KR20200035615A - 난용성 곡물을 이용한 신바이오틱 조성물 및 이의 제조방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 난용성 곡물을 이용한 신바이오틱 조성물 및 이의 제조방법에 관한 것으로, 본 발명의 신바이오틱 조성물은 난용성 곡물에 존재하는 식이섬유를 프리바이오틱스로 장내 유익 미생물을 프로바이오틱스로 이용하여 두가지의 유용효과를 동시에 나타내는 조성물을 제조하였으며, 이를 식품용 조성물로 유용하게 이용할 있다.

Description

난용성 곡물을 이용한 신바이오틱 조성물 및 이의 제조방법{Synbiotic composition Using nonsoluble grains and Method for Manufacturing the Same}

본 발명은 난용성 곡물을 이용한 신바이오틱 조성물 및 이의 제조방법에 관한 것이다.

국민 1인당 하루 평균 식이섬유 추정 섭취량은 조사자에 따라 다소 차이가 있으나 20g 미만이고, 다른 나라의 권장량과 비교할 때 한국인의 식이섬유 섭취상태는 잠정적 권장량에 미달이다. 식이섬유는 혈중 insulin, 글루로스, 중성지방, 콜레스테롤의 상승 억제와 식사 섭취량의 감소, 체중 증가 억제, 체지방 감소에 효과가 있으며, 변비증상의 개선과 당뇨병 환자의 내당능 개선 효과가 있다고 알려져 있다. 식이섬유를 사용함으로써 지방 성분을 저하시켜 영양의 질을 개선할 수 있으며, Resistant starch, β-glucans와 같이 추출된 섬유질 성분이 과자, 아침식사용 곡물에서 섬유질을 증가시키기 위해 사용된다.

곡류는 부족한 영양성분 보충 역할 뿐만 아니라 성인병 예방에 필요한 식이섬유, 비타민, 미네랄 등이 쌀에 비해 약 2~3배 정도 풍부하여 기능성 소재로써 가치가 높으나, 거의 대부분 밥에 섞어먹는 혼반용으로 사용되고 가공제품으로의 이용은 가공적성과 기호도 문제로 인하여 극히 제한적으로 이용되고 있다.

최근 식품은 단순한 영양공급에서 최근 생체적 리듬과 신진대사 조절 및 질병예방 등의 건강 향상으로 초점이 전환되고 있으며 그에 따라 식품의 기능적 측면이 매우 중요시되었고 이러한 식품의 주요 소재로써 곡류의 가치에 주목하고 있다.

국내외 연구결과에 따르면 난용성 곡물의 다양한 생리활성에 관한 연구들이 수행되어 항산화 활성에 관한 연구로 흑태의 항산화효과, 항당뇨, 동맥경화증의 예방, 항염증 등에 대한 연구, 총 안토시아닌에 대해서는 안토시아닌의 항산화 작용에 대한 연구보고, 항암 효과와 항염증에 대한 연구와 페놀성 화합물의 다양한 생리활성에 대한 연구들이 알려져 있다.

프로바이오틱스(Probiotics)란 항생물질에 상대되는 개념으로 장내미생물의 균형을 개선함으로써 소화흡수, 장운동, 면역기능 증가 등에 관여하는 장내 유산균으로서 Bifidobacterium, Lactobacillus, Streptococcus 속 등이 알려져 있다.

인간이 노쇠하면 소화흡수, 장운동, 면역기능 저하 등에 의해 Bifidobacterium 등은 급격히 감소하고, 해로운 균은 급격히 증가된다.

인체의 장내에 400여종의 세균 중 Bifidobacterium은 인체 외부로부터 병원성균에 의한 장의 감염을 예방하여 장내 균총의 균형을 유지하고, 발암 억제, 콜레스테롤 감소, 면역력 증강 등의 효능이 있다고 알려져 있다. 특히, 곡물에 존재하는 식이섬유인 프리바이오틱스(prebiotics)는 장내 유해 균총의 증식을 억제하고 유용균을 증식시키는 인자로 장내환경 개선과 숙주의 건강 개선에 유의적인 작용한다.

프로바이오틱스(Probiotics)와 프리바이오틱스(prebiotics)의 유용한 효과를 동시에 나타내도록 하는 것이 신바이오틱스(synbiotics)이며 신바이오틱스의 장점은 상부 소화관 통과시의 프로바이오틱스 생존율 향상, 숙주의 소화관 내 생태계에서의 프로바이오틱스의 효과 지속, 프리바이오틱스로는 확보할 수 없는 살아남은 미생물로부터의 건강 효과 등을 들 수 있다.

