KR20220118490A - 렌티바이러스 벡터의 일시적 생산을 위한 방법 및 작제물 - Google Patents

렌티바이러스 벡터의 일시적 생산을 위한 방법 및 작제물 Download PDF

Info

Publication number
KR20220118490A
KR20220118490A KR1020227024546A KR20227024546A KR20220118490A KR 20220118490 A KR20220118490 A KR 20220118490A KR 1020227024546 A KR1020227024546 A KR 1020227024546A KR 20227024546 A KR20227024546 A KR 20227024546A KR 20220118490 A KR20220118490 A KR 20220118490A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
gene
lentiviral
promoter
liters
cells
Prior art date
Application number
KR1020227024546A
Other languages
English (en)
Inventor
영 신
아난디타 세스
Original Assignee
론자 워커스빌 아이엔씨.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 론자 워커스빌 아이엔씨. filed Critical 론자 워커스빌 아이엔씨.
Publication of KR20220118490A publication Critical patent/KR20220118490A/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/66—Microorganisms or materials therefrom
    • A61K35/76—Viruses; Subviral particles; Bacteriophages
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0603—Embryonic cells ; Embryoid bodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2510/00—Genetically modified cells
    • C12N2510/02—Cells for production
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/15011—Lentivirus, not HIV, e.g. FIV, SIV
    • C12N2740/15041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/16011—Human Immunodeficiency Virus, HIV
    • C12N2740/16041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2740/16043—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/16011—Human Immunodeficiency Virus, HIV
    • C12N2740/16051—Methods of production or purification of viral material
    • C12N2740/16052—Methods of production or purification of viral material relating to complementing cells and packaging systems for producing virus or viral particles
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2999/00—Further aspects of viruses or vectors not covered by groups C12N2710/00 - C12N2796/00 or C12N2800/00
    • C12N2999/007—Technological advancements, e.g. new system for producing known virus, cre-lox system for production of transgenic animals

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Reproductive Health (AREA)
  • Gynecology & Obstetrics (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

본 개시내용은 포유동물 세포를 사용하여 렌티바이러스 벡터를 생산하는 방법에 관한 것이다. 구체적으로, 방법은 요구된 패키징 요소를 제공하고 벡터를 세포에 전달하기 위해 4개가 아닌 3개의 플라스미드를 이용하여, 현탁액-기반 세포를 포함한 포유동물 세포에서 많은 수의 렌티바이러스 벡터의 생산을 허용한다. 이들 방법은 특정 관심있는 유전자를 포함하도록 맞춤화될 수 있는 렌티바이러스 벡터의 생산을 허용한다.

