KR20200051983A - 나노입자 구조체 및 그 형성 방법 - Google Patents

나노입자 구조체 및 그 형성 방법 Download PDF

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Abstract

나노입자 구조체 및 그 형성 방법이 제공된다.
상기 나노입자 구조체는 금속 산화물 나노입자를 포함한다. 상기 금속 산화물 나노입자는 세리아 및 지르코니아를 포함할 수 있다. 상기 나노입자 구조체는 상기 금속 산화물 나노입자에 결합된 항체를 더 포함할 수 있다.
상기 나노입자 구조체의 형성 방법은 금속 산화물 나노입자를 형성하는 단계를 포함한다. 상기 나노입자 구조체의 형성 방법은 상기 금속 산화물 나노입자에 항체를 결합시키는 단계를 더 포함할 수 있다.

Description

나노입자 구조체 및 그 형성 방법{NANOPARTICLE STRUCTURE AND METHOD OF FORMING THE SAME}
본 발명은 나노입자 구조체 및 그 형성 방법에 관한 것이다.
신경성 통증은 중추 신경계의 생리 현상에 이상이 생긴 것을 의미한다. 자극 이 없는 경우의 통증(자발적 통증) 인지, 무독성 자극에 대한 통증(이질통) 인지, 및 독성 자극에 대한 과장된 통증(통각 과민) 인지를 유발하는 감소된 자극 한계치로 나타내어진다. 중추 신경계에 상주하는 면역 세포인 마이크로글리아는 신경성 통증의 병인과 관련된 주요 인자 중 하나이다.
손상된 신경 유도 신호는 IL-1β, IL-6 및 TNF-α와 같은 척수 마이크로글리아 활성화 및 이후의 통증 관련 유전자 발현을 유도한다. 이것은 차례로 고통을 전달하는 뉴런이나 신경 회로를 민감하게 하여 통증 중심 민감화를 유발한다.
또, 척수 신경 절단(spinal nerve transection, SNT)은 척수 마이크로글리아 내 활성 산소종의 발생을 유도하여 신경성 통증을 유발한다. NADPH 옥시다제 2(Nox2) 유래 활성 산소종 생성은 신경 손상으로 유도된 척수 마이크로글리아 활성화 및 이후의 통증 과민증에 중요한 역할을 한다.
상기와 같은 문제점을 해결하기 위하여, 본 발명은 새로운 나노입자 구조체를 제공한다.
본 발명은 치료 효과가 우수한 나노입자 구조체를 제공한다.
본 발명의 다른 목적들은 다음의 상세한 설명과 첨부한 도면으로부터 명확해 질 것이다.
본 발명의 실시예들에 따른 나노입자 구조체는 금속 산화물 나노입자를 포함한다.
상기 금속 산화물 나노입자는 세리아를 포함할 수 있다. 상기 금속 산화물 나노입자는 지르코니아를 더 포함할 수 있다.
상기 금속 산화물 나노입자는, Ce0.7Zr0.3O2의 화학식을 가질 수 있다.
상기 나노입자 구조체는 상기 금속 산화물 나노입자에 결합된 항체를 더 포함할 수 있다. 상기 항체는 마이크로글리아 표적화 항체를 포함할 수 있다. 상기 나노입자 구조체는 신경성 통증을 완화시킬 수 있다. 상기 나노입자 구조체는 마이크로글리아 세포 활성화를 억제할 수 있다.
본 발명의 실시예들에 따른 나노입자 구조체의 형성 방법은 금속 산화물 나노입자를 형성하는 단계를 포함한다.
상기 금속 산화물 나노입자는, 세륨(III) 아세틸아세토네이트 하이드레이트 및 지르코늄(IV) 아세틸아세토네이트 하이드레이트를 올레일아민에 넣은 후 가열하여 반응시키는 것에 의해 형성될 수 있다.
상기 나노입자 구조체의 형성 방법은 상기 금속 산화물 나노입자에 항체를 결합시키는 단계를 더 포함할 수 있다.
상기 금속 산화물 나노입자에 상기 항체를 결합시키는 단계는, 상기 금속 산화물 나노입자에 인지질-PEG를 결합시키는 단계, 및 상기 항체와 상기 인지질-PEG를 반응시키는 단계를 포함할 수 있다.
상기 항체는, 상기 금속 산화물 나노입자에 결합되기 전에 NHS-에스테르와 반응하고, 상기 인지질-PEG와 반응하여 아미드 결합할 수 있다.
