KR20200046453A - 온도반응형 천연고분자를 이용한 치료용 줄기세포 전달체의 제조방법 - Google Patents
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Abstract
개시된 내용은 온도반응형 천연고분자를 이용한 치료용 줄기세포 전달체의 제조방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 히알루론산으로 신경줄기세포와 신경줄기세포 표식자를 캡슐화하는 제1캡슐화단계 및 상기 제1캡슐화단계를 통해 캡슐화된 입자를 하이드로겔 용액으로 캡슐화하는 제2캡슐화단계로 이루어진다.
상기의 과정을 통해 제조되는 치료용 줄기세포 전달체는 줄기세포를 생분해성 하이드로겔로 표식자와 함께 캡슐을 하며, 신체 조건에서 겔화가 일어나는 온도감음형 하이드로겔 용액으로 캡슐화 함으로써 줄기세포 치료제와 같은 약물을 담지함으로 발생하는 온도 감응성 문제를 해결하고, 줄기세포의 안정성도 확보하는 효과를 나타낸다.
상기의 과정을 통해 제조되는 치료용 줄기세포 전달체는 줄기세포를 생분해성 하이드로겔로 표식자와 함께 캡슐을 하며, 신체 조건에서 겔화가 일어나는 온도감음형 하이드로겔 용액으로 캡슐화 함으로써 줄기세포 치료제와 같은 약물을 담지함으로 발생하는 온도 감응성 문제를 해결하고, 줄기세포의 안정성도 확보하는 효과를 나타낸다.
Description
개시된 내용은 온도반응형 천연고분자를 이용한 치료용 줄기세포 전달체의 제조방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 줄기세포 치료제와 같은 약물을 담지함으로 발생하는 온도 감응성 문제를 해결하고, 줄기세포의 안정성도 확보하는 효과를 나타내는 온도반응형 천연고분자를 이용한 치료용 줄기세포 전달체의 제조방법에 관한 것이다.
현대 사회는 의료 기술의 발달로 인간의 수명이 증가함에 따라 고령화 사회로 빠르게 변화하고 있으며, 손상된 인체의 기능을 대신해 몸 안에 이식되어 사용되는 다양한 종류의 생체 재료를 사용부위나 목적에 따라 이용하면 의료비 절감과 치료 부작용 감소 등의 효과가 기대할 수 있다.
줄기 세포 치료제의 경우도 마찬가지로, 줄기세포는 질병 및 손상된 조직에 대한 재생을 직접 수행할 수 있으나, 줄기세포만 단독으로 이식하여 사용할 경우, 이식 세포의 낮은 생존율 및 생착률 때문에 손상된 조직을 근원적으로 복구하고자 하는 데에 한계가 있어 줄기세포를 하이드로겔과 함께 손상부위에 이식하는 연구가 진행되고 있다.
하이드로젤은 고체상으로 체내에 이식할 시, 시술 범위가 넓어지는 단점이 있기 때문에, 상온에서는 용액, 체온에서는 하이드로겔이 되는 온도감응성 고분자와 줄기 세포를 혼합하여, 체내에 이를 주사로 주입하고, 체온에 의해 하이드로젤이 형성되면서 이식 세포을 포집하고 생착 시키려는 연구가 시도되고 있다.
그러나, 지금까지 연구 목적으로 사용되어온 온도감응성 고분자는 대부분 합성 고분자로, 합성 고분자는 임상적으로 사용되기에는 안전성의 문제가 있어, 천연 고분자 기반 또는 생적합성 온도감응성 하이드로겔이 적용된 치료용 줄기세포 전달체의 개발이 요구되고 있다.
또한, 지지체 및 세포의 생존과 생착을 돕고 분화를 유도하는 다기능성을 구현해야 하는데, 기존에는 온도감응성 고분자에 화학적 합성 방법을 통하여, 기능기를 도입하는 방식이 이용되어 왔으나, 이는 온도감응성 고분자의 감응성을 변화시키며, 합성 과정에서 생긴 독성 물질이 남아있을 수 있고, 다기능성을 원하는 수준까지 구현하기 힘들다는 단점이 있어, 생체적합성이며, 온도감응성 고분자의 감응성을 보존할 수 있고, 효율적인 다기능성 구현 방법이 필요한 실정이다.
