KR20200051738A - 수성 의약 조성물 - Google Patents

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Abstract

항체와 리소좀 효소의 융합 단백질을 유효 성분으로서 함유하여 이루어지는, 시장에 유통시키는 것이 가능할 정도로 안정된 수성 의약 조성물이 개시되어 있다. 상기 수성 의약 조성물은, 항체와 리소좀 효소의 융합 단백질의 농도가 0.5 내지 20mg/mL이고, 염화 나트륨의 농도가 0.3 내지 1.2mg/mL이고, 수크로오스의 농도가 50 내지 100mg/mL이고, 비이온성 계면 활성제의 농도가 0.15 내지 3mg/mL이고, 완충제의 농도가 3 내지 30mM이고, pH가 5.0 내지 7.5인 것을 포함한다.

Description

수성 의약 조성물
본 발명은, 항체와 리소좀 효소를 결합시킨 단백질을 유효 성분으로 하는 의약의, 용액 상태에서 저장 안정적인 수성 의약 조성물에 관한 것으로, 상세하게는, 안정화제로서, 수크로오스와 비이온성 계면활성제를 함유하는 수성 의약 조성물에 관한 것이다.
단백질을 유효 성분으로서 함유하여 이루어진 의약은, 예전에는, 단백질의 저장 안정성을 고려하여 동결 건조 제제로서 공급되는 것이 일반적이었다. 현재에는, 이두론산-2-설파타아제, α-갈락토시다아제 A, 글루코세레브로시다아제, α-L-이두로니다아제, N-아세틸갈락토사민-4-설파타아제를 포함하는 리소좀 효소, 항사람 IL-6 수용체 항체, 항사람 PD-1 항체를 포함하는 항체, 에리스로포이에틴, 다베포에틴, 성장 호르몬을 포함하는 생리 활성 단백질을 주제(主劑)로서 함유하여 이루어진 의약의 대부분이, 수성 의약 조성물의 형태로 제조, 판매되고 있다. 수성 의약 조성물은 사용시에서의 약제의 용해 조작이 불필요하므로, 동결 건조 제제에 비해 편리성이 높다.
수성 의약 조성물에는, 주제인 단백질의 안정성을 높이기 위해서, 다양한 첨가물이 포함되어 있다. 수용액 중에서의 단백질의 안정성을 높이는 효과를 갖는 첨가물로서는, 예를 들면, 히스티딘, 메티오닌, 아르기닌, 글리신을 포함하는 아미노산, 폴리소르베이트 80을 포함하는 비이온성 계면활성제, 인산 완충제를 포함하는 완충제가 알려져 있다. 예를 들어, 성장 호르몬의 수성 의약 조성물의 경우, 안정화제로서 히스티딘을 첨가함으로써, 성장 호르몬의 안정성이 높아지는 것이 알려져 있다(특허문헌 1). 또한, 다베포에틴의 수성 의약 조성물의 경우, 안정화제로서 메티오닌을 첨가함으로써, 다베포에틴의 안정성이 높아지는 것이 알려져 있다(특허문헌 2). 이와 같이, 수성 의약 조성물의 조성은, 수성 의약 조성물마다 각각 다르고, 주제의 단백질의 특성에 따라서 연구가 이루어진 것이다.
특허문헌 1: 일본 공표특허공보 특표2000-508665호 특허문헌 2: 일본 공표특허공보 특표2005-527470호
본 발명의 목적은, 안정화제로서, 수크로오스와 비이온성 계면활성제를 함유하여 이루어지고, 시장에 유통시키는 것이 가능한 정도로 안정적인, 항체와 리소좀 효소를 결합시킨 단백질을 유효 성분으로서 함유하여 이루어진 수성 의약 조성물을 제공하는 것이다.
상기 목적을 위한 연구에 있어서, 본 발명자들은, 항체와 사람 리소좀 효소의 일종인 사람 이두론산-2-설파타아제를 결합시킨 단백질이, 수크로오스와 비이온성 계면활성제를 함유하는 수성 의약 조성물 중에서 안정적임을 발견하여, 본 발명을 완성했다. 즉, 본 발명은 이하를 포함하는 것이다.
1. 항체와 리소좀 효소의 융합 단백질을 유효 성분으로서 함유하여 이루어진 수성 의약 조성물로서, 상기 융합 단백질의 농도가 0.5 내지 20mg/mL이고, 염화 나트륨의 농도가 0.3 내지 1.2mg/mL이고, 수크로오스의 농도가 50 내지 100mg/mL이고, 비이온성 계면활성제의 농도가 0.15 내지 3mg/mL이고, 완충제의 농도가 3 내지 30mM이고, pH가 5.0 내지 7.5인, 수성 의약 조성물.
2. 항체와 리소좀 효소의 융합 단백질을 유효 성분으로서 함유하여 이루어진 수성 의약 조성물로서, 상기 융합 단백질의 농도가 1.0 내지 10mg/mL이고, 염화 나트륨의 농도가 0.6 내지 1.0mg/mL이고, 수크로오스의 농도가 55 내지 95mg/mL이고, 비이온성 계면활성제의 농도가 0.15 내지 1mg/mL이고, 완충제의 농도가 10 내지 30mM이고, pH가 5.5 내지 7.0인, 수성 의약 조성물.
3. 상기 융합 단백질의 상기 농도가 2.0 내지 10mg/mL인, 상기 1 또는 2에 기재된 수성 의약 조성물.
4. 상기 염화 나트륨의 상기 농도가 0.7 내지 0.9mg/mL인, 상기 1 내지 3 중 어느 하나에 기재된 수성 의약 조성물.
5. 상기 수크로오스의 상기 농도가 60 내지 90mg/mL인, 상기 1 내지 4 중 어느 하나에 기재된 수성 의약 조성물.
6. 상기 비이온성 계면활성제의 상기 농도가 0.3 내지 0.8mg/mL인, 상기 1 내지 5 중 어느 하나에 기재된 수성 의약 조성물.
7. 상기 비이온성 계면활성제가 폴리소르베이트 또는 폴록사머인, 상기 1 내지 6 중 어느 하나에 기재된 수성 의약 조성물.
8. 상기 비이온성 계면활성제가 폴리소르베이트 20, 폴리소르베이트 80 및 폴리옥시에틸렌(160) 폴리옥시프로필렌(30) 글리콜로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 것인, 상기 1 내지 6 중 어느 하나에 기재된 수성 의약 조성물.
9. 상기 완충제가 인산 완충제인, 상기 1 내지 8 중 어느 하나에 기재된 수성 의약 조성물.
10. 상기 인산 완충제의 농도가 15 내지 25mM인, 상기 9에 기재된 수성 의약 조성물.
11. 상기 pH가 6.0 내지 7.0인, 상기 1 내지 10 중 어느 하나에 기재된 수성 의약 조성물.
12. 상기 pH가 6.2 내지 6.8인, 상기 1 내지 10 중 어느 하나에 기재된 수성 의약 조성물.
13. 상기 융합 단백질이 상기 사람 리소좀 효소를 상기 항체의 경쇄 또는 중쇄 중 어느 하나의 C 말단측 또는 N 말단측 중 어느 하나에 펩타이드 결합에 의해 결합시킨 것인, 상기 1 내지 12 중 어느 하나에 기재된 수성 의약 조성물.
14. 상기 융합 단백질이 상기 사람 리소좀 효소를 상기 항체의 중쇄의 C 말단측에 펩타이드 결합에 의해 결합시킨 것인, 상기 1 내지 12 중 어느 하나에 기재된 수성 의약 조성물.
15. 상기 융합 단백질이, 상기 사람 리소좀 효소를 상기 항체의 경쇄 또는 중쇄 중 어느 하나의 C 말단측 또는 N 말단측 중 어느 하나에 적어도 1개의 아미노산 잔기를 포함하는 펩타이드 링커를 개재하여 결합시킨 것인, 상기 1 내지 12 중 어느 하나에 기재된 수성 의약 조성물.
16. 상기 융합 단백질이, 상기 사람 리소좀 효소를 상기 항체의 중쇄의 C 말단측에 적어도 1개의 아미노산 잔기를 포함하는 펩타이드 링커를 개재하여 결합시킨 것인, 상기 1 내지 12 중 어느 하나에 기재된 수성 의약 조성물.
17. 상기 펩타이드 링커가 (Gly-Ser)로 나타내어지는 아미노산 서열을 갖는 것인, 상기 15 또는 16에 기재된 수성 의약 조성물.
18. 상기 리소좀 효소가 사람 리소좀 효소인, 상기 1 내지 17 중 어느 하나에 기재된 수성 의약 조성물.
19. 상기 리소좀 효소가 α-L-이두로니다아제, 이두론산-2-설파타아제, 글루코세레브로시다아제, β-갈락토시다아제, GM2 활성화 단백질, β-헥소사미니다아제 A, β-헥소사미니다아제 B, N-아세틸글루코사민-1-포스포트랜스퍼라아제, α-만노시다아제, β-만노시다아제, 갈락토실세라미다아제, 사포신 C, 알릴설파타아제 A, α-L-푸코시다아제, 아스파르틸글루코사미니다아제, α-N-아세틸갈락토사미니다아제, 산성 스핑고미엘리나아제, α-갈락토시다아제, β-글루쿠로니다아제, 헤파란 N-설파타아제, α-N-아세틸글루코사미니다아제, 아세틸 CoA α-글루코사미니드 N-아세틸트랜스퍼라아제, N-아세틸글루코사민-6-황산 설파타아제, 산성 세라미다아제, 아밀로-1,6-글루코시다아제, 시알리다아제, 아스파르틸글루코사미니다아제, 팔미토일 단백질 티오에스테라아제-1(PPT-1), 트리펩티딜 펩티다아제-1(TPP-1), 히알루로니다아제-1, 및 CLN1 및 CLN2로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 것인, 상기 1 내지 18 중 어느 하나에 기재된 수성 의약 조성물.
20. 상기 사람 리소좀 효소가 사람 이두론산-2-설파타아제인, 상기 18에 기재된 수성 의약 조성물.
21. 상기 항체가 사람 항체 또는 사람화 항체인, 상기 1 내지 20 중 어느 하나에 기재된 수성 의약 조성물.
22. 상기 항체가 혈관 내피 세포의 표면에 존재하는 분자를 항원으로서 인식하는 것인, 상기 1 내지 21 중 어느 하나에 기재된 수성 의약 조성물.
23. 상기 혈관 내피 세포가 사람의 혈관 내피 세포인, 상기 22에 기재된 수성 의약 조성물.
24. 상기 혈관 내피 세포가 뇌혈관 내피 세포인, 상기 22 또는 23에 기재된 수성 의약 조성물.
25. 상기 뇌혈관 내피 세포의 표면에 존재하는 분자가 트랜스페린 수용체(TfR), 인슐린 수용체, 렙틴 수용체, 리포 단백질 수용체, IGF 수용체, OATP-F, 유기 음이온 트랜스포터, MCT-8 및 모노카복실산 트랜스포터로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 것인, 상기 24에 기재된 수성 의약 조성물.
26. 상기 항체가 사람화 항사람 트랜스페린 수용체(hTfR) 항체인, 상기 21에 기재된 수성 의약 조성물.
27. 상기 항체가 사람화 항 hTfR 항체이고, 상기 사람 리소좀 효소가 사람 이두론산-2-설파타아제이고, 상기 융합 단백질이 사람화 항 hTfR 항체와 사람 이두론산-2-설파타아제의 융합 단백질인 것이고, 상기 융합 단백질이 이하의 (a) 내지 (c)로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 것인, 상기 21에 기재된 수성 의약 조성물:
(a) 서열 번호 2로 나타내어지는 아미노산 서열을 갖는 사람화 항 hTfR 항체의 경쇄와,
서열 번호 8로 나타내어지는 아미노산 서열을 갖는 사람화 항 hTfR 항체의 중쇄의 C 말단측에, 사람 이두론산-2-설파타아제가 펩타이드 링커를 개재하여 결합한 것으로 이루어진,
융합 단백질;
(b) 서열 번호 4로 나타내어지는 아미노산 서열을 갖는 사람화 항 hTfR 항체의 경쇄와,
서열 번호 9로 나타내어지는 아미노산 서열을 갖는 사람화 항 hTfR 항체의 중쇄의 C 말단측에, 사람 이두론산-2-설파타아제가 펩타이드 링커를 개재하여 결합한 것으로 이루어진,
융합 단백질;
(c) 서열 번호 6으로 나타내어지는 아미노산 서열을 갖는 사람화 항 hTfR 항체의 경쇄와,
서열 번호 10으로 나타내어지는 아미노산 서열을 갖는 사람화 항 hTfR 항체의 중쇄의 C 말단측에, 사람 이두론산-2-설파타아제가 펩타이드 링커를 개재하여 결합한 것으로 이루어진,
융합 단백질.
28. 상기 항체가 사람화 항 hTfR 항체이고, 상기 사람 리소좀 효소가 사람 이두론산-2-설파타아제이고, 상기 융합 단백질이 사람화 항 hTfR 항체와 사람 이두론산-2-설파타아제의 융합 단백질인 것이고, 상기 융합 단백질이 이하의 (a) 내지 (c)로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 것인, 상기 21에 기재된 수성 의약 조성물:
(a) 상기 사람화 항 hTfR 항체의 경쇄가 서열 번호 2로 나타내어지는 아미노산 서열을 갖는 것이고,
상기 사람화 항 hTfR 항체의 중쇄가, 그 C 말단측에서, (Gly-Ser)로 나타내어지는 아미노산 서열을 갖는 펩타이드 링커를 개재하여, 사람 이두론산-2-설파타아제와 결합하고 있고, 전체로서 서열 번호 13으로 나타내어지는 아미노산 서열을 갖는 것인,
융합 단백질;
(b) 상기 사람화 항hTR 항체의 경쇄가 서열 번호 4로 나타내어지는 아미노산 서열을 갖는 것이고,
상기 사람화 항 hTfR 항체의 중쇄가, 그 C 말단측에서, (Gly-Ser)로 나타내어지는 아미노산 서열을 갖는 펩타이드 링커를 개재하여, 사람 이두론산-2-설파타아제와 결합하고 있고, 전체로서 서열 번호 15로 나타내어지는 아미노산 서열을 갖는 것인,
융합 단백질;
(c) 상기 사람화 항 hTfR 항체의 경쇄가 서열 번호 6으로 나타내어지는 아미노산 서열을 갖는 것이고,
상기 사람화 항 hTfR 항체의 중쇄가, 그 C 말단측에서, (Gly-Ser)로 나타내어지는 아미노산 서열을 가지는 펩타이드 링커를 개재하여, 사람 이두론산-2-설파타아제와 결합하고 있고, 전체로서 서열 번호 17로 나타내어지는 아미노산 서열을 갖는 것인,
융합 단백질.
29. 상기 항체가 사람화 항 hTfR 항체이고, 상기 사람 리소좀 효소가 사람 이두론산-2-설파타아제이고, 상기 융합 단백질이 사람화 항 hTfR 항체와 사람 이두론산-2-설파타아제의 융합 단백질인 것이고, 상기 융합 단백질이 이하의 (a) 내지 (c)로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 것인, 상기 21에 기재된 수성 의약 조성물;
(a) 상기 사람 이두론산-2-설파타아제가 링커 서열 Gly-Ser을 개재하여 중쇄의 C 말단측에서 결합하여 이루어진 결합체와, 경쇄로 이루어지고, 상기 결합체의 아미노산 서열이 서열 번호 13으로 나타내어지는 것이고, 상기 경쇄의 아미노산 서열이 서열 번호 2로 나타내어지는 것,
(b) 상기 사람 이두론산-2-설파타아제가 링커 서열 Gly-Ser을 개재하여 중쇄의 C 말단측에서 결합하여 이루어진 결합체와, 경쇄로 이루어지고, 상기 결합체의 아미노산 서열이 서열 번호 15로 나타내어지는 것이고, 상기 경쇄의 아미노산 서열이 서열 번호 4로 나타내어지는 것,
(c) 상기 사람 이두론산-2-설파타아제가 링커 서열 Gly-Ser을 개재하여 중쇄의 C 말단측에서 결합하여 이루어진 결합체와, 경쇄로 이루어지고, 상기 결합체의 아미노산 서열이 서열 번호 17로 나타내어지는 것이고, 상기 경쇄의 아미노산 서열이 서열 번호 6으로 나타내어지는 것.
본 발명에 의하면, 시장에 유통시키는 것이 가능할 정도로, 항체와 리소좀 효소를 결합시킨 융합 단백질을, 수성 의약 조성물 중에서 안정화시킬 수 있다.
[도 1-1] 진탕 6시간 후(하얀 막대) 및 24시간 후(검정 막대)의 수성 의약 조성물 중에 포함된 단위 액량(200μL)당의 입자수의 측정값을 나타내는 도면. 세로축은 입자수(개/200μL)를, 가로축은 폴록사머 188의 농도(mg/mL)를 각각 나타낸다.
[도 1-2] 도 1-1을, 폴록사머 188의 농도 범위(0.25 내지 5mg/mL)에서 확대한 도면. 세로축은 입자수(개/200μL)를, 가로축은 폴록사머 188의 농도(mg/mL)를 각각 나타낸다.
[도 2] 진탕 6시간 후(검정 막대) 및 24시간 후(빗금 막대)의 수성 의약 조성물 중에서의 I2S-항 hTfR 항체의 중합체의 함유율을 나타내는 도면. 세로축은 중합체의 함유율(%)을, 가로축은 폴록사머 188의 농도(mg/mL)를 각각 나타낸다.
[도 3] 처방 H(pH6.0), 처방 I(pH6.5) 및 처방 J(pH7.0) 중에서의 I2S-항 hTfR 항체의 중합체의 함유율을 나타내는 도면. 하얀 막대는 5℃에서 1주간, 검정 막대는 25℃에서 1주간, 빗금 막대는 40℃에서 1주간, 및 그물코 막대는 50℃에서 24시간 정치 후의, 처방 H 내지 J 중에서의 중합체의 함유율을 각각 나타낸다. 세로축은 중합체의 함유율(%)을 나타낸다.
[도 4] 처방 H(pH6.0), 처방 I(pH6.5) 및 처방 J(pH7.0) 중에서의 I2S-항 hTfR 항체의 분해물의 함유율을 나타내는 도면. 하얀 막대는 5℃에서 1주간, 검정 막대는 25℃에서 1주간, 빗금 막대는 40℃에서 1주간, 및 그물코 막대는 50℃에서 24시간 정치 후의, 처방 H 내지 J 중에서의 분해물의 함유율을 각각 나타낸다. 세로축은 분해물의 함유율(%)을 나타낸다.
[도 5] 처방 K(pH6.0), 처방 L(pH6.5) 및 처방 M(pH7.0) 중에서의 I2S-항 hTfR 항체의 중합체의 함유율을 나타내는 도면. 하얀 막대는 5℃에서 1주간, 검정 막대는 25℃에서 1주간, 빗금 막대는 40℃에서 1주간, 및 그물코 막대는 50℃에서 24시간 정치 후의, 처방 K 내지 M 중에서의 중합체의 함유율을 각각 나타낸다. 세로축은 중합체의 함유율(%)을 나타낸다.
[도 6] 처방 K(pH6.0), 처방 L(pH6.5) 및 처방 M(pH7.0) 중에서의 I2S-항 hTfR 항체의 분해물의 함유율을 나타내는 도면. 하얀 막대는 5℃에서 1주간, 검정 막대는 25℃에서 1주간, 빗금 막대는 40℃에서 1주간, 및 그물코 막대는 50℃에서 24시간 정치한 후의, 처방 K 내지 M 중에서의 분해물의 함유율을 각각 나타낸다. 세로축은 분해물의 함유율(%)을 나타낸다.
본 발명은, 항체와 리소좀 효소를 결합시킨 단백질을 유효 성분으로 하는 의약의, 용액 상태에서 저장 안정적인 수성 의약 조성물에 관한 것이다. 여기에서, 리소좀 효소와 결합되는 항체는, 바람직하게는 사람 항체 또는 사람화 항체이지만, 항원에 특이적으로 결합하는 성질을 갖는 것인 한, 항체의 동물종 등에 특별히 제한은 없다. 예를 들어, 항체는, 사람 이외의 포유 동물의 항체라도 좋고, 또한 사람 항체와 사람 이외의 다른 포유 동물의 항체의 키메라 항체라도 좋다.
사람 항체는, 그 전체가 사람 유래의 유전자에 코드되는 항체를 말한다. 단, 유전자의 발현 효율을 상승시키는 등의 목적으로, 코드되는 항체의 아미노산 서열에 변이를 가하지 않고, 본래의 사람의 유전자에 변이를 가한 유전자에 코드되는 항체도, 사람 항체이다. 또한, 사람 항체를 코드하는 2개 이상의 유전자를 조합하여, 어느 하나의 사람 항체의 일부를, 다른 사람 항체의 일부로 치환한 항체도, 사람 항체이다. 사람 항체는, 면역 글로불린 경쇄의 3개소의 상보성 결정 영역(CDR)과 면역 글로불린 중쇄의 3개소의 상보성 결정 영역(CDR)을 갖는다. 면역 글로불린 경쇄의 3개소의 CDR은, N 말단측에 있는 것부터 차례로 CDR1, CDR2 및 CDR3라고 한다. 면역 글로불린 중쇄의 3개소의 CDR은, N 말단측에 있는 것부터 차례로 CDR1, CDR2 및 CDR3라고 한다. 어느 하나의 사람 항체의 CDR을, 그 밖의 사람 항체의 CDR로 치환함으로써, 사람 항체의 항원 특이성, 친화성 등을 개변한 항체도, 사람 항체이다.
