JP2023503168A - 生体適合性油性磁性流体および製造方法 - Google Patents

Abstract

【課題】生体適合性油性磁性流体および製造方法の提供。【解決手段】本発明は、酸化鉄ベースの磁性ナノ粒子と、少なくとも１種の脂肪酸エステルを含む油相とを含む生体適合性油性磁性流体であって、前記磁性ナノ粒子が１種または複数種のリン脂質の分子で表面官能化されていることを特徴とする生体適合性油性磁性流体に関し、特に酸化鉄ベースの磁性ナノ粒子と、少なくとも１種の脂肪酸エステルを含む油相とを含む生体適合性油性磁性流体であって、前記油相中に、２０～８０℃の範囲の温度からコロイド状分散液を形成し、前記磁性ナノ粒子が、酸化鉄ベースの磁性ナノ粒子の表面は完全には覆わず、特に、油相中に存在する脂肪酸エステルが酸化鉄ベースの磁性ナノ粒子の表面にアクセスできるような、酸化鉄ベースの磁性ナノ粒子の表面被覆率を確実にする１種または複数種のリン脂質の分子で、酸化鉄ベースの前記磁性ナノ粒子が表面官能化されていることを特徴とする生体適合性油性磁性流体に関する。本発明はまた、このような生体適合性油性磁性流体を製造するための方法および核磁気共鳴画像法のための、またはがんのための温熱療法治療の状況での造影剤としてのその使用に関する。本発明は最後に、このような生体適合性油性磁性流体を含むナノエマルジョンに関する。【選択図】図１

Description

本発明は、少なくとも１種の脂肪酸エステルを含む油相中に分散した磁性酸化鉄ベースの磁性ナノ粒子を含む生体適合性油性磁性流体であって、ナノ粒子が１種または複数種のリン脂質で表面官能化されている、生体適合性油性磁性流体に関する。本発明はまた、このような生体適合性油性磁性流体を製造するための方法および造影剤としてのまたは磁気誘導性温熱療法によるがん治療におけるその使用に関する。最後に、本発明は、このような生体適合性油性磁性流体を含むナノエマルジョンに関する。

磁性流体は、水性溶媒もしくは有機溶媒、または油であってよい担体液体中の超常磁性ナノ粒子の動力学的に安定した分散液から構成される。磁性流体は、外部静磁場が適用された場合磁力を帯びる。磁性流体は、磁場作用の下で移動または変形することができる。磁気誘導性温熱療法における使用の状況では、磁性粒子は、外部交番磁場の作用の下で加熱媒体として使用される。

これら磁性流体の使用に応じて、磁性粒子は水性媒体中、油性媒体中またはエマルジョン中に分散している。

現在、水性磁性流体は、ＭＲＩおよび磁気誘導性温熱療法による固形腫瘍の療法における造影剤としての使用について特に公知である。例えば、ＭａｇＦｏｒｃｅ ＡＧ（登録商標）により開発されたＮａｎｏＴｈｅｒｍ（登録商標）療法の状況では、水性懸濁剤中の酸化鉄ナノ粒子は、標的組織内の腫瘍および塊に注入される。ナノ粒子は、適用された外部磁場の作用で熱を放出し、これが腫瘍細胞の破壊を誘導する。この治療は、化学療法または放射線療法の補助として適用することができる。

有効な磁性流体は、短い磁気誘導治療時間で、および低濃度のナノ粒子で、大きな腫瘍体積を破壊することを可能にしなければならない。しかし、水性分散媒体の発熱性能は油性媒体の性能ほど良好ではない（エマルジョン中に含まれているかどうかに関わらず）。実際に、一般的に油の熱容量は、水の熱容量よりずっと低く、その熱伝導率もまた低い。よって、磁気温熱療法治療における磁性流体組成物の有効性を改善するために、油性磁性流体組成物または少なくともエマルジョンの油相中の磁性粒子分散液を使用することが好ましい。

さらに、患者における水性磁性流体の全身注入は、標的に存在する磁性粒子の量という問題を提起する。すなわち、磁性粒子の量は、３７℃に温度調節された水性環境である生活環境における熱損失を埋め合わせるのに十分でなければならない。全身投与によりこのような治療の有効性を改善することは、推奨用量（酸化鉄造影剤では約０．８ｍｇＦｅ／ｋｇ）をはるかに超えた、好ましい薬物動態および有効な標的化によりもたらされる病理学的領域での十分な蓄積を伴う多量の注入ナノ粒子の注入が必要とされる。

磁性流体ナノエマルジョンまたは磁性流体油性懸濁液は、ＭＲＩ造影剤としての、および磁気温熱療法によるがん治療のための使用が主に公知である。

造影剤として使用されているエマルジョン中の磁性流体の一例が出願ＦＲ３００１１５４において報告されており、この出願は、水相と、油、Ｃ６～Ｃ１８飽和脂肪酸グリセリド、および１種または複数種のＣ８～Ｃ２２脂肪酸で覆われた鉄化合物ベースの磁性粒子を含む脂質相と、少なくとも１種の両親媒性脂質、および少なくとも１種の標的化リガンドを含む界面活性剤とを含む水中油型ナノエマルジョンについて記載している。このようなナノエマルジョンは、添加剤、例えば、ナノエマルジョンの安定化に必要な界面活性剤を含有し、これにより磁性流体組成物の生体適合性が変化し得る。しかし、優れた生体適合性は薬用の使用には不可欠である。

この状況において、出願人は、ある温度で化学的安定性およびコロイド安定性を有することで、ナノ粒子の磁気エネルギーを熱エネルギーへと復元すること、好ましくは注入による投与モードに適合させることを可能にしながら、医薬用の磁性流体組成物の生体適合性および意図する使用に対するこれらの有効性（特に、磁気誘導性温熱療法において使用する状況での、生活環境内の放熱率の減少による熱伝達）を改善しようと試みた。本発明の磁性流体組成物は、異なる医学的用途、特に磁気温熱療法によるがん治療用または造影剤としての用途を想定することができる。

磁性流体の有効性を改善するため、出願人は、特に磁気温熱療法用または造影剤としてのこれらの用途を考慮して、油性磁性流体、ならびに磁性流体エマルジョンに特に興味を持っている。

酸化鉄ナノ粒子は生体適合性であるため、出願人は、これらナノ粒子が分散される媒体の生体適合性の改善を試みた。特に、出願人は、生体適合性添加剤および生体適合性液体担体のみを使用し、生体適合性ではないもの、したがって患者に毒性をもたらし得るものは一切回避しようと試みた。

この状況において、本発明は、酸化鉄ベースの磁性ナノ粒子と、少なくとも１種の脂肪酸エステルを含む油相とを含む新規の生体適合性油性磁性流体であって、前記ナノ粒子が１種または複数種のリン脂質の分子で表面官能化されている生体適合性油性磁性流体を提案する。有利には、本発明による油性磁性流体中で、酸化鉄ベースの磁性ナノ粒子は、好ましくはコロイド状分散液の形態で、少なくとも１種の脂肪酸エステルを含有する油相中に分散している。

実際に、磁気凝集物の形成は、誘導条件下で（すなわち、交番磁場の作用の下で）ナノ粒子の加熱効率の減少をもたらし得る。よって、凝集物の形成、特に大きな凝集物をできるだけ防ぐため、これらのナノ粒子の分散液に特定の注意が払われるべきである。

よって、コロイド安定性は、磁性流体組成物が磁気温熱療法において、造影剤として、または他の任意の治療上の用途に使用されるかに関わらず、磁性流体組成物の性能を改善するための必要条件である。一般的には、酸化鉄ナノ粒子は、界面活性剤または分散液を使用して、コロイドという観点から油性条件下およびエマルジョン中で動力学的に安定化しており、特に磁気双極性相互作用により加熱効率に有害となり得る磁性ナノ粒子凝集物の形成を防ぐ。温度使用条件下で、磁性ナノ粒子は、適用された交番磁場または静磁場の作用で凝結すべきではなく、単相のままであるべきである。しかし、界面活性剤または分散剤は、生体適合性が不十分であるか、またはまったく生体適合性ではない場合が多い。

仏国特許出願公開第３００１１５４号明細書

したがって、出願人は、界面活性剤も分散剤も（または任意の他の非生体適合性添加剤も）使用することなく、温熱療法における用途のため、異なる温度でのナノ粒子分散性に対する条件を探究した。よって出願人は、使用されている金属酸化物ナノ粒子の表面化学反応を研究した。実際に油相中のある特定の構成成分の存在と組み合わせた、思慮深く選択された化学的表面官能化が、注入と適合性のある温度条件下で、油性磁性流体組成物のコロイド安定化の有意な改善を可能にすることを出願人は観察した。

よって、本発明は好ましくは、酸化鉄ベースの磁性ナノ粒子と、少なくとも１種の脂肪酸エステルを含む油相とを含む生体適合性油性磁性流体であって、前記酸化鉄ベースの磁性ナノ粒子が前記油相中に、２０～８０℃の範囲に属する温度からコロイド状分散液を形成し、酸化鉄ベースの磁性ナノ粒子の表面は完全には覆わず、特に、油相中に存在する脂肪酸エステルが酸化鉄ベースの磁性ナノ粒子の表面にアクセスできるような、酸化鉄ベースの磁性ナノ粒子の表面被覆率を確実にする１種または複数種のリン脂質の分子で前記磁性ナノ粒子が表面官能化されていることを特徴とする生体適合性油性磁性流体に関する。

本発明による生体適合性の油性の流体は、有利には、以下の特徴のうちの１つもしくはもう１つの特徴を単独もしくは組み合わせて有する、または以下の特徴のすべてをも有する：
－ 油性磁性流体は水を含まない、および／または界面活性剤を含まない；
－ リン脂質分子は、酸化鉄ベースの磁性ナノ粒子の表面の１９～７６％、好ましくは２９～７６％、優先的には３４～５０％の被覆率を確実にする；
－ リン脂質分子内での官能化の表面密度（またグラフトの表面密度とも呼ばれる）は、０．３２分子／ｎｍ^２～１．２２分子／ｎｍ^２、好ましくは０．４８分子／ｎｍ^２～１．２２分子／ｎｍ^２、優先的には０．５６分子／ｎｍ^２～０．７９分子／ｎｍ^２の範囲に属する；
－ リン脂質は、少なくとも１つの脂肪鎖、好ましくは２つの脂肪鎖、特にＣ６～Ｃ３０および好ましくはＣ８～Ｃ２４またはさらにＣ１０～Ｃ２２、特にＣ１８飽和または一価不飽和もしくは多価不飽和、分枝または好ましくは、直鎖炭化水素鎖を含有する；
－ 油相は、油相の全質量に対して、少なくとも７０質量％の脂肪酸エステルを含み、好ましくは油相は、油相の全質量に対して８０質量％～９５質量％の脂肪酸エステルを含む；
－ 油相の脂肪酸エステルは、個々にまたは混合物中で使用されている、Ｃ６～Ｃ１２、好ましくはＣ６～Ｃ１０飽和脂肪酸トリグリセリドおよびＣ６～Ｃ１２、好ましくはＣ６～Ｃ１０飽和脂肪酸プロピレングリコールから選択される；
－ 磁性ナノ粒子の含有量は、油性磁性流体の全質量に対して、０．０１質量％～５０質量％、好ましくは０．１質量％～１０質量％の範囲に属する；磁性ナノ粒子の含有量が問題になった場合、含有量は酸化鉄ベースの磁性ナノ粒子のみを含み、官能化は含まない；
－ 磁性ナノ粒子は、楕円体、多面体、例えば、ナノキューブ、両錐体またはナノスター、ウエハー、ナノロッド、ナノディスク、またはナノフラワーの形態である；
－ リン脂質は－Ｏ（Ｏ）Ｐ（ＯＨ）Ｏ^－極性ヘッドを有し、好ましくは１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスファチジン酸および１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスファチジン酸の塩から選択される；
－ 生体適合性油性磁性流体は、特にがん治療薬物、例えば、パクリタキセル、ドセタキセル、またはカルムスチンから選択される親油性活性成分をさらに含む。

官能化した酸化鉄ベースの磁性ナノ粒子、例えば本発明の状況で定義されたものは、その実施形態の変化形に関わらず、本発明に不可欠な部分でもある。

本発明はまた、本発明による生体適合性油性磁性流体を製造するための方法にも関する。

本発明による生体適合性油性磁性流体を製造するための方法は、油性磁性流体の生体適合性に対して有害となり得る添加剤を使用することなく、磁性ナノ粒子を分散させることを可能にする。よって、有利なことに、本方法は、がん細胞を破壊しようとするがん治療または誘導治療のための薬剤の存在に関係した医薬活性を除いて、患者に対する毒性を誘導し得るいかなる化合物の使用も除外する。好ましくは、使用される流体および溶媒は生体適合性であり、非生体適合性添加剤は使用されない。有利には、本発明による油性磁性流体を製造するための方法において、いかなる界面活性剤も分散剤も使用されない。

界面活性剤も分散剤も含まず、注入と適合性のある温度で、コロイド状懸濁液の形態で磁性ナノ粒子を含む油性磁性流体を得るため、発明者らは、磁性ナノ粒子の溶媒和層の形成を含む特定の方法を開発した。

出願人は、リン脂質分子により磁性ナノ粒子の官能化の程度を最適化および制御することを可能にする生体適合性油性磁性流体を製造するための方法を開発した。実際に、出願人は、研究中にリン脂質分子の選択および官能化の程度が生体適合性油性磁性流体の安定性および効率に影響を及ぼしたことを観察した。

よって、本発明による生体適合性油性磁性流体を製造するための方法は以下の継続的ステップを含む：
ａ－ 水または水／水と混和性のある溶媒の混合物であってよい水性溶媒中に酸化鉄ベースの磁性ナノ粒子の水性分散液を準備するステップ、
ｂ－ 磁性ナノ粒子の水性分散液から水性溶媒を除去するステップ、
ｃ－ 溶媒または揮発性有機溶媒Ｓ２の混合物の添加により、磁性ナノ粒子のコロイド状ゾルを得るステップ、
ｄ－ 少なくとも１種のリン脂質の分子でコロイド状ゾルの前記磁性ナノ粒子を表面官能化するステップ、
ｅ－ 前記揮発性有機溶媒Ｓ２を除去し、少なくとも１種の脂肪酸エステルを含む油相中に、官能化磁性ナノ粒子を分散させるステップ。

本発明による生体適合性の磁性流体を製造するための方法は、有利には、ステップｃの後およびステップｄの前に、酸を添加するステップｃ２をさらに含む。このステップは、より効率的な官能化という観点から、磁性ナノ粒子の表面に対する、リン脂質分子の極性ヘッドの親和性を増加させることを可能にする。

本発明はまた、医薬、特に、本発明による生体適合性油性磁性流体、または本発明による生体適合性油性磁性流体を製造するための方法に従い得られる生体適合性油性磁性流体を含むがん治療のための医薬に関する。

本発明はまた、磁気誘導性温熱療法によるがん治療中のその使用のための、本発明による生体適合性油性磁性流体、または本発明による生体適合性油性磁性流体を製造するための方法に従い得られる生体適合性油性磁性流体に関する。本発明はまた、磁気温熱療法によるがん治療のための治療法であって、本発明による生体適合性油性磁性流体、または本発明による製造方法に従い得られる生体適合性油性磁性流体の腫瘍内注入、次いで外部交番磁場の適用を含む治療法に関する。

本発明はまた、本発明による生体適合性油性磁性流体、または本発明による製造方法に従い得られる生体適合性油性磁性流体の１０質量％～３０質量％と、水相と、少なくとも１種の界面活性剤とを含む水中油型ナノエマルジョンに関する。このようなナノエマルジョンはまた分散剤および／または標的化リガンドを含むことができる。好ましくは、ナノエマルジョンは生体適合性である。

本発明はまた、本発明によるナノエマルジョンの製造に関する。本方法は、以下の継続的ステップを含む：
ｉ－ 本発明による生体適合性油性磁性流体、または本発明による生体適合性油性磁性流体を製造するための方法に従い得られる生体適合性油性磁性流体を準備するステップ、
ｉｉ－ 少なくとも１種の界面活性剤を含む水相を準備するステップ、および
ｉｉｉ－ 水相と生体適合性油性磁性流体を混合して、ナノエマルジョンを形成するステップ。

本発明によるナノエマルジョンまたは本発明による方法に従い得られるナノエマルジョンは、がん治療のための全身投与に使用することができる。よって、本発明はまた医薬、特に本発明によるナノエマルジョン、または本発明によるナノエマルジョンを製造するための方法に従い得られるナノエマルジョンを含むがん治療のための医薬に関する。本発明はまた、磁気温熱療法によるがん治療中の使用のための、本発明によるナノエマルジョン、または本発明によるナノエマルジョンを製造するための方法に従い得られるナノエマルジョンに関する。本発明はまた、磁気温熱療法によるがん治療のための治療法であって、本発明によるナノエマルジョン、または本発明による製造方法に従い得られるナノエマルジョンの全身注入、次いで磁場の適用を含む治療法に関する。