본 발명의 실시예들에 따르면, 치료 효과가 우수한 새로운 나노입자 구조체가 구현될 수 있다. 예를 들어, 상기 나노입자 구조체는 마이크로글리아 활성화를 억제할 수 있다. 상기 나노입자 구조체의 표적화된 전달은 마이크로글리아 내 염증성 사이토카인 및 활성 산소종의 향상된 소거를 유도하여 과활성화된 마이크로글리아의 하향 조절을 가능하게 한다. 이에 의해, 마이크로글리아 활성화에 의해 유도되는 신경성 통증이 억제될 수 있다. 또, 상기 나노입자 구조체는 마이크로글리아 활성화와 관련된 다양한 질병 치료에 활용될 수 있으며, 마이크로글리아 이외의 다른 표적화 치료에도 응용될 수 있다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 나노입자 구조체 및 그 형성 방법을 개략적으로 나타낸다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 나노입자 구조체의 TEM 이미지를 나타낸다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 나노입자 구조체의 XRD 분석 그래프를 나타낸다.
도 4는 세륨의 XPS 분석 그래프를 나타낸다.
도 5는 지르코늄의 XPS 분석 그래프를 나타낸다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른 나노입자 구조체의 FCS 분석 그래프를 나타낸다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따른 나노입자 구조체의 유체역학적 직경 및 ζ 전위를 나타낸다.
도 8은 본 발명의 일 실시예에 따른 나노입자 구조체의 활성 산소종 소거 성능을 나타낸다.
도 9는 본 발명의 일 실시예에 따른 나노입자 구조체로 처리된 마이크로글리아 세포의 이미지를 나타낸다.
도 10은 본 발명의 일 실시예에 따른 나노입자 구조체의 마이크로글리아 흡수 효능을 설명하기 위한 도면이다.
도 11은 본 발명의 일 실시예에 따른 나노입자 구조체의 처리 후 통증 매개 유전자 발현 수준을 나타낸다.
도 12 내지 도 14는 본 발명의 일 실시예에 따른 나노입자 구조체의 마이크로글리아 특이 전달을 설명하기 위한 도면이다.
도 15 내지 도 17은 본 발명의 일 실시예에 따른 나노입자 구조체의 진통 효과를 설명하기 위한 도면이다.
이하, 실시예들을 통하여 본 발명을 상세하게 설명한다. 본 발명의 목적, 특징, 장점은 이하의 실시예들을 통해 쉽게 이해될 것이다. 본 발명은 여기서 설명되는 실시예들에 한정되지 않고, 다른 형태로 구체화될 수도 있다. 여기서 소개되는 실시예들은 개시된 내용이 철저하고 완전해질 수 있도록 그리고 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 본 발명의 사상이 충분히 전달될 수 있도록 하기 위해 제공되는 것이다. 따라서, 이하의 실시예들에 의하여 본 발명이 제한되어서는 안 된다.
도면들에서 요소의 크기, 또는 요소들 사이의 상대적인 크기는 본 발명에 대한 더욱 명확한 이해를 위해서 다소 과장되게 도시될 수 있다. 또, 도면들에 도시된 요소의 형상이 제조 공정상의 변이 등에 의해서 다소 변경될 수 있을 것이다. 따라서, 본 명세서에서 개시된 실시예들은 특별한 언급이 없는 한 도면에 도시된 형상으로 한정되어서는 안 되며, 어느 정도의 변형을 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
본 발명의 실시예들에 따른 나노입자 구조체는 금속 산화물 나노입자를 포함한다.
상기 금속 산화물 나노입자는 세리아를 포함할 수 있다. 상기 금속 산화물 나노입자는 지르코니아를 더 포함할 수 있다.
상기 금속 산화물 나노입자는, Ce0.7Zr0.3O2의 화학식을 가질 수 있다.
상기 나노입자 구조체는 상기 금속 산화물 나노입자 표면에 결합된 항체를 더 포함할 수 있다. 상기 항체는 마이크로글리아 표적화 항체를 포함할 수 있다. 상기 나노입자 구조체는 신경성 통증을 완화시킬 수 있다. 상기 나노입자 구조체는 마이크로글리아 세포 활성화를 억제할 수 있다.
본 발명의 실시예들에 따른 나노입자 구조체의 형성 방법은 금속 산화물 나노입자를 형성하는 단계를 포함한다.
상기 금속 산화물 나노입자는, 세륨(III) 아세틸아세토네이트 하이드레이트 및 지르코늄(IV) 아세틸아세토네이트 하이드레이트를 올레일아민에 넣은 후 가열하여 반응시키는 것에 의해 형성될 수 있다.
상기 나노입자 구조체의 형성 방법은 상기 금속 산화물 나노입자에 항체를 결합시키는 단계를 더 포함할 수 있다.