Description

렌티바이러스 벡터의 일시적 생산을 위한 방법 및 작제물
본 개시내용은 포유동물 세포를 사용하여 렌티바이러스 벡터를 생산하는 방법에 관한 것이다. 구체적으로, 본 방법은 필요한 패키징 요소를 제공하고 벡터를 세포에 전달하기 위해 4개가 아닌 3개의 플라스미드를 이용하여, 현탁액-기반 세포를 포함한 포유동물 세포에서 다수의 렌티바이러스 벡터의 생성을 허용한다. 이들 방법은 특정 관심있는 유전자를 포함하도록 맞춤화될 수 있는 렌티바이러스 벡터의 생산을 허용한다.
렌티바이러스 벡터는 유전자 및 세포 치료 분야에서 가장 일반적으로 사용되는 전달 방법 중 하나이다. 렌티바이러스 벡터 생산의 과정에서, 벡터의 생산에 필요한 서열은 복제-가능 렌티바이러스(RCL)를 생성할 기회를 최소화하기 위해 여러 다른 플라스미드 또는 발현 카세트로 분할된다. 일반적으로, 3세대 렌티바이러스 생산 시스템은 다음을 발현하는 4개의 별도 플라스미드 또는 발현 카세트를 이용한다:
1) 렌티바이러스 그룹 특이적 항원(GAG) 유전자 및 렌티바이러스 중합효소(POL) 단백질;
2) 엔벨로프 단백질(통상적으로 수포성 구내염 바이러스 당단백질(VSV-G));
3) 비리온 단백질의 발현의 HIV 조절인자(REV) 단백질; 및
4) 관심있는 유전자(GOI)를 함유하는 전달 벡터(TV).
가장 일반적인 접근법에서, 상기 4개의 플라스미드는 노동-집약적이고 비용이 많이 드는 렌티바이러스 벡터를 생성하기 위해 세포 내에 일시적으로 형질감염된다. 4개의 별도 플라스미드의 형질감염에 필요한 DNA의 양의 최적화 또한 시간이 많이 걸리고 지루하다. 부가하여, 4개 플라스미드의 일시적인 형질감염은 많은 양의 플라스미드 DNA를 필요로 하며, 이는 잠재적인 복제-가능 렌티바이러스의 의도하지 않은 생성을 도입하여 안전성 문제를 제기한다.
4개 플라스미드의 일시적 형질감염과 연관된 어려움을 극복하기 위해 필요한 것은 관심있는 유전자를 인코딩하는 플라스미드를 포함하는 4개 미만의 플라스미드의 형질감염을 사용하여 확장가능한 양의 렌티바이러스 벡터를 생성하는 방법이다. 본 발명은 이들 요구를 충족시킨다.
일부 실시형태에서, 렌티바이러스 벡터를 생산하는 방법이 본 명세서에 제공되며, 이는 포유동물 세포를 제1 프로모터의 제어 하에 비리온 단백질의 발현의 렌티바이러스 조절자(REV) 유전자 및 제2 프로모터의 제어 하에 엔벨로프 당단백질 유전자를 인코딩하는 제1 핵산, 제3 프로모터의 제어 하에 관심있는 유전자를 인코딩하는 제2 핵산, 및 제4 프로모터의 제어 하에 렌티바이러스 그룹 특이적 항원(GAG) 유전자 및 렌티바이러스 중합효소(POL) 유전자를 인코딩하는 제3 핵산으로 형질감염시키는 단계; 형질감염된 포유동물 세포를 배양하는 단계; 및 렌티바이러스 벡터를 단리하는 단계를 포함한다.
도 1a-1b는 본 발명의 실시형태에 따른 렌티바이러스 생산을 위한 플라스미드의 개략도이다.
도 2는 관심있는 유전자로서 GFP를 사용하여 본 명세서에 기재된 방법(3-플라스미드 시스템)을 사용하여 달성된 렌티바이러스 역가를 나타낸다.
도 3은 관심있는 유전자로서 CD-19 CAR-T를 사용하여 상업적으로 이용가능한 생성물(4 플라스미드 시스템)과 비교하여 본 명세서에 기재된 방법(3-플라스미드 시스템)을 사용하여 달성된 렌티바이러스 역가를 나타낸다.
청구범위 및/또는 명세서에서 "포함하는"이라는 용어와 함께 사용될 때 "a" 또는 "an"이라는 단어의 사용은 "하나"를 의미할 수 있지만, 또한 "하나 또는 그 이상", "적어도 하나" 및 "하나 또는 하나 초과"의 의미와도 일치한다.
본 출원 전체에 걸쳐, 용어 "약"은 값을 결정하기 위해 이용되는 방법/장치에 대한 고유한 오차 변동을 값이 포함함을 나타내기 위해 사용된다. 전형적으로, 이 용어는 상황에 따라 대략적으로 또는 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19% 또는 20% 미만의 가변성을 포괄하도록 의미된다.
청구범위에서 용어 "또는"의 사용은 대안만을 지칭하도록 명시적으로 나타내내거나 대안이 상호 배타적이지 않는 한 "및/또는"을 의미하는 데 사용되지만, 개시내용은 대안 및/또는 "및/또는" 만을 지칭하는 정의를 지지한다.
본 명세서 및 청구범위(들)에서 사용되는 단어 "포함하는" (및 "포함하다" 및 "포함한다"와 같은 포함하는의 임의의 형태), "갖는" (및 "가지다" 및 "갖다"와 같은 갖는의 임의의 형태), "포괄하는" (및 "포괄하다" 및 "포괄한다"와 같은 포괄하는의 임의의 형태) 또는 "함유하는" (및 "함유하다" 및 "함유한다"와 같은 함유하는의 임의의 형태)은 포괄적이거나 개방형이며 추가, 언급되지 않은 요소 또는 방법 단계를 배제하지 않는다. 본 명세서에서 논의된 임의의 실시형태는 본 발명의 임의의 방법, 시스템, 숙주 세포, 발현 벡터 및/또는 조성물과 관련하여 구현될 수 있는 것으로 고려된다. 더욱이, 발명의 조성물, 시스템, 세포 및/또는 핵산을 사용하여 본 명세서에 기재된 임의의 방법을 달성할 수 있다.
본 명세서에 사용된 "핵산", "핵산 분자" 또는 "올리고뉴클레오티드"는 공유 원자가로 연결된 뉴클레오티드를 포함하는 중합체 화합물을 의미한다. 용어 "핵산"은 폴리리보핵산(RNA) 및 폴리데옥시리보핵산(DNA)을 포함하며, 둘 모두는 단일- 또는 이중-가닥일 수 있다. DNA는 상보적 DNA(cDNA), 게놈 DNA, 플라스미드 또는 벡터 DNA, 합성 DNA를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. RNA는 mRNA, tRNA, rRNA, snRNA, microRNA, miRNA 또는 MIRNA를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
본 명세서에 사용된 "유전자"는 폴리펩티드를 인코딩하는 뉴클레오티드의 어셈블리를 지칭하고, cDNA 및 게놈 DNA 핵산 분자를 포함한다. "유전자"는 또한 코딩 서열에 선행하는 (5' 비-코딩 서열) 및 이어지는 (3' 비-코딩 서열) 조절 서열로서 작용할 수 있는 핵산 단편을 지칭한다. 일부 실시형태에서, 유전자는 다수의 카피와 통합된다. 일부 실시형태에서, 유전자는 미리정의된 카피 수로 통합된다.
