부재 하의 발현 수준에 의해 나타난 바와 같이, 유도성 작제물(박스 C)은 매우 엄격한 유전자 조절을 나타낸다.

ㆍ 전반적으로, 독시사이클린 처리는 유도 시스템과 상관없이 바이러스 입자 발현을 증가시켰다.

실시예 4: VSV-G/GagPol 패키징 세포주의 생성 및 분석

선형 PEI를 이용하여 아폽토시스 억제제와 함께 또는 아폽토시스 억제제 없이 VSV-G 또는 VSV-G와 GagPol 중 어느 하나를 인코딩하는 선형화된 유도성 패키징 작제물(하기 표 2에 상세히 설명됨)로 현탁 HEK293 세포를 형질감염시켰다. 그 후에, 숙주 세포주와 유사한 성장 특성을 가지며 ≥90%의 생존도를 얻을 때까지 퓨로마이신 처리로 안정하게 통합된 유전자를 가진 세포를 선택하였다(도 1). 상기 VSV-G/GagPol 세포 풀을 단일 세포 클로닝(cloning)으로 옮겨졌으며 단일클론성 높은 발현 세포주를 얻었다. 이것은 소니 SH800 세포 분별장치(Sony SH800 Cell Sorter)를 이용한, 96 웰 플레이트 중에 제조된 클로닝 배지 내로의 단일 세포 분류를 통해 수행되었다. 이후에 콜로니를 형성하는 단일 세포는 VSV-G 단백질 발현 평가를 위한 충분한 수의 세포가 얻어질 때까지 여러 규모-확대 단계를 거쳤다. 이 목적을 위해, 세포 클론을 비히클 대조군(DMSO) 또는 독시사이클린 중 어느 하나와 함께 24시간 동안 인큐베이션시켜 VSV-G/GagPol 발현을 유도하였다. 상기 세포를 항-VSV-G 및 대응하는 2차 FITC-접합된 항체로 염색시켰고 유세포 분석기로 FITC 양성 세포에 대해 분석하였다. 결과가 도 6에 나타나있다.

표 2. 안정한 패키징 세포주 생성에 이용된 작제물

클로닝 실험에 이어 많은 클론성 세포주가 생산되었다. 2개 클론으로부터의 대표적인 데이터가 도 7에 나타나있다. 클론 CV02 및 CV 35 둘 다는 독시사이클린 처리에 이어 VSV-G의 높은 수준 발현을 나타내었다. 그러나, CV 35는 또한 VSV-G의 높은 기저 발현을 나타내었는데, 이는 Tet 조절 시스템의 누설-기능성(leaky-functionality)을 나타낸다. 이것은 생성된 패키징 작제물을 이용하여, VSV-G/GagPol 유전자의 안정한 높은 발현이 유도성 환경에서 달성될 수 있음을 입증한다.

실시예 5: 생산자 세포주의 생성 및 분석

선형 PEI를 이용하여 Rev 단독, 또는 Rev와 바이러스 게놈의 조합 중 어느 하나를 인코딩하는 선형화된 구성적 작제물(eGFP 또는 CD19)로 단일클론성 VSV-G/GagPol 현탁 HEK293 세포주(실시예 4에 상세히 설명됨)를 형질감염시켰다(작제물 상세 내용에 대해 표 3 참조). 그 후에, 숙주 세포주와 유사한 성장 특성을 가지며 ≥90%의 생존도가 얻어질 때까지 블라스티시딘 선택으로 안정하게 통합된 유전자를 가진 세포를 선택하였다. 생성된 생산자 세포를 독시사이클린으로 유도하고, 정해진 생산 기간 후에 배양 상층액을 수집하고 세포 부스러기로부터 투명하게 하였다. 그 후에, 이 바이러스 상층액을 연속 희석하였고 72시간 동안 저캇 세포(Jurkat cell)의 감염(eGFP 및 CD19) 또는 부착된 293 세포의 감염(eGFP 단독)을 위해 이용하였다. 유세포 분석기를 통해 eGFP 렌티바이러스로 감염된 저캇 및 293 세포를 직접적으로 분석하고, 10 내지 20% eGFP 양성(즉, 형질도입된) 세포를 수득하는 희석물을 이용하여 감염성 입자 농도를 계산하였다.