상기 금속 산화물 나노입자에 상기 항체를 결합시키는 단계는, 상기 금속 산화물 나노입자에 인지질-PEG를 결합시키는 단계, 및 상기 항체와 상기 인지질-PEG를 반응시키는 단계를 포함할 수 있다.
상기 항체는, 상기 금속 산화물 나노입자에 결합되기 전에 NHS-에스테르와 반응하고, 상기 인지질-PEG와 반응하여 아미드 결합할 수 있다.
[ 실시예 ]
Ce 0 . 7 Zr 0 . 3 O 2 나노입자의 합성
0.36mg의 세륨(III) 아세틸아세토네이트 하이드레이트 및 0.14mg의 지르코늄(IV) 아세틸아세토네이트 하이드레이트가 15ml의 올레일아민에 첨가된다. 이 혼합물은 20℃에서 10분 동안 초음파처리되고 2℃/min의 가열 속도로 80℃까지 가열된다. 상기 혼합물은 80℃에서 1일 동안 반응되고 20℃까지 냉각된다. 생성물은 아세톤(100ml)으로 세척되고 5000rpm의 원심분리를 여러 번 수행하여 수집된다. 그 결과물인 Ce0.7Zr0.3O2 나노입자(7CZ 나노입자)가 최종 농도 10mg/ml로 클로로포름에 분산된다. 상기 7CZ 나노입자는 약 2nm의 크기를 가질 수 있다.
인지질-PEG- FITC의 결합
6mg의 DSPE-PEG(2000)-아민과 0.6mg의 플루오레세인 이소티오시아네이트(fluorescein isothiocyanate, FITC)가 0.6ml의 클로로포름에 분산된다. 이 혼합물은 40℃에서 4시간 동안 스터링(stirring)되면서 가열 유지된다. 4시간 반응 후 FITC가 PEG 내 아민기와 공유 결합된다.
NHS -에스테르에 CD11b 항체 결합
EDC 커플링 반응에서, 1.5mg의 CD11b 또는 FITC-CD11b 항체가 30mg의 EDCI, 18mg의 NHS(N-Hydroxysuccinimide)-에스테르, 60μl의 TEA, 및 9ml의 탈이온수의 혼합 용액에 첨가된다. 이 혼합물은 상온에서 2시간 동안 흔들어진다. 2시간 반응 후 CD11b 항체의 카르복실산기가 NHS-에스테르에 공유 결합된다.
인지질-PEG 캐핑된 7CZ 나노입자, 7CZ-FITC 나노입자의 합성
수분산성 7CZ 나노입자를 형성하기 위해, 1.5ml의 7CZ 나노입자가 클로로포름(10mg/ml) 내 분산되고, 클로로포름(10mg/ml, mPEG(200)-PE 대 DSPE-PEG(2000)-아민의 비가 2:1) 내 PEG(2000)의 4.5ml 혼합물과 혼합된다. 7CZ-FITC 나노입자의 경우에 클로로포름 내 분산된 같은 양의 7CZ 나노입자가 클로로포름(10mg/ml, mPEG(200)-PE 대 DSPE-PEG(2000)-아민 대 DSPE-PEG(2000)-FITC의 비가 10:3:2) 내 PEG(2000)과 PEG(2000)-FITC의 4.5ml 혼합물과 혼합된다. 각 샘플은 회전 증발기에서 처리되고 진공 오븐에서 70℃에서 2시간 동안 처리되어 클로로포름을 완전히 제거한다. 그 결과물은 5ml의 탈이온수에 분산되어 투명한 콜로이드 서스펜션을 형성한다. 인지질-PEG의 잔존물이 0.4μm 필터를 이용한 필터링과 초원심분리를 여러 번 수행하여 제거된다. 각 샘플의 정화된 생성물이 탈이온수에 유지된다.
7CZ 나노입자 또는 7CZ-FITC 나노입자에 CD11b 항체 결합
CD11b 또는 FITC-CD11b 항체를 7CZ 나노입자 또는 7CZ-FITC 나노입자에 결합시키기 위해, 수분산된 샘플(7CZ 나노입자 또는 7CZ-FITC 나노입자)이 탈이온수에 형성된 항체-NHS 에스테르 혼합물의 중간체에 첨가된다. 나노입자와 항체를 포함하는 이 혼합물은 실온에서 12시간 동안 스터링된다. 반응 생성물은 초원심분리 후 여러 번 세척된다. 정제된 7CZ-Ab 나노입자(항체(Ab)가 결합된 7CZ 나노입자) 또는 7CZ-Ab-FITC 나노입자가 최종적으로 탈이온수에 분산된다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 나노입자 구조체 및 그 형성 방법을 개략적으로 나타낸다.