렌티바이러스 벡터 및 이들의 생산
렌티바이러스 벡터는 인간 면역결핍 바이러스(HIV-1)를 기반으로 하는 잘 연구된 벡터 시스템이다. HIV-2 유인원 면역결핍 바이러스, 비영장류 렌티브러스, 고양이 면역결핍 바이러스, 및 소 면역결핍 바이러스 등을 포함한 다른 렌티바이러스 시스템도 유전자 전달 시스템으로 개발되었다. 인간에서 HIV-1의 병원성 특성에 기인한 안전성 문제에 따라, 임상 및 연구와 개발 목적으로 사용하기 위해 가장 널리 사용되는 렌티바이러스 시스템은 다음을 발현하는, 도 1a에 도시된 바와 같은, 4-플라스미드 시스템을 기반으로 한다:
1) 렌티바이러스 그룹 특이적 항원(GAG) 유전자 및 렌티바이러스 중합효소(POL) 단백질
2) 엔벨로프 단백질(통상적으로 수포성 구내염 바이러스 당단백질(VSV-G))
3) 비리온 단백질의 발현의 HIV 조절인자(REV) 단백질; 및
4) 관심있는 유전자(GOI)를 함유하는 전달 벡터(TV).
전통적으로, 인간 배아 신장 세포(예를 들어, HEK293)와 같은 포유동물 세포는 부착 세포 배양으로서 4개의 플라스미드 각각으로 형질감염된 다음 관심있는 유전자를 함유하는 원하는 렌티바이러스가 생산된다. 일반적으로, 이들 일시적으로 형질감염된 세포는 렌티바이러스를 생산할 수 있다.
렌티바이러스 벡터는 일반적으로 면역결핍 및 신경퇴행성 질환을 포함하는 치료법 및 질환 치료를 위해 원하는 세포 내에 도입되는 관심있는 유전자로 생산된다.
본 발명은 렌티바이러스를 생산하는 개선된 방법을 제공하며, 이는 현탁액에서 성장할 수 있는 세포를 포함하는 3개의 플라스미드 시스템을 사용하여 렌티바이러스를 제조하는 방법을 포함하여, 생산된 렌티바이러스의 양에서 유의한 증가 및 노동의 양에서 감소와 시간-집약적인 DNA 양 최적화 프로토콜을 허용한다.
실시형태에서, 포유동물 세포를 제1 프로모터의 제어 하에 비리온 단백질의 발현의 렌티바이러스 조절자(REV) 유전자 및 제2 프로모터의 제어 하에 엔벨로프 당단백질 유전자를 인코딩하는 제1 핵산, 제3 프로모터의 제어 하에 관심있는 유전자를 인코딩하는 제2 핵산, 및 제4 프로모터의 제어 하에 렌티바이러스 그룹 특이적 항원(GAG) 유전자 및 렌티바이러스 중합효소(POL) 유전자를 인코딩하는 제3 핵산으로 형질감염시키는 것을 포함하는, 렌티바이러스 벡터를 생산하는 방법이 본 명세서에 제공된다.
적합하게는, 본 명세서에 기술된 다양한 방법에서 이용될 수 있는 세포는 포유동물 세포 및 세포주 또는 배양물이다. 본 명세서에 사용된 용어 "포유동물 세포"는 예를 들어 인간 세포, 마우스 세포, 랫트 세포, 원숭이 세포, 햄스터 세포 등과 같은 포유류 목의 임의의 구성원으로부터의 세포를 포함한다. 일부 실시형태에서, 세포는 마우스 세포, 인간 세포, 차이니즈 햄스터 난소(CHO) 세포, CHOK1 세포, CHO-DXB11 세포, CHO-DG44 세포, 모든 변이체를 포함한 CHOK1SV(예를 들어, POTELLIGENT®, Lonza, 영국 슬라우 소재), 모든 변이체를 포함한 CHOK1SV GS-KO(글루타민 신타제 녹아웃) 세포(예를 들어, XCEED™ Lonza, 영국 슬라우 소재)이다. 예시적인 인간 세포는 HEK293, HeLa 세포 또는 HT1080 세포와 같은 인간 배아 신장(HEK) 세포를 포함한다.
포유동물 세포는 부착 배양 또는 현탁 배양일 수 있는 포유동물 세포 배양을 포함한다. 부착 배양은 기질 표면, 예를 들어 플라스틱 플레이트, 접시 또는 기타 적절한 세포 배양 성장 플랫폼에서 성장하는 세포를 지칭하고 고정시키는 것에 의존할 수 있다. 현탁 배양은 가스 및 영양소 교환을 위한 넓은 표면적을 허용하는, 예를 들어 배양 플라스크 또는 대형 현탁 수조에서 유지될 수 있는 세포를 지칭한다. 현탁 세포 배양은 종종 적절한 혼합을 제공하기 위해 혼합 또는 교반 메커니즘을 이용한다. 세포를 현탁액에 유지하기 위한 배지 및 조건은 일반적으로 당업계에 공지되어 있다. 예시적인 현탁 세포 배양은 인간 HEK293 클론 세포를 포함한다.
실시형태에서, 본 명세서에 기재된 방법은 렌티바이러스 벡터를 생성하는 것을 포함한다. 본 명세서에 사용된 "벡터" 또는 "발현 벡터"는 세포에서 부착된 핵산 분자의 복제 및/또는 발현을 유발하기 위해 본 명세서에 기재된 핵산 분자가 부착될 수 있는 플라스미드, 파지, 바이러스 또는 코스미드와 같은 레플리콘이다. "벡터"는 에피솜(예를 들어, 플라스미드) 및 비-에피솜 벡터를 포함한다. 용어 "벡터"는 시험관내, 생체내 또는 생체외에서 핵산 분자를 세포 내로 도입하기 위한 바이러스 및 비바이러스 수단 둘 모두를 포함한다. 용어 벡터는 합성 벡터를 포함할 수 있다. 벡터는 형질감염, 형질도입, 세포 융합 및 리포펙션을 포함하나 이에 제한되지 않는 잘 알려진 방법에 의해 원하는 숙주 세포 내로 도입될 수 있다. 벡터는 프로모터를 포함한 다양한 조절 요소를 포함할 수 있다. "렌티바이러스 벡터"는 원하는 유전자가 유전자 요법 목적을 위해 연구 또는 치료 적용에 사용하기에 적합하게 삽입될 수 있는 벡터를 지칭한다. 적절하게는, 렌티바이러스 벡터는 HIV 패밀리에서 유래한다.
