KR20200037795A - 표적 입자 또는 세포의 선택적인 농화를 위한 플로우 셀 - Google Patents

표적 입자 또는 세포의 선택적인 농화를 위한 플로우 셀 Download PDF

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Abstract

본 발명은 미세유체 분야에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명은 유체로부터 표적 입자 또는 세포의 선택적인 농화를 위한 신규한 플로우 셀에 관한 것이다. 플로우 셀은 표적 입자 또는 세포의 수율을 크게 향상시키는 신규한 디자인을 나타낸다. 본 발명은 또한 본 발명에 따른 플로우 셀을 포함하는 미세유체 장치를 제공한다. 다른 측면에서, 본 발명은 유체 샘플로부터 표적 입자 또는 세포를 고립시키기 위한 본 발명의 플로우 셀 또는 미세유체 장치의 용도에 관한 것이다. 마지막으로, 본 발명은 본 발명의 플로우 셀을 사용하여 유체로부터 표적 입자 또는 세포를 선택적으로 농화시키는 방법에 관한 것이다.

Description

표적 입자 또는 세포의 선택적인 농화를 위한 플로우 셀
본 발명은 미세유체 공학 분야에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명은 유체로부터 표적 입자 또는 세포의 선택적인 농화(enrichment)를 위한 신규한 플로우 셀에 관한 것이다. 플로우 셀은 표적 입자 또는 세포의 수율을 크게 향상시키는 신규한 디자인을 나타낸다. 본 발명은 또한 본 발명에 따른 플로우 셀을 포함하는 미세유체 장치를 제공한다. 다른 측면에서, 본 발명은 유체 샘플로부터 표적 입자 또는 세포의 고립을 위한 본 발명의 플로우 셀 또는 미세유체 장치의 용도에 관한 것이다. 마지막으로, 본 발명은 본 발명의 플로우 셀을 사용하여 유체로부터 표적 입자 또는 세포의 선택적인 농화를 위한 방법에 관한 것이다.
액체에서 희귀 세포의 신뢰성 있는 검출은 상이한 실제 분야들에서 중요하다. 예를 들어, 식수에서 병원성 박테리아의 검출 및 정량화는 지극히 중요하다. 다른 예는 혈액에 순환 종양 세포(CTC)의 검출인데, 이는 종양 질환을 모니터링하고 제어하는 분야에서 중요한 도구가 되었다. 원발성 종양으로부터 확산되어 혈액으로 순환하는 종양 세포는 유방암과 같은 암에 걸린 환자에게 큰 위험을 초래하는데, 그 이유는 이들 종양 세포들이 전이를 형성할 수 있기 때문이다. 따라서, 혈액에서 순환 종양 세포의 검출은 암 진단 후 예후를 결정하고, 전이의 위험을 평가하고, 치료 모니터링을 위해 중요하다.
그러나, 혈액 내 이들 세포의 농도가 매우 낮아서 세포의 초기 농화 또는 고립이 필수적이기 때문에, CTC의 검출은 기술적으로 어렵다. 한편, 혈액으로부터 CTC를 분리하기 위해 분리 및 농화를 위한 몇몇 면역 세포 화학적 방법들이 확립되었다. 예를 들어, 종양-특이적 세포 표면 항원에 대한 항체로 유도체화된 마그네틱 입자들이 혈액 샘플로부터 종양 세포 또는 종양 세포 클러스터를 분리하기 위해 사용된다. 그러나, 확립된 시스템들은 충분히 선택적인 것이 아니고 따라서 불특정 세포 결합을 자주 나타낸다. 또한, 당업계에 공지된 시스템들은 고가이며, 이들 시스템의 사용은 종종 시간 소모적이다.
면역 세포 화학적 농화 방법 이외에, 유체에서 입자 또는 세포의 검출을 위해 소위 미세유체 시스템들이 개발되었다. 이들 시스템은 플로우 셀 재료 내에 에칭되거나 성형된 마이크로 채널을 갖는 유리 또는 폴리머 플로우 셀을 포함한다. 관심있는 입자 또는 세포를 함유한 유체는 채널을 통해 인도되며 입자 또는 세포에 대해 특이성을 나타내는 분자로 유도체화된 표면들에 의해 포획된다. 그러나, 미세유체 플로우 셀 또는 장치를 통해 인도될 때, 세포들은 유동 채널을 가로 질러 최소의 분자 확산하며 유선(streamline)을 추종하는 것이 밝혀졌다. 혼합의 결과적인 부족은 세포 또는 입자와 유도체화된 포획 표면 사이에 상호 작용의 수를 감소시키며, 이에 의해 낮은 포집 효율로 이어진다. 따라서, 유체의 층상 단축 유동의 효과적인 혼합은 관류 시스템(flow-through system)에서 입자 또는 세포의 분리를 위해 필수적이다. 혼합은 입자 또는 세포와 플로우 셀의 표면 사이에 개선된 접촉을 제공한다.
이러한 목적을 위해, 플로우 셀 내의 마이크로 채널에는 종종 직선 유동을 방해하는 장벽 요소들이 장착되고, 이에 의해 유동의 반전을 생성한다. 예를 들어, 층류의 한정된 편향을 야기하는 마이크로 컬럼을 포함하는 미세유체 시스템들이 개발되었다. 소위 "CTC-Chip"(Nagrath et al. 2007)은 층류를 방해하고 동시에 칩의 표면을 상당히 확장시키는 대략 78,000 개의 마이크로 컬럼들을 사용합니다. CTC-Chip의 표면은 상기 표면과 접촉시 종양 세포를 포집하기 위해 안티-EpCAM 항체에 의해 화학적으로 기능화된다. 이 시스템은 1-2 ml/h의 최대 유동률로 작동할 수 있으며 60 내지 65%의 포집 효율에 도달한다.
유사하게, [Sheng et al.(2012)]은 채널당 약 59,000 개의 컬럼들을 포함하는 미세유체 시스템을 사용한다. 전술한 항체 대신에, 고정화된 종양 세포 특이적 압타머가 마이크로 컬럼, 즉 종양 세포의 표면 구조에 결합하는 단일 가닥 DNA 올리고뉴클레오티드에 코팅된다. 600 nl/s의 유동률을 갖는 전혈 샘플과 함께 40 ㎛ 높이의 마이크로 채널에서 이 시스템을 사용하여, 95% 초과의 종양 세포의 포집 효율이 달성되었다. 1 ml의 전혈이 28분 내에 처리되었다. 광학 검출 시스템에 의한 포집 입자 또는 세포의 후속 검출은 마이크로 컬럼을 포함하는 시스템에서 어려운데, 그 이유는 3차원 시스템이고 세포가 초점의 동일한 레벨에 존재하지 않기 때문이다.
위에서 언급한 마이크로 컬럼 외에, 예를 들어 ["헤링본 칩"(Stott et al. 2010)]에 소위 생선뼈 구조들이 사용되었다. 이 칩은 표면에 생선뼈 구조를 포함하는 8개의 마이크로 채널들을 포함하고 있다. 채널의 모든 내부 벽들은 anti-EpCAM 항체가 코팅되어 있다. 저자에 따르면, 생선뼈 구조는 층류에 소용돌이를 유도하는데 이는 시스템에서 세포 표면 상호 작용을 증가시킨다. 그러나, 이 소형화 수준의 미세유체 시스템에서는, 수성 시스템에서 레이놀즈 수가 적기 때문에 소용돌이가 일어날 수 없고, 따라서 이들 시스템에서의 유동은 실제로 층류이다. 종양 세포 라인 PC-3에 대한 91.8% ± 5.2%(n = 6)의 포집 효율이 1.2 ml/h의 유동률을 사용하여 이 칩으로 달성되었다.
또한, 사인 형상 마이크로 컬럼들이 사용되었고, 이 안에서 세포는 원심력에 의해 채널 벽들에 운반된다(Adams et al. 2008, Kamande et al. 2013). 이들 벽의 폭은 적용 분야에 따라 변하며, 이에 의해 이러한 시스템의 표준화를 불가능하게 한다. [Warkiani et al.(2013)]은 그 안에서 표적 세포들이 채널의 외벽을 향하여 유동하는 사다리꼴 마이크로 채널을 사용한다.
전술한 플로우 셀 시스템들을 이용하여, 예를 들어 혈소판, 대식세포, 순환 종양 세포, 적혈구, 백혈구 등의 다양한 입자 또는 세포가 전혈 샘플에서 선택적으로 분리되어 유도체화된 표면에 포획될 수 있다. 그러나 상기 시스템들은 분리 시간이 비교적 길고 따라서 적은 양의 샘플을 처리하는 데만 유용하다. 또한, 상기 시스템들의 어떠한 것도 입자-표면 접촉의 수를 효과적으로 증가시킬 수 없다. 또한, 칩 또는 플로우 셀 표면에 통합된 장벽 요소들은 자동화된 광학 검출 및 평가에 과도하게 방해하거나 심지어 불가능하게 한다. 그러므로, 현재 사용되는 시스템들의 단점을 극복할 수 있는 새로운 미세유체 시스템들에 대한 요구가 있다.
