KR20200040688A

KR20200040688A - 카벤 화합물, 카벤-금속나노입자 복합체 및 이의 제조방법

Info

Publication number: KR20200040688A
Application number: KR1020190125410A
Authority: KR
Inventors: 권오석; 강태준; 박선주; 박철순; 김경호; 김진영; 이지연; 이창수
Original assignee: 한국생명공학연구원
Priority date: 2018-10-10
Filing date: 2019-10-10
Publication date: 2020-04-20
Also published as: EP3865477A1; EP3865477B1; JP2022502470A; EP3865477A4; JP7212409B2; WO2020076106A1; CN113166072A; US20210356461A1; KR102291885B1; CN113166072B

Abstract

본 발명은 말단에 질소 함유 작용기를 가진 폴리에틸렌글리콜(PEG)이 치환된 카벤 화합물, 카벤 화합물과 금속나노입자가 결합된 카벤-금속나노입자 복합체, 이의 제조방법 및 이를 이용한 바이오 센서에 관한 것이다.

Description

카벤 화합물, 카벤-금속나노입자 복합체 및 이의 제조방법 {Carbene Compound, Carbene-Metal Nanoparticle Complex and Method for Manufacturing Thereof}

본 발명은 카벤 화합물, 카벤-금속나노입자 복합체 및 이의 제조방법에 관한 것이다.

금은 실생활뿐만 아니라 산업분야에서 그 가치가 매우 중요하며, 그것의 크기와 모양에 따라서, 다양한 분야(반도체 메모리 소자, 유기화학 반응 촉매, 차세대 에너지, 현장진단용 LFA(Lateral Flow Assay) 및 바이오 센서 분야 등)에서 독특한 물리적 및 화학적 성질을 보여주고 있다. 최근에는 나노 과학의 발전으로 인해, 금 나노 제조 등 금 가공방법의 개발에 따라 그 활용 범위가 더욱 다양해지고 있다.

금 나노프로브(나노입자(nanoparticle), 나노로드(nanorod) 등)의 대량 생산기술이 개발됨에 따라 바이오 산업분야에서 질병 진단 및 치료에 활용되고 있는데, 금 나노프로브에서는 특히 금 표면 처리기술이 성능에 미치는 영향이 매우 크다. 이러한 금 표면 처리를 위하여 종래 알킬아민(alkylamine), 카르복실산(carboxylic acid)(데칸산, 시트르산 등), 티올(thiol), 암모늄(ammonium) 등을 이용한 처리 방법이 물 또는 유기용매에 대한 분산성, 바이오 탐침부의 부착 용이성 등의 이점으로 인하여 널리 활용되고 있다.

이들 중에서도 티올은 금(Au)과 높은 결합강도를 가진다. 또한, 티올-금 결합은 높은 염 농도 용액 및 산/염기 용액 하에서 그 표면이 불안정하여 뭉침 현상이 발생하며, 특히 60℃ 이상 및 0℃ 이하에서 뭉침 현상이 매우 심하여 제품의 저장성에 심각한 한계를 가지고 있다. 예를 들어, 현장 진단용 LFA에 사용되는 제품인 금 나노프로브는 표면이 티올로 둘러싸여 수분산이 가능하게 출시되었으며, 반드시 냉장보관을 하도록 되어 있는데, 금 나노입자에 바이오 탐침부(예를 들어, 항체, DNA 등)를 고정화하면 제품을 냉장보관 할 수 없어 즉각적으로 사용을 해야 한다는 단점을 가진다. 그리고 LFA 제품의 특성상 아프리카와 같은 고온의 지역에도 많이 납품되므로, 고온에서 견딜 수 있는 높은 안정성을 가지는 금 나노프로브가 반드시 필요하다.

위와 같은 문제를 해결하기 위하여, 카벤 화합물과 금 원자 간의 반응성이 높고 단단한 결합이 가능하다는 장점 때문에, 종래에는 이미다졸륨 염(imidazolium salt)을 금 이온과 반응시켜 유기 금속 착물을 형성하고, 그 후에 환원 반응을 통해서 카벤 금 나노입자를 제조하는 방법(J. Am. Chem. Soc. 2015, 137, 7974-7977)이 사용되었으나 금 나노입자의 모양 또는 크기에 균일성이 없는 것으로 보이며, 벤즈이미다졸륨 염(benzimidazolium salt)을 금 이온(aurate ion)으로 음이온 변환하고 유기 금속 착물 형성과 환원 반응을 동시에 저온(0.6℃) 에서 반응시켜 균일한 형태의 금 나노입자를 합성(Chem. Mater. 2015, 27, 414-423)하였으나, 유기용매에서 합성함으로써 물에서는 분산이 되지 않아 이를 바이오 센서에 적용 또는 응용할 수 없다는 단점이 있다. 그리고 무엇보다 종래의 카벤 금 나노입자는 말단기에 아무런 기능성 작용기가 없어서, 바이오 센서 등에 적용이 불가능하다.