이에 따라, 생체 내에 주입하기에 적절한 하이드로젤 연구개발로 조직공학 및 재생의학을 위한 자극 반응성을 지닌 동적인 폴리펩타이드 하이드로젤 개발이 활발히 연구되고 있는데, 효과적으로 약물을 체내에 경구 투여하거나 선택적인 조직성장을 유도하기 위해서는 약물이나 세포가 전달되는 과정에서 손실되지 않으면서 해당 부위에서의 효과적인 방출 필요하며 염증을 일으키지 않아야 한다.
하이드로젤은 대체적으로 생체적합성이 우수하지만, 약물전달에 제한되는 여러 문제점들을 갖고 있어 그것을 해결하기 위해 많은 노력이 필요하다. 특히 합성고분자 기반으로 하는 온도 감응성 하이드로젤 연구에서 이들 하이드로젤 내부에 캡슐된 줄기세포의 생존율이 현저히 낮고, 또한 분화가 제대로 일어나지 않은 문제로 인해 상용화가 어렵다. 특히 줄기세포 분화연구에 있어서 iPSC, 직접교차분화 분야는 기술변화가 빠르고 미개발 영역이 많아서 원천기술 개발의 가능성이 매우 높다.
급성 허혈성 뇌졸중 가 중등에 자배엽줄기세포, 태아 신경세포, 제대혈 세포, 급성 심근 경색에 혈관전구세포 등의 연구자 임상 및 임상시도가 진행 중이며 일부는 다소 효과가 있는 것으로 보고되고 있다.
신생아기 저산소성-허혈성 뇌손상 모델은 뇌졸중 및 척수손상 모델에 비해 상대적으로 연구 보고가 부족하며, 신경영양인자의 투여는 신경보호 효과만을 고려한 치료법으로 사용하고 있다.
난치성질환 치료를 위하여 줄기세포를 이용한 세포이식법이 새로운 질환치료방법으로 받아들여지고 있음에도 현재까지 이식된 줄기세포의 생체내 주입 시스템 및 작용기전에 대한 연구는 매우 부족한 실정이다.
생체 내에 주입된 줄기세포의 불안정성으로 인하여 비정상적인 조직 및 암 세포로의 진행을 유발 할 수 있음. 이에 따라 줄기세포의 분화를 정확히 제어할 뿐만 아니라 동시에 long-term으로 모니터링이 가능한 기술이 반드시 필요하다.
조직 공학 및 약물 전달을 위한 지지체를 만드는 재료로 이용하는 하이드로젤은 약한 기계적 특성 때문에 여러 분야로의 응용가능성을 상당히 제한해 오고 있으며, 한편 줄기세포의 모니터링 연구는 자성 나노입자, quantum dot 등의 나노구조체를 줄기세포 내에 인입시킨 후 줄기세포의 이미징을 이용한 추적방법이 연구되어 왔고, 줄기세포의 분화시 나타나는 특정 인자의 검출을 통한 줄기세포의 분화 모니터링 연구는 거의 없는 상태다.
줄기세포를 이용한 효율적 치료를 위해서는 줄기세포의 제어와 모니터링이 동시에 이루어져야 하나 현재 전 세계적으로 줄기세포의 제어 및 모니터링을 동시에 수행할 수 있는 플랫폼 기술은 없는 상태다.
또한, 지지체 및 세포의 생존과 생착을 돕고 분화를 유도하는 다기능성을 구현해야 하는데, 기존에는 온도감응성 고분자에 화학적 합성 방법을 통하여, 기능기를 도입하는 방식이 이용되어 왔으나, 이는 온도감응성 고분자의 감응성을 변화시키며, 합성 과정에서 생긴 독성 물질이 남아있을 수 있고, 다기능성을 원하는 수준까지 구현하기 힘들다는 단점이 있어, 생체적합성이며, 온도감응성 고분자의 감응성을 보존할 수 있고, 효율적인 다기능성 구현 방법에 단점이 있다.
