KR20130114469A

KR20130114469A - 세리아 나노복합체와 이를 포함하는 약학 조성물 및 이들의 제조 방법

Info

Publication number: KR20130114469A
Application number: KR1020120036880A
Authority: KR
Inventors: 현택환; 이승훈; 김태호; 김치경
Original assignee: 서울대학교산학협력단
Priority date: 2012-04-09
Filing date: 2012-04-09
Publication date: 2013-10-17
Also published as: EP2796151A1; JP2015518480A; WO2013154290A1; US20150079162A1

Abstract

본 발명은 세리아 나노복합체, 이를 포함하는 약학 조성물 및 이의 제조 방법에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 본 발명은 계면활성제로 둘러싸인 세리아 나노입자를 폴리에틸렌 글리콜-인지질로 캡핑(capping)한 구조를 갖는 나노복합체와, 이를 포함하는 허혈성 뇌졸중 치료 또는 예방용 약학 조성물 및 이들의 제조 방법에 대한 것이다.

Description

세리아 나노복합체와 이를 포함하는 약학 조성물 및 이들의 제조 방법{Ceria Nanocomposite, Pharmaceutical Formulation Comprising the Same, and Process for Preparing the Sames}

본 발명은 세리아 나노복합체, 이를 포함하는 약학 조성물 및 이의 제조 방법에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 본 발명은 계면활성제로 둘러싸인 세리아 나노입자를 폴리에틸렌 글리콜-인지질로 캡핑(capping)한 구조를 갖는 세리아 나노복합체와, 이를 포함하는 허혈성 뇌졸중 치료 또는 예방용 약학 조성물 및 이들의 제조 방법에 대한 것이다.

허혈성 뇌졸중(ischemic stroke)은 미국의 첫번째 주요 성인 장애(adult disability) 원인이고 전세계적으로 두번째 주요 사망 원인이다. 초과산화물 음이온(superoxide anion, O₂ ^-), 과산화수소(H₂O₂) 및 하이드록실 라디칼(HOㆍ)과 같은 반응성 산소종(reactive oxygen species, ROS)이 허혈 기간 중에 생성되고, 허혈성 뇌졸중 손상의 원인이 되는 가장 치명적인 메카니즘 중 하나인 산화적 손상(oxidative damage)을 유발한다. 그러나 임상 진료에서 허혈성 뇌졸중에 대해 입증된 신경보호 치료법(neuroprotective therapy)은 존재하지 아니한다.

세리아(ceria, CeO₂) 나노입자는 가역적으로 산소와 결합하고, CeO₂ 나노입자 표면에서 Ce³ ⁺와 Ce⁴ ⁺ 간의 산화상태 변화에 의해 자유라디칼 제거 활성을 갖는 것으로 알려져 있다(Celardo, I., Pedersen, J. Z., Traversa, E. & Ghibelli, L. Pharmacological potential of cerium oxide nanoparticles. Nanoscale 3, 1411-1420, 2011).

최근에, 세리아 나노입자가, 두 가지 주된 ROS, 즉 초과산화물 음이온 및 과산화수소로부터 세포를 보호하기 위하여 초과산화물 디스뮤타제-유사 활성(세륨이 Ce⁴ ⁺로 산화되는 경우) 및 카탈라아제-유사 활성(세륨이 Ce³ ⁺로 환원되는 경우)을 나타낸다고 보고되었다(Heckert, E. G., Karakoti, A. S., Seal, S. & Self, W. T. The role of cerium redox state in the SOD mimetic activity of nanoceria. Biomaterials 29, 2705-2709, 2008; Korsvik, C., Patil, S., Seal, S. & Self, W. T. Superoxide dismutase mimetic properties exhibited by vacancy engineered ceria nanoparticles. Chem . Commun . 1056-1058, 2007).

국제특허출원 PCT/US2006/024963호는 치료 조성물용 세륨 나노입자를 공개하면서, 상기 조성물이 뇌졸중 치료에 사용될 수 있을 것이라고 언급하고 있다. 그러나, 상기 PCT/US2006/024963호에는 세륨 나노입자를 뇌졸중 치료에 적용한 실시예는 전혀 기재되어 있지 아니하다.

Estevez 등은 세리아 나노입자가 뇌졸중의 치료에 사용될 수 있다고 개시하고 있다.(A Y Estevez, S Pritchard, K Harper, J W Aston, A Lynch, J J Lucky, J S Ludington, P Chatani, W P Mosenthal, J C Leiter, S Andreescu, J S Erlichman, "Neuroprotective mechanisms of cerium oxide nanoparticles in a mouse hippocampal brain slice model of ischemia", FREE RADICAL BIOLOGY AND MEDICINE, Volume: 51, Issue: 6, Pages: 1155-1163, 2011).

그러나 상기 Estevez 등의 논문은 단지 세리아 나노입자에 대해서만 기재하고 있을 뿐, 세리아 나노복합체에 대해서는 전혀 기재하고 있지 아니하다.

본 발명자들은 세리아 나노입자를 올레일 아민 등과 같은 계면활성제로 둘러싼 후, 이를 PEG-인지질로 캡핑(capping)하여 제조되는 세리아 나노복합체는, 생체 독성 없이 세포막을 용이하게 투과하여 세포질 내로 효과적으로 확산한다는 점에 착안하여, 본 발명을 완성하였다.

또한, 본 발명자들은 본 발명의 세리아 나노복합체가 허혈성 뇌졸중의 치료 및 예방에 효과적임을 밝힘으로써, 상기 세리아 나노복합체를 포함하는 허혈성 뇌졸중 치료 및 예방용 약학 조성물을 완성하였다.