(특허문헌 1) 미국 공개특허공보 2006/0100365호(2006.05.11.)

본 발명은 LFA와 같은 바이오 센서 등의 분야에 이용될 수 있도록, 말단기에 기능성 작용기를 포함하는 카벤 화합물을 합성하여 결론적으로 카벤-금속나노입자의 표면을 안정화시켜, 고농도의 염(salt) 용액, 강산 또는 강염기, 고온 및 초극저온(ultra-low temperature)의 다양한 환경에서도, 화학적 및 물리적으로 안정성을 가진 카벤 금 나노입자 복합체를 제공하고자 한다.

본 발명은 말단에 질소 함유 작용기를 가진 폴리에틸렌글리콜(PEG)이 치환된 하기 화학식 1 또는 2로 표시되는 카벤 화합물을 제공한다:

[화학식 1]

[화학식 2]

상기 화학식 1 및 2에 있어서,

R1, R2, R5 및 R6은 서로 같거나 상이하고 각각 독립적으로 수소, 탄소수 1 내지 20의 알킬기, 탄소수 3 내지 20의 시클로알킬기, 탄소수 6 내지 30의 아릴기 또는 탄소수 2 내지 30의 헤테로아릴기이거나,

R3, R4, R7, R8, R9 및 R10은 서로 같거나 상이하고 각각 독립적으로 수소, 탄소수 1 내지 20의 알킬기, 탄소수 3 내지 20의 시클로알킬기, 탄소수 6 내지 30의 아릴기, 탄소수 2 내지 30의 헤테로아릴기 또는 하기 화학식 3으로 표시되는 구조이거나, R7 내지 R10 중 서로 인접한 두 개 이상의 치환기가 결합하여 탄화수소 고리를 형성하고,

R3 및 R4 중 적어도 하나는 하기 화학식 3으로 표시되는 구조이고,

R7 내지 R10 중 적어도 하나는 하기 화학식 3으로 표시되는 구조이거나, R7 내지 R10 중 서로 인접한 두 개 이상의 치환기가 결합하여 탄화수소 고리를 형성하는 경우 상기 탄화수소 고리를 형성하는 탄소에 결합된 수소 중 적어도 하나는 하기 화학식 3으로 표시되는 구조로 치환되고,

[화학식 3]

상기 화학식 3에 있어서,

n은 괄호 내 단위의 반복 수로 1 내지 30의 정수이고,

A는 질소(N) 원자를 포함하는 탄소수 1 내지 20의 지방족 탄화수소기 또는 질소(N) 원자를 포함하는 탄소수 2 내지 30의 방향족 탄화수소기이다.

또한, 본 발명은 전술한 카벤 화합물이 금속나노입자와 결합된 카벤-금속나노입자 복합체를 제공한다.

본 발명은 티올기를 함유한 폴리에틸렌글리콜과 금속나노입자를 혼합하는 단계 및 상기 티올기를 함유한 폴리에틸렌글리콜이 결합된 금속나노입자와 전술한 카벤 화합물을 혼합하는 단계를 포함하는 카벤-금속나노입자 복합체의 제조방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 전술한 카벤-금속나노입자 복합체를 포함하는 바이오 센서를 제공한다.

본 발명의 카벤 화합물은 안정성이 우수하여, 이를 금속에 결합시킨 카벤-금속나노입자 복합체는 종래의 금속 나노프로브에 비하여, 다양한 종류의 용매, 다양한 범위의 pH나 온도에서도 금속나노입자로부터 카벤 화합물이 쉽게 분리되지 않고, 따라서 본 발명의 카벤-금속나노입자 복합체를 이용하면 바이오 탐침부(생체 물질)를 보다 단단하게 고정할 수 있어서, 바이오 센서 등에 유용하게 적용될 수 있다.