본 발명에 있어서, 본래의 사람 항체 유전자를 개변함으로써, 본래의 항체의 아미노산 서열로 치환, 결실, 부가 등의 변이를 가한 항체도, 사람 항체라고 한다. 본래의 항체의 아미노산 서열 중의 아미노산 잔기를 다른 아미노산 잔기로 치환시키는 경우, 치환되는 아미노산 잔기의 개수는. 바람직하게는 1 내지 20개이고, 보다 바람직하게는 1 내지 5개이고, 더욱 바람직하게는 1 내지 3개이다. 본래의 항체의 아미노산 서열 중의 아미노산 잔기를 결실시키는 경우, 결실시키는 아미노산 잔기의 개수는, 바람직하게는 1 내지 20개이고, 보다 바람직하게는 1 내지 5개이고, 더욱 바람직하게는 1 내지 3개이다. 또한, 이들 아미노산 잔기의 치환과 결실을 조합한 변이를 가한 항체도, 사람 항체이다. 아미노산 잔기를 부가시키는 경우, 본래의 항체의 아미노산 서열 중 또는 N 말단측 혹은 C 말단측에, 바람직하게는 1 내지 20개, 보다 바람직하게는 1 내지 5개, 더욱 바람직하게는 1 내지 3개의 아미노산 잔기가 부가된다. 이들 아미노산 잔기의 부가, 치환 및 결실 중 적어도 2개를 조합한 변이를 가한 항체도 사람 항체이다. 변이를 가한 항체의 아미노산 서열은, 본래의 항체의 아미노산 서열과, 바람직하게는 80% 이상의 동일성을 나타내고, 보다 바람직하게는 85% 이상의 동일성을 나타내고, 더욱 바람직하게는 90% 이상의 동일성을 나타내고, 보다 더 바람직하게는 95% 이상의 동일성을 나타내고, 보다 더 바람직하게는 98% 이상의 동일성을 나타내는 것이다. 즉, 본 발명에 있어서 「사람 유래의 유전자」라고 할 때는, 사람 유래의 본래의 유전자에 더해서, 사람 유래의 본래의 유전자에 개변을 가함으로써 얻어지는 유전자도 포함된다.
본 발명에 있어서, 「사람화 항체」의 용어는, 가변 영역의 일부(예를 들어, 특히 CDR의 전부 또는 일부)의 아미노산 서열이 사람 이외의 포유 동물 유래이고, 그 이외의 영역이 사람 유래인 항체를 말한다. 예를 들어, 사람화 항체로서, 사람 항체를 구성하는 면역 글로불린 경쇄의 3개소의 상보성 결정 영역(CDR)과 면역 글로불린 중쇄의 3개소의 상보성 결정 영역(CDR)을, 다른 포유 동물의 CDR에 의해서 치환함으로써 제작된 항체를 들 수 있다. 사람 항체의 적절한 위치에 이식되는 CDR의 유래가 되는 다른 포유 동물의 생물종은, 사람 이외의 포유 동물인 한 특별히 한정은 없지만, 바람직하게는, 생쥐, 쥐, 토끼, 말, 또는 사람 이외의 영장류이고, 보다 바람직하게는 생쥐 및 쥐이고, 예를 들어 생쥐이다.
본 발명에 있어서, 항체가 사람 항체 또는 사람화 항체인 경우에 대해, 이하 상술한다. 사람 항체 및 사람화 항체의 경쇄에는, λ쇄와 κ쇄가 있다. 항체를 구성하는 경쇄는, λ쇄와 κ쇄 중 어느 것이라도 좋다. 또한, 사람 항체 및 사람화 항체의 중쇄에는, γ쇄, μ쇄, α쇄, σ쇄 및 ε쇄가 있고, 각각 IgG, IgM, IgA, IgD 및 IgE에 대응하고 있다. 항체를 구성하는 중쇄는, γ쇄, μ쇄, α쇄, σ쇄 및 ε쇄 중 어느 것이라도 좋지만, 바람직하게는 γ쇄이다. 추가로, 항체의 중쇄의 γ쇄에는, γ1쇄, γ2쇄, γ3쇄 및 γ4쇄가 있고, 각각, IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4에 대응하고 있다. 항체를 구성하는 중쇄가 γ쇄인 경우, 그 γ쇄는, γ1쇄, γ2쇄, γ3쇄 및 γ4쇄 중 어느 것이라도 좋지만, 바람직하게는, γ1쇄 또는 γ4쇄이다. 항체가 사람화 항체 또는 사람 항체이고, 또한 IgG인 경우, 그 항체의 경쇄는 λ쇄와 κ쇄 중 어느 것이라도 좋고, 그 항체의 중쇄는, γ1쇄, γ2쇄, γ3쇄 및 γ4쇄 중 어느 것이라도 좋지만, 바람직하게는, γ1쇄 또는 γ4쇄이다. 예를 들어, 바람직한 항체의 하나의 형태로서, 경쇄가 λ쇄이고 중쇄가 γ1쇄인 것을 들 수 있다.
본 발명에 있어서, 「키메라 항체」의 용어는, 2개 이상의 다른 종에서 유래하는, 2개 이상의 다른 항체의 단편이 연결되어 이루어진 항체를 말한다.
사람 항체와 다른 포유 동물 항체의 키메라 항체란, 사람 항체의 일부가 사람 이외의 포유 동물의 항체의 일부에 의해서 치환된 항체이다. 항체는, 이하에 설명하는 Fc 영역, Fab 영역 및 힌지부로 이루어진다. 이러한 키메라 항체의 구체예로서, Fc 영역이 사람 항체에 유래하는 한편으로 Fab 영역이 다른 포유 동물의 항체에 유래하는 키메라 항체를 들 수 있다. 힌지부는, 사람 항체 또는 다른 포유 동물의 항체 중 어느 하나에 유래한다. 반대로, Fc 영역이 다른 포유 동물에 유래하는 한편으로 Fab 영역이 사람 항체에 유래하는 키메라 항체를 들 수 있다. 힌지부는, 사람 항체 또는 다른 포유 동물의 항체 중 어느 것에 유래해도 좋다.
또한, 항체는, 가변 영역과 정상(定常) 영역으로 이루어진다고 말할 수도 있다. 키메라 항체의 다른 구체예로서, 중쇄의 정상 영역(CH)과 경쇄의 정상 영역(CL)이 사람 항체에 유래하는 한편으로, 중쇄의 가변 영역(VH) 및 경쇄의 가변 영역(VL)이 다른 포유 동물의 항체에 유래하는 것, 반대로, 중쇄의 정상 영역(CH)과 경쇄의 정상 영역(CL)이 다른 포유 동물의 항체 유래하는 한편으로, 중쇄의 가변 영역(VH) 및 경쇄의 가변 영역(VL)이 사람 항체에 유래하는 것도 들 수 있다. 여기에서, 다른 포유 동물의 생물종은, 사람 이외의 포유 동물인 한 특별히 한정은 없지만, 바람직하게는, 생쥐, 쥐, 토끼, 말, 또는 사람 이외의 영장류이고, 보다 바람직하게는 생쥐이다.
사람 항체와 생쥐 항체의 키메라 항체는, 특히, 「사람/생쥐 키메라 항체」라고 한다. 사람/생쥐 키메라 항체에는, Fc 영역이 사람 항체에 유래하는 한편으로 Fab 영역이 생쥐 항체에 유래하는 키메라 항체나, 반대로, Fc 영역이 생쥐 항체에 유래하는 한편으로 Fab 영역이 사람 항체에 유래하는 키메라 항체를 들 수 있다. 힌지부는, 사람 항체 또는 생쥐 항체 중 어느 하나에 유래한다. 사람/생쥐 키메라 항체의 다른 구체예로서, 중쇄의 정상 영역(CH)과 경쇄의 정상 영역(CL)이 사람 항체에 유래하는 한편으로, 중쇄의 가변 영역(VH) 및 경쇄의 가변 영역(VL)이 생쥐 항체에 유래하는 것, 반대로, 중쇄의 정상 영역(CH)과 경쇄의 정상 영역(CL)이 생쥐 항체에 유래하는 한편으로, 중쇄의 가변 영역(VH) 및 경쇄의 가변 영역(VL)이 사람 항체에 유래하는 것도 들 수 있다.
항체는, 본래, 2개의 면역 글로불린 경쇄와 2개의 면역 글로불린 중쇄의 합계 4개의 폴리펩타이드쇄로 이루어진 기본 구조를 갖는다. 단, 본 발명에 있어서, 「항체」라고 할 때는, 이 기본 구조를 갖는 것에 더하여,
(1) 1개의 면역 글로불린 경쇄와 1개의 면역 글로불린 중쇄의 합계 2개의 폴리펩타이드쇄로 이루어진 것이나, 이하에 상술하는 바와 같이,
(2) 면역 글로불린 경쇄의 C 말단측에 링커 서열을, 그리고 추가로 그 C 말단측에 면역 글로불린 중쇄를 결합시켜서 이루어진 것인 단쇄 항체, 및
(3) 면역 글로불린 중쇄의 C 말단측에 링커 서열을, 그리고 추가로 그 C 말단측에 면역 글로불린 경쇄를 결합시켜서 이루어진 것인 단쇄 항체도 포함된다. 또한,
(4) 항체의 기본 구조에서 Fc 영역이 결실된 것인 Fab 영역으로 이루어진 것 및 Fab 영역과 힌지부의 전부 혹은 일부로 이루어진 것(Fab, F(ab') 및 F(ab')2를 포함함)도, 본 발명에서의 「항체」에 포함된다. 심지어, 경쇄의 가변 영역과 중쇄의 가변 영역을 링커 서열을 개재하여 결합시켜서 단쇄 항체로 한 scFv도, 본 발명에서의 항체에 포함된다.
본 발명에 있어서, 「단쇄 항체」라고 할 때는, 면역 글로불린 경쇄의 가변 영역의 전부 또는 일부를 포함하는 아미노산 서열의 C 말단측에 링커 서열이 결합하고, 추가로 그 C 말단측에 면역 글로불린 중쇄의 가변 영역의 전부 또는 일부를 포함하는 아미노산 서열이 결합하여 이루어지고, 특정의 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 단백질을 말한다. 예를 들어, 상기 (2) 및 (3)에 나타내어지는 것은 단쇄 항체에 포함된다. 또한, 면역 글로불린 중쇄의 가변 영역의 전부 또는 일부를 포함하는 아미노산 서열의 C 말단측에 링커 서열이 결합하고, 추가로 그 C 말단측에 면역 글로불린 경쇄의 가변 영역의 전부 또는 일부를 포함하는 아미노산 서열이 결합하여 이루어지고, 특정의 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 단백질도, 본 발명에서의 「단쇄 항체」이다. 면역 글로불린 중쇄의 C 말단측에 링커 서열을 개재하여 면역 글로불린 경쇄가 결합한 단쇄 항체에 있어서는, 통상, 면역 글로불린 중쇄는, Fc 영역이 결실되어 있다. 면역 글로불린 경쇄의 가변 영역은, 항체의 항원 특이성에 관여하는 상보성 결정 영역(CDR)을 3개 갖고 있다. 마찬가지로, 면역 글로불린 중쇄의 가변 영역도, CDR을 3개 갖고 있다. 이러한 CDR은, 항체의 항원 특이성을 결정하는 주된 영역이다. 따라서, 단쇄 항체에는, 면역 글로불린 중쇄의 3개의 CDR이 전부와, 면역 글로불린 경쇄의 3개의 CDR의 전부가 포함되는 것이 바람직하다. 단, 항체의 항원 특이적인 친화성이 유지되는 한, CDR의 1개 또는 복수개를 결실시킨 단쇄 항체로 할 수도 있다.
단쇄 항체에 있어서, 면역 글로불린 경쇄와 중쇄의 사이에 배치되는 링커 서열은, 바람직하게는 2 내지 50개, 보다 바람직하게는 8 내지 50개, 더욱 바람직하게는 10 내지 30개, 보다 더 바람직하게는 12 내지 18개 또는 15 내지 25개, 예를 들어 15개 혹은 25개의 아미노산 잔기로 구성되는 펩타이드쇄이다. 그러한 링커 서열은, 이로 인해 양 쇄가 연결되어 이루어지는 항 hTfR 항체가 hTfR에 대한 친화성을 유지하는 한, 그 아미노산 서열에 한정은 없지만, 바람직하게는, 글리신만 또는 글리신과 세린으로 구성되는 것이고, 예를 들면, 아미노산 서열 Gly-Ser, 아미노산 서열 Gly-Gly-Ser, 아미노산 서열 Gly-Gly-Gly, 아미노산 서열 Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(서열 번호 19), 아미노산 서열 Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(서열 번호 20), 아미노산 서열 Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly(서열 번호 21), 또는 이러한 아미노산 서열이 2 내지 10회, 혹은 2 내지 5회 반복된 서열을 갖는 것이다. 예를 들어, 면역 글로불린 중쇄의 가변 영역의 전 영역으로 이루어진 아미노산 서열의 C 말단측에, 링커 서열을 개재하여 면역 글로불린 경쇄의 가변 영역을 결합시켜서 ScFV로 하는 경우, 아미노산 서열 Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(서열 번호 19)의 3개가 연속한 것에 상당하는 합계 15개의 아미노산 잔기로 이루어진 링커 서열이 적합하다.
본 발명에 있어서, 항체가 특이적으로 인식하는 항원은, 예를 들어, 혈관 내피 세포의 표면에 존재하는 분자(표면 항원)이다. 이러한 표면 항원으로서는, 트랜스페린 수용체(TfR), 인슐린 수용체, 렙틴 수용체, 리포 단백질 수용체, IGF 수용체, OATP-F 등의 유기 음이온 트랜스포터, MCT-8 등의 모노카복실산 트랜스포터, Fc 수용체를 들 수 있지만, 이것들에 한정되는 것은 아니다.
상기의 표면 항원 중에서도, 트랜스페린 수용체(TfR), 인슐린 수용체, 렙틴 수용체, 리포 단백질 수용체, IGF 수용체, OATP-F 등의 유기 음이온 트랜스포터, MCT-8 등의 모노카복실산 트랜스포터는, 혈액 뇌관문(Blood Brain Barrier)을 형성하는 뇌 모세 혈관 내피 세포의 표면에 존재하는 것이다. 이들 항원을 인식할 수 있는 항체는, 항원을 개재하여 뇌 모세 혈관 내피 세포(뇌혈관 내피 세포)에 결합할 수 있다. 그리고 뇌 모세 혈관 내피 세포에 결합한 항체는, 혈액 뇌관문을 통과하여 중추 신경계에 도달할 수 있다. 따라서, 목적의 단백질을, 이러한 항체와 결합시킴으로써, 중추 신경계에까지 도달시킬 수 있다. 목적의 단백질로서는, 중추 신경계에서 약효를 발휘할만한 기능을 갖는 단백질을 들 수 있다. 예를 들어, 중추 신경 장애를 동반하는 리소좀병 환자에게 있어서 결손되어 있거나 또는 기능 부전인 리소좀 효소를, 목적의 단백질로서 들 수 있다. 이러한 리소좀 효소는, 그대로는 중추 신경계에 도달할 수 없고, 환자의 중추 신경 장애에 대하여 약효를 나타내는 경우가 없지만, 이들 항체와 결합시킴으로써 혈액 뇌관문을 통과할 수 있게 되므로, 리소좀병 환자에게 있어서 보이는 중추 신경 장애를 개선할 수 있다.
본 발명에 있어서, 「사람 트랜스페린 수용체」 또는 「hTfR」의 용어는, 서열 번호 22로 나타내어지는 아미노산 서열을 갖는 막단백질을 말한다. 본 발명의 항 hTfR 항체는, 그 일 실시형태에 있어서, 서열 번호 22로 나타내어지는 아미노산 서열 중 N 말단측으로부터 89번째의 시스테인 잔기에서 C 말단의 페닐알라닌까지의 부분(hTfR의 세포외 영역)에 대하여 특이적으로 결합하는 것이지만, 이것에 한정되지 않는다.
항체 제작 방법을 hTfR에 대한 항체를 예로 들어 이하에 설명한다. hTfR에 대한 항체의 제작 방법으로서는, hTfR 유전자를 편입한 발현 벡터를 도입한 세포를 사용하여, 재조합 사람 트랜스페린 수용체(rhTfR)를 제작하고, 이 rhTfR을 사용하여 생쥐 등의 동물을 사용하여 면역하여 얻는 방법이 일반적이다. 면역 후의 동물로부터 hTfR에 대한 항체 생산 세포를 빼내서, 이것과 미엘로마 세포를 유합시킴으로써, hTfR에 대한 항체 생산능을 갖는 하이브리도마 세포를 제작할 수 있다.
또한, 생쥐 등의 동물로부터 얻은 면역계 세포를 체외 면역법에 의해 rhTfR로 면역하는 것에 의해서도 hTfR에 대한 항체를 산생하는 세포를 취득할 수 있다. 체외 면역법에 의해 면역하는 경우, 그 면역계 세포가 유래하는 동물종에 특별히 한정은 없지만, 바람직하게는, 생쥐, 쥐, 토끼, 기니피그, 개, 고양이, 말 및 사람을 포함한 영장류이고, 보다 바람직하게는, 생쥐, 쥐 및 사람이고, 더욱 바람직하게는 생쥐 및 사람이다. 생쥐의 면역계 세포로서는, 예를 들어, 생쥐의 비장에서 조제한 비세포(脾細胞)를 사용할 수 있다. 사람의 면역계 세포로서는, 사람의 말초혈, 골수, 비장 등의 조직에서 조제한 세포를 사용할 수 있다. 사람의 면역계 세포를 체외 면역법에 의해 면역한 경우, hTfR에 대한 사람 항체를 얻을 수 있다.
본 발명에 있어서, 항체와 결합시켜야할 사람 리소좀 효소에 특별히 한정은 없지만, α-L-이두로니다아제, 이두론산-2-설파타아제, 글루코세레브로시다아제, β-갈락토시다아제, GM2 활성화 단백질, β-헥소사미니다아제 A, β-헥소사미니다아제 B, N-아세틸글루코사민-1-포스포트랜스퍼라아제, α-만노시다아제, β-만노시다아제, 갈락토실세라미다아제, 사포신 C, 알릴설파타아제 A, α-L-푸코시다아제, 아스파르틸글루코사미니다아제, α-N-아세틸갈락토사미니다아제, 산성 스핑고미엘리나아제, α-갈락토시다아제, β-글루쿠로니다아제, 헤파란 N-설파타아제, α-N-아세틸글루코사미니다아제, 아세틸 CoA α-글루코사미니드 N-아세틸트랜스퍼라아제, N-아세틸글루코사민-6-황산 설파타아제, 산성 세라미다아제, 아밀로-1,6-글루코시다아제, 시알리다아제, 아스파르틸글루코사미니다아제, 팔미토일 단백질 티오에스테라아제-1(PPT-1), 트리펩티딜 펩티다아제-1(TPP-1), 히알루로니다아제-1, CLN1 및 CLN2 등의 리소좀 효소, 를 들 수 있다.
항체가 혈관 내피 세포의 표면에 존재하는 분자(표면 항원)를 특이적으로 인식하는 것인 경우, 항체와 결합시킨 사람 리소좀 효소는 각각, α-L-이두로니다아제는 헐러 증후군 또는 헐러 샤이에 증후군에서의 중추 신경 장애 치료제로서, 이두론산-2-설파타아제는 헌터 증후군에서의 중추 신경 장애 치료제로서, 글루코세레브로시다아제는 고셰병에서의 중추 신경 장애 치료제로서, β갈락토시다아제는 GM1-강글리오시도시스 1 내지 3형에서의 중추 신경 장애 치료제로서, GM2 활성화 단백질은 GM2-강글리오시도시스 AB 이형에서의 중추 신경 장애 치료제로서, β-헥소사미니다아제 A는 샌드호프병 및 테이삭스병에서의 중추 신경 장애 치료제로서, β-헥소사미니다아제 B는 샌드호프병에서의 중추 신경 장애 치료제로서, N-아세틸글루코사민-1-포스포트랜스퍼라아제는 I-세포병에서의 중추 신경 장애 치료제로서, α-만노시다아제는 α-만노시도시스에서의 중추 신경 장애 치료제로서, β-만노시다아제는 β-만노시도시스에서의 중추 신경 장애 치료제로서, 갈락토실세라미다아제는 크라베병에서의 중추 신경 장애 치료제로서, 사포신 C는 고셰병 유사 축적증에서의 중추 신경 장애 치료제로서, 알릴설파타아제 A는 이염성 백질 변성증(이염성 백질 디스트로피)에서의 중추 신경 장애 치료제로서, α-L-푸코시다아제는 푸코사이드 축적증에서의 중추 신경 장애 치료제로서, 아스파르틸글루코사미니다아제는 아스파르틸글루코사민뇨증에서의 중추 신경 장애 치료제로서, α-N-아세틸갈락토사미니다아제는 쉰들러병 및 가와사키병에서의 중추 신경 장애 치료제로서, 산성 스핑고미엘리나아제는 니만 피크병에서의 중추 신경 장애 치료제로서, α-갈락토시다아제는 파브리병에서의 중추 신경 장애 치료제로서, β-글루쿠로니다아제는 슬라이 증후군에서의 중추 신경 장애 치료제로서, 헤파란 N-설파타아제, α-N-아세틸글루코사미니다아제, 아세틸 CoA α-글루코사미니드 N-아세틸트랜스퍼라아제 및 N-아세틸글루코사민-6-황산 설파타아제는 산필리포 증후군에서의 중추 신경 장애 치료제로서, 산성 세라미다아제는 파버병에서의 중추 신경 장애 치료제로서, 아밀로-1,6-글루코시다아제는 코리병(포르브스·코리병)에서의 중추 신경 장애 치료제로서, 시알리다아제는 시알리다아제 결손증에서의 중추 신경 장애 치료제로서, 아스파르틸글루코사미니다아제는 아스파르틸글루코사민뇨증에서의 중추 신경 장애 치료제로서, 팔미토일 단백질 티오에스테라아제-1(PPT-1)는, 신경 세로이드 리포푸신증 또는 Santavuori-Haltia병에서의 중추 신경 장애 치료제로서, 트리펩티딜 펩티다아제-1(TPP-1)은, 신경 세로이드 리포푸신증 또는 Jansky-Bielschowsky병에서의 중추 신경 장애 치료제로서, 히알루로니다아제-1은 히알루로니다아제 결손증에서의 중추 신경 장애 치료제로서, CLN1 및 CLN2는 바텐병에서의 중추 신경 장애 치료제로서 사용할 수 있다.