도 1을 참조하면, 세륨(III) 아세틸아세토네이트 하이드레이트 및 지르코늄(IV) 아세틸아세토네이트 하이드레이트를 올레일아민에 첨가한다. 이 혼합물을 20℃에서 10분 동안 초음파처리하고 2℃/min의 가열 속도로 80℃까지 가열한다. 상기 혼합물을 80℃에서 1일 동안 반응시키고 20℃까지 냉각한다. 이에 의해, 7CZ 나노입자가 형성된다. 상기 7CZ 나노입자는 세리아 및 지르코니아를 포함할 수 있다. 상기 7CZ 나노입자는 약 2nm의 크기를 가질 수 있다.
상기 7CZ 나노입자를 PEG화(PEGylation)한다. 상기 7CZ 나노입자는 상기 PEG화에 의해 수분산성을 가질 수 있다. 상기 PEG화는 상기 7CZ 나노입자에 인지질-PEG를 반응시키는 것에 의해 이루어질 수 있다.
CD11b 항체는 EDC 커플링 반응을 통해 NHS-에스테르와 결합한다. 상기 EDC 커플링 반응에 의해 CD11b 항체의 카르복실산기가 NHS-에스테르에 공유 결합된다.
수분산된 7CZ 나노입자가 항체-NHS 에스테르가 형성된 탈이온수에 첨가되고, CD11b 항체가 7CZ 나노입자에 결합되어 CD11b 항체가 결합된 7CZ 나노입자(7CZ-Ab 나노입자)가 형성된다. CD11b 항체의 결합은 항체와 인지질-PEG 껍질 사이의 안정한 아미드 결합에 의해 이루어질 수 있다.
이와 같이, 항체로 기능화된 세리아-지르코니아 나노입자(Ce0.7Zr0.3O2; 7CZ 나노입자)는 비가수성 졸 겔 반응을 통해 합성될 수 있다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 나노입자 구조체의 TEM 이미지를 나타내고, 도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 나노입자 구조체의 XRD 분석 그래프를 나타낸다.
도 2 및 도 3을 참조하면, HRTEM(high-resolution transmission electron microscopy) 이미지는 약 2nm의 균일한 크기의 코어 7CZ 나노입자의 이산되고 잘 정의된 격자 패턴을 보여준다. 또, SAED(selected area electron diffraction) 및 XRD(X-ray diffraction) 데이터는 7CZ 나노입자의 형석계 입방형 구조를 나타낸다.
도 4는 세륨의 XPS 분석 그래프를 나타내고, 도 5는 지르코늄의 XPS 분석 그래프를 나타낸다.
도 4 및 도 5를 참조하면, Zr4+ 이온이 세리아 나노입자에 삽입됨으로써 정방성(tetragonality)이 증가하기 때문에 XRD 패턴에서 7CZ 나노입자의 약간의 피크 시프트가 관찰된다. 상기 합성 방법은 7CZ 나노입자가 고용체 형성을 가능하게 하므로, 7CZ 나노입자에서 높은 Ce3+/Ce4+ 비율(7CZ 나노입자에서의 Ce3+ 이온 비율: 52.55%)을 갖는 것이 XPS(X-ray photoelectron spectroscopy) 분석에 의해 확인된다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른 나노입자 구조체의 FCS 분석 그래프를 나타낸다.
도 6을 참조하면, 나노입자의 PEG화 및 기능화(항체 결합) 후 FCS(fluorescence correlation spectroscopy) 분석에서. 7CZ-Ab 나노입자는 자유 항체 및 7CZ 나노입자보다 증가된 확산 시간 및 감소된 확산 계수를 나타낸다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따른 나노입자 구조체의 유체역학적 직경 및 ζ 전위를 나타낸다.
도 7을 참조하면, 나노입자의 PEG화 및 기능화(항체 결합) 후 및 DLS(dynamic light scattering) 분석에서, 유체 역학적 직경(hydrodynamic diameter, HD)과 ζ 전위는 7CZ 나노입자의 경우 9.1nm 및 -8.8mV이지만 7CZ-Ab 나노입자의 경우 18.2nm 및 -17.5mV이다. 자유 항체 및 7CZ 나노입자와 비교하여, 7CZ-Ab 나노입자의 증가된 확산 시간과 유체역학적 직경 및 감소된 확산 계수와 ζ 전위는 항체가 나노입자에 성공적으로 결합된 것에 기인한다.
나노입자의 활성 산소종 소거 활성에 대한 항체 효과를 비교하기 위해 SOD(superoxide dismutase) 유사활성, CAT(catalase) 유사활성 및 HORAC(hydroxyl radical protection factor) 활성을 분석하였다.