도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 카벤 금 나노입자 복합체를 이용한 LFA의 모식도를 나타낸 도시이다.
도 2는 본 발명의 실험예 1에 따른 pH 안정성에 대한 실험 결과를 나타낸 도시이다.
도 3은 본 발명의 실험예 2의 <1>에 따른 염 안정성에 대한 실험 결과를 나타낸 도시이다.
도 4는 본 발명의 실험예 2의 <2>에 따른 용매 안정성에 대한 실험 결과를 나타낸 도시이다.
도 5는 본 발명의 실험예 3의 <1>에 따른 온도 안정성에 대한 실험 결과를 나타낸 도시이다.
도 6은 본 발명의 실험예 3의 <2>에 따른 금 나노입자의 온도안정성에 대한 실험 결과를 나타낸 도시이다.
도 7은 본 발명의 실험예 4에 따른 말라리아 진단 키트에 대한 실험 결과를 나타낸 도시이다.
도 8은 본 발명의 실험예 5에 따른 pH 안정성에 대한 실험 결과를 나타낸 도시이다.
도 9는 본 발명의 실험예 6에 따른 고온 안정성에 대한 실험 결과를 나타낸 도시이다.
도 10은 본 발명의 실험예 7에 따른 저온 안정성에 대한 실험 결과를 나타낸 도시이다.
도 11은 본 발명의 제조예 1에 따라 제조된 카벤 화합물의 ¹H-NMR 스펙트럼을 나타낸 도시이다.
도 12는 본 발명의 제조예 3에 따라 제조된 카벤 화합물의 ¹H-NMR 스펙트럼을 나타낸 도시이다.
도 13은 본 발명의 제조예 4에 따라 제조된 카벤 화합물의 ¹H-NMR 스펙트럼을 나타낸 도시이다.
도 14는 본 발명의 제조예 5에 따라 제조된 카벤 화합물의 ¹H-NMR 스펙트럼을 나타낸 도시이다.
도 15는 본 발명의 제조예 6에 따라 제조된 카벤 화합물의 ¹H-NMR 스펙트럼을 나타낸 도시이다.
도 16은 본 발명의 일 실시형태에 따른 카벤-금속나노입자 복합체의 TEM 이미지를 나타낸 도시이다.
도 17은 금-황 결합과 금-카벤 결합의 결합 에너지/결합 길이를 비교한 도시이다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

1. 카벤 화합물

본 발명은 말단에 질소 함유 작용기를 가진 폴리에틸렌글리콜(PEG)이 치환된 상기 화학식 1 또는 화학식 2로 표시되는 카벤 화합물을 제공한다.

상기 카벤 화합물은 말단에 질소 함유 작용기가 치환된 폴리에틸렌글리콜(PEG)을 카벤 화합물에 도입시켜 제조될 수 있다.

상기 카벤 화합물은 말단 부위에 폴리에틸렌글리콜 그룹을 도입함으로써 수분산성을 높여주고, 상기 폴리에틸렌글리콜 말단에 질소 함유 작용기를 도입함으로써, 향후 클릭 반응(click reaction)을 통해 질소 함유 작용기에 바이오 탐침부(예를 들어, 항체, DNA, 압타머, 프라이머 등)의 부착이 용이하도록 기능화된 것일 수 있다. 따라서, LFA 등에서 통상적으로 바이오 탐침부가 금속나노입자 간의 정전기적 인력에 의해 결합되는 것과는 다르게, 클릭 반응을 통한 단단한 화학적 공유결합으로 고정될 수 있는 장점이 있다.

상기 질소 함유 작용기는 아자이드(azide), 프탈이미드(phthalimide) 또는 아민(amine)일 수 있다.

상기 R1, R2, R5 및 R6은 서로 같거나 상이하고 각각 독립적으로 수소, 탄소수 1 내지 20의 알킬기 또는 탄소수 6 내지 30의 아릴기일 수 있다.

상기 R1, R2, R5 및 R6은 서로 같거나 상이하고 각각 독립적으로 수소 또는 탄소수 1 내지 20의 알킬기일 수 있다.

상기 R1, R2, R5 및 R6은 서로 같거나 상이하고 각각 독립적으로 수소, 이소프로필 또는 벤질일 수 있다.

상기 R1 및 R2 중 적어도 하나 및 상기 R5 및 R6 중 적어도 하나는 서로 같거나 상이하며 각각 독립적으로 탄소수 1 내지 20의 알킬기 또는 탄소수 6 내지 30의 아릴기일 수 있다.

상기 R1 및 R2 중 적어도 하나 및 상기 R5 및 R6 중 적어도 하나는 서로 같거나 상이하며 각각 독립적으로 이소프로필 또는 벤질일 수 있다.

상기 R3, R4, R7, R8, R9 및 R10은 서로 같거나 상이하고 각각 독립적으로 수소, 탄소수 1 내지 20의 알킬기, 탄소수 3 내지 20의 시클로알킬기, 탄소수 6 내지 30의 아릴기, 탄소수 2 내지 30의 헤테로아릴기 또는 상기 화학식 3으로 표시되는 구조이거나, R7 내지 R10 중 서로 인접한 두 개 이상의 치환기가 결합하여 탄화수소 고리를 형성할 수 있다.

상기 R3, R4, R7, R8, R9 및 R10은 서로 같거나 상이하고 각각 독립적으로 수소 또는 상기 화학식 3으로 표시되는 구조이거나, R7 내지 R10 중 서로 인접한 두 개 이상의 치환기가 결합하여 탄화수소 고리를 형성할 수 있다.

상기 R7 내지 R10 중 서로 인접한 두 개 이상의 치환기가 결합하여 탄화수소 고리를 형성하는 경우 상기 탄화수소 고리를 형성하는 탄소에 결합된 수소 중 적어도 하나는 상기 화학식 3으로 표시되는 구조로 치환될 수 있다.