항체가 혈관 내피 세포의 표면에 존재하는 분자(표면 항원)을 특이적으로 인식하는 것인 경우에, 항체와 결합시켜야 할 리소좀 효소로서 적합한 것으로서, 사람 이두론산-2-설파타아제(hI2S)를 들 수 있다. hI2S는, 헤파란 황산이나 데르마탄황산과 같은 글리코사미노글리칸(GAG) 분자 내에 존재하는 황산에스테르 결합을 가수 분해하는 활성을 갖는 리소좀 효소의 일종이다. 헌터 증후군은 이 효소가 선천적으로 결실되는 유전자 질환이다. 헌터 증후군의 환자는, 헤파란 황산, 데르마탄황산이 조직 내에 축적하는 결과, 각막 혼탁, 정신 발달 지체 등의 여러 증상을 나타낸다. 단, 경증의 경우에는 정신 발달 지연은 관찰되지 않는 경우도 있다. 따라서, 상기 항체와 hI2S의 융합 단백질은, BBB를 통과함으로써 뇌 조직 내에 축적된 GAG를 분해할 수 있으므로, 정신 발달 지체를 나타내는 헌터 증후군의 환자에게 투여함으로써, 중추 신경 장애 치료제로서 사용할 수 있다.
본 발명에 있어서, 「사람 I2S」 또는 「hI2S」의 용어는, 특히 야생형의 hI2S와 동일한 아미노산 서열을 갖는 hI2S를 말한다. 야생형의 hI2S는, 서열 번호 1로 나타내어지는 525개의 아미노산 잔기로 구성된 아미노산 서열을 갖는다. 단, 이것에 한정되지 않고, I2S 활성을 갖는 것인 한, 야생형의 hI2S의 아미노산 서열로 치환, 결실, 부가 등의 변이를 가한 것도 hI2S에 포함된다. hI2S의 아미노산 서열의 아미노산 잔기를 다른 아미노산 잔기로 치환시키는 경우, 치환시키는 아미노산 잔기의 개수는, 바람직하게는 1 내지 10개이고, 보다 바람직하게는 1 내지 5개이고, 더욱 바람직하게는 1 내지 3개이고, 보다 더 바람직하게는 1 내지 2개이다. hI2S의 아미노산 서열 중의 아미노산 잔기를 결실시키는 경우, 결실시키는 아미노산 잔기의 개수는, 바람직하게는 1 내지 10개이고, 보다 바람직하게는 1 내지 5개이고, 더욱 바람직하게는 1 내지 3개이고, 보다 더 바람직하게는 1 내지 2개이다. 또한, 이들 아미노산 잔기의 치환과 결실을 조합한 변이를 가할 수도 있다. hI2S에 아미노산 잔기를 부가시키는 경우, hI2S의 아미노산 서열 중 또는 N 말단측 혹은 C 말단측에, 바람직하게는 1 내지 10개, 보다 바람직하게는 1 내지 5개, 더욱 바람직하게는 1 내지 3개, 보다 더 바람직하게는 1 내지 2개의 아미노산 잔기가 부가된다. 이들 아미노산 잔기의 부가, 치환 및 결실 중 적어도 2개를 조합한 변이를 가할 수도 있다. 변이를 가한 hI2S의 아미노산 서열은, 본래의 hI2S의 아미노산 서열과, 바람직하게는 80% 이상의 동일성을 갖고, 보다 바람직하게는 85% 이상의 동일성을 갖고, 보다 더 바람직하게는 90% 이상의 동일성을 나타내고, 더욱 바람직하게는, 95% 이상의 동일성을 나타낸다.
또한 본 발명에 있어서, hI2S가 I2S 활성을 갖는다고 할 때는, hI2S를 항체와 융합시켜서 융합 단백질로 했을 때에, 천연형의 hI2S가 본래 갖는 활성에 대하여, 3% 이상의 활성을 갖고 있는 것을 말한다. 단, 그 활성은, 천연형의 hI2S가 본래 갖는 활성에 대하여, 10% 이상인 것이 바람직하고, 20% 이상인 것이 보다 바람직하고, 50% 이상인 것이 더욱 바람직하고, 80% 이상인 것이 보다 더 바람직하다. 항체와 융합시킨 hI2S가 변이를 가한 것인 경우도 마찬가지이다. 항체는, 예를 들면 항 hTfR 항체이다.
본 발명에 있어서 「융합 단백질」이라고 할 때는, 항체와 사람 리소좀 효소를, 비펩타이드 링커 혹은 펩타이드 링커를 개재하여, 또는 직접 결합시킨 물질을 말한다. 항체와 사람 리소좀 효소를 결합시키는 방법은, 이하에 상술한다.
항체와 사람 리소좀 효소를 결합시키는 방법으로서는, 비펩타이드 링커 또는 펩타이드 링커를 개재하여 결합시키는 방법이 있다. 비펩타이드 링커로서는, 비오틴-스트렙토아비딘, 폴리에틸렌리콜, 폴리프로필렌글리콜, 에틸렌글리콜과 프로필렌글리콜과의 공중합체, 폴리옥시에틸화폴리올, 폴리비닐알코올, 다당류, 덱스트란, 폴리비닐에테르, 생분해성 고분자, 지질 중합체, 키틴류, 및 히알루론산, 또는 이것들의 유도체, 또는 이것들을 조합한 것을 사용할 수 있다. 펩타이드 링커는 펩타이드 결합한 1 내지 50개의 아미노산 잔기로 구성된 펩타이드쇄 또는 그 유도체로서, 그 N 말단과 C 말단이, 각각 항체 또는 사람 리소좀 효소 중 어느 하나와 공유 결합을 형성함으로써 항체와 사람 리소좀 효소를 결합시키는 것이다.
비펩타이드 링커로서 비오틴-스트렙토아비딘을 사용하는 경우, 항체가 비오틴을 결합시킨 것이고, 사람 리소좀 효소가 스트렙토아비딘을 결합시킨 것이고, 이 비오틴과 스트렙토아비딘과의 결합을 통해서, 항체와 사람 리소좀 효소를 결합시켜도 좋고, 반대로, 항체가 스트렙토아비딘을 결합시킨 것이고, 사람 리소좀 효소가 비오틴을 결합시킨 것이고, 이 비오틴과 스트렙토아비딘과의 결합을 통해서, 항체와 사람 리소좀 효소를 결합시켜도 좋다. 비오틴 및 스트렙토아비딘은, 주지의 수법에 의해 단백질에 결합시킬 수 있다.
비펩타이드 링커로서 PEG를 사용하여 본 발명의 항체와 사람 리소좀 효소를 결합시킨 것은, 특히, 항체-PEG-사람 리소좀 효소라고 한다. 항체-PEG-사람 리소좀 효소는, 항체와 PEG를 결합시켜서 항체-PEG를 제작하고, 이어서 항체-PEG와 사람 리소좀 효소를 결합시킴으로써 제조할 수 있다. 또는, 항체-PEG-사람 리소좀 효소는, 사람 리소좀 효소와 PEG를 결합시켜서 사람 리소좀 효소-PEG를 제작하고, 이어서 사람 리소좀 효소-PEG와 항체를 결합시킴으로써도 제조할 수 있다. PEG를 항체 및 사람 리소좀 효소와 결합시킬 때에는, 카보네이트, 카르보닐이미다졸, 카복실산의 활성 에스테르, 아즐락톤, 환상 이미드티온, 이소시아네이트, 이소티오시아네이트, 이미데이트, 또는 알데히드 등의 관능기로 수식된 PEG가 사용된다. 이러한 PEG에 도입된 관능기가, 주로 항체 및 사람 리소좀 효소 분자 내의 아미노기와 반응함으로써, PEG와 항체 및 사람 리소좀 효소가 공유 결합한다. 이때 사용되는 PEG의 분자량 및 형상에 특별히 한정은 없지만, 그 평균 분자량(MW)은, 바람직하게는 MW=300 내지 60000이고, 보다 바람직하게는 MW=500 내지 20000이다. 예를 들어, 평균 분자량이 약 300, 약 500, 약 1000, 약 2000, 약 4000, 약 10000, 약 20000 등인 PEG는, 비펩타이드 링커로서 적합하게 사용할 수 있다.
예를 들어, 항체-PEG는, 항체와 알데히드기를 관능기로서 갖는 폴리에틸렌글리콜(ALD-PEG-ALD)을, 상기 항체에 대한 ALD-PEG-ALD의 몰비가 11, 12.5, 15, 110, 120 등이 되도록 혼합하고, 이것에 NaCNBH3 등의 환원제를 첨가하여 반응시킴으로써 얻어진다. 이어서, 항체-PEG를, NaCNBH3 등의 환원제의 존재 하에서, 사람 리소좀 효소와 반응시킴으로써, 항체-PEG-사람 리소좀 효소가 얻어진다. 반대로, 먼저 사람 리소좀 효소와 ALD-PEG-ALD를 결합시켜서 사람 리소좀 효소-PEG를 제작하고, 이어서 사람 리소좀 효소-PEG와 항체를 결합시킴으로써도, 항체-PEG-사람 리소좀 효소를 얻을 수 있다.
항체와 사람 리소좀 효소는, 항체의 중쇄 또는 경쇄의 C 말단측 또는 N 말단측에, 링커 서열을 개재하여 또는 직접, 각각 사람 리소좀 효소의 N 말단 또는 C 말단을 펩타이드 결합에 의해 결합시킬 수도 있다. 이러한 항체와 사람 리소좀 효소를 결합시켜서 이루어지는 융합 단백질은, 항체의 중쇄 또는 경쇄를 코드하는 cDNA의 3' 말단측 또는 5' 말단측에, 직접 또는 링커 서열을 코드하는 DNA 단편을 사이에 두고, 사람 리소좀 효소를 코드하는 cDNA가 인프레임으로 배치된 DNA 단편을, 포유 동물 세포, 효모 등의 진핵 생물용의 발현 벡터에 편입하고, 이 발현 벡터를 도입한 세포를 배양함으로써, 얻을 수 있다. 이 세포에는, 사람 리소좀 효소를 코드하는 DNA 단편을 중쇄와 결합시키는 경우에 있어서는, 항체의 경쇄를 코드하는 cDNA 단편을 편입한 발현 벡터도, 동일한 호스트 세포에 도입되고, 또한, 사람 리소좀 효소를 코드하는 DNA 단편을 경쇄와 결합시키는 경우에 있어서는, 항체의 중쇄를 코드하는 cDNA 단편을 편입한 발현 벡터도, 동일한 호스트 세포에 도입된다. 항체가 단쇄 항체인 경우, 항체와 사람 리소좀 효소를 결합시킨 융합 단백질은, 사람 리소좀 효소를 코드하는 cDNA의 5' 말단측 또는 3' 말단측에, 직접, 또는 링커 서열을 코드하는 DNA 단편을 사이에 두고, 단쇄 항체를 코드하는 cDNA를 연결한 DNA 단편을, 포유 동물 세포, 효모 등의 진핵 생물용의 발현 벡터에 편입하고, 이 발현 벡터를 도입한 이들 세포 중에서 발현시킴으로써, 얻을 수 있다.
항체의 경쇄의 C 말단측에 사람 리소좀 효소를 결합시킨 타입의 융합 단백질은, 항체가, 경쇄의 가변 영역의 전부 또는 일부를 포함하는 아미노산 서열과, 중쇄의 가변 영역의 전부 또는 일부를 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 것이고, 사람 리소좀 효소가, 이 항체의 경쇄의 C 말단측에 결합된 것이다. 여기서 항체의 경쇄와 사람 리소좀 효소는, 직접 결합해도 좋고, 링커를 개재하여 결합해도 좋다.
항체의 중쇄의 C 말단측에 사람 리소좀 효소를 결합시킨 타입의 융합 단백질은, 항체가, 경쇄의 가변 영역의 전부 또는 일부를 포함하는 아미노산 서열과, 중쇄의 가변 영역의 전부 또는 일부를 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 것이고, 사람 리소좀 효소가, 이 항체의 중쇄의 C 말단측에 결합된 것이다. 여기서 항체의 중쇄와 사람 리소좀 효소는, 직접 결합해도 좋고, 링커를 개재하여 결합해도 좋다.
항체의 경쇄의 N 말단측에 사람 리소좀 효소를 결합시킨 타입의 융합 단백질은, 항체가, 경쇄의 가변 영역의 전부 또는 일부를 포함하는 아미노산 서열과, 중쇄의 가변 영역의 전부 또는 일부를 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 것이고, 사람 리소좀 효소가, 이 항체의 경쇄의 N 말단측에 결합된 것이다. 여기서 항체의 경쇄와 사람 리소좀 효소는, 직접 결합해도 좋고, 링커를 개재하여 결합해도 좋다.
항체의 중쇄의 N 말단측에 사람 리소좀 효소를 결합시킨 타입의 융합 단백질은, 항체가, 경쇄의 가변 영역의 전부 또는 일부를 포함하는 아미노산 서열과, 중쇄의 가변 영역의 전부 또는 일부를 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 것이고, 사람 리소좀 효소가, 이 항체의 중쇄의 N 말단측에 결합된 것이다. 여기서 항체의 중쇄와 사람 리소좀 효소는, 직접 결합해도 좋고, 링커를 개재하여 결합해도 좋다.
이때 항체와 사람 리소좀 효소의 사이에 링커 서열을 배치하는 경우, 그 서열은, 바람직하게는 1 내지 50개, 보다 바람직하게는 1 내지 17개, 더욱 바람직하게는 1 내지 10개, 보다 더 바람직하게는 1 내지 5개의 아미노산 잔기로 구성되는 것이지만, 항체에 결합시켜야 할 사람 리소좀 효소에 따라서, 링커 서열을 구성하는 아미노산 잔기의 개수는, 1개, 2개, 3개, 1 내지 17개, 1 내지 10개, 10 내지 40개, 20 내지 34개, 23 내지 31개, 25 내지 29개 등으로 적절히 조정할 수 있다. 그와 같은 링커 서열은, 이것에 의해 연결된 항체가 hTfR과의 친화성을 유지하고, 또한 상기 링커 서열에 의해 연결된 사람 리소좀 효소가, 생리적 조건 하에서 상기 단백질의 생리 활성을 발휘할 수 있는 한, 그 아미노산 서열에 한정은 없지만, 바람직하게는, 글리신과 세린으로 구성되는 것이고, 예를 들면, 글리신 또는 세린 중 어느 1개의 아미노산 잔기로 이루어진 것, 아미노산 서열 Gly-Ser, 아미노산 서열 Gly-Gly-Ser, 아미노산 서열 Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(서열 번호 19), 아미노산 서열 Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(서열 번호 20), 아미노산 서열 Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly(서열 번호 21), 또는 이러한 아미노산 서열이 1 내지 10개, 혹은 2 내지 5개 연속해서 이루어지는 1 내지 50개의 아미노산 잔기로 이루어진 서열, 2 내지 17개, 2 내지 10개, 10 내지 40개, 20 내지 34개, 23 내지 31개, 25 내지 29개의 아미노산 잔기로 이루어진 서열 등을 갖는 것이다. 예를 들어, 아미노산 서열 Gly-Ser을 갖는 것은 링커 서열로서 적합하게 사용할 수 있다. 항체가 단쇄 항체라도 동일하다.
또한, 본 발명에 있어서, 1개의 펩타이드쇄에 복수의 링커 서열이 포함되는 경우, 편의상, 각 링커 서열은 N 말단측부터 차례로 제1링커 서열, 제2링커 서열과 같이 명명한다.
항체가 사람화 항체이고 또한 항사람 트랜스페린 수용체 항체인 경우의, 항체의 바람직한 형태로서, 이하의 (x) 내지 (z)를 들 수 있다. 즉,
(x) 경쇄가 서열 번호 2로 나타내어지는 아미노산 서열을 갖는 것이고, 중쇄가 서열 번호 8로 나타내어지는 아미노산 서열을 갖는 것;
(y) 경쇄가 서열 번호 4로 나타내어지는 아미노산 서열을 갖는 것이고, 중쇄가 서열 번호 9로 나타내어지는 아미노산 서열을 갖는 것;
(z) 경쇄가 서열 번호 6으로 나타내어지는 아미노산 서열을 갖는 것이고, 중쇄가 서열 번호 10으로 나타내어지는 아미노산 서열을 갖는 것, 중 어느 하나이다.
또한, 여기서, (x), (y) 및 (z)는, 실시예 중에 나타내어지는 사람화 항 hTfR 항체 번호 1, 사람화 항 hTfR 항체 번호 2, 및 사람화 항 hTfR 항체 번호 3에 각각 상당한다.
단, 항체가 사람화 항체이고 또한 항사람 트랜스페린 수용체 항체인 경우의, 항체의 바람직한 형태는, 상기의 (x) 내지 (z)에 한정되는 것은 아니다. 예를 들어, 항체의 경쇄의 아미노산 서열이 상기의 (x) 내지 (z)에서의 각각의 경쇄의 아미노산 서열과 80% 이상의 동일성을 갖는 것이고, 상기 항체의 중쇄의 아미노산 서열이 상기의 (x) 내지 (z)에서의 각각의 중쇄의 아미노산 서열과 80% 이상의 동일성을 갖는 것인 항체도, hTfR에 대하여 친화성을 갖는 한, 본 발명에서 사용할 수 있다. 또한, 항체의 경쇄의 아미노산 서열이 상기의 (x) 내지 (z)에서의 각각의 경쇄의 아미노산 서열과 85% 이상의 동일성을 갖는 것이고, 상기 항체의 중쇄의 아미노산 서열이 상기의 (x) 내지 (z)에서의 각각의 중쇄의 아미노산 서열과 85% 이상의 동일성을 갖는 것인 항체도, hTfR에 대하여 친화성을 갖는 한, 본 발명에서 사용할 수 있다. 또한, 항체의 경쇄의 아미노산 서열이 상기의 (x) 내지 (z)에서의 각각의 경쇄의 아미노산 서열과 90% 이상의 동일성을 갖는 것이고, 상기 항체의 중쇄의 아미노산 서열이 상기의 (x) 내지 (z)에서의 각각의 중쇄의 아미노산 서열과 90% 이상의 동일성을 갖는 것인 항체도, hTfR에 대하여 친화성을 갖는 한, 본 발명에서 사용할 수 있다. 또한, 항체의 경쇄의 아미노산 서열이 상기의 (x) 내지 (z)에서의 각각의 경쇄의 아미노산 서열과 95% 이상의 동일성을 갖는 것이고, 상기 항체의 중쇄의 아미노산 서열이 상기의 (x) 내지 (z)에서의 각각의 중쇄의 아미노산 서열과 95% 이상의 동일성을 갖는 것인 항체도, hTfR에 대하여 친화성을 갖는 한, 본 발명에서의 항체로서 사용할 수 있다.
또한, 경쇄의 아미노산 서열이, 상기의 (x) 내지 (z)에서의 각각의 경쇄의 아미노산 서열을 구성하는 아미노산 잔기의 1 내지 10개가 치환, 결실 또는 부가를 한 것이고, 중쇄의 아미노산 서열이, 상기의 (x) 내지 (z)에서의 각각의 중쇄의 아미노산 서열을 구성하는 아미노산 잔기의 1 내지 10개가 치환, 결실 또는 부가를 한 항체도, hTfR에 대하여 친화성을 갖는 한, 본 발명에서의 항체로서 사용할 수 있다. 또한, 경쇄의 아미노산 서열이, 상기의 (x) 내지 (z)에서의 각각의 경쇄의 아미노산 서열을 구성하는 아미노산 잔기의 1 내지 5개가 치환, 결실 또는 부가를 한 것이고, 중쇄의 아미노산 서열이, 상기의 (x) 내지 (z)에서의 각각의 중쇄의 아미노산 서열을 구성하는 아미노산 잔기의 1 내지 5개가 치환, 결실 또는 부가를 한 항체도, hTfR에 대해서 친화성을 갖는 한, 본 발명에서의 항체로서 사용할 수 있다. 나아가서는, 경쇄의 아미노산 서열이, 상기 (x) 내지 (z)에서의 각각의 경쇄의 아미노산 서열을 구성하는 아미노산 잔기의 1 내지 3개가 치환, 결실 또는 부가를 한 것이고, 중쇄의 아미노산 서열이, 상기의 (x) 내지 (z)에서의 각각의 중쇄의 아미노산 서열을 구성하는 아미노산 잔기의 1 내지 3개가 치환, 결실 또는 부가를 한 항체도, hTfR에 대하여 친화성을 갖는 한, 본 발명에서의 항체로서 사용할 수 있다.