본 발명의 기본적인 목적은 계면활성제로 둘러싸인 세리아 나노입자를 폴리에틸렌 글리콜-인지질로 캡핑(capping)한 구조를 나타내는 세리아 나노복합체를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 계면활성제로 둘러싸인 세리아 나노입자를 폴리에틸렌 글리콜-인지질로 캡핑(capping)한 구조를 갖는 세리아 나노복합체를 포함하는 허혈성 뇌졸중 치료 또는 예방용 약학 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 (i) 제1 유기 용매 내에서 세륨 전구체와 계면활성제를 반응시켜 세륨-계면활성제 착화합물을 형성하는 단계; (ii) 상기 (i)단계의 세륨-계면활성제 착화합물 용액을 가열하면서 물을 첨가하여 계면활성제로 둘러싸인 세륨 나노입자를 형성하는 단계; 및 (iii) 제2 유기 용매 내에서 상기 계면활성제로 둘러싸인 세륨 나노입자를 폴리에틸렌 글리콜-인지질로 피복시키는 단계를 포함하는, 세리아 나노복합체 제조 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 기본적인 목적은 계면활성제로 둘러싸인 세리아 나노입자를 폴리에틸렌 글리콜-인지질로 캡핑(capping)한 구조를 갖는 세리아 나노복합체를 제공함으로써 달성될 수 있다.

본 명세서에서 "인지질(phospholipid)"이란, 지질 부분과 인함유 친수성 부분을 포함하는 양친매성 분자를 의미한다. 상기 친수성 부분은 바람직하게는 포스파티딜세린, 포스파티딜에탄올아민, 포스파티딜콜린 또는 포스파티딜리노시톨일 수 있다.

본 명세서에서 "폴리에틸렌 글리콜(polyethylene glycol (PEG))"은 고분자 사슬 내의 에틸렌 옥사이드의 갯수에 따라 약 100 Da 내지 약 10,000 Da의 분자량을 갖는 화합물을 의미한다.

본 명세서에서 "폴리에틸렌 글리콜-인지질(PEG-phospholipid)"은 아래의 화학식 I의 구조를 갖는 화합물이다.

화학식 I

상기 화학식 I에서 R은 C₁₅-C₂₅ 직쇄형 알킬기이고, M⁺는 NH⁴ ⁺ 또는 Na⁺이며, n은 35 내지 55의 정수이다.

본 발명의 세리아 나노복합체는, 세리아 나노입자의 표면에 계면활성제의 친수성 부위가 물리적 또는 화학적 결합을 하고, PEG-인지질 분자의 인지질 부위의 두 가닥 알킬기(R)가 상기 계면활성제의 친유성 부위를 감싸는 구조를 갖는다.

본 발명의 세리아 나노복합체에 있어서, 상기 세리아 나노입자의 크기는 3 nm 내지 20 nm이고, 상기 나노복합체의 크기는 15 nm 내지 100 nm인 것이 바람직하다.

또한, 본 발명의 세리아 나노복합체에 있어서, 상기 계면활성제는 세틸트리메틸암모늄브로마이드(CTAB), 옥틸트리메틸암모늄브로마이드(OCTAB), 도데실트리메틸암모늄브로마이드(DTAB)와 같이, 8 내지 25개의 탄소로 이루어진 알킬트리메틸암모늄염((CH₃)₃RNX, R은 C₈ ~ C₂₅, X는 Br, Cl, I) 계열의 계면활성제; 올레일아민(Oleylamine), 옥틸아민(octylamine), 헥사데실아민(Hexadecylamine), 옥타데실아민(Dctadecylamine)과 같이, 6 내지 20개의 탄소로 이루어진 알킬아민(alkyl amine(RNH₂)계 계면활성제; (에틸렌 옥사이드)₂₀(프로필렌 옥사이드)₇₀(에틸렌 옥사이드)₂₀과 같은 폴리에틸렌옥사이드(poly(ethylene oxide, PEO)-폴리프로필렌옥사이드(poly(propylene oxide, PPO)-폴리에틸렌옥사이드 계열의 폴리(알킬렌 옥사이드) 삼중공중합체(poly(alkylene oxide) triblock copolymer); 또는 불포화지방산(올레익산(C₁₈), 리놀레산(C₁₈))과 포화 지방산(라우릭산(C₁₂), 미리스틱산(C₁₄), 팔미틱산(C₁₆), 스테아릭산(C₁₈))을 포함한 C₁₂ ~ C₁₈ 지방산의 알칼리염일 수 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 계면활성제로 둘러싸인 세리아 나노입자를 폴리에틸렌 글리콜-인지질로 캡핑(capping)한 구조를 갖는 세리아 나노복합체를 포함하는 허혈성 뇌졸중 치료 또는 예방용 약학 조성물을 제공함으로써 달성될 수 있다.

본 발명의 약학 조성물에 포함되는 세리아 나노복합체에서, 세리아 나노입자의 크기는 3 nm 내지 20 nm이고, 상기 세리아 나노복합체의 크기는 15 nm 내지 100 nm인 것이 바람직하다.