상기 R3 및 R4 중 적어도 하나는 상기 화학식 3으로 표시되는 구조일 수 있다. 또한, 상기 R7 내지 R10 중 적어도 하나는 상기 화학식 3으로 표시되는 구조일 수 있다.

상기 n은 괄호 내 단위의 반복 수로 1 내지 30의 정수일 수 있고, 바람직하게는 1 내지 10일 수 있다. 상기 n이 1 미만인 경우 카벤 화합물의 수분산성이 떨어지게 되며, n이 30 초과인 경우 긴 폴리에틸렌글리콜의 사슬 때문에 바이오 탐침부 간의 거리가 멀어져서 오히려 바이오 센싱 효율이 감소하게 된다.

상기 A는 질소(N) 원자를 포함하는 탄소수 1 내지 20의 알킬기 또는 질소(N) 원자를 포함하는 탄소수 2 내지 30의 헤테로아릴기이다. 구체적으로 상기 A는 아자이드(azide), 프탈이미드(phthalimide) 또는 아민(amine)일 수 있다.

본 발명에 있어서, "인접한" 기는 해당 치환기가 치환된 원자와 직접 연결된 원자에 치환된 치환기, 해당 치환기와 입체구조적으로 가장 가깝게 위치한 치환기, 또는 해당 치환기가 치환된 원자에 치환된 다른 치환기를 의미할 수 있다. 예컨대, 벤젠고리에서 오쏘(ortho) 위치로 치환된 2개의 치환기 및 지방족 고리에서 동일 탄소에 치환된 2개의 치환기는 서로 "인접한" 기로 해석될 수 있다.

상기 알킬기는 직쇄 또는 분지쇄일 수 있고, 탄소수 1 내지 20일 수 있고, 바람직하게는 탄소수 1 내지 10일 수 있다. 더 바람직하게는 탄소수 1 내지 6일 수 있다. 상기 알킬기의 구체적인 예로는 메틸, 에틸, 프로필, n-프로필, 이소프로필, 부틸, n-부틸, 이소부틸, tert-부틸, sec-부틸, 1-메틸부틸, 1-에틸부틸, 펜틸, n-펜틸, 이소펜틸, 네오펜틸, tert-펜틸, 헥실, n-헥실, 1-메틸펜틸, 2-메틸펜틸, 4-메틸-2-펜틸, 3,3-디메틸부틸, 2-에틸부틸, 헵틸, n-헵틸, 1-메틸헥실, 시클로펜틸메틸, 시클로헥실메틸, 옥틸, n-옥틸, tert-옥틸, 1-메틸헵틸, 2-에틸헥실, 2-프로필펜틸, n-노닐, 2,2-디메틸헵틸, 1-에틸프로필, 1,1-디메틸프로필, 이소헥실, 4-메틸헥실, 5-메틸헥실, 벤질 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 시클로알킬기는 탄소수 3 내지 20일 수 있고, 바람직하게는 탄소수 3 내지 10일 수 있다. 상기 시클로알킬기의 구체적인 예로는 시클로프로필, 시클로부틸, 시클로펜틸, 3-메틸시클로펜틸, 2,3-디메틸시클로펜틸, 시클로헥실, 3-메틸시클로헥실, 4-메틸시클로헥실, 2,3-디메틸시클로헥실, 3,4,5-트리메틸시클로헥실, 4-tert-부틸시클로헥실, 시클로헵틸, 시클로옥틸 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 아릴기는 탄소수 6 내지 30일 수 있고, 바람직하게는 탄소수 6 내지 10일 수 있다. 상기 아릴기는 단환식 아릴기 또는 다환식 아릴기일 수 있다. 상기 단환식 아릴기의 구체적인 예로는 페닐기, 바이페닐기, 터페닐기 등이 있고, 상기 다환식 아릴기의 구체적인 예로는 나프틸기, 안트라세닐기, 페난트릴기, 파이레닐기, 페릴레닐기, 크라이세닐기, 플루오레닐기, 트리페닐렌기 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 헤테로아릴기는 이종원자로 N, O, P, S, Si 및 Se 중 선택되는 1개 이상을 포함하는 방향족 고리기로서, 탄소수는 2 내지 30일 수 있고, 바람직하게는 탄소수 2 내지 20일 수 있다. 상기 헤테로아릴기의 구체적인 예로는 티오펜기, 퓨란기, 피롤기, 이미다졸기, 티아졸기, 옥사졸기, 옥사디아졸기, 트리아졸기, 피리딜기, 피리미딜기, 트리아진기, 트리아졸기, 아크리딜기, 퀴놀리닐기, 퀴나졸린기, 퀴녹살리닐기, 프탈라지닐기, 이소퀴놀린기, 인돌기, 카바졸기, 벤즈옥사졸기, 벤즈이미다졸기, 벤조티아졸기, 벤조카바졸기, 벤조티오펜기, 디벤조티오펜기, 벤조퓨라닐기 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

또한, 상기 알킬기, 시클로알킬기, 아릴기, 헤테로아릴기 또는 탄화수소 고리는 다시 알킬기, 시클로알킬기, 아릴기 또는 헤테로아릴기로 치환 또는 비치환될 수 있다.