상기의 항체의 바람직한 형태의 (x)에 있어서, 서열 번호 2로 나타내어지는 경쇄의 아미노산 서열 중, 서열 번호 23으로 나타내어지는 아미노산 서열이 가변 영역이고, 서열 번호 8로 나타내어지는 중쇄의 아미노산 서열 중, 서열 번호 24로 나타내어지는 아미노산 서열이 가변 영역이다. 또한, 상기의 항체의 바람직한 형태의 (y)에 있어서, 서열 번호 4로 나타내어지는 경쇄의 아미노산 서열 중, 서열 번호 25로 나타내어지는 아미노산 서열이 가변 영역이고, 서열 번호 9로 나타내어지는 중쇄의 아미노산 서열 중, 서열 번호 26으로 나타내어지는 아미노산 서열이 가변 영역이다. 또한, 상기의 항체의 바람직한 형태의 (z)에 있어서, 서열 번호 6으로 나타내어지는 경쇄의 아미노산 서열 중, 서열 번호 27로 나타내어지는 아미노산 서열이 가변 영역이고, 서열 번호 10으로 나타내어지는 중쇄의 아미노산 서열 중, 서열 번호 28로 나타내어지는 아미노산 서열이 가변 영역이다. 이들 항체의 바람직한 형태의 (x) 내지 (z)에 있어서, 중쇄 또는/및 경쇄의 아미노산 서열을 구성하는 아미노산 서열 중으로의 치환, 결실 또는 부가는, 특히, 이것들의 가변 영역에 도입된다. 단, 상기 경쇄의 가변 영역으로 한 아미노산 서열의 C 말단측의 1 내지 10개의 아미노산 잔기를 제외한 아미노산 서열, 1 내지 5개의 아미노산 잔기를 제외한 아미노산 서열, 또는 1 내지 3개의 아미노산 잔기를 제외한 아미노산 서열을 가변 영역으로 할 수도 있다. 또한, 상기 경쇄의 가변 영역으로 한 아미노산 서열 및 그 C 말단측에 이어지는 1 내지 10개의 아미노산 잔기를 포함하는 아미노산 서열, 1 내지 5개의 아미노산 잔기를 포함하는 아미노산 서열, 또는 1 내지 3개의 아미노산 잔기를 포함하는 아미노산 서열을 가변 영역으로 할 수도 있다. 또한, 상기 중쇄의 가변 영역으로 한 아미노산 서열의 C 말단측의 1 내지 10개의 아미노산 잔기를 제외한 아미노산 서열, 1 내지 5개의 아미노산 잔기를 제외한 아미노산 서열, 또는 1 내지 3개의 아미노산 잔기를 제외한 아미노산 서열을 가변 영역으로 할 수도 있다. 또한, 상기 중쇄의 가변 영역으로 한 아미노산 서열 및 그 C 말단측에 이어지는 1 내지 10개의 아미노산 잔기를 포함하는 아미노산 서열, 1 내지 5개의 아미노산 잔기를 포함하는 아미노산 서열, 또는 1 내지 3개의 아미노산 잔기를 포함하는 아미노산 서열을 가변 영역으로 할 수도 있다.
또한, 본 발명에 있어서, 본래의 단백질(항체를 포함함)의 아미노산 서열과 변이를 가한 단백질의 아미노산 서열과의 동일성은, 주지의 상동성 계산 알고리즘을 사용하여 용이하게 산출할 수 있다. 예를 들어, 그러한 알고리즘으로서, BLAST(Altschul SF. J Mol. Biol. 215. 403-10, (1990)), Pearson 및 Lipman의 유사성 검색법(Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 85. 2444(1988)), Smith 및 Waterman의 국소 상동성 알고리즘(Adv. Appl. Math. 2. 482-9(1981)) 등이 있다.
본 발명에서의, 항체와 사람 리소좀 효소의 융합 단백질의 바람직한 일 형태로서, 사람화 항사람 트랜스페린 수용체 항체(사람화 항 hTfR 항체)와 사람 이두론산-2-설파타아제(hI2S)의 융합 단백질을 들 수 있다. 이 융합 단백질에 있어서, 사람 트랜스페린 수용체에 대한 친화성과, 사람 리소좀 효소의 효소 활성 중 어느 것이라도 유지시킬 수 있는 한, hI2S는, 사람화 항 hTfR 항체를 구성하는 중쇄와 경쇄 중에 어느 것에도 융합시켜도 좋다. 또한, hI2S를 중쇄에 결합시키는 경우에 있어서, 중쇄의 N 말단측 또는 C 말단측 중 어느 것에 hI2S를 융합시켜도 좋고, hI2S를 경쇄에 결합시킬 경우에 있어서, 경쇄의 N 말단측 또는 C 말단측 중 어느 것에 hI2S를 융합시켜도 좋다.
이러한 사람화 항 hTfR 항체와 hI2S의 융합 단백질의 바람직한 일 형태로서, 사람화 항 hTfR 항체의 중쇄의 C 말단측에 사람 이두론산-2-설파타아제를 결합시킨 융합 단백질을 들 수 있다. 이러한 융합 단백질의 적합한 것으로서 이하의 (1) 내지 (3)에 나타내어지는 것을 예시할 수 있다.
(1) 서열 번호 2로 나타내어지는 아미노산 서열을 갖는 사람화 항 hTfR 항체의 경쇄와,
서열 번호 8로 나타내어지는 아미노산 서열을 갖는 사람화 항 hTfR 항체의 중쇄의 C 말단측에, 사람 이두론산-2-설파타아제가 링커 서열을 개재하여 결합한 것,
으로 이루어진 융합 단백질.
(2) 서열 번호 4로 나타내어지는 아미노산 서열을 갖는 사람화 항 hTfR 항체의 경쇄와,
서열 번호 9로 나타내어지는 아미노산 서열을 갖는 사람화 항 hTfR 항체의 중쇄의 C 말단측에, 사람 이두론산-2-설파타아제가 링커 서열을 개재하여 결합한 것,
으로 이루어진 융합 단백질.
(3) 서열 번호 6으로 나타내어지는 아미노산 서열을 갖는 사람화 항 hTfR 항체의 경쇄와,
서열 번호 10으로 나타내어지는 아미노산 서열을 갖는 사람화 항 hTfR 항체의 중쇄의 C 말단측에, 사람 이두론산-2-설파타아제가 링커 서열을 개재하여 결합한 것,
으로 이루어진 융합 단백질.
이들 (1) 내지 (3)의 융합 단백질에 있어서, 사람 이두론산-2-설파타아제는, 바람직하게는 서열 번호 1로 나타내어지는 아미노산을 갖는 것이고, 링커 서열은, 바람직하게는 (Gly-Ser)로 나타내어지는 아미노산 서열을 갖는 것이다. 또한 이들 융합 단백질은, 통상, 2개의 경쇄와 2개의 사람 이두론산-2-설파타아제와 결합된 중쇄로 구성된다.
또한, 이러한 사람화 항 hTfR 항체와 hI2S의 융합 단백질의 바람직한 일 형태로서,
(1) 상기 사람화 항 hTfR 항체의 경쇄가 서열 번호 2로 나타내어지는 아미노산 서열을 갖는 것이고, 상기 사람화 항 hTfR 항체의 중쇄가, 그 C 말단측에서, (Gly-Ser)로 나타내어지는 아미노산 서열을 갖는 링커를 개재하여, 사람 이두론산-2-설파타아제와 결합하고 있고, 전체로서 서열 번호 13으로 나타내어지는 아미노산 서열을 갖는 것인 융합 단백질,
(2) 상기 사람화 항 hTfR 항체의 경쇄가 서열 번호 4로 나타내어지는 아미노산 서열을 갖는 것이고, 상기 사람화 항 hTfR 항체의 중쇄가, 그 C 말단측에서, (Gly-Ser)로 나타내어지는 아미노산 서열을 갖는 링커를 개재하여, 사람 이두론산-2-설파타아제와 결합하고 있고, 전체로서 서열 번호 15로 나타내어지는 아미노산 서열을 갖는 것인 융합 단백질,
(3) 상기 사람화 항 hTfR 항체의 경쇄가 서열 번호 6으로 나타내어지는 아미노산 서열을 갖는 것이고, 상기 사람화 항 hTfR 항체의 중쇄가, 그 C 말단측에서, (Gly-Ser)로 나타내어지는 아미노산 서열을 갖는 링커를 개재하여, 사람 이두론산-2-설파타아제와 결합하고 있고, 전체로서 서열 번호 17로 나타내어지는 아미노산 서열을 갖는 것인 융합 단백질, 을 들 수 있다. 이들 융합 단백질은, 통상, 2개의 경쇄와 2개의 사람 이두론산-2-설파타아제와 결합한 중쇄로 구성된다.
또한, 이러한 사람화 항 hTfR 항체와 hI2S의 융합 단백질의 바람직한 일 형태로서,
(1) 상기 사람 이두론산-2-설파타아제가 링커 서열 Gly-Ser을 개재하여 중쇄의 C 말단측에서 결합하여 이루어진 중합체와, 경쇄로 이루어지고, 상기 결합체의 아미노산 서열이 서열 번호 13으로 나타내어지는 것이고, 상기 경쇄의 아미노산 서열이 서열 번호 2로 나타내어지는 것,
(2) 상기 사람 이두론산-2-설파타아제가 링커 서열 Gly-Ser을 개재하여 중쇄의 C 말단측에서 결합하여 이루어진 중합체와, 경쇄로 이루어지고, 상기 결합체의 아미노산 서열이 서열 번호 15로 나타내어지는 것이고, 상기 경쇄의 아미노산 서열이 서열 번호 4로 나타내어지는 것,
(3) 상기 사람 이두론산-2-설파타아제가 링커 서열 Gly-Ser을 개재하여 중쇄의 C 말단측에서 결합하여 이루어진 결합체와, 경쇄로 이루어지고, 상기 결합체의 아미노산 서열이 서열 번호 17로 나타내어지는 것이고, 상기 경쇄의 아미노산 서열이 서열 번호 6으로 나타내어지는 것, 을 들 수 있다. 이러한 융합 단백질은, 통상, 2개의 경쇄와 2개의 사람 이두론산-2-설파타아제와 결합한 중쇄로 구성된다.
일 실시형태에서의 수성 의약 조성물은, 유효 성분으로서 항체와 사람 리소좀 효소의 융합 단백질, 주로 등장화제로서 염화 나트륨, 주로 안정화제로서 수크로오스와 비이온성 계면활성제, 및 pH 조절제로서 완충제를 함유하여 이루어지는 것이다.
수성 의약 조성물에 포함되는 항체와 사람 리소좀 효소의 융합 단백질의 농도는, 바람직하게는 0.5 내지 20mg/mL이고, 보다 바람직하게는 1.0 내지 10mg/mL이고, 더욱 바람직하게는 2.0 내지 10mg/mL이고, 보다 더 바람직하게는 2.0 내지 6.0mg/mL이고, 예를 들면, 2.5mg/mL 및 5.0mg/mL이다.
수성 의약 조성물에 함유되는 염화 나트륨의 농도는, 바람직하게는 0.3 내지 1.2mg/mL이고, 보다 바람직하게는 0.5 내지 1.0mg/mL이고, 더욱 바람직하게는 0.6 내지 1.0mg/mL이고, 보다 더 바람직하게는 0.7 내지 0.9mg/mL이고, 예를 들면, 0.8mg/mL이다.
수성 의약 조성물에 포함되는 수크로오스의 농도는, 바람직하게는 50 내지 100mg/mL이고, 더욱 바람직하게는 55 내지 95mg/mL이고, 더욱 바람직하게는 60 내지 90mg/mL이고, 보다 더 바람직하게는 70 내지 80mg/mL이고, 예를 들면, 75mg/mL이다.
수성 의약 조성물에 함유되는 비이온성 계면활성제로서는, 폴리소르베이트나 폴록사머 등을 단독으로 또는 이것들을 조합하여 사용할 수 있다. 폴리소르베이트로서는 폴리소르베이트 20, 폴리소르베이트 80이, 폴록사머로서는 폴록사머 188(폴리옥시에틸렌(160) 폴리옥시프로필렌(30) 글리콜)이 특히 적합하다. 또한, 수성 의약 조성물에 함유되는 비이온성 계면활성제의 농도는, 0.15 내지 3mg/mL인 것이 바람직하고, 0.15 내지 1mg/mL인 것이 보다 바람직하고, 0.2 내지 0.8mg/mL인 것이 더욱 바람직하고, 0.3 내지 0.8mg/mL인 것이 보다 더 바람직하고, 예를 들면, 0.325mg/mL 및 0.65mg/mL이다.
수성 의약 조성물에 함유되는 완충제는, 약제학적으로 허용할 수 있는 것인 한 특별히 한정은 없지만, 인산 완충제가 바람직하다. 완충제로서 인산 완충제가 사용되는 경우, 수성 의약 조성물에 함유되는 인산 완충제의 농도는, 바람직하게는 3 내지 30mM이고, 보다 바람직하게는 10 내지 30mM이고, 더욱 바람직하게는 15 내지 25mM이고, 예를 들면 20mM이다. 또한, 완충제에 의해서 조정되는 수성 의약 조성물의 pH는, 바람직하게는 5.5 내지 7.5이고, 보다 바람직하게는 5.5 내지 7.0이고, 더욱 바람직하게는 6.0 내지 7.0이고, 보다 더 바람직하게는 6.2 내지 6.8이고, 예를 들면 6.5이다. 또한, 수성 의약 조성물의 생리 식염수에 대한 침투압비는, 0.9 내지 1.1로 조정된다.
본 발명의 수성 의약 조성물의 적합한 조성으로서,
(A) 항체와 사람 리소좀 효소의 융합 단백질의 농도가 0.5 내지 20mg/mL이고, 염화 나트륨의 농도가 0.3 내지 1.2mg/mL이고, 수크로오스의 농도가 50 내지 100mg/mL이고, 비이온성 계면활성제의 농도가 0.15 내지 1mg/mL이고, 완충제의 농도가 3 내지 30mM로서, pH가 5.0 내지 7.5인 것,
(B) 항체와 사람 리소좀 효소의 융합 단백질의 농도가 1.0 내지 10mg/mL이고, 염화 나트륨의 농도가 0.6 내지 1.0mg/mL이고, 수크로오스의 농도가 55 내지 95mg/mL이고, 비이온성 계면활성제의 농도가 0.15 내지 1mg/mL이고, 완충제의 농도가 10 내지 30mM로서, pH가 5.5 내지 7.0인 것, 을 들 수 있다.
상기 (A) 및 (B)로 나타내어지는 수성 의약 조성물에 있어서, 항체와 사람 리소좀 효소의 융합 단백질은, 예를 들어, 사람화 항 hTfR 항체와 hI2S의 융합 단백질이다. 이러한 사람화 항 hTfR 항체와 hI2S의 융합 단백질의 바람직한 형태로서,
(1) 상기 사람화 항 hTfR 항체의 경쇄가 서열 번호 2로 나타내어지는 아미노산 서열을 갖는 것이고, 상기 사람화 항 hTfR 항체의 중쇄가 서열 번호 8로 나타내어지는 아미노산 서열을 갖는 것으로서, 중쇄의 C 말단측에, 링커 서열을 개재하여, 사람 이두론산-2-설파타아제가 결합한 것인 융합 단백질,
(2) 상기 사람화 항 hTfR 항체의 경쇄가 서열 번호 4로 나타내어지는 아미노산 서열을 갖는 것이고, 상기 사람화 항 hTfR 항체의 중쇄가 서열 번호 9로 나타내어지는 아미노산 서열을 갖는 것으로서, 중쇄의 C 말단측에, 링커 서열을 개재하여, 사람 이두론산-2-설파타아제가 결합한 것인 융합 단백질,
(3) 상기 사람화 항 hTfR 항체의 경쇄가 서열 번호 6으로 나타내어지는 아미노산 서열을 갖는 것이고, 상기 사람화 항 hTfR 항체의 중쇄가 서열 번호 10으로 나타내어지는 아미노산 서열을 갖는 것으로서, 중쇄의 C 말단측에, 링커 서열을 개재하여, 사람 이두론산-2-설파타아제가 결합한 것인 융합 단백질, 을 들 수 있다.
상기 (1) 내지 (3)의 융합 단백질에 있어서, 사람 이두론산-2-설파타아제는, 바람직하게는 서열 번호 1로 나타내어지는 아미노산을 갖는 것이고, 링커 서열은, 바람직하게는 (Gly-Ser)로 나타내어지는 아미노산 서열을 갖는 것이다. 또한 이들 융합 단백질은, 통상, 2개의 경쇄와 2개의 사람 이두론산-2-설파타아제와 결합한 중쇄로 구성된다.
또한, 상기 (A) 및 (B)로 나타내어지는 수성 의약 조성물에서의, 사람화 항 hTfR 항체와 hI2S의 융합 단백질의 더욱 바람직한 형태로서,
(1) 상기 사람화 항 hTfR 항체의 경쇄가 서열 번호 2로 나타내어지는 아미노산 서열을 갖는 것이고, 상기 사람화 항 hTfR 항체의 중쇄가, 그 C 말단측에서, (Gly-Ser)로 나타내어지는 아미노산 서열을 갖는 링커를 개재하여, 사람 이두론산-2-설파타아제와 결합하고 있고, 전체로서 서열 번호 13으로 나타내어지는 아미노산 서열을 갖는 것,
(2) 상기 사람화 항 hTfR 항체의 경쇄가 서열 번호 4로 나타내어지는 아미노산 서열을 갖는 것이고, 상기 사람화 항 hTfR 항체의 중쇄가, 그 C 말단측에서, (Gly-Ser)로 나타내어지는 아미노산 서열을 갖는 링커를 개재하여, 사람 이두론산-2-설파타아제와 결합하고 있고, 전체로서 서열 번호 15로 나타내어지는 아미노산 서열을 갖는 것
(3) 상기 사람화 항 hTfR 항체의 경쇄가 서열 번호 6으로 나타내어지는 아미노산 서열을 갖는 것이고, 상기 사람화 항 hTfR 항체의 중쇄가, 그 C 말단측에서, (Gly-Ser)로 나타내어지는 아미노산 서열을 갖는 링커를 개재하여, 사람 이두론산-2-설파타아제와 결합하고 있고, 전체로서 서열 번호 17로 나타내어지는 아미노산 서열을 갖는 것, 을 들 수 있다.
또한, 상기 (A) 및 (B)로 나타내어지는 수성 의약 조성물에서의, 사람화 항 hTfR 항체와 hI2S의 융합 단백질의 더욱 바람직한 형태로서,
(1) 상기 사람 이두론산-2-설파타아제가 링커 서열 Gly-Ser을 개재하여 중쇄의 C 말단측에서 결합해서 이루어진 결합체와, 경쇄로 이루어지고, 상기 결합체의 아미노산 서열이 서열 번호 13으로 나타내어지는 것이고, 상기 경쇄의 아미노산 서열이 서열 번호 2로 나타내어지는 것,
(2) 상기 사람 이두론산-2-설파타아제가 링커 서열 Gly-Ser을 개재하여 중쇄의 C 말단측에서 결합해서 이루어진 결합체와, 경쇄로 이루어지고, 상기 결합체의 아미노산 서열이 서열 번호 15로 나타내어지는 것이고, 상기 경쇄의 아미노산 서열이 서열 번호 4로 나타내어지는 것,
(3) 상기 사람 이두론산-2-설파타아제가 링커 서열 Gly-Ser을 개재하여 중쇄의 C 말단측에서 결합해서 이루어진 결합체와, 경쇄로 이루어지고, 상기 결합체의 아미노산 서열이 서열 번호 17로 나타내어지는 것이고, 상기 경쇄의 아미노산 서열이 서열 번호 6으로 나타내어지는 것, 을 들 수 있다.
상기 (A) 또는 (B)로 나타내어지는 수성 의약 조성물에 있어서, 사람화 항 hTfR 항체와 hI2S의 융합 단백질의 바람직한 농도는, 0.5 내지 20mg/mL, 1.0 내지 10mg/mL, 2.0 내지 10mg/mL 또는 2.0 내지 6.0mg/mL이고, 적절하게, 2.5mg/mL, 5.0mg/mL 등으로 조정된다.
상기 (A) 또는 (B)로 나타내어지는 수성 의약 조성물에 있어서, 염화 나트륨의 바람직한 농도는, 0.3 내지 1.2mg/mL, 0.5 내지 1.0mg/mL, 0.6 내지 1.0mg/mL 또는 0.7 내지 0.9mg/mL이고, 예를 들면, 0.8mg/mL이다.
상기 (A) 또는 (B)로 나타내어지는 수성 의약 조성물에 있어서, 수크로오스의 바람직한 농도는, 50 내지 100mg/mL, 55 내지 95mg/mL, 60 내지 90mg/mL 또는 70 내지 80mg/mL이고, 예를 들면, 75mg/mL이다.
상기 (A) 또는 (B)로 나타내어지는 수성 의약 조성물에 있어서, 비이온성 계면활성제로서는, 폴리소르베이트나 폴록사머 등을 단독으로 또는 이것들을 조합하여 사용할 수 있다. 폴리소르베이트로서는 폴리소르베이트 20, 폴리소르베이트 80이, 폴록사머로서는 폴록사머 188(폴리옥시에틸렌(160) 폴리옥시프로필렌(30) 글리콜)이 특히 적합하다. 또한, 그 농도는, 0.15 내지 3mg/mL인 것이 바람직하고, 0.15 내지 1mg/mL인 것이 보다 바람직하고, 0.2 내지 0.8mg/mL인 것이 더욱 바람직하고, 0.3 내지 0.8mg/mL인 것이 보다 더 바람직하고, 예를 들면, 0.325mg/mL 및 0.65mg/mL이다.