본 명세서에 사용된 "형질감염"은 플라스미드 및/또는 벡터를 포함하는 외인성 핵산 분자의 세포 내로의 도입을 의미한다. "형질감염된" 세포는 세포 내부의 외인성 핵산 분자를 포함하고 "형질전환된" 세포는 세포 내의 외인성 핵산 분자가 세포에서 표현형 변화를 유도하는 세포이다. 형질감염된 핵산 분자는 숙주 세포의 게놈 DNA 내에 통합될 수 있고/있거나 세포에 의해 일시적으로 또는 장기간 동안 염색체외에서 유지될 수 있다. 외인성 핵산 분자 또는 단편을 발현하는 숙주 세포 또는 유기체는 "재조합", "형질전환된" 또는 "트랜스제닉" 유기체로 지칭된다. 다수의 형질감염 기술이 일반적으로 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, Graham 등, Virology, 52:456 (1973); Sambrook 등, Molecular Cloning, a laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratories, New York (1989); Davis 등, Basic Methods in Molecular Biology, Elsevier (1986); 및 Chu 등, Gene 13:197 (1981) 참고. 적합하게는, 본 명세서에 기재된 하나 이상의 벡터를 사용한 포유동물 세포의 형질감염은 핵산을 숙주 세포의 게놈 DNA 내에 통합하기 위해 형질감염 제제, 예컨대 폴리에틸렌이민(PEI) 또는 다양한 지질 및 중합체를 포함하는 다른 적합한 제제를 이용한다.
적합하게는, 포유동물 세포가 형질감염되는 핵산은 제1 프로모터의 제어 하에 비리온 단백질의 발현의 렌티바이러스 조절자(REV) 유전자; 제2 프로모터의 제어 하에 엔벨로프 당단백질 유전자; 제3 프로모터의 제어 하에 관심있는 유전자; 및 제4 프로모터의 제어 하에 렌티바이러스 그룹 특이적 항원(GAG) 유전자 및 렌티바이러스 중합효소(POL) 유전자 둘 모두를 포함한다. 실시형태에서, 유전자 또는 관심대상은 선택적으로 이용될 수 있다.
비리온 단백질의 발현의 렌티바이러스 조절자(REV)는 후기 유전자 발현을 촉진하는 RNA-결합 단백질이다. 그것을 또한 바이러스 구조 단백질을 인코딩하는 스플라이싱되지 않은 또는 단일-스플라이싱된 mRNA의 핵에서 세포질로의 이송에 중요하다.
엔벨로프 당단백질 유전자, 적합하게는 수포성 구내염 바이러스 당단백질(VSV-G) 유전자가 렌티바이러스 벡터의 표면 상에 발현 및 표시되고 렌티바이러스 벡터의 표적 세포 내로의 형질도입을 매개한다.
GAG는 스플라이싱되지 않은 mRNA로부터 번역된 다음 바이러스 프로테아제(PR)에 의해 매트릭스 단백질, 캡시드 및 뉴클레오캡시드 단백질로 절단되는 폴리단백질을 인코딩한다. 렌티바이러스 중합효소(POL)는 GAG mRNA 번역 동안 리보솜의 프레임 이동의 결과로 GAG-POL 폴리단백질로 발현되고 역전사효소, 프로테아제 및 인테그라제를 인코딩한다. 이들 세 단백질은 비리온 내의 바이러스 게놈과 연관되어 있다. 적합하게는 GAG 유전자는 HIV GAG 유전자이고 POL 유전자는 HIV POL 유전자이다.
적합한 실시형태에서, VSV-G 및 REV를 인코딩하는 핵산을 포함하는 핵산은 코돈-최적화된다. 렌티바이러스 벡터를 생성하는 데 사용되는 추가 요소도 코돈 최적화될 수 있다.
본 명세서에 기재된, "코돈 최적화"는 핵산 서열이 알고리즘을 통해 처리되어 통계적으로 동일한 단백질을 코딩하는 임의의 다른 핵산 서열보다 숙주 세포의 리보솜에 의해 성공적인 번역을 겪을 가능성이 더 큰 "최적화된" 핵산 서열을 생성하는 과정이다. 코돈 최적화의 과정은 유전 코드의 고유한 축퇴성으로 인해 가능하게 되며, 여기서 3개 염기쌍의 다중 조합이 동일한 단일 아미노산을 코딩할 수 있다.
적합하게는, GAG 및 Pol 유전자를 인코딩하는 핵산의 경우, GAG에서 Pol로의 프레임 이동뿐만 아니라 폴리단백질 발현은 그의 고유 서열에 의존한다. 따라서, GAG 및 Pol은 그의 고유 서열을 보존하기 위해 코돈-최적화에서 적절하게 배제된다.
렌티바이러스 벡터를 생산하는 방법은 렌티바이러스 벡터를 생산할 수 있도록 형질감염된 포유동물 세포를 배양한 다음, 렌티바이러스 벡터를 추가로 단리할 수 있도록 포유동물 세포를 단리하는 것을 추가로 포함한다.
형질감염된 포유동물 세포를 배양하는 방법은 당업계에 공지되어 있고 다양한 세포 배양 배지의 사용, 세포의 성장을 촉진하기 위한 적절한 기체 농도/교환 및 온도 제어 및 세포의 게놈 내로 작제물의 통합을 포함한다.
바이러스 벡터를 단리하는 방법은 체의 사용, 필터 장치, 세포-선별 장치 및 자기 분류, 세포 계수를 포함한 분류 등을 비롯한 다양한 여과 기술을 포함한다.
본 명세서에 언급된 바와 같이, 다양한 핵산의 각각의 구성분(발현 카세트라고도 함)은 프로모터의 제어 하에 있다. 본 명세서에 사용된 "제어 하에"는 "프로모터", "프로모터 서열" 또는 "프로모터 영역"에 의해 조절되는 유전자를 지칭하며, 이는 RNA 폴리머라제에 결합하고 다운스트림 코딩 또는 비-코딩 유전자 서열의 전사를 개시할 수 있는 DNA 조절 영역/서열을 지칭한다. 달리 말하면, 프로모터와 유전자는 작동가능한 조합으로 되거나 작동가능하게 연결되어 있다. 본 명세서에 언급된 바와 같이, "작동가능한 조합으로", "작동가능한 순서로" 및 "작동가능하게 연결된"이라는 용어는 주어진 유전자의 전사를 지시할 수 있는 프로모터 및/또는 원하는 단백질 분자의 합성이 생성되는 방식으로의 아미노산 서열의 연결을 지칭한다. 이 용어는 또한 기능성 단백질이 생성되도록 하는 방식으로의 아미노산 서열의 연결을 지칭한다.
적합한 실시형태에서, VSV-G 유전자 발현은 라우스 육종 바이러스(RSV) 프로모터에 의해 구동된다. RSV 긴 말단 반복은 다양한 세포 유형에 유용한 강력한 프로모터인 전사 시작 부위 코어(TSSC)라고 하는, TATA 박스 및 Inr-유사 서열로 구성된 전사적으로 유력한 인핸서 및 코어 프로모터를 포함한다.
실시형태에서, REV 유전자 발현은 거대세포바이러스(CMV) 프로모터에 의해 구동된다. 그것은 다양한 세포에서 이식유전자의 일시적인 발현에 적합하게 사용되는 CMV의 즉시-초기 인핸서 및 프로모터이다.