본 발명은 상기 단점을 극복하고 개선된 입자 또는 세포 수율을 제공하는 신규한 구조를 갖는 미세유체 플로우 셀을 제공한다. 특히, 본 발명은 유체로부터 표적 입자 또는 표적 세포의 선택적인 농화 또는 분리를 위한 미세유체 플로우 셀에 관한 것이다. 플로우 셀은 상기 플로우 셀을 통해 유체를 인도하기 위한 적어도 하나의 구불구불한 형상의 유동 채널을 형성하기 위하여 상호 결합 가능한 상부 및 하부를 포함한다. 바람직하게는, 유동 채널은 예를 들어 에칭 또는 절삭에 의해서 플로우 셀의 상부 내에 오목하게 형성되며, 플로우 셀의 두 부분을 서로 끼워 맞춤한 후에 플로우 셀의 하부의 표면은 유동 채널의 하부 플레이트를 형성한다. 구불구불한 형상의 유동 채널은 플로우 셀의 대향 측면으로부터 교대로 연장되는 복수의 이격된 내벽부에 의해 형성된다.
유동 채널의 예시적인 실시예들이 도 2a, 2b 및 2c에 도시되어 있다. 이들 개략도에서, 플로우 셀의 상부는 유동 채널이 상부 내에 오목하게 형성된 상태로 도시되어 있다. 플로우 셀의 상부에 오목한 유동 채널은 구불구불한 형상의 패턴을 가지며, 이는 유동 채널이 상기 채널을 통해 유동하는 유체의 유동이 채널의 공간적 연장부를 따라 여러 번 역전되도록 하는 형상으로 형성되는 것을 의미한다. 바람직하게는, 유동 채널은 본질적으로 180도 만큼, 즉 유동의 방향이 완전한 반전으로 유동의 방향을 1회 이상 변경하기 위해 S 자형 또는 사인곡선 형태이다. 결과적으로, 채널을 통해 인도되는 유체 스트림은 채널의 인접한 섹션들을 통해 유동할 때 그 방향을 변경한다. 보다 구체적으로, 유체 스트림은 플로우 셀의 대향 측면으로부터 연장되는 내벽부들 중 하나 주위로 유동할 때 그 방향을 변경한다. 유동 채널의 예시적인 실시예들이 도 2a, 2b 및 2에 도시되어 있다. 이들 개략도에 플로우 셀의 상부가 도시되어 있는데, 여기에서 유동 채널은 상부 내에 오목하게 형성되어 있다. 플로우 셀의 상부에 오목한 유동 채널은 구불구불한 형상의 패턴을 가지며, 이는 유동 채널이 상기 채널을 통해 유동하는 유체의 유동이 채널의 공간적 연장부를 따라 여러 번 역전되도록 하는 형상으로 형성되는 것을 의미한다. 바람직하게는, 유동 채널은 본질적으로 180도 만큼, 즉 유동 방향의 완전한 반전으로 유동의 방향을 1회 이상 변경하기 위해 S 자형 또는 사인곡선 형태이다. 결과적으로, 채널을 통해 인도되는 유체 스트림은 채널의 인접한 섹션들을 통해 유동할 때 그 방향을 변경한다. 보다 구체적으로, 유체 스트림은 플로우 셀의 대향 측면으로부터 연장되는 내벽부들 중 하나 주위로 유동할 때 그 방향을 변경한다.
유동 채널은 또한 표적 입자 또는 세포에 대해 친화성을 갖는 분자, 예를 들어 표적 세포의 표면 구조에 유도되는 항체 또는 압타머로 코팅된 하나 이상의 표면을 포함한다. 바람직하게는, 유동 채널의 하부 플레이트를 형성하는 플로우 셀의 하부가 코팅된다. 이것은 중력이 세포 및 입자를 코팅된 포획 표면으로 강제하는 것을 돕는 특별한 이점을 갖는다. 그러나, 하나 이상의 내부 표면이 친화성 분자로 코팅되는 것도 가능하다.
본 발명에 따라, 플로우 셀 내에서 유동 채널을 형성하는 벽부를 수정함으로써 표적 세포 또는 입자 농화의 효율이 향상될 수 있음이 밝혀졌다. 특히, 유체 유동을 전환하는 장벽을 제공하는 적어도 하나의, 바람직하게는 모든 내벽부들은 유동 채널을 통해 유동하는 유체 스트림의 일부가 각각의 벽부를 가로지르도록 허용하는 적어도 하나의 개구를 포함하는 한편 유체 스트림의 나머지는 벽부의 주위로 유동한다. 이들 개구는 바람직하게는 리세스 또는 슬릿의 형태를 갖는다. 더욱 바람직하게는, 모든 벽부들이 적어도 하나의 이러한 개구를 포함한다. 개구는 유동 채널을 통해 인도된 유체의 일부가 벽부을 가로지르도록 허용하는 치수를 갖는다. 이는 표적 세포 또는 입자를 함유하는 유체가 벽부와 접촉할 때, 유체가 2개의 서브 스트림으로 분할되어 벽부의 개구를 통해 벽부를 가로지르는 제1 유체 스트림이 생성되고, 이에 의해 채널 팽창부를 따라 존재하는 압력 구배의 방향으로 직접 유동한다. 동시에, 상기 벽부 주위로 유동하도록 벽부에 의해 편향되는 제2 유체 스트림이 생성된다. 벽부를 통과한 후에 2개의 스트림이 다시 합쳐질 때, 유체에 존재하는 입자 또는 세포를 코팅된 포획 표면으로 신속하게 운반하는 나선형 대류가 발생된다. 바람직하게는, 코팅된 포획 표면은 플로우 셀의 하부에 의해 형성된다.
본 발명의 플로우 셀의 상부 및/또는 하부는 유리, 플라스틱, 실리콘 또는 폴리디메틸실록산(PDMS)과 같은 중합체 재료로 구성될 수 있다. 바람직하게는, 플로우 셀의 상부 및/또는 하부를 위해 선택된 물질은 반투명하며 포획된 세포를 형광 현미경법에 의해 광학적 검출을 할 수 있도록 낮은 자가 형광을 갖는다. 바람직한 일 실시예에서, 상부는 이들 재료들 중 하나로 만들어진다. 다른 바람직한 실시예에서, 하부는 이들 재료들 중 하나로 만들어진다. 또 다른 바람직한 실시예에서, 상부 및 하부 모두가 이들 재료들 중 하나로 만들어진다. 가장 바람직하게는, 상부 및 하부는 동일한 재료로 만들어진다. 본 발명의 바람직한 실시예에서, 상부 및/또는 하부는 사출 성형에 의해 처리될 수 있는 플라스틱으로 구성된다. 이는 플로우 셀을 제조하는 비용을 크게 감소시키는 사출 성형에 의해 플로우 셀이 제조될 수 있게 한다.
미세유체 플로우 셀은 적어도 하나의 유동 채널을 포함하지만, 바람직하게는 미세유체 플로우 셀은 둘 이상의 유동 채널을 포함한다. 바람직한 실시예에서, 미세유체 플로우 셀은 2 - 100개의 유동 채널, 2 - 50개의 유동 채널 또는 2 - 10개의 유동 채널을 포함한다. 채널들은 바람직하게 병렬로 배열된다. 또한 모든 채널이 동일한 평면에 있는 것이 바람직하다. 플로우 셀은 일반적으로 하나 이상의 입구 및 하나 이상의 출구를 또한 포함할 것이며, 유동 채널(들)은 입구와 출구 사이에 위치된다. 각각의 유동 채널은 플로우 셀의 입구와 접촉하므로 유체는 입구를 통해 플로우 셀 내로 펌핑될 수 있고, 입구와 유체 접촉하는 유동 채널로 들어가고, 유동 채널을 통해 유동한 후에 출구를 통해 플로우 셀을 빠져나갈 수 있다.
본 발명에 따라, 유동 채널들 중 적어도 하나, 바람직하게는 모든 유동 채널은 상기 유동 채널을 통해 인도되는 유체의 다중 방향 전환을 제공한다. 유동 채널의 방향은 플로우 셀의 대향 측면으로부터 교대로 연장되는 내벽부들에 의해 규정된다. 이들 교대로 연장되는 내벽부는, 예를 들어 플로우 셀의 상부를 형성하는 PDMS와 같은 적합한 재료의 고체 블록 내에 S 자형 유동 채널을 에칭 또는 절삭함으로써 쉽게 생성될 수 있다.
유동의 방향 전환을 제공하는 내벽부는 상이한 기하학적 형태를 가질 수 있고, 바람직한 실시예에서 이들 벽부는 평면 스트립 또는 돌출부이다. 단일 플로우 셀의 상부에서 교대로 연장되는 벽부들의 수는 약 10 - 1000개, 바람직하게는 약 50 - 500개, 예컨대 약 200 - 400개의 범위일 수 있다. 이러한 배열에 의해, 유동 채널을 통해 유동하는 유체 스트림이 연장된 벽부 주위로 유동하고, 이에 의해 유동 방향을 여러 번 변경한다. 바람직하게는, 유동 방향은 적어도 약 90도, 약 100도, 약 110도, 약 120도, 약 130도, 약 140도, 약 150도, 약 160도, 약 170도, 또는 약 180도 만큼 변경된다. 이러한 구조는 유동 채널 내에 본질적으로 S 자형 유동 패턴을 유발하는데, 이는 유체가 본질적으로 사인 곡선 또는 S 자형 곡선의 형태로 유동 채널을 통해 반복적으로 유동한다는 것을 의미한다.