SOD 분석 키트(Sigma-Aldrich)를 사용하여 수퍼옥사이드 음이온 소거 활성을 평가하였다. 최종 농도 0.1mM의 각 샘플 20μl를 160μl의 WST-1(2-(4-iodophenyl)-3-(4-nitrophenyl)-5-(2,4-disulfophenyl)-2H-tetrazolium sodium salt) 용액에 첨가하였다. 그리고, 수퍼옥사이드 음이온 발생제로 잔틴 옥시다제(xanthine oxidase) 용액 20μl를 각 마이크로플레이트 웰에 첨가하였다. 37℃에서 20분 동안 항온 유지한 후 멀티플 플레이트 리더(multiple plate reader)를 이용하여 450nm에서 각 웰의 흡광도를 측정하였다. 상기 흡광도는 수퍼옥사이드 음이온의 양에 비례하기 때문에 발색 현상의 감소를 수량화하는 것에 의해 수퍼옥사이드의 억제율을 산하였다.
CAT 분석 키트(Amplex Red hydrogen peroxide/peroxidase assay kit, Molecular Probes, Inc.)를 사용하여 CAT 유사활성을 측정하였다. 최종 농도 0.1mM의 각 샘플 10μl를 각 마이크로플레이트 웰에 최종 농도 5μM의 H2O2 용액 40μl와 혼합하였다. 20분 동안 항온 유지한 후 Amplex Red 시약/HRP 용액을 각 웰에 첨가하였고, 각 샘플에 대하여 빛을 차단하고 25℃에서 30분 동안 항온 유지하였다. 멀티플 플레이트 리더를 이용하여 형광을 측정하였다.
HORAC 분석 키트(Cell Biolabs, Inc.)를 사용하여 수산기 라디칼 소거 활성을 평가하였다. 최종 농도 0.1mM의 각 샘플 20μl를 140μl의 형광 프로브에 첨가하였다. 25℃에서 30분 동안 항온 유지한 후 20μl의 수산기 개시제와 20μl의 펜톤 시약(Fenton reagent)을 각 마이크로플레이트 웰에 첨가하여 수산기 라디칼을 발생시켰다. 15초 동안 흔들고 25℃에서 20분 동안 항온 유지한 후 멀티플 플레이트 리더를 이용하여 형광을 측정하였다.
도 8은 본 발명의 일 실시예에 따른 나노입자 구조체의 활성 산소종 소거 성능을 나타낸다.
도 8을 참조하면, 수행된 SOD 유사활성 분석, CAT 유사활성 분석, 및 HORAC 활성 분석에서, 나노입자에서의 항체-결합은 7CZ 나노입자가 수행하는 것과 동일한 성능을 보여줌으로써 활성 산소종을 제거하기 위한 촉매 활성에 차이를 만들지 않는다. 이러한 결과는 수성 매질에서의 활성 산소종의 제거가 항체 결합에 대한 것이 아니라 금속 산화물 나노입자(코어 나노입자)의 능력에 대한 것임을 나타낸다.
7CZ 나노입자 및 7CZ-Ab 나노입자의 마이크로글리아 흡수(uptake)를 비교 테스트하기 위해, 두 농도의 FITC 결합 나노입자, 0.01mM 및 0.02mM을 순수 마이크로글리아 배양에 처리하여 3시간 및 15시간 후 ICC 및 FACS를 이용하여 세포 밀도 내 FITC 신호를 분석하였다.
도 9는 본 발명의 일 실시예에 따른 나노입자 구조체로 처리된 마이크로글리아 세포의 이미지를 나타내고, 도 10은 본 발명의 일 실시예에 따른 나노입자 구조체의 마이크로글리아 흡수 효능을 설명하기 위한 도면이다.
도 9를 참조하면, 7CZ-Ab 나노입자 처리에서 더 높은 형광 신호가 나타났으며, 7CZ 나노입자보다 7CZ-Ab 나노입자가 더 큰 마이크로글리아 흡수 효율을 나타낸다.
도 9 및 도 10을 참조하면, 7CZ 나노입자는 3시간 시점에서 마이크로글리아에 내재화되지 않았지만, 7CZ-Ab 나노입자는 마이크로글리아 세포에 흡수되었는데, 이는 7CZ-Ab 나노입자가 7CZ 나노입자보다 빠른 속도로 마이크로글리아에 내재화됨을 나타낸다. 따라서, FACS 분석은 마이크로글리아 세포에 의한 7CZ-Ab 나노입자의 흡수가 7CZ 나노입자보다 유의하게 증가한 것을 보였다. 7CZ-Ab-FITC에 양성인 마이크로글리아 세포의 백분율은 약 60%였고, 저농도(0.005mM)에서 나노입자를 3시간 처리한 후 7CZ-FITC에 양성인 마이크로글리아 세포는 5% 미만이었다. 0.01mM의 농도에서 7CZ-Ab 나노입자는 약 40%의 마이크로글리아 세포의 7CZ 나노입자 흡수와 비교하여 80% 이상의 마이크로글리아 세포에 의해 흡수되었다.