CD19의 경우에, 감염된 저캇 세포를 단백질 L을 통해 염색하여 표면 CD19 발현을 검출하고, eGFP와 유사하게, 감염성 입자 농도를 추산한다. VSV-G/GagPol 발현의 동시적인 독시사이클린 유도 및 eGFP 바이러스 게놈의 일시적 감염을 이용해 패키징 세포주(VSV-G/GagPol + Rev)를 평가한다. 이후, 생산된 바이러스 상층액을 연속 희석하고 감염성 입자 농도를 확립하기 위해 저캇 및 293 세포를 감염시키기 위해 이용한다. 바람직한 생산자 풀은 소니 SH800 세포 분별장치를 이용한, 96 웰 플레이트 중에 제조된 클로닝 배지 내로의 단일 세포 분류로 이동시켰다. 이후에 콜로니를 형성하는 단일 세포는, 상기에 약술된 방식으로 독시사이클린 유도에 이어 렌티바이러스 생산 평가를 위해 충분한 수의 세포가 얻어질 때까지 여러 규모-확대 단계를 거쳤다.

표 3. 안정한 생산자 세포주 생성을 위한 단일클론성 패키징 세포주의 형질감염을 위해 이용된 작제물

실시예 6: 바이러스 유전자와 복제 적격 렌티바이러스(RCL)를 생성할 가능성 사이의 전사적 번역-초과 분석

레트로바이러스 벡터의 이용에 관한 주요 안전 관련사항(safety implication)은 복제-적격 입자를 생성시키는 리스크이다. 이것은 3세대 시스템에 의한 일시적 렌티바이러스 발현의 환경에서 처리되어 왔는데, 이 시스템은 패키징 인자에 대한 별개의 벡터뿐만 아니라 프로모터 활성을 제거하는 LTR 영역 내 결실을 포함하여 전이유전자의 전사가 내부 프로모터에 의존하도록 한다.

안정한 생물생산(bioproduction) 세포주를 생성하기 위해 이용되는 작제물 중 VSV-G 및 gag-pol 유전자의 배열, 및 RCL 생성의 리스크를 감소시키는 가능성을 평가하기 위해, VSV-G가 루시퍼라제 리포터와 함께 정방향 및 역방향 둘 다로 발현되는, 2개의 추가적인 작제물을 생성하였다. 이것이 도 8에 예시되어 있다.

그 후에 2개의 작제물을 부착 HEK293T 세포 내로 일시적으로 형질감염시켰고, 독시사이클린으로 처리하여 전사를 유도하였으며, 24시간 후에 루시퍼라제 활성을 측정하였다. 정방향 작제물에서 루시퍼라제 활성의 존재는 번역-초과 전사를 나타내는데, 이는 안정한 세포주 환경 중에서 본 발명에서 이용된 유전자 배열에 의해 회피되는 안전 문제와 직접적으로 관련이 있다.

실시예 7: VSV-G/GagPol 패키징 세포주의 분석

추가적인 패키징 세포주를 실시예 4에 기재된 것과 동일한 방법으로 생산하였다. 생산 매개변수를 분석하고 최적화하기 위해, 패키징 세포주를 진탕 플라스크 내 및 미니어처 생물 반응 장치 시스템(AMBR15) 내 둘 다에서 성장시켰다. 여기서 예시된 것들은 선형화된 Q1850 플라스미드의 안정한 통합에 의해 생산하였다.

생산 매개변수를 조사하기 위해, Rev/게놈 플라스미드(Q1847)의 PEI-기반 형질감염 후 72시간 동안 패키징 세포주를 배양하였고 독시사이클린을 이용해 유도하였다. 상층액을 수집하고 유세포 분석기-기반 감염성 역가 측정법으로 분석하였다. 데이터는 도 9에 나타나있으며, AMBR 생물 반응 장치 시스템에서의 상이한 공정 조건을 이용한 바람직한 패키징 계통(CV170)의 분석을 대표한다.

실시예 8: 생산자 세포주의 분석

바람직한 패키징 세포주(CV170)를 완전히 안정한 생산자 세포주의 생성을 위한 시작 지점으로서 이용하였다. 선형화된 Q3928 플라스미드의 안정한 통합에 의해 안정한 풀을 만들었고, 이후에 이를 FACS 분류에 의해 클로닝하였다. 이후에 클론성 계통을 확장하고 깊은 웰 진탕 플레이트(deep well shaking plate)에서 분석하였다. 이 데이터에 기반하여, 선택된 클론성 세포주를 진탕 플라스크 배양 내로 규모-확대시켰다.