2. 카벤-금속나노입자 복합체 및 이의 제조방법

본 발명은 전술한 카벤 화합물이 금속나노입자와 결합된 카벤-금속나노입자 복합체를 제공한다.

상기 금속나노입자의 입자 직경은 1 ㎚ 내지 40 ㎚일 수 있다. 상기 금속나노입자의 입자 직경이 1 ㎚ 미만인 경우 금속나노입자의 표면에 필요한 수준의 카벤 화합물을 도입하기가 어려워 바이오 센서로서의 효율이 떨어지게 되고, 상기 금속나노입자의 입자 직경이 40 ㎚ 초과인 경우 카벤-금속나노입자 복합체가 균일하지 못하여 바이오 센서의 효율 및 재현성이 떨어질 수 있다. 즉, 40 ㎚를 초과하면 작은 환경의 변화만으로도 금속나노입자의 뭉침현상이 발생할 가능성이 높아진다.

상기 금속나노입자는 구리(Cu), 코발트(Co), 비스무트(Bi), 은(Ag), 알루미늄(Al), 금(Au), 하프늄(Hf), 크롬(Cr), 인듐(In), 망간(Mn), 몰리브데넘(Mo), 마그네슘(Mg), 니켈(Ni), 나이오븀(Nb), 납(Pb), 팔라듐(Pd), 백금(Pt), 레늄(Re), 로듐(Rh), 안티모니(Sb), 탄탈럼(Ta), 티타늄(Ti), 텅스텐(W), 바나듐(V), 지르코늄(Zr), 아연(Zn), 철(Fe) 및 이들의 조합(예를 들어, 두 금속나노입자(bimetallic nanoparticles))으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나일 수 있다. 바람직하게는, 상기 카벤-금속나노입자 복합체가 적용될 바이오 센서의 다양한 환경에서의 안정성, 결정성 및 카벤 화합물과 금속나노입자의 표면 간의 결합력을 고려하면, 상기 금속은 금(Au)일 수 있다.

상기 카벤-금속나노입자 복합체는 도 16의 TEM 이미지에 나타내 바와 같이, 균일한 형태를 가질 수 있고, 카벤-금속나노입자 복합체가 균일한 형태를 가지기 때문에 수분산성이 우수해진다.

또한, 본 발명은 일 말단에 티올기를 포함하고 다른 말단에 질소 함유 작용기를 포함하는 폴리에틸렌글리콜과 금속나노입자를 혼합하여 황-금속나노입자를 제조하는 단계 및 상기 황-금속나노입자와 전술한 카벤 화합물을 혼합하는 단계를 포함하는 카벤-금속나노입자 복합체의 제조방법을 제공한다.

구체적으로, 상기 일 말단에 티올기를 포함하고 다른 말단에 질소 함유 작용기를 포함하는 폴리에틸렌글리콜과 금속나노입자를 혼합하는 경우, 티올기의 황이 금속 표면에서 금속-황 결합을 매개로 하여, 금속나노입자의 표면에 말단에 질소 함유 작용기를 포함하는 폴리에틸렌글리콜이 도입될 수 있다. 이렇게 형성된 황-금속나노입자에 본 발명에 따른 전술한 카벤 화합물을 도입하게 되면, 금속나노입자의 표면에 존재하는 금속-황 결합이 금속-카벤 결합으로 치환되면서, 최종적으로 카벤-금속나노입자 복합체가 형성될 수 있다.

이 때, 상기 금속나노입자의 표면에 존재하는 금속-황 결합을 금속-카벤 결합으로 치환하는 반응은 상온(20℃ 내지 30℃)에서 일어날 수 있다. 알려진 바와 같이 금속-카벤 결합이 금속-황 결합보다 결합력이 강하기 때문에, 상온에서 1 내지 10시간 방치하는 것만으로도 치환반응이 일어날 수 있다. 특히, 도 17에 따르면, 상기 금속이 금(Au)인 경우에, 금-황 결합(결합 에너지: -14.36 Kcal/mol, 결합 길이: 2.60 Å)보다 금-카벤 결합의(결합 에너지: -63.55 Kcal/mol, 결합 길이: 2.03 Å) 세기가 더 강하기 때문에, 위와 같이 상온에서도 금속-황 결합이 금-카벤 결합으로의 치환이 용이할 수 있다(Chem. Soc. Rev. 2017 Apr 18;46(8):2057-2075 참고).

상기 카벤-금속나노입자 복합체는 위와 같이 말단에 질소기가 노출된 상태로 존재하기 때문에, 이후 바이오 탐침부(생체 물질)를 보다 용이하게 결합시킬 수 있는 장점이 있다. 특히, 금속-황 결합과 달리 금속-카벤 결합의 안정성으로 인하여, 고농도의 염(salt) 조건, 강산 또는 약염기 조건, 고온 및 초극저온(ultra low temperature)의 다양한 환경에서도 금속-카벤 결합을 유지함으로써 카벤-금속나노입자 복합체의 뭉침현상이 일어나지 않는 효과가 있다.