따라서 곡물소재를 이용하여 장내 균총을 개선하고 여러 건강 기능성을 부여하는 프리바이오틱스 소재를 활용한 제품개발이 절실히 필요하며 이러한 난용성 곡물과 장내 유익균과의 상관관계 연구를 위해서 새로운 기술개발이 요구되고 있다.

국내등록특허(001) KR 10-1805863

본 발명의 목적은 장내 유용균을 증식을 위하여 난용성 곡물 추출물을 이용하여 신바이오틱 조성물을 제조하는데 있다.

본 발명은 균주 및 곡물을 포함하는 신바이오틱 조성물에 있어서,

상기 균주는 Lactobacillus salivarius 및 Lactobacillus plantarum로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 균주이고,

상기 곡물은 옥수수, 수수, 검은콩, 메밀 및 흑미로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 곡물인 것인 신바이오틱 조성물을 제공한다.

본 발명의 신바이오틱 조성물은 난용성 곡물에 존재하는 식이섬유를 프리바이오틱스로 장내 유익 미생물을 프로바이오틱스로 이용하여 두가지의 유용효과를 동시에 나타내는 조성물을 제조하였으며, 이를 식품용 조성물로 유용하게 이용할 있다.

도 1은 Lactobacillus salivarius 균주의 생장을 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 2는 Lactobacillus plantarum 균주의 생장을 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 3은 Lactobacillus brevis 균주의 생장을 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 4는 Lactobacillus sakei 균주의 생장을 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 5는 Leuconostoc mesenteroides 균주의 생장을 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 6은 Leuconostoc lactis 균주의 생장을 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 7은 Lactobacillus brevis cfm 11 균주의 생장을 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 8은 pH 농도에 따른 장내 유익균들의 생장을 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 9는 Bile salt 농도에 따른 장내 유익균들의 생장을 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 10은 온도에 따른 장내 유익균들의 생장을 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 11은 장내 유익균들의 유기산 함량을 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 12는 레이저현미경(CLSM)을 통해 옥수수에 부착된 Lactobacillus salivarius 균주를 확인한 사진이다:(A):Lactobacillus salivarius (B): 옥수수의 DIC 이미지 (C): 곡물과 균주의 혼합물.
도 13은 레이저현미경(CLSM)을 통해 수수에 부착된 Lactobacillus salivarius 균주를 확인한 사진이다:(A):Lactobacillus salivarius (B): 옥수수의 DIC 이미지 (C): 곡물과 균주의 혼합물.
도 14는 레이저현미경(CLSM)을 통해 검정콩에 부착된 Lactobacillus salivarius 균주를 확인한 사진이다:(A):Lactobacillus salivarius (B): 옥수수의 DIC 이미지 (C): 곡물과 균주의 혼합물.
도 15는 레이저현미경(CLSM)을 통해 메밀에 부착된 Lactobacillus salivarius 균주를 확인한 사진이다:(A):Lactobacillus salivarius (B): 옥수수의 DIC 이미지 (C): 곡물과 균주의 혼합물.
도 16은 레이저현미경(CLSM)을 통해 흑미에 부착된 Lactobacillus salivarius 균주를 확인한 사진이다:(A):Lactobacillus salivarius (B): 옥수수의 DIC 이미지 (C): 곡물과 균주의 혼합물.
도 17은 레이저현미경(CLSM)을 통해 옥수수에 부착된 Lactobacillus plantarum 균주를 확인한 사진이다:(A):Lactobacillus plantarum (B): 옥수수의 DIC 이미지 (C): 곡물과 균주의 혼합물.
도 18은 레이저현미경(CLSM)을 통해 수수에 부착된 Lactobacillus plantarum 균주를 확인한 사진이다:(A):Lactobacillus plantarum (B): 옥수수의 DIC 이미지 (C): 곡물과 균주의 혼합물.
도 19는 레이저현미경(CLSM)을 통해 검정콩에 부착된 Lactobacillus plantarum 균주를 확인한 사진이다:(A):Lactobacillus plantarum (B): 옥수수의 DIC 이미지 (C): 곡물과 균주의 혼합물.
도 20은 레이저현미경(CLSM)을 통해 메밀에 부착된 Lactobacillus plantarum 균주를 확인한 사진이다:(A):Lactobacillus plantarum (B): 옥수수의 DIC 이미지 (C): 곡물과 균주의 혼합물.
도 21은 레이저현미경(CLSM)을 통해 흑미에 부착된 Lactobacillus plantarum 균주를 확인한 사진이다:(A):Lactobacillus plantarum (B): 옥수수의 DIC 이미지 (C): 곡물과 균주의 혼합물.
도 22는 옥수수 추출물에 수크로스, 콩가루, NaCl이 들어간 배지에 Lactobacillus salivarius 균주를 배양시킨 후 생장곡선을 나타낸 그래프이다.
도 23은 옥수수 추출물에 글루코스, 콩가루, NaCl이 들어간 배지에 Lactobacillus salivarius 균주를 배양시킨 후 생장곡선을 나타낸 그래프이다.
도 24는 옥수수 추출물에 수크로스, 콩가루, NaCl이 들어간 배지에 Lactobacillus plantarum 균주를 배양시킨 후 생장곡선을 나타낸 그래프이다.
도 25는 옥수수 추출물에 글루코스, 콩가루, NaCl이 들어간 배지에 Lactobacillus plantarum 균주를 배양시킨 후 생장곡선을 나타낸 그래프이다.
도 26은 옥수수 추출물에 수크로스, 콩가루의 함량에 따른 Lactobacillus salivarius 균주를 배양시킨 후 생장곡선을 나타낸 그래프이다.
도 27은 옥수수 추출물에 글루코스, 콩가루의 함량에 따른 Lactobacillus salivarius 균주를 배양시킨 후 생장곡선을 나타낸 그래프이다.
도 28은 옥수수 추출물에 수크로스, 콩가루의 함량에 따른 Lactobacillus plantarum 균주를 배양시킨 후 생장곡선을 나타낸 그래프이다.
도 29는 옥수수 추출물에 글루코스, 콩가루의 함량에 따른 Lactobacillus plantarum 균주를 배양시킨 후 생장곡선을 나타낸 그래프이다.
도 30은 옥수수 추출물, 혼합곡물추출물(옥수수, 수수, 검은콩, 메밀, 흑미)에 글루코스 또는 수크로스, NaCl, 콩가루를 첨가한 배지에서 Lactobacillus salivarius, Lactobacillus plantarum 균주를 배양시킨 후 생장곡선을 나타낸 그래프이다.
도 31은 혼합곡물추출물(옥수수, 수수, 검은콩, 메밀, 흑미) 추출물에 Lactobacillus salivarius , Lactobacillus plantarum 균주를 배양시킨 후 유기산을 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.