진탕 플라스크 내로 이동시키자마자, 세포 배양 배지에 독시사이클린을 부가하는 것에 의해 생산자 세포주를 유도하였다. 유도 후 72시간에, 상층액을 수집하고 유세포 분석기-기반 감염성 역가 측정법으로 분석하였다. 데이터는 비-유도된 것부터 유도된 것까지 바이러스 역가의 배수 변화로서 도 10에 나타나있다.

서열

<110> Oxford Genetics Limited <120> RETROVIRAL VECTORS <130> MPI20-001 <150> GB 1715052.5 <151> 2017-09-19 <160> 14 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 2571 <212> DNA <213> Human immunodeficiency virus type 1 <400> 1 atgagagtga aggagaaata tcagcacttg tggagatggg ggtggagatg gggcaccatg 60 ctccttggga tgttgatgat ctgtagtgct acagaaaaat tgtgggtcac agtctattat 120 ggggtacctg tgtggaagga agcaaccacc actctatttt gtgcatcaga tgctaaagca 180 tatgatacag aggtacataa tgtttgggcc acacatgcct gtgtacccac agaccccaac 240 ccacaagaag tagtattggt aaatgtgaca gaaaatttta acatgtggaa aaatgacatg 300 gtagaacaga tgcatgagga tataatcagt ttatgggatc aaagcctaaa gccatgtgta 360 aaattaaccc cactctgtgt tagtttaaag tgcactgatt tgaagaatga tactaatacc 420 aatagtagta gcgggagaat gataatggag aaaggagaga taaaaaactg ctctttcaat 480 atcagcacaa gcataagagg taaggtgcag aaagaatatg cattttttta taaacttgat 540 ataataccaa tagataatga tactaccagc tataagttga caagttgtaa cacctcagtc 600 attacacagg cctgtccaaa ggtatccttt gagccaattc ccatacatta ttgtgccccg 660 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ttctgggacg cagggggtgg gaagccctca aatattggtg gaatctccta 2400 cagtattgga gtcaggaact aaagaatagt gctgttagct tgctcaatgc cacagccata 2460 gcagtagctg aggggacaga tagggttata gaagtagtac aaggagcttg tagagctatt 2520 cgccacatac ctagaagaat aagacagggc ttggaaagga ttttgctata a 2571 <210> 2 <211> 856 <212> PRT <213> Human immunodeficiency virus type 1 <400> 2 Met Arg Val Lys Glu Lys Tyr Gln His Leu Trp Arg Trp Gly Trp Arg 1 5 10 15 Trp Gly Thr Met Leu Leu Gly Met Leu Met Ile Cys Ser Ala Thr Glu 20 25 30 Lys Leu Trp Val Thr Val Tyr Tyr Gly Val Pro Val Trp Lys Glu Ala 35 40 45 Thr Thr Thr Leu Phe Cys Ala Ser Asp Ala Lys Ala Tyr Asp Thr Glu 50 55 60 Val His Asn Val Trp Ala Thr His Ala Cys Val Pro Thr Asp Pro Asn 65 70 75 80 Pro Gln Glu Val Val Leu Val Asn Val Thr Glu Asn Phe Asn Met Trp 85 90 95 Lys Asn Asp Met Val Glu Gln Met His Glu Asp Ile Ile Ser Leu Trp 100 105 110 Asp Gln Ser Leu Lys Pro Cys Val Lys Leu Thr Pro Leu Cys Val Ser 115 120 125 Leu Lys Cys Thr Asp Leu Lys Asn Asp Thr Asn Thr Asn Ser Ser Ser 130 135 140 Gly Arg Met Ile Met Glu Lys Gly Glu Ile Lys Asn Cys Ser Phe Asn 145 150 155 160 Ile Ser Thr Ser Ile Arg Gly Lys Val Gln Lys Glu Tyr Ala Phe Phe 165 170 175 Tyr Lys Leu Asp Ile Ile Pro Ile Asp Asn Asp Thr Thr Ser Tyr Lys 180 185 190 Leu Thr Ser Cys Asn Thr Ser Val Ile Thr Gln Ala Cys Pro Lys Val 195 200 205 Ser Phe Glu Pro Ile Pro Ile His Tyr Cys Ala Pro Ala Gly Phe Ala 210 215 220 Ile Leu Lys Cys Asn Asn Lys Thr Phe Asn Gly Thr Gly Pro Cys Thr 225 230 235 240 Asn Val Ser Thr Val Gln Cys Thr His Gly Ile Arg Pro Val Val Ser 245 250 255 Thr Gln Leu Leu Leu Asn Gly Ser Leu Ala Glu Glu Glu Val Val Ile 260 265 270 Arg Ser Val Asn Phe Thr Asp Asn Ala Lys Thr Ile Ile Val Gln Leu 275 280 285 Asn Thr Ser Val Glu Ile Asn Cys Thr Arg Pro Asn Asn Asn Thr Arg 290 295 300 Lys Arg Ile Arg Ile Gln Arg Gly Pro Gly Arg Ala Phe Val Thr Ile 305 310 315 320 