본 발명의 약학 조성물에 포함되는 세리아 나노복합체에서, 상기 계면활성제는 세틸트리메틸암모늄브로마이드(CTAB), 옥틸트리메틸암모늄브로마이드(OCTAB), 도데실트리메틸암모늄브로마이드(DTAB)와 같이, 8 내지 25개의 탄소로 이루어진 알킬트리메틸암모늄염((CH₃)₃RNX, R은 C₈ ~ C₂₅, X는 Br, Cl, I) 계열의 계면활성제; 올레일아민(Oleylamine), 옥틸아민(octylamine), 헥사데실아민(Hexadecylamine), 옥타데실아민(Dctadecylamine)과 같이, 6 내지 20개의 탄소로 이루어진 알킬아민(alkyl amine(RNH₂)계 계면활성제; (ethylene oxide)₂₀(propylene oxide)₇₀(ethylene oxide)₂₀과 같은 폴리에틸렌옥사이드(poly(ethylene oxide, PEO)-폴리프로필렌옥사이드(poly(propylene oxide, PPO)-폴리에틸렌옥사이드 계열의 폴리(알킬렌 옥사이드) 삼중공중합체(poly(alkylene oxide) triblock copolymer); 또는 불포화지방산(올레익산(C₁₈), 리놀레산(C₁₈))과 포화 지방산(라우릭산(C₁₂), 미리스틱산(C₁₄), 팔미틱산(C₁₆), 스테아릭산(C₁₈))을 포함한 C₁₂ ~ C₁₈ 지방산의 알칼리염일 수 있다.

또한, 본 발명의 허혈성 뇌졸중 치료 또는 예방용 약학 조성물에 포함되는 상기 세리아 나노복합체는 투여 대상의 체중 1 kg 당 0.5 mg 내지 0.7 mg인 것이 바람직하다.

또한, 본 발명의 허혈성 뇌졸중 치료 또는 예방용 약학 조성물의 투여 경로는 경구 투여, 비강 투여, 정맥내 투여, 직장 투여, 복강내(intraperitoneal) 투여, 피하 투여, 피내(intradermal) 투여일 수 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 (i) 제1 유기 용매 내에서 세륨 전구체와 계면활성제를 반응시켜 세륨-계면활성제 착화합물을 형성하는 단계; (ii) 상기 (i)단계의 세륨-계면활성제 착화합물 용액을 가열하면서 물을 첨가하여 계면활성제로 둘러싸인 세륨 나노입자를 형성하는 단계; 및 (iii) 제2 유기 용매 내에서 상기 계면활성제로 둘러싸인 세륨 나노입자를 폴리에틸렌 글리콜-인지질로 피복시키는 단계를 포함하는, 세리아 나노복합체 제조 방법을 제공함으로써 달성될 수 있다.

상기 제1 유기 용매는 자일렌, 톨루엔, 메시틸렌(Mesitylene) 등의 방향족화합물; 옥틸 에테르, 부틸 에테르, 헥실 에테르, 데실 에테르 등의 에테르(Ether)계 화합물; 피리딘(Pyridine) 등의 헤테로고리화합물(Heterocyclic compounds); 디메틸설폭사이드(dimethylsulfoxide, DMSO), 디메틸포름아미드(Dimethylformamide, DMF); 옥탄올, 데칸올 등의 알코올; 또는 옥탄, 데칸, 도데칸, 테트라데칸, 헥사데칸 등의 하이드로카본일 수 있다.

상기 세륨 전구체는 세륨(III) 아세테이트 하이드레이트, 세륨(III) 아세틸아세토네이트 하이드레이트, 세륨(III) 카보네이트 하이드레이트, 세륨(IV) 하이드록사이드, 세륨(III) 플루오라이드, 세륨(IV) 플루오라이드, 세륨(III) 클로라이드, 세륨(III) 클로라이드 헵타하이드레이트, 세륨(III) 브로마이드, 세륨(III) 아이오다이드, 세륨(III) 나이트레이트 헥사하이드레이트, 세륨(III) 옥살레이트 하이드레이트, 세륨(III) 설페이트, 세륨(III) 설페이트 하이드레이트 또는 세륨(IV) 설페이트로부터 선택될 수 있다.

상기 계면활성제는 세틸트리메틸암모늄브로마이드(CTAB), 옥틸트리메틸암모늄브로마이드(OCTAB), 도데실트리메틸암모늄브로마이드(DTAB)와 같이, 8 내지 25개의 탄소로 이루어진 알킬트리메틸암모늄염((CH₃)₃RNX, R은 C₈ ~ C₂₅, X는 Br, Cl, I) 계열의 계면활성제; 올레일아민(Oleylamine), 옥틸아민(octylamine), 헥사데실아민(Hexadecylamine), 옥타데실아민(Dctadecylamine)과 같이, 6 내지 20개의 탄소로 이루어진 알킬아민(alkyl amine(RNH₂)계 계면활성제; (ethylene oxide)₂₀(propylene oxide)₇₀(ethylene oxide)₂₀과 같은 폴리에틸렌옥사이드(poly(ethylene oxide, PEO)-폴리프로필렌옥사이드(poly(propylene oxide, PPO)-폴리에틸렌옥사이드 계열의 폴리(알킬렌 옥사이드) 삼중공중합체(poly(alkylene oxide) triblock copolymer); 또는 불포화지방산(올레익산(C₁₈), 리놀레산(C₁₈))과 포화 지방산(라우릭산(C₁₂), 미리스틱산(C₁₄), 팔미틱산(C₁₆), 스테아릭산(C₁₈))을 포함한 C₁₂ ~ C₁₈ 지방산의 알칼리염일 수 있다.

상기 (ii)단계의 가열 온도는 80℃ 내지 90℃이고, 가열 시간은 30분 내지 3시간인 것이 바람직하다.

상기 (iii)단계의 제2 유기 용매는 클로로포름, 디클로로메탄, 펜탄, 헥산, 헵탄, 사이클로헥산, 에틸 아세테이트, 테트라하이드로퓨란, 디에틸 에테르 또는 트리클로로에틸렌일 수 있다.

상기 (iii)단계에서 제조되는 세리아 나노복합체의 크기는 15 nm 내지 100 nm인 것이 바람직하다.