유동 채널은 바람직하게는 약 0.4 내지 약 2.0 mm, 보다 바람직하게는 약 0.6 내지 약 2.0 mm, 더욱더 바람직하게는 약 0.9 내지 약 1.8 mm의 폭을 갖는다. 여기에서 사용되는 바와 같이, 유동 채널의 폭은 유동 채널의 2개의 측벽 사이의 공간으로 정의된다. 또한, 채널은 약 10 내지 약 400 ㎛, 예컨대 약 100 내지 약 200 ㎛의 높이를 갖는다. 여기에서 사용되는 바와 같이, 유동 채널의 높이는 유동 채널의 상부에 의해 형성되는 상부 채널 벽과 유동 채널의 하부에 의해 형성되는 하부 채널 벽 사이의 공간으로 정의된다. 연장하는 벽부들은 약 0.1 내지 약 1.0 mm, 보다 바람직하게는 약 0.6 내지 약 0.8 mm, 더욱더 바람직하게는 약 0.3 내지 약 0.6 mm의 폭을 가질 수 있다. 본 발명의 특히 바람직한 실시예에서, 플로우 셀은 10 - 50 개의 유동 채널을 포함하며, 각각의 채널은 약 100 내지 약 200 ㎛의 폭, 약 100 내지 약 200 ㎛의 높이를 갖고 있으며, 각각의 채널은 0.6 내지 약 0.8 mm의 폭을 가진 연장하는 벽부들을 포함한다.
전술한 바와 같이, 벽부는 유체의 일부가 벽부의 주위로 유동하지 않고 벽부을 통과하게 허용하는 개구들을 포함한다. 바람직하게는, 개구는 벽부에 형성된 슬릿 또는 리세스이다. 슬릿 또는 리세스는 벽부의 어느 곳에나 위치될 수 있지만, 바람직하게는 포획 표면 근처에, 예를 들어 플로우 셀의 하부에 인접한 벽부의 부분에 위치한다. 바람직한 실시예에서, 리세스는 벽부의 하부 가장자리와 플로우 셀의 하부 사이에 간극이다. 즉, 벽부는 플로우 셀의 하부와 접촉하지 않지만, 대신에 벽부의 일부 또는 전체 폭에 걸쳐 연장하는 리세스를 갖는다.
유동 채널이 1.3 mm 미만의 폭을 갖는 경우, 슬릿 또는 리세스는 약 10 - 100 ㎛, 바람직하게는 약 20 - 60 ㎛, 보다 바람직하게는 약 20 - 40 ㎛의 폭을 가질 수 있다. 유동 채널 1.3 mm 초과의 폭을 갖는 경우, 슬릿 또는 리세스는 약 10 - 100 ㎛, 바람직하게는 약 20 - 70 ㎛, 더욱 바람직하게는 약 20 - 50 ㎛의 폭을 가질 수 있다.
미세유체 플로우 셀의 전체 치수와 관련하여, 일반적으로 약 0.5 cm, 약 1.0 cm 또는 약 1.5 cm와 같은, 2 cm 이하의 폭을 가질 것이다. 바람직하게는, 본 발명의 미세유체 플로우 셀은 약 0.5 내지 2.0 cm의 폭, 보다 바람직하게는 1.5 내지 2.0 cm의 폭을 갖는다. 미세유체 플로우 셀은 일반적으로 길이가 5 cm 이하, 예컨대 약 1.0 cm, 약 2.0 cm, 약 3.0 cm, 약 4.0 cm 또는 약 5.0 cm 일 것이다. 바람직하게는, 본 발명의 미세유체 플로우 셀은 약 1.0 내지 5.0 cm의 길이, 보다 바람직하게는 2.0 내지 4.0 cm의 길이를 갖는다.
적어도 하나의 유동 채널은 농화할 입자 또는 세포에 대해 특정 친화성이 있는 코팅을 가진 하나 이상의 표면을 포함한다. 본 명세서에서 "포획 표면"으로 지칭되는 이러한 표면은 바람직하게는 중력이 농화할 또는 고립시킬 입자 또는 세포를 포획 표면을 향하여 보낼수 있도록 미세유체 플로우 셀의 하부에 있다. 그러나 채널의 측벽들에 위치될 수도 있다. 대안적으로, 하나 이상의 채널의 모든 벽들이 친화성 코팅으로 코팅될 수도 있다. 코팅은 표적 입자 또는 세포의 미리 결정된 구조에 선택적으로 결합하기에 적합한 하나 이상의 친화성 분자 유형을 포함한다.
특히 바람직한 양태에 따라, 친화성 분자를 포함하는 포획 표면은 천연 또는 합성 친수성 중합체 층으로 코팅된다. 바람직하게는, 친수성 중합체는 고도로 수 화된 지지체 물질 상에 3차원 구조를 형성한다. 따라서, 이러한 중합체 네트워크는 종종 "히드로겔"로 지칭된다. 히드로겔은 최대 99% 이상의 물을 함유할 수 있는 반면에, 중합체 함량은 1% 이하일 수 있다. 본 발명에 사용하기 위한 히드로겔을 제조하기 위한 방법은 예를 들어 WO 02/10759에 기재되어 있다. 본 명세서에 전체적으로 통합된 이 국제 출원은 히드로겔 중합체를 지지체 물질에 결합시키는 접착 매개체 층들의 사용을 기술하고 있다. WO 02/10759에서 제공되는 히드로겔 코팅들은 본 발명의 방법에 사용하기에 특히 바람직하다.
다양한 친수성 폴리머들이 히드로겔 코팅을 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 코팅은 다당류, 폴리알코올, 폴리에테르, 폴리아미드, 폴리카르복실산, 폴리술 페이트, 폴리술포네이트, 폴리포스페이트, 폴리포스포네이트 및/또는 이들의 조합 또는 기능화된 유도체를 포함하거나 이로 구성될 수 있다. 이러한 기능화는 예를 들어 이소티오시아네이트, 이소시아네이트, 카르복실산 아지드, N-히드록시숙신이미드, 설포-N-히드록시숙신이미드, N-아실이미다졸, 설포닐클로라이드 유도체, 알데히드, 케토, 글리옥살, 옥시란, 카포네이트, 아릴할로게나이드, 이미도에스테르, 무수물, 할로겐알킬, 할로겐아실, 말레이미드, 아지리딘, 아크릴로일, 설프하이드릴, 디설파이드, 디아조알칸, 디아조아세틸, 이미다졸릴카바메이트, 히드라지드, 디아조, 아릴아지드, 벤조페논, 디아조피루베이트 또는 디아지린을 포함한다. 추가의 바람직한 기능화는 니트릴로트리아세트산(NTA) 유도체를 포함하며, 따라서 리간드 또는 항체가 금속 킬레이트에 의해 고정될 수 있다. 스트렙타비딘 및/또는 바이오틴 유도체들이 또한 기능화를 위해 적합하다. 바람직한 실시예에 따라, 히드로겔 코팅은 폴리카르복실레이트 중합체를 포함하거나 이로 구성된다. 추가의 바람직한 실시예에 따라, 히드로겔 코팅은 예를 들어 제타 포텐셜 측정에 의해 측정되었을 때 약간 음전하를 갖는다.
히드로겔 코팅은 히드로겔 표면 상에 표적 입자 또는 세포의 포획을 허용하는 임의의 두께일 수 있다. 바람직하게는, 히드로겔 코팅은 약 100 nm 내지 약 5000 nm, 바람직하게는 약 500 nm 내지 약 3000 nm의 두께를 가질 수 있고, 예를 들어 약 600 nm, 약 700 nm, 약 800 nm, 약 900 nm, 약 1000 nm, 약 1100 nm, 약 1200 nm, 약 1300 nm, 약 1400 nm, 약 1500 nm, 약 1600 nm, 약 1700 nm, 약 1800 nm 또는 약 1900 nm의 두께를 갖는다. 코팅의 두께는 종래 기술에서 이용 가능한 통상적인 방법, 예를 들어 원자력 현미경법 또는 타원편광 반사법에 의해 결정될 수 있다.
코팅은 바람직하게는 친수성 중합체의 사슬이 기재 표면에 대해 적어도 부분적으로 수직으로, 즉 브러시 모양으로 정렬되는 3차원 표면 구조를 제공한다. 평면형 구조와 비교하여 증가된 표면으로 인해, 이러한 브러시 모양 히드로겔 표면은 표적 입자 또는 세포를 결합할 수 있는 항체 및 다른 친화성 분자와 같은 생체 분자에 대해 특히 향상된 고정 능력을 나타낸다. 브러시 모양 구조의 히드로겔 코팅, 특히 특정 폴리카르복실레이트 중합체를 포함하거나 이로 구성된 코팅은 후속 검출 및/또는 정량화를 위해 고체 지지체에 세포를 선택적으로 부착하기 위한 우수한 표면을 제공한다는 것이 밝혀졌다. 본 발명에 사용하기에 바람직한 히드로겔 표면들은, 예를 들어 독일 뒤셀도르프에 소재하는 XanTec bioanalytics GmbH 로부터의 HC 또는 HCX 코팅된 슬라이드로 이용 가능하다.