Gly Lys Ile Gly Asn Met Arg Gln Ala His Cys Asn Ile Ser Arg Ala 325 330 335 Lys Trp Asn Asn Thr Leu Lys Gln Ile Ala Ser Lys Leu Arg Glu Gln 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cacacattca agacgccgcc agccagctgc cggacgatga gtcgctgttc 1320 ttcggagaca cgggcttgtc aaagaatccc atcgagctgg tggaaggatg gttttcatcc 1380 tggaaaagca gcatcgcttc attcttcttc atcattggcc tgatcatcgg cctatttcta 1440 gtcctgcggg tgggaattca tctgtgcatc aagctcaagc acactaagaa gcggcaaatc 1500 tacactgata tcgagatgaa tcgcctgggc aag 1533 <210> 4 <211> 511 <212> PRT <213> Vesicular stomatitis virus <400> 4 Met Lys Cys Leu Leu Tyr Leu Ala Phe Leu Phe Ile Gly Val Asn Cys 1 5 10 15 Lys Phe Thr Ile Val Phe Pro His Asn Gln Lys Gly Asn Trp Lys Asn 20 25 30 Val Pro Ser Asn Tyr His Tyr Cys Pro Ser Ser Ser Asp Leu Asn Trp 35 40 45 His Asn Asp Leu Ile Gly Thr Ala Leu Gln Val Lys Met Pro Lys Ser 50 55 60 His Lys Ala Ile Gln Ala Asp Gly Trp Met Cys His Ala Ser Lys Trp 65 70 75 80 Val Thr Thr Cys Asp Phe Arg Trp Tyr Gly Pro Lys Tyr Ile Thr His 85 90 95 Ser Ile Arg Ser Phe Thr Pro Ser Val Glu Gln Cys Lys Glu Ser Ile 100 105 110 Glu Gln Thr Lys Gln Gly Thr Trp Leu Asn Pro Gly Phe Pro Pro Gln 115 120 125 Ser Cys Gly Tyr Ala 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ttaaaacata tagtatgggc aagcagggag 120 ctagaacgat tcgcagttaa tcctggcctg ttagaaacat cagaaggctg tagacaaata 180 ctgggacagc tacaaccatc ccttcagaca ggatcagaag aacttagatc attatataat 240 acagtagcaa ccctctattg tgtgcatcaa aggatagaga taaaagacac caaggaagct 300 ttagacaaga tagaggaaga gcaaaacaaa agtaagaaaa aagcacagca agcagcagct 360 gacacaggac acagcaatca ggtcagccaa aattacccta tagtgcagaa catccagggg 420 caaatggtac atcaggccat atcacctaga actttaaatg catgggtaaa agtagtagaa 480 gagaaggctt tcagcccaga agtgataccc atgttttcag cattatcaga aggagccacc 540 ccacaagatt taaacaccat gctaaacaca gtggggggac atcaagcagc catgcaaatg 600 ttaaaagaga ccatcaatga ggaagctgca gaatgggata gagtgcatcc agtgcatgca 660 gggcctattg caccaggcca gatgagagaa ccaaggggaa gtgacatagc aggaactact 720 agtacccttc aggaacaaat aggatggatg acacataatc cacctatccc agtaggagaa 780 atctataaaa gatggataat cctgggatta aataaaatag taagaatgta tagccctacc 840 agcattctgg acataagaca aggaccaaag gaacccttta gagactatgt agaccgattc 900 tataaaactc taagagccga gcaagcttca caagaggtaa 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ggattaa 4307 <210> 6 <211> 348 <212> DNA <213> Human immunodeficiency virus type 1 <400> 6 atggcaggcc gctcagggga ctcggatgag gatctgctga aggcggtgcg gctcatcaaa 60 ttcctgtacc agagcaaccc gccaccgaac cccgaaggaa ctcgccaggc tcgcaggaac 120 cgccgcagac gctggcgcga acggcagcgc cagatccaca gcatcagcga acgcatcctg 180 tcaacttact tgggacggtc agcggaacct gtcccgctgc agctgccgcc gctggagcgc 240 ctgactctgg attgcaacga agactgcgga accagcggaa cccagggcgt gggaagccca 300 cagatcctgg tggaatcgcc taccatcttg gaaagcggcg cgaaagaa 348 <210> 7 <211> 116 <212> PRT <213> Human immunodeficiency virus type 1 <400> 7 Met Ala Gly Arg Ser Gly Asp Ser Asp Glu Asp Leu Leu Lys Ala Val 1 5 10 15 Arg Leu Ile Lys Phe Leu Tyr Gln Ser Asn Pro Pro Pro Asn Pro Glu 20 25 30 Gly Thr Arg Gln Ala Arg Arg Asn Arg Arg Arg Arg Trp Arg Glu Arg 35 40 45 Gln Arg