개시된 내용은 줄기세포 치료제와 같은 약물을 담지함으로 발생하는 온도 감응성 문제를 해결하고, 줄기세포의 안정성도 확보하는 효과를 나타내는 온도반응형 천연고분자를 이용한 치료용 줄기세포 전달체의 제조방법을 제공하는 것이다.
개시된 내용은 히알루론산으로 신경줄기세포와 신경줄기세포 표식자를 캡슐화하는 제1캡슐화단계 및 상기 제1캡슐화단계를 통해 캡슐화된 입자를 하이드로겔 용액으로 캡슐화하는 제2캡슐화단계로 이루어지는 것을 특징으로 하는 온도반응형 천연고분자를 이용한 치료용 줄기세포 전달체의 제조방법에 대해 기술하고 있다.
바람직하기로는, 상기 히알루론산은 가교구조를 갖는 것으로 한다.
더 바람직하기로는, 상기 히알루론산은 아민기를 갖는 히알루론산과 카르복실기를 갖는 히알루론산을 반응시켜 제조되는 것으로 한다.
더욱 바람직하기로는, 상기 아민기를 갖는 히알루론산은 히알루론산-아디픽 디히드라자이드로 이루어지는 것으로 한다.
더욱 더 바람직하기로는, 상기 카르복실기를 갖는 히알루론산은 히알루론산-알데히드로 이루어지는 것으로 한다.
더욱 더 바람직하기로는, 상기 하이드로겔 용액은 키토산과 콜라겐을 혼합하여 제조되는 것으로 한다.
더욱 더 바람직하기로는, 상기 하이드로겔 용액은 키토산과 콜라겐이 1:1의 중량부로 혼합되어 이루어지는 것으로 한다.
더욱 더 바람직하기로는, 상기 하이드로겔 용액은 키토산과 콜라겐 혼합물에 DMEM과 수산화나트륨을 혼합하여 제조되는 것으로 한다.
더욱 더 바람직하기로는, 상기 하이드로겔 용액은 키토산과 콜라겐을 1:1의 중량부로 혼합하고, 상기 혼합물 100 중량부 대비 DMEM을 40 내지 50 중량부 및 수산화나트륨 25 내지 35 중량부를 혼합하여 제조되는 것으로 한다.
더욱 더 바람직하기로는, 상기 키토산은 탈아세틸화도가 75 내지 85%인 수용성 키토산으로 이루어지는 것으로 한다.
개시된 온도반응형 천연고분자를 이용한 치료용 줄기세포 전달체의 제조방법은 줄기세포 치료제와 같은 약물을 담지함으로 발생하는 온도 감응성 문제를 해결하고, 줄기세포의 안정성도 확보하는 효과를 나타내는 치료용 줄기세포 전달체를 제공하는 탁월한 효과를 나타낸다.
도 1은 개시된 일 실시예에 따른 온도반응형 천연고분자를 이용한 치료용 줄기세포 전달체의 제조방법을 나타낸 순서도이다.
도 2는 개시된 천연고분자를 이용한 치료용 줄기세포 전달체의 제조방법을 통해 제조되는 줄기세포 전달체의 구성을 개략적으로 나타낸 그림이다.
도 3은 개시된 아민기를 가진 히알루론산과 카르복실기를 가지는 히알루론산 혼합물의 알데히드 반응전과 반응후의 상태를 나타낸 사진이다.
도 4는 개시된 실시예 1을 통해 제조된 온도반응형 천연고분자를 이용한 치료용 줄기세포 전달체의 겔링화를 측정하여 나타낸 사진이다.
도 2는 개시된 천연고분자를 이용한 치료용 줄기세포 전달체의 제조방법을 통해 제조되는 줄기세포 전달체의 구성을 개략적으로 나타낸 그림이다.
도 3은 개시된 아민기를 가진 히알루론산과 카르복실기를 가지는 히알루론산 혼합물의 알데히드 반응전과 반응후의 상태를 나타낸 사진이다.
도 4는 개시된 실시예 1을 통해 제조된 온도반응형 천연고분자를 이용한 치료용 줄기세포 전달체의 겔링화를 측정하여 나타낸 사진이다.
이하에는, 본 발명의 바람직한 실시예와 각 성분의 물성을 상세하게 설명하되, 이는 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 발명을 용이하게 실시할 수 있을 정도로 상세하게 설명하기 위한 것이지, 이로 인해 본 발명의 기술적인 사상 및 범주가 한정되는 것을 의미하지는 않는다.