본 발명에 따라, 포획 표면은 샘플에서 표적 세포에 선택적으로 결합하는 하나 이상의 상이한 유형의 친화성 분자를 포함하며, 이에 의해 유체에 존재하는 임의의 다른 입자 또는 세포로부터 표적 입자 또는 세포를 분리할 수 있다. "친화성 분자"는 입자 또는 세포의 미리 결정된 구조에, 바람직하게는 세포의 표면에 존재하는 단백질 또는 당류 구조에 결합하는 분자로서 광의로 이해된다. 친화성 분자들은 바람직하게 수용체, 렉틴, 리간드, 항체, 항체 단편, 핵산(예를 들어, 압타머), 당류 구조 또는 이들의 조합과 같은 단백질 분자들이다. 특히 바람직한 양태에서, 친화성 분자들은 예를 들어 암 항원에 대한 항체와 같은, 항체들이다.
세포의 고립이 요구되는 경우, 항체의 항체 분자 또는 항원-결합 단편의 사용이 특히 바람직하다. 따라서, 바람직한 실시예에서, 본 발명의 미세유체 플로우 셀의 포획 표면 상의 코팅은 항체, 바람직하게는 종양 세포에 특이적으로 결합하는 항체를 포함한다. 본 발명의 맥락에서, 용어 "항체"는 원하는 면역학적 활성, 즉 표적 세포에 대한 특이적 결합을 나타내는 한에는 단일클론 항체, 폴리클론 항체, 다중 특이적 항체(예를 들어, 이중 특이적 항체), 안티-이디오타입 항체, 키메라 항체 및 인화 항체를 포함한다. 특히, 이 용어는 그래프팅 기술(grafting techniques) 등에 의해서 제조된 임의의 종류의 인공 항체 분자를 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 본 방법에 사용하기 위한 항체는 IgG, IgM, IgA, IgE, IgD와 같은 임의의 동형 클래스(isotype class)뿐만 아니라 예를 들어 IgG1, IgG2 등의 서브클래스일 수 있다.
전체 항체 이외에, 본 발명은 또한 표적 세포에 특이적으로 결합하는 항체의 항원-결합 단편에 관련되어 있다. 본 명세서 사용된 바와 같이, 항체의 항원-결합 단편은 표적 세포, 예를 들어 전파된 종양 세포의 특정 항원 구조에 대한 전체 항체 분자의 특이적 결합 활동의 적어도 일부를 유지하는 단편이다. 본 발명의 항원-결합 단편들은 Fv, Fab, F(ab') 및 F(ab')2 단편들을 포함할 수 있다. 용어 "항원-결합 단편"에 또한 포함되는 것들은 단쇄 Fv 항체 단편 및 이황화 결합 Fv 단편(dsFv)이다. 항체 단편의 재조합 생산 방법은 종래 기술에 기술되어 있으며, 예를 들어 파지 표시(phage display) 또는 리보솜 표시(ribosome display)와 같은 기술들을 포함한다. 이들 방법에 의해 생성된 재조합 항체 단편들은 정화되고 표적 세포, 예를 들어 종양 세포에 대한 친화도 및 특이성에 대해 테스트될 수 있다.
포획 표면에 대한 특이적 친화성 분자의 고정(immobilization)은 상이한 방식으로 실행될 수 있다. 포획 표면이 유리 슬라이드와 같은 고체 지지체인 경우, 유리 표면의 아미노 실릴화가 이용될 수 있다. 포획 표면이 히드로겔을 포함하는 경우, 아미노 또는 히드록실 작용기를 통해 친화성 분자를 N-히드록시 숙신이미드(NHS)로 사전 활성화된 히드로겔에 공유 결합이 이용될 수 있다. 고정화된 친화성 분자들은 흡착되기보다는 히드로겔 코팅에 공유 결합되기 때문에, 이들 친화성 분자가 아미노, (디)설파이드 또는 알데히드 잔기와 같은 적합한 반응기를 갖는 한, 고정화 공정은 예를 들어 항체, 단백질, 펩타이드, 저분자량 화합물, 핵산 등의 모든 종류의 친화성 분자에 대해 마찬가지로 적합하다. 대안적인 결합 전략을 위해, 스트렙타비딘, 단백질 A, 디설파이드 또는 히드라지드 기능화된 코팅들이 종래 기술에서 마찬가지로 이용 가능하다. 친화성 분자를 함유하는 완충액이 전체 포획 표면에 적용되거나 상기 표면의 한정된 구역에 적용될 수 있다. 하나의 기판 상에 상이한 친화성 분자를 결합시키는 것이 쉽게 가능하다. 바람직한 실시예에서, 히드로겔-코팅된 포획 표면은 상이한 결합 특이성을 갖는 2개 이상의 친화성 분자, 예컨대 2, 3, 4 또는 5 개의 상이한 항체를 포함한다.
물론 본 발명의 포획 표면은 동일한 표적 세포의 동일하거나 상이한 항원 구조에 보내지는 상이한 항체 또는 항체 단편과 같은, 상이한 유형의 친화성 분자를 또한 포함할 수 있다. 대안적으로, 동일한 공정 내에서 상이한 유형의 표적 세포들의 동시 농화가 요구되는 경우, 포획 표면은 상이한 표적 세포들에 보내지는 상이한 항체 또는 항체 단편을 또한 포함할 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 포획 표면 상의 친화성 분자의 전체 밀도는 약 0.1 내지 약 100 ng/㎟의 범위이며, 예를 들어 약 0.5 ng/㎟, 약 1 ng/㎟, 약 5 ng/㎟, 약 8 ng/㎟, 약 10 ng/㎟, 약 15 ng/㎟, 약 20 ng/㎟, 약 30 ng/㎟, 약 40 ng/㎟, 약 50 ng/㎟, 약 60 ng/㎟, 약 70 ng/㎟, 약 80 ng/㎟, 약 90 ng/㎟, 약 100 ng/㎟, 또는 훨씬 높은 밀도이다. 상기 밀도는 항체 또는 항체 단편인 친화성 분자를 나타내는 것이 특히 바람직하다. 포획 표면에 고정되는 친화성 분자의 결합 능력이 커플링 공정에 의해 실질적으로 영향을 받지않는 것이 또한 바람직하다. 포획 표면에 고정된 후, 친화성 분자, 예를 들어 항체 또는 항체 단편은 표적 분자에 대한 본래의 결합 능력, 즉 고정화 없이 표적에 대한 결합 능력의 50% 초과, 바람직하게는 60% 초과, 70% 초과, 80% 초과, 90% 초과 및 보다 바람직하게는 95% 초과를 유지한다.
본 발명의 친화성 분자, 예를 들어 항체 또는 이로부터 유래된 항원-결합 단편은 표적 세포, 예를 들어 종양 세포에 대한 선택적 결합을 나타내는 그들의 능력에 기초하여 선택된다. 여기에서 사용된 바와 같이, 선택적 결합은 친화성 분자가 표적 세포에 적어도 약 4배 강하게 표적 세포에 결합하는 것을 의미하고, 일반적으로 예를 들어 친화성 분자/표적 리간드 쌍의 KD 값에 의해 나타낼 때 샘플에서 비표적 세포에 대한 결합에 비해 약 5배 이상, 약 6배 이상, 약 8배 이상, 약 10배 이상, 약 15배 이상, 약 20배 이상, 약 50배 이상, 또는 심지어 약 100배 이상 강하다. 예를 들어, 본 발명의 방법에서 전혈 샘플을 사용할 때, 친화성 분자는 여과 액에 존재하는 백혈구에 실질적으로 어떠한 결합도 나타내지 않아야 한다.
추가의 측면에서, 포획 표면 상의 친화성 분자는 수용체, 렉틴, 리간드 또는 이들의 기능적인 부분일 수 있다. 또한, 표적 세포의 구조에 대한 낮은 친화성을 갖는 친화성 분자가 사용될 수 있다. 하나의 상호 작용만으로는 일반적으로 분리 공정을 위해 충분히 안정적이지 않지만, 포획 표면을 갖는 하나의 세포의 접촉 영역에 걸쳐 분포된 몇몇 약한 상호 작용의 협력 효과는 충분히 강력하고 특별한 상호 작용을 유발한다. 이는 입자들의 상대적으로 작은 표면적이 너무 작아서 그러한 협동 메커니즘을 허용하지 않기 때문에, 종래의 나노 입자 기반 기술에 비해 상당한 이점이다.
바람직한 실시예에서, 농화될 및/또는 고립될 표적 세포는 이들 종양 세포의 세포 표면 마커에 대해 특이적 결합 친화성을 갖는 항체 또는 그 단편을 통해 채널에서 포획 표면, 예를 들어 히드로겔 코팅 표면에 결합되는 전파된 종양 세포이다. 전파된 종양 세포의 적합한 표면 마커는 당해 분야에 잘 알려져 있으며 표피 성장 인자 수용체(EGFR), 상피 세포 접착 분자(EpCAM 또는 CD326), 인슐린 성장 인자-1 수용체(IGF-1R), 상피 성장 인자 수용체 2(Her2), 사이토케라틴 19(CK19), 사이토케라틴 20(CK20), 뮤신 1(MUC1), 뮤신 2(MUC2), 인간 상피막 항원(EMA), 상피 항원(Ber-EP4), 및/또는 엽산 수용체 알파(FRalpha)를 포함한다. 추가의 마커는 문헌에서 광범위하게 논의된다. 예를 들어, Pantel et al. (2008), Nature Reviews, 8, 1-12; Pantel et al.(2009), Nat Rev Clin Oncol., 6(6):339-51 참조.