3. 바이오 센서

본 발명은 전술한 카벤-금속나노입자 복합체를 포함하는 바이오 센서를 제공한다.

상기 바이오 센서는 특히, 금속나노입자의 입자 크기, 재질, 모양, 주변 환경에 의해 색깔이 달라지고, 이에 따라 금속나노입자의 표면 플라즈몬 밴드(surface plasmon band)가 변화하는 것을 이용하는 나노 바이오 센서일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니며, 휴대가 용이하도록 제조된 현장진단용 LFA(Lateral Flow Assay) 진단 키트일 수 있으며, 이 외에도, SERS(Surface-Enhanced Raman Spectroscopy) 기반의 바이오 센서, Dark field 기반의 바이오 센서 등이 적용될 수 있다.

이 때, 바이오 센서는 분석하고자 하는 생체 물질과 특이적으로 결합하는 바이오 탐침부(예를 들어, 항체, DNA, 압타머, 프라이머 등)를 기판 또는 금속나노입자에 고정화시키는 것이 중요하다.

상기 바이오 센서에서, 본 발명의 카벤-금속나노입자 복합체는 바이오 탐침부를 고정화하는 역할을 할 수 있다. 구체적으로 본 발명의 카벤-금속나노입자 복합체는 말단에 질소 함유 작용기를 포함하고 있어서, 클릭 반응(click reaction)을 이용하여 질소 함유 작용기에 바이오 탐침부(예를 들어, 항체, DNA, 압타머, 프라이머 등)가 부착될 수 있다. 이에 따라, 통상적으로 바이오 탐침부가 금속나노입자와 정전기적 인력에 의하여 결합되는 것과는 다르게, 바이오 탐침부가 금속나노입자에 더 단단한 화학적 결합으로 고정화될 수 있기 때문에, 이를 바이오 센서 등의 분야에 적용하는 경우 제품의 우수한 저장성 및 보관 용이성과 더불어 다양한 환경에의 적용성도 높일 수 있는 장점이 있다.

이하에서, 바람직한 실시예를 들어 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다.

그러나 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이에 의하여 한정되는 것은 아니다.

<제조예> 카벤 화합물의 제조

<제조예 1>

위와 같은 반응식에 따라, 카벤 화합물 1을 제조하였다.

도 11에 카벤 화합물 1의 ¹H-NMR 분석 결과를 나타내었다.

<제조예 2>

위와 같은 반응식에 따라, 카벤 화합물 2를 제조하였다.

<제조예 3>

위와 같은 반응식에 따라, 카벤 화합물 3을 제조하였다.

도 12에 카벤 화합물 3의 ¹H-NMR 분석 결과를 나타내었다.

<제조예 4>

위와 같은 반응식에 따라, 카벤 화합물 4를 제조하였다.

도 13에 카벤 화합물 4의 ¹H-NMR 분석 결과를 나타내었다.

<제조예 5>

위와 같은 반응식에 따라, 카벤 화합물 5를 제조하였다.

도 14에 카벤 화합물 5의 ¹H-NMR 분석 결과를 나타내었다.

<제조예 6>

위와 같은 반응식에 따라, 카벤 화합물 6을 제조하였다.

도 15에 카벤 화합물 6의 ¹H-NMR 분석 결과를 나타내었다.

<실시예> 카벤 금 나노입자 복합체의 제조

<실시예 1>

먼저 말단에 아자이드가 도입된 티올-PEG 화합물을 유기용매에 분산된 금 나노입자에 넣고 금-황 결합으로 제조된 금 나노입자 복합체(Au NPs Thiol)를 제조하였다.

이후, 제조예 1에서 제조한 카벤 화합물 1을 넣어, 금-황 결합을 금-카벤 결합으로 치환하여, 카벤 금 나노입자 복합체(Au NPs Carbene)를 제조하였다.

<비교예 1>

아래 구조와 같은 금 나노입자 복합체를 준비하였다.

<비교예 2>

아래 구조와 같은 금 나노입자 복합체를 준비하였다.

<실험예>

<실험예 1> pH 안정성 실험

pH 1 내지 12의 용액을 각각 준비하고, 실시예 1의 카벤 금 나노입자 복합체(Au NPs Carbene), 금 나노입자 복합체(Au NPs Thiol)를 담가, 용액의 색깔 변화를 관찰하고, 그 결과를 도 2에 나타내었다.

<실험예 2> 염 안정성 실험

<1> 물, NaCl 농도 10 mM, 50 mM, 100 mM, 250 mM, 500 mM, 1,000 mM의 수용액을 준비하고, 실시예 1의 카벤 금 나노입자 복합체(Au NPs Carbene), 금 나노입자 복합체(Au NPs Thiol)를 담가, 용액의 색깔 변화를 관찰하고, 그 결과를 도 3에 나타내었다.