본 개시내용의 일부 예에서, 프로모터 서열은 전사 개시 부위를 포함하고 상류로 확장되어 배경 위에서 검출가능한 수준에서 전사를 개시하는데 필요한 염기 또는 요소의 최소 수를 포함한다. 일부 실시형태에서, 프로모터 서열은 전사 개시 부위뿐만 아니라 RNA 폴리머라제의 결합을 담당하는 단백질 결합 도메인을 포함한다. 진핵생물 프로모터는 항상 그런 것은 아니지만 종종 "TATA" 박스와 "CAT" 박스를 함유할 것이다. 유도성 프로모터를 포함하는 다양한 프로모터가, 예를 들어, 본 개시내용의 숙주 세포 또는 벡터에서 유전자 발현을 유도하기 위해 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, 프로모터는 누출 프로모터가 아니며, 즉 프로모터는 본 명세서에 기재된 바와 같은 유전자 생성물 중 어느 것도 구성적으로 발현하지 않는다. 본 명세서에 기재된 바와 같은 다른 실시형태에서, 프로모터는 외부 조절의 영향과 무관하게 mRNA 합성을 개시하는 구성적 프로모터이다.
본 명세서에 기재된 바와 같이, 적합하게는 포유동물 세포는 포유동물 세포 배양이고, 실시형태에서 현탁 배양이다. 예시적인 세포는 HEK293T 세포를 포함한다.
적합한 실시형태에서, 렌티바이러스 벡터에 함유될 관심있는 유전자는 치료적 관심있는 유전자이다. 본 명세서에서 언급된, 용어 "관심있는 유전자" 또는 "GOI"는 이종 유전자를 기술하기 위해 사용된다. 본 명세서에 언급된, 코딩 서열 또는 제어 서열과 같은 핵산 서열과 관련된 용어 "이종 유전자" 또는 "HG"는 정상적으로 함께 연결되지 않고/않거나 정상적으로 특정 세포와 연관되지 않는 핵산 서열, 예를 들어, 유전자을 나타낸다. 일부 실시형태에서, 이종 유전자는 코딩 서열 자체가 자연에서 발견되지 않는 작제물이다(예를 들어, 고유 유전자와 상이한 코돈을 갖는 합성 서열). 대립형질 변이 또는 자연적으로 발생하는 돌연변이 이밴트는 본 명세서에 사용된 바와 같이 이종 DNA를 발생시키지 않는다.
본 명세서에 언급된, 용어 "치료적 관심있는 유전자"는 임의의 기능적으로 관련된 뉴클레오티드 서열을 지칭한다. 따라서, 본 개시내용의 치료적 관심있는 유전자는 요법-표적 세포 게놈에서 결함이 있거나 누락된 단백질을 인코딩하거나 원하는 생물학적 또는 치료적 효과(예를 들어, 항바이러스 기능)를 갖는 비-천연 단백질을 인코딩하는 임의의 원하는 유전자를 포함할 수 있거나, 또는 서열은 안티센스 또는 리보자임 기능을 갖는 분자에 상응할 수 있다. 적절한 치료적 관심있는 유전자의 대표적인(비-제한적인) 예는 염증성 질환, 자가면역, 만성 및 감염성 질환, 예를 들어 AIDS, 암, 신경계 질환, 심혈관 질환, 고콜레스테혈증 같은 장애를 포함하는 것; 다양한 빈혈, 지중해 빈혈 및 혈우병을 포함한 다양한 혈액 장애; 낭포성 섬유증, 고셔병, 아데노신 데아미나제(ADA) 결핍, 폐기종 등과 같은 유전적 결함의 치료에 사용되는 것을 포함한다. 암 및 바이러스 질환에 대한 안티센스 요법에 유용한 여러 안티센스 올리고뉴클레오티드(예를 들어, mRNA의 번역 개시 부위(AUG 코돈) 주변 서열에 상보적인 짧은 올리고뉴클레오티드)는 당업계에 기재되어 있고 또한 적합한 치료적 관심있는 유전자의 예이다.
본 명세서에 기재된 생산 방법은 교반 탱크, 에어리프트, 섬유, 극세사, 중공 섬유, 세라믹 매트릭스, 유동층, 고정층 및/또는 분출층 생물반응기를 포함하나 이에 제한되지 않는 임의의 적합한 반응기(들)를 이용할 수 있다. 본 명세서에 사용된 "반응기"는 발효기 또는 발효 유닛, 또는 임의의 다른 반응 용기를 포함할 수 있고 용어 "반응기"는 "발효기"와 상호교환적으로 사용된다. 용어 발효기 또는 발효는 미생물 및 포유류 배양 둘 모두를 지칭한다. 예를 들어, 일부 양태에서, 예시적인 생물반응기 유닛은 다음 중 하나 이상 또는 모두를 수행할 수 있다: 영양소 및/또는 탄소원의 공급, 적절한 가스(예를 들어, 산소)의 주입, 발효 또는 세포 배양 배지의 유입구 및 유출구 흐름, 기체 및 액체 상의 분리, 온도의 유지, 산소 및 CO2 수준의 유지, pH 수준의 유지, 교반(예를 들어, 혼합) 및/또는 세정/멸균. 발효 유닛과 같은 예시적인 반응기 유닛은 유닛 내에 다중 반응기를 포함할 수 있으며, 예를 들어 유닛은 각 유닛에 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 또는 100개 이상의 생물반응기를 가질 수 있고/있거나 시설은 시설 내에 단일 또는 다중 반응기가 있는 다중 유닛을 함유할 수 있다. 다양한 실시형태에서, 생물반응기는 배치, 반 유가, 유가, 관류 및/또는 연속 발효 공정에 적합할 수 있다. 임의의 적합한 반응기 직경을 사용할 수 있다. 실시형태에서, 생물반응기는 약 100mL 내지 약 50,000L의 부피를 가질 수 있다. 비-제한적인 예는 100mL, 250mL, 500mL, 750mL, 1리터, 2리터, 3리터, 4리터, 5리터, 6리터, 7리터, 8리터, 9리터, 10리터, 15리터, 20리터, 25리터, 30리터, 40리터, 50리터, 60리터, 70리터, 80리터, 90리터, 100리터 , 150리터, 200리터, 250리터, 300리터, 350리터, 400리터, 450리터, 500리터, 550리터, 600리터, 650리터, 700리터, 750리터, 800리터, 850리터, 900리터, 950리터, 1000리터, 1500리터, 2000리터, 2500리터, 3000리터, 3500리터, 4000리터, 4500리터, 5000리터, 6000리터, 7000리터, 8000리터, 9000리터, 10,000리터, 15,000리터, 20,000리터, 및/또는 50,000리터의 부피를 포함한다. 부가적으로, 적합한 반응기는 다중-사용, 단일-사용, 일회용 또는 비-일회용일 수 있으며 금속 합금 예컨대 스테인리스강(예를 들어, 316L 또는 기타 적합한 스테인리스강) 및 인코넬, 플라스틱, 및/또는 유리를 포함하는 임의의 적합한 재료로 형성될 수 있다.
본 명세서에 기재된 다양한 방법에 따라 생산된 렌티바이러스 벡터로 포유동물 대상체, 적합하게는 인간 대상체를 치료하는 방법이 또한 본 명세서에 제공된다. 적합하게는, 방법은 치료적 관심있는 유전자를 포함하는 관심있는 유전자로 인간 대상체를 치료하는 데 사용된다. 인간 대상체에 대한 투여는, 예를 들어 흡입, 주사 또는 정맥내 투여뿐만 아니라 당업계에 공지된 다른 투여 방법을 포함할 수 있다.