이하 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 신바이오틱 조성물을 제조하기 위하여 프리바이오틱스(prebiotics)로 이용할 수 있는 최적 난용성 곡물(옥수수, 수수, 검은콩, 메밀 및 흑미)을 선별하였다. 선별된 혼합곡물추출물(옥수수, 수수, 검은콩, 메밀 및 흑미)에 김치 또는 분변에서 분리한 장내 미생물 7종(Lactobacillus salivarius , Lactobacillus plantarum , Lactobacillus brevis , Lactobacillus sakei , Leuconostoc mesenteroides , Leuconotoc lactis , Lactobaicllus brevis cfm 11)을 증식시켜 최적 균주를 탐색한 결과, 내산성, 담즙산 내성, 내열성, 유기산 생성량을 분석하여 Lactobacillus salivarius , Lactobacillus plantarum 균주가 프로바이오틱스(probiotics)로서 적절한 균주임을 확인하였다(도 8 내지 도 11). 선발된 Lactobacillus salivarius , Lactobacillus plantarum 균주 균주와 난용성 곡물(옥수수, 수수, 검은콩, 메밀 및 흑미)의 부착능이 우수함을 CLSM(공초점 레이저 주사 현미경)을 이용하여 확인한 결과 부착성이 뛰어난 것을 확인하였다(도 12 내지 도 21). 혼합곡물추출물(옥수수, 수수, 검은콩, 메밀 및 흑미, prebiotics)에 균주((Lactobacillus salivarius , Lactobacillus plantarum , probiotics)를 배양할 경우, 옥수수 단독 추출물에 비하여 균주 생균수가 48시간 이후에도 일정하게 유지되는 것을 확인하였다(도 30). 따라서 본 발명은 난용성 곡물을 이용하여 신바이오틱 조성물을 제조하는 최적 조건을 확립하였으므로 본 발명을 완성하였다.

< 준비예 1> 시료에서 균 분리 및 동정

<1-1> 김치에서 균 분리

김치(파김치, 배추김치, 물김치, 열무김치) 10g을 0.85% NaCl 90ml에 넣어 stomacher를 통해 균질화하였다. 균질화한 용액을 0.85% NaCl을 통해 십진법으로 희석시켜 희석한 용액 0.1ml을 MRS agar에 접종하였으며, 37℃에서 48시간 incubator에 배양하고, Lactobacilli MRS agar에서 자란 유산균을 접종을 통해 균 분리하여 배양시킨다. 그람염색을 한 후 현미경을 통해 균주를 검출하고, 시퀀싱(sequencing)을 통해 균을 동정하였다.