개시된 온도반응형 천연고분자를 이용한 치료용 줄기세포 전달체의 제조방법은 히알루론산으로 신경줄기세포와 신경줄기세포 표식자를 캡슐화하는 제1캡슐화단계(S101) 및 상기 제1캡슐화단계(S101)를 통해 캡슐화된 입자를 하이드로겔 용액으로 캡슐화하는 제2캡슐화단계(S103)로 이루어진다.
상기와 같은 단계를 통해 이루어지는 천연고분자를 이용한 치료용 줄기세포 전달체의 제조방법을 통해 제조되는 줄기세포 전달체의 구성을 개략적으로 아래 도 2에 나타내었다.
상기 제1캡슐화단계(S101)는 히알루론산으로 신경줄기세포와 신경줄기세포 표식자를 캡슐화하는 단계로, 뇌 조직에 투입하고자 하는 신경줄기세포와 그 표식자를 캡슐화하며 이때, 사용되는 히알루론산은 아민기를 가진 히알루론산과, 카르복실기를 가지는 히알루론산을 혼합하여 사용함으로써 가교제 없는 상태로 줄기세포를 캡슐화할 수 있다.
줄기세포를 하이드로젤에 캡슐하는 방법은 미세유체칩 기술을 이용하여 아민기를 가진 히알루론산과 및 카르복실기를 가지는 히알루론산 두가지 성분과 신경줄기세포 및 그 표식자를 적절한 유량으로 흘려줌으로써 캡슐의 효율 및 생존율을 향상시킬 수 있다.
또한, 상기와 같이 아민기를 가진 히알루론산과, 카르복실기를 가지는 히알루론산을 혼합하면, 알데히드 반응에 의해 별도의 가교제를 투입하지 않고도 가교구조를 가진 형태로 제조될 수 있다. 상기와 같이 가교구조를 갖는 히알루론산 하이드로겔의 경우는 히알로니다제, 리소솜 같은 효소에 의해 서서히 생분해되는 특징이 있는데, 상기 히알루론산 하이드로겔은 세포 수용체에 부착되고 아민기를 가진 히알루론산과 카르복실기를 가지는 히알루론산의 혼합비율을 조절하여 생분해 속도 및 하이드로겔의 공극 구조 크기의 조절이 가능하다.
이때, 상기 아민기를 갖는 히알루론산은 히알루론산-아디픽 디히드라자이드로 이루어지는 것이 바람직하며, 상기 카르복실기를 갖는 히알루론산은 히알루론산-알데히드로 이루어지는 것이 바람직하다.
상기와 같은 가교구조의 히알루론산 하이드로겔은 37℃의 온도조건에서 약 10분 후에 겔화가 진행되며, 상온에서는 약 40분 후에 겔화가 진행된다.
아래 도 3에 아민기를 가진 히알루론산과 카르복실기를 가지는 히알루론산 혼합물의 알데히드 반응(37℃의 온도에서 10분 경과)전과 반응후의 상태를 나타낸 사진을 첨부하였다.
상기 제2캡슐화단계(S103)는 상기 제1캡슐화단계(S101)를 통해 캡슐화된 입자를 하이드로겔 용액으로 캡슐화하는 단계로, 상기 제1캡슐화단계(S101)를 통해 캡슐화된 입자를 하이드로겔 용액에 혼합하게 되면 상기 제1캡슐화단계(S101)를 통해 캡슐화된 입자의 표면이 하이드로겔 용액으로 코팅된다.
이때, 상기 제2캡슐화단계(S103)에서 사용되는 하이드로겔 용액은 키토산과 콜라겐을 혼합하여 제조되며, 바람직하게는 키토산과 콜라겐이 1:1의 중량부로 혼합되어 이루어지는 것이 바람직하다.
상기 제2캡슐화단계(S103)에서 사용되는 하이드로겔 용액의 제조방법에 대해 더욱 상세하게 설명하면, 키토산과 콜라겐 혼합물에 DMEM과 수산화나트륨을 혼합하여 제조되는데, 키토산과 콜라겐을 1:1의 중량부로 혼합하고, 상기 혼합물 100 중량부 대비 DMEM을 40 내지 50 중량부 및 수산화나트륨 25 내지 35 중량부를 혼합하여 제조된다.