본 발명의 세리아 나노복합체는 세포막을 통과하여 세포질 내에 효율적으로 도달할 수 있다. 따라서 본 발명의 세리아 나노복합체는 허혈성 뇌졸중 부위에서 효과적인 치료 효과를 나타낸다.

도 1은 본 발명의 실시예 1에서 합성된 세리아 나노입자의 특성을 나타낸다.
도 2는 본 발명의 실시예 2에서 합성된 인지질-PEG로 둘러싸인 세리아 나노입자의 수동력학적 크기 분포(도 2a) 및 상기 입자의 수분산액(도 2b)을 보여 준다.
도 3은 본 발명의 실시예 3의 세리아 나노입자 분산액의 색 변화 및 과산화수소 용액 첨가 후 세리아 나노입자 분산액의 색 변화 및 UV/Vis 흡광도를 보여 준다.
도 4는 본 발명의 실시예 4의 국소 뇌허혈 재관류 모델에서의 생체내 경색부 및 허혈 세포 사멸을 보여 준다.
도 5는 본 발명의 실시예 5의 세포의 산화적 손상 하에서 첨가한 세리아 나노입자의 농도에 따른 세포 생존율 변화를 보여 준다.
도 6은 본 발명의 실시예 5의, 형광 로다민 염료가 접합된 세리아 나노입자를 사용하여 인큐베이션한 CHO-K1 세포의 형광현미경 사진이다.
도 7은 본 발명의 실시예 6에서의 세리아 나노입자의 생체분포를 보여 준다.
도 8은 본 발명의 실시예 7에서의 세리아 나노입자의 ROS 제거 및 세포자멸 감소 효과를 보여 준다.

이하, 다음의 실시예 또는 도면을 들어 본 발명을 보다 구체적으로 설명하고자 한다. 그러나 다음의 실시예 또는 도면에 대한 설명은 본 발명의 구체적인 실시 태양을 특정하여 설명하고자 하는 것일 뿐이며, 본 발명의 권리 범위를 이들에 기재된 내용으로 한정하거나 제한해석하고자 의도하는 것은 아니다.

실시예 1. 세리아 나노입자의 합성( 역미셀 방법)

1 mmol(0.43 g)의 세륨(III) 아세테이트(98%, Aldrich) 및 12 mmol(3.25 g)의 올레일아민(C₁₈ 함량 약 80-90%, Acros Organics)를 15 ml의 자일렌(98.5%, Aldrich)에 첨가하였다. 이렇게 제조된 용액을 2 시간 동안 실온에서 교반한 후, 감압하에서 90℃까지 가열하였다. 90℃에서 격렬히 교반하면서 1 ml의 탈이온수를 상기 용액에 주입하였고, 용액이 회백색(off-white)으로 변하였는데, 이는 반응이 개시되었다는 것을 의미한다. 이렇게 얻은 혼합물을 90℃에서 3 시간 동안 숙성시켜 밝은 황색의 콜로이드 용액을 얻었고, 이를 실온으로 냉각하였다. 에탄올(100 ml)을 상기 혼합물에 첨가하여 세리아 나노입자를 침전시켰다. 원심분리법을 이용하여 에탄올과 아세톤으로 침전물을 세척하였고, 세척된 세리아 나노입자는 n-헥산 및 클로로포름과 같은 유기용매에 잘 분산되었다.

투과전자현미경 사진에 따르면, 분리되고(discrete) 균일한 3 nm 크기의 세리아 나노입자가 생성되었음을 알 수 있다(도 1a). 고해상도 TEM 사진을 보면 상기 세리아 나노입자가 교차-격자(cross-lattice) 패턴을 보임을 알 수 있는데, 이는 낮은 반응 온도에도 불구하고 높은 결정성을 갖는다는 것을 보여 준다(도 1b). 제한시야 전자회절(selected area electron diffraction (SAED)) 패턴(도 1c) 및 X-선 회절(XRD) 패턴(도 1d)을 보면, 상기 세리아 나노입자가 입방형석구조(cubic fluorite structure)(JCPDS card No.: 34-0394)임을 알 수 있다. 쉐러식(Scherrer formula)에 의해 계산된 입자 크기는 3.3 nm인데, 이는 TEM에 의해 측정된 값과 잘 일치한다. 순수한 세리아 나노입자의 백색과 대비하여, 이렇게 제조된 나노입자는 누르스름한(yellowish) 색이었는데, 그 이유는 상기 제조된 세리아 나노입자가 산화세륨(IV) 뿐만 아니라 산화세륨(III)으로 이루어졌기 때문이다. X-선 광전자 분광법(X-ray photoelectron spectroscopy (XPS))을 사용하여 Ce³ ⁺(885.0 eV 및 903.5 eV에서 피크) 및 Ce⁴ ⁺(882.1 eV, 888.1 eV, 898.0 eV, 900.9 eV, 906.4 eV 및 916.40 eV에서 피크)의 원자가상태(valence state)를 동정하였고, 도 1e에 나타난 바와 같이, 혼합된 원자가상태를 확인하였다.

실시예 2. 인지질- PEG 로 둘러싸인 세리아 나노입자의 합성

생체친화적인 세리아 나노입자를 제조하기 위하여, 페길화(PEGylation)를 수행하였다. 세리아 나노입자를 첨가한 CHCl₃(10 mg/ml) 5 ml를, 50 mg의 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[메톡시(폴리에틸렌 글리콜)-2000](Avanti Lipids)를 함유하는 5 ml의 CHCl₃ 용액과 1:1의 비율로 혼합하였다. 로터리 증발기를 사용하여 용매를 증발시켰고, 감압하의 80℃에서 1 시간 동안 인큐베이션하였다. 추가로 5 ml의 물을 첨가하여 투명하고 연황색의 현탁액이 되었다. 여과 후, 초원심분리에 의해 과량의 mPEG-2000 PE를 제거하였다. 상기 정제된 인지질-PEG로 둘러싸인(capped) 세리아 나노입자를 증류수에 분산시켰다.