<1-2> 분변에서 균 분리

돼지 분변은 음성의 한 돼지 농장에서 가져왔으며, 사람 분변은 충북대학교 식품생명공학과 학생들의 분변을 사용하였다. 채취한 분변 1g을 PBS buffer 9ml에 넣어, 원심분리(8000rpm, 10분, 4℃)를 하였다. 상등액을 제거하고 0.85% NaCl에 희석시켜 주었다. polymyxin B sulfate 20mg, cycloserine 10mg, cysteine hydrochloride 0.5g을 RCM(Reinforced clostridial medium) 1L에 넣어 Selective clostridium medium을 제조한 다음 Selective clostridium medium에 희석액을 0.1ml 넣어 접종하였다. 37℃에서 48시간 동안 incubator에 배양한 다음 배지에서 작은 환이 자라나면 RCM(Reinforced clostridial medium)에 접종하였다. 37℃에서 48시간 동안 incubator에 배양하고, RCM에서 균이 자라면 그람 염색을 한 후 현미경을 통해 균주를 검출하고, 시퀀싱(sequencing)을 통해 균을 동정하였다.

<1-3> 균 분리 결과

상기 제조예 1-1 내지 1-4에서 균주를 분리하여 7개의 균주를 하기 표 1에 나타내었다.

번호	균주명
1	Lactobacillus salivarius strain JCM 1231
2	Lactobacillus plantarum strain JCM 1149
3	Lactobacillus brevis strain ATCC 14893
4	Lactobacillus sakei strain NBRC 15893
5	Leuconostoc mesenteroides strain ATCC 8293
6	Leuconostoc lactis strain JCM 6123
7	Lactobaicllus brevis cfm 11

< 준비예 2> 곡물 일반성분 분석

<2-1> 수분함량

프리바이오틱스(prebiotics)로 적합하다고 여겨지는 곡물로 옥수수(corn), 수수(sorghum), 검은콩(black bean), 메밀(Buck wheat), 흑미(Black rice)를 구매하여 사용하였다. AOAC 방법을 참고하여 수행하였으며, 난용성 곡물은 총 5가지(옥수수, 검정콩, 메밀, 흑미)을 갈아준 후 3g을 정량한 다음 105℃에서 상압가열건조법으로 건조한 후 무게를 측정하였다.

<2-2> 조회분

AOAC 방법을 참고하여 수행하였으며, 난용성 곡물은 총 5가지(옥수수, 수수, 검정콩, 메밀, 흑미)을 갈아준 후 3g을 정량한 다음 회화기에서 곡물을 550℃로 회화시킨 후 무게를 측정하였다.

<2-3> 조단백

AOAC 방법을 참고하여 수행하였으며, 난용성 곡물은 총 5가지(옥수수, 수수, 검정콩, 메밀, 흑미)을 갈아준 후 1g을 정량한 다음 micro-kjeldahl 질소 정량법으로 측정하였다.

<2-4> 조지방

AOAC 방법을 참고하여 수행하였으며, 난용성 곡물은 총 5가지(옥수수, 수수, 검정콩, 메밀, 흑미)을 soxhlet 추출법을 사용해 분석하였다.

<2-5> 식이섬유

AOAC 방법을 참고하여 수행하였으며, 난용성 곡물은 총 5가지(옥수수, 수수, 검정콩, 메밀, 흑미) 1g을 MES/TRIS 완충용액(0.05M MES, 0.05M TRIS, 24℃에서 pH 8.2)에 40ml 넣고, 교반하여 충분히 분산시켰다. 내열성 α-amylase 50μL을 가한다음 95℃ water bath에 40분간 교반시켜, water bath 온도를 60℃로 낮춘 후 protease 100μL를 넣고, water bath에서 30분간 반응시켜주었다. 0.561N HCl 용액 5mL을 가하여 pH를 4.0~4.7로 조정한다. amyloglucosidase 300μL를 넣고 30분간 교반시켜주고, 불용성 식이섬유 함량은 105℃ 수분 건조로 항량을 구한 셀라이트를 넣은 유리 도가니에 효소분해 한 시료를 여과한 다음 잔사는 70℃의 물 10mL로 3회 씻은 후 세척액은 여액에 합쳤다(여과액+물 세척용액 20mL). 잔사를 다시 90% ethanol과 acetone의 순으로 각각 15mL씩 2회 세척한 후 무게를 측정하고, 잔사량에서 잔사의 회분량과 단백질량을 감하여 불용성 식이섬유 함량을 구하였다. 수용성 식이섬유는 앞서 90% ethanol과 acetone의 순으로 각각 15mL씩 2회 세척 전 얻은 여액에 90% ethanol 200mL를 가하고, 1시간 동안 정치하여 침전물을 형성하고, 105℃ 수분건조로 항량을 구한 셀라이트를 넣은 유리 도가니에 다시 여과한 다음 남은 잔사를 90% ethanol과 acetone의 순으로 각각 15mL로 2회 세척한 후 무게를 측정하고, 잔사량에서 잔사의 회분량과 단백질량을 감하여 수용성 식이섬유 함량을 구하였다.