Gln Ile His Ser Ile Ser Glu Arg Ile Leu Ser Thr Tyr Leu 50 55 60 Gly Arg Ser Ala Glu Pro Val Pro Leu Gln Leu Pro Pro Leu Glu Arg 65 70 75 80 Leu Thr Leu Asp Cys Asn Glu Asp Cys Gly Thr Ser Gly Thr Gln Gly 85 90 95 Val Gly Ser Pro Gln Ile Leu Val Glu Ser Pro Thr Ile Leu Glu Ser 100 105 110 Gly Ala Lys Glu 115 <210> 8 <211> 19 <212> DNA <213> Escherichia coli <400> 8 tccctatcag tgatagaga 19 <210> 9 <211> 624 <212> DNA <213> Escherichia coli <400> 9 atgtcgcgcc tggacaaaag caaagtgatt aactcagcgc tggaactgtt gaatgaggtg 60 ggaattgaag gactcactac tcgcaagctg gcacagaagc tgggcgtcga gcagccaacg 120 ctgtactggc atgtgaagaa taaacgggcg ctcctagacg cgcttgccat cgaaatgctg 180 gaccgccatc acacccactt ttgccccctg gagggcgaat cctggcaaga ttttctgcgg 240 aacaatgcaa agtcgttccg gtgcgctctg ctgtcccacc gcgatggcgc aaaagtgcac 300 ctgggcactc ggcccaccga gaaacaatac gaaaccctgg aaaaccaact ggctttcctt 360 tgccaacagg gattttcact ggagaatgcc ctgtacgcac tatccgcggt cggccacttt 420 accctgggat gcgtcctcga agatcaggag caccaagtcg ccaaggagga aagagaaact 480 cctaccactg actcaatgcc tccgctcctg agacaagcca tcgagctgtt cgaccaccag 540 ggtgctgaac ctgcatttct gttcgggctt gaactgatta tctgcggcct ggagaaacag 600 ttgaagtgcg agtcgggatc ctag 624 <210> 10 <211> 207 <212> PRT <213> Escherichia coli <400> 10 Met Ser Arg Leu Asp Lys Ser Lys Val Ile Asn Ser Ala Leu Glu Leu 1 5 10 15 Leu Asn Glu Val Gly Ile Glu Gly Leu Thr Thr Arg Lys Leu Ala Gln 20 25 30 Lys Leu Gly Val Glu Gln Pro Thr Leu Tyr Trp His Val Lys Asn Lys 35 40 45 Arg Ala Leu Leu Asp Ala Leu Ala Ile Glu Met Leu Asp Arg His His 50 55 60 Thr His Phe Cys Pro Leu Glu Gly Glu Ser Trp Gln Asp Phe Leu Arg 65 70 75 80 Asn Asn Ala Lys Ser Phe Arg Cys Ala Leu Leu Ser His Arg Asp Gly 85 90 95 Ala Lys Val His Leu Gly Thr Arg Pro Thr Glu Lys Gln Tyr Glu Thr 100 105 110 Leu Glu Asn Gln Leu Ala Phe Leu Cys Gln Gln Gly Phe Ser Leu Glu 115 120 125 Asn Ala Leu Tyr Ala Leu Ser Ala Val Gly His Phe Thr Leu Gly Cys 130 135 140 Val Leu Glu Asp Gln Glu His Gln Val Ala Lys Glu Glu Arg Glu Thr 145 150 155 160 Pro Thr Thr Asp Ser Met Pro Pro Leu Leu Arg Gln Ala Ile Glu Leu 165 170 175 Phe Asp His Gln Gly Ala Glu Pro Ala Phe Leu Phe Gly Leu Glu Leu 180 185 190 Ile Ile Cys Gly Leu Glu Lys Gln Leu Lys Cys Glu Ser Gly Ser 195 200 205 <210> 11 <211> 876 <212> DNA <213> Baculovirus <400> 11 atgaacgagg acactccgcc gttttatttt atcaatacgc gcgacaactt tcgcgataac 60 atcgccgaac acgtattcga tatgttacta gaaagacatg gctcgtttga aaattatccc 120 attgtaaaca cggcattcat caacagcttg atcgttaacg ggtttaaata caatcaagtc 180 gatgaccacg ttgtgtgcga gtattgtgaa gcagaaataa aaaattggtc cgaagacgag 240 tgtattgaat atgcacacgt aaccttgtcg ccgtattgcg cctacgccaa taagattgct 300 gagcatgaat cgtttggcga caacattacc atcaacgctg tactggtaaa agaaggcaga 360 cccaagtgtg tgtacagatg catgtccaat ttacagtcgc gtatggatac gtttgttact 420 ttttggcctg ccgcattgcg tgacatgatt ataaacatcg cggaagcggg acttttttac 480 acgggtcgcg gagacgaaac tgtatgtttc ttttgcgatt gttgcgtacg tgattggcat 540 actaacgaag acgcctggca gcgacacgcc accgaaaacc cgcaatgcta ctttgtgctg 600 tcggtgaaag gtaaagaatt ttgtcaaaac gcaattactg ccactcacgt tgataaacgt 660 gacgatgacg acgacgacga tgataattta aacgagagcg tcgatgacat