상기 인지질-PEG로 둘러싸인 세리아 나노입자는 인산염완충 식염수(phosphate-buffered saline (PBS)) 내에서 뛰어난 콜로이드 안정성을 보였고, 이들의 수동력학적 직경은 수 주 동안 18 nm로 유지되었다(도 2).

실시예 3. 자촉매 활성( autocatalytic activity ) 분석

다양한 농도의 과산화수소 용액(0 M, 0.1 M, 0.5 M 및 1 M)을 5 mM의 세리아 나노입자 분산액에 처리함으로써 자촉매 활성을 분석하였다. 상기 분산액의 색 변화 및 과산화수소 용액을 첨가한 후의 UV/Vis 흡광도를 측정하였다(도 3). 대조군으로서, 과산화수소를 첨가하지 아니한 세리아 나노입자 분산액을 사용하였다. 다양한 농도의 과산화수소 용액을 5 mM의 세리아 나노입자를 함유하는 PBS에 첨가하였을 때, 가역적 자촉매 활성이 3주 후에도 유지되었다.

실시예 4. 국소 뇌허혈 재관류 모델

Longa 등에 의해 개발된 혈관내 내경동맥 봉합법(endovascular internal carotid artery (ICA) suture method)을 약간 변경한 방법을 사용하여 국소 뇌허혈 재관류 모델(focal cerebral ischemia-reperfusion model)을 유도하였다. 30%의 산소 및 70%의 공기에서 3% 이소플루란(isoflurane)을 사용하여 흡입 마취한 후, 중간선 경부 절개(midline cervical incision)에 의해 좌측 총경동맥(common carotid artery (CCA))을 그 분기(bifurcation) 위치에서 노출시켰다. 외경동맥(external carotid artery (ECA)) 및 CCA를 5-0 실크 봉합사로 결찰하였다. 상기 CCA를 가로절단하였고, 5-0 나일론 단사 봉합사(끝 부분을 가열하여 둥글게 처리하였음)를 상기 CCA 내부로 삽입하였다. 중간대뇌동맥(middle cerebral artery (MCA)) 및 기부 전대뇌동맥(proximal anterior cerebral artery)의 기점(origin)을 폐쇄하기 위하여, 상기 봉합사를 상기 ICA 내부로 20 mm 만큼 전진시켰다. 상기 봉합사를 결찰사를 사용하여 제자리에 고정시켰고, 상기 상처를 봉합하였다. 폐쇄 후 60분이 지난 후, 상기 단사를 제거하였다. 서미스터-제어 가열 덮개(thermistor-controlled heating blanket)를 사용하여 직장 온도(rectal temperature)를 37±0.5℃로 유지하였다.

재관류 후 즉시, 다양한 양의 세리아 나노입자(0.1 mg/kg, 0.3 mg/kg, 0.5 mg/kg, 0.7 mg/kg, 1.0 mg/kg, 1.5 mg/kg) 또는 PBS를 정맥 내 주입한 후 라트의 뇌의 경색부(infarct volume)를 비교함으로써, 최적 복용량을 찾았다(도 4a 및 4b). 저복용 세리아 나노입자(0.1 mg/kg 및 0.3 mg/kg)의 경우에는 경색부가 감소하지 아니한 반면에, 0.5 mg/kg 및 0.7 mg/kg 농도의 세리아 나노입자의 경우에는 경색부가 대조군의 경색부의 50%에 이를 정도로 현저히 감소하였다(p<0.05). 그러나 보다 더 많은 복용량(1.0 mg/kg 및 1.5 mg/kg)의 경우에는 뇌졸중으로부터의 보호 효과를 보이지 못했다. 이러한 사실을 뒷받침하기 위하여, TUNEL법(terminal dexoynucleotidyl transferase-mediated dUTP-biotin nick end labeling)을 사용하여 동결 단면(frozen section)을 갖는 얇은 뇌 조각(brain slice)에서 세포 사멸에 대한 현미경 분석을 수행하였다(도 4c). 정량분석에서, 세리아주입 군(0.5 mg/kg)에서 TUNEL-양성 세포의 개수가 현저히 감소하였다(p<0.05; 도 4d). 이로써, 세리아 나노입자의 최적 복용량(0.5 mg/kg 내지 0.7 mg/kg)은 설치류 뇌졸중 모델에서 강력한 신경보호 효과를 보인다는 점을 알 수 있다.

실시예 5. tBHP 를 사용한 세포 ROS 생성 유도 및 세포 생존율 분석

96-웰 플레이트 내의 CHO-K1 세포를 PBS로 2회 세척하였고, 1 mM의 터셔리-부틸 하이드로퍼옥사이드(tert-butyl hydroperoxide (tBHP)) 용액을 첨가한 후 1시간 동안 인큐베이션하였다. PBS로 세척한 후, 세리아 나노입자(0.125 mM, 0.25 mM)를 각 웰에 첨가하였다. 상기 세리아 나노입자를 6시간 동안 처리한 후, MTT(3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyltetrazolium bromide) 분석(Sigma)을 수행하였다.