<2-6> 곡물 일반성분 분석

상기 분석결과를 하기 표 2 및 3에 나타내었다. 옥수수, 수수, 검은콩, 메밀, 흑미의 수분은 8.2~12.47%, 조회분 1.10~4.79%, 조단백질 7.84~33.9%, 조지방 2.65~17.33%였고, 선정곡물 별 식이섬유 함량은 불용성 식이섬유 5.82~27%, 수용성 식이섬유 0.14~3.37%, 총 식이섬유 함량은 6.17~30.37%으로 나타났다. 불용성 식이섬유 함량은 검은콩이 27%로 가장 높았고, 수용성 식이섬유 함량은 3.37%로 검은콩이 가장 높게 확인되었다.

%	수분함량	조회분	조단백	조지방
옥수수	12.47±0.18	1.18±0.01	7.84±0.23	2.65±0.05
수수	10.24±0.07	1.10±0.05	11.26±0.23	4.16±0.05
검은콩	8.63±0.04	4.79±0.03	33.9±0.18	17.33±0.42
메밀	8.2±0.07	1.79±0.02	14.92±0.27	4.66±0.18
흑미	12.19±0.37	2.07±0.04	9.62±0.16	3.04±0.03

	수용성 식이섬유(%)	불용성 식이섬유(%)	총식이섬유(%)
옥수수	0.14±0.02	6.03±0.31	6.17±0.32
수수	0.59±0.09	6.58±0.09	7.17±0.14
검은콩	3.37±0.03	27±1.08	30.37±1.09
메밀	0.92±0.05	5.82±0.14	6.75±0.19
흑미	0.51±0.14	7±0.86	7.51±1

< 실시예 1> 프로바이오틱스 ( Probiotics ) 생육 분석

상기 준비예에서 분리한 7개 균주 Lactobacillus salivarius , Lactobacillus plantarum, Lactobacillus brevis , Lactobacillus sakei , Leuconostoc mesenteroides, Leuconotoc lactis , Lactobaicllus brevis cfm 11를 초기 농도를 ELISA reader를 통해 맞춘 다음 농도를 맞춘 후 균주액을 시간대별로 따로 나눠주었다. 7개의 균주는 0.85% NaCl로 십진 희석을 시켜 접종하고, 0,1,2,4,6,8,10,12,16,20,24 시간대로 균주를 MRS 배지에 스프레딩 및 600nm에서 0ptical Density를 측정하였다. 접종한 배지는 incubator에 37℃, 48시간 동안 배양하였다.

그 결과, Lactobacillus sakei , Lactobacillus salivarius , Lactobacillus brevis cfm11은 15~20 시간 이후부터는 log CFU/ml값이 점점 감소하는 것을 관찰 할 수 있었다. 균주 중에 Leuconostoc mesenteroides가 MRS broth에서 가장 높은 생장을 보였다. 7가지 균주는 MRS broth에서 7-8.5 log CFU/ml로 잘 생장할 수 있을 것을 확인하였다(도 1 내지 7).

< 실시예 2> 프로바이오틱스 ( Probiotics ) 균주 특성 분석

<2-1> 내산성 분석

균주는 총 7가지(Lactobacillus salivarius , Lactobacillus plantarum , Lactobacillus brevis , Lactobacillus sakei , Leuconostoc mesenteroides , Leuconotoc lactis , Lactobacillus brevis cfm11)를 준비하여 내산성을 분석하였다.

구체적으로, MRS broth에서 37℃에서 24시간 배양한 균주 1 mL를 eppendorf tube에 옮긴 뒤, 원심분리기(W-100T, Hanil Co. Ltd., Kyungbuk, Korea)로 4,000 rpm에서 5분간 원심분리하여 균체만 회수하였다. 회수한 균주를 PBS buffer solution을 통해 수세시켜준다. 균주를 pH 2,3,4,6의 PBS buffer solution 1ml에 넣어 볼텍서(vortex-Genie2shaker,ems-tech,gyeonggi,korea)를 통해 혼합하였다. 혼합한 균주는 37℃에서 3시간동안 배양하였다. 배양이 끝난 균주는 4,000 rpm에서 5분간 원심분리하고 PBS solution으로 수세를 해준다. 수세 후 균주를 0.85% NaCl에 십진 희석시켜주었고 MRS agar에 접종하였다. 접종한 균주는 48시간, 37℃ 동안 배양하였다.