最後に本発明は、造影剤、特に磁気共鳴画像（ＭＲＩ）のための造影剤であって、本発明による生体適合性油性磁性流体、または本発明による油性磁性流体を含むナノエマルジョンを含む造影剤に関する。

他の様々な特徴は、非限定的な例として、本発明の主題の実施形態の態様を示す添付の図面を参照して下記でなされる説明から明らかとなる。

ａ）本発明による磁性流体およびｂ）本発明によるナノエマルジョンの略図である。 非官能化磁性ナノ粒子およびＤＯＰＡで官能化された磁性ナノ粒子の拡散反射赤外分光法（ＤＲＩＦＴ）分析を示す。 酸の存在下、異なる量の関与する楕円体ナノ粒子ＦＦ１についてのＴＧＡ測定によって決定されたＤＯＰＡの化学吸着収率を示す。 ７分および３０分の反応時のＤＯＰＳの単層を形成するのに必要な量の２０００％に対応する官能化ナノ粒子のサーモグラムを示す。 ０．８１分子／ｎｍ^２の理論上のリン脂質分子被覆密度でＤＯＰＡによって官能化された後に水中またはＭｉｇｌｙｏｌ Ｍ８４０（登録商標）中に分散させた、（磁場－周波数ペア：７５５ｋＨｚ、１０．２ｋＡ／ｍの）磁気誘導に供した楕円体ナノ粒子ＦＦ１の分散液の速度論的温度プロファイルを示す（調節温度Ｔ_０＝３７℃およびＣＦｅ_２Ｏ_３＝５ｇ／Ｌ（ここで、ＣＦｅ_２Ｏ_３は、Ｆｅ_２Ｏ_３の質量濃度である））。図５Ａの挿入図には、［０～１０秒］の範囲にわたる温度プロファイルを拡大する。 １．２９分子／ｎｍ^２の理論上のリン脂質分子被覆密度でＤＯＰＡによって官能化された後に水中またはＭｉｇｌｙｏｌ Ｍ８４０（登録商標）中に分散させた、（磁場－周波数ペア：４７３．５ｋＨｚ、１３．３６ｋＡ／ｍの）磁気誘導に供したナノフラワー形態のＦＦ２の分散液の速度論的温度プロファイルを示す（調節温度Ｔ_０＝３７℃およびＣＦｅ_２Ｏ_３＝５ｇ／Ｌ（ここで、ＣＦｅ_２Ｏ_３は、Ｆｅ_２Ｏ_３の質量濃度である））。 １．１０分子／ｎｍ^２の理論上のリン脂質分子被覆密度でＤＯＰＡによって官能化された後に水中またはＭｉｇｌｙｏｌ Ｍ８４０（登録商標）中に分散させた、（磁場－周波数ペア：４７３．５ｋＨｚ、１３．３６ｋＡ／ｍの）磁気誘導に供したナノフラワー形態のＦＦ３の分散液の速度論的温度プロファイルを示す（調節温度Ｔ_０＝３７℃およびＣＦｅ_２Ｏ_３＝５ｇ／Ｌ（ここで、ＣＦｅ_２Ｏ_３は、Ｆｅ_２Ｏ_３の質量濃度である））。 分散液を２サイクルの磁気誘導（磁場／周波数ペア：４７３．５ｋＨｚ、１３．３６ｋＡ／ｍでのナノ粒子分散液ＦＦ２、Ｔ_０＝３７℃の調節温度およびＣＦｅ_２Ｏ_３＝５ｇ／Ｌ）に供し、１．２９分子ｎｍ^２のリン脂質分子の名目表面被覆密度でＤＯＰＡによって官能化した後に水中またはＭｉｇｌｙｏｌ Ｍ８４０（登録商標）中に分散させたナノフラワー形態ＦＦ２のナノ粒子の分散液の速度論的温度プロファイルを示す。 分散液を２サイクルの磁気誘導（磁場／周波数ペア：３４４．５ｋＨｚ、１６．２３ｋＡ／ｍでのナノ粒子分散液ＦＦ２、Ｔ_０＝３７℃の調節温度およびＣＦｅ_２Ｏ_３＝５ｇ／Ｌ）に供し、１．２９分子ｎｍ^２のリン脂質分子の名目表面被覆密度でＤＯＰＡによって官能化した後に水中またはＭｉｇｌｙｏｌ Ｍ８４０（登録商標）中に分散させたナノフラワー形態ＦＦ２のナノ粒子の分散液の速度論的温度プロファイルを示す。 分散液を２サイクルの磁気誘導（磁場／周波数ペア：４７３．５ｋＨｚ、１３．３６ｋＡ／ｍでのナノ粒子分散液ＦＦ３、Ｔ_０＝３７℃の調節温度およびＣＦｅ_２Ｏ_３＝５ｇ／Ｌ）に供し、１．１０分子ｎｍ^２のリン脂質分子の名目表面被覆密度でＤＯＰＡによって官能化された後に水中またはＭｉｇｌｙｏｌ Ｍ８４０（登録商標）中に分散させたナノフラワー形態ＦＦ３のナノ粒子の分散液の速度論的温度プロファイルを示す。 分散液を４７３．５ｋＨｚ、１３．３６ｋＡ／ｍの磁場／周波数ペア、Ｔ_０＝３７℃の調節温度および酸化鉄の質量濃度ＣＦｅ_２Ｏ_３＝５ｇ／Ｌの磁気誘導に供し、１．１０分子／ｎｍ^２のリン脂質分子の名目表面被覆密度にＤＯＰＡによって官能化した後の、水中の、分散媒の体積によるナノフラワー形態ＦＦ３のナノ粒子分散液の速度論的温度プロファイルおよびナノ粒子によって放散される熱力の値（比吸収率（ＳＡＲ）によって表される）を示す。 分散液を４７３．５ｋＨｚ、１３．３６ｋＡ／ｍの磁場／周波数ペア、Ｔ_０＝３７℃の調節温度および酸化鉄の質量濃度ＣＦｅ_２Ｏ_３＝５ｇ／Ｌの磁気誘導に供し、１．１０分子／ｎｍ^２のリン脂質分子の名目表面被覆密度にＤＯＰＡによって官能化した後の、Ｍｉｇｌｙｏｌ Ｍ８４０（登録商標）中の、分散媒の体積によるナノフラワー形態ＦＦ３のナノ粒子分散液の速度論的温度プロファイルおよびナノ粒子によって放散される熱力の値（比吸収率（ＳＡＲ）によって表される）を示す。 磁気誘導温度センサー（ＭＦＡと呼ばれる：４７３．５ｋＨｚ；１３．３６ｋＡ／ｍ、Ｔ_０＝２５℃、周囲室温）の先端に直接付着させた、水中およびＭｉｇｌｙｏｌ Ｍ８４０（登録商標）中の５ｇ／Ｌの１μＬのナノ粒子分散液ＦＦ３に対応する速度論的プロファイルを示す。 １．１０分子／ｎｍ^２のリン脂質分子の名目表面被覆密度にＤＯＰＡによって官能化された後の、３００ｇ／Ｌの酸化鉄Ｆｅ_２Ｏ_３の質量濃度の、温度センサー（Ｔ_０＝２５℃、周囲室温）の先端に付着させた体積１μＬについての、Ｍｉｇｌｙｏｌ Ｍ８４０（登録商標）中に分散させたナノ粒子ＦＦ３の速度論的温度プロファイルを示す。 ４７３．５ＫＨｚ、１３．３６ｋＡ／ｍ（調節温度Ｔ_０＝３７℃）で２０秒間の誘導下の、水相中に乳化させたＭｉｇｌｙｏｌ Ｍ８４０中に分散させた楕円体ナノ粒子ＦＦ１を含有するナノエマルジョン（１）および（４）（ＣＦｅ_２Ｏ_３＝１２ｇ／Ｌ）の速度論的温度プロファイルを示す。 図１０Ａは、マウス皮下腫瘍における、実施例６に記載された油性磁性流体の腫瘍内注入（同じ注入部位への３００ｇ／Ｌの１μＬの油性磁性流体の２回の注入）の後、誘導治療（４７３．５ＫＨｚ、１３．３６ｋＡ／ｍ）の前（Ｔ０）および２４時間後（Ｔ２４）に生成されたバイオルミネセンス画像を示す。 図１０Ｂは、誘導治療の２４時間後よりも後のｅｘ ｖｉｖｏの腫瘍の蛍光反射率画像化（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｒｅｆｌｅｃｔａｎｃｅ ｉｍａｇｉｎｇ）（ＦＲＩ）およびバイオルミネセンス画像化（ＢＬＩ）画像を示す。 図１１Ａは、マウス皮下腫瘍における、実施例６に記載された油性磁性流体の腫瘍内注入（腫瘍上の異なる場所への３００ｇ／Ｌの１μＬの油性磁性流体の３回の注入）の後、誘導治療（４７３．５ＫＨｚ、１３．３６ｋＡ／ｍ）の前（Ｔ０）および２４時間後（Ｔ２４）に生成されたバイオルミネセンス画像を示す。 図１１Ｂは、誘導治療の２４時間後よりも後のｅｘ ｖｉｖｏの腫瘍の蛍光（ＦＲＩ）およびバイオルミネセンス（ＢＬＩ）画像を示す。

生体適合性油性磁性流体
本発明は、図１に図示されているような、少なくとも１種の脂肪酸エステルを含む油相中の懸濁液中の官能化磁性ナノ粒子を含む生体適合性油性磁性流体に関する。

本発明の状況で使用される官能化磁性ナノ粒子は、少なくとも１種のリン脂質の分子により表面官能化された酸化鉄ベースのナノ粒子である。酸化鉄は生体適合性であるという利点がある。有利には、本発明の状況で使用されるナノ粒子は、有毒性となり得る任意の金属元素、例えば、コバルトまたはマンガンを含まない。

本発明の状況で、「ナノ粒子」とは、基本サイズがナノメーターの粒子、すなわち、平均基本サイズが１ｎｍより大きく、１００ｎｍ未満であり、数の上では、好ましくは平均値に対して３０％未満の標準偏差で単一モードサイズ分布を示す粒子を指す。基本サイズとはナノ粒子の最も大きな寸法を意味する。本発明の状況で、官能化磁性粒子の基本サイズは、酸化鉄ベースのナノ粒子の寸法に対応し、よってリン脂質分子での官能化を含まない。

好ましくは、本発明の状況で、磁性ナノ粒子は平均基本サイズ３０ｎｍ未満、好ましくは２５ｎｍ未満を有する。好ましくは、本発明の状況で使用される磁性ナノ粒子は、３ｎｍより大きい、好ましくは５ｎｍより大きい平均基本サイズを有する。好ましくは、官能化磁性ナノ粒子は、５～３４ｎｍ、好ましくは７～２４ｎｍの範囲に属する平均基本サイズを有する。

「平均基本サイズ」とは、リン脂質コーティングなしで、凝集していない無機ナノ粒子の平均サイズを意味する。平均基本サイズは、１セットのナノ粒子、特に２００個のセットのナノ粒子において測定された基本サイズの算術平均に対応する。ナノ粒子の基本サイズは、油相の除去後、透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）により測定することができる。

本発明による油性磁性流体において、本発明による官能化酸化鉄をベースとした磁性ナノ粒子は、２０～８０℃の範囲に属する温度から、好ましくは６０℃または７０℃と等しい温度から、優先的には３７℃と等しい温度から、さらにより好ましくは、２０℃または２５℃と等しい温度から、使用される油相中にコロイド状分散液を形成する。慣例的に、コロイド状分散液とは、少なくとも２４時間安定している、すなわち、沈殿も、凝集もしない液相中に分散した固体粒子を意味する。媒体の温度の関数としての磁気磁性流体分散液のコロイド安定性は、不透明な、濁ったまたは遮光性の性質を有する凝集物または凝結物の懸濁液とは対照的に、これらの明瞭さおよび半透明さにより定性的に特徴付けることができる。定量的な評価は、８００ｎｍにおいて透過率を測定することにより行うことができる。例えば、５～１５ｎｍのサイズ範囲の、Ｆｅ_２Ｏ_３－γ中の質量濃度０．２ｇ／Ｌのナノ粒子分散液は、このような分散液が、同じ濃度の安定した分散液の透過率と比べて、８００ｎｍにおいてこれらの透過率の少なくとも３０％を失った場合不安定とみなされる。このような透過率の測定は、温度調整装置を備えたＶＡＲＩＡＮ Ｃａｒｙ５００分光光度計を用いて実施することができる。

リン脂質分子における表面被覆率の関数としてのコロイド安定性はまた、ナノ粒子の溶媒和球を考慮することにより、水力学的サイズのナノ粒子を得ることを可能にする動的光散乱（ＤＬＳ）測定により特定することもできる。よって、１０ｎｍのナノ粒子では、４０ｎｍ～５０ｎｍの流体力学的径が最適な条件で測定され、安定性ドメインの限界での条件で１００ｎｍ周辺、分散液が安定していない場合には１００ｎｍよりずっと大きい径が測定され得る。

他の技術、例えば、エックス線回折（ＸＲＤ）がナノ粒子についての情報を得るために使用され、これは実施例に記載されているプロトコルに従い結晶コヒーレンスドメインのサイズを得ることを可能にする。

本発明の状況で使用されるナノ粒子は、様々な形状、例えば、楕円体、多面体、例えば、ナノキューブ、両錐体またはナノスター、ウエハー、ナノロッド、ナノディスクまたはナノフラワーなどの形状であってもよい。いわゆるナノフラワーナノ粒子は、複数の出芽を形成するエピタキシャルナノ結晶の集合体から生成した花の形態において代表的形態を有する。

本発明の状況で、「楕円体」とは、球状または準球状、すなわち、１．２未満の球形度指数（すなわち、その最も大きな直径とその最も小さな直径との間の比）を有することを意味する。

本発明の第１の好ましい実施形態によると、官能化磁性ナノ粒子は楕円体の形態、特に球状または準球状である。次いでこの実施形態によると、磁性ナノ粒子は、５～２０ｎｍ、好ましくは７～１５ｎｍの範囲に属する平均基本サイズを有する。

本発明の第２の好ましい実施形態によると、本発明の状況で使用される官能化ナノ粒子はナノフラワー形態、好ましくは単結晶または準単結晶である。次いでこの実施形態によると、磁性ナノ粒子は、１０～３４ｎｍ、好ましくは１０～２４ｎｍの範囲に属する平均基本サイズを有する。

本発明の状況で、使用されるナノ粒子は、少なくとも１種のリン脂質の分子により表面官能化された酸化鉄ベースのナノ粒子である。特定の実施形態によると、磁性ナノ粒子は、その表面がリン脂質分子で官能化された酸化鉄単独で構成されるナノ粒子である。

本発明の状況で、「酸化鉄ベースの」ナノ粒子とは、酸化鉄で本質的に構成されるナノ粒子、または酸化鉄で独占的に構成されるナノ粒子さえも意味する。

酸化鉄粒子は、フェリ磁性ナノ粒子であり、通常マグネタイト粒子（Ｆｅ_３Ｏ_４）または磁赤鉄鉱粒子（γ－Ｆｅ_２Ｏ_３）または式［Ｆｅ^３＋］_Ｔｄ［Ｆｅ^３＋ _{１＋２ｚ／３}Ｆｅ^２＋ _１－ｚＶ_ｚ／３］_ＯｈＯ_４の他の任意の立方体三二酸化物（ＴｄおよびＯｈは、それぞれスピネルの四面体のおよび八面体部位を表し、Ｖはカチオン空孔を表す）（式中、ｚは０から１に変動する）であってもよい。好ましくは、酸化鉄ナノ粒子は磁赤鉄鉱のナノ粒子、すなわち式［Ｆｅ^３＋］_Ｔｄ［Ｆｅ^３＋ _{１＋２ｚ／３}Ｆｅ^２＋ _１－ｚＶ_ｚ／３］_ＯｈＯ_４（ｚ＝１）の立方体三二酸化物である。

本発明の状況で、生体適合性油性磁性流体の磁性ナノ粒子は、１種または複数種のリン脂質で表面官能化される、すなわち同じまたは異なるリン脂質分子が、各磁性ナノ粒子の表面に化学結合で結合している。これら化学結合は、好ましくは、リン脂質分子の極性ヘッドおよび表面鉄部位により確立された配位または錯体形成結合である。特に、リン脂質ヘッド、中でも－Ｏ（Ｏ）Ｐ（ＯＨ）Ｏ^－型のものは、酸化鉄ベースのナノ粒子への１つまたは複数の配位結合により結合している。