tgaggaaaaa 720 tacgaatgca aagtctgtct tgaacgccaa cgcgacgcag tgcttatgcc ttgtcggcat 780 ttttgtgttt gcgttcagtg ttattttggt ttagatcaaa agtgtccgac ctgtcgtcaa 840 gacgtcaccg atttcataaa aatatttgtg gtgtag 876 <210> 12 <211> 1521 <212> DNA <213> Epstein Barr virus <400> 12 atgggagatc gtagcgaagt ccccggtccg gcacgccccg gacctccggg aattggcccc 60 gaaggccctc taggacagct cctgcgtcgg caccgcagtc cctccccgac ccgtggaggc 120 caagagcccc ggcgggtcag acgccgcgta ttagtccagc aggaagagga agtagtaagt 180 ggctcaccat cagggccccg gggagacagg tcagaggtcc caggcccagc ccgccctggc 240 ccgccgggta tcggacccga agggcccctg ggccagctgt tgcgccggca cagatcaccc 300 agccccaccc gcggcggtca ggaacctcgc cgggtcagac ggcgggtgct cgtacaacag 360 gaagaggaag ttgtttctgg atcgccctcg ggcccgcgcg gcgaccgctc agaggtgcct 420 ggaccagccc ggcctgggcc ccccggaatc ggacctgaag gaccgctggg tcagttacta 480 cgccggcacc ggtccccttc gccgactcgg ggcgggcagg aaccccggcg cgtgaggcgt 540 cgcgtcctgg tccagcagga ggaagaggtt gtcagcggca gcccatccgg gccgaggggg 600 gatcgttcgg aagtgcccgg cccagcacgc ccgggcccgc caggtattgg gcccgaaggt 660 ccgttaggtc agctgctccg gcggcatagg tcaccatccc cgactcgggg cggccaggaa 720 ccgcggagag tgcgccggag agtgctggtg caacaggagg aagaagtcgt gtccgggtcg 780 ccgtcaggtc ctcggggcga ccggtcagaa gtacctggac cggcccgccc cggaccgccg 840 ggcatcgggc cggaaggccc cctgggacag ctgctgcgga gacatagatc gccatccccc 900 accagaggcg gacaggaacc gcgccgcgtg cgccgccggg tgctggttca gcaagaagaa 960 gaggttgtgt cgggttcacc tagcggcccg agaggcgacc ggagcgaagt gccaggacca 1020 gcacgtccgg gccctccagg tatcggccca gaaggaccac tgggacaact gctgagacgc 1080 catcgctcgc cgagccctac gcgcggaggt caagaaccga gacgggtccg cagacgagtc 1140 ctcgttcaac aagaagaaga ggtcgtgtct ggaagcccgt ctggcccaag aggggacaga 1200 agcgaggtgc cgggaccggc gcggccgggg ccgccgggga tcgggcctga aggtccgctg 1260 gggcagctct tgcgcagaca ccgctcgccc agcccaaccc gcggtggaca agaaccccga 1320 cgggtgcggc ggcgcgtgct cgtgcaacaa gaagaagagg ttgtctcggg ctcgccatct 1380 ggcccgctca gaccaagacc gcgaccgccg gcccggtccc tccgcgaatg gctgctgcgc 1440 atcagagaca gattcgagcc gccaactgaa accacccagc ggcagtccat ctacattgag 1500 gaagaggaag atgaggatta g 1521 <210> 13 <211> 702 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 13 atgagccagt caaatcggga actggtggtg gattttctga gctacaagct ctcgcaaaag 60 ggctactcat ggagccagtt ttcggatgtc gaagaaaacc ggaccgaggc tccagagggc 120 accgaatcgg agatggaaac tccgtcagca atcaacggaa atccatcatg gcacctggca 180 gatagcccgg cggtgaacgg agcaaccgga cattcaagct ccctggacgc cagagaagtg 240 attccgatgg cggcagtgaa gcaggcgcta cgcgaagcgg gagacgagtt cgagctgcgg 300 tacaggagag cttttagcga cctgactagc cagctccaca tcactccggg gaccgcctac 360 cagtcgtttg aacaggtggt gaacgagctg tttcgggatg gagtcaactg gggcagaatc 420 gtggccttct tttccttcgg cggtgcgctg tgcgtcgaat ccgtggacaa ggagatgcag 480 gtcctggtca gccggatcgc agcgtggatg gccacttatc tcaacgatca cctggagccg 540 tggattcaag agaatggggg ctgggacacc ttcgtggaac tgtatggaaa caacgcggca 600 gcagagtcga ggaagggcca agaacgcttt aatcggtggt tcctgactgg aatgacggtg 660 gcaggagtgg tgctactggg ctcgcttttc agccgcaaat aa 702 <210> 14 <211> 16 <212> PRT <213> Vesicular stomatitis virus <400> 14 Met Leu Ser Tyr Leu Ile Phe Ala Leu Ala Val Ser Pro Ile Leu Gly 1 5 10 15