그 결과, 균주가 대체적으로 pH가 낮아질 때 생장이 감소하는 것을 확인할 수 있다. pH 2,3,4에서 Lactobacillus brevis cfm11, Lactobacillus sakei , Lactobacillus salivarius 균주가 다른 균주들보다 내산성이 높은 것을 확인하였다. Leuconstoc mesenteroides가 7가지 균주들 중 내산성이 가장 약하였다. Lactobacillus brevis cfm11, Lactobacillus sakei , Lactobacillus salivarius 균주들은 MRS broth의 생장곡선과 비교했을 때 log CFU/ml값의 차이가 크지 않아 내산성이 강한 것을 확인하였다(도 8)

<2-2> 담즙산 분석

균주는 총 7가지(Lactobacillus salivarius, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus brevis , Lactobacillus sakei , Leuconostoc mesenteroides , Leuconotoc lactis , Lactobacillus brevis cfm11)를 준비하여 답즙산을 분석하였다.

구체적으로, MRS broth에서 37℃에서 24시간 배양한 균주 1 mL를 eppendorf tube에 옮긴 뒤, 원심분리기(W-100T, Hanil Co. Ltd., Kyungbuk, Korea)로 4,000 rpm에서 5분간 원심분리하여 균체만 회수하였다. 회수한 균주를 PBS buffer solution을 통해 수세시켜준다. 수세된 균주를 0.3, 0.6, 1%의 bile salt에 넣어 볼텍싱(voltexing)을 통해 혼합하였다. 혼합한 균주는 37℃에서 3시간동안 배양하였다. 배양이 끝난 균주는 4,000 rpm에서 5분간 원심분리하고 PBS solution으로 수세를 해준다. 수세 후 균주를 0.85% NaCl에 십진 희석시켜주고 MRS agar에 접종하였다. 접종한 균주는 48시간, 37℃ 동안 배양하였다.

그 결과, Lactobacillus salivarius , Lactobacillus sakei , Lactobacillus brevis cfm11은 다른 균주에 비해 Bile salt에 영향을 받지 않는 것을 확인할 수 있다. 4가지 균주(Lactobacillus lactis , Leuconostoc mesenteroides , Lactobacillus plantarum , Lactobacillus brevis)들은 Bile salt의 농도가 높아질수록 생장 수가 점점 감소하였고 Leuconostoc mesenteroides가 균주 중 bile salt에 영향을 가장 많이 받는 것을 확인할 수 있었다. Lactobacillus plantarum이 7가지 균주들 중 담즙산에 내성이 가장 좋았다(도 9).

<2-3> 내열성 분석

균주는 총 7가지(Lactobacillus salivarius, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus brevis, Lactobacillus sakei, Leuconostoc mesenteroides, Leuconotoc lactis , Lactobacillus brevis cfm11)를 준비하여 답즙산을 분석하였다.

구체적으로, MRS broth에서 37℃에서 24시간 배양한 균주를 30, 40, 50, 60, 80℃로 세팅한 water bath에 10분간 중탕하였다. 중탕 이후 균주를 0.85% NaCl에 십진 희석시켜 준 후 MRS agar에 접종하였다. 접종한 균주는 48시간 37℃로 배양하였다.

그 결과, 7가지 균주 모두 30, 40, 50℃에서는 균주의 수가 크게 감소하지 않고 유지되었고, 60℃에서는 Lactobacillus sakei , Leuconostoc mesenteroides , Leuconostorc latis만 생장하였다. 80℃에서는 Leuconostoc mesenteroides만 생장하는 것을 보아 가장 내열성이 좋다고 볼 수 있다. 내열성이 약한 균주들은 열처리를 10분만 해도 사멸한다는 것을 확인할 수 있었다(도 10).

<2-4> 유기산 분석

균주는 총 7가지(Lactobacillus salivarius , Lactobacillus plantarum , Lactobacillus brevis , Lactobacillus sakei , Leuconostoc mesenteroides , Leuconotoc lactis , Lactobacillus brevis cfm11)를 준비하여 답즙산을 분석하였다.

구체적으로, 균주의 유기산 측정에서 유기산은 Citric acid, Lactic acid, Acetic acid를 사용하였으며, HPLC(Acme 9000, Young Lin Instrument Co., Ltd., Anyang, Korea)를 사용하였다. column(aminex ion, Biorad,korea)을 유기산 측정에 사용하였으며 유속은 0.6mL/min으로 설정하였다.

MRS broth에서 48시간 배양한 균주를 4,000 rpm에서 5분간 원심분리하였다. 원심분리 후 90℃인 water bath에 10분간 중탕하였다. 중탕 후 용액을 0.45㎛ syringe filter로 여과시켜준다. 여과 시킨 용액은 HPLC를 통해 유기산을 분석하였다.