렌티바이러스 패키징 유전자 및 관심있는 유전자를 인코딩하는 핵산의 유전자 성분과 마찬가지로 예시적인 포유동물 세포가 본 명세서에 기재되어 있다.
렌티바이러스를 생산하는 방법이 본 명세서에 기술되어 있고, 적합하게는 렌티바이러스 패키징 유전자를 인코딩하는 핵산 및 관심있는 유전자를 인코딩하는 핵산의 생성물의 생산을 유도하고, 형질감염된 포유동물 세포를 배양하고, 렌티바이러스 벡터를 수확하는 것을 포함한다.
추가적인 예시적인 실시형태
실시형태 1은 포유동물 세포를 제1 프로모터의 제어 하에 비리온 단백질의 발현의 렌티바이러스 조절자(REV) 유전자 및 제2 프로모터의 제어 하에 엔벨로프 당단백질 유전자를 인코딩하는 제1 핵산, 제3 프로모터의 제어 하에 관심있는 유전자를 인코딩하는 제2 핵산, 및 제4 프로모터의 제어 하에 렌티바이러스 그룹 특이적 항원(GAG) 유전자 및 렌티바이러스 중합효소(POL) 유전자 둘 모두를 인코딩하는 제3 핵산으로 형질감염시키는 단계; 형질감염된 포유동물 세포를 배양하는 단계; 및 바이러스 벡터를 단리하는 단계를 포함하는, 렌티바이러스 벡터를 생산하는 방법이다.
실시형태 2는 실시형태 1의 방법을 포함하며, 여기서 포유동물 세포는 포유동물 세포 배양이다.
실시형태 3은 실시형태 2의 방법을 포함하며, 여기서 포유동물 세포 배양은 현탁 배양이다.
실시형태 4는 실시형태 1의 방법을 포함하며, 여기서 포유동물 세포는 HEK293T 세포이다.
실시형태 5는 실시형태 1-4 중 어느 하나의 방법을 포함하며, 여기서 엔벨로프 당단백질 유전자는 수포성 구내염 바이러스 당단백질(VSV-G) 유전자이다.
실시형태 6은 실시형태 1-5 중 어느 하나의 방법을 포함하며, 여기서 GAG 유전자는 HIV GAG 유전자이고 POL 유전자는 HIV POL 유전자이다.
실시형태 7은 실시형태 5-6 중 어느 하나의 방법을 포함하며, 여기서 VSV-G 및 REV를 인코딩하는 핵산은 코돈-최적화된다.
실시형태 8은 실시형태 1-7 중 어느 하나의 방법을 포함하며, 여기서 VSV-G 발현은 라우스 육종 바이러스(RSV) 프로모터에 의해 구동된다.
실시형태 9는 실시형태 1-8 중 어느 하나의 방법을 포함하며, 여기서 REV 유전자 발현은 거대세포바이러스(CMV) 프로모터에 의해 구동된다.
실시형태 10은 실시형태 1-9 중 어느 하나의 방법을 포함하며, 여기서 관심있는 유전자는 치료적 관심있는 유전자이다.
실시형태 11은 실시형태 1-10 중 어느 하나의 방법에 의해 생성된 렌티바이러스 벡터이다.
실시형태 11은 포유동물 대상체에게 청구항 11의 렌티바이러스 벡터를 투여하는 것을 포함하는, 렌티바이러스 벡터로 치료의 방법이다.
실시예
실시예 1: 3-플라스미드 시스템을 사용한 GFP를 발현하는 렌티바이러스 벡터의 생성
재료 및 방법
3개의 플라스미드(pUC-Gag-Pol, pUC-VSV-G-REV, 및 pUC-GFP)를 제작하였으며, 그 구조를 도 1b에 나타내었다. 음영 영역은 VSV 및 Rev 유전자의 코돈 최적화를 나타낸다. 이들 플라스미드를 포유동물 생산 세포주(HEK293 세포) 내로 형질감염시켰다. 이들 형질감염으로부터 바이러스를 수확한 후, 유세포분석을 사용하여 감염성 렌티바이러스 역가를 측정하였다.
결과
도 2에 도시된 바와 같이, 테스트 #1 및 테스트 #2에서 일 밀리리터(mL)의 세포 배양 수확물에서 LV-GFP의 3.0E+06 형질도입 단위(TU) 이상이 생성되었으며, 이는 3-플라스미드 디자인이 기능적이고 삼중 플라스미드 일시적 형질감염 과정을 통한 렌티바이러스 벡터를 생산한다는 것을 나타낸다.
실시예 2: 상업적으로 이용가능한 4-플라스미드 시스템과 비교하여 3-플라스미드 시스템을 사용한 CD-19 CAR-T를 발현하는 렌티바이러스 벡터의 생산
재료 및 방법
다른 맥락에서 3-플라스미드 시스템의 효능을 확인하기 위해, CD-19에 대해 친화성을 갖는 항체 서열을 GOI로 이용하고 제3 플라스미드 전달 벡터(이하, "CD-19 CAR-T 플라스미드"라 칭함)에 클로닝하였다. CD-19 CAR-T 플라스미드를 pUC-Gag-Pol 및 pUC-VSV-G-REV와 함께 포유동물 세포주(HEK293 세포) 내에 형질감염시켰다. 3- 및 4-플라스미드 시스템에 의해 생성된 얻어진 렌티바이러스 역가의 직접적인 비교를 위해> CD-19 CAR-T 플라스미드를 4-플라스미드 시스템으로부터 상업적으로 이용가능한 패키징 플라스미드와 함께 포유동물 세포주 내에 형질감염시켰다.
결과
각 형질감염으로부터의 감염성 렌티바이러스 역가를 액적 디지털 중합효소 연쇄 반응(ddPCR)에 의해 측정하였다. 도 3에 도시된 바와 같이, 3-플라스미드 시스템으로부터의 LV-CD-19 CAR-T 역가(9.1E+07 TU/mL)는 상업적으로 이용가능한 4-플라스미드 시스템(6.7E+07 TU/mL)에 필적하거나 더 높았다. 이들 결과는 3-플라스미드 시스템을 사용하여 렌티바이러스 벡터를 생성하는 작업흐름의 최적화가 상업적으로 이용가능한 4-플라스미드 시스템에 비해 감소된 형질감염 효율 및 생존가능한 형질도입 유닛의 생산을 초래하지 않는다는 것을 입증한다.
본 명세서에 기술된 방법 및 적용에 대한 다른 적절한 변형 및 적응이 임의의 실시형태의 범주를 벗어나지 않고 이루어질 수 있다는 것은 관련 기술 분야의 통상인에게 용이하게 명백할 것이다.
특정 실시형태가 본 명세서에서 예시되고 설명되었지만, 청구범위는 설명되고 도시된 부분의 특정 형태 또는 배열로 제한되지 않는다는 것을 이해해야 한다. 명세서에는 예시적인 실시형태가 개시되어 있으며, 특정한 용어가 사용되었지만, 이들은 단지 일반적이고 설명적인 의미로 사용되며 제한을 위한 것은 아니다. 상기 교시에 비추어 실시형태의 변형 및 변화가 가능하다. 따라서 실시형태는 구체적으로 기술된 것과는 다르게 실시될 수 있음을 이해해야 한다.
본 명세서에 언급된 모든 간행물, 특허 및 특허 출원은 각각의 개별 간행물, 특허 또는 특허 출원이 참조로 포함되는 것으로 구체적이고 개별적으로 표시된 것처럼 동일한 정도로 참조로 본 명세서에 포함된다.