FITC 양성 마이크로글리아 세포 수가 더 높은 농도의 나노입자 처리(0.02mM)에서도 유사하였지만, 7CZ-Ab 나노입자 처리 세포의 MFI는 7CZ 나노입자 처리 세포의 MFI보다 훨씬 높았으며, 이는 더 높은 농도에서 마이크로글리아에 의한 더 높은 7CZ-Ab 나노입자 흡수를 나타낸다. 이들 데이터는 7CZ 나노입자에 대한 CD11-Ab 결합이 마이크로글리아 및 흡수 효율에 대한 그의 표적화 용량을 증가시킨다는 것을 보여준다.
활성화된 척수 마이크로글리아에서 유도되는 IL-1β, IL-6, 및 NO와 같은 전염증성 매개체는 신경성 통증의 발달에 기여한다. 또, 활성 산소종은 전염증 유전자 발현 유도에 관여한다. 따라서, 7CZ 나노입자 및 7CZ-Ab 나노입자가 체외에서 글리아 세포에서 통증 매개 유전자 발현을 억제하는지 여부를 시험하였다.
도 11은 본 발명의 일 실시예에 따른 나노입자 구조체의 처리 후 통증 매개 유전자 발현 수준을 나타낸다.
도 11을 참조하면, 혼합된 글리아 세포는 LTA 처리(1μg/ml)되거나 LTA와 함께 세농도 0.01mM, 0.02mM, 및 0.04mM의 7CZ 나노입자 또는 7CZ-Ab 나노입자로 15시간 처리되었다. LTA 처리에서, iNOS, IL-6 및 IL-1β의 mRNA 발현은 각각 169, 12 및 22배 증가하였으나 7CZ 또는 7CZ-Ab 나노입자와 함께 처리한 것은 투여량에 따라 현저히 감소하였다.
7CZ-Ab 나노입자 처리에 의한 사이토카인 및 iNOS의 현저하게 높은 감소율에 의해 나타난 바와 같이 7CZ-Ab의 처리가 7CZ보다 억제 효과가 더 높다. iNOS, IL-6 및 IL-1β의 LTA 유도 mRNA 발현은 0.1mM의 7CZ-Ab 나노입자 처리로 각각 95%, 86% 및 91% 감소하였으며, 0.1mM의 7CZ 나노입자 처리로 82%, 63%, 71%로 감소한 것으로 나타났다. 이는 7CZ-Ab 나노입자가 7CZ 나노입자보다 마이크로글리아에서 통증 매개 유전자 발현을 더 잘 억제하는 것을 나타낸다.
도 12 내지 도 14는 본 발명의 일 실시예에 따른 나노입자 구조체의 마이크로글리아 특이 전달을 설명하기 위한 도면이다.
도 12 내지 도 14를 참조하면, CD11b-Ab 결합이 마이크로글라아에 의한 7CZ 나노입자의 증가된 흡수를 유도하고, 생체 내 마이크로글리아에 특이성을 부여한다. 생체 내 7CZ-Ab 나노입자의 흡수를 확인하기 위해, 나노입자가 마우스의 척수에 주입되어 24시간 후에 IHC(immunohistochemistry)를 통해 분석되었다.
L4-L6 조직 샘플은 세포 타입 특이 항체로 면역 염색되고, FITC 신호의 국소화가 관찰된다. FITC 신호는 주로 Iba-1+ 마이크로글리아에서 국소화되고 GFAP+ 성상 세포(astrocytes) 및 MAP-2+ 뉴런에서는 국소화되지 않는다. FITC 양성 세포는 7CZ-Ab-FITC 투여 24시간 후 흘림 세포계측법(flow cytometry)에 의해 척수에서 분석되었다.
세포 타입 특이 마커를 이용한 7CZ Ab-FITC 양성 세포의 특징에서, FITC 신호는 84%의 CD11b+ 마이크로글리아, 26%의 GLAST+ 성상 세포, 및 11%의 Thy-1+ 뉴런에서 관찰된다. 성상 세포와 뉴런에 비해 현저히 높은 비율의 마이크로글리아 세포가 7CZ-Ab 나노입자의 흡수를 보인다.
마이크로글리아 세포의 MFI는 성상 세포 및 뉴런의 MFI보다 훨씬 더 높다. 마우스에 7CZ-Ab 나노입자의 투여는 CD11b+ 마이크로글리아 흡수 특징에 현저한 차이를 나타내고, 7CZ 나노입자에 CD11b-Ab의 결합의 결과로서 마이크로글리아에 나노입자의 특이성을 나타낸다.