「リン脂質」とは慣例的に、リン酸塩型極性ヘッドおよび１つまたは複数の脂肪鎖で構成される分子を意味する。好ましくは、リン脂質分子は、これらの極性ヘッドを介してナノ粒子の表面に結合している。

好ましくは、生体適合性油性磁性流体の磁性ナノ粒子は、単一型のリン脂質で表面官能化されている。好ましくはないが、２個またはそれよりも多くの異なるナノ粒子で磁性ナノ粒子を官能化することも想定され得る。

本発明の状況で、リン脂質分子は、少なくとも１つの脂肪鎖、好ましくは少なくとも２つの脂肪鎖、特に２つの脂肪鎖を含有する。これらの脂肪鎖は通常６～３０個の炭素原子を含む飽和または不飽和の、直鎖または分枝の炭化水素鎖である。これらの脂肪鎖は、使用される各リン脂質と異なってもよいし、または好ましくは同一であってもよい。

好ましくは、リン脂質分子の脂肪鎖は直鎖である。任意の理論に拘束されることを望むことなく、出願人は、リン脂質分子のこれらの脂肪鎖が、油相の脂肪酸エステルの脂肪鎖によりインターカレートされており、よって溶媒和球の生成を可能にするという意見を有する。リン脂質分子の脂肪鎖上に分枝がないことにより、このインターカレーションが促進される。

リン脂質分子の脂肪鎖は、飽和または一価不飽和もしくは多価不飽和であってもよい。有利には、リン脂質分子の脂肪鎖は一価不飽和である。

リン脂質分子の脂肪鎖は、有利には６～３０個の炭素原子、好ましくは８～２４個の炭素原子、好ましくは１０～２２個の炭素原子および、特に、１８個の炭素原子を含む。

本発明の状況で、磁性粒子の官能化は、好ましくはリン脂質分子の極性ヘッドを介して生じる：磁性ナノ粒子の表面に存在する酸化鉄部位と、リン脂質分子の極性ヘッドとの間の化学結合が、強いアンカリングおよび確実な官能化を可能にする。よって、この表面官能化は良好な化学的安定性を付与し、生理学的条件および貯蔵条件下で劣化されない。

本発明による油性磁性流体の磁性粒子を表面官能化するために使用されるリン脂質分子の極性ヘッドはホスフェート断片であり、好ましくは低い立体障害を有する。出願人は研究中に、低い立体障害が、速度および官能化率のより良い制御を可能にすることを実際に観察した。本発明による磁性ナノ粒子の表面に結合することができるリン脂質分子の極性ヘッドの例として、リン酸、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルエタノール、ホスホチオエタノールまたはその塩から得られるホスフェート断片が挙げられる。特に好ましい方式では、極性ヘッドは－Ｏ（Ｏ）Ｐ（ＯＨ）Ｏ^－基である。

リン脂質分子は、グリセロリン脂質の塩形態、例えば、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスファチジン酸（ＤＯＰＡ）、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスファチジル－Ｌ－セリン、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスファチジルエタノールアミン、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスファチジン酸（ＤＳＰＡ）、ホスファチジルイノシトール、１，２－ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホチオエタノール、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－Ｎ－［３－（２－ピリジルジチオ）プロピオネート］、またはスフィンゴ脂質由来のもの、例えば、スフィンゴミエリンから、有利に選択することができる。アニオン形態のＤＯＰＡおよびＤＳＰＡが特に好ましい。

好ましくは、リン脂質分子は、酸化鉄ベースの磁性ナノ粒子の表面の１９～７６％、好ましくは２９～７６％、優先的には３４～５０％の被覆率を確実にする。

リン脂質分子による磁性ナノ粒子の官能化の表面密度は、好ましくは０．３２分子／ｎｍ^２～１．２２分子／ｎｍ^２、好ましくは０．４８分子／ｎｍ^２～１．２２分子／ｎｍ^２、優先的には０．５６分子／ｎｍ^２～０．７９分子／ｎｍ^２の範囲に属する。官能化密度は、実施例のように、熱重量分析（ＴＧＡ）を使用して決定することができる。

一実施形態によると、ナノ粒子は楕円体の形態であり、リン脂質分子によるこれらナノ粒子の官能化の表面密度は、好ましくは０．３２分子／ｎｍ^２～１．２２分子／ｎｍ^２、好ましくは０．４８分子／ｎｍ^２～１．２２分子／ｎｍ^２、優先的には０．５６分子／ｎｍ^２～０．７９分子／ｎｍ^２の範囲に属する。

特に好ましい実施形態によると、本発明による磁性流体は以下の特徴を有する：
－ 磁性ナノ粒子は楕円体の形態であり、好ましくは５～２０ｎｍ、好ましくは７～１５ｎｍの範囲に属する平均基本サイズを有する、
－ リン脂質分子の極性ヘッドは－Ｏ（Ｏ）Ｐ（ＯＨ）Ｏ^－基である。好ましくは、ナノ粒子は１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスファチジン酸、または１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスファチジン酸のリン酸アニオンで官能化されている、
－ リン脂質分子による磁性ナノ粒子の被覆の表面密度は、０．３２分子／ｎｍ^２～１．２２分子／ｎｍ^２、好ましくは０．４８分子／ｎｍ^２～１．２２分子／ｎｍ^２、優先的には０．５６分子／ｎｍ^２～０．７９分子／ｎｍ^２の範囲に属する、
－ 脂肪酸エステルは、カプロン酸、カプリン酸およびカプリル酸のトリグリセリドならびにカプロン酸、カプリン酸およびカプリル酸のプロピレングリコールエステル、ならびにこれらの混合物から選択される、
－ 油相は、油相の全質量に対して少なくとも７０質量％の脂肪酸エステルを含み、好ましくは油相は、油相の全質量に対して８０質量％～９５質量％の脂肪酸エステルを含む、
－ 油相の脂肪酸エステルは、単独でまたは混合物として使用されるＣ６～Ｃ１２、好ましくはＣ６～Ｃ１０飽和脂肪酸トリグリセリドおよびＣ６～Ｃ１２、好ましくはＣ６～Ｃ１０飽和脂肪酸プロピレングリコールから選択される。

別の実施形態によると、ナノ粒子はナノフラワー形態のものである。

第１の実施形態によると、本発明による生体適合性油性磁性流体中に存在する官能化磁性ナノ粒子は、ホスファチジルセリン極性ヘッドと、少なくとも１つの、好ましくは２つのＣ１０～Ｃ２２、特にＣ１８不飽和、好ましくは、一価不飽和の直鎖脂肪鎖とを有するリン脂質分子で表面官能化された磁赤鉄鉱ナノ粒子である。好ましくは、この実施形態によると、磁赤鉄鉱ナノ粒子は１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスファチジル－Ｌ－セリンで表面官能化される。この実施形態によると、各ナノ粒子上のリン脂質分子被覆の有効な表面密度は、例えば、０．４８～１．２２分子／ｎｍ^２、好ましくは０．５６～０．７９分子／ｎｍ^２の範囲に属する。

好ましい第２の実施形態によると、本発明による生体適合性油性磁性流体に存在する官能化磁性ナノ粒子は、－Ｏ（Ｏ）Ｐ（ＯＨ）Ｏ極性ヘッドと、少なくとも１つの、好ましくは２つのＣ１０～Ｃ２２、特にＣ１８不飽和、好ましくは、一価不飽和の直鎖脂肪鎖とを有するリン脂質分子で表面官能化された磁赤鉄鉱ナノ粒子である。好ましくは、この実施形態によると、磁赤鉄鉱ナノ粒子は１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスファチジン酸の塩形態で表面官能化される。この実施形態によると、各ナノ粒子上のリン脂質分子による被覆の表面密度は、有利には０．３２分子／ｎｍ^２～１．２２分子／ｎｍ^２、好ましくは０．４８分子／ｎｍ^２～１．２２分子／ｎｍ^２、優先的には０．５６分子／ｎｍ^２～０．７９分子／ｎｍ^２の範囲に属する。

好ましくは、油性磁性流体中の磁性ナノ粒子含有量（これは酸化鉄ベースの磁性ナノ粒子のみを含み、官能化は含まない）は、油性磁性流体の全質量に対して、０．０１質量％～５０質量％、好ましくは０．１質量％～１０質量％の範囲に属する。言い換えると、生体適合性油性磁性流体１リットル当たりの磁性ナノ粒子の質量含有量は、有利には０．０１ｇ／Ｌ～５００ｇ／Ｌ、好ましくは１ｇ／Ｌ～１００ｇ／Ｌの範囲に属する。

本発明の状況で、官能化ナノ粒子は、油相中に分散または懸濁され、コロイド状分散液を形成する。この油相は有利には水を含まない、すなわち、この油相は、油相の全質量に対して、０．１質量％未満の水、好ましくは０．０５質量％未満の水、より好ましくは０．０１質量％未満の水を含む。

油相は、少なくとも１種の脂肪酸エステル、好ましくは、油相の全質量に対して、少なくとも７０質量％の脂肪酸エステル、好ましくは８０質量％～９５質量％の脂肪酸エステルを含む。

本発明の状況で、脂肪酸エステルは、４～３６個の炭素原子を含む脂肪族鎖を有するカルボン酸のエステルである。

脂肪酸エステルの脂肪鎖は、一価不飽和もしくは多価不飽和、または飽和であり得る。飽和および不飽和の脂肪酸エステルの混合物もまた本発明の状況で使用することができる。

脂肪酸エステルの脂肪鎖は分枝、または、好ましくは、直鎖であってもよい。任意の理論に拘束されることを望むことなく、出願人は、脂肪酸エステルのこれらの脂肪鎖が、官能化ナノ粒子のリン脂質分子の脂肪鎖によりインターカレートされており、よって溶媒和球の生成を可能にするという意見を持っている。脂肪酸エステルの脂肪鎖上に分枝がないとこのインターカレーションは促進される。

好ましくは、本発明の状況で、脂肪酸エステルは、Ｃ６～Ｃ１８飽和脂肪酸エステル、好ましくはＣ６～Ｃ１２、特にＣ６～Ｃ１０から選択される。好ましくは、脂肪酸エステルはＣ６～Ｃ１２飽和脂肪酸エステル、特にＣ６～Ｃ１０から選択される。例として、脂肪酸エステルの脂肪酸は、カプロン酸、カプリル酸、カプリン酸、ラウリン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、オレイン酸、リノール酸、リノレン酸およびドコサヘキサエン酸から選択することができる。

好ましくは、本発明の状況で、脂肪酸エステルは、単独でまたは混合物として使用されるＣ６～Ｃ１８飽和脂肪酸トリグリセリド、好ましくはＣ６～Ｃ１２、特にＣ６～Ｃ１０およびＣ６～Ｃ１２飽和脂肪酸プロピレングリコール、特にＣ６～Ｃ１０から選択される。好ましくは、脂肪酸エステルは、単独でまたは混合物として使用されるＣ６～Ｃ１２飽和したトリグリセリド、特にＣ６～Ｃ１０およびＣ６～Ｃ１２飽和脂肪酸プロピレングリコール、特にＣ６～Ｃ１０から選択される。

本発明の状況で使用することができる脂肪酸エステルの例として、単独でまたは混合物として使用される飽和脂肪酸のトリグリセリド、例えば、カプロン酸、カプリン酸もしくはカプリル酸のトリグリセリド、または飽和脂肪酸のプロピレングリコール、例えば、プロピレングリコールジカプリロカプレートが挙げられる。

第１の実施形態によると、油相はＣ６～Ｃ１０脂肪酸トリグリセリドおよびＣ６～Ｃ１０脂肪酸プロピレングリコールから選択される単一の脂肪酸エステルを含む。この実施形態によると、脂肪酸エステルは有利には、カプロン酸、カプリン酸およびカプリル酸のトリグリセリド、ならびにカプロン酸、カプリン酸およびカプリル酸のプロピレングリコールエステルから選択される。

第２の実施形態によると、油相は、脂肪酸エステルの混合物、特に２種または３種の脂肪酸エステルを含む。この実施形態によると、脂肪酸エステルは有利には、カプリル酸、カプリン酸およびラウリン酸のエステルから選択される。

油相はまた前記脂肪酸エステルとは異なる１種または複数種の油、任意選択で１種または複数種の親油性の添加剤を含むことができる。有利には、これら追加の油および親油性添加剤は生体適合性であり、本発明による油性磁性流体が患者に投与された場合、患者に対していかなる毒性も生成しない。特定の実施形態によると、本発明による油性磁性流体は界面活性剤または分散剤を含まない。

本発明の状況で、いずれの生体適合性油も使用することができる。

例えば、生体適合性油性磁性流体の油相は、ダイズ油、オリーブ油、ゴマ油、綿実油、ポピー種子油、コプラ油、ヤシ油、アマニ油、ヒマワリ油、Ｃ６～Ｃ１２飽和脂肪酸トリグリセリド油、および魚油から選択される油を含むことができる。

本発明の好ましい実施形態によると、油相は、少なくとも１種の脂肪酸エステルおよび少なくとも１種の油、好ましくは脂肪酸エステルとは異なる単一の油を含む。この実施形態によると、脂肪酸エステルは、好ましくは、単独でまたは混合物として使用されるカプリン酸またはカプリル酸のトリグリセリド、プロピレングリコールジカプリロカプレートから選択される。

好ましくは、本発明による生体適合性油性磁性流体の油相は、油相の全質量に対して、３０質量％未満、好ましくは２０質量％～５質量％の少なくとも１種の脂肪酸エステル以外の油を含む。

生体適合性油性磁性流体はまた、他の生体適合性の親油性添加剤を含むことができる。生体適合性の親油性添加剤の例として、親油性活性成分、例えば、がん治療用の親油性活性成分、例えば、パクリタキセル、ドセタキセル、またはカルムスチンが挙げられる。先行技術において公知の他の生体適合性の親油性添加剤は、本発明の状況で使用することができるが、ここでは詳述しない。

好ましくは、油相中の磁性ナノ粒子の質量パーセンテージは、油性磁性流体の全質量に対して０．０１％～５０％、好ましくは０．１％～１０％の範囲に属する。

有利には、本発明による生体適合性油性磁性流体は安定している。磁性ナノ粒子はよく分散し、２０～８０℃の範囲に属する温度、特に３７℃から、さらにより良いことには、２５℃から、またさらには２０℃から凝結しない。コロイド状分散液は大気圧（１０１３．２５ｈＰａ）下で得られる。前記官能化した酸化鉄ベースの磁性ナノ粒子が前記油相中で、２０～８０℃の範囲に属する温度から、コロイド状分散液を形成すると述べた場合、これは、コロイド状の懸濁液がこの全温度範囲にわたり得られることを意味するわけではない。これは、範囲内の少なくとも１つの温度において、特に範囲の少なくとも一部にわたり、特に、記載されているナノ粒子のすべてが分散し、磁気誘導下でこれらのすべての熱を放出する高温範囲において、安定性が得られることを意味する。しかし、官能化した酸化鉄ベースの磁性ナノ粒子が、周辺温度で、特に温度が２０～２５℃の範囲に属する場合、前記油相中にコロイド状分散液を形成することが好ましい。有利には、コロイド状分散液の安定性は、取得してから少なくとも２４時間、好ましくは少なくとも１カ月維持される。分散液のコロイド特性およびその安定性は、外気下および大気圧で（１０１３．２５ｈＰａ）、特に２４時間の期間にわたり検証することができる。

本発明の状況で、生体適合性油性磁性流体が安定している温度範囲は、リン脂質分子による官能化の表面密度、これらの化学的性質ならびに磁性ナノ粒子のサイズおよび形態に依存する。

本発明による生体適合性油性磁性流体を製造するための方法
本発明はまた、例えば上記に詳述された、本発明による生体適合性油性磁性流体を製造するための方法に関する。この方法は以下の継続的ステップを含む：
ａ－ 水または水／水と混和性のある溶媒の混合物であってもよい水性溶媒中の酸化鉄ベースの磁性ナノ粒子の水性分散液を準備するステップ、
ｂ－ 磁性ナノ粒子の水性分散液から水性溶媒を除去するステップ、
ｃ－ 溶媒または揮発性有機溶媒Ｓ２の混合物の添加により、磁性ナノ粒子のコロイド状ゾルを得るステップ、
ｄ－ 少なくとも１種のリン脂質の分子でコロイド状ゾルの前記磁性ナノ粒子を表面官能化するステップ、
ｅ－ 前記揮発性有機溶媒Ｓ２を除去し、少なくとも１種の脂肪酸エステルを含む油相中に官能化磁性ナノ粒子を分散させるステップ。