세포 생존율을 측정하기 위하여, MTT(3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyltetrazolium bromide) 분석법(Sigma)을 사용하였다. 초기에 CHO-K1 세포를 25,000 세포/웰의 밀도로 96-웰 플레이트에 3개씩 접종하고, 37℃에서 24시간 동안 배양 배지 내에서 배양하였다. CHO-K1 세포를 PBS로 2회 세척하였고, 각 웰에 다양한 농도의 세리아 나노입자(0.125 mM, 0.25 mM 및 0.5 mM)를 첨가하였다. 상기 세리아 나노입자를 6시간 동안 처리한 후, 상기 96-웰 플레이트 내의 세포에 대한 생존율을 분석하였다. 각 웰에 5 mg/ml의 MTT 용액 20 μl를 첨가하였고, 5% CO₂의 습윤 분위기에서 37℃에서 2시간 동안 인큐베이션하였다. 상등액을 흡기(aspiration)하고 상기 세포들을 200 μl의 DMSO에 용해시켰다. 30분 동안 진탕(shaking)한 후, 96-웰 플레이트 리더(96-well plate reader, victor3)를 사용하여 540 nm에서의 흡광도를 측정하였다.

상기 MTT 분석에서, 1 M의 tBHP는, 대조군과 비교하여, 세포 사멸을 현저히 증가시켰지만(83%, p<0.05; 도 5), 0.125 mM의 세리아 나노입자를 첨가한 경우에는 세포 생존율이 향상되었다(113%, p<0.05). 또한, 로다민 염료(rhodamine dye)를 사용한 형광 영상에 나타난 바와 같이, 세리아 나노입자는 대부분 세포내 공간(intracellular space) 내에서 검출되었다(도 6). 친유성 고분자로 코팅된 50 nm 미만의 세리아 나노입자는 효과적으로 세포막을 관통하여 확산하고 세포질 전체에 위치한다는 점을 이해할 수 있다. 이러한 결과는, 세포 내로 도입된 세리아 나노입자가, 시험관내에서(in vitro) ROS-유도 세포 사멸(ROS-induced cell death)에 대한 보호 효과를 갖는다는 점을 입증한다.

실시예 6. 세리아 나노입자의 생체내 분포

세리아 나노입자를 정맥내 주입한 지 6 시간 내지 24 시간 후에, 국소 뇌허혈인 라트(rat)를 단두(decapitation)한 후 신속히 뇌와 다른 장기를 회수하였다. 사후 샘플을 얻은 후 유도결합 플라즈마-질량분광법(inductively coupled plasma-mass spectrometry (ICP-MS))에 의해 뇌, 심장, 신장, 간 및 혈액 내의 세리아 농도를 측정하였다.

간에서의 세리아 나노입자 농도는 혈액 및 다른 내부 장기에서의 세리아 나노입자의 농도보다 훨씬 더 높았다(도 7a). 그런데, 비허혈 뇌에서의 세리아 나노입자의 농도는 매우 낮았는데, 허혈 후 6시간 내지 24시간 후에 현격히 증가하였고(p<0.05), 신장 및 심장에서의 세리아 나노입자 농도보다 훨씬 더 높았다. 로다민 B 이소티오시아네이트-접합(Rhodamine B isothiocyanate-conjugated) 세리아 나노입자 및 형광현미경 분석법을 사용하여 세리아 나노입자를 추적하였다. 도 7b에 나타난 바와 같이, 양성-염색된 세포들이 허혈 반구(ischemic hemisphere) 내에 상당히 많이 존재하였지만, 비허혈 반구 내에는 거의 존재하지 아니하였다. 상기 형광 신호에 대해 3차원 재구성(reconstruction)에 의한 컴퓨터 시각 증강(computerized visual augmentation)을 수행하여, 상기 허혈 반구 내의 경색주변부(peri-infarct area)에서 세리아 나노입자의 신호가 매우 증가하였다는 사실을 알아냈다(도 7c). 이로써, 정맥내 주입된 세리아 나노입자가 정상 뇌조직으로 충분히 투과하지 아니하지만, 허혈 뇌조직으로는 투과한다는 점을 입증하였다. 실제로, 세리아 나노입자의 직경이 혈액-뇌 장벽(blood-brain barrier)의 구멍 크기보다 더 크기 때문에, 세리아 나노입자가 정상 뇌를 투과하지 않는다는 점을 보인 것이다. 그러나 뇌 허혈로 인하여 혈액-뇌 장벽이 상당히 손상되고, 이러한 손상으로 인하여 세리아 나노입자가 뇌로 유입된다.

실시예 7. ROS 제거 및 세포자멸 감소 효과의 분석

뇌허혈에서의 ROS 생성을 하이드로에티딘(hydroethidine (HEt))을 사용하여 검사하였다. HEt 용액(100 μl, 디메틸설폭사이드 내에 20 mg/ml; Sigma, St. Louis, MO, USA)를 허혈 유도 15분 전에 수컷 스프래그-돌리 라트(Sprague-Dawley rat)(Koatech, Seoul, Republic of Korea)에 투여하였다. 심장관통 관류(transcardial perfusion)에 의한 허혈 유도 4시간 후에 상기 라트를 죽였다. HEt 검출에 대하여 355 nm에서의 여기 및 >415 nm에서의 방출, 또는 산화된 HEt 검출에 대하여 510 nm 내지 550 nm에서의 여기 및 >580 nm에서의 방출에서, 현미경을 사용하여 형광을 평가하였다. 전세포자멸 단백질(pro-apoptotic protein)을 평가하기 위하여, 상기 라트의 머리를 잘라 죽였고, 국소 허혈-재관류 유도 후 24시간에서 뇌를 추출하였다. 반구 분쇄액(hemisphere homogenate)을 원심분리한 후,10% 소듐 도데실 설페이트-폴리아크릴아미드 겔 상에서 50 μg의 단백질을 분리하여 니트로셀룰로스 막(nitrocellulose membrane)으로 옮겼다. 이 막을 차단 버퍼(pH 7.5의 50 mM Tris 내의 5% 탈지유, 0.15 mM의 NaCl, 0.05% Tween-20) 내에서 인큐베이션시켰고 포스포-P53(phospho-P53), 분할 카스파제-3(cleaved caspase-3) 및 겔솔린(gelsolin)(Cell Signaling Tech., Danvers, MA)을 인식하는 항체를 사용하여 블랏(blot)을 조사하였다. 증강 화학발광(enhanced chemiluminescence)에 의해 면역반응성을 시각화하였고, 측정값과 대조군의 평균값을 비교하여 상대적 밀도를 결정하였다.