도 15 내지 도 17은 본 발명의 일 실시예에 따른 나노입자 구조체의 진통 효과를 설명하기 위한 도면이다.
도 15 내지 도 17을 참조하면, 7CZ-Ab 나노입자에 의한 마이크로글리아 표적화가 더 나은 진통 효과가 있는지를 분석하기 위해, 7CZ 나노입자 또는 7CZ-Ab 나노입자 처리 마우스의 신경 손상 유발성 통증 과민증에 대한 감수성을 비교하였다. L5 SNT 후, SNT 마우스는 본프레이(Vonfrey) 테스트에 의해 측정된 기계적 자극에 대한 증가된 민감성을 나타내었다. 기계적 자극에 대한 PWT는 손상 1일 후 약 0.99g에서 0.1g 미만으로 감소하였다.
임계 값은 2주 동안 0.1g 미만으로 유지되었다. 동일한 몰 농도의 나노입자가 척수강 루트를 통해 투여된 7CZ 나노입자 또는 7CZ-Ab 나노입자 전처리된 마우스에 대하여 PWT를 측정하였다. 7CZ 나노입자 처리된 마우스에서 PWT는 1dpi에서 0.28g, 3dpi에서 0.32g, 7dpi에서 0.42g 및 14dpi에서 0.32g로 증가하였고, 이는 기계적 이질통증이 적당히 감소함을 나타낸다. 그러나, 7CZ-Ab 나노입자 처리된 마우스에서는 PWT가 1dpi에서 0.48g, 3dpi에서 0.42g, 7dpi에서 0.47g, 14dpi에서 0.73g으로 증가하여 7CZ-Ab 나노입자가 7CZ 나노입자와 비교하여 더 강한 진통 효과가 있음을 나타낸다.
7CZ 나노입자(14일째, p값 = 0.023)와 비교하여 7CZ-Ab 나노입자 처리로 인한 WT(withdrawal threshold)의 유의한 증가는 신경성 통증 치료에 대한 더 큰 치료 효과를 의미하며, 이는 증가된 마이크로글리아 표적화 효율에 기인한 것일 수 있다.
생체 내 신경 손상에 의해 유도된 신경성 통증에서 척수 마이크로글리아 활성에 대한 7CZ 나노입자와 7CZ-Ab 나노입자의 영향을 평가하기 위해, 나노입자가 L5 SNT 이전에 투여되었다. 쉠(sham) 마우스 및 SNT 손상을 입은 마우스에 대하여 7CZ 나노입자 또는 7CZ-Ab 나노입자를 주사하고 3일 및 14일 후에 마우스의 척수 절편에서 Iba-1(마이크로글리아 세포 마커) 강도를 측정하고 비교하였다.
SNT 손상을 입은 마우스의 척수 등 호른(동측)에서 Iba-1 형광 강도는 쉠 마우스에 비해 3일 동안 0.54배, 14일 동안 0.45배 증가하였다. 그러나 3일 동안 7CZ-Ab 나노입자를 처리한 마우스에서 SNT에 의해 유발된 마이크로글리아 활성화가 30% 감소했고 7CZ 나노입자를 주입한 마우스에서는 19%가 감소되었다.
14일 시점에서, SNT 유도 마이크로글리아 세포의 활성화는 7CZ-Ab 나노입자 투여로 22%, 7CZ 나노입자 투여로 20% 감소하였다. 두 가지 형태의 나노입자가 이후의 시점에서 SNT 유도 마이크로글리아 세포 활성화를 완화시켰지만, 7CZ-Ab 나노입자는 초기에 7CZ 나노입자에 비해 마이크로글리아 세포 활성화의 더 큰 감소를 나타냈다. 생체 내에서 7CZ-Ab 나노입자는 7CZ 나노입자보다 더 효과적으로 SNT 유도 척수 마이크로글리아 활성을 억제한다.
상술한 바와 같이, 마이크로글리아 세포에 나노입자를 표적화시키는 것은 마이크로글리아에 의한 나노입자의 더 많은 흡수를 초래하여 보다 큰 활성 산소종 소거 효과 및 전염증성 유전자 발현 감소를 강화시킬 수 있다. 즉, 7CZ 나노입자보다 항체가 결합된 7CZ(7CZ-Ab) 나노입자의 더 높은 마이크로글리아 흡수(microglial uptake)가 생체 외(in vitro)와 생체 내(in vivo)에서 더 많은 활성 산소종과 전염증성 사이토카인(pro-inflammatory cytokines)을 줄임으로써 마이크로글리아 활성화를 더욱 감소시킬 수 있다. 또, 7CZ 나노입자에 대한 CD11b 결합은 생체 내 마이크로글리아에 특이성을 부여할 수 있다. 이러한 나노입자는 마이크로글리아 활성화를 감소시키고, 단일 투여량의 척수강 내 주입으로 기계적 이질통을 억제할 수 있다. 따라서, 신경성 통증 치료를 위한 진통제로서 CD11b가 결합된 7CZ 나노입자를 적용할 수 있다.