Claims (18)

1. 이중-가닥 핵산 분자로서,
   (a) env 유전자를 포함하는 제1 핵산; 및
   (b) gag-pol 유전자를 포함하는 제2 핵산;을 포함하며,
   상기 제1 및 제2 핵산의 코딩 서열이 상기 이중 가닥 핵산 분자의 반대 가닥(opposing strand) 상에 있고, 상기 env 및 gag-pol 유전자가 각각 독립적으로 제1 및 제2 유도성 프로모터와 작동가능하게-연관되고, 상기 제1 및 제2 유도성 프로모터가 그들 사이에 95% 미만의 뉴클레오티드 서열 동일성을 가지며, 상기 이중-가닥 핵산 분자가 아폽토시스 억제제(apoptosis inhibitor)를 인코딩하는 1개 이상의 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 이중-가닥 핵산 분자.
2. 제1항에 있어서, 상기 제1 및 제2 프로모터 사이의 뉴클레오티드 서열 동일성이 90%, 85%, 80%, 70% 또는 60% 미만인, 이중-가닥 핵산 분자.
3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 env 유전자가 VSV-G 유전자인, 이중-가닥 핵산 분자.
4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 gag-pol 유전자가 HIV-1 유래이거나, 또는 이의 유도체인, 이중-가닥 핵산 분자.
5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 핵산 분자가 rev 유전자를 추가적으로 포함하는, 이중-가닥 핵산 분자.
6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 핵산 분자가 전이유전자(transgene)를 추가적으로 포함하는, 이중-가닥 핵산 분자.
7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 핵산 분자가 아폽토시스 억제제를 인코딩하는 1개 또는 2개의 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 이중-가닥 핵산 분자.
8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 아폽토시스 억제제가 셀로바이러스(Celovirus) GAM1, 아데노바이러스(Adenovirus) E4 Orf6, 아데노바이러스 E1B 55K, 아데노바이러스 E1B 19K, 점액종바이러스(Myxomavirus) M11L, 거대세포바이러스(Cytomegalovirus) IE1, 거대세포바이러스 IE2, 바큐로바이러스(Baculovirus) p35, 바큐로바이러스 IAP-1, 헤르페스바이러스(Herpesvirus) US3, 헤르페스바이러스 사이미리(Saimiri) ORF16, 단순 헤르페스 2 LAT ORF 1, 인간 XIAP, 아프리카 돼지열(African Swine Fever) ASFV-5-HL(LMW-5-HL/A179L), 카포시 육종 바이러스(Kaposi's Sarcoma virus) KSbcl2, 백시니아 바이러스(Vaccinia virus) SPI-2, 우두바이러스(Cowpoxvirus) CrmA, 앱스타인 바 바이러스(Epstein Barr virus) BHRF1, 앱스타인 바 바이러스 EBNA-5, 앱스타인 바 바이러스 BZLF-1, 유두종바이러스(Papillomavirus) E6, 인간 Aven, 인간 BCL2 및 인간 BCL-XL로 이루어진 군으로부터 선택되는, 이중-가닥 핵산 분자.
9. 제7항에 있어서, 상기 핵산 분자가 아폽토시스 억제제 IAP1 및 EBNA5; IAP1 및 BCL-XL; 또는 EBNA5 및 BCL-XL를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 이중-가닥 핵산 분자.