Claims (12)

  1. 렌티바이러스 벡터의 제조 방법으로서,
    a. 다음으로 포유동물 세포를 형질감염시키는 단계:
    i. 제1 프로모터의 제어 하에 비리온 단백질의 발현의 렌티바이러스 조절자(REV) 유전자 및 제2 프로모터의 제어 하에 엔벨로프 당단백질 유전자를 인코딩하는 제1 핵산;
    ii. 제3 프로모터의 제어 하에 관심있는 유전자를 인코딩하는 제2 핵산; 및
    iii. 제4 프로모터의 제어 하에 렌티바이러스 그룹 특이적 항원(GAG) 유전자 및 렌티바이러스 중합효소(POL) 유전자 둘 모두를 인코딩하는 제3 핵산,
    b. 형질감염된 포유동물 세포를 배양하는 단계; 및
    c. 렌티바이러스 벡터를 단리하는 단계를 포함하는, 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 포유동물 세포는 포유동물 세포 배양인, 방법.
  3. 제2항에 있어서, 상기 포유동물 세포 배양은 현탁 배양인, 방법.
  4. 제1항에 있어서, 상기 포유동물 세포는 HEK293T 세포인, 방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 엔벨로프 당단백질 유전자는 수포성 구내염 바이러스 당단백질(VSV-G) 유전자인, 방법.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 GAG 유전자는 HIV GAG 유전자이고 POL 유전자는 HIV POL 유전자인, 방법.
  7. 제5항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 VSV-G 및 REV를 인코딩하는 핵산은 코돈-최적화된, 방법.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 VSV-G 유전자 발현은 라우스 육종 바이러스(RSV) 프로모터에 의해 구동되는, 방법.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 REV 유전자 발현은 거대세포바이러스(CMV) 프로모터에 의해 구동되는, 방법.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 관심있는 유전자는 치료적 관심있는 유전자인, 방법.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항의 방법에 의해 생성된 렌티바이러스 벡터.
  12. 렌티바이러스 벡터로 치료하는 방법으로서,
    a. 포유동물 대상체에게 제11항의 렌티바이러스 벡터를 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
KR1020227024546A 2019-12-18 2020-12-17 렌티바이러스 벡터의 일시적 생산을 위한 방법 및 작제물 KR20220118490A (ko)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201962949848P 2019-12-18 2019-12-18
US62/949,848 2019-12-18
PCT/US2020/065458 WO2021127076A1 (en) 2019-12-18 2020-12-17 Methods and constructs for transient production of lentiviral vector