세리아 나노입자에서 전자를 통한 두 가지 산화 상태(Ce3+, Ce4+)의 자동 전환은 입자가 지속적으로 활성 산소종을 소거할 수 있게 한다. 또한 염증성 질환을 개선하기 위해 Ce3+ 이온이 Ce4+ 이온보다 더 중요하기 때문에 다른 도펀트 이온을 삽입하여 세리아 나노입자의 Ce3+ 함량을 높게 유지하는 것이 필요하다.
세리아-지르코니아 나노입자는 염증 관련 질환의 발병 기전에서 해로운 분자인 수퍼옥사이드 음이온(O2 -)과 수산기 라디칼(·OH)의 제거에 대한 보다 큰 활성을 보여줌으로써 다양한 질병 모델에서 향상된 치료를 수행할 수 있다. 또, 나노 치료제에 대한 표적화된 전달 접근법은 부작용을 피하면서 약물의 효능을 증진시킬 수 있고, 병든 구역을 표적화하여 치료하는 것은 환자에게 더 높은 회복률을 제공할 수 있다.
예를 들어, 통증의 주요 원인인 마이크로글리아의 활성화를 완화하는데 2nm 크기의 세리아-지르코니아 나노입자(Ce0.7Zr0.3O2)는 우수한 활성 산소종 소거 성능을 보인다. 또, 마이크로글리아 표적화 항체(CD11b)를 나노입자에 기능화시켜 마이크로글리아 활성화의 초기 단계에서 활성 산소종 생성 및 염증 반응을 차단할 수 있다.
이제까지 본 발명에 대한 구체적인 실시예들을 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

Claims (13)

  1. 금속 산화물 나노입자를 포함하는 나노입자 구조체.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 금속 산화물 나노입자는 세리아를 포함하는 것을 특징으로 하는 나노입자 구조체.
  3. 제 2 항에 있어서,
    상기 금속 산화물 나노입자는 지르코니아를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 나노입자 구조체.
  4. 제 3 항에 있어서,
    상기 금속 산화물 나노입자는,
    Ce0.7Zr0.3O2 의 화학식을 갖는 것을 특징으로 하는 나노입자 구조체.
  5. 제 1 항에 있어서,
    상기 금속 산화물 나노입자에 결합된 항체를 더 포함하는 나노입자 구조체.
  6. 제 4 항에 있어서,
    상기 항체는 마이크로글리아 표적화 항체를 포함하는 것을 특징으로 하는 나노입자 구조체.
  7. 제 6 항에 있어서,
    상기 나노입자 구조체는 신경성 통증을 완화시키는 것을 특징으로 하는 나노입자 구조체.
  8. 제 6 항에 있어서,
    상기 나노입자 구조체는 마이크로글리아 세포 활성화를 억제하는 것을 특징으로 하는 나노입자 구조체.
  9. 금속 산화물 나노입자를 형성하는 단계를 포함하는 나노입자 구조체의 형성 방법.
  10. 제 9 항에 있어서,
    상기 금속 산화물 나노입자는,
    세륨(III) 아세틸아세토네이트 하이드레이트 및 지르코늄(IV) 아세틸아세토네이트 하이드레이트를 올레일아민에 넣은 후 가열하여 반응시키는 것에 의해 형성되는 것을 특징으로 하는 나노입자 구조체의 형성 방법.
  11. 제 9 항에 있어서,
    상기 금속 산화물 나노입자에 항체를 결합시키는 단계를 더 포함하는 나노입자 구조체의 형성 방법.
  12. 제 11 항에 있어서,
    상기 금속 산화물 나노입자에 항체를 결합시키는 단계는,
    상기 금속 산화물 나노입자에 인지질-PEG를 결합시키는 단계, 및
    상기 항체와 상기 인지질-PEG를 반응시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 나노입자 구조체의 형성 방법.
  13. 제 12 항에 있어서,
    상기 항체는,
    상기 금속 산화물 나노입자에 결합되기 전에 NHS-에스테르와 반응하고, 상기 인지질-PEG와 반응하여 아미드 결합하는 것을 특징으로 하는 나노입자 구조체의 형성 방법.
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