<2> 고농도 염이온 수용액에서의 안정성을 확인하기 위하여, 1,000 mM의 NaCl 수용액에 실시예 1의 카벤 금 나노입자 복합체(Au NPs Carbene), 비교예 2의 금 나노입자 복합체를 담가, 용액의 색깔 변화를 관찰하고, 그 결과를 도 4에 나타내었다.

<실험예 3> 온도 안정성 실험

<1> 실시예 1의 카벤 금 나노입자 복합체(Au NPs Carbene)가 혼합된 -20℃ 의 저온 및 -78℃의 극저온의 수용액을 준비하고, 상온에서 방치한 후 1일, 3일, 5일, 7일 후의 용액의 색깔 변화를 관찰하고, 그 결과를 도 5에 나타내었다.

<2> 5 ㎚의 금 나노입자(Aldrich)와 20 ㎚의 금 나노입자(BBI solution)를 준비하여 수용액을 제조한 후, 각각 -20℃로 냉동하고, 다시 상온에서 5일간 방치하면서 수용액의 변화를 관찰하고, 그 결과를 도 6에 나타내었다.

<실험예 4> 말라리아 진단 키트

실시예 1의 카벤 금 나노입자 복합체(Au NPs Carbene)에 말라리아 항체를 클릭 반응(click reaction)으로 도입하여, 말라리아 진단 키트(LFA)를 제조하였다.

100 ng/ml, 10 ng/ml, 1 ng/ml의 말라리아 항원 시료를 가지고 진단 테스트를 실시하였고, 그 결과를 도 7에 나타내었다.

<실험예 5> pH 안정성 실험

pH 1 내지 12의 용액을 각각 준비하고, 실시예 1의 카벤 금 나노입자 복합체(Au NPs Carbene), 비교예 1의 금 나노입자 복합체를 담가, 용액의 색깔 변화를 관찰하고, 그 결과를 도 8에 나타내었다.

<실험예 6> 고온 안정성 실험

실시예 1의 카벤 금 나노입자 복합체(Au NPs Carbene), 비교예 1의 금 나노입자 복합체가 담긴 수용액을 각각 준비하고, 100℃에서 6시간 방치한 후 용액의 색깔 변화를 관찰하고, 그 결과를 도 9에 나타내었다.

<실험예 7> 저온 안정성 실험

실시예 1의 카벤 금 나노입자 복합체(Au NPs Carbene), 비교예 1의 금 나노입자 복합체가 담긴 수용액을 각각 준비하고, -20℃에서 6시간 방치한 후 용액의 색깔 변화를 관찰하고, 그 결과를 도 10에 나타내었다.

상기 실험예 1 및 실험예 5에 따르면, 티올-PEG가 결합된 금 나노입자(Au NPs Thiol) 및 금 나노입자(Au NPs)는 강산, 강염기의 조건에서 금 나노입자에 결합된 리간드가 떨어짐으로 인해 금 나노입자의 뭉침현상으로 보라색을 나타내는 반면에, 본 발명에 따른 카벤 금 나노입자 복합체(Au NPs Carbene)는 pH 전영역에서 금 나노입자가 뭉치지 않고 안정하게 유지되는 것(pH 전영역에서 색 변화가 없음)을 확인할 수 있었다.

상기 실험예 2의 <1> 및 <2>에 따르면, 티올-PEG가 결합된 금 나노입자(Au NPs Thiol) 및 금 나노입자(Au NPs)는 각각 50 mM, 100 mM 농도 부근에서부터 금 나노입자에 결합된 리간드가 떨어짐으로 인해 금 나노입자의 뭉침현상으로 검붉은색을 나타내는 반면에, 본 발명에 따른 카벤 금 나노입자 복합체(Au NPs Carbene)는 NaCl 염의 전 농도 영역(0~1,000mM)에서 금 나노입자가 뭉치지 않고 안정하게 유지되는 것을 확인할 수 있었다.

실험예 3의 <1>, 실험예 6, 실험예 7에 따르면, 금-황 결합으로 도입된 금 나노입자는 고온(70℃) 및 저온(-20℃)에서 금 나노입자에 결합된 리간드가 떨어짐으로 인해 금 나노입자의 뭉침현상으로 보라색을 나타내는 반면에, 본 발명에 따른 카벤 금 나노입자 복합체(Au NPs Carbene)는 고온(100℃), 저온(-20℃), 극저온(-78℃)에서도 금 나노입자가 뭉치지 않고 안정하게 유지되는 것을 확인할 수 있었다.

한편, 실험예 3의 <2>에 따르면, 대조군으로 금 나노입자의 경우 저온(-20℃)에서는 수분에서 수시간 내에 금 나노입자가 뭉쳐서 가라앉는 현상을 확인할 수 있었다.