이때, 상기 키토산은 탈아세틸화도가 75 내지 85%인 수용성 키토산으로 이루어지는 것이 바람직하며, 상기의 과정을 통해 제조된 하이드로겔 용액은 pH 7.2~7.3과 37℃의 온도 조건에서 겔화 되는데 약 20분 정도가 소요된다.
상기 제1캡슐화단계(S101)에서 제조된 입자를 상기 제2캡슐화단계(S103)에서 사용되는 하이드로겔 용액에 혼합하고 분산시켜 제조된 치료용 줄기세포 전달체는 뇌 조직에 주입 후에는 겔화가 진행될 수 있는데, 키토산과 콜라겐의 혼합물로 제조된 하이드로겔은 상온에서는 용액 상으로 존재하고, 뇌 조직에 주입된 후 20분 이내에 서서히 겔화가 진행되면서 치료용 줄기세포 전달체의 용액이 외부로 흘러 나오는 것을 방지하는 역할을 하게 된다.
이후에, 체온으로 인해 겔화가 진행된 키토산과 콜라겐의 혼합물로 제조된 하이드로겔은 체내에서 서서히 생분해되어 내부에 함유된 제1캡슐화단계를 통해 제조된 입자에 함유된 줄기세포가 서서 방출되도록 한다.
이하에서는, 개시된 온도반응형 천연고분자를 이용한 치료용 줄기세포 전달체의 제조방법 및 그 제조방법을 통해 제조된 치료용 줄기세포 전달체의 물성을 실시예를 들어 설명하기로 한다.
<제조예 1>
미세유체칩 기술을 이용하여 아민기를 갖는 히알루론산(히알루론산-아디픽 디히드라자이드), 카르복실기를 갖는 히알루론산(히알루론산-알데히드) 혼합물로 신경줄기세포 및 신경줄기세포 표식자가 캡슐화된 입자를 제조하였다.
<제조예 2>
키토산(탈아세틸화도가 80%인 수용성 키토산)과 콜라겐을 1:1의 중량부로 혼합하고, 상기 혼합물 100 중량부 대비 DMEM을 45 중량부 및 수산화나트륨 30 중량부를 혼합하여 하이드로겔 용액을 제조하였다.
<실시예 1>
상기 제조예 1을 통해 제조된 입자를 상기 제조예 2를 통해 제조된 하이드로겔 용액에 혼합 및 분산하여 온도반응형 천연고분자를 이용한 치료용 줄기세포 전달체를 제조하였다.
상기 실시예 1을 통해 제조된 온도반응형 천연고분자를 이용한 치료용 줄기세포 전달체의 겔링화를 측정하여 아래 도 4에 나타내었다.
(단, 겔링화는 모사 뇌조직을 모방한 스펀지를 이용하였다.)
다공성 조직을 겔링화가 일어나는 신체 내 조건과 유사한 (pH7.2~7.3, 37℃) 조건으로 조절한 다음 다양한 다공성 조직별로 치료용 줄기세포 전달체를 주입하였다.
다공성 조직 상에서 치료용 줄기세포 전달체가 겔링화가 되지 않는 경우, 액상 상태로 공극 사이를 빠져나가기 때문에 다공성 조직 내에 하이드로젤이 존재 하지 않게 된다.
겔링화가 일어날 수 있는 pH, 온조 조건을 조정한 다공성 조직의 수직 및 수평 단면을 확인한 결과 약 20분 정도에 겔화가 일어나는 것을 관찰 할 수 있었으며, 공극 사이즈에 따라 겔화 되는 형태가 달라짐을 알 수 있었는데, 공극 크기가 가장 작은 경우 좁고 긴 형태로 겔화가 일어나고, 공극이 가장 큰 경우 넓은 범위에 걸쳐 많은 양의 겔화가 진행되는 것으로 확인되었다.