상기 (A) 또는 (B)로 나타내어지는 수성 의약 조성물에 있어서 사용되는 완충제는, 약제학적으로 허용할 수 있는 것인 한 특별히 한정은 없지만, 인산 완충제가 바람직하다. 완충제로서 인산 완충제가 사용되는 경우, 그 농도는, 바람직하게는 3 내지 30mM이고, 보다 바람직하게는 10 내지 30mM이고, 더욱 바람직하게는 15 내지 25mM이고, 예를 들면 20mM이다. 또한, 완충제에 의해서 조정되는 수성 의약 조성물의 pH는, 바람직하게는 5.5 내지 7.5이고, 보다 바람직하게는 5.5 내지 7.0이고, 더욱 바람직하게는 6.0 내지 7.0이고, 보다 더 바람직하게는 6.2 내지 6.8이고, 예를 들면 6.5이다. 또한, 수성 의약 조성물의 생리 식염수에 대한 침투압비는, 0.9 내지 1.1로 조정된다.
항체와 사람 리소좀 효소의 융합 단백질이 사람화 항 hTfR 항체와 hI2S의 융합 단백질인 경우의, 수성 의약 조성물의 적합한 조성의 일례로서, 상기 융합 단백질의 농도가 5mg/mL이고, 염화 나트륨의 농도가 0.8mg/mL이고, 수크로오스의 농도가 75mg/mL이고, 비이온성 계면활성제의 농도가 0.65mg/mL이고, 인산 완충제의 농도가 20mM인 것을 들 수 있다. 이 수성 의약 조성물에 있어서, pH는 바람직하게는 6.0 내지 7.0, 보다 바람직하게는 6.2 내지 6.8로, 또한, 생리 식염수에 대한 침투압비는 0.9 내지 1.1로 조정된다. 또한, 비이온성 계면활성제는, 바람직하게는 폴리소르베이트 또는 폴록사머이고, 폴리소르베이트로서는 폴리소르베이트 20 또는 폴리소르베이트 80이, 폴록사머로서는 폴록사머 188(폴리옥시에틸렌(160) 폴리옥시프로필렌(30) 글리콜)을 적합하게 사용할 수 있다. 이것들 중에서도 특히 폴록사머 188을 비이온성 계면활성제로서 적합하게 사용할 수 있다.
항체와 사람 리소좀 효소의 융합 단백질이 사람화 항 hTfR 항체와 hI2S의 융합 단백질인 경우의, 다른 수성 의약 조성물의 적합한 조성의 추가적인 일례로서, 상기 융합 단백질의 농도가 2.5mg/mL이고, 염화 나트륨의 농도가 0.8mg/mL이고, 수크로오스의 농도가 75mg/mL이고, 비이온성 계면활성제의 농도가 0.325mg/mL이고, 인산 완충제의 농도가 20mM인 것을 들 수 있다. 이 수성 의약 조성물에 있어서, pH는 바람직하게는 6.0 내지 7.0, 보다 바람직하게는 6.2 내지 6.8로, 또한, 생리 식염수에 대한 침투압비는 0.9 내지 1.1로 조정된다. 또한, 비이온성 계면활성제는, 바람직하게는 폴리소르베이트 또는 폴록사머이고, 폴리소르베이트로서는 폴리소르베이트 20 또는 폴리소르베이트 80이, 폴록사머로서는 폴록사머 188(폴리옥시에틸렌(160) 폴리옥시프로필렌(30) 글리콜)을 적합하게 사용할 수 있고, 특히 폴록사머 188이 적합하다.
항체와 사람 리소좀 효소의 융합 단백질을 유효 성분으로 하는 본 발명의 수성 의약 조성물은, 주사제로서 정맥 내, 근육 내, 복강 내 또는 피하에 투여할 수 있다. 본 발명의 수성 의약 조성물은, 바이알에 충전한 형태로 해도 좋고, 주사기에 미리 충전한 것인 프리필드형 제제로서 공급할 수도 있다.
실시예
이하, 실시예를 참조하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하지만, 본 발명이 실시예에 한정되는 것은 의도하지 않는다.
〔실시예 1〕 hI2S-사람화 항 hTfR 항체 융합 단백질 발현용 벡터의 구축
hI2S-사람화 항 hTfR 항체 융합 단백질 발현용 벡터는, 서열 번호 2로 나타내어지는 아미노산 서열을 갖는 경쇄와 서열 번호 8로 나타내어지는 아미노산 서열을 갖는 중쇄로 이루어진 사람화 항 hTfR 항체 번호 1, 서열 번호 4로 나타내어지는 아미노산 서열을 갖는 경쇄와 서열 번호 9로 나타내어지는 아미노산 서열을 갖는 중쇄로 이루어진 사람화 항 hTfR 항체 번호 2, 서열 번호 6으로 나타내어지는 아미노산 서열을 갖는 경쇄와 서열 번호 10으로 나타내어지는 아미노산 서열을 갖는 중쇄로 이루어진 사람화 항 hTfR 항체 번호 3의, 3종류의 사람화 항 hTfR 항체(번호 1 내지 3)를 코드하는 유전자를 사용하여 구축했다.
pEF/myc/nuc 벡터(Invitrogen사)를, KpnI와 NcoI로 소화하고, EF-1α 프로모터 및 그 제1 인트론을 포함하는 영역을 잘라내고, 이것을 T4 DNA 폴리메라아제로 평활 말단화 처리했다. pCI-neo(Invitrogen사)를, BglII 및 EcoRI로 소화하고, CMV의 인핸서/프로모터 및 인트론을 포함하는 영역을 절제한 후에, T4 DNA 폴리메라아제로 평활 말단화 처리했다. 이것에, 상기의 EF-1α 프로모터 및 그 제1 인트론을 포함하는 영역을 삽입하여, pE-neo 벡터를 구축했다. pE-neo 벡터를, SfiI 및 BstXI로 소화하고, 네오마이신 내성 유전자를 포함한 약 1kbp의 영역을 절제했다. pcDNA3.1/Hygro(+)(Invitrogen사)를 주형으로 해서 프라이머 Hyg-Sfi5'(서열 번호 11) 및 프라이머 Hyg-BstX3'(서열 번호 12)를 사용하여, PCR 반응에 의해 하이그로마이신 유전자를 증폭했다. 증폭한 하이그로마이신 유전자를, SfiI 및 BstXI로 소화하고, 상기의 네오마이신 내성 유전자를 절제한 pE-neo 벡터에 삽입했다. 얻어진 벡터를 pE-hygr 벡터로 했다.
서열 번호 2로 나타내어지는 아미노산 서열을 갖는 사람화 항 hTfR 항체 번호 1의 경쇄의 전체 길이를 코드하는 유전자를 포함하는 DNA 단편(서열 번호 3)을 합성했다. 이 DNA 단편의 5'측에는 MluI 서열을, 3'측에는 NotI 서열을 도입했다. 이 DNA 단편을 MluI와 NotI로 소화하고, pE-hygr 벡터의 MluI-NotI의 사이에 편입했다. 얻어진 벡터를 사람화 항 hTfR 항체 번호 1의 경쇄 발현용 벡터인 pE-hygr(LC1)로 했다.
서열 번호 4로 나타내어지는 아미노산 서열을 갖는 사람화 항 hTfR 항체 번호 2의 경쇄의 전체 길이를 코드하는 유전자를 포함하는 DNA 단편(서열 번호 5)을 합성했다. 이 DNA 단편의 5'측에는 MluI 서열을, 3'측에는 NotI 서열을 도입했다. 이 DNA 단편을 MluI와 NotI로 소화하고, pE-hygr 벡터의 MluI-NotI의 사이에 편입했다. 얻어진 벡터를, 사람화 항 hTfR 항체 번호 2의 경쇄 발현용 벡터인 pE-hygr(LC2)로 했다.
서열 번호 6으로 나타내어지는 아미노산 서열을 갖는 사람화 항 hTfR 항체 번호 3의 경쇄의 전체 길이를 코드하는 유전자를 포함하는 DNA 단편(서열 번호 7)을 합성했다. 이 DNA 단편의 5'측에는 MluI 서열을, 3'측에는 NotI 서열을 도입했다. 이 DNA 단편을 MluI와 NotI로 소화하고, pE-hygr 벡터의 MluI-NotI의 사이에 편입했다. 얻어진 벡터를, 사람화 항 hTfR 항체 번호 3의 경쇄 발현용 벡터인 pE-hygr(LC3)로 했다.
서열 번호 8로 나타내어지는 아미노산 서열을 갖는 사람화 항 hTfR 항체 번호 1의 중쇄의 C 말단측에 (Gly-Ser)의 아미노산 서열을 갖는 링커를 개재하여 서열 번호 1로 나타내어지는 아미노산 서열을 갖는 hI2S를 결합시킨 단백질을 코드하는 유전자를 포함하는, 서열 번호 14로 나타내어지는 염기 서열을 갖는 DNA 단편을 인공적으로 합성했다. 이 DNA 단편은, 서열 번호 13으로 나타내어지는 아미노산 서열을 갖는 사람화 항 hTfR 항체 번호 1의 중쇄와 hI2S를 결합시킨 단백질을 코드한다. 이 DNA 단편을 MluI와 NotI로 소화하고, pE-neo 벡터의 MluI와 NotI의 사이에 편입하여, pE-neo(HC-I2S-1)를 구축했다.
서열 번호 9로 나타내어지는 아미노산 서열을 갖는 사람화 항 hTfR 항체 번호 2의 중쇄의 C 말단측에 (Gly-Ser)의 아미노산 서열을 갖는 링커를 개재하여 서열 번호 1로 나타내어지는 아미노산 서열을 갖는 hI2S를 결합시킨 단백질을 코드하는 유전자를 포함하는, 서열 번호 16으로 나타내어지는 염기 서열을 갖는 DNA 단편을 인공적으로 합성했다. 이 DNA 단편은, 서열 번호 15로 나타내어지는 아미노산 서열을 갖는 사람화 항 hTfR 항체 번호 2의 중쇄와 hI2S를 결합시킨 단백질을 코드한다. 이 DNA 단편을 MluI와 NotI로 소화하고, pE-neo 벡터의 MluI와 NotI의 사이에 편입하여, pE-neo(HC-I2S-2)를 구축했다.
서열 번호 10으로 나타내어지는 아미노산 서열을 갖는 사람화 항 hTfR 항체 번호 3의 중쇄의 C 말단측에 (Gly-Ser)의 아미노산 서열을 갖는 링커를 개재하여 서열 번호 1로 나타내어지는 아미노산 서열을 갖는 hI2S를 결합시킨 단백질을 코드하는 유전자를 포함하는, 서열 번호 18로 나타내어지는 염기 서열을 갖는 DNA 단편을 인공적으로 합성했다. 이 DNA 단편은, 서열 번호 17로 나타내어지는 아미노산 서열을 갖는 사람화 항 hTfR 항체 번호 3의 중쇄와 hI2S를 결합시킨 단백질을 코드한다. 이 DNA 단편을 MluI와 NotI로 소화하고, pE-neo 벡터의 MluI와 NotI의 사이에 편입하여, pE-neo(HC-I2S-3)를 구축했다.
〔실시예 2〕 hI2S-사람화 항 hTfR 항체 융합 단백질의 고발현 세포주의 제작
CHO 세포(CHO-K1: American Type Culture Collection으로부터 입수)를, 하기의 방법에 의해, GenePulser(Bio-Rad사)를 사용하여, 실시예 1에서 구축한 pE-hygr(LC1)과 pE-neo(HC-I2S-1)의 조합, pE-hygr(LC2)과 pE-neo(HC-I2S-2)의 조합, 및 pE-hygr(LC3)과 pE-neo(HC-I2S-3)의 조합으로, 각각 형질 전환했다. 세포의 형질 전환은 대체로 이하의 방법으로 행했다.
5×105개의 CHO-K1 세포를 CD OptiCHO™ 배지(Thermo Fisher Scientific사)를 첨가한 3.5cm 배양 디쉬에 파종하고, 37℃, 5% CO2의 조건 하에서 하룻밤 배양했다. 배양 후, 세포를 5×106세포/mL의 밀도가 되도록 Opti-MEM™I 배지(Thermo Fisher Scientific사)에서 현탁했다. 세포 현탁액 100μL를 채취하여, 이것에 CD OptiCHO™ 배지에서 100μg/mL로 희석한 pE-hygr(LC1) 및 pE-neo(HC-I2S-1) 플라스미드 DNA 용액을 5μL씩 첨가했다. GenePulser(Bio-Rad사)를 사용하여, 일렉트로포레이션을 실시하고, 세포에 플라스미드를 도입했다. 37℃, 5% CO2의 조건 하에서 하룻밤 배양한 후, 세포를, 0.5mg/mL의 하이그로마이신 및 0.8mg/mL의 G418을 포함하는 CD OptiCHO™ 배지에서 선택 배양했다. pE-hygr(LC2) 및 pE-neo(HC-I2S-2)의 조합, pE-hygr(LC2) 및 pE-neo(HC-I2S-3)의 조합에서도 동일하게 하여 세포를 형질 전환시켰다.
이어서, 한계 희석법에 의해, 1웰당 1개 이하의 세포가 파종되도록, 96웰 플레이트 위에 선택 배양에서 선택된 세포를 파종하여, 각 세포가 단클론 콜로니를 형성할 때까지 약 10일간 배양했다. 단클론 콜로니가 형성된 웰의 배양 상청을 채취하고, 사람화 항체 함량을 ELISA법으로 정량하여, hI2S-사람화 항 hTfR 항체 융합 단백질의 고발현 세포주를 선택했다.
이때의 ELISA법은 대체로 이하의 방법으로 실시했다. 96웰 마이크로타이터 플레이트(Nunc사)의 각 웰에, 염소 항사람 IgG 폴리클로날 항체 용액을 0.05M 탄산수소염 완충액(pH9.6)으로 4μg/mL로 희석한 것을 100μL씩 첨가하고, 실온에서 적어도 1시간 정치하여 항체를 플레이트에 흡착시켰다. 이어서, 인산 완충 생리 식염수(pH7.4)에 0.05% Tween20을 첨가한 것(PBS-T)으로 각 웰을 3회 세정 후, Starting Block(PBS) Blocking Buffer(Thermo Fisher Scientific사)를 각 웰에 200μL씩 첨가하고 플레이트를 실온에서 30분 정치했다. 이어서, 각 웰을 PBS-T로 3회 세정한 후, 0.5% BSA 및 0.05% Tween20을 포함하는 인산 완충 생리 식염수(pH7.4)(PBS-BT)로 적당한 농도로 희석한 배양 상청 또는 사람 IgG 표준품을, 각 웰에 100μL씩 첨가하고, 플레이트를 실온에서 적어도 1시간 정치했다. 이어서, 플레이트를 PBS-T로 3회 세정한 후, PBS-BT로 희석한 HRP 표지 항사람 IgG 폴리클로날 항체 용액을, 각 웰에 100μL씩 첨가하고, 플레이트를 실온에서 적어도 1시간 정치했다. PBS-T로 각 웰을 3회 세정 후, 0.4mg/mL o-페닐렌디아민을 포함한 인산-시트르산 완충액(pH5.0)을 100μL씩 각 웰에 첨가하여, 실온에서 8 내지 20분간 정치했다. 이어서, 1mol/L 황산을 100μL씩 각 웰에 첨가하여, 반응을 정지시켜서, 96웰 플레이트 리더를 사용하여 490nm에서의 흡광도를 측정했다. 높은 측정값을 나타낸 웰에 대응하는 세포를, hI2S-사람화 항 hTfR 항체 융합 단백질의 고발현 세포주로서 선택했다.
pE-hygr(LC1)과 pE-neo(HC-I2S-1)의 조합으로 형질 전환시켜서 얻어진 hI2S-사람화 항 hTfR 항체 융합 단백질의 고발현 세포주를, hI2S-항 hTfR 항체 발현주 1로 했다. 이 세포주가 발현하는 hI2S와 사람화 항 hTfR 항체의 융합 단백질을 I2S-항 hTfR 항체 1로 했다.
pE-hygr(LC2)과 pE-neo(HC-I2S-2)의 조합으로 형질 전환시켜서 얻어진 hI2S-사람화 항 hTfR 항체 융합 단백질의 고발현 세포주를, hI2S-항 hTfR 항체 발현주 2로 했다. 이 세포주가 발현하는 hI2S와 사람화 항 hTfR 항체의 융합 단백질을 I2S-항 hTfR 항체 2로 했다.
pE-hygr(LC3)과 pE-neo(HC-I2S-3)의 조합으로 형질 전환시켜서 얻어진 hI2S-사람화 항 hTfR 항체 융합 단백질의 고발현 세포주를, hI2S-항 hTfR 항체 발현주 3으로 했다. 이 세포주가 발현하는 hI2S와 사람화 항 hTfR 항체의 융합 단백질을 I2S-항 hTfR 항체 3으로 했다.
〔실시예 3〕 hI2S-항 hTfR 항체 발현주의 배양
I2S-항 hTfR 항체를, 이하의 방법으로 제조했다. 실시예 2에서 얻은 hI2S-항 hTfR 항체 발현주 3을, 세포 밀도가 약 2×105개/mL가 되도록, 4mM L-알라닐-L-글루타민, 100μmol/L 히포크산틴 및 16μmol/L 티미딘을 함유하는, 약 200L의 무혈청 배지(EX-CELL Advanced CHO Fed-batch Medium, Sigma Aldrich사)에 현탁시켰다. 이 세포 현탁액의 140L를 배양조로 옮겼다. 배지를 임펠러로 89rpm의 속도로 교반하여, 배지의 용존 산소 농도를 약 40%로 유지하고, 34 내지 37℃의 온도 범위에서, 약 11일간 세포를 배양했다. 배양 기간 중, 세포수, 세포의 생존률, 배지의 글루코오스 농도 및 젖산 농도를 감시했다. 배지의 글루코오스 농도가 15mmol/L 미만이 된 경우에는, 즉시 글루코오스 농도가 약 38mmol/L가 되도록, 글루코오스 용액을 배지에 첨가했다. 배양 종료 후에 배지를 회수했다. 회수한 배지를, Millistak+HC Pod Filter grade D0HC(Merck사)로 여과하고, 추가로 Millistak+ HCgrade X0HC(Merck사)로 여과하여, I2S-항 hTfR 항체 3을 포함한 배양 상청을 얻었다. 이 배양 상청을, Pellicon™ 3 Cassette w/Ultracel PLCTK Membrane(구멍 지름: 30kDa, 막 면적: 1.14㎡, Merck사)을 사용하여 한외 여과하고, 액량이 약 17분의 1이 될 때까지 농축했다. 이어서, 이 농축액을 Opticap XL600(0.22μm, Merck사)을 사용하여 여과했다. 얻어진 액을 농축 배양 상청으로 했다.
〔실시예 4〕 바이러스의 불활화
실시예 3에서 얻은 농축 배양 상청에, 트리N-부틸인산(TNBP) 및 폴리소르베이트 80을, 최종 농도가 각각 0.3%(v/v) 및 1%(w/v)가 되도록 첨가하고, 실온에서 4시간 온화하게 교반했다. 이 공정은 배양 상청 중에 혼입되는 바이러스를 불활화시키기 위한 것이다. 단, 생물 유래의 성분을 포함하지 않는 무혈청 배지를 사용하여 배양을 하는 한, 바이러스의 불활화 공정이 없어도 배양 상청 중에 인체에 유해한 바이러스가 혼입될 가능성은 거의 없다.
〔실시예 5〕 hI2S-항 hTfR 항체의 정제
바이러스 불활화 후의 농축 배양 상청을, 0.5배용(倍容)의 140mM NaCl을 함유하는 20mM Tris-HCl 완충액(pH7.0)을 첨가한 후에, Millipak-200 Filter Unit(구멍 지름: 0.22μm, Merck사)으로 여과했다. 이 여과 후의 용액을, 컬럼 체적의 4배용의 140mM NaCl을 함유하는 20mM Tris-HCl 완충액(pH7.0)으로 평형화한, 프로틴 A 어피니티 컬럼인 MabSelect SuRe LX 컬럼(컬럼 체적: 약 3.2L, 베드 높이: 약 20cm, GE Healthcare사)에, 200cm/hr의 일정 유속으로 부하하여, I2S-항 hTfR 항체 3을 프로틴 A에 흡착시켰다.
이어서, 컬럼 체적의 5배용의 500mM NaCl 및 450mM 아르기닌을 함유하는 10mM Tris-HCl 완충액(pH7.0)을 동일 유속으로 공급하여 컬럼을 세정했다. 이어서 컬럼 체적의 2.5배용의 140mM NaCl을 함유하는 20mM Tris-HCl 완충액(pH7.0)을 동일 유속으로 공급하여 컬럼을 추가로 세정했다. 이어서, 컬럼 체적의 5배용의 140mM NaCl을 함유하는 100mM 글리신 완충액(pH3.5)으로, 프로틴 A에 흡착된 I2S-항 hTfR 항체 3을 용출시켰다. 용출액은, 미리 1M Tris-HCl 완충액(pH7.5)에 넣어 둔 용기에 받아서, 즉시 중화했다.
상기의 프로틴 A 어피니티 컬럼으로부터의 용출액에, 200mM 인산 완충액(pH 7.0)과, 4M NaCl 및 2mM 인산 완충액을 함유하는 10mM MES 완충액(pH7.3)과, 1M Tris-HCl 완충액(pH8.0)을 순차 첨가하여, 용출액에 포함되는 인산나트륨 및 NaCl의 농도를, 각각 2mM 및 215mM로 조정하는 동시에, 용출액의 pH를 7.3으로 조정했다. 이어서, 이 용출액을, Opticap XL600(구멍 지름: 0.22μm, Merck사)으로 여과했다. 이 여과 후의 용액을, 컬럼 체적의 4배용의 215mM NaCl 및 2mM 인산나트륨을 함유하는 10mM MES 완충액(pH7.3)으로 평형화한, 하이드록시아파타이트 컬럼인 CHT TypeII 40μm 컬럼(컬럼 체적: 약 3.2L, 베드 높이: 약 20cm, Bio-Rad사)에, 200cm/hr의 일정 유속으로 부하하여, I2S-항 hTfR 항체 3을 하이드록시아파타이트에 흡착시켰다.