따라서, 미세유체 플로우 셀의 코팅에서 친화성 분자로서 사용하기 위한 항체는 예컨대 항체 클론 323A3(미국 시애틀, Kamiya Biomedical Company로부터 입수 가능함), 항체 클론 MK-1-25(독일 헤르포르트, Acris로부터 입수 가능함), 항체 클론 AUA1(미국 리틀톤, Novus Biologicals로부터 입수 가능함), 항체 클론 158206(독일 비스바덴, R'n'D Systems GmbH로부터 입수 가능함), 항체 클론 528(독일 하이델베르크, Santa Cruz Biotechnology Inc로부터 입수 가능함)과 같은 안티-EpCAM 항체, 예컨대 CP-751,871(독일 베를린, Pphrm AG로부터 입수 가능함)과 같은 안티-IGF-IR 항체, 예컨대 카탈로그 번호 sc-70563, sc-18895, sc-70560, sc-70559, sc-70561, sc-21714, sc-65295, sc-52311, sc-69736, sc-65255, sc-8498, sc-52378, sc-20922, sc-18884, sc-18894, sc-19650, sc-51529, sc-8500-R, sc-13507, sc-53191, sc-8499, sc-18896 및 sc-69735로 지칭되는 독일 하이델베르크, Santa Cruz Biotechnology Inc로부터 입수 가능한 것과 같은 안티-CD19 항체; 예컨대 카탈로그 번호 sc-71611, sc-71610, sc-71612, sc-71613, sc-59931, sc-71614, sc-59794, sc-59795, sc-59796, sc-59797, sc-52347, sc-6827, sc-53376, sc-59798, sc-52085, sc-59799, sc-53377, sc-6826, sc-59793, sc-59800, sc-15333, sc-25274, sc-53379, sc-52086, sc-52087, sc-52088, sc-52089, sc-52090, sc-52091, sc-52092, sc-52093 , sc-6825, sc-53380, sc-73595, sc-53381, sc-56441, sc-65589, sc-65220, sc-69644, sc-73606, sc-80889, sc-73605, sc-7313 및 sc-52094로 지칭되는 독일 하이델베르크, Santa Cruz Biotechnology Inc로부터 입수 가능한 것과 같은 안티-MUC1 항체; 예컨대 카탈로그 번호 sc-59859, sc-7314, sc-15334, sc-23170, sc-23171 및 sc-13312로 지칭되는 독일 하이델베르크, Santa Cruz Biotechnology Inc로부터 입수 가능한 것과 같은 안티-MUC2 항체; 예컨대 카탈로그 번호 sc-53258, sc-53257, sc-33110, sc-33120, sc-25724, sc-33111, sc-33119, sc-53003 및 sc-56371로 지칭되는 독일 하이델베르크, Santa Cruz Biotechnology Inc로부터 입수 가능한 것과 같은 안티-CK19 항체; 예컨대 카탈로그 번호 sc-25725, sc-17112, sc-52320, sc-70918, sc-56522, sc-56372 및 sc-58730으로 지칭되는 독일 하이델베르크, Santa Cruz Biotechnology Inc로부터 입수 가능한 것과 같은 안티-CK20 항체; 예컨대 독일 함부르크 Dako Deutschland GmbH의 클론 E29와 같은 안티-상피막 항원 항체; 독일 함부르크의 Dako Deutschland GmbH의 클론 Ber-EP4와 같은 안티-상피 항원 항체, 독일 하이델베르크의 Santa Cruz Biotechnology Inc로부터 입수 가능한 sc-120과 같은 안티-egfr 항체를 포함할 수 있다. 추가의 적합한 항체는 예를 들어, 독일 베를린의 Novocastra Deutschland로부터의 항체 VU-1D9; 독일 하이델베르크의 Progen Biotechnik GmbH로부터의 항체 Ks5+8.22/C22; 독일 뮌헨의 Micromet로부터의 항체 A45-BB3-Cy3; 독일 뢰르라히의 Enzo Life Sciences GmbH로부터의 항체 Mov18/Zel이다. 본 발명은 또한 상기 임의의 항체들의 항원-결합 단편의 사용을 고려한다.
고립하려는 입자 또는 세포를 포함하는 유체는 바람직하게는 액체이지만, 기체일 수도 있다. 바람직하게는, 유체는 개체로부터의 체액 또는 조직 추출물이다. 바람직하게는, 샘플이 유래된 개체는 척추 동물, 더욱 바람직하게는 포유 동물이다. 특히 바람직한 실시예에서, 샘플은 인간으로부터 유래된다. 유체는 일반적으로 세포 현탁액입니다. 샘플은 혈액(예를 들어, 전혈) 또는 혈액 성분, 소변, 흉막 삼출액, 복수, 기관지 폐포 세척액, 암컷 유방 선샘의 유두 흡인물 또는 골수를 포함하거나 이로 구성될 수 있다. 바람직한 측면에서, 표적 세포를 포함하는 샘플은 예를 들어 혈액 또는 골수 샘플이고, 예를 들어 개인으로부터의 샘플은 혈액 또는 골수를 각각 포함하거나 주로 구성된다. 샘플은 종래 기술에 알려진 임의의 적합한 방법에 의해 채취될 수 있다. 예를 들어, 샘플이 인간 혈액 샘플인 경우, 정맥 천자에 의해 채취될 수 있다. 골수, 예를 들어 인간 골수를 얻기 위한 방법들도 당해 분야에 잘 알려져있다. 예를 들어, 혈액과 혼합된 적골수는 장골의 크레스트 또는 흉골로부터 채취될 수 있으며, 이는 일반적으로 최소 침습 수술에 의해 수행된다. 대안으로, 생물학적 샘플은 복수, 즉, 복강액, 흉수, 여성 유방의 유두로부터의 흡인물, 소변 및 기타 체액일 수 있다.
다른 바람직한 실시예에서, 유체는 미생물 존재량이 결정되어야 하는 액체이다. 예를 들어, 액체는 예를 들어 정맥 투여용으로 만들어지기 때문에 살균할 필요가 있는 액체 식품 품목 또는 액체 제약 제품일 수 있다. 이러한 실시예에서, 플로우 셀은 얼마나 많은 박테리아 세포가 액체에 포함되어 있는 지를 결정하기 위해서 이용될 수 있다. 따라서, 플로우 셀은 식품 또는 의약품의 품질 관리에 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 방법에 사용될 샘플이 특히 높은 점도를 갖는 경우, 샘플을 필터 요소에 적용하기 전에 또는 동시에 샘플을 희석시키는 것이 바람직할 수 있다. 이를 위해, 친화성 분리 표면에 대한 표적 세포의 후속하는 결합을 방해하지 않는 임의의 생리학적으로 용인되는 완충제가 사용될 수 있다. 샘플의 희석을 위해 적합한 완충제는 생리학적 pH 내에서 완충하는 등삼투압 완충제, 예를 들어 포스페이트 완충 식염수(PBS), 행크의 밸런시드 염 용액, 트리스-완충 식염수, HEPES-완충 식염수, MES 완충제 등이다. 생리학적 완충제의 pH는 바람직하게는 pH 약 6.0 내지 약 9.0의 범위, 보다 바람직하게는 pH 약 6.5 내지 약 8.0, 가장 바람직하게는 pH 약 7.0 내지 약 7.5, 예를 들어 7.4이다.
다른 측면에서, 본 발명은 미세유체 장치에 관한 것으로서,
(a) 전술한 바와 같이 미세유체 플로우 셀, 및
(b) 미세유체 플로우 셀을 통해 유체를 인도하기 위한 적어도 하나의 펌프를 포함한다.
미세유체 장치는 앞서 명세서에서 전술한 바와 같은 미세유체 플로우 셀 및 추가로 미세유체 플로우 셀의 채널들을 통해 유체를 인도하기 위한 적어도 하나의 펌프를 포함한다. 경우에 따라, 미세유체 장치에 연결된 다수의 펌프를 갖는 것이 바람직할 수 있는데, 예를 들면 하나의 펌프는 유체의 유동을 제어하고 다른 펌프는 플로우 셀을 통해 세척 완충액을 인도할 수 있다.
본 발명은 또한 유체 샘플로부터 표적 입자 또는 세포의 고립을 위해 명세서에 설명된 바와 같은 미세유체 플로우 셀 또는 미세유체 장치의 용도에 관한 것이다. 전술한 바와 같이, 샘플은 예컨대 혈액 샘플과 같은 체액 샘플일 수 있다. 유체 샘플로부터 종양 세포의 고립를 위한 본 발명의 미세유체 플로우 셀 또는 장치의 사용이 본원에서 바람직하다. 본 발명은 또한 표적 입자 또는 세포를 친화성 분자를 포함하는 표면과의 접촉을 증가시킴으로써, 유체 샘플로부터 고립된 표적 입자 또는 세포의 수율을 개선하기 위해 명세서에 설명된 바와 같은 미세유체 플로우 셀 또는 미세유체 장치의 용도에 관한 것이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 유체로부터 표적 입자 또는 세포의 선택적인 농화 방법을 제공하며,
(a) 본원 명세서에 기술된 바와 같이 미세유체 플로우 셀을 통해 유체 샘플을 인도하는 단계, 및
(b) 코팅된 표면으로부터 표적 입자 또는 세포를 후속해서 분리하는 단계를 포함한다.