뇌졸중 발생 후, 산화된 하이드로에티딘 신호(ROS 검출자)가, 대조군과 비교하여, 세리아 나노입자를 주입한 군에서 증가하였다(p<0.05; 도 8a 및 8b). 이러한 결과는, 세리아 나노입자가 허혈 이후에 항산화제로서의 역할을 적절히 수행하였다는 점을 의미한다. 뇌졸중 이후 세포자멸에 대한 세리아 나노입자의 효과를 분석하기 위하여, 세포자멸적 TUNEL-양성 세포들을 분석하였다(형태학적 기준에 따른 TUNEL-양성 세포들의 하위군). 세리아 나노입자를 주입한 군에서의 자멸 세포의 수는 대조군에서 보다 더 낮았고(p<0.05; 도 8c), 포스포-P53, 분할 카스파제-3 및 겔솔린과 같은 전세포자멸 단백질은 상기 세리아 나노입자를 주입한 군에서 감소하였다(p<0.05; 도 8d 및 8e). ROS 생성 및 세포자멸은 밀접하게 연관되어 있는데, 이들이 동일한 장소인 미토콘드리아에서 발생하기 때문이다.

Claims

계면활성제로 둘러싸인 세리아 나노입자를 폴리에틸렌 글리콜-인지질로 캡핑(capping)한 구조를 갖는 세리아 나노복합체.
제1항에 있어서, 상기 세리아 나노입자의 크기가 3 nm 내지 20 nm인 것임을 특징으로 하는 세리아 나노복합체.
제1항에 있어서, 상기 나노복합체의 크기가 15 nm 내지 100 nm인 것임을 특징으로 하는 세리아 나노복합체.
제1항에 있어서, 상기 계면활성제가 알킬트리메틸암모늄염((CH₃)₃RNX, R은 C₈-C₂₅이고, X는 Br, Cl 또는 I), C₆-C₂₀ 알킬아민, 폴리(알킬렌 옥사이드) 삼중공중합체 및 C₁₂-C₁₈ 지방산의 알칼리염으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것임을 특징으로 하는 세리아 나노복합체.
제4항에 있어서, 상기 알킬트리메틸암모늄염이 세틸트리메틸암모늄브로마이드, 옥틸트리메틸암모늄브로마이드 및 도데실트리메틸암모늄브로마이드로 이루어진 군으로부터 선택되는 것임을 특징으로 하는 세리아 나노복합체.
제4항에 있어서, 상기 C₆-C₂₀ 알킬아민이 올레일아민, 옥틸아민, 헥사데실아민 및 옥타데실아민으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것임을 특징으로 하는 세리아 나노복합체.
제4항에 있어서, 상기 폴리(알킬렌 옥사이드) 삼중공중합체가 (에틸렌 옥사이드)₂₀(프로필렌 옥사이드)₇₀(에틸렌 옥사이드)₂₀인 것임을 특징으로 하는 세리아 나노복합체.
제4항에 있어서, 상기 C₁₂-C₁₈ 지방산의 알칼리염이 올레익산, 리놀레산, 라우릭산, 미리스틱산, 팔미틱산 및 스테아릭산으로 이루어진 군으로부터 선택되는 지방산의 알칼리염인 것임을 특징으로 하는 세리아 나노복합체.
계면활성제로 둘러싸인 세리아 나노입자를 폴리에틸렌 글리콜-인지질로 캡핑(capping)한 구조를 갖는 세리아 나노복합체를 포함하는 허혈성 뇌졸중 치료 또는 예방용 약학 조성물.
제9항에 있어서, 상기 세리아 나노입자의 크기가 3 nm 내지 20 nm인 것임을 특징으로 하는 허혈성 뇌졸중 치료 또는 예방용 약학 조성물.
제9항에 있어서, 상기 세리아 나노복합체의 크기가 15 nm 내지 100 nm인 것임을 특징으로 하는 허혈성 뇌졸중 치료 또는 예방용 약학 조성물.
제9항에 있어서, 상기 계면활성제가 알킬트리메틸암모늄염((CH₃)₃RNX, R은 C₈-C₂₅이고, X는 Br, Cl 또는 I), C₆-C₂₀ 알킬아민, 폴리(알킬렌 옥사이드) 삼중공중합체 및 C₁₂-C₁₈ 지방산의 알칼리염으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것임을 특징으로 하는 허혈성 뇌졸중 치료 또는 예방용 약학 조성물.
제12항에 있어서, 상기 알킬트리메틸암모늄염이 세틸트리메틸암모늄브로마이드, 옥틸트리메틸암모늄브로마이드 및 도데실트리메틸암모늄브로마이드로 이루어진 군으로부터 선택되는 것임을 특징으로 하는 허혈성 뇌졸중 치료 또는 예방용 약학 조성물.
제12항에 있어서, 상기 C₆-C₂₀ 알킬아민이 올레일아민, 옥틸아민, 헥사데실아민 및 옥타데실아민으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것임을 특징으로 하는 허혈성 뇌졸중 치료 또는 예방용 약학 조성물.
제12항에 있어서, 상기 폴리(알킬렌 옥사이드) 삼중공중합체가 (에틸렌 옥사이드)₂₀(프로필렌 옥사이드)₇₀(에틸렌 옥사이드)₂₀인 것임을 특징으로 하는 허혈성 뇌졸중 치료 또는 예방용 약학 조성물.