이어서, 컬럼 체적의 5배용의 이 완충액을 동일 유속으로 공급하여 컬럼을 세정했다. 이어서, 컬럼 체적의 5배용의 215mM NaCl을 함유하는 35mM 인산 완충액(pH7.3)으로, 하이드록시아파타이트에 흡착된 I2S-항 hTfR 항체 3을 용출시켰다. 또한, 하이드록시아파타이트 컬럼에서의 정제는, 프로틴 A 어피니티 컬럼으로부터의 용출액을 절반씩 사용하고, 2회에 걸쳐서 실시했다.
상기의 하이드록시아파타이트 컬럼으로부터의 용출액에, 희염산을 첨가하여 pH를 6.5로 조정했다. 이어서, Pellicon™ 3 Cassette w/Ultracel PLCTK Membrane(구멍 지름: 30kDa, 막 면적: 1.14㎡, Merck사)을 사용하여 한외 여과하고, 용액 중의 I2S-항 hTfR 항체 3의 농도가 약 2mg/mL가 될 때까지 농축했다. 이어서, 이 농축액을 Opticap XL600(0.22μm, Merck사)을 사용하여 여과했다.
상기의 농축액을, 컬럼 체적의 5배용의 0.8mg/mL NaCl 및 75mg/mL 수크로오스를 함유하는 20mM 인산 완충액(pH6.5)으로 평형화한, 사이즈 배제 컬럼인 Superdex 200 컬럼(컬럼 체적: 약 12.6L, 베드 높이: 40cm, GE Healthcare사)에, 19cm/hr의 일정 유속으로 부하하고, 추가로, 이 완충액을 동일 유속으로 공급했다. 이때, 사이즈 배제 컬럼으로부터의 용출액의 유로에, 용출액의 흡광도를 연속적으로 측정하기 위한 흡광 광도계를 배치하여, 280nm의 흡광도를 모니터하고, 280nm에서 흡수 피크를 나타낸 획분을, I2S-항 hTfR 항체 3을 포함한 획분으로서 회수하고, 이것을 I2S-항 hTfR 항체 정제품으로 했다. 또한, 사이즈 배제 컬럼에서의 정제는, 하이드록시아파타이트 컬럼으로부터의 용출액을 절반씩 사용하고, 2회에 걸쳐서 실시했다.
〔실시예 6〕 I2S-항 hTfR 항체를 함유하는 수성 의약 조성물의 안정성의 검토 1
실시예 5에서 얻은 I2S-항 hTfR 항체 정제품을 사용하여, 염화 나트륨, 인산 완충제, 수크로오스 및 폴록사머 188, 및 I2S-항 hTfR 항체를 함유하고, 폴록사머 188의 농도만이 다른 표 1에 나타내는 7종류의 수성 의약 조성물을 조제했다. 이들 7종류의 수성 의약 조성물(처방 A 내지 G)을, 각각 1mL씩 유리 바이알에 충전하고, 밀봉하여, 진탕기(SR-2S, 타이테크사)를 사용하여, 실온에서, 연속해서 6시간 또는 24시간 진탕시켰다(진탕 속도: 240왕복/분, 진폭: 40 mm). 진탕 후의 수성 의약 조성물 중에 포함된 단위 액량(200μL)당의 입자수(입자 직경: 1 내지 100μm)를, 실시예 8에 기재된 방법으로 측정했다. 또한, 진탕 후의 수성 의약 조성물 중에 포함된 I2S-항 hTfR 항체의 중합체의 함유율을, 실시예 9에 기재된 방법으로 측정했다.
수성 의약 조성물 중에 포함되는 입자수의 측정 결과를 도 1-1에 나타낸다. 폴록사머 188의 농도를 0.1mg/mL 이하로 했을 때는, 폴록사머 188의 농도를 0.25mg/mL 이상으로 했을 때와 비교하여, 진탕 6시간 후 및 24시간 후 중 어느 쪽에 있어서도, 수성 의약 조성물 중에 포함되는 1 내지 100μm의 입자 직경의 입자 수가 대폭 증가하는 것을 알 수 있었다. 추가로, 폴록사머 188의 농도가 0.25mg/mL 내지 5mg/mL의 범위에서 보면, 폴록사머 188의 농도를 0.25mg/mL 및 5mg/mL로 했을 때는, 폴록사머 188의 농도를 0.5 내지 2.5mg/mL로 했을 때와 비교하여, 수성 의약 조성물 중에 포함되는 1 내지 100μm의 입자 직경의 입자수가 증가하는 경향이 있었다(도 1-2). 특히, 진탕 24시간 후의 입자수는, 폴록사머 188의 농도를 1mg/mL로 했을 때에, 최소값을 나타냈다. 이러한 결과는, 1 내지 100μm의 입자 직경의 입자의 발생을 방지하기 위한 폴록사머 188의 최적 농도가 대략 1mg/mL인 것을 나타내는 것이다.
이어서, 수성 의약 조성물 중에 포함된 I2S-항 hTfR 항체의 중합체의 함유율의 측정 결과에 대하여 본다. 그 측정 결과를 도 2에 나타낸다. 폴록사머 188의 농도를 1mg/mL 이상으로 했을 때는, 진탕 6시간 후 및 24시간 후 중 어느 쪽에 있어서도, 수성 의약 조성물 중에 중합체는 거의 생기지 않았다. 폴록사머 188의 농도를 0.5mg/mL로 했을 때는, 진탕 6시간 후 및 24시간 후에서의 중합체의 함유율은, 각각 약 0.028% 및 0.15%로 미미한 것이었다. 그러나, 폴록사머 188의 농도를 0.25mg/mL로 했을 때는, 진탕 6시간 후 및 24시간 후에서의 중합체의 함유율은, 각각 약 0.24% 및 0.5%로 급격히 상승했다. 폴록사머 188의 농도를 0.1mg/mL로 했을 때는, 폴록사머 188의 농도를 0.25mg/mL로 했을 때와 비교하여, 더욱 중합체의 함유율이 증가했다. 이러한 결과는, 진탕 6시간 후 및 24시간 후에서의 중합체의 증가를 방지하기 위한 폴록사머 188의 최적 농도가 0.5mg/mL보다 높은 것을 나타내는 것이고, 특히 1.0mg/mL 이상인 것을 나타내는 것이다.
이상의 결과로부터, I2S-항 hTfR 항체의 중합체의 발생을 억제하기 위해서 효과적인, 수성 의약 조성물에서의 폴록사머 188의 농도는, 1mg/mL 이상인 것이 유도된다. 단, 수성 의약 조성물은 약제로서 사람에게 투여되어야 하는 것이기 때문에, 폴록사머 188의 농도는 낮게 설정되는 것이 바람직하다. 이러한 사정도 감안하면, 수성 의약 조성물에서의 폴록사머 188의 적합한 농도는, 0.15 내지 3mg/mL의 범위에 있고, 보다 적합한 농도는, 0.3 내지 2mg/mL의 범위에 있다고 결론지어진다.
Figure pct00001
〔실시예 7〕 I2S-항 hTfR 항체를 함유하는 수성 의약 조성물의 안정성의 검토 2
실시예 5에서 얻은 I2S-항 hTfR 항체 정제품을 사용하여, 염화 나트륨, 인산 완충제, 수크로오스 및 폴록사머 188, 및 I2S-항 hTfR 항체를 함유하고, pH가 다른 표 2에 나타내는 3종류(처방 H 내지 J)의 수성 의약 조성물을 조제했다. 추가로, 처방 H 내지 J와 비교하여, I2S-항 hTfR 항체 및 폴록사머 188을 2분의 1의 농도로 함유하는 3종류(처방 K 내지 M)의 수성 의약 조성물을 조제했다. 이들 종류의 수성 의약 조성물을, 처방 H 내지 J에 대해서는 2mL씩, 처방 K 내지 M에 대해서는 4mL씩 유리 바이알에 충전하고, 밀봉하여, 5℃에서 1주간, 25℃에서 1주간, 40℃에서 1주간, 및 50℃에서 24시간, 어두운 곳에서 정치했다. 이어서, 각 수성 의약 조성물 중에 포함된 I2S-항 hTfR 항체의 중합체의 함유율을, 실시예 9에 기재한 방법으로 측정했다. 추가로, 각 수성 의약 조성물 중에 포함된 I2S-항 hTfR 항체의 분해물의 함유율을, 실시예 10에 기재된 방법으로 측정했다.
처방 H 내지 J에 대하여, 수성 의약 조성물 중에 포함된, I2S-항 hTfR 항체의 중합체 및 분해물의 함유율의 측정 결과를, 각각 도 3 및 도 4에 나타낸다. I2S-항 hTfR 항체의 중합체의 함유율은, pH6 내지 7의 범위이고, pH가 상승함에 따라서 증가하는 경향이 있었다(도 3). 한편, I2S-항 hTfR 항체의 분해물의 함유율은, pH가 상승함에 따라서 감소하는 경향이 있었다(도 4).
처방 K 내지 M에 대하여, 수성 의약 조성물 중에 포함된 I2S-항 hTfR 항체의, 중합체의 함유율 및 분해물의 함유율의 측정 결과를, 각각 도 5 및 도 6에 나타낸다. 처방 K 내지 M에 대해서도, 처방 H 내지 J와 마찬가지로, I2S-항 hTfR 항체의 중합체의 함유율은, pH6 내지 7의 범위에서, pH가 상승함에 따라서 증가하는 경향이 있고(도 5), 한편, I2S-항 hTfR 항체의 분해물의 함유율은, pH가 상승함에 따라서 감소하는 경향이 있었다(도 6).
이상의 결과에서 나타내어지는 바와 같이, 수성 의약 조성물의 pH를 pH7로 했을 때는, pH를 pH6 및 6.5로 한 경우와 비교하여 중합체의 함유율이 커지는 경향이 있고, 수성 의약 조성물의 pH를 pH6으로 했을 때는, pH를 pH6.5 및 7로 한 경우와 비교하여 분해물의 함유율이 커지는 경향이 있다. 따라서, I2S-항 hTfR 항체의 중합체의 발생을 억제하고, 또한, I2S-항 hTfR 항체의 분해를 억제하기 위해서 효과적인, 수성 의약 조성물의 최적 pH는, 대략 pH6.5라고 결론지어진다.
Figure pct00002
〔실시예 8〕 수성 의약 조성물 중에 포함되는 입자수(입자 직경: 1 내지 100μm)의 측정
수성 의약 조성물 중에 포함되는 입자수의 측정은, 플로우 이미징 입자 해석 장치인 FlowCAM™(플루이드 이미징 테크놀로지즈사)을 사용하여 행했다. 플로우 이미징 입자 해석 장치는, 샘플 용액을 실린지 펌프에 의해서 광학계와 직교하는 플로우 셀에 끌어들여, 플로우 셀 안을 통과하는 입자를 리얼 타임으로 촬영함으로써, 샘플 용액 중에 포함된 입자수를 측정할 수 있는 장치이다. 측정은, 검지해야 할 입자 사이즈를 1 내지 100μm로 설정하여 행했다.
〔실시예 9〕 수성 의약 조성물 중에 포함되는 I2S-항 hTfR 항체의 중합체의 함유율의 측정
시마즈 HPLC 시스템 LC-20A(시마즈 세이사쿠쇼)에, 사이즈 배제 컬럼 크로마토그래피 컬럼인 TSKgel UltraSW Aggregate 3μm 컬럼(7.8mm 지름×30cm 길이, TOSOH사)을 세트했다. 또한, 컬럼의 하류에 흡광 광도계를 설치하여, 컬럼으로부터의 유출액의 흡광도(측정 파장 215nm)를 연속하여 측정할 수 있도록 했다. 0.2M 인산나트륨 완충 수용액으로 컬럼을 평형화시킨 후, 3 내지 20μg의 I2S-항 hTfR 항체를 함유하는 샘플 용액을 컬럼에 부하하고, 추가로 0.2M 인산나트륨 완충 수용액을 0.5mL/분의 유속으로 흘렸다. 이 사이, 컬럼으로부터의 유출액의 흡광도(측정 파장 215nm)를 측정함으로써, 용출 프로필을 얻었다. 얻어진 용출 프로필로부터, I2S-항 hTfR 항체의 단량체의 피크 면적(단량체 피크 면적)과, 이 단량체 피크보다 먼저 나타내어지는 I2S-항 hTfR 항체의 중합체의 피크 면적(중합체 피크 면적)을 구했다. 중합체의 함유율(%)을 다음 식으로 구했다.
중합체의 함유율(%)={중합체 피크 면적/(단량체 피크 면적+중합체 피크 면적)}×100
〔실시예 10〕 수성 의약 조성물 중에 포함된 I2S-항 hTfR 항체의 분해물의 함유율의 측정
시마즈 HPLC 시스템 LC-20A(시마즈 세이사쿠쇼)에, 사이즈 배제 컬럼 크로마토그래피 컬럼인 TSKgel UltraSW Aggregate 3μm 컬럼(7.8mm 지름×30cm 길이, TOSOH사)을 세트했다. 또한, 컬럼의 하류에 흡광 광도계를 설치하여, 컬럼으로부터의 유출액의 흡광도(측정 파장 215nm)를 연속하여 측정할 수 있도록 했다. 0.2M 인산나트륨 완충 수용액으로 컬럼을 평형화시킨 후, 3 내지 20μg의 I2S-항 hTfR 항체를 함유하는 샘플 용액을 컬럼에 부하하고, 추가로 0.2M 인산나트륨 완충 수용액을 0.5mL/분의 유속으로 흘렸다. 이 사이, 컬럼으로부터의 유출액의 흡광도(측정 파장 215nm)를 측정함으로써, 용출 프로필을 얻었다. 얻어진 용출 프로필로부터, I2S-항 hTfR 항체의 단량체의 피크 면적(단량체 피크 면적)과, 이 단량체 피크보다 나중에 나타내어지는 I2S-항 hTfR 항체의 분해물의 피크 면적(분해물 피크 면적)을 구했다. 분해물의 함유율(%)을 다음 식으로 구했다.
분해물의 함유율(%)={분해물 피크 면적/(단량체 피크 면적+분해물 피크 면적)}×100
〔실시예 11〕 수성 의약 조성물의 제제 설계
상기의 실시예 6 및 7에서 나타낸 검토 결과를 바탕으로, I2S-항 hTfR 항체를 함유하는 수성 의약 조성물의 제제 실시예로서, 표 3에 나타내는 조성을 갖는 것(처방 O 및 P)을 설계할 수 있다. 이 수성 의약 조성물은, 1 내지 10mL의 액량으로, 유리제 또는 플라스틱제의 바이알, 앰플 또는 주사기에 충전·봉입되어, 저온(예를 들어 4℃)에서 저장된다. 주사기에 충전·봉입된 것은 프리필드 실린지형의 제제가 된다.
Figure pct00003
[산업상의 이용 가능성]
본 발명에 의하면, 항체와 리소좀 효소를 결합시킨 단백질을 유효 성분으로서 함유하여 이루어진 수성 의약 조성물을, 시장에 안정적으로 제공할 수 있다.