ステップａでは、磁性ナノ粒子は、リン脂質分子、例えば、本発明による生体適合性油性磁性流体の官能化ナノ粒子に関して上に記載されているリン脂質分子などにより官能化されていない。これらナノ粒子は、表面官能化ステップ（ステップｄ）後、本発明による油性磁性流体の官能化ナノ粒子に対応する。したがって、これらの非官能化ナノ粒子は、酸化鉄を含み、好ましくは、酸化鉄、特に本発明による生体適合性油性磁性流体の官能化磁性ナノ粒子に関して記載されている酸化鉄から選択される酸化鉄で単独で構成される。水性媒体中で、前記酸化鉄は、前記ナノ粒子の表面上で加水分解し、表面上に鉄ヒドロキシル部位を生成することができる。これらが水相中に分散された場合、これら酸化鉄ナノ粒子は次いで、媒体のｐＨ値に応じて、正または負の静電帯電をこれらの表面に有する。さらに、これら非官能化ナノ粒子は、本発明による生体適合性油性磁性流体の官能化ナノ粒子と同じ形態を有する。

これら非官能化ナノ粒子は水性媒体中の懸濁液中にある。水性媒体は、とりわけ水で構成することができ、任意選択で、水と混和性のある１種または複数種の溶媒、例えば、メタノール、エタノール、イソプロパノール、テトラヒドロフラン、ジメチルスルホキシド、ジメチルホルムアミド、アセトニトリル、アセトンまたは酢酸エチルとの混合物で構成することができる。好ましくは、水性媒体は水単独で構成され、酸性媒体中（例えば、硝酸塩または過塩素酸塩およびｐＨ２．５でのこれらの酸性形態）または塩基性媒体中（例えば、カリウム、テトラメチルアンモニウムおよびｐＨ１０でのこれらの対応する塩基）の磁性流体の安定化から生じるスペクテーター型対イオンを任意選択で含むことができる。

水性分散液中の磁性ナノ粒子濃度は限定されない。有利には、濃度は１ｇ／Ｌより大きい、好ましくは１０ｇ／Ｌより大きい、または１００ｇ／Ｌよりさらに大きい。

好ましくは、非官能化ナノ粒子の水性分散液は水性溶媒および非官能化ナノ粒子のみで構成される。好ましくはないが、非官能化ナノ粒子の水性分散液はまた、親水性添加剤、例えば、巨大分子起源の立体安定化剤、例えば、ポリ（ビニルピロリドン）、デキストラン、官能化ポリ（エチレンオキシド）または界面活性剤、例えば、β－オクチルグルコシド、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）８０またはドデシル硫酸ナトリウムを含むことができる。

非官能化酸化鉄ベースの磁性ナノ粒子の水性分散液は、当業者に公知の任意の技術で製造することができる。

本発明による生体適合性油性磁性流体を製造するための方法のステップｂは、非官能化磁性ナノ粒子の水性分散液から、水性溶媒を除去することからなる。言い換えると、このステップは、非官能化ナノ粒子の水性分散液中の溶媒として使用された水（または任意選択で水性媒体中に存在する、水と混和性のある他の任意の溶媒）ならびに物理吸着した水を除去し、よって溶媒を有さない非官能化磁性ナノ粒子の凝集物を得ることを可能にすることからなる。

このために、先行技術で公知の異なる技術を使用することができる：
－ 金属のナノ粒子を水性媒体から分離するための磁石の使用、この媒体は例えば、吸引またはピペット操作により取り去る、
－ 磁気カラムでの抽出、
－ 限外濾過法、
－ 遠心分離、
－ 水と混和性のある有機溶媒、例えば、メタノール、エタノール、イソプロパノール、テトラヒドロフラン、ジメチルスルホキシド、ジメチルホルムアミド、アセトニトリル、アセトン、または酢酸エチルを用いた継続的洗浄、
－ フリーズドライ、
－ 浸透気化法。

好ましくは、水および／または任意選択で存在する水と混和性のある溶媒は、ナノ粒子の凝結後除去する。凝結は、媒体が中和される時点で得られるか、または、水と混和性のある溶媒、例えば、アセトンまたはエタノールの添加により得られる。次いで、水を含む水性媒体を凝結させたナノ粒子から分離する。例えば、膜ポンプを使用して媒体が吸引またはポンプで送り込まれる間、例えば、磁石を使用して非官能化磁性ナノ粒子の凝集物を保持する。

よって、使用した水性溶媒を除去するための方法に関わらず、水と混和性のある揮発性極性有機溶媒（以下Ｓ１と呼ばれる溶媒）、例えばエタノールによる継続的洗浄は、すべての物理吸着した水をナノ粒子から除去することを可能にし得る。

有利には、この水の除去ステップは、これらの生み出された表面に従い、非官能化磁性ナノ粒子の質量に対して０．２５質量％未満、好ましくは０．０２５質量％未満の含水量を有する非官能化磁性ナノ粒子を回収することを可能にする。

製造方法のステップｃは、非官能化磁性ナノ粒子のコロイド状ゾルを製造するステップからなる。

本発明の状況で、「コロイド状ゾル」とは、連続的液体媒体中の固体粒子の均質なコロイド状分散液を意味する。

非官能化ナノ粒子のコロイド状ゾルは、分散媒中に非官能化ナノ粒子を分散させることにより作り出すことができる。

分散は当業者に公知の任意の技術、例えば、ボルテックスおよび超音波浴中での均質化により実施することができる。

好ましくは、分散媒はまた、磁性ナノ粒子の表面官能化のために続いて使用されるリン脂質の可溶化を可能にする。また、分散媒は、１種または複数種の揮発性有機溶媒（溶媒Ｓ２と呼ぶ）を含む、またはさらにはこれらで独占的に構成される。実際に、このような揮発性有機溶媒は、非官能化ナノ粒子の分散ならびに官能化ステップｄの間に使用されるリン脂質の可溶化の両方を可能にする。よって、表面官能化反応の速度、収率およびリン脂質グラフト率の制御は大きく改善される。

好ましくは、使用される分散媒、特に、揮発性有機溶媒Ｓ２は生体適合性である。よって、微量のこの分散媒が本発明による油性磁性流体中に依然として存在する場合でも、患者に対していかなる毒性も生じない。

好ましくは、分散媒は、本方法のステップｅの間、減圧下での蒸発によりその除去が促進されるよう揮発性である。よって、分散媒が生体適合性でない事例では、この媒体に起因する毒性は存在しない。

揮発性有機溶媒型分散媒Ｓ２の例として、単独でまたはメタノール（例えば２：１ ｖ／ｖの比）、ジエチルエーテル、ヘプタン、ジクロロメタンまたはイソプロパノールとの混合物でのクロロホルムが挙げられる。

特定の実施形態によると、分散媒は単一の揮発性有機溶媒Ｓ２、好ましくは極性のもので構成される。この実施形態によると、分散媒は有利にはクロロホルムである。

好ましくは、コロイド状ゾル中の磁性ナノ粒子濃度は、コロイド状ゾルの全質量に対して、０．１質量％～５０質量％、好ましくは１質量％～１０質量％の範囲に属する。このような磁性ナノ粒子濃度は、有利には良好な生産収率および官能化ステップ後の磁性ナノ粒子表面上のリン脂質分子の分布という点でグラフト率の制御を可能にする。

ステップｃの後およびステップｄの前に実施される任意選択のステップｃ２は、ナノ粒子官能化ステップ（ステップｄ）を考慮して、特に磁性ナノ粒子表面上に存在する鉄部位と、リン脂質分子の極性ホスファチドヘッドとの錯体形成を促進するために実施することができる。このため、磁性ナノ粒子の非官能化コロイド状ゾルに有機酸を添加する。好ましくは、弱有機酸が使用される。弱有機酸とは、その水中の解離反応が完全ではない酸を意味する。リン脂質分子の化学吸着速度は改善される。

有利には、このステップに使用される有機酸は生体適合性である。

好ましくは、この任意選択のステップｃ２に使用される有機酸は、コロイド状ゾルを得るためにステップｃで、有利には１０体積％未満で使用される揮発性有機溶媒Ｓ２に混和性のある弱有機酸から選択される。

リン脂質分子で官能化されていない磁性ナノ粒子を活性化するために使用することができる有機酸の例として、酢酸、乳酸、プロパン酸および／またはブタン酸が挙げられる。

生体適合性油性磁性流体を製造するための方法のステップｄは、少なくとも１種のリン脂質で、コロイド状ゾルの磁性ナノ粒子を表面官能化することからなる。このため、コロイド状ゾルをリン脂質と接触させる。例えば、リン脂質の溶液は、機械的撹拌を用いて、大気圧でコロイド状ゾルに添加することができる。コロイド状ゾル形成に対する任意の公知の技術を使用することができる。

使用されるリン脂質の溶液は、求められている磁性ナノ粒子の官能化に従い、１種または複数種のリン脂質、およびリン脂質が溶解可能な少なくとも１種の溶媒（本明細書で以下溶媒Ｓ３と呼ぶ）を含むことができる。有利には、リン脂質は、特にナトリウム原子などのアルカリ性カチオンを有する塩化形態のホスフェート官能基を保持することによって、磁性ナノ粒子上の前記リン脂質の極性ヘッドのホスフェート官能基の配位／錯体形成を促進する。

リン脂質は一般的に、安定性の目的のため塩形態である。

溶媒Ｓ３は有機溶媒であってもよい。好ましくは、この溶媒Ｓ３は揮発性である。

適切な溶媒Ｓ３の例として、単独でまたはメタノール（例えば、２：１ ｖ：ｖの比）、ジエチルエーテル、ヘプタン、ジクロロメタンまたはイソプロパノールとの混合物でのクロロホルムが挙げられる。

好ましくはこの溶媒（または溶媒の混合物）Ｓ３は、磁性ナノ粒子のコロイド状ゾル中の分散媒として使用される揮発性有機溶媒Ｓ２と同じである。

このリン脂質溶液中で使用されるリン脂質は、本発明による生体適合性油性磁性流体の磁性ナノ粒子を官能化するリン脂質分子に関して詳述されているリン脂質である。

有機溶媒Ｓ２およびＳ３中の磁性ナノ粒子分散液中のリン脂質含有量は、使用される磁性ナノ粒子により生み出される全表面、使用されるリン脂質およびその生み出された表面、ならびに使用される脂肪酸エステルに依存する。有利には、反応媒体中のリン脂質含有量は、コロイド状ゾルの全質量に対して、０．００５質量％～１０質量％の間、好ましくは０．０５質量％～２．５質量％に含まれる。

第１の実施形態に従い、リン脂質分子は、非官能化磁性ナノ粒子により生み出される表面に対して過剰に、好ましくはリン脂質で飽和した単層を形成するのに必要な量の１０００％に対応する量で存在する。実際に、過剰のリン脂質は、磁性ナノ粒子の表面で、反応平衡をシフトさせ、リン脂質の化学吸着速度を増加させる。このような過剰量は、この官能化反応が動力学的に好ましくない場合、例えば、使用されるリン脂質分子の極性ホスフェートヘッドが立体的に束縛されている場合に有利である。よって、コロイド状ゾル中に含有されているリン脂質分子に対する反応時間は、過剰のリン脂質分子に応じて考慮すべきパラメーターである。溶媒、例えば、エタノールの添加により反応は停止し、ナノ粒子の凝結および過剰なリン脂質分子の沈殿を引き起こす。よって、例えば、束縛された極性ヘッド、例えば、ホスファチジルセリンを有する２０００％過剰のリン脂質の場合、本発明の状況で記載されている油中への磁性ナノ粒子の分散に必要な化学吸着時間は、５～３０分、好ましくは６～１０分間、さらにより良いことには、７～８分の間隔から選択される。この実施形態によると、本方法は、例えば、継続的洗浄により、好ましくは有機溶媒の混合物、例えば、エタノール／クロロホルム混合物（３：１）を用いて、過剰のリン脂質分子を除去するその後のステップ、ならびにクロロホルムをエタノールと共に除去する最終ステップを含む。

第２の実施形態に従い、使用されるリン脂質分子の量は、非官能化磁性ナノ粒子の生み出された表面に対して欠乏して存在し、好ましくはリン脂質で飽和した単層を形成するのに必要な量の３８％～１００％の範囲、特に３８％～１００％未満の範囲のパーセンテージで存在する。実際に、リン脂質分子の欠乏は、リン脂質分子により磁性ナノ粒子の官能化率を制御することを可能にする。このような欠乏は、官能化反応が動力学的に非常に好ましい場合、例えば、使用されるリン脂質が－Ｏ（Ｏ）Ｐ（ＯＨ）Ｏ^－、Ｍ^＋、極性ヘッド（Ｍはアルカリ金属原子、好ましくはナトリウム原子である）を有する場合に有利である。

官能化ステップｄの終わりの時点で、磁性ナノ粒子の官能化の被覆率パーセンテージおよび／または表面密度は、例えば、本発明による生体適合性油性磁性流体の官能化磁性ナノ粒子に関して記載されている通りである。本発明による方法に対する条件は、官能化のこのような被覆率パーセンテージおよび／またはこのような表面密度を有するように当業者で調節される。

磁性ナノ粒子の官能化が完了したら、コロイド状ゾルの分散媒および使用されるリン脂質溶液の溶媒Ｓ３のほとんどすべては、例えば、リン脂質酸化を防ぐための不活性ガス（窒素またはアルゴン）の流れの下での蒸発により除去されて（ステップｅ）、リン脂質分子で官能化した磁性ナノ粒子の凝集物が得られる。

最後に、これらの官能化ナノ粒子は少なくとも１種の脂肪酸エステルを含む油相中に分散させる（ステップｅ）。任意の微量の溶媒Ｓ２およびＳ３および主にエタノールは、例えば、回転式エバポレーター内、８０℃で有効な３０分間の間、減圧下で蒸発させる。油相および脂肪酸エステルは、本発明による生体適合性油性磁性流体に関して記載されているものなどである。油相中のコロイド状形態でのこの分散液は、周辺温度で自然に、または３０～８０℃の範囲の温度への加熱により生じる。最も多くの場合、この温度は、グラフト率および利用されるリン脂質分子、油および脂肪酸エステルに従い決定される。このような加熱は、ステップｅ）において、またはその後の加熱ステップにおいて行うことにより、コロイド状分散液を得ることができる。

本発明による生体適合性油性磁性流体の使用
本発明はまた、本発明による生体適合性油性磁性流体、または本発明による製造方法に従い得られる生体適合性油性磁性流体の使用に関する。

本発明による生体適合性油性磁性流体、または本発明の方法に従い得られる生体適合性油性磁性流体は、医薬として、特に、磁気温熱療法によるがん治療のための、特に良性または悪性の小結節または固形腫瘍の治療のための医薬として使用することができる。

有利には、がんを治療するためのこの医薬は、第１の実施形態において、生体適合性油性磁性流体単独で構成される。代わりに、第２の、好ましくない実施形態に従い、医薬は生体適合性油性磁性流体ならびに親油性がん治療剤を含む。

がん患者を治療するために、当業者に公知の任意の技術を使用して生体適合性油性磁性流体の腫瘍内投与が行われ、次いで、外部交番磁場が適用されて、生体適合性油性磁性流体中に含まれる磁性ナノ粒子の加熱が誘導される。この局在型加熱は油性磁性流体の油相の全体積にわたり放散し、よって腫瘍細胞の破壊を可能にする。

特定の実施形態に従い、この加熱は、熱感受性担体に含有された治療剤の放出を伴い、あるいは熱活性化可能な治療剤の活性化のため、または熱感受性プロモーターの転写制御下で遺伝子の発現を誘導するため、または化学療法および／もしくは放射線療法プロトコルの状況で独立して共投与される別の治療剤との相乗効果を発揮するために使用することができる。

通常、適用される交番磁場は５～２５ｋＡ／ｍの範囲内にあり、周波数は１００～７５０ｋＨｚの範囲内にある。適用される磁場／周波数ペアの期間は、治療すべき腫瘍体積の関数として、所与の酸化鉄質量濃度の油性磁性流体に対して放散される体積１単位当たりの熱量に依存する。温熱療法による治療に対するこれらのプロトコルは、求められている治療のタイプに従い（これには、異なる熱量、例えば、温熱切除、治療剤の放出、熱活性化可能な治療剤の活性化または熱感受性プロモーターの転写制御下での遺伝子発現の誘導が必要とされる）異なる磁場／周波数ペアに対して較正される。

第１の実施形態に従い、生体適合性油性磁性流体はこの治療において唯一の医薬として使用される。

第２の実施形態に従い、特に油性磁性流体が化学療法医薬を含まない場合、生体適合性油性磁性流体は、別の化学療法医薬、例えば、パクリタキセル、ドセタキセルまたはカルムスチンと組み合わせて、好ましくは磁気油中に含有されて使用される。熱感受性活性成分、例えば、Ｔｈｅｒｍｏｄｏｘ（登録商標）を含有する注入用製剤の同時注入もまた考慮することができる。