제12항에 있어서, 상기 C₁₂-C₁₈ 지방산의 알칼리염이 올레익산, 리놀레산, 라우릭산, 미리스틱산, 팔미틱산 및 스테아릭산으로 이루어진 군으로부터 선택되는 지방산의 알칼리염인 것임을 특징으로 하는 허혈성 뇌졸중 치료 또는 예방용 약학 조성물.
제9항에 있어서, 상기 세리아 나노복합체의 함량이 0.5 mg/kg 내지 0.7 mg/kg인 것임을 특징으로 하는 허혈성 뇌졸중 치료 또는 예방용 약학 조성물.
제9항에 있어서, 상기 조성물의 투여 경로가 경구 투여, 비강 투여, 정맥내 투여, 직장 투여, 복강내 투여, 피하 투여, 피내 투여인 것임을 특징으로 하는 허혈성 뇌졸중 치료 또는 예방용 약학 조성물.
(i) 제1 유기 용매 내에서 세륨 전구체와 계면활성제를 반응시켜 세륨-계면활성제 착화합물을 형성하는 단계;
(ii) 상기 (i)단계의 세륨-계면활성제 착화합물 용액을 가열하면서 물을 첨가하여 계면활성제로 둘러싸인 세륨 나노입자를 형성하는 단계; 및
(iii) 제2 유기 용매 내에서 상기 계면활성제로 둘러싸인 세륨 나노입자를 폴리에틸렌 글리콜-인지질로 피복시키는 단계를 포함하는, 세리아 나노복합체 제조 방법.
제19항에 있어서, 상기 제1 유기 용매가 자일렌, 톨루엔, 메시틸렌, 옥틸 에테르, 부틸 에테르, 헥실 에테르, 데실 에테르, 피리딘, 디메틸설폭사이드, 디메틸포름아미드, 옥탄올, 데칸올, 옥탄, 데칸, 도데칸, 테트라데칸 및 헥사데칸으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것임을 특징으로 하는 세리아 나노복합체 제조 방법.
제19항에 있어서, 상기 세륨 전구체가 세륨(III) 아세테이트 하이드레이트, 세륨(III) 아세틸아세토네이트 하이드레이트, 세륨(III) 카보네이트 하이드레이트, 세륨(IV) 하이드록사이드, 세륨(III) 플루오라이드, 세륨(IV) 플루오라이드, 세륨(III) 클로라이드, 세륨(III) 클로라이드 헵타하이드레이트, 세륨(III) 브로마이드, 세륨(III) 아이오다이드, 세륨(III) 나이트레이트 헥사하이드레이트, 세륨(III) 옥살레이트 하이드레이트, 세륨(III) 설페이트, 세륨(III) 설페이트 하이드레이트 및 세륨(IV) 설페이트로 이루어진 군으로부터 선택되는 것임을 특징으로 하는 세리아 나노복합체 제조 방법.
제19항에 있어서, 상기 계면활성제가 알킬트리메틸암모늄염((CH₃)₃RNX, R은 C₈-C₂₅이고, X는 Br, Cl 또는 I), C₆-C₂₀ 알킬아민, 폴리(알킬렌 옥사이드) 삼중공중합체 및 C₁₂-C₁₈ 지방산의 알칼리염으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것임을 특징으로 하는 세리아 나노복합체 제조 방법.
제22항에 있어서, 상기 알킬트리메틸암모늄염이 세틸트리메틸암모늄브로마이드, 옥틸트리메틸암모늄브로마이드 및 도데실트리메틸암모늄브로마이드로 이루어진 군으로부터 선택되는 것임을 특징으로 하는 세리아 나노복합체 제조 방법.
제22항에 있어서, 상기 C₆-C₂₀ 알킬아민이 올레일아민, 옥틸아민, 헥사데실아민 및 옥타데실아민으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것임을 특징으로 하는 세리아 나노복합체 제조 방법.
제22항에 있어서, 상기 폴리(알킬렌 옥사이드) 삼중공중합체가 (에틸렌 옥사이드)₂₀(프로필렌 옥사이드)₇₀(에틸렌 옥사이드)₂₀인 것임을 특징으로 하는 세리아 나노복합체 제조 방법.
제22항에 있어서, 상기 C₁₂-C₁₈ 지방산의 알칼리염이 올레익산, 리놀레산, 라우릭산, 미리스틱산, 팔미틱산 및 스테아릭산으로 이루어진 군으로부터 선택되는 지방산의 알칼리염인 것임을 특징으로 하는 세리아 나노복합체 제조 방법.
제19항에 있어서, 상기 (ii)단계의 가열 온도가 80℃ 내지 90℃인 것임을 특징으로 하는 세리아 나노복합체 제조 방법.
제19항에 있어서, 상기 (ii)단계의 가열 시간이 30분 내지 3시간인 것임을 특징으로 하는 세리아 나노복합체 제조 방법.
제19항에 있어서, 상기 제2 유기 용매가 클로로포름, 디클로로메탄, 펜탄, 헥산, 헵탄, 사이클로헥산, 에틸 아세테이트, 테트라하이드로퓨란, 디에틸 에테르 및 트리클로로에틸렌으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것임을 특징으로 하는 세리아 나노복합체 제조 방법.
제19항에 있어서, 폴리에틸렌 글리콜-인지질로 피복된 세리아 나노입자의 크기가 15 nm 내지 100 nm인 것임을 특징으로 하는 세리아 나노복합체 제조 방법.