10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 따른 이중-가닥 핵산 분자를 포함하는, 레트로바이러스 벡터, 보다 바람직하게는 렌티바이러스 벡터.
11. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 따른 이중-가닥 핵산을 포함하는 포유류 세포로서, 바람직하게는 상기 이중-가닥 핵산이 상기 포유류 세포의 핵 게놈 내로 안정하게 통합되어 있는, 포유류 세포.
12. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 따른 이중-가닥 핵산 분자를 포함하는 레트로바이러스 패키징 세포(retroviral packaging cell).
13. 키트로서,
    (i) 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 따른 이중-가닥 핵산을 포함하는 레트로바이러스 패키징 벡터를 포함하되, 다음 중 1개 이상과 함께 포함하는, 키트:
    (ii) 전이유전자 및 레트로바이러스 rev 유전자를 포함하는 레트로바이러스 전송 벡터(Transfer Vector);
    (iii) 바이러스 입자의 생산에 적합한 세포주의 세포.
14. 키트로서,
    (i) rev 유전자를 추가적으로 포함하는, 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 따른 이중-가닥 핵산을 포함하는 레트로바이러스 패키징 벡터를 포함하되, 다음 중 1개 이상과 함께 포함하는, 키트:
    (ii) 전이유전자를 포함하는 레트로바이러스 전송 벡터;
    (iii) 바이러스 입자의 생산에 적합한 세포주의 세포.
15. 레트로바이러스 패키징 세포의 생산 방법으로서, 상기 방법은,
    (i) 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 따른 이중-가닥 핵산 분자를 포유류 세포 내로 안정하게 통합시키고,
    그에 의해 레트로바이러스의 env 및 gag-pol 유전자 및 임의로 상기 rev 유전자를 발현하는 포유류 세포를 생산하는 단계를 포함하는, 방법.
16. 레트로바이러스 입자의 생산에 있어서 제12항에 따른 레트로바이러스 패키징 세포의 용도.
17. 레트로바이러스의 생산 방법으로서, 상기 방법은,
    (a) 5' 및 3' 레트로바이러스 LTR을 포함하는 레트로바이러스 전송 벡터 및 레트로바이러스 패키징 신호 및 레트로바이러스 rev 유전자를, 제12항에 따른 레트로바이러스 패키징 세포 내로 도입시키는 단계로서, 상기 레트로바이러스 패키징 세포는 이의 게놈 내로 안정하게 통합된 레트로바이러스의 env 및 gag-pol 유전자를 포함하는, 단계;
    (b) 레트로바이러스가 조립(assemble)되고 상기 세포에 의해 분비되는 조건 하에서 상기 세포를 배양하는 단계; 및
    (c) 패키징된 레트로바이러스를 상층액(supernatant)으로부터 수확하는 단계를 포함하는, 방법.
18. 레트로바이러스의 생산 방법으로서, 상기 방법은,
    (a) 전이유전자를 포함하는 레트로바이러스 전송 벡터를 제12항에 따른 레트로바이러스 패키징 세포 내로 도입시키는 단계로서, 상기 레트로바이러스 패키징 세포는 이의 게놈 내로 안정하게 통합된 레트로바이러스의 env, gag-pol 및 rev 유전자를 포함하는, 단계;
    (b) 레트로바이러스가 조립되고 상기 세포에 의해 분비되는 조건 하에서 상기 세포를 배양하는 단계; 및
    (c) 패키징된 레트로바이러스를 상층액으로부터 수확하는 단계를 포함하는, 방법.

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