本発明による生体適合性油性磁性流体、または本発明による方法に従い得られる生体適合性油性磁性流体はまた、医学画像、例えば、ＭＲＩ、近赤外線（ＮＩＲ）蛍光画像化、および内視鏡検査による局所的ファイバーアプローチのための造影剤として使用することができる。

蛍光画像化における使用の場合、患者に投与される油性磁性流体は好ましくは親油性蛍光体を含む。

本発明はまた、個体の全身または身体の一部に対する画像化方法であって、前記全身または全身の一部の１つまたは複数の画像を、医学画像技術により取得するステップを含み、前記全身または前記全身の一部が生体適合性油性磁性流体を含む造影媒体を含む方法に関する。

有利には、本発明による油性磁性流体は、少なくとも誘導治療中に到達する温度でコロイド状の形態で分散している。磁性ナノ粒子はその時点でよく分散されており、時間の経過と共に凝集物を形成せず、凝結しない。

さらにより有利には、磁性流体は、特に少なくとも２４時間の間、有利には少なくとも１カ月の間、２０～４０℃の範囲に属する温度で、大気圧で、特に室温（２０℃）または生理学的温度（３７℃）で安定している。外気で評価される短期安定性（２４時間以内の期間）と長期的安定性（２４時間より長い期間）とを区別することが可能である。長期的安定性は、特に不活性雰囲気下、例えば、アルゴンまたは窒素下で、光からの保護下で、安定性が評価されなければならない温度、特に２０℃または３７℃で、磁性流体を保つことにより評価することができる。

本発明による磁性流体が、周辺温度より高い温度、特に２０～４０℃の範囲に属する温度のみでコロイド状分散液に対応する場合、磁性流体をサーモスタット付き容器またはチャンバー内で保つこと、または使用前にこれらをコロイド状分散液を得ることを可能にする温度に加熱することさえ必要となり得る。磁性流体はまた、サーモスタット付きの点滴を使用した注入により、または満足するコロイド安定性が得られる２０～４０℃の範囲の温度で磁性流体を維持するよう、加熱キットまたはデバイスを導入することにより投与することができる。

本発明による生体適合性油性磁性流体を含むナノエマルジョン

本発明はまた、図１に概略的に示されている通り、本発明による生体適合性油性磁性流体ナノエマルジョン、または本発明による油性磁性流体を製造するための方法に従い得られる生体適合性油性磁性流体ナノエマルジョンに関する。

「ナノエマルジョン」とは、連続相中のその分散相の小滴がナノメーターサイズ、すなわち、１００ｎｍ～３００ｎｍ未満の間であるエマルジョンを意味する。

本発明の状況で、ナノエマルジョンは、単純な水中油型または油中水型のエマルジョン、または水中油中水型のマルチプルエマルジョンであってもよい。好ましくは、本発明によるナノエマルジョンは水中油型エマルジョンである。

第１の実施形態に従い、ナノエマルジョンの親油相は生体適合性油性磁性流体単独で構成される。

第２の実施形態に従い、ナノエマルジョン親油相は、生体適合性油性磁性流体を、特に油、親油性蛍光体、パーフルオロカーボンまたは親油性活性成分、例えば、パクリタキセル、ドセタキセル、エトポシド、カルムスチンの中から選択される１種または複数種の他の親油性化合物と組み合わせて含む。

さらに、これらの薬物動態を改善するために、磁性の脂質滴の界面相は、１種または複数種のペグ化脂質（リン脂質）および／または標的化リガンド（抗体、ペプチド、アプタマー）を含有することができる。

本発明によるナノエマルジョンに使用することができる、活性のあるがん治療成分以外の親油性化合物は好ましくは生体適合性であり、いかなる毒性も生成しない。

先行技術で公知のいずれの生体適合性油も使用することができる。本発明の状況でナノエマルジョンの別の脂質化合物として使用することができる油の例として、ダイズ油、オリーブ油、ゴマ油、綿実油、ポピー種油、コプラ油、ヤシ油、アマニ油、ヒマワリ油、脂肪酸トリグリセリド油、例えば、Ｍｉｇｌｙｏｌ ８１２Ｎ（登録商標）またはＬａｂｒａｆａｃ（登録商標）ＷＬ １３４９、脂肪酸プロピレングリコール油、例えば、Ｍｉｇｌｙｏｌ ８４０（登録商標）またはＬａｂｒａｆａｃ（登録商標） ＰＧおよび魚油が挙げられる。

ナノエマルジョンが、生体適合性油性磁性流体に加えて、油または油の混合物を含む場合、これらの油は一般的に、ナノエマルジョンの全質量に対して、１０質量％～３５質量％、好ましくは２０質量％～３０質量％の範囲に属する含有量で存在する。

本発明の状況で使用することができる親油性蛍光体として、リン脂質およびスフィンゴミエリンの蛍光アナログ、シアニン、例えば、インドシアニングリーン（ＩＣＧ）および親油性カルボシアニンが挙げられる。

ナノエマルジョンが親油性蛍光体を含む場合、これらの油は好ましくは、ナノエマルジョンの全質量に対して、０．０００１質量％～０．０２質量％、好ましくは０．００１質量％～０．０１％質量％の範囲に属する含有量で存在する。

標的化リガンドは、分子の相互作用により生物学的ターゲットを認識することを可能にし、よって投与される混合物の特異性を改善することが公知である。標的化リガンドの例として、アミノ酸、例えば、葉酸、糖、例えば、マンノースもしくはＦＤＧ（ＰＥＴ画像化に一般的に使用されているフルオロデオキシグルコース）、ペプチド配列、例えば、インテグリンに対する環式ＲＧＤペプチドもしくはソマトスタチンタイプ２受容体に対して高親和性を有する（Ｔｙｒ３）－オクトレオテート（ＴＡＴＥ）、合成化合物、例えば、ドーパミンＤ２受容体のアンタゴニストとして作用するラクロプリド、異なるフォーマットの抗体、例えば、ラクダ類由来の抗体（ナノボディー）もしくはファージディスプレイスクリーニング法により選択された組換え抗体の断片、例えば、ＰＳＭＡに対するｓｃＦｖもしくは免疫療法に使用される抗ＰＤ１／ＰＤＸ１、またはがん細胞の膜受容体に対するＳＥＬＥＸスクリーニング法により選択されるアプタマーに基づく薬剤が挙げられる。

本発明によるナノエマルジョンの水相は通常、水により、任意選択で１種または複数種の水と混和性のある溶媒、例えばエタノールおよびプロピレングリコールと組み合わせて構成される。ナノエマルジョンの水相はまた塩（ナトリウムまたは塩化カリウム）または緩衝液を含むことができる。

さらに、ナノエマルジョンは、分散剤とも呼ばれる、好ましくは生体適合性である１種または複数種の界面活性剤を含むことができる。よって、これら界面活性剤および分散剤はナノエマルジョンの水相／親油相境界面に存在する。

本発明の範囲内で適切となり得る界面活性剤および分散剤の例として、卵またはダイズレシチン、胆汁酸、例えばデオキシコール酸ナトリウム、ポリオキシエチレン化ヒマシ油、ポリソルベート２０、ポリソルベート４０、ポリソルベート６０、ポリソルベート８０、モノラウリン酸ソルビタン（Ｓｐａｎ（登録商標）２０、Ｓｐａｎ（登録商標）４０、Ｓｐａｎ（登録商標）６０、および／またはＳｐａｎ（登録商標）８０）、ポロキサマーまたはＰＥＧブロックコポリマーが挙げられる。

これらの薬剤が存在する場合、界面活性剤および／または分散剤含有量は通常、ナノエマルジョンの全質量に対して１質量％～５質量％、好ましくは１．８質量％～３．８質量％の範囲に属する。

有利には、本発明によるナノエマルジョンは周辺温度（２０℃）、大気圧で安定している。特に、本発明によるナノエマルジョンは、少なくとも２４時間の間、好ましくは少なくとも６か月の間、周辺温度（２０℃）および大気圧で安定している。

本発明の状況で、ナノエマルジョンのコロイド安定性は、実施例で詳述されているように、動的光散乱（ＤＬＳ）による粒径分布の評価で決定される。

本発明によるナノエマルジョンに対する製造方法

本発明はまた、本発明によるナノエマルジョンを製造するための方法に関する。

ナノエマルジョンを製造するためのこのような方法は以下の継続的ステップを含む：
ｉ－ 本発明による生体適合性油性磁性流体、または本発明による生体適合性油性磁性流体を製造するための方法に従い得られる生体適合性油性磁性流体を含む親油相を準備するステップ、
ｉｉ－ 水相を準備するステップ、
ｉｉｉ－ 親油相と水相を混合して、ナノエマルジョンを形成するステップ。

特に、好ましくは、ステップｉｉｉの混合は、本発明による油性磁性流体がコロイド状分散液の形態で存在する温度で行われる。本発明による生体適合性油性磁性流体を含む親油相はまた、水相と混合する前にこのような温度で加熱することもできる。

本発明によるナノエマルジョンを製造するための方法は、ステップｉの後およびステップｉｉｉの前に、生体適合性油性磁性流体を、油、親油性蛍光体、標的化リガンド、親油性界面活性剤、ファーマコフォア、例えば上記に記載されているものなどから選択される１種または複数種の化合物と接触させて、ナノエマルジョンの親油相を得る任意選択のステップｉ２を含むことができる。この任意選択のステップは、当業者に公知の任意の技術に従い、周辺温度および圧力で混合することにより実施することができる。

ステップｉｉでは、水相は、これらが存在する場合、例えば、上記に記載されている１種または複数種の界面活性剤を含むことができる。

ステップｉｉｉでは、水相と親油相の混合を慣例的に、当業者に公知の任意の技術を使用して高速で行う。例えば、任意選択で、特に６０～７０℃の範囲の温度に事前に加熱した親油相および水相は、最初に高速で混合して粗いエマルジョンを形成し、次いでソニケーターを使用して、または高圧均質化によりホモジナイズする。

水相、親油相および任意選択で存在する界面活性剤は、本発明によるナノエマルジョンに関して記載されているものなどである。

本発明によるナノエマルジョンの使用

本発明はまた、本発明によるナノエマルジョンまたは本発明の方法に従い得られるナノエマルジョンの使用に関する。

本発明によるナノエマルジョンは、医薬として、特に磁気誘導性温熱療法によるがんの治療における医薬として使用することができる。このため、ナノエマルジョンの全身投与を実施し、これに続いて外部交番磁場の適用を実施する。この場合、腫瘍内の生成物の蓄積が最大に到達した瞬間に磁場が適用される。注入と交番磁場の適用との間のこの待ち時間は光学的画像化（ファイバーであってもなくても）により、ＭＲＩにより、または超音波（パーフルオロカーボンに基づく製剤に対する）により予測される。腫瘍内投与の場合、磁場は注入の後適用することができる。ナノエマルジョンに対する磁性誘導の特徴（磁場／周波数ペアの値および適用の期間）は所望の熱量に従い調整することができる。磁性油滴の加熱は治療剤の放出を伴うことができ、あるいは熱活性化可能な治療剤の活性化のため、または熱感受性プロモーターの転写制御下で遺伝子の発現を誘導するため、または化学療法および／もしくは放射線療法プロトコルの状況で独立して共投与される別の治療剤との相乗効果を発揮するために使用することができる。

第１の実施形態に従い、ナノエマルジョンは本治療における唯一の医薬として使用される。

第２の実施形態に従い、特にナノエマルジョンが化学療法医薬を含まない場合、ナノエマルジョンは、親油性性質の別の化学療法医薬、例えば、タキサン（パクリタキセルおよびドセタキセル）またはカルムスチンと組み合わせて使用される。熱感受性活性成分、例えば、Ｔｈｅｒｍｏｄｏｘ（登録商標）を含有する注入用製剤の同時注入もまた考慮することができる。

投与される油性磁性流体の体積および濃度ならびに注入の数および各注入間の時間は、規定通りに、特に治療される腫瘍（場所、体積）および患者（年齢、健康状態）に依存し、医師により決定される。

本発明によるナノエマルジョンはまた、医学画像、例えば、ＭＲＩ、超音波または近赤外線（ＮＩＲ）蛍光画像化、および内視鏡検査による局所的ファイバーアプローチのための造影剤生成物として使用することもできる。

蛍光画像化における使用の場合、患者に投与されるナノエマルジョンは好ましくは親油性蛍光体を含む。

本発明はまた、個体の全身または身体の一部に対する画像化法であって、前記全身または全身の一部の１つまたは複数の画像を医学画像技術により取得するステップを含み、前記全身または前記全身の一部が、エマルジョンを含む造影剤生成物を含む画像化法に関する。

キット
本発明はまた、本発明による油性磁性流体または本発明によるナノエマルジョンが中に配置される容器を含むキットに関する。キットはまた、本発明に従い記載されているような１種または複数種のリン脂質の分子で表面官能化された磁性ナノ粒子を、単独で１つの容器内に含み、任意選択でもう１つの別個の容器内に、油性磁性流体を構成することを意図した少なくとも１種の脂肪酸エステルを含有する油相を含むことができる。磁性流体またはナノエマルジョンは、その使用または投与直前にキットから再構成することができる。キットはまた、適用可能な磁場／周波数ペアおよび所与の濃度の磁性流体の１体積単位当たりに放散される対応する熱量に対する使用条件および条項を含むことができる。鉄濃度もまた指示目的のため承認されていることに注目されたい。

材料および方法：
Ａ）試験されたリン脂質：
下記の実施例において油性磁性流体を製造するのに使用されるリン脂質は、以下である：
－ 下記の化学式１：

の１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、
（ナトリウム塩形態の）下記の化学式２：

の１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスファチジン酸（ＤＯＰＡ）、
－ （ナトリウム塩形態の）下記の化学式３：

の１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスファチジン酸（ＤＳＰＡ）、および
－ （ナトリウム塩形態の）下記の化学式４：

の１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホ－Ｌ－セリン（ＤＯＰＳ）。

Ｂ）油相の組成：
実施例において使用される油相は、脂肪酸トリグリセリドまたは脂肪酸プロピレングリコールの混合物：それぞれＭｉｇｌｙｏｌ ８１２Ｎ（登録商標）およびＭｉｇｌｙｏｌ ８４０（登録商標）である。下記の表１は、これらの油を構成する脂肪酸トリグリセリドまたはプロピレングリコールを構成する脂肪酸を示す（パーセンテージは、油の全重量に対する質量パーセンテージである）。

Ｃ）鉄分決定：
鉄含有量は、酸化鉄のナノ粒子を塩酸（ＨＣｌ）の５Ｍ溶液に溶解させることによって、紫外可視分光法によって決定される。ナノ粒子が５Ｍ ＨＣｌに完全に溶解した後、３５０ｎｍでの吸光度を測定して、鉄濃度を決定する。鉄濃度は、式：Ａ^{３５０ｎｍ}＝ε．ｌ．［Ｆｅ］に従って決定される。モル吸光係数εは、２９６０Ｌ^－１．ｍｏｌ．ｃｍ^－１に等しい。

Ｄ）ナノ粒子のサイズ：
Ｄ１）動的光散乱（ＤＬＳ）による測定
ナノ粒子の流体力学的半径は、６５８ｎｍの波長を有し、１３５°の角度のレーザーを備えたＣｏｒｄｏｕａｎ Ｖａｓｃｏ装置を使用して、動的光散乱によって決定される；データは６０秒の期間にわたって取得される。

Ｄ２）エックス線回折（ＸＲＤ）による測定
結晶子のサイズは、下記のシェラーの数式１を使用することによって、ＸＲＤによって決定され、式中、Γは、結晶子の平均直径であり、λは、エックス線の波長（λ（Ｃｕ Ｋα）＝１．５４０６Å）であり、βは、最強ピークの半分の高さにおける幅であり、Θは、ブラッグ角である：

Ｄ３）透過電子顕微鏡法（ＴＥＭ）による測定
ナノ粒子の平均基本サイズは、１２０ｋＶで作動し、Ｕｌｔｒａ ｓｃａｎ ＵＳＣ１０００カメラ（２ｋ×２ｋ）を備えたＰｈｉｌｉｐｓ ＣＭ１２０顕微鏡を用いて得られた２００個のナノ粒子のサイズを画像処理ソフトウェア（ＩｍａｇｅＪ Ｒａｓｂａｎｄ，Ｗ．Ｓ．、ＩｍａｇｅＪ、米国国立衛生研究所、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、Ｍａｒｙｌａｎｄ、米国、ｈｔｔｐｓ：／／ｉｍａｇｅｊ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｉｊ／、１９９７～２０１９。）を使用して測定することによって、透過電子顕微鏡法によって決定される。

Ｅ）表面特徴付け：
Ｅ１）熱重量分析（ＴＧＡ）
減圧下７０℃で予め乾燥した約１０ｍｇのナノ粒子を白金るつぼに入れ、Ｓｅｔａｒａｍ製のＴａｇ２４００熱天秤を使用して分析を実施する。サンプルを空気下５℃／分の傾斜で６００℃に加熱する。