[서열표 프리 텍스트]
서열 번호 2: 사람화 항 hTfR 항체 번호 1의 경쇄의 아미노산 서열
서열 번호 3: 사람화 항 hTfR 항체 번호 1의 경쇄를 코드하는 염기 서열을 포함하는 염기 서열, 합성 서열
서열 번호 4: 사람화 항 hTfR 항체 번호 2의 경쇄의 아미노산 서열
서열 번호 5: 사람화 항 hTfR 항체 번호 2의 경쇄를 코드하는 염기 서열을 포함하는 염기 서열, 합성 서열
서열 번호 6: 사람화 항 hTfR 항체 번호 3의 경쇄의 아미노산 서열
서열 번호 7: 사람화 항 hTfR 항체 번호 3의 경쇄를 코드하는 염기 서열을 포함하는 염기 서열, 합성 서열
서열 번호 8: 사람화 항 hTfR 항체 번호 1의 중쇄의 아미노산 서열
서열 번호 9: 사람화 항 hTfR 항체 번호 2의 중쇄의 아미노산 서열
서열 번호 10: 사람화 항 hTfR 항체 번호 3의 중쇄의 아미노산 서열
서열 번호 11: 프라이머 Hyg-Sfi5', 합성 서열
서열 번호 12: 프라이머 Hyg-BstX3', 합성 서열
서열 번호 13: 항 hTfR 항체 번호 1의 중쇄와 I2S의 융합 단백질의 아미노산 서열
서열 번호 14: 항 hTfR 항체 번호 1의 중쇄와 I2S의 융합 단백질을 코드하는 염기 서열, 합성 서열
서열 번호 15: 항 hTfR 항체 번호 2의 중쇄와 I2S의 융합 단백질의 아미노산 서열
서열 번호 16: 항 hTfR 항체 번호 2의 중쇄와 I2S의 융합 단백질을 코드하는 염기 서열, 합성 서열
서열 번호 17: 항 hTfR 항체 번호 3의 중쇄와 hI2S의 융합 단백질의 아미노산 서열
서열 번호 18: 항 hTfR 항체 번호 3의 중쇄와 hI2S의 융합 단백질을 코드하는 염기 서열, 합성 서열
서열 번호 19: 링커의 아미노산 서열의 예 1
서열 번호 20: 링커의 아미노산 서열의 예 2
서열 번호 21: 링커의 아미노산 서열의 예 3
서열 번호 23: 사람화 항 hTfR 항체 번호 1의 경쇄의 가변 영역의 아미노산 서열
서열 번호 24: 사람화 항 hTfR 항체 번호 1의 중쇄의 가변 영역의 아미노산 서열
서열 번호 25: 사람화 항 hTfR 항체 번호 2의 경쇄의 가변 영역의 아미노산 서열
서열 번호 26: 사람화 항 hTfR 항체 번호 2의 중쇄의 가변 영역의 아미노산 서열
서열 번호 27: 사람화 항 hTfR 항체 번호 3의 경쇄의 가변 영역의 아미노산 서열
서열 번호 28: 사람화 항 hTfR 항체 번호 3의 중쇄의 가변 영역의 아미노산 서열
<110> JCR Pharmaceuticals Co., Ltd. <120> Aqueous Pharmaceutical Composition <130> 1208JP <160> 28 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 525 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Ser Glu Thr Gln Ala Asn Ser Thr Thr Asp Ala Leu Asn Val Leu Leu 1 5 10 15 Ile Ile Val Asp Asp Leu Arg Pro Ser Leu Gly Cys Tyr Gly Asp Lys 20 25 30 Leu Val Arg Ser Pro Asn Ile Asp Gln Leu Ala Ser His Ser Leu Leu 35 40 45 Phe Gln Asn Ala Phe Ala Gln Gln Ala Val Cys Ala Pro Ser Arg Val 50 55 60 Ser Phe Leu Thr Gly Arg Arg Pro Asp Thr Thr Arg Leu Tyr Asp Phe 65 70 75 80 Asn Ser Tyr Trp Arg Val His Ala Gly Asn Phe Ser Thr Ile Pro Gln 85 90 95 Tyr Phe Lys Glu Asn Gly Tyr Val Thr Met Ser Val Gly Lys Val Phe 100 105 110 His Pro Gly Ile Ser Ser Asn His Thr Asp Asp Ser Pro Tyr Ser Trp 115 120 125 Ser Phe Pro Pro Tyr His Pro Ser Ser Glu Lys Tyr Glu Asn Thr Lys 130 135 140 Thr Cys Arg Gly Pro Asp Gly Glu Leu His Ala Asn Leu Leu Cys Pro 145 150 155 160 Val Asp Val Leu Asp Val Pro Glu Gly Thr Leu Pro Asp Lys Gln Ser 165 170 175 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Ala Gly Leu Ala Gly Leu Gln Val Pro Pro Arg Cys Pro Val Pro 385 390 395 400 Ser Phe His Val Glu Leu Cys Arg Glu Gly Lys Asn Leu Leu Lys His 405 410 415 Phe Arg Phe Arg Asp Leu Glu Glu Asp Pro Tyr Leu Pro Gly Asn Pro 420 425 430 Arg Glu Leu Ile Ala Tyr Ser Gln Tyr Pro Arg Pro Ser Asp Ile Pro 435 440 445 Gln Trp Asn Ser Asp Lys Pro Ser Leu Lys Asp Ile Lys Ile Met Gly 450 455 460 Tyr Ser Ile Arg Thr Ile Asp Tyr Arg Tyr Thr Val Trp Val Gly Phe 465 470 475 480 Asn Pro Asp Glu Phe Leu Ala Asn Phe Ser Asp Ile His Ala Gly Glu 485 490 495 Leu Tyr Phe Val Asp Ser Asp Pro Leu Gln Asp His Asn Met Tyr Asn 500 505 510 Asp Ser Gln Gly Gly Asp Leu Phe Gln Leu Leu Met Pro 515 520 525 <210> 2 <211> 214 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence of the light-chain of humanized anti-hTfR antibody No. 1 <400> 2 Asp Ile Gln Val Thr Gln Ser Pro Ser Phe Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Asn Ser Ala 20 25 30 Val Ala Trp Phe Gln Gln 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anti-hTfR antibody No. 2 <400> 4 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Asp Phe Gln Ser Val Thr Pro Lys 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Asn Asn 20 25 30 Leu Gln Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Lys Tyr Ala Ser Gln Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn Ser Leu Glu Ala 65 70 75 80 Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Leu Cys Gln Gln Ser Asn Ser Trp Pro Arg 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125 Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140 Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160 Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175 Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190 Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205 Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210> 5 <211> 725 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleotide sequence encoding amino acid sequence of the light-chain of humanized anti-hTfR antibody No. 2, synthetic sequence <400> 5 acgcgtgccg ccaccatggg ctggagctgg attctgctgt tcctcctgag cgtgacagca 60 ggagtgcaca gcgaaattgt gctgacccag tctcccgatt tccagtccgt gacccccaag 120 gagaaagtca ccatcacatg cagagcatca cagtccatta gcaacaatct gcagtggtac 180 cagcagaagc cagaccagag ccccaagctg ctgatcaaat atgcctctca gagtatttca 240 ggcatacctt ctaggttctc cggtagcggc tctggaaccg actttactct gaccatcaac 300 agtctggagg ctgaagatgc cgctacatac ttgtgccagc agagtaattc atggcctagg 360 acctttggcc aggggacaaa ggtggagatc aaaaggactg tggcagcccc aagtgtcttc 420 atttttcccc cttcagacga acagctgaag agcggcacag catctgtggt ctgtctgctg 480 aacaatttct acccacggga ggctaaggtg cagtggaaag tcgataacgc actgcagtcc 540 ggaaatagcc aggagtctgt gactgaacag gacagtaagg attcaaccta ttccctgtcc 600 agcacactga ctctgagcaa agccgattac gagaagcaca aagtgtatgc ttgcgaagtc 660 acacatcagg ggctgtctag tcccgtgact aagtctttta ataggggtga atgttaagcg 720 gccgc 725 <210> 6 <211> 219 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence of the light-chain of humanized anti-hTfR antibody No. 3 <400> 6 Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr Pro Gly 1 5 10 15 Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser 20 25 30 Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ser Gln Ser 85 90 95 Thr His Val Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 110 Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu 115 120 125 Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe 130 135 140 Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln 145 150 155 160 Ser 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gacgagcagc tgaagtccgg cacagcctct 480 gtcgtgtgcc tgctgaacaa cttctacccc cgcgaggcca aggtgcagtg gaaggtggac 540 aacgccctgc agagcggcaa cagccaggaa agcgtgaccg agcaggactc caaggacagc 600 acctacagcc tgagcagcac cctgaccctg agcaaggccg actacgagaa gcacaaggtg 660 tacgcctgcg aagtgaccca ccagggcctg tctagccccg tgaccaagag cttcaacaga 720 ggcgagtgct aagcggccgc 740 <210> 8 <211> 446 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence of the heavy-chain of humanized anti-hTfR antibody No. 1 <400> 8 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Leu Thr Phe Ser Asn Tyr 20 25 30 Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Leu Val 35 40 45 Ala Asn Ile Asn Thr Asn Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Thr Asn Asn Arg Tyr Asp Glu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val 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acid sequence of the heavy-chain of humanized anti-hTfR antibody No. 3 <400> 10 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu 1 5 10 15 Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Asn Tyr 20 25 30 Trp Leu Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Asp Ile Tyr Pro Gly Gly Asp Tyr Pro Thr Tyr Ser Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Val Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ser Gly Asn Tyr Asp Glu Val Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro 115 120 125 Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly 130 135 140 Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn 145 150 155 160 Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln 165 170 175 Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser 180 185 190 Ser Leu Gly Thr 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ggactattgg ggccagggca ccctggtgac agtgtctagc 420 gcctctacca agggcccaag cgtgtttcct ctggctccat cctctaaatc cacctctggc 480 ggcacagccg ctctgggctg tctggtgaag gattacttcc cagagcccgt gacagtgtct 540 tggaacagcg gcgccctgac ctccggcgtg cacacatttc ctgctgtgct gcagagctcc 600 ggcctgtaca gcctgtctag cgtggtgacc gtgccatcct ctagcctggg cacccagaca 660 tatatctgca acgtgaatca caagcccagc aatacaaagg tggataagaa ggtggagcca 720 aagtcctgtg acaagaccca cacatgcccc ccttgtcctg ctccagagct gctgggagga 780 ccaagcgtgt tcctgtttcc acccaagccc aaggataccc tgatgatctc tcggacccca 840 gaggtgacat gcgtggtggt ggatgtgagc cacgaggacc ccgaggtgaa gttcaactgg 900 tatgtggacg gcgtggaggt gcacaatgct aagaccaagc ccagggagga gcagtacaac 960 tccacctata gagtggtgtc tgtgctgaca gtgctgcacc aggattggct gaacggcaag 1020 gagtataagt gcaaggtgtc caataaggcc ctgcccgctc ctatcgagaa gaccatctct 1080 aaggccaagg gccagcccag agagcctcag gtgtacacac tgcctccatc ccgggatgag 1140 ctgaccaaga accaggtgtc tctgacatgt ctggtcaagg gcttctatcc ctctgacatc 1200 gccgtggagt gggagagcaa tggccagcct gagaacaatt acaagaccac accccctgtg 1260 ctggattccg acggctcttt ctttctgtat agcaagctga ccgtggacaa gtcccggtgg 1320 cagcagggca acgtgttcag ctgttccgtg atgcacgaag ctctgcataa tcactatact 1380 cagaaatccc tgtcactgtc acctggtaaa ggatcttccg aaacgcaggc caactcgacc 1440 acagatgctc tgaacgttct tctcatcatc gtggatgacc tgcgcccctc cctgggctgt 1500 tatggggata agctggtgag gtccccaaat attgaccaac tggcatccca cagcctcctc 1560 ttccagaatg cctttgcgca gcaagcagtg tgcgccccga gccgcgtttc tttcctcact 1620 ggcaggagac ctgacaccac ccgcctgtac gacttcaact cctactggag ggtgcacgct 1680 ggaaacttct ccaccatccc ccagtacttc aaggagaatg gctatgtgac catgtcggtg 1740 ggaaaagtct ttcaccctgg gatatcttct aaccataccg atgattctcc gtatagctgg 1800 tcttttccac cttatcatcc ttcctctgag aagtatgaaa acactaagac atgtcgaggg 1860 ccagatggag aactccatgc caacctgctt tgccctgtgg atgtgctgga tgttcccgag 1920 ggcaccttgc ctgacaaaca gagcactgag caagccatac agttgttgga aaagatgaaa 1980 acgtcagcca gtcctttctt cctggccgtt gggtatcata agccacacat ccccttcaga 2040 taccccaagg aatttcagaa gttgtatccc ttggagaaca tcaccctggc ccccgatccc 2100 gaggtccctg atggcctacc ccctgtggcc tacaacccct ggatggacat caggcaacgg 2160 gaagacgtcc aagccttaaa catcagtgtg ccgtatggtc caattcctgt ggactttcag 2220 cggaaaatcc gccagagcta ctttgcctct gtgtcatatt tggatacaca ggtcggccgc 2280 ctcttgagtg ctttggacga tcttcagctg gccaacagca ccatcattgc atttacctcg 2340 gatcatgggt gggctctagg tgaacatgga gaatgggcca aatacagcaa ttttgatgtt 2400 gctacccatg ttcccctgat attctatgtt cctggaagga cggcttcact tccggaggca 2460 ggcgagaagc ttttccctta cctcgaccct tttgattccg cctcacagtt gatggagcca 2520 ggcaggcaat ccatggacct tgtggaactt gtgtctcttt ttcccacgct ggctggactt 2580 gcaggactgc aggttccacc tcgctgcccc gttccttcat ttcacgttga gctgtgcaga 2640 gaaggcaaga accttctgaa gcattttcga ttccgtgact tggaagaaga tccgtacctc 2700 cctggtaatc cccgtgaact gattgcctat agccagtatc cccggccttc agacatccct 2760 cagtggaatt ctgacaagcc gagtttaaaa gatataaaga tcatgggcta ttccatacgc 2820 accatagact ataggtatac tgtgtgggtt ggcttcaatc ctgatgaatt tctagctaac 2880 ttttctgaca tccatgcagg ggaactgtat tttgtggatt ctgacccatt gcaggatcac 2940 aatatgtata atgattccca aggtggagac cttttccagt tgttgatgcc ttaagcggcc 3000 gc 3002 <210> 15 <211> 980 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence of fused protein of the heavy-chain of humanized anti-hTfR antibody No.2 and hI2S <400> 15 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 Val Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Val Ile Ser Thr Tyr Tyr Gly His Gly Ser Tyr Asn Gln Arg Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Ala Thr Met Thr Val Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Val Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Val Arg Gly Gly Tyr Gly Ser Ser Ser Leu Ala Gly Asn Phe Asp Val 100 105 110 Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly 115 120 125 Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly 130 135 140 Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys 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<212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleotide sequence encoding amino acid sequence of fused protein of the heavy-chain of humanized anti-hTfR antibody No.2 and hI2S, synthetic sequence <400> 16 acgcgtgccg ccaccatggg ctggagctgg attctgctgt tcctcctgag cgtgacagca 60 ggagtgcaca gccaggtgca gctggtccag tcaggagccg aagtgaaaaa gcccggagcc 120 tcagtcaaag tgtcttgtaa agcatcaggt tatacattta cagactacgt catgcactgg 180 gtgaggcagg cacctggaca gggtctggaa tggatcggcg tgatctccac ttactatggc 240 catggaagct acaaccagag attcaagggc agggcgacaa tgactgtaga caaatcaatt 300 tccactgctt atatggagct ggtaaggctg cggtccgacg ataccgctgt gtactattgc 360 gtacgaggag gatacggctc cagctctctg gctggtaatt tcgatgtgtg ggggcagggt 420 accacagtca ccgtgagttc agcaagcaca aagggcccat ctgtgtttcc actggccccc 480 tccagcaaaa gcacctctgg gggtacagcc gctctgggat gtctggtgaa ggattatttc 540 ccagagccag tcaccgtgtc ctggaacagc ggagccctga catctggagt ccacactttt 600 ccagctgtgc tgcagtctag tgggctgtac tccctgtcat ccgtggtcac tgtccccagc 660 tctagtctgg gtacccagac atatatctgc aacgtgaatc acaagccatc taataccaaa 720 gtcgacaaga aagtggaacc caagtcctgt gataaaactc atacctgccc cccttgtcct 780 gcaccagagc tgctgggagg accatccgtg ttcctgtttc cacccaagcc taaagacacc 840 ctgatgatta gccgaactcc cgaagtcacc tgcgtggtcg tggacgtgtc tcacgaggac 900 cctgaagtca agtttaactg gtacgtggat ggcgtcgagg tgcataatgc taagacaaaa 960 ccccgagagg aacagtacaa cagtacatat cgtgtcgtgt cagtgctgac cgtcctgcat 1020 caggactggc tgaacgggaa ggaatataag tgcaaagtgt ccaataaggc actgcccgcc 1080 cctatcgaga aaaccattag caaggccaaa ggacagccta gggaaccaca ggtgtacaca 1140 ctgcctccat cccgggacga gctgactaag aaccaggtca gcctgacctg tctggtgaaa 1200 ggcttctatc cttcagatat cgctgtggag tgggaaagta atggacagcc agagaacaat 1260 tacaagacta ccccccctgt gctggactct gatgggagtt tctttctgta ttctaagctg 1320 accgtggata aaagtcggtg gcagcagggt aatgtcttta gttgttcagt gatgcacgaa 1380 gcactgcaca accactacac ccagaaatca ctgtcactgt caccagggaa aggatcttcc 1440 gaaacgcagg ccaactcgac cacagatgct ctgaacgttc ttctcatcat cgtggatgac 1500 ctgcgcccct ccctgggctg ttatggggat aagctggtga ggtccccaaa tattgaccaa 1560 ctggcatccc acagcctcct cttccagaat gcctttgcgc agcaagcagt gtgcgccccg 1620 agccgcgttt ctttcctcac tggcaggaga cctgacacca cccgcctgta cgacttcaac 1680 tcctactgga gggtgcacgc tggaaacttc tccaccatcc cccagtactt caaggagaat 1740 ggctatgtga ccatgtcggt gggaaaagtc tttcaccctg ggatatcttc taaccatacc 1800 gatgattctc cgtatagctg gtcttttcca ccttatcatc cttcctctga gaagtatgaa 1860 aacactaaga catgtcgagg gccagatgga gaactccatg ccaacctgct ttgccctgtg 1920 gatgtgctgg atgttcccga gggcaccttg cctgacaaac agagcactga gcaagccata 1980 cagttgttgg aaaagatgaa aacgtcagcc agtcctttct tcctggccgt tgggtatcat 2040 aagccacaca tccccttcag ataccccaag gaatttcaga agttgtatcc cttggagaac 2100 atcaccctgg cccccgatcc cgaggtccct gatggcctac cccctgtggc ctacaacccc 2160 tggatggaca tcaggcaacg ggaagacgtc caagccttaa acatcagtgt gccgtatggt 2220 ccaattcctg tggactttca gcggaaaatc cgccagagct actttgcctc tgtgtcatat 2280 ttggatacac aggtcggccg cctcttgagt gctttggacg atcttcagct ggccaacagc 2340 accatcattg catttacctc ggatcatggg tgggctctag gtgaacatgg agaatgggcc 2400 aaatacagca attttgatgt tgctacccat gttcccctga tattctatgt tcctggaagg 2460 acggcttcac ttccggaggc aggcgagaag cttttccctt acctcgaccc ttttgattcc 2520 gcctcacagt tgatggagcc aggcaggcaa tccatggacc ttgtggaact tgtgtctctt 2580 tttcccacgc tggctggact tgcaggactg caggttccac ctcgctgccc cgttccttca 2640 tttcacgttg agctgtgcag agaaggcaag aaccttctga agcattttcg attccgtgac 2700 ttggaagaag atccgtacct ccctggtaat ccccgtgaac tgattgccta tagccagtat 2760 ccccggcctt cagacatccc tcagtggaat tctgacaagc cgagtttaaa agatataaag 2820 atcatgggct attccatacg caccatagac tataggtata ctgtgtgggt tggcttcaat 2880 cctgatgaat ttctagctaa cttttctgac atccatgcag gggaactgta ttttgtggat 2940 tctgacccat tgcaggatca caatatgtat aatgattccc aaggtggaga ccttttccag 3000 ttgttgatgc cttaagcggc cgc 3023 <210> 17 <211> 975 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence of fused protein of the heavy-chain of humanized anti-hTfR antibody No. 3 and hI2S <400> 17 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu 1 5 10 15 Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Met Asn Tyr 20 25 30 Trp Leu Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Asp Ile Tyr Pro Gly Gly Asp Tyr Pro Thr Tyr Ser Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Val Lys Ala Ile Ile Ser Ala Asp Thr Ser Ile Ser Thr Val Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Leu Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Phe Cys 85 90 95 Ala Arg Ser Gly Asn Tyr Asp Glu Val Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro 115 120 125 Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly 130 135 140 Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn 145 150 155 160 Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln 165 170 175 Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser 180 185 190 Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser 195 200 205 Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys 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tctctgaaga tcagctgtaa gggttctgga tacagcttta tgaactactg gctgggatgg 180 gtgcgccaga tgcccgggaa aggcctggag tggattgggg acatctaccc cggcggagac 240 taccctacat acagcgagaa gttcaaggtc aaggccatca tctcagccga cacgtccatc 300 agcaccgtct acctgcagtt gagcagcctg aaggcctcgg acaccgccat gtatttctgt 360 gcgagatcag gcaattacga cgaagtggcc tactggggcc aaggaaccct ggtcaccgtc 420 tcctcagcta gcaccaaggg cccatcggtc ttccccctgg caccctcctc caagagcacc 480 tctgggggca cagcggccct gggctgcctg gtcaaggact acttccccga accggtgacg 540 gtgtcgtgga actcaggcgc cctgaccagc ggcgtgcaca ccttcccggc tgtcctacag 600 tcctcaggac tctactccct cagcagcgtg gtgaccgtgc cctccagcag cttgggcacc 660 cagacctaca tctgcaacgt gaatcacaag cccagcaaca ccaaggtgga caagaaagtt 720 gagcccaaat cttgtgacaa aactcacacg tgcccaccgt gcccagcacc tgaactcctg 780 gggggtccgt cagtcttcct cttcccccca aaacccaagg acaccctcat gatctcccgg 840 acccctgagg tcacatgcgt ggtggtggac gtgagccacg aagaccctga ggtcaagttc 900 aactggtacg tggacggcgt ggaggtgcat aatgccaaga caaagccgcg ggaggagcag 960 tacaacagca cgtaccgggt ggtcagcgtc ctcaccgtcc tgcaccagga ctggctgaat 1020 ggcaaggagt acaagtgcaa ggtctccaac aaagccctcc cagcccccat cgagaaaacc 1080 atctccaaag ccaaagggca gccccgagaa ccacaggtgt acaccctgcc cccatcccgg 1140 gatgagctga ccaagaacca ggtcagcctg acctgcctgg tcaaaggctt ctatcccagc 1200 gacatcgccg tggagtggga gagcaatggg cagccggaga acaactacaa gaccacgcct 1260 cccgtgctgg