그 결과, Standard 농도는 100, 50, 25, 12.5, 6.25, 3.125, 1.5625mM로 측정을 하였다. 7가지 균주 중에 Lactobacillus salivarius가 314.32mM로 Lactic acid 함량이 가장 높았으며 Leuconostoc mesenteroides가 16.16mM로 citric acid 함량이 가장 높았다. Acetic acid는 Lactobacillus brevis cfm11이 가장 높았다(도 11).

상기 결과들로부터, 내열성, 내산성, 내담즙산, 유기산 측정을 통해 프로바이오틱스(probiotics)로서 적절한 균주는 Lactobacillus plantarum , Lactobacillus salivarius, Leuconostoc mesenteroides, Lactobacillus sakei로 확인되었다

< 실시예 3> CLSM (confocal laser scanning microscopy)를 통한 균주와 곡물 부착능 분석

본 발명 균주의 곡물 부착능을 확인하기 위하여, CLSM(confocal laser scanning microscopy) 분석을 수행하였다. CLSM은 광학현미경이나 형광현미경보다 명확한 입체적인 조직영상을 얻을 수 있고, 레이저 광투과에 의한 표본내부의 스캔기능, 비파괴적 전저리에 의한 생세포 관찰이 가능함으로 이를 이용하여 부착능을 시각적으로 확인하였다.

구체적으로, 장내유익균과 곡물시료간의 부착성을 확인하기 위해 균주로는 Lactobacillus salivarius와 Lactobacillus plantarum 균주를 사용하였다. 곡물(옥수수, 수수, 검은콩, 메밀 및 흑미)은 분쇄기를 사용하였으며 100 mesh size 이하의 분말을 실험에 사용하였다. Lactobacillus salivarius와 Lactobacillus plantarum 균주를 MRS broth에서 37℃에서 24시간 배양하고 배양액 1 mL를 eppendorf tube에 옮긴 뒤, 원심분리기로 4,000 rpm에서 5분간 원심분리하여 균체만 회수하였다. 회수 된 균체에 1X PBS buffer를 이용하여 피펫팅을 통해 수세 후 다시 4,000 rpm에서 5분간 원심분리 하였다. 균체의 염색을 위해 0.1% FITC(Fluorescein isothiocyanate, Sigma Aldrich, U.S.A)에 15분간 암실에서 침지시킨 후, 1X PBS buffer를 이용하여 피펫팅을 통해 수세 후 다시 4,000 rpm에서 5분간 원심분리 하는 과정을 3회 반복하여 염색약을 제거하였다. 곡물분말과 염색된 균체를 1분간 충분히 볼텍싱(voltexing)을 통해 혼합하였다. 곡물과 장내유익균을 혼합한 것을 공초점 현미경인 Confocal laser scanning microscope(CLSM 710, Kr/Ar Ion Laser, Zeiss, Jena, Germany)을 사용하여 관찰하였다. 혼합물 속 곡물분말을 확인하기 위해 CLSM에 내장된 DIC 필터를 사용하여 관찰하였다.

그 결과, Lactobacillus salivarius와 Lactobacillus plantarum 균주는 5종류의 곡물에 부착이 되는 것을 관찰할 수 있었다(도 12 내지 도 21). CLSM 분석 결과를 보면 균주가 간균과 구균처럼 보이는 것이 있는데 균주가 간균이라 눕혀서 찍으면 길어보이며 세로로 곡물사이에 들어가 있으면 구균처럼 확인하였다. Z-stack으로 나온 결과에서 곡물 속에 균주가 들어가 있는 것을 가져왔다. 흡착 정도를 비교해보면 옥수수에서 Lactobacillus salivarius와 Lactobacillus plantarum 둘 다 가장 잘 부착되는 것으로 보였다. 렌즈는 40배이며 image size는 1024 x 1024이였다.

< 실시예 4> 균주와 곡물의 발효조건 분석

생육곡선을 통한 균주(probiotics)와 곡물(prebiotics)의 발효 조건 탐색하기 위하여, 옥수수 곡물 소재를 분쇄기를 사용하였으며 100 mesh size 이하의 분말을 55℃, 100rpm, 24시간 동안 shaking water bath에 열수 추출하였다. 열수 추출 후 거름종이를 이용하여 감압여과 하고 여과액을 증류수와 1:1 비율로 혼합해 배지를 만들었다. 배지에 탄소원으로 수크로스 또는 글루코스를 사용하였으며 질소원은 콩가루를 사용하였다. 탄소원은 배지의 0.5, 1, 2%로 넣어주고 질소원은 0.5, 1%로 넣어주었다. 그리고 염(NaCl)은 배지의 1%로 첨가하였다. 대조군으로 MRS broth와 증류수를 1:1 비율로 혼합하여 배지로 사용하였다. 균주는 Lactobacillus salivarius와 Lactobacillus plantarum를 사용하였으며 배지의 1%를 첨가하여 배양하였다. 배양은 shaking incubator에서 37℃, 48시간, 130rpm으로 배양하였다. 측정 시간은 4,8,12,18,24,36,48 시간으로 콜로니를 측정하였다.