Ｅ２）拡散反射赤外分光法
拡散反射赤外分光法（ＤＲＩＦＴ）は、Ｂｒｕｋｅｒ ＩＦＳ Ｅｑｕｉｎｏｘ ５５分光計を用いて行われる。官能化ナノ粒子を洗浄ステップの後に７０℃でオーブン乾燥する。次いで、ナノ粒子を無水ＫＢｒ（３質量％）中で粉砕する。

Ｅ３）表面官能化密度ならびに理論上（名目とも呼ばれる）および実際の被覆率の決定
表面に噴霧されたリン脂質分子によって生み出される表面は、脂質鎖の体積と比較した極性ヘッドが占める体積に依存する。リン脂質の場合、２つの部分（極性および疎水性）のバルク体積は同等であり、その結果、脂質が円錐ではなく円筒となる。この特定の特徴により、それらが集合してミセルではなくベシクル膜となることが可能になる。リン脂質の面積バルク値は、一般に、それらが単独でまたは混合物で存在する環境、不飽和の数、固体表面（支持脂質膜）とのまたは液体媒体（ベシクル）中の相互作用および温度などの異なる物理化学的パラメーターによって、６０から６５Å^２の間である。－Ｏ（Ｏ）Ｐ（ＯＨ）Ｏ^－、Ｎａ^＋ホスファチジルヘッドを含むリン脂質分子（（ＤＯＰＡおよびＤＳＰＡの場合のように）の基準値は６２Å^２であり、脂質膜に含有される飽和単層内の分子密集に対応する。この分子表面密度値は、単一の単層を考慮することによって、脂質膜（リン脂質二重層）に見られるものである。明らかに、ＯＨ官能基が置換されている場合、わずかな差が存在する。例えば、ジオレオイルホスファチジルセリンについては、生み出された分子表面積は、およそ６５Å^２／分子であり、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミンについては、一般に、６０から６５Å^２の間で測定される。したがって、下記では６２Å^２で選択される。この６２Å^２の値は、本発明の状況で、想定されるリン脂質に関わらず、ナノ粒子の表面の被覆パーセンテージを計算するため、およびリン脂質分子の表面官能化密度を計算するために使用される。

リン脂質の「名目または理論上の被覆率」は、単層を形成するのに必要な量に対する関与する脂質の量によって表されるモルパーセンテージであり、ＴＥＭによって測定されたナノ粒子の平均サイズおよび使用されるリン脂質の極性ヘッドの基準表面から計算される。ナノ粒子が楕円体である場合、粒子によって生み出される平均表面を評価するために、ＴＥＭによって測定されたナノ粒子の平均サイズを直径とみなすことが考えられる。ナノフラワーについては、その表面粗さを考慮して、ゾル－ゲル経路（ストーバー合成経路）による異なる厚さのシリカの反復コーティングによって、その生み出された表面を推定した。このように、この方法は、同じ直径の滑らかな球の表面積よりも１５％大きい表面積を推定することを可能にした。

ＴＧＡ測定は、２００℃から６００℃の間で測定された全質量損失から、関与するナノ粒子によって生み出される表面に対する完全燃焼中に分解された有機残留物のモル質量から、表面単位当たりのナノ粒子上に実際に存在するリン脂質分子の量を決定することを可能にする。グラフト収率は、ナノ粒子の表面に化学吸着したリン脂質分子の量と、反応中に関与する名目量との比率を表す。

Ｆ）酸化鉄ナノ粒子の合成
Ｆ１）アルカリ共沈によるＦＦ１ナノ粒子の合成
１７０ｍＬの１．５Ｍ塩酸に溶解させた質量３１．４１ｇのＦｅＣｌ_２．４Ｈ_２Ｏ（０．１５８ｍｏｌ）を、３．５Ｌの水に溶解させた８５．４ｇのＦｅＣｌ_３．６Ｈ_２Ｏ（０．３１６ｍｏｌ）を含有するビーカーに注ぎ入れる（初期化学量論比Ｆｅ^２＋／Ｆｅ^３＋＝０．５）。高速機械的撹拌下、３００ｍＬのアンモニア溶液（２８～３０％ｍ／ｍ）を迅速に添加する。媒体を１５分間撹拌下に置く。マグネタイトナノ粒子凝結物を永久磁石を用いてデカンテーションし、次いで、上澄み液を除去する。水で洗浄する２回の継続的ステップの後、体積２００ｍＬの２Ｍ ＨＮＯ_３を添加することによってナノ粒子の表面を酸化し、次いで、１５分間撹拌下に置く。上澄み液をデカンテーションし、除去した後、６００ｍＬの０．３３Ｍ硝酸鉄溶液を添加することによってナノ粒子のコアを酸化して磁赤鉄鉱とする。反応媒体を３０分間沸騰させる。上澄み液をデカンテーションし、除去した後、２００ｍＬの２Ｍ硝酸を添加する。次いで、過剰の酸を除去するために、凝結物を磁気的にデカンテーションし、アセトンで３回洗浄する。最後に、凝結物を２００ｍＬの水中で解膠させる。過剰のアセトンの蒸発後、磁性流体を水で体積１Ｌにする。以後、磁赤鉄鉱ナノ粒子のこの分散液をＦＦ１と呼ぶ。合成の終わりに、磁性流体は、６９ｇ／Ｌの酸化鉄の質量濃度を有し、１１３１６ｍ^２／Ｌの単位体積当たりの表面積を生み出す。このようにして得られた楕円体ナノ粒子のＴＥＭによって決定された平均基本サイズは、７．５ｎｍ±２ｎｍであり、ＸＲＤによって測定された場合は６．９ｎｍである。測定された流体力学的半径は、Ｄ_Ｈ＝３８ｎｍである。

Ｆ２）ポリオールによるＦＦ２ナノ粒子の合成
質量１．０８２ｇのＦｅＣｌ_２．４Ｈ_２Ｏ（５．４４ｍｍｏｌ）および０．３９８ｇのＦｅＣｌ_３．６Ｈ_２Ｏ（１，４７ｍｍｏｌ）を、８０ｇのジエチレングリコール（ＤＥＧ）およびＮ－メチルジエタノールアミン（ＮＭＤＥＡ）（比１：１、ｖ／ｖ）の混合物に溶解させる。この溶液を、前駆体が完全に溶解するまで窒素流下で１時間撹拌しながら混合する。質量０．６４ｇのＮａＯＨ（１６ｍｍｏｌ）を、４０ｇのＮＭＤＥＡ／ＤＥＧ混合物（１：１、ｖ／ｖ）に窒素流下で溶解させる。前駆体を含有する溶液にＮａＯＨ溶液を添加し、混合物を２℃／分で４時間２２０℃に加熱する。得られたナノ粒子を磁気的に沈降させ、エタノール／酢酸エチル（１：１、ｖ／ｖ）混合物で３回洗浄して、有機および無機不純物を除去する。１０％硝酸による洗浄を実施する。８．２５ｇのＦｅ_３（ＮＯ_３）_３．９Ｈ_２Ｏ（２０．４ｍｍｏｌ）を２０ｍＬの水に可溶化し、溶液をナノ粒子に添加する。ナノ粒子分散液を８０℃で４５分間加熱して、磁赤鉄鉱を得る。上澄み液をデカンテーションし、除去した後、ナノ粒子を１０％硝酸で洗浄し、次いでアセトンで洗浄し、最後にジエチルエーテルで洗浄する。最後に、ナノ粒子を水中に再分散させる。以後、磁赤鉄鉱ナノ粒子のこの分散液をＦＦ２と呼ぶ。合成の終わりに、磁性流体は、２０ｇ／Ｌの酸化鉄の質量濃度を有し、１５７４ｍ^２／Ｌの表面を生み出す。このようにして得られたナノフラワー形態のナノ粒子の平均基本サイズは、ＴＥＭ法によって１５．４ｎｍ±３ｎｍ、ＸＲＤによって１６ｎｍで測定される。測定された流体力学的半径は、Ｄ_Ｈ＝２６ｎｍである。

ポリオールによるＦＦ３ナノ粒子の合成
ＦＦ３ナノ粒子は、今回は断熱反応条件下で２℃／分で４時間２２０℃への温度上昇が行われることを除いて、ＦＦ２ナノ粒子を得るために記載されたものと同じ操作条件下で合成される。これを行うため、熱の損失を制限し、それにより、温度傾斜のより良好な速度論的制御を可能にするために、グラスウールを開放空気中のマントル・ヒーター上の反応器の壁面と接触してフラスコの周りに置いた。ＴＥＭ法によって得られたナノフラワー形態のナノ粒子の平均基本サイズは、１８．５ｎｍ±３．１ｎｍである。

Ｇ）油性分散液中のコロイド安定性
分散液中のコロイド安定性は、第１近似では、目視で、次いで温度調節装置を備えたＶＡＲＩＡＮ Ｃａｒｙ ５００分光光度計を用いて８００ｎｍでの透過率を測定することによって、温度の関数として観察される。ナノ粒子分散液の品質は、ＤＬＳ（方法Ｄ１）によっても検査される。実施例の表に「＋」が表示されている場合、これは、ナノ粒子を対応する温度で油相中に分散させることによってコロイド特性が得られること、およびこのコロイド特性が、得られた少なくとも２４時間後、すなわち、少なくとも分散液の製造から透過率の測定までの間に経過する時間の後に依然として存在することを意味する。

実施例１：クロロホルム中のＦＦ１、ＦＦ２およびＦＦ３ナノ粒子の分散液
この実施例の目的は、化学吸着によるリン脂質グラフトを実施することができるように、界面活性剤に頼ることなく水性磁性流体ＦＦ１、ＦＦ２およびＦＦ３のナノ粒子をクロロホルム中に移行させることである。そのようにするため、体積１ｍＬのアンモニア溶液（２８～３０％、ｍ／ｍ）を、γ－Ｆｅ_２Ｏ_３ ６９ｇ／Ｌの３５．４ｍＬのＦＦ１に添加する。ナノ粒子凝結物を永久磁石を用いてデカンテーションし、次いで、上澄み液を除去する。凝集したナノ粒子を水で２回洗浄する。次いで、凝集したナノ粒子をエタノールで５回洗浄する。最後に、体積８０ｍＬのクロロホルムをナノ粒子に添加し、ナノ粒子を３分間超音波浴中で再分散させる。最終濃度は、クロロホルム中γ－Ｆｅ_２Ｏ_３ ３０．５ｇ／Ｌである。プロトコルは、磁性流体ＦＦ２およびＦＦ３についても同一である。

実施例２：酸の存在下、立体障害のない（ｕｎｈｉｎｄｅｒｅｄ）極性ヘッドを示すリン脂質分子による磁性ナノ粒子の官能化から得られる生体適合性油性磁性流体の製造。
実施例２．１．：一価不飽和リン脂質分子で官能化されたナノ粒子の分散液
実施例２．１．１：ＤＯＰＡによって官能化された磁性流体ＦＦ１の磁性ナノ粒子のＭｉｇｌｙｏｌ Ｍ８４０（登録商標）中の分散液
この実施例では、Ｍｉｇｌｙｏｌ Ｍ８４０（登録商標）中のＤＯＰＡによって官能化されたＦＦ１の磁性ナノ粒子の分散液を製造する。リン脂質分子の基準面積バルクは６２Å^２であり、脂質膜に含有される飽和単層内の分子密集に対応する。ＤＯＰＡ単層を形成するのに必要な量と比較して５５％（すなわち、０．８９分子／ｎｍ^２）の名目被覆率（単層を形成するのに必要な量と比較した関与する脂質の量に対応する）を有するナノ粒子についての官能化プロトコルは、以下の通りである：実施例１において製造されたクロロホルム中に分散させた体積１６．４ｍＬの磁性ナノ粒子（［γ－Ｆｅ_２Ｏ_３］＝３０．５ｇ／Ｌ、生み出された表面＝８２ｍ^２）を、体積４７．７ｍＬの酢酸－クロロホルム溶液（１：９、ｖ／ｖ）中で希釈する。この分散液に、体積３．５１ｍＬのＤＯＰＡ（クロロホルム中２５ｍｇ／ｍＬ、４５．２ｍ^２）をボルテックス下で添加する。４℃で１４時間の反応後、ナノ粒子が凝結するまでエタノールを媒体中に添加し、全体を磁気的にデカンテーションする。磁気凝結物を１００ｍＬのクロロホルム／エタノール混合物（１：３、ｖ／ｖ）で３回洗浄し、次いで１００ｍＬのエタノールで２回洗浄する。最後の洗浄の終わりに、ナノ粒子を窒素流下で乾燥し、体積１５ｍＬのＭｉｇｌｙｏｌ Ｍ８４０（登録商標）をナノ粒子に添加する。ナノ粒子は、水浴中で加熱した後、３５℃から油中に分散する。

同様に、単層に対して２０％から１５０％の間で設定された名目ＤＯＰＡ被覆率の範囲は、０．３３ＤＯＰＡ／ｎｍ^２から２．４２ＤＯＰＡ／ｎｍ^２の間に含まれる理論上のグラフト密度に対応し、一定のＤＯＰＡ濃度（１．２５ｍｇ／ｍＬ）で作業することによって達成することができる。ある特定の名目密度変数については、ナノ粒子は、周囲温度（２０℃）で自発的に分散する。

名目ＤＯＰＡ被覆率は、下記の数式２に従って計算される。

［式中、Ｎ^ＰＬは、リン脂質分子の数であり、Ｎ^ＮＰは、ナノ粒子の数であり、Ｒは、ｎｍ単位のナノ粒子半径である。］

Ｍｉｇｌｙｏｌ Ｍ８４０（登録商標）中のＤＯＰＡによって官能化されたＦＦ１に由来するナノ粒子分散液の安定性を、下記の表３にまとめる通り、異なる温度および異なる被覆率で評価した。分散液の品質を指定する基準は、以下である：－＝非分散性（混濁媒体）、＋＝経時的に安定なコロイド状ゾル（澄明な分散液）。これらのスクリーニング基準は、好都合には、目視観察によって評価することができ、８００ｎｍでの透過率測定と良好に一致する。ＴＧＡ測定は、表面単位当たりの実際のＤＯＰＡ量およびグラフト収率を決定することを可能にした。名目および実際のＤＯＰＡ表面密度ならびに２０℃および３７℃でのＭ８４０（登録商標）中のナノ粒子のコロイド安定性を下記の表２にまとめる。

ナノ粒子へのＤＯＰＡの化学吸着は、Ｐ－ＯＨおよびＰ－Ｏ結合の振動にそれぞれ対応する１０７０ｃｍ^－１および１１７０ｃｍ^－１および１２００ｃｍ^－１の間のバンドの存在により、ＤＲＩＦＴによって確認される（図２）。ＴＧＡ分析もまた、ナノ粒子へのＤＯＰＡの化学吸着を確認する。ＴＧＡ分析は、全範囲にわたって４９％から９７．５％の間、コロイド安定性ドメインにわたって５１％から８０％の実際のグラフト収率を決定することを可能にする（図３）。これらの収率は、リン脂質分子の使用を最小限に抑えることを可能にすることから有利である。

実施例２．１．２：ＤＯＰＡによって官能化された磁性流体ＦＦ１の磁性ナノ粒子のＭｉｇｌｙｏｌ ８１２Ｎ（登録商標）中の分散液
使用されるプロトコルは、修飾されたナノ粒子をＭｉｇｌｙｏｌ ８１２Ｎ（登録商標）中に再分散させることを除いて、実施例２．１．１に記載されたものと同じである。範囲は、同じ条件、すなわち、一定のＤＯＰＡ濃度（１．２５ｍｇ／ｍＬ）下で作成される。

Ｍｉｇｌｙｏｌ ８１２Ｎ（登録商標）中のＤＯＰＡによって官能化されたＦＦ１に由来するナノ粒子分散液の安定性を、下記の表３にまとめる通り、異なる温度および異なる名目被覆率で評価した。分散液の品質を指定する基準は、以下である：－＝非分散性（混濁媒体）、＋＝経時的に安定なコロイド状ゾル（澄明な分散液）。

実施例２．１．３：ＤＯＰＡによって官能化された磁性流体ＦＦ２の磁性ナノ粒子のＭｉｇｌｙｏｌ Ｍ８４０（登録商標）中の分散液
ＤＯＰＡ化学吸着プロトコルは、磁性流体ＦＦ２のナノ粒子を使用することを除いて、実施例２．１．１に記載されたものと同一である。