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20220118490A true KR20220118490A (ko) 2022-08-25

Family

ID=74104244

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020227024546A KR20220118490A (ko) 2019-12-18 2020-12-17 렌티바이러스 벡터의 일시적 생산을 위한 방법 및 작제물

Country Status (8)

Country Link
US (1) US20230026345A1 (ko)
EP (1) EP4077642A1 (ko)
JP (1) JP2023507554A (ko)
KR (1) KR20220118490A (ko)
CN (1) CN114829588A (ko)
CA (1) CA3159482A1 (ko)
IL (1) IL293910A (ko)
WO (1) WO2021127076A1 (ko)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA3235253A1 (en) 2021-11-09 2023-05-19 Fraunhofer-Gesellschaft Zur Forderung Der Angewandten Forschung E.V. Koala retrovirus envelope glycoproteins and uses thereof

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP3489353B8 (en) * 2015-11-24 2023-08-30 GlaxoSmithKline Intellectual Property Development Limited Stable cell lines for retroviral production
EP3607072A4 (en) * 2017-04-03 2021-01-06 American Gene Technologies International Inc. COMPOSITIONS AND METHODS OF TREATMENT OF PHENYLCETONURISM
GB201715052D0 (en) * 2017-09-19 2017-11-01 Oxford Genetics Ltd Vectors

Also Published As

Publication number Publication date
CN114829588A (zh) 2022-07-29
JP2023507554A (ja) 2023-02-24
WO2021127076A1 (en) 2021-06-24
EP4077642A1 (en) 2022-10-26
IL293910A (en) 2022-08-01
CA3159482A1 (en) 2021-06-24
US20230026345A1 (en) 2023-01-26

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CA3120282A1 (en) Fusosome compositions for hematopoietic stem cell delivery
US12037599B2 (en) Methods and constructs for production of lentiviral vector
JP2022043022A (ja) レンチウイルスベクターのバイオ生産法
JP2023504593A (ja) 産生系
Santhosh et al. A lentiviral vector with novel multiple cloning sites: stable transgene expression in vitro and in vivo
US20230026345A1 (en) Methods and constructs for transient production of lentiviral vector
US20230227858A1 (en) Cell lines with multiple docks for gene insertion
JP2024500801A (ja) 細胞トランスフェクションの改善のための方法およびシステム
Tschorn Development of transposon and retrovirus-derived vectors for the rapid establishment of efficient producer cell lines
US20220056476A1 (en) Vectors for protein manufacture
Ali Synthetic Biology Approaches to Lentiviral Packaging Cell Engineering
van Heuvel Optimization of retroviral packaging cells for scale-up of vector production
Accordino Lentiviral Vector Production at High Cell Density by Transient Transfection of Suspended Culture HEK Cells
KR20240099439A (ko) 코알라 레트로바이러스 외피 당단백질 및 그 용도
JP2023551397A (ja) ポリマー／核酸複合体の溶液の調製
CA3168529A1 (en) Replication competent virus assay
CN117677706A (zh) 慢病毒载体
Yasemin van Heuvel Optimization of retroviral packaging cells for scale-up of vector production
Wu et al. Propagation kinetics of retrovirus transgene vector and replication-competent retrovirus in static and microcarrier cell culture systems using different medium exchange strategies
Ghani et al. 818. Development of Packaging Cell Lines for the Large-Scale Production of High-Titer Clinical Grade Recombinant Retroviruses
Brady et al. 816. Rapid, Consistent and Scalable Production of Viral Vectors in Suspension Cells by Cotransfection of Viral Component Plasmid DNA or RNA
Yu et al. 817. Rapid and Efficient Titration of Retroviral Vectors Using Quantitative Real-Time PCR