본 발명의 방법은 두 개의 연속적인 단계를 포함한다. 제1 단계에서, 유체 샘플은 미세유체 플로우 셀을 통해 인도된다. 일반적으로, 플로우 셀은 완충액으로 미리 세척되었다. 바람직하게는, 샘플은 종양 세포를 함유하거나 함유할 것으로 추정되는 혈액 샘플이다. 0.1 내지 5 ml/h, 바람직하게는 1.0 내지 5.0 ml/h의 유동률이 사용된다. 표적 입자 또는 세포는 채널에서 코팅된 포획 표면과 상호 작용하며 상기 표면에 부착될 것이다. 일단, 유체 샘플이 플로우 셀을 통해 인도되었다면 플로우 셀 표면은 플로우 셀을 세척 완충액으로 플러싱하여 세척될 수 있다. 세척 단계는 포획 표면에 비특이적으로 결합된 임의의 물질을 제거한다. 이어서, 세포를 포획 표면으로부터 조심스럽게 제거함으로써 세포가 수득될 수 있다. 예를 들어, 세포는 그들이 결합된 표면으로부터 세포를 조심스럽게 긁어내어 제거될 수 있다. 대안적으로, 개별 세포들이 패치 클램프 또는 유사한 것에 의해 제거될 수 있다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 유체 샘플로부터 고립된 표적 입자 또는 세포의 수율을 개선하는 방법에 관한 것으로, 상기 방법은
(a) 본원 명세서에 설명된 바와 같이 미세유체 플로우 셀을 통해 유체 샘플을 인도하는 단계, 및
(b) 코팅된 표면으로부터 표적 입자 또는 세포를 후속해서 분리하는 단계를 포함한다.
상기 방법을 수행하기 위한 예시적인 미세유체 장치가 도 4에 도시되어 있다. 장치는 입구 및 출구를 통해 튜브에 연결된 본 발명의 미세유체 플로우 셀을 포함하며, 튜브는 탱크로부터 플로우 셀에 고립되거나 농화될 입자 또는 셀을 포함하는 유체를 인도하는 펌프에 연결된다. 도 4에서 장치는 플로우 셀에서 포획 표면에 코팅되는 항체에 대한 종양 세포의 결합을 방해할 수 있는 단백질을 액체로부터 제거하기 위한 컬럼을 추가로 포함한다.
분석될 유체 샘플이 혈액 샘플인 경우, 포획 표면에 표적 세포의 결합을 방해할 수 있는 적혈구 및/또는 혈소판은 샘플로부터 제거되는 것이 바람직하다. 이를 위해, 샘플은 0.5 내지 5 ㎛의 크기를 갖는 기공, 구멍 또는 개구들을 가진 필터 요소를 통해서 여과될 수 있다. 적혈구(erythrocytes)는 혈액에서 산소 수송을 담당하는 평균 직경이 5 - 8 ㎛인 무핵의(non-nulceated) 혈액 세포입니다. 이들 t세포의 높은 변형성으로 인해, 0.5 ㎛ 정도로 작은 기공 크기를 갖는 필터 요소가 이들 세포의 대다수를 제거하는데 효과적으로 사용될 수 있는 것으로 밝혀졌다. 적혈구는 평평한 형태를 가지며, 그 이완되고 평평한 상태에서 적혈구의 평균 직경보다 현저히 작은 크기를 갖는 구멍을 통과할 수 있는 관형 구조를 형성할 수 있다.
유사하게, 혈소판은 일반적으로 1 - 2 ㎛의 평균 직경과 약간의 변형성을 갖는 핵이없는 세포이며, 약간의 변형성이란 전술한 기공 크기를 갖는 필터 요소의 기공을 이들이 또한 통과할 수 있음을 의미한다. 대조적으로, 백혈구 또는 종양 세포와 같은 유핵 세포는 일반적으로 5 ㎛보다 크고 제한된 변형 능력을 갖고 있다. 이러한 세포들은 필터 요소에 의해 유지될 것이다. 여과 단계는 샘플에 존재하는 적혈구의 상당 부분을 제거한다. 바람직하게는, 여과 공정은 샘플에 존재하는 적혈구의 약 30%, 약 40%, 약 50%, 약 60%, 약 70%, 약 80%, 약 90%, 약 95%, 또는 심지어 최대 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99%, 또는 그 이상을 제거한다. 여과 단계는 마찬가지로 샘플에 존재하는 혈소판의 상당 부분을 제거하는데 적합하다. 바람직하게는, 여과 공정은 샘플에 존재하는 혈소판의 약 30%, 약 40%, 약 50%, 약 60%, 약 70%, 약 80%, 약 90%, 약 95%, 또는 심지어 최대 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99%, 또는 그 이상을 제거한다. 백혈구 또는 종양 세포와 같은 유핵 세포는 필터 요소에 의해 유지되므로, 여과는 각각 적혈구 또는 혈소판에 대한 이들 세포의 비율을 농화하기 위해 사용될 수 있다. 필터 요소의 기공 크기는 0.5 내지 5 ㎛이며, 예를 들어 0.5, 1, 2, 3, 4 또는 5 ㎛이다. 바람직하게는, 필터 요소의 기공 크기는 1 내지 3 ㎛이다. 이와 관련하여, 본 명세서에서 특정 기공의 크기는 그 기공을 가로 지르는 최소 직경으로 이해된다. 다시 말해서, 본 명세서에서 사용되는 바와 같이 기공 크기는 상기 기공을 여전히 통과할 수 있는 가장 큰 구형체의 직경과 동일하다.
필터 요소는 직물 또는 부직포를 포함하거나 이로 구성될 수 있다. 필터 요소는 세포 분리를 할 수 있는 당해 분야에 널리 알려져 있는 부직포로 만들어질 수 있고, 이들은 예를 들어 셀룰로오스 아세테이트, 셀룰로오스 니트레이트, 히드록시프로필 셀룰로오스(HPV), 히드 록시에틸 셀룰로오스(HEC), 히드록시부틸메틸 셀룰로오스, 히드록시프로필메틸 셀룰로스를 포함하는 셀룰로오스 또는 셀룰로오스 파생물과 같은, 다양한 재료로 구성될 수 있다. 부직포 필터에 일반적으로 사용되는 다른 재료로는 폴리카보네이트, 히드록시에틸 스타치, 폴리설폰, 폴리에테르설폰, 폴리아미드, 폴리에테르 케톤, 폴리에테르이미드, 폴리아릴렌, 폴리페닐렌 에테르, 폴리비닐리덴 플루오라이드(PVDF), 폴리테트라 플루오르에틸렌(PTFE) 등 및 유리를 포함한다. 부직포 필터 재료는 다양한 공지된 공정, 예를 들어 멜트 블로잉, 스펀 본딩, 에어 레이잉, 웨트-포밍 및 본디드 카디드 웹 방법에 의해 제조될 수 있다. 적합한 부직포 필터는 여러 다른 공급업체, 예를 들어 Carl Roth(카를스루에, 독일), SCHLEICHER & Schuell(다셀, 독일) 및 Satorius(괴팅겐, 독일)로부터 또한 입수할 수 있다. 대안적으로, 필터 요소는 직물, 즉 직조 공정에 의해 제조된 재료일 수 있다. 본 발명의 방법에 사용되는 직물은 폴리아미드, 방향족 폴리아미드, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리에스터, 폴리플루오로카본, 폴리아크릴로니트릴, 폴리우레탄, 폴리아클레이트, 나일론, 폴리페닐렌 설피드, 폴리테트라플루오로에틸렌, 폴리벤즈이미다졸 등을 포함하거나 구성될 수 있다. 적합한 직조 필터는 다른 공급 업체로부터 구매할 수 있다.
샘플 또는 희석된 샘플은 필터 요소의 양 측면 사이에 압력 차이를 제공함으로써 간단히 필터 요소를 통해 여과될 수 있으며, 압력은 샘플이 제공되고 농축물이 형성되는 측에서 더 높다. 예를 들어, 이러한 압력 차이는 중력 또는 정수압의 차이를 적절히 이용함으로써 유리하게 생성될 수 있다. 여과를 위해 선택된 특정 장치, 및 필터 요소의 파라미터에 의존하여, 특히 필터 요소의 기공 또는 메시(mesh) 크기에 의존하여, 당업자는 필터 요소를 통해 샘플을 인도하기 위해 적용되는 압력을 조절할 수 있을 것이다.
적혈구 및/또는 혈소판을 제거하기 위한 여과 단계는 샘플이 본 발명의 플로우 셀과 접촉되기 전에 수행될 것이다. 이러한 단계를 전체 공정 흐름에 쉽게 통합시키기 위하여, 튜브 및 분리 공정에 유용한 다른 요소를 이미 포함하는 플라스틱 또는 다른 적합한 재료의 즉시 사용 가능한 카트리지를 사용하는 것이 가능하다. 예를 들어, 플로우 셀을 포함하기 위한 규정된 플러그인 위치뿐만 아니라 펌프, 폐기물 용기 등을 연결하기 위한 루어 락을 구비한 통합된 튜브를 포함하는 분리 카트리지가 사출 성형을 통해 제조될 수 있다. 유사하게, 여과 카트리지에는 샘플이 예를 들어 주사기에 의해 주입되는 깔때기 형상 용기가 제공될 수 있다. 깔때기 형상 용기는 적혈구 및/또는 혈소판을 분리하기 위한 필터 요소를 포함한다. 바람직하게는, 여과 및 후속 분리가 중단없이 하나의 공정 흐름에서 수행될 수 있도록 여과 카트리지가 분리 카트리지에 끼워질 수 있다. 여과 카트리지 및 분리 카트리지를 포함하는 플로우 셀 어셈블리가 도 6a 및 6b에 도시되어 있다.