Ｍｉｇｌｙｏｌ Ｍ８４０Ｎ（登録商標）中のＤＯＰＡによって官能化されたＦＦ２に由来するナノ粒子分散液の安定性を、下記の表４にまとめる通り、異なる温度および異なる名目被覆率で評価した。分散液の品質を指定する基準は、以下である：－＝非分散性（混濁媒体）、＋＝経時的に安定なコロイド状ゾル（澄明な分散液）。磁性流体ＦＦ２のナノ粒子の流体力学的直径（Ｄ_Ｈ）値を、外部交番磁場（７５５ｋＨｚ、１０．２ｋＡ．ｍ^－１）の適用による誘導下６０℃で、異なるＤＯＰＡグラフト率について、外部のＤＬＳ（ＶＡＳＣＯ－ＦＬＥＸ、Ｃｏｒｄｏｕａｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）によって測定した。

実施例２．１．４：ＤＯＰＡによって官能化された磁性流体ＦＦ３の磁性ナノ粒子のＭｉｇｌｙｏｌ Ｍ８４０（登録商標）中の分散液
磁性ナノ粒子をＭｉｇｌｙｏｌ Ｍ８４０（登録商標）中に分散させるためのＤＯＰＡ化学吸着プロトコルは、１．１０分子／ｎｍ^２の名目被覆率を適用することによって磁性流体ＦＦ３のナノ粒子を使用することを除いて、実施例２．１．１に記載されたものと同一である。ＳＡＲ（比吸収率）測定およびマウスが担持する腫瘍に対するｉｎ ｖｉｖｏ温熱切除実験（実施例６）のために、５ｇ／Ｌおよび３００ｇ／Ｌに等しい質量濃度の２つの分散液を製造する。

実施例２．２：置換された極性ヘッドを有するリン脂質分子で官能化されたナノ粒子の分散液の製造：ＤＯＰＥによって官能化された磁性流体ＦＦ１の磁性ナノ粒子のＭｉｇｌｙｏｌ Ｍ８４０（登録商標）中の分散液
使用されるプロトコルは、用いるリン脂質の性質を除いて、実施例２．１．１に記載されたものと同じである。範囲は、同じ条件、すなわち、一定のＤＯＰＥ濃度（１．２５ｍｇ／ｍＬ）下で作成される。

Ｍｉｇｌｙｏｌ Ｍ８４０（登録商標）中のＤＯＰＥによって官能化されたＦＦ１に由来するナノ粒子分散液の安定性を評価した。結果を下記の表５にまとめる。これらの結果は、温度および被覆率の関数として示される。分散液の品質を指定する基準は、以下である：－＝非分散性（混濁媒体）、＋＝経時的に安定なコロイド状ゾル（澄明な分散液）。

５２％の被覆率で、官能化ナノ粒子は、３５℃から分散性である。７０℃で、安定性範囲は、４８から６１％の間の名目被覆率に拡大される。極性ヘッド上の置換基の存在は、ＤＯＰＡの化学吸着速度に対する化学吸着速度に影響を及ぼし、表面組成および温度のコロイド安定性範囲を減少させる。

実施例２．３．：置換されていない極性ヘッドを有する飽和リン脂質分子で官能化されたナノ粒子の分散液の製造：ＤＳＰＡによって官能化された磁性流体ＦＦ１の磁性ナノ粒子のＭｉｇｌｙｏｌ Ｍ８４０（登録商標）中の分散液
使用されるプロトコルは、用いるリン脂質の性質を除いて、実施例２．１．１に記載されたものと同じである。範囲は、同じ条件、すなわち、一定のＤＳＰＡ濃度（１．２５ｍｇ／ｍＬ）下で作成される。

Ｍｉｇｌｙｏｌ Ｍ８４０Ｎ（登録商標）中のＤＳＰＡによって官能化されたＦＦ１に由来するナノ粒子の安定性を、下記の表６にまとめる通り、異なる温度および異なる被覆率で評価した。分散液の品質を指定する基準は、以下である：－＝非分散性（混濁媒体）、＋＝経時的に安定なコロイド状ゾル（澄明な分散液）。

磁性ナノ粒子の分散温度、すなわち、それを上回ると磁性ナノ粒子の分散液が澄明となる温度は、使用されるＤＳＰＡの量に依存する。上記で詳述したプロトコルに従って、温度ごとの８００ｎｍでの透過測定によって、磁性ナノ粒子の分散温度を決定した。

ＤＳＰＡによって官能化されたナノ粒子ＦＦ１は、生体適合性油中に周囲温度を上回る温度で、２４％の名目被覆率では３５℃から分散性である。Ｍｉｇｌｙｏｌ Ｍ８４０（登録商標）中の分散液の温度は、リン脂質分子の被覆率と共に上昇する。

実施例３：酸の非存在下、リン脂質分子による磁性ナノ粒子の官能化から得られる生体適合性油性磁性流体の製造
実施例３．１．：置換されたホスフェートヘッドを有するリン脂質分子を使用するナノ粒子の表面官能化による生体適合性油性磁性流体の製造：Ｍｉｇｌｙｏｌ Ｍ８４０（登録商標）中のＤＯＰＳで修飾されたＦＦ１に由来する磁性ナノ粒子の場合
置換されたリン脂質のある特定の極性ヘッドがもたらす立体障害は、酸化鉄表面における化学吸着の速度を減速させる効果を有する。しかし、これらの速度は、リン脂質濃度の上昇に作用することによって、すなわち、前記リン脂質分子をリン脂質分子の単層に対して過剰で導入することによって加速させることができる。この場合、反応は、ナノ粒子によってグラフトされるリン脂質分子の数を制御するための主要なパラメーターとなる。

体積１４．２ｍＬのＤＯＰＳ（クロロホルム中２５ｍｇ／ｍＬ）を、クロロホルム中に分散させた１．６４ｍＬの磁性ナノ粒子ＦＦ１（［Ｆｅ_２Ｏ_３］＝３０．５ｇ／Ｌ）にボルテックス下で添加する。化学吸着反応を、異なる反応時間で、反応を阻害するためにエタノールを添加することによって停止させ、ナノ粒子の凝結および過剰のリン脂質分子の沈殿を誘導する。次いで、懸濁液を磁石によってデカンテーションする。凝結物を５０ｍＬのエタノールで３回洗浄する。最後の洗浄中に、ナノ粒子を窒素流下で乾燥し、体積１５ｍＬのＭｉｇｌｙｏｌ Ｍ８４０（登録商標）をナノ粒子に添加する。ナノ粒子は、油中に自発的に分散する。

Ｍｉｇｌｙｏｌ Ｍ８４０Ｎ（登録商標）中のＤＯＰＳによって官能化されたＦＦ１に由来するナノ粒子分散液の安定性を、下記の表７にまとめる通り、異なる名目被覆率につながる異なる反応時間の後に評価した。分散液の品質を指定する基準は、以下である：－＝非分散性（混濁媒体）、＋＝経時的に安定なコロイド状ゾル（澄明な分散液）。

ＴＧＡは、ＤＯＰＳ化学吸着速度を経時的に追跡することを可能にする。表８および図４は、７分の反応、洗浄および乾燥の後、または３０分の反応、洗浄および乾燥の後の２０００％過剰のＤＯＰＳで官能化されたナノ粒子の実際のグラフト密度の変動を示す。図４は、このようにして得られた７分および３０分の反応時の２０％過剰のＤＯＰＳで官能化されたナノ粒子のサーモグラムを示す。

実施例３．２．：置換されていないホスフェートヘッドを有するリン脂質分子を使用するナノ粒子の表面官能化による生体適合性油性磁性流体の製造：Ｍｉｇｌｙｏｌ Ｍ８４０（登録商標）中のＤＯＰＡで修飾されたＦＦ１に由来する磁性ナノ粒子の場合
リン脂質欠乏が５０％（すなわち、_{ＤＯＰＡ／ｎｍ２}＝０．８１ＤＯＰＡ．ｎｍ^－２）であるナノ粒子を製造するためのプロトコルは、以下の通りである：クロロホルム中に分散させた体積１６．４ｍＬの磁性ナノ粒子ＦＦ１（［γ－Ｆｅ_２Ｏ_３］＝３０．５ｇ／Ｌ）を、４４ｍＬのクロロホルム中で希釈する。この分散液に、体積３．１８ｍＬのＤＯＰＡ（クロロホルム中２５ｍｇ／ｍＬ）をボルテックス下で添加する。４℃で１４時間の反応後、ナノ粒子が凝結するまでエタノールを添加し、全体を磁気的にデカンテーションする。凝結物をクロロホルム／エタノール混合物（１：３、ｖ／ｖ）で洗浄し、次いでエタノールで洗浄する。最後の洗浄中に、ナノ粒子を窒素流下で乾燥し、体積１５ｍＬのＭｉｇｌｙｏｌ Ｍ８４０（登録商標）をナノ粒子に添加する。ナノ粒子は、油中に自発的に分散する。

同様に、脂質膜の単層内の分子密集に対して５％から９６％欠乏の間にある名目ＤＯＰＡ被覆率の範囲は、０．０８ＤＯＰＡ／ｎｍ^２から１．５５ＤＯＰＡ／ｎｍ^２の間に含まれる被覆密度に対応し、一定のＤＯＰＡ濃度（１．２５ｍｇ／ｍＬ）で作業することによって達成することができる。

反応中に酸を添加していないＭｉｇｌｙｏｌ Ｍ８４０Ｎ（登録商標）中のＤＯＰＡによって官能化されたＦＦ１に由来するナノ粒子の安定性を、下記の表９にまとめる通り、異なる温度および異なる名目被覆率で評価した。分散液の品質を指定する基準は、以下である：－＝非分散性（混濁媒体）、＋＝経時的に安定なコロイド状ゾル（澄明な分散液）。

実施例４：ＦＦ１、ＦＦ２およびＦＦ３に由来する油性および水性磁性流体の比較。
生体適合性油相中または水性媒体中の５ｇ／ｋｇ溶媒の酸化鉄質量濃度を有するナノ粒子の分散液を製造して、その磁気誘導下の加熱を測定し、比較する。サンプルの温度を光ファイバー（ＯＴＧ－Ｍ４２０、Ｏｐｓｅｎ（商標））によって測定し、サンプルの温度を３７℃に設定する。

異なる磁場／周波数ペアを利用するために、２つの異なる装置によって交番磁場を発生させる。第１の装置は、ｎＢ ｎａｎｏＳｃａｌｅ Ｂｉｏｍａｇｎｅｔｉｃｓ製のＤＭ３であり、以下の条件：４７３．５ｋＨｚおよび１３．３６ｋＡ．ｍ^－１、３４４．５ｋＨｚおよび１６．２３ｋＡ．ｍ^－１、２１７ｋＨｚおよび２０．０９ｋＡ．ｍ^－１、ならびに１４６ｋＨｚ、２１．９６ｋＡ．ｍ^－１を提供する。

第２の装置は、Ｍｉｎｉｍａｘ Ｊｕｎｉｏ（商標）１ＴＳ ３．５ｋＷ発生装置によって供給される誘導コイルからなり、追加の条件：７５５ｋＨｚ、１０．２ｋＡ．ｍ^－１の利用を可能にする。

磁気誘導下の加熱率を測定することにより、比吸着率（ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｄｓｏｒｐｔｉｏｎ ｒａｔｅ）（ＳＡＲ）と呼ばれる磁性液体の質量単位当たりのナノ粒子の熱力を決定することが可能になる。ＳＡＲは、下記の数式３に従って決定される：

［式中、Ｃ_Ｐは、Ｊ．（ｇ．Ｋ）^－１単位の分散媒の熱容量を表し（Ｃ_水＝４，１８Ｊ．ｇ^－１．Ｋ^－１およびＣ_油≒２Ｊ．ｇ^－１．Ｋ^－１）、ｍ_Ｓは、溶媒質量であり、ｍ_ＮＰは、ナノ粒子質量であり、ΔＴ／Δｔは、時間の関数としての温度発展曲線の接線の始点（３７℃）における傾きを表す。］

磁気誘導下の、それぞれ０．８１、１．２９および１．１０分子／ｎｍ^２の理論上の被覆密度でＤＯＰＡによって官能化され、Ｍｉｇｌｙｏｌ Ｍ８４０（登録商標）中に分散させたＦＦ１、ＦＦ２およびＦＦ３にそれぞれ由来する実施例２．１．１、２．１．３および２．１．４において得られたナノ粒子を用いて得られたプロファイルと比較した、５ｇ／Ｌに等しい酸化鉄質量濃度の磁性水性分散液ＦＦ１、ＦＦ２およびＦＦ３の温度プロファイルを、それぞれ２つの磁場／周波数ペア（（図５Ａ）７５５ｋＨｚ、１０．２ｋＡ／ｍ、（図５Ｂ）４７３．５ｋＨｚ、１３．３６ｋＡ／ｍ、（図５Ｃ）４７３．５ｋＨｚ、１３．３６ｋＡ／ｍ）について、図５Ａ、５Ｂおよび５Ｃに示す。

１０秒で、水性磁性流体ＦＦ１の温度は０．１２℃上昇する一方、Ｍｉｇｌｙｏｌ Ｍ８４０（登録商標）中に分散させたＤＯＰＡによって官能化されたＦＦ１に由来するナノ粒子については、上昇は０．５℃であり、４倍超の温度増加に相当する。１００秒の誘導期間にわたって、この同じ増加が測定され、すなわち、油相中では４．８℃超の温度上昇、水相中ではわずか１．２℃である。ＦＦ２に関しては、１０秒で、水性分散液ＦＦ２の温度は０．８℃上昇する一方、ＤＯＰＡによって官能化され、Ｍｉｇｌｙｏｌ Ｍ８４０（登録商標）中に分散させたＦＦ２分散液については、温度上昇は５．８倍高く、すなわち、５．２℃である。油中のＦＦ３分散液についてはさらに高い上昇が観察される：１０秒で、水性磁性流体については３℃の温度上昇が測定される一方、油性磁性流体については温度上昇は１２倍大きく、すなわち、３６℃である。したがって、ＦＦ３の油性分散液は、非常に急速な温度上昇を有し、ＦＦ３の水性分散液に対して明確に優れた加熱特性を有する。

３種類のナノ粒子ＦＦ１、ＦＦ２およびＦＦ３について両方の媒体（水性および油性）中で測定されたＳＡＲ値を下記の表１０にリスト化する：

７５５ｋＨｚ、１０．２ｋＡ／ｍでの誘導下のＦＦ１分散液についての３７℃でのＳＡＲ値は、水性媒体と油性媒体との間で倍増する。４７３．５ｋＨｚ、１３．３６ｋＡ／ｍでの誘導に供した分散液ＦＦ２およびＦＦ３から得られるナノフラワー形態を有する２種類の磁性ナノ粒子についての３７℃でのＳＡＲ値は、水性媒体と油性媒体との間でそれぞれ２．６および８．８倍に増大する。

数回の磁気誘導サイクルに供したこれらの油性磁性流体の安定性もまた評価した。

ＦＦ２の油性および水性分散液を、２つの異なる磁場／周波数ペア（３４４．５ｋＨｚ、１６．２３ｋＡ．ｍ^－１で２サイクル、続いて４７３．５ｋＨｚ、１３．３６ｋＡ．ｍ^－１で２サイクル）について、磁気誘導下の４回の継続的加熱／冷却サイクル（ΔＴ＞１０Ｋ、すなわち、３７℃から４７℃超まで）に供した。

ＦＦ３の油性および水性分散液を、４７３．５ｋＨｚ、１３．３６ｋＡ．ｍ^－１の磁場／周波数ペアの２回の磁気誘導サイクルについて、２回の継続的加熱／冷却サイクル（ΔＴ＞４０Ｋ、すなわち、３７℃から７７℃超まで）に供した。

図６Ａ、６Ｂおよび６Ｃは、それぞれ、交番磁場の適用中の、水中に分散させたナノ粒子ＦＦ２およびＦＦ３（５ｇ／ｋｇ）ならびにＭｉｇｌｙｏｌ Ｍ８４０中のＤＯＰＡによって官能化された同じナノ粒子（それぞれ１．２９および１．１０分子／ｎｍ^２の理論上の被覆密度について、酸性条件、実施例２．１．３および２．１．４）（５ｇ／ｋｇ）の分散液の温度プロファイルを示す。図６Ａでは、２サイクルの４７３．５ｋＨｚ、１３．３６ｋＡ．ｍ^－１での誘導下の加熱および冷却（Ｔ_０＝３７℃）を実施する。図６Ｂでは、２サイクルの３４４．５ｋＨｚ、１６．２３ｋＡ．ｍ^－１での誘導下の加熱および冷却（Ｔ_０＝３７℃）を実施する。図６Ｃでは、２サイクルの４７３．５ｋＨｚ、１３．３６ｋＡ．ｍ^－１での誘導下の加熱および冷却（Ｔ_０＝３７℃）を実施する。