공극 사이즈가 작은 경우 치료용 줄기세포 전달체 용액이 겔화 되기 전에는 액상 형태로 공극 구조표면을 따라 모세관 현상에 의해 공극 사이에 머물지 못하고 용액이 흘러 가면서 좁고 긴 형태로 존재하지만, 공극이 큰 경우 체류시간이 늘어남에 따라 겔링화 되는 용액의 양이 늘어나 넓은 범위에서 치료용 줄기세포 전달체가 관찰되었다.
따라서 공극 크기에 따라 약간의 차이는 있지만, 폐쇄된 뇌 조직안에서는 겔링화 조건 및 일정시간이 지나면 충분히 치료용 줄기세포 전달체의 겔링화가 일어나 신경줄기세포의 생착율을 향상될 수 있다.
따라서, 개시된 온도반응형 천연고분자를 이용한 치료용 줄기세포 전달체의 제조방법은 줄기세포 치료제와 같은 약물을 담지함으로 발생하는 온도 감응성 문제를 해결하고, 줄기세포의 안정성도 확보하는 효과를 나타내는 치료용 줄기세포 전달체를 제공할 수 있다.
S101 ; 제1캡슐화단계
S103 ; 제2캡슐화단계
S103 ; 제2캡슐화단계
Claims (10)
- 히알루론산으로 신경줄기세포와 신경줄기세포 표식자를 캡슐화하는 제1캡슐화단계; 및
상기 제1캡슐화단계를 통해 캡슐화된 입자를 하이드로겔 용액으로 캡슐화하는 제2캡슐화단계;로 이루어지는 것을 특징으로 하는 온도반응형 천연고분자를 이용한 치료용 줄기세포 전달체의 제조방법.
- 청구항 1에 있어서,
상기 히알루론산은 가교구조를 갖는 것을 특징으로 하는 온도반응형 천연고분자를 이용한 치료용 줄기세포 전달체의 제조방법.
- 청구항 2에 있어서,
상기 히알루론산은 아민기를 갖는 히알루론산과 카르복실기를 갖는 히알루론산을 반응시켜 제조되는 것을 특징으로 하는 온도반응형 천연고분자를 이용한 치료용 줄기세포 전달체의 제조방법.
- 청구항 3에 있어서,
상기 아민기를 갖는 히알루론산은 히알루론산-아디픽 디히드라자이드로 이루어지는 것을 특징으로 하는 온도반응형 천연고분자를 이용한 치료용 줄기세포 전달체의 제조방법.
- 청구항 3에 있어서,
상기 카르복실기를 갖는 히알루론산은 히알루론산-알데히드로 이루어지는 것을 특징으로 하는 온도반응형 천연고분자를 이용한 치료용 줄기세포 전달체의 제조방법.
- 청구항 1에 있어서,
상기 하이드로겔 용액은 키토산과 콜라겐을 혼합하여 제조되는 것을 특징으로 하는 온도반응형 천연고분자를 이용한 치료용 줄기세포 전달체의 제조방법.
- 청구항 6에 있어서,
상기 하이드로겔 용액은 키토산과 콜라겐이 1:1의 중량부로 혼합되어 이루어지는 것을 특징으로 하는 온도반응형 천연고분자를 이용한 치료용 줄기세포 전달체의 제조방법.
- 청구항 6에 있어서,
상기 하이드로겔 용액은 키토산과 콜라겐 혼합물에 DMEM과 수산화나트륨을 혼합하여 제조되는 것을 특징으로 하는 온도반응형 천연고분자를 이용한 치료용 줄기세포 전달체의 제조방법.
- 청구항 8에 있어서,
상기 하이드로겔 용액은 키토산과 콜라겐을 1:1의 중량부로 혼합하고, 상기 혼합물 100 중량부 대비 DMEM을 40 내지 50 중량부 및 수산화나트륨 25 내지 35 중량부를 혼합하여 제조되는 것을 특징으로 하는 온도반응형 천연고분자를 이용한 치료용 줄기세포 전달체의 제조방법.
- 청구항 6 내지 9중 어느 한 항에 있어서,
상기 키토산은 탈아세틸화도가 75 내지 85%인 수용성 키토산으로 이루어지는 것을 특징으로 하는 온도반응형 천연고분자를 이용한 치료용 줄기세포 전달체의 제조방법.
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