도 1은 대응하는 유지 장치에 장착된 본 발명의 미세유체 플로우 셀의 개략적인 분해도이다.
도 2는 본 발명의 미세유체 플로우 셀 내의 유동 채널 구조의 3가지 가능한 실시 형태를 도시한 도면이다.
도 3은 본 발명의 플로우 셀의 다른 가능한 구조들의 개략도이다.
도 4는 본 발명의 미세유체 플로우 셀을 포함하는 본 발명의 미세유체 장치의 개략도이다.
도 5는 본 발명의 미세유체 플로우 셀을 사용하여 평균 세포 검출률을 측정하기 위한 실험 결과를 도시한 도면이다. 외부 좌측 막대 : 아미노-실란화 표면에서 바이탈 세포의 회수. 내부 좌측 막대 : 아미노-실란화 표면에서 포름알데히드-고정 세포의 회수. 내부 우측 막대 : HC-유도 표면에서 바이탈 세포의 회수. 외부 우측 막대 : HC-유도 표면에서 포름알데히드-고정 세포의 회수.
도 6은 여과 카트리지 및 분리 카트리지를 포함하는 본 발명의 미세유체 장치의 개략도이다.
이제 본 발명은 첨부된 도면을 참조하여 예시적으로 설명된다. 도 1은 적어도 하나의 구불구불한 형상의 유동 채널을 형성하도록 상호 결합될 수 있는 상부(1) 및 하부(2)를 포함하는 본 발명의 미세유체 플로우 셀을 도시한다. 도 1에 도시된 실시예에서, 하부는 고립되거나 농화될 표적 세포 또는 입자에 대해 친화성을 갖는 분자로 코팅된 유리 슬라이드이다. 선택적으로, 고무 링과 같은 밀봉 수단(9)이 상부(1)와 하부(2) 사이에 위치될 수 있다. 미세유체 장치에 사용될 때, 플로우 셀의 상부(1) 및 하부(2)는 상부 유지 수단(10) 및 하부 유지 수단(11)에 의해 둘러싸이며, 이들은 상부(1) 및 하부(2)의 조립체를 둘러싸서 안정화하도록 형성되어 있다. 상부(1)는 상부의 재료 내로 에칭되거나 성형된 하나 이상의 유동 채널을 포함한다.
유동 채널은 상이한 기하학적 구조를 가질 수 있으며, 이들 중 일부는 도 2에 도시되어 있다. 예를 들어, 도 2a는 각진 형태로 구불구불한 s 자형인 유동 채널(3)을 포함하는 본 발명의 플로우 셀의 상부(1)를 도시한다. 유동 채널(3)은 플로우 셀의 대향 측면으로부터 교대로 연장되는 복수의 이격된 내벽부(4)에 의해 형성된다. 플로우 셀의 상부(1)는 유동 채널(3)과 유체 접촉하며 펌프를 통하여 유동 채널(3)을 포함하는 상부(1) 내로 유체를 안내할 수 있는 입구(7)를 포함한다. 유체는 입구(7)를 통해 유동 채널(3)로 들어가고 출구(8)를 통해 플로우 셀을 빠져나간다. 도 2b는 둥근 형태로 구불구불한 s 자형인 유동 채널(3)을 포함하는 본 발명의 플로우 셀의 상부(1)를 도시한다. 도 2c는 지그재그 형태인 유동 채널(3)을 포함하는 본 발명의 플로우 셀의 상부(1)를 도시한다.
도 3a는 본 발명의 플로우 셀의 예시적인 실시예에 대한 개략도를 도시한다. 플로우 셀은 상부 플레이트 및 2개의 측벽을 포함하는 상부(1)를 포함한다(상부 플레이트 및 하나의 측벽은 도시되지 않음). 유동 채널을 형성하도록 상부(1)는 하부(2)와 결합할 수 있다. 하부는 코팅된 유리 슬라이드이다. 상부는 플로우 셀의 양쪽 측벽으로부터 교대로 연장되는 복수의 이격된 내벽부(4)를 포함한다. 이 구조에 의해, 본질적으로 S 자형 유동 채널이 형성된다. 본 실시예에서, 우측 벽으로부터 연장하는 내벽부(4)만이 개구를 포함하는데, 개구는 벽부의 하부 가장자리와 플로우 셀의 하부 플레이트 사이에 형성된다. 플로우 셀을 통해 안내되는 유체 스트림은 벽부와 접촉하여 두 개의 스트림으로 분할된다. 하나의 스트림은 벽부 주위로 유동하고, 제2 스트림은 벽부와 하부 플레이트 사이의 개구를 지난다. 스트림들이 다시 합쳐질 때, 하부 플레이트 쪽으로 입자 및 세포를 보내는 힘이 생성된다.
도 3b는 도 3a의 플로우 셀을 통한 단면도를 도시한다. 벽부(4)는 플로우 셀의 상부(1)의 우측 벽으로부터 연장된다. 개구(6)가 형성되도록 벽부(4)는 하부(2)로부터 이격되어 있다. 도 3c는 대안적인 구조를 가진 셀을 통한 단면도를 도시한다. 여기서, 개구(6)는 벽부(4)와 하부(2) 사이의 간극의 형태가 아니라, 벽부(4)의 중앙에 있는 슬릿 형태이다. 플로우 셀의 다른 대안적인 구조가 도 3d에 도시되어 있고, 여기에서 유동 채널 내로 연장되는 각각의 벽부는 2개의 개구(6)를 구비하는데, 이들 중 하나는 하부(2)에 인접한 수평 슬릿 형태이고 하나는 유동 채널의 상부(1)의 측벽에 인접한 수직 슬릿을 형성한다.
샘플 유체로부터 표적 세포를 분리하기 위해, 도 2b에 도시된 바와 같이 상부(1)을 구비한 미세유체 플로우 셀이 사용되었다. 내벽부의 폭은 0.5 mm 였고, 유동 채널(3)의 폭은 1.75 mm 였다. 또한, 플로우 셀의 하부와 내벽부의 하부 가장자리와 사이의 개구는 40 ㎛ 였다. 플로우 셀의 하부(2)로서 1 x 3 cm 크기의 유리 슬라이드가 사용되었다. 미세유체 플로우 셀을 밀봉하기 위해 O-링(9)이 사용되었다. 실험에 사용된 미세유체 플로우 셀의 일반적인 어셈블리가 도 1에 도시되어 있다. 코팅된 포집 표면으로서 다른 기능화된 유리 슬라이드들이 사용되었다. 하나의 접근법에서, HC-코팅된 슬라이드 표면을 MCF7 또는 HT29 암 세포의 EpCAM 항원에 특별히 결합하는 안티-EpCAM 항체로 고정시켰다. 다른 접근법에서, 세포의 분리를 보조하는 아미노-실란화 포지티브 하전된 표면(또한 그의 결합으로도 알려짐)들이 사용되었으며, 후자는 일반적으로 네거티브 하전된다. 아미노-실란화 표면의 경우, 추가 성분이 없는 세포 현탁액을 실험에 사용하였다. 분리하기 전에, 플로우 셀을 새로운 완충액으로 세척하였다. 분리 공정은 바이탈 MCF7 또는 HT29 종양 세포뿐만 아니라 포름알데히드에 미리 고정된 세포로 수행되었다. 세포 현탁액을 HC-코팅된 마이크로 타이터 플레이트의 웰에 피펫으로 세팅하고 정확한 세포 수를 광학 스캐너로 카운트 하였다. 이어서, 세포 현탁액을 HC-코팅된 피펫 팁을 사용하여 미세유체 장치 내로 옮겼다. 일반적으로, 고정 세포의 약 1.8% 및 바이타 세포의 약 5.8%가 전달 동안에 손실된다. 이러한 세포 소실은 각각 피펫 팁에 부착 또는 세포 사멸에 각각 기인한다. 2 ml/hour(밀리리터/시간)의 펌프 속도를 갖는 펌프를 사용하여 세포 현탁액을 미세유체 플로우 셀 내에 도입하였다. 종양 세포는 플로우 셀을 통해 세포 현탁액을 인도하는 것에 의해 분리되었다. 플로우 셀이 광학 스캐너로 평가되었고 유리 슬라이드에 결합된 세포들이 카운트 되었다. 아래와 같은 결과들을 얻었다.
Figure pct00001
상기 표에서 본 발명의 미세유체 플로우 셀을 사용한 세포 검출률이 매우 높다는 것을 보여준다. 특히, 본 발명의 새로운 미세유체 플로우 셀을 사용하여 85 내지 96%의 회수율이 달성되었다. 세포 회수 실험의 결과가 5에 도시되어 있다. 외부 좌측 막대는 아미노-실란화 표면에서 바이탈 세포의 회수에 대한 결과를 보여준다. 내부 좌측 막대는 아미노-실란화 표면에서 포름알데하이드-고정 세포의 회수에 대한 결과를 보여준다. 내부 우측 막대는 HC-유도 표면에서 바이탈 세포의 회수에 대한 결과를 보여준다. 외부 우측 막대는 HC-유도 표면에서 포름알데히드-고정 세포의 회수에 대한 결과를 보여준다.