actccgacgg ctccttcttc ctctacagca agctcaccgt ggacaagagc 1320 aggtggcagc aggggaacgt cttctcatgc tccgtgatgc atgaggctct gcacaaccac 1380 tacacgcaga agagcctctc cctgtctccg ggtaaaggat cttccgaaac gcaggccaac 1440 tcgaccacag atgctctgaa cgttcttctc atcatcgtgg atgacctgcg cccctccctg 1500 ggctgttatg gggataagct ggtgaggtcc ccaaatattg accaactggc atcccacagc 1560 ctcctcttcc agaatgcctt tgcgcagcaa gcagtgtgcg ccccgagccg cgtttctttc 1620 ctcactggca ggagacctga caccacccgc ctgtacgact tcaactccta ctggagggtg 1680 cacgctggaa acttctccac catcccccag tacttcaagg agaatggcta tgtgaccatg 1740 tcggtgggaa aagtctttca ccctgggata tcttctaacc ataccgatga ttctccgtat 1800 agctggtctt ttccacctta tcatccttcc tctgagaagt atgaaaacac taagacatgt 1860 cgagggccag atggagaact ccatgccaac ctgctttgcc ctgtggatgt gctggatgtt 1920 cccgagggca ccttgcctga caaacagagc actgagcaag ccatacagtt gttggaaaag 1980 atgaaaacgt cagccagtcc tttcttcctg gccgttgggt atcataagcc acacatcccc 2040 ttcagatacc ccaaggaatt tcagaagttg tatcccttgg agaacatcac cctggccccc 2100 gatcccgagg tccctgatgg cctaccccct gtggcctaca acccctggat ggacatcagg 2160 caacgggaag acgtccaagc cttaaacatc agtgtgccgt atggtccaat tcctgtggac 2220 tttcagcgga aaatccgcca gagctacttt gcctctgtgt catatttgga tacacaggtc 2280 ggccgcctct tgagtgcttt ggacgatctt cagctggcca acagcaccat cattgcattt 2340 acctcggatc atgggtgggc tctaggtgaa catggagaat gggccaaata cagcaatttt 2400 gatgttgcta cccatgttcc cctgatattc tatgttcctg gaaggacggc ttcacttccg 2460 gaggcaggcg agaagctttt cccttacctc gacccttttg attccgcctc acagttgatg 2520 gagccaggca ggcaatccat ggaccttgtg gaacttgtgt ctctttttcc cacgctggct 2580 ggacttgcag gactgcaggt tccacctcgc tgccccgttc cttcatttca cgttgagctg 2640 tgcagagaag gcaagaacct tctgaagcat tttcgattcc gtgacttgga agaagatccg 2700 tacctccctg gtaatccccg tgaactgatt gcctatagcc agtatccccg gccttcagac 2760 atccctcagt ggaattctga caagccgagt ttaaaagata taaagatcat gggctattcc 2820 atacgcacca tagactatag gtatactgtg tgggttggct tcaatcctga tgaatttcta 2880 gctaactttt ctgacatcca tgcaggggaa ctgtattttg tggattctga cccattgcag 2940 gatcacaata tgtataatga ttcccaaggt ggagaccttt tccagttgtt gatgccttaa 3000 gcggccgc 3008 <210> 19 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence of an exemplified linker 1 <400> 19 Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 <210> 20 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence of an exemplified linker 2 <400> 20 Gly Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 <210> 21 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence of an exemplified linker 3 <400> 21 Ser Gly Gly Gly Gly Gly 1 5 <210> 22 <211> 760 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 22 Met Met Asp Gln Ala Arg Ser Ala Phe Ser Asn Leu Phe Gly Gly Glu 1 5 10 15 Pro Leu Ser Tyr Thr Arg Phe Ser Leu Ala Arg Gln Val Asp Gly Asp 20 25 30 Asn Ser His Val Glu Met Lys Leu Ala Val Asp Glu Glu Glu Asn Ala 35 40 45 Asp Asn Asn Thr Lys Ala Asn Val Thr Lys Pro Lys Arg Cys Ser Gly 50 55 60 Ser Ile Cys Tyr Gly Thr Ile Ala Val Ile Val Phe Phe Leu Ile Gly 65 70 75 80 Phe Met Ile Gly Tyr Leu Gly Tyr Cys Lys Gly Val Glu Pro Lys Thr 85 90 95 Glu Cys Glu Arg Leu Ala Gly Thr Glu Ser Pro Val Arg Glu Glu Pro 100 105 110 Gly Glu Asp Phe Pro Ala Ala Arg Arg Leu Tyr Trp Asp Asp Leu Lys 115 120 125 Arg Lys Leu Ser Glu Lys Leu Asp Ser Thr Asp Phe Thr Gly Thr Ile 130 135 140 Lys Leu Leu Asn Glu Asn Ser Tyr Val Pro Arg Glu Ala Gly Ser Gln 145 150 155 160 Lys Asp Glu Asn Leu Ala Leu Tyr Val Glu Asn Gln Phe Arg Glu Phe 165 170 175 Lys Leu Ser Lys Val Trp Arg Asp Gln His Phe Val Lys Ile Gln Val 180 185 190 Lys Asp Ser Ala Gln Asn Ser Val Ile Ile Val Asp Lys Asn Gly Arg 195 200 205 Leu Val Tyr Leu Val Glu Asn Pro Gly Gly Tyr Val Ala Tyr Ser Lys 210 215 220 Ala Ala Thr Val Thr Gly Lys Leu Val His Ala Asn Phe Gly Thr Lys 225 230 235 240 Lys Asp Phe Glu Asp Leu Tyr Thr Pro Val Asn Gly Ser Ile Val Ile 245 250 255 Val Arg Ala Gly Lys Ile Thr Phe Ala Glu Lys Val Ala Asn Ala Glu 260 265 270 Ser Leu Asn Ala Ile Gly Val Leu Ile Tyr Met Asp Gln Thr Lys Phe 275 280 285 Pro Ile Val Asn Ala Glu Leu Ser Phe Phe Gly His Ala His Leu Gly 290 295 300 Thr Gly Asp Pro Tyr Thr Pro Gly Phe Pro Ser Phe Asn His Thr Gln 305 310 315 320 Phe Pro Pro Ser Arg Ser Ser Gly Leu Pro Asn Ile Pro Val Gln Thr 325 330 335 Ile Ser Arg Ala Ala Ala Glu Lys Leu Phe Gly Asn Met Glu Gly Asp 340 345 350 Cys Pro Ser Asp Trp Lys Thr Asp Ser Thr Cys Arg Met Val Thr Ser 355 360 365 Glu Ser Lys Asn Val Lys Leu Thr Val Ser Asn Val Leu Lys Glu Ile 370 375 380 Lys Ile Leu Asn Ile Phe Gly Val Ile Lys Gly Phe Val Glu Pro Asp 385 390 395 400 His Tyr Val Val Val Gly Ala Gln Arg Asp Ala Trp Gly Pro Gly Ala 405 410 415 Ala Lys Ser Gly Val Gly Thr Ala Leu Leu Leu Lys Leu Ala Gln Met 420 425 430 Phe Ser Asp Met Val Leu Lys Asp Gly Phe Gln Pro Ser Arg Ser Ile 435 440 445 Ile Phe Ala Ser Trp Ser Ala Gly Asp Phe Gly Ser Val Gly Ala Thr 450 455 460 Glu Trp Leu Glu Gly Tyr Leu Ser Ser Leu His Leu Lys Ala Phe Thr 465 470 475 480 Tyr Ile Asn Leu Asp Lys Ala Val Leu Gly Thr Ser Asn Phe Lys Val 485 490 495 Ser Ala Ser Pro Leu Leu Tyr Thr Leu Ile Glu Lys Thr Met Gln Asn 500 505 510 Val Lys His Pro Val Thr Gly Gln Phe Leu Tyr Gln Asp Ser Asn Trp 515 520 525 Ala Ser Lys Val Glu Lys Leu Thr Leu Asp Asn Ala Ala Phe Pro Phe 530 535 540 Leu Ala Tyr Ser Gly Ile Pro Ala Val Ser Phe Cys Phe Cys Glu Asp 545 550 555 560 Thr Asp Tyr Pro Tyr Leu Gly Thr Thr Met Asp Thr Tyr Lys Glu Leu 565 570 575 Ile Glu Arg Ile Pro Glu Leu Asn Lys Val Ala Arg Ala Ala Ala Glu 580 585 590 Val Ala Gly Gln Phe Val Ile Lys Leu Thr His Asp Val Glu Leu Asn 595 600 605 Leu Asp Tyr Glu Arg Tyr Asn Ser Gln Leu Leu Ser Phe Val Arg Asp 610 615 620 Leu Asn Gln Tyr Arg Ala Asp Ile Lys Glu Met Gly Leu Ser Leu Gln 625 630 635 640 Trp Leu Tyr Ser Ala Arg Gly Asp Phe Phe Arg Ala Thr Ser Arg Leu 645 650 655 Thr Thr Asp Phe Gly Asn Ala Glu Lys Thr Asp Arg Phe Val Met Lys 660 665 670 Lys Leu Asn Asp Arg Val Met Arg Val Glu Tyr His Phe Leu Ser Pro 675 680 685 Tyr Val Ser Pro Lys Glu Ser Pro Phe Arg His Val Phe Trp Gly Ser 690 695 700 Gly Ser His Thr Leu Pro Ala Leu Leu Glu Asn Leu Lys Leu Arg Lys 705 710 715 720 Gln Asn Asn Gly Ala Phe Asn Glu Thr Leu Phe Arg Asn Gln Leu Ala 725 730 735 Leu Ala Thr Trp Thr Ile Gln Gly Ala Ala Asn Ala Leu Ser Gly Asp 740 745 750 Val Trp Asp Ile Asp Asn Glu Phe 755 760 <210> 23 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence of the light-chain variable region of humanized anti-hTfR antibody No.1 <400> 23 Asp Ile Gln Val Thr Gln Ser Pro Ser Phe Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Asn Ser Ala 20 25 30 Val Ala Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Trp Thr Ser Thr Arg His Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Val Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Ser Thr Pro Arg 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 24 <211> 116 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence of the heavy-chain variable region of humanized anti-hTfR antibody No.1 <400> 24 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Leu Thr Phe Ser Asn Tyr 20 25 30 Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Leu Val 35 40 45 Ala Asn Ile Asn Thr Asn Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Thr Asn Asn Arg Tyr Asp Glu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val 100 105 110 Thr Val Ser Ser 115 <210> 25 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence of the light-chain variable region of humanized anti-hTfR antibody No.2 <400> 25 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Asp Phe Gln Ser Val Thr Pro Lys 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Asn Asn 20 25 30 Leu Gln Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Lys Tyr Ala Ser Gln Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn Ser Leu Glu Ala 65 70 75 80 Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Leu Cys Gln Gln Ser Asn Ser Trp Pro Arg 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 26 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence of the heavy-chain variable region of humanized anti-hTfR antibody No.2 <400> 26 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 Val Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Val Ile Ser Thr Tyr Tyr Gly His Gly Ser Tyr Asn Gln Arg Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Ala Thr Met Thr Val Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Val Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Val Arg Gly Gly Tyr Gly Ser Ser Ser Leu Ala Gly Asn Phe Asp Val 100 105 110 Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr 115 120 <210> 27 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence of the light-chain variable region of humanized anti-hTfR antibody No.3 <400> 27 Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr Pro Gly 1 5 10 15 Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser 20 25 30 Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ser Gln Ser 85 90 95 Thr His Val Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 28 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence of the heavy-chain variable region of humanized anti-hTfR antibody No.3 <400> 28 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu 1 5 10 15 Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Asn Tyr 20 25 30 Trp Leu Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Asp Ile Tyr Pro Gly Gly Asp Tyr Pro Thr Tyr Ser Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Val Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ser Gly Asn Tyr Asp Glu Val Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser 115

Claims (29)

  1. 항체와 리소좀 효소의 융합 단백질을 유효 성분으로서 함유하여 이루어진 수성 의약 조성물로서, 상기 융합 단백질의 농도가 0.5 내지 20mg/mL이고, 염화 나트륨의 농도가 0.3 내지 1.2mg/mL이고, 수크로오스의 농도가 50 내지 100mg/mL이고, 비이온성 계면활성제의 농도가 0.15 내지 3mg/mL이고, 완충제의 농도가 3 내지 30mM이고, pH가 5.0 내지 7.5인, 수성 의약 조성물.
  2. 항체와 리소좀 효소의 융합 단백질을 유효 성분으로서 함유하여 이루어진 수성 의약 조성물로서, 상기 융합 단백질의 농도가 1.0 내지 10mg/mL이고, 염화 나트륨의 농도가 0.6 내지 1.0mg/mL이고, 수크로오스의 농도가 55 내지 95mg/mL이고, 비이온성 계면활성제의 농도가 0.15 내지 1mg/mL이고, 완충제의 농도가 10 내지 30mM이고, pH가 5.5 내지 7.0인, 수성 의약 조성물.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 융합 단백질의 상기 농도가 2.0 내지 10mg/mL인, 수성 의약 조성물.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 염화 나트륨의 상기 농도가 0.7 내지 0.9mg/mL인, 수성 의약 조성물.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 수크로오스의 상기 농도가 60 내지 90mg/mL인, 수성 의약 조성물.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 비이온성 계면활성제의 상기 농도가 0.3 내지 0.8mg/mL인, 수성 의약 조성물.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 비이온성 계면활성제가 폴리소르베이트 또는 폴록사머인, 수성 의약 조성물.
  8. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 비이온성 계면활성제가 폴리소르베이트 20, 폴리소르베이트 80 및 폴리옥시에틸렌(160) 폴리옥시프로필렌(30) 글리콜로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 것인, 수성 의약 조성물.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 완충제가 인산 완충제인, 수성 의약 조성물.
  10. 제9항에 있어서, 상기 인산 완충제의 농도가 15 내지 25mM인, 수성 의약 조성물.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 pH가 6.0 내지 7.0인, 수성 의약 조성물.
  12. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 pH가 6.2 내지 6.8인, 수성 의약 조성물.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 융합 단백질이, 상기 사람 리소좀 효소를 상기 항체의 경쇄 또는 중쇄 중 어느 하나의 C 말단측 또는 N 말단측 중 어느 하나에 펩타이드 결합에 의해 결합시킨 것인, 수성 의약 조성물.
  14. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 융합 단백질이, 상기 사람 리소좀 효소를 상기 항체의 중쇄의 C 말단측에 펩타이드 결합에 의해 결합시킨 것인, 수성 의약 조성물.
  15. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 융합 단백질이, 상기 사람 리소좀 효소를 상기 항체의 경쇄 또는 중쇄 중 어느 하나의 C 말단측 또는 N 말단 측 중 어느 하나에 적어도 1개의 아미노산 잔기를 포함하는 펩타이드 링커를 개재하여 결합시킨 것인, 수성 의약 조성물.
  16. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 융합 단백질이, 상기 사람 리소좀 효소를 상기 항체의 중쇄의 C 말단측에 적어도 1개의 아미노산 잔기를 포함하는 펩타이드 링커를 개재하여 결합시킨 것인, 수성 의약 조성물.
  17. 제15항 또는 제16항에 있어서, 상기 펩타이드 링커가 (Gly-Ser)로 나타내어지는 아미노산 서열을 갖는 것인, 수성 의약 조성물.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 리소좀 효소가 사람 리소좀 효소인, 수성 의약 조성물.
  19. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 리소좀 효소가 α-L-이두로니다아제, 이두론산-2-설파타아제, 글루코세레브로시다아제, β-갈락토시다아제, GM2 활성화 단백질, β-헥소사미니다아제 A, β-헥소사미니다아제 B, N-아세틸글루코사민-1-포스포트랜스퍼라아제, α-만노시다아제, β-만노시다아제, 갈락토실세라미다아제, 사포신 C, 알릴설파타아제 A, α-L-푸코시다아제, 아스파르틸글루코사미니다아제, α-N-아세틸갈락토사미니다아제, 산성 스핑고미엘리나아제, α-갈락토시다아제, β-글루쿠로니다아제, 헤파란 N-설파타아제, α-N-아세틸글루코사미니다아제, 아세틸 CoA α-글루코사미니드 N-아세틸트랜스퍼라아제, N-아세틸글루코사민-6-황산 설파타아제, 산성 세라미다아제, 아밀로-1,6-글루코시다아제, 시알리다아제, 아스파르틸글루코사미니다아제, 팔미토일 단백질 티오에스테라아제-1, 트리펩티딜 펩티다아제-1, 히알루로니다아제-1, CLN1 및 CLN2로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 것인, 수성 의약 조성물.
  20. 제18항에 있어서, 상기 사람 리소좀 효소가 사람 이두론산-2-설파타아제인, 수성 의약 조성물.
  21. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체가 사람 항체 또는 사람화 항체인, 수성 의약 조성물.
  22. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체가 혈관 내피 세포의 표면에 존재하는 분자를 항원으로서 인식하는 것인, 수성 의약 조성물.
  23. 제22항에 있어서, 상기 혈관 내피 세포가 사람의 혈관 내피 세포인, 수성 의약 조성물.
  24. 제22항 또는 제23항에 있어서, 상기 혈관 내피 세포가 뇌혈관 내피 세포인, 수성 의약 조성물.
  25. 제24항에 있어서, 상기 뇌혈관 내피 세포의 표면에 존재하는 분자가 트랜스페린 수용체(TfR), 인슐린 수용체, 렙틴 수용체, 리포 단백질 수용체, IGF 수용체, OATP-F, 유기 음이온 트랜스포터, MCT-8 및 모노카복실산 트랜스포터로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 것인, 수성 의약 조성물.
  26. 제21항에 있어서, 상기 항체가 사람화 항사람 트랜스페린 수용체(hTfR) 항체인, 수성 의약 조성물.
  27. 제21항에 있어서, 상기 항체가 사람화 항 hTfR 항체이고, 상기 사람 리소좀 효소가 사람 이두론산-2-설파타아제이고, 상기 융합 단백질이 사람화 항 hTfR 항체와 사람 이두론산-2-설파타아제의 융합 단백질인 것이고, 상기 융합 단백질이 이하의 (a) 내지 (c)로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 것인, 수성 의약 조성물 :
    (a) 서열 번호 2로 나타내어지는 아미노산 서열을 갖는 사람화 항 hTfR 항체의 경쇄와,
    서열 번호 8로 나타내어지는 아미노산 서열을 갖는 사람화 항 hTfR 항체의 중쇄의 C 말단측에, 사람 이두론산-2-설파타아제가 펩타이드 링커를 개재하여 결합한 것으로 이루어진,
    융합 단백질;
    (b) 서열 번호 4로 나타내어지는 아미노산 서열을 갖는 사람화 항 hTfR 항체의 경쇄와,
    서열 번호 9로 나타내어지는 아미노산 서열을 갖는 사람화 항 hTfR 항체의 중쇄의 C 말단측에, 사람 이두론산-2-설파타아제가 펩타이드 링커를 개재하여 결합한 것으로 이루어진,
    융합 단백질;
    (c) 서열 번호 6으로 나타내어지는 아미노산 서열을 갖는 사람화 항 hTfR 항체의 경쇄와,
    서열 번호 10으로 나타내어지는 아미노산 서열을 갖는 사람화 항 hTfR 항체의 중쇄의 C 말단측에, 사람 이두론산-2-설파타아제가 펩타이드 링커를 개재하여 결합한 것으로 이루어진,
    융합 단백질.
  28. 제21항에 있어서, 상기 항체가 사람화 항 hTfR 항체이고, 상기 사람 리소좀 효소가 사람 이두론산-2-설파타아제이고, 상기 융합 단백질이 사람화 항 hTfR 항체와 사람 이두론산-2-설파타아제의 융합 단백질인 것이고, 상기 융합 단백질이 이하의 (a) 내지 (c)로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 것인, 수성 의약 조성물:
    (a) 상기 사람화 항 hTfR 항체의 경쇄가 서열 번호 2로 나타내어지는 아미노산 서열을 갖는 것고,
    상기 사람화 항 hTfR 항체의 중쇄가 그 C 말단측에서 (Gly-Ser)로 나타내어지는 아미노산 서열을 갖는 펩타이드 링커를 개재하여 사람 이두론산-2-설파타아제와 결합하고 있고, 전체로서 서열 번호 13으로 나타내어지는 아미노산 서열을 갖는 것인,
    융합 단백질;
    (b) 상기 사람화 항 hTfR 항체의 경쇄가 서열 번호 4로 나타내어지는 아미노산 서열을 갖는 것이고,
    상기 사람화 항 hTfR 항체의 중쇄가 그 C 말단측에서 (Gly-Ser)로 나타내어지는 아미노산 서열을 갖는 펩타이드 링커를 개재하여 사람 이두론산-2-설파타아제와 결합하고 있고, 전체로서 서열 번호 15로 나타내어지는 아미노산 서열을 갖는 것인,
    융합 단백질;
    (c) 상기 사람화 항 hTfR 항체의 경쇄가 서열 번호 6으로 나타내어지는 아미노산 서열을 갖는 것이고,
    상기 사람화 항 hTfR 항체의 중쇄가 그 C 말단측에서 (Gly-Ser)로 나타내어지는 아미노산 서열을 갖는 펩타이드 링커를 개재하여 사람 이두론산-2-설파타아제와 결합하고 있고, 전체로서 서열 번호 17로 나타내어지는 아미노산 서열을 갖는 것인,
    융합 단백질.
  29. 제21항에 있어서, 상기 항체가 사람화 항 hTfR 항체이고, 상기 사람 리소좀 효소가 사람 이두론산-2-설파타아제이고, 상기 융합 단백질이 사람화 항 hTfR 항체와 사람 이두론산-2-설파타아제의 융합 단백질인 것이고, 상기 융합 단백질이 이하의 (a) 내지 (c)로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 것인, 수성 의약 조성물;
    (a) 상기 사람 이두론산-2-설파타아제가 링커 서열 Gly-Ser을 개재하여 중쇄의 C 말단측에 결합해서 이루어진 결합체와 경쇄로 이루어지고, 상기 결합체의 아미노산 서열이 서열 번호 13으로 나타내어지는 것이고, 상기 경쇄의 아미노산 서열이 서열 번호 2로 나타내어지는 것,
    (b) 상기 사람 이두론산-2-설파타아제가 링커 서열 Gly-Ser을 개재하여 중쇄의 C 말단측에 결합해서 이루어진 결합체와 경쇄로 이루어지고, 상기 결합체의 아미노산 서열이 서열 번호 15로 나타내어지는 것이고, 상기 경쇄의 아미노산 서열이 서열 번호 4로 나타내어지는 것,
    (c) 상기 사람 이두론산-2-설파타아제가 링커 서열 Gly-Ser을 개재하여 중쇄의 C 말단측에 결합해서 이루어진 결합체와 경쇄로 이루어지고, 상기 결합체의 아미노산 서열이 서열 번호 17로 나타내어지는 것이고, 상기 경쇄의 아미노산 서열이 서열 번호 6으로 나타내어지는 것.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2990785A1 (en) 2015-06-24 2016-12-29 Jcr Pharmaceuticals Co., Ltd. Anti-human transferrin receptor antibody permeating blood-brain barrier
WO2016208696A1 (ja) 2015-06-24 2016-12-29 Ｊｃｒファーマ株式会社 Ｂｄｎｆを含む融合蛋白質
AU2017385288B9 (en) * 2016-12-26 2022-01-13 Jcr Pharmaceuticals Co., Ltd. Novel anti-human transferrin receptor antibody capable of penetrating blood-brain barrier
MA50746A (fr) 2017-10-02 2020-08-12 Denali Therapeutics Inc Protéines de fusion comprenant des enzymes d'enzymothérapie substitutive
KR20210024082A (ko) 2018-06-25 2021-03-04 제이씨알 파마 가부시키가이샤 단백질 함유 수성 액제
US20220378882A1 (en) * 2019-10-30 2022-12-01 Jcr Pharmaceuticals Co., Ltd. Aqueous pharmaceutical composition containing fusion protein of serum albumin and growth hormone
EP4311555A1 (en) * 2021-03-24 2024-01-31 JCR Pharmaceuticals Co., Ltd. Stable aqueous pharmaceutical composition or freeze-dried pharmaceutical composition
WO2022239817A1 (ja) * 2021-05-12 2022-11-17 Ｊｃｒファーマ株式会社 ムコ多糖症ｉ型の治療用医薬組成物

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2016208695A1 (ja) * 2015-06-24 2016-12-29 Ｊｃｒファーマ株式会社 血液脳関門を通過する抗ヒトトランスフェリン受容体抗体

Family Cites Families (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20020077461A1 (en) 1996-04-24 2002-06-20 Soren Bjorn Pharmaceutical formulation
US20030104996A1 (en) 2001-08-30 2003-06-05 Tiansheng Li L-methionine as a stabilizer for NESP/EPO in HSA-free formulations
JP2010519220A (ja) * 2007-02-16 2010-06-03 ワイス エルエルシー マンニトール誘導性のタンパク質凝集を抑制するためのスクロースの使用
RU2600847C2 (ru) 2010-05-10 2016-10-27 Интас Биофармасьютикалс Лимитед Жидкий состав полипептидов, содержащих fc-домен иммуноглобулина
IL291554B2 (en) 2010-06-25 2024-02-01 Shire Human Genetic Therapies Administering therapeutic agents to the central nervous system
US9474803B2 (en) 2012-11-27 2016-10-25 Alteogen Inc. Composition for stabilizing fusion protein in which protein and FC domain are fused
WO2015009961A1 (en) 2013-07-19 2015-01-22 Armagen Technologies, Inc. Compositions and methods related to structures that cross the blood brain barrier
JP6616189B2 (ja) 2013-12-25 2019-12-04 Ｊｃｒファーマ株式会社 血液脳関門を通過する新規抗トランスフェリン受容体抗体
CN107074931A (zh) * 2014-06-13 2017-08-18 圣塔玛丽亚生物疗法公司 经配制的受体多肽和相关方法
WO2018038243A1 (ja) * 2016-08-25 2018-03-01 Ｊｃｒファーマ株式会社 抗体融合蛋白質の製造方法
BR112019013202A2 (pt) 2016-12-28 2019-12-10 Japan Chem Res formulação liofilizada

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2016208695A1 (ja) * 2015-06-24 2016-12-29 Ｊｃｒファーマ株式会社 血液脳関門を通過する抗ヒトトランスフェリン受容体抗体

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