실험예 4에 따르면, 본 발명에 따른 카벤 금 나노입자 복합체(Au NPs Carbene)를 적용한 말라리아 진단 키트에서, 10 ng/ml의 낮은 농도에서도 진단이 가능한 것을 확인할 수 있었다.

Claims

말단에 질소 함유 작용기를 가진 폴리에틸렌글리콜(PEG)이 치환된 하기 화학식 1 또는 화학식 2로 표시되는 카벤 화합물:
[화학식 1]

[화학식 2]

상기 화학식 1 및 화학식 2에 있어서,
R1, R2, R5 및 R6은 서로 같거나 상이하고 각각 독립적으로 수소, 탄소수 1 내지 20의 알킬기, 탄소수 3 내지 20의 시클로알킬기, 탄소수 6 내지 30의 아릴기 또는 탄소수 2 내지 30의 헤테로아릴기이거나,
R3, R4, R7, R8, R9 및 R10은 서로 같거나 상이하고 각각 독립적으로 수소, 탄소수 1 내지 20의 알킬기, 탄소수 3 내지 20의 시클로알킬기, 탄소수 6 내지 30의 아릴기, 탄소수 2 내지 30의 헤테로아릴기 또는 하기 화학식 3으로 표시되는 구조이거나, R7 내지 R10 중 서로 인접한 두 개 이상의 치환기가 결합하여 탄화수소 고리를 형성하고,
R3 및 R4 중 적어도 하나는 하기 화학식 3으로 표시되는 구조이고,
R7 내지 R10 중 적어도 하나는 하기 화학식 3으로 표시되는 구조이거나, R7 내지 R10 중 서로 인접한 두 개 이상의 치환기가 결합하여 탄화수소 고리를 형성하는 경우 상기 탄화수소 고리를 형성하는 탄소에 결합된 수소 중 적어도 하나는 하기 화학식 3으로 표시되는 구조로 치환되고,
[화학식 3]

상기 화학식 3에 있어서,
n은 괄호 내 단위의 반복 수로 1 내지 30의 정수이고,
A는 질소(N) 원자를 포함하는 탄소수 1 내지 20의 알킬기 또는 질소(N) 원자를 포함하는 탄소수 2 내지 30의 헤테로아릴기이다.
청구항 1에 있어서,
상기 질소 함유 작용기는 아자이드(azide), 프탈이미드(phthalimide) 및 아민(amine)으로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나인 카벤 화합물.
청구항 1에 있어서,
상기 R1 및 R2 중 적어도 하나 및 상기 R5 및 R6 중 적어도 하나는 서로 같거나 상이하며 각각 독립적으로 탄소수 1 내지 20의 알킬기, 탄소수 3 내지 20의 시클로알킬기, 탄소수 6 내지 30의 아릴기 또는 탄소수 2 내지 30의 헤테로아릴기인 카벤 화합물.
청구항 1 내지 청구항 3 중 어느 한 항에 따른 카벤 화합물이 금속나노입자와 결합된 카벤-금속나노입자 복합체.
청구항 4에 있어서,
상기 금속나노입자의 입자 직경이 1 ㎚ 내지 40 ㎚인 카벤-금속나노입자 복합체.
청구항 4에 있어서,
상기 금속은 구리(Cu), 코발트(Co), 비스무트(Bi), 은(Ag), 알루미늄(Al), 금(Au), 하프늄(Hf), 크롬(Cr), 인?(In), 망간(Mn), 몰리브데넘(Mo), 마그네슘(Mg), 니켈(Ni), 나이오븀(Nb), 납(Pb), 팔라듐(Pd), 백금(Pt), 레늄(Re), 로듐(Rh), 안티모니(Sb), 탄탈럼(Ta), 티타늄(Ti), 텅스텐(W), 바나듐(V), 지르코늄(Zr), 아연(Zn), 철(Fe) 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나인 카벤-금속나노입자 복합체.
일 말단에 티올기를 포함하고 다른 말단에 질소 함유 작용기를 포함하는 폴리에틸렌글리콜과 금속나노입자를 혼합하여, 황-금속나노입자를 제조하는 단계; 및
상기 황-금속나노입자와 청구항 1 내지 청구항 3 중 어느 한 항에 따른 카벤 화합물을 혼합하는 단계;
를 포함하는 카벤-금속나노입자 복합체의 제조방법.
청구항 7에 있어서,
상기 황-금속나노입자와 상기 카벤 화합물을 혼합하는 단계는, 상기 금속나노입자의 표면에 존재하는 금속-황 결합을 금속-카벤 결합으로 치환하는 단계를 포함하는 카벤-금속나노입자 복합체의 제조방법.
바이오 탐침부가 클릭 반응(click reaction)을 통해 고정화된, 청구항 4에 따른 카벤-금속나노입자 복합체를 포함하는 바이오 센서.