도 4는 신규한 미세유체 플로우 셀을 포함하는 본 발명의 미세유체 장치를 도시한다. 플로우 셀은 유동 채널(3)을 형성하기 위해 상호 결합 가능한 상부(1) 및 하부(2)를 포함한다. 플로우 셀은 배관(17)을 통해 펌프(13)에 연결되는데, 펌프는 미세유체 장치를 통해 완충액 및 샘플을 인도한다. 표적 입자 또는 표적 세포를 포함하는 유체 샘플은 주입 장치(12)에 연결된 밸브(14)를 통해 미세유체 장치 내로 주입된다. 주입 장치는 예를 들어 배관을 통해 밸브에 연결된 주사기일 수 있다. 도 4에 도시된 실시예에서, 미세유체 장치는 플로우 셀에서 샘플의 처리를 방해할 수 있는 특정 화합물을 샘플 유체로부터 제거하는 정제 컬럼(15)을 또한 포함한다. 정제 컬럼 대신에, 하나 이상의 필터가 사용될 수도 있다. 예를 들어, 과도한 양의 적혈구가 미세유체 플로우 셀로 들어가는 것을 방지하기 위하여 혈액 샘플에서 적혈구를 제거하는 필터가 사용될 수 있다. 미세유체 장치는 플로우 셀을 통해 유동한 유체를 수집하기 위한 폐기물 용기(16)를 또한 포함할 수 있다.
도 6a 및 도 6b는 분리 카트리지(18) 및 여과 카트리지(24)를 갖는 카트리지 조립체의 측면도와 평면도를 도시한다. 여과 카트리지(24)의 깔때기 형상 리셉터클(22)이 수직으로 배향되고 분리 카트리지(18)가 수평으로 배향되도록 여과 카트리지(24)가 분리 카트리지(18)에 끼워져 있다. 여과 카트리지(24)는 루어 록(21)을 통해 주사기(19)에 연결될 수 있고, 주사기는 샘플 유체를 여과 카트리지(24)에 적용하는데 사용된다. 바람직한 실시예에서, 샘플 유체가 혈액 샘플인 경우, 깔때기 형상 리셉터클(22)은 폐기물 도관(26)에 연결되는 리셉터클의 상부 섹션에 필터 요소(25)를 포함한다. 필터 요소(25)는 적혈구 및 혈소판이 필터 요소를 통과할 수 있도록 0.5 내지 5 ㎛의 크기를 가진 기공, 구멍 또는 구경을 갖는 하나 이상의 필터를 포함한다. 혈액 샘플은 입구를 통해 깔때기 형상 리셉터클(22) 내로 주입된다. 입구는 필터 요소(25) 아래의 섹션에 위치한다. 깔때기 형상 리셉터클(22)에 샘플을 주입하기 전에, 필터 요소(25)가 입구 아래에 놓이도록 분리 카트리지(18)에 이미 연결되어 있을 수 있는 여과 카트리지(24)가 뒤집어진다. 이어서 혈액 샘플이 깔때기 형상 리셉터클(22) 내로 주입되고 이에 의해 혈액 샘플은 필터 요소(25)와 접촉한다. 적혈구 및 혈소판은 필터 요소를 통과하고 폐기물 도관(26)을 통해 깔때기 형상 리셉터클(22)을 빠져나간다. 분리는 중력에 의존하여 수행될 수 있거나 폐기물 도관(26)에 연결된 펌프에 의해 보조될 수 있다. 여과 카트리지(24)는 적혈구 및 혈소판이 샘플에 포함된 다른 세포로부터 분리되어 필터 요소(25)를 통과하기에 충분한 시간 동안 이 위치에서 유지된다. 적혈구 및 혈소판은 리셉터클(22)에서 제거되고 도관(26)을 통해 폐기물 용기로 인도된다. 적혈구 및 혈소판을 제거한 후, 여과 카트리지(24)는 다시 올바른 위치로 되돌려지며, 이제 적혈구 및 혈소판이 고갈되어 있는 샘플은 배관(20)을 통해 분리 카트리지(18) 및 플로우 셀(23)로 인도되어 처리된다. 플로우 셀(23)에서, 입자들은 각각의 친화성 분자로 코팅된 표면에 포획되어 고정화된다.

Claims (15)

  1. 플로우 셀을 통해 유체를 인도하기 위한 구불구불한 형상의 적어도 하나의 유동 채널(3)을 형성하기 위해 서로 결합가능한 상부(1) 및 하부(2)를 포함하는, 유체로부터 표적 입자 또는 표적 세포를 선택적으로 농화 또는 고립하기 위한 미세유체 플로우 셀에 있어서,
    상기 구불구불한 형상의 유동 채널(3)은 플로우 셀의 대향 측면들로부터 교대로 연장되는 복수의 이격된 내벽부(4)들에 의해 한정되며, 상기 유동 채널(3)은 표적 입자 또는 세포에 친화성을 갖는 분자로 코팅된 적어도 하나의 표면을 포함하며,
    하나 이상의 내벽부(4)들은 하나 이상의 개구부(6)를 포함하여 상기 유동 채널(3)을 따라 유동하는 유체 스트림의 일부가 상기 벽부(4)를 가로지를 수 있는 것을 특징으로 하는 미세유체 플로우 셀.
  2. 제1항에 있어서,
    플로우 셀은 복수의 유동 채널(3), 바람직하게는 2 - 50 개의 유동 채널(3)을 갖는 것을 특징으로 하는 미세유체 플로우 셀.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    플로우 셀은 유리, 플라스틱, 실리콘 또는 폴리디메틸실록산(PDMS)으로 구성되는 것을 특징으로 하는 미세유체 플로우 셀.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    코팅은 항체 또는 압타머, 바람직하게는 종양 세포에 특이적으로 결합하는 항체 또는 압타머를 포함하고 있는 것을 특징으로 하는 미세유체 플로우 셀.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    플로우 셀은 적어도 하나의 입구(7) 및 적어도 하나의 출구(8)를 포함하는 것을 특징으로 하는 미세유체 플로우 셀.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 구불구불한 형상의 유동 채널(3)은 0.9 내지 1.8 mm의 폭을 갖고 있는 것을 특징으로 하는 미세유체 플로우 셀.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
    개구는 약 10 - 100 ㎛, 바람직하게는 약 20 - 50 ㎛의 폭을 갖는 슬릿인 것을 특징으로 하는 미세유체 플로우 셀.
  8. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
    플로우 셀은 2 cm 이하의 폭 및/또는 5 cm 이하의 길이를 갖는 것을 특징으로 하는 미세유체 플로우 셀.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 구불구불한 형상의 유동 채널(3)은 약 100 - 300 ㎛의 높이를 갖는 것을 특징으로 하는 미세유체 플로우 셀.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서,
    수직 배향된 여과 카트리지(24)에 유체 연결되고, 상기 여과 카트리지(24)는 폐기물 도관(26)에 연결된 리셉터클의 상부 섹션에 필터 요소(25)를 포함하는 깔때기 형상 리셉터클(22)을 포함하며, 상기 여과 카트리지(24)는 상기 깔때기 형상 리셉터클(22) 내로 유체 샘플을 인도하기 위한 입구를 또한 포함하는 것을 특징으로 하는 미세유체 플로우 셀.
  11. (a) 제1항 내지 제10항 중 한 항에 따른 미세유체 플로우 셀, 및
    (b) 미세유체 플로우 셀을 통해 유체를 인도하기 위한 적어도 하나의 펌프를 포함하는 것을 특징으로 하는 미세유체 장치.
  12. 제11항에 있어서,
    단백질 및/또는 적혈구의 분리 수단을 또한 포함하는 것을 특징으로 하는 미세유체 장치.
  13. 유체 샘플로부터 표적 입자 또는 세포, 바람직하게는 종양 세포의 고립을 위한 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 따른 미세유체 플로우 셀 또는 제11항 내지 제12항에 따른 미세유체 장치의 용도.
  14. (a) 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 따른 미세유체 플로우 셀을 통해 유체의 샘플을 인도하는 단계, 및
    (b) 코팅된 표면으로부터 입자 또는 세포를 얻는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 유체로부터 표적 입자 또는 세포를 선택적으로 농화시키는 방법.
  15. 제14항에 있어서,
    유체 샘플은 제10항에 따른 미세유체 플로우 셀을 통해 인도되고,
    상기 방법은 샘플이 필터 요소(25)와 접촉하도록 유체 샘플을 깔때기 형상 리셉터클(22) 내로 주입하는 단계를 또한 포함하며, 여기에서 깔때기 형상 리셉터클(22)은 작은 화합물, 입자 또는 세포가 중력에 의해 필터 요소(25)를 통과할 수 있고 폐기물 도관(26)을 통해 제거될 수 있는 위치에 유지되며, 이어서 샘플이 미세유체 플로우 셀과 접촉되도록 바람직하게는 약 180도의 회전에 의해 여과 카트리지(24)의 위치를 변경하는 것을 특징으로 하는 유체로부터 표적 입자 또는 세포를 선택적으로 농화시키는 방법.
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