これらの水性および油性分散液について測定されたＳＡＲ値を下記の表１１に詳述する。

ＦＦ２分散液に由来する磁性ナノ粒子の３７℃でのＳＡＲ値は、磁場／周波数条件３４４ｋＨｚ、１６．２３ｋＡ．ｍ^－１および４７３．５ｋＨｚ、１３．３６ｋＡ．ｍ^－１の両方について、水性媒体と油性媒体との間でそれぞれ３倍に増大する。１０秒の誘導時間の間に、水性分散液ＦＦ２の温度は約１℃上昇する一方、ＤＯＰＡで官能化され、Ｍｉｇｌｙｏｌ Ｍ８４０（登録商標）中に分散させたＦＦ２に由来する同じナノ粒子については、温度の上昇は約６から７倍高い。

ＦＦ３分散液に由来する磁性ナノ粒子の３７℃でのＳＡＲ値は、磁場／周波数条件４７３．５ｋＨｚ、１３．３６ｋＡ．ｍ^－１について、水性媒体と油性媒体との間で８．３から９．４倍に増大する。１０秒の誘導時間の間に、水性分散液ＦＦ３の温度は約３．５℃上昇する一方、ＤＯＰＡで官能化され、Ｍｉｇｌｙｏｌ Ｍ８４０（登録商標）中に分散させたＦＦ３に由来する同じナノ粒子については、温度の上昇は約１１から１２倍高い。したがって、油性磁性流体は、潜在的に、誘導下の治療時間を劇的に減少させることを可能にし得る。

誘導による数回の加熱サイクルの実施は、分散液がナノ粒子および油相の特性の変化なしにナノ粒子の局所温度上昇に耐えることを実証する。ナノ粒子の表面上でリン脂質分子の分解は起こらない。この特性は、磁気誘導性温熱療法治療シーケンスを増大させる必要性を満たすという観点から興味深いものになり得る。

図７Ａ、７Ｂおよび７Ｃに示す温度プロファイルから、ＳＡＲ値を、水中および油（Ｍｉｇｌｙｏｌ Ｍ８４０（登録商標））中で、ナノ粒子ＦＦ３（５ｇ／Ｋｇ）の分散液体積を５００μＬから１μＬまで変動させることによっても測定した。

分散液の発熱力および温度プラトー値は、表面積対体積比の増加と共に次第に優勢となる熱損失に起因して、分散液の体積と共に低下する。油性分散液については、熱損失は、その弱い熱伝導率および蒸発などの吸熱現象の非存在に起因して、水性磁性流体に対してはるかに低い。体積２００および５００μＬについては、加熱力は依然として同程度に高く、水性分散液の加熱力よりも９倍大きく、これらの測定条件について温度プラトーを観察することはできない。体積５０および１０μＬについては、その依然として非常に高いＳＡＲ値に起因して、それぞれ８５℃および７５℃の温度閾値にかなり迅速に（２～３分）到達する。プラトー値、特にＳＡＲ値は、ＦＦ３の水性分散液の値よりも約５から１０倍とはるかに高いままである。このように、Ｍｉｇｌｙｏｌ Ｍ８４０（登録商標）中ＦＦ３分散液は、１０μＬまでの小さい体積についてさえ、非常に高いＳＡＲ値を示す。

体積１μＬについてのＳＡＲ値は、センサーの先端に磁性流体を直接付着させることによって測定される。この場合、初期温度は室温である（Ｔ０＝２５℃）。６５Ｗ／ｇのＳＡＲが、Ｍｉｇｌｙｏｌ Ｍ８４０（登録商標）中のＦＦ３の分散液についてのみ測定可能である。７℃の媒体温度の低下によって明らかになる水の蒸発が非常に急速であるため、この体積について水性分散液ＦＦ３のＳＡＲを測定することはできない。

図８は、実施例６に示す磁気温熱療法による腫瘍の温熱切除の動物実験に使用されるＭｉｇｌｙｏｌ Ｍ８４０（登録商標）中に分散させた体積１μＬの分散液ＦＦ３についての速度論的温度プロファイルを示す。酸化鉄Ｆｅ_２Ｏ_３の質量濃度が３００ｇ／Ｌ（Ｔ０＝２５℃、周囲室温）である分散液は、２０秒で７５℃の温度上昇を示す速度論的加熱プロファイルを有し、ＳＡＲ値は５３Ｗ／ｇとなる。３００ｇ／Ｌに濃縮されたこの分散液は、μＬオーダーの非常に小さい体積についてさえ、非常に急速な局所温度上昇を可能にし、このことは、低体積腫瘍の温熱切除の状況での治療の精度の改善に寄与し得る。

実施例５：油性磁性流体からのナノエマルジョンの製造
項目２．１．１で１．１２分子／ｎｍ^２の被覆密度について得られたＤＯＰＡによって官能化された磁性ナノ粒子ＦＦ１を、Ｍｉｇｌｙｏｌ ８４０で構成される油相中に分散させる。分散した酸化鉄ナノ粒子を含有する油相は、単独で直接使用され、それにより、ナノエマルジョンの油相の１００％を構成するか、またはＭｉｇｌｙｏｌ ８４０中で事前に希釈して、ナノエマルジョンの親油相の全質量の１／３または２／３を構成することができる。

ナノエマルジョンは、任意選択で、均質な混合物を得るために親油相（Ｍｉｇｌｙｏｌ ８４０）を油性磁性流体と混合し、この中に、卵レシチンＥ８０を高温（７０℃）時に分散させることによって製造される。同じ温度に予め加熱した水相を補助界面活性剤（ポリソルベート８０）と混合する。エマルジョンおよび均質化は、ソニケーターを１０分間使用して、転相によって単一のステップで得られる。ナノエマルジョンを得た後、これは、温度を特に２０℃の温度に下げた後に安定なままである。

ナノエマルジョン１から５の組成の例を下記の表１２から１６に詳述し、表中、パーセンテージは、ナノエマルジョンの全重量に対する質量パーセンテージである。

サンプルを脱イオン水中で１／１０００に希釈することによって、ゼータ電位（ＰＺ）測定を実施する。ＺＰ値は、Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ ＺＳ機器（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ ＳＡ、Ｗｏｒｃｅｓｔｅｒｓｈｉｒｅ、英国）を使用して、電気泳動およびレーザー・ドップラーによる検出によって決定される。例の粒径特徴（平均流体力学的直径、多分散指数（ＰＤＩ）およびゼータ電位（ＰＺ）を以下の表１７に示す：

４７３．５ＫＨｚ、１３．３６ｋＡ／ｍでの誘導下の磁性流体ＦＦ１の同じ酸化鉄濃度（ＣＦｅ_２Ｏ_３＝１２ｇ／Ｌ、Ｔ_０＝３７℃）を示すナノエマルジョン１および４の発熱力を図９と比較する。

等しい磁性流体濃度であるがより大きい油相パーセンテージで、加熱が改善される（エマルジョン１および４の比較）。

実施例６：磁気温熱療法による皮下腫瘍の温熱切除
マウスにおける腫瘍の磁気温熱療法による温熱切除のための、Ｍｉｇｌｙｏｌ Ｍ８４０（登録商標）中のＤＯＰＡによって官能化された磁性ナノ粒子ＦＦ３から構成される実施例２．１．４による油性磁性流体の有効性を評価した。

腫瘍媒体中の生成物の分布を追跡するために、近赤外で発光する親油性蛍光体：１，１’－ジオクタデシル－３，３，３’，３’－テトラメチルインドトリカルボシアニンヨージド（ＤｉＲ）を油性磁性流体に予め組み込んだ。この蛍光体の最大発光は、７８０ｎｍにある。

試験されたマウスは、足に皮下移植された腫瘍ＲＭ１－ＣＭＶ－ＬｕｃＦを有するＢ６アルビノマウス（Ｂ６Ｎ－Ｔｙｒｃ－Ｂｒｄ／ＢｒｄＣｒＣｒｌ）である。腫瘍体積を、デジタルキャリパーで測定されたｌおよびｗ寸法から推定し、フェルドマンの式：体積＝π／６×ｆ×（ｌ×ｗ）^３／２（雌のマウスについてはｆ＝１．５８）から計算した。それにより、試料によっておよそ１７０±２０ｍｍ^３の異なる体積が推定された。

腫瘍体積を考慮して、３００μｇ／μＬの酸化鉄濃度を有する油性磁性流体の腫瘍内顕微注入を実施することによって実験を行った。油性磁性流体を腫瘍に直接注入した。イソフルラン麻酔下、ベベル針（２６ゲージ）を備えた１０μＬハミルトン・シリンジを使用して注入を実施し、次いで、マウスを誘導コイル下の加熱ベッドに置く。各マウスについて、４７３．５ｋＨｚおよび１３．３６ｋＡ．ｍ^－１で１５分間の誘導治療を１回のみ実施した。

第１の実験では、２μＬの油性磁性流体ＦＦ３（酸化鉄３００μｇ／μＬ、すなわち、質量６００μｇ）の腫瘍内注入を、２×１μＬに分割して新たな試料に対して２．５ｍｍの深さで実施し、２回の注入（同じ注入点に実施する）の間に１分待機する。最後の注入の終わりに、針を引き抜く前に１分の待機時間を再度適用する。腫瘍体積中のナノ粒子によって放散される熱量（Ｑ_Ｖ）は、第１近似では、式：Ｑ_Ｖ＝ｍ_Ｐ（Ｆｅ_２Ｏ_３）×ＳＡＲ（１μＬ）×ｔ／Ｖ_腫瘍に従って計算することができる。これらの操作条件下で、熱量Ｑｖ＝０．１７Ｊ／ｍｍ^３である。注入の後、誘導治療の前および２４時間後に、バイオルミネセンスおよび蛍光画像を生成した。図１０Ａに示す通り、１つの温熱切除領域を腫瘍の中心に明確に観察することができる。交番磁場の適用中に、サーマルカメラによって測定された温度差は３℃であった。２４時間後のバイオルミネセンスの積分によって測定された腫瘍成長は減速される。腫瘍切除術後のｅｘ ｖｉｖｏ蛍光画像は、磁性流体注入領域の位置を示す。ｅｘ ｖｉｖｏバイオルミネセンス画像は、磁性流体が注入された部位におけるがん細胞の生存性の損失を示す（図１０Ｂ）。

第２の実験では、３×１μＬの油性磁性流体ＦＦ３（３００μｇ／μＬ、すなわち、質量９００μｇ）の複数回の注入を、腫瘍の３つの別個の部位に分配して、２．５ｍｍの深さで実施した（図１１Ａ）。各注入について、針を引き抜く前に１分の待機時間を適用した。これらの操作条件下で、熱量Ｑｖ＝０．２５Ｊ／ｍｍ^３である。交番磁場（ΔＴ≒２０℃）の適用の２４時間後に、磁性流体注入領域の近傍の腫瘍切除領域を容易に識別することができる。ｅｘ ｖｉｖｏ測定は、治療領域における腫瘍の部分的切除を確認する（図１１Ｂ）。

Claims (18)

1. 酸化鉄ベースの磁性ナノ粒子と少なくとも１種の脂肪酸エステルを含む油相とを含む生体適合性油性磁性流体であって、前記磁性ナノ粒子が１種または複数種のリン脂質の分子により表面官能化されていることを特徴とする生体適合性油性磁性流体。
2. 酸化鉄ベースの磁性ナノ粒子と、少なくとも１種の脂肪酸エステルを含む油相とを含み、前記酸化鉄ベースの磁性ナノ粒子が、前記油相中に、２０～８０℃の範囲に属する温度からコロイド状分散液を形成し、前記酸化鉄ベースの磁性ナノ粒子の表面は完全には覆わず、特に、前記油相中に存在する前記脂肪酸エステルが前記酸化鉄ベースの磁性ナノ粒子の表面にアクセスできるような、前記酸化鉄ベースの磁性ナノ粒子の表面被覆率を確実にする１種または複数種のリン脂質の分子で前記磁性ナノ粒子が表面官能化されていることを特徴とする、請求項１に記載の生体適合性油性磁性流体。
3. 水を含まないおよび／または界面活性剤を含まないことを特徴とする、請求項１または２に記載の油性磁性流体。
4. 前記リン脂質分子が、酸化鉄ベースの磁性ナノ粒子の表面被覆率１９～７６％、好ましくは２９～７６％、優先的には３４～５０％を確実にする、請求項１～３のいずれか一項に記載の油性磁性流体。
5. リン脂質分子による前記磁性ナノ粒子のグラフトの表面密度が、０．３２分子／ｎｍ^２～１．２２分子／ｎｍ^２、好ましくは０．４８分子／ｎｍ^２～１．２２分子／ｎｍ^２、優先的には０．５６分子／ｎｍ^２～０．７９分子／ｎｍ^２の範囲に属することを特徴とする、請求項１～４のいずれか一項に記載の油性磁性流体。
6. 前記リン脂質が、少なくとも１つの脂肪鎖、好ましくは２つの脂肪鎖、特にＣ６～Ｃ３０、好ましくはＣ８～Ｃ２４、またはさらにＣ１０～Ｃ２２、特にＣ１８飽和または一価不飽和もしくは多価不飽和の、分枝または好ましくは直鎖炭化水素鎖を含有することを特徴とする、請求項１～５のいずれか一項に記載の油性磁性流体。
7. 前記油相が、前記油相の全質量に対して、７０質量％、好ましくは８０質量％～９５質量％の脂肪酸エステルを含むことを特徴とする、請求項１～６のいずれか一項に記載の油性磁性流体。
8. 前記油相の前記脂肪酸エステルが、単独でまたは混合物として使用されるＣ６～Ｃ１２、好ましくはＣ６～Ｃ１０飽和脂肪酸トリグリセリドおよびＣ６～Ｃ１２、好ましくはＣ６～Ｃ１０飽和脂肪酸プロピレングリコールから選択されることを特徴とする、請求項１～７のいずれか一項に記載の油性磁性流体。
9. 前記磁性ナノ粒子の含有量が、前記油性磁性流体の全質量に対して、０．０１質量％～５０質量％、好ましくは０．１質量％～１０質量％の範囲に属することを特徴とする、請求項１～８のいずれか一項に記載の油性磁性流体。
10. 前記磁性ナノ粒子が、楕円体、多面体、例えば、ナノキューブ、両錐体またはナノスター、ウエハー、ナノロッド、ナノディスクまたはナノフラワーの形状であることを特徴とする、請求項１～９のいずれか一項に記載の油性磁性流体。
11. 前記リン脂質が－Ｏ（Ｏ）Ｐ（ＯＨ）Ｏ^－極性ヘッドを有し、好ましくは１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスファチジン酸および１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスファチジン酸の塩から選択されることを特徴とする、請求項１～１０のいずれか一項に記載の油性磁性流体。
12. 特にがん治療薬物、例えば、パクリタキセル、ドセタキセルまたはカルムスチンから選択される親油性活性成分をさらに含む、請求項１～１１のいずれか一項に記載の油性磁性流体。
13. 請求項１～１２のいずれか一項に記載の油性磁性流体を製造するための方法であって、以下の継続的ステップ：
    ａ－ 水または水／水と混和性のある溶媒の混合物であってもよい水性溶媒中の酸化鉄ベースの磁性ナノ粒子の水性分散液を準備するステップ、
    ｂ－ 磁性ナノ粒子の前記水性分散液から前記水性溶媒を除去するステップ、
    ｃ－ 溶媒または揮発性有機溶媒（Ｓ２）の混合物の添加により、磁性ナノ粒子のコロイド状ゾルを得るステップ、
    ｄ－ 少なくとも１種のリン脂質の分子で、前記コロイド状ゾルの前記磁性ナノ粒子を表面官能化するステップ、
    ｅ－ 前記揮発性有機溶媒（Ｓ２）を除去し、少なくとも１種の脂肪酸エステルを含む油相中に前記官能化磁性ナノ粒子を分散するステップ
    を含む方法。
14. ステップｃの後およびステップｄの前に、酸を添加するステップｃ２を含む、請求項１３に記載の油性磁性流体を製造するための方法。
15. 請求項１～１２のいずれか一項に記載の油性磁性流体または請求項１３もしくは１４のいずれか一項に記載の製造方法に従い得られる油性磁性流体を含む医薬。
16. 請求項１～１２のいずれか一項に記載の油性磁性流体または請求項１３もしくは１４のいずれか一項に記載の製造方法に従い得られる油性磁性流体の１０質量％～３０質量％と、水相と、少なくとも１種の界面活性剤とを含む水中油型ナノエマルジョン。
17. 請求項１～１２のいずれか一項に記載の生体適合性油性磁性流体を含む造影剤。
18. 磁気誘導性温熱療法によるがん治療におけるその使用のための、請求項１～１２のいずれか一項に記載の生体適合性油性磁性流体または請求項１３もしくは１４に記載の方法に従い得られる生体適合性油性磁性流体。
    
    

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