그 결과, 옥수수 추출물에 수크로스, 콩가루, 염(NaCl)이 들어간 배지에 Lactobacillus salivarius를 배양시켰다. Lactobacillus salivarius는 MRS broth에서 가장 높은 생장수를 보였으며 MRS broth를 제외하고 수크로스 0.5% 콩가루 1%가 함유된 배지에서 가장 높은 생장수가 확인하였다. 수크로스 2%, 콩가루 0.5%가 들어간 배지에서는 균주 생장이 가장 낮은 것으로 확인하였다. Lactobacillus salivarius는 24시간부터 생장수가 조금씩 감소하기 시작하는데 소모하는 영양소가 점점 부족한 것을 확인하였다(도 22).

또는, 옥수수 추출물에 수크로스, 콩가루, 염(NaCl)이 들어간 배지에 Lactobacillus salivarius를 배양시켰다. Lactobacillus salivarius는 MRS broth에서 가장 높은 생장수를 보였으며 MRS broth를 제외하고 수크로스 0.5% 콩가루 1%가 함유된 배지에서 가장 높은 생장수가 확인하였다. 수크로스 2%, 콩가루 0.5%가 들어간 배지에서는 균주 생장이 가장 낮은 것으로 확인하였다. Lactobacillus salivarius는 24시간부터 생장수가 조금씩 감소하기 시작하는데 소모하는 영양소가 점점 부족한 것을 확인하였다(도 23).

또는, 옥수수 추출물에 수크로스, 콩가루, 염(NaCl)을 넣어 배지를 만든 후 Lactobacillus plantarum 균주를 1% 배양하였다. MRS broth에서 배양한 균주가 cfu/ml 값이 가장 높았고 MRS broth를 제외하고 수크로스 1%, 콩가루 1%가 가장 높았다. 수크로스 2%, 콩가루 0.5%는 36시간까지는 일정하게 생장수를 유지하다가 48시간때에 급격히 감소하였다. 대부분의 균주가 36시간까지는 생장수를 유지하였다(도 24).

또는, 옥수수 추출물에 수크로스, 콩가루, 염(NaCl)을 넣어 배지를 만든 후 Lactobacillus plantarum 균주를 1% 배양하였다. MRS broth에서 배양한 균주가 cfu/ml 값이 가장 높았고 MRS broth를 제외하고 글루로스 1%, 콩가루 1%가 가장 높았다. 글루로스 0.5%, 콩가루 0.5%는 36시간 이후에 CFU/ml값이 갑자기 감소한 것을 관찰할 수 있었다. 균주가 급격하게 감소한 이유는 균주가 흡수하는 영양소가 고갈되어서 균주가 감소한 것으로 판단된다. 글루로스 1%, 콩가루 1%와 수크로스 1%, 콩가루 1%를 가지고 있는 배지에서 생장수를 비교했을 때 글루로스1 %, 콩가루 1%를 함유한 배지가 생장수가 더 높았다(도 25).

결론적으로, Lactobacillus salivarius는 수크로스 0.5%, 콩가루 1%, NaCl 1%가 함유된 배지에서 가장 효율적으로 생장하였으며 Lactobacillus plantarum은 글루로스 1%, 콩가루 1%, NaCl 1%가 함유된 배지에서 가장 효율적으로 생장하였다.

< 실시예 5> 균주와 곡물의 발효액의 유기산 분석

24시간 55℃에서 열수추출한 옥수수 추출물에 수크로스 또는 글루코스를 0.5, 1, 2%를 첨가하고 콩가루를 0.5, 1%를 첨가한 배지에 1% NaCl을 넣고 1%의 Lactobacillus salivarius와 Lactobacillus plantarum 균주를 주입하여 37℃, 48시간, 130rpm으로 shaking incubator에 배양하였다. 48시간 후 균주를 배양한 배지를 원심분리(10000rpm,4℃,3분)하였다. 원심분리한 배양액을 filter paper를 사용하여 감압여과를 하였다. 감압여과 후 90℃에서 10분간 water bath에 중탕하여 균주를 사멸시켜주었다. 중탕한 발효액을 0.45μm syringe filter에 여과시켜준 후 vial에 주입해 측정하였다.

standard 유기산은 Citric acid, Lactic acid, Acetic acid를 사용하였으며 농도를 100, 50, 25, 12.5, 6.25, 3.125, 1.5625mM로 희석시켜 HPLC로 측정하였다. 이동상은 0.008N 황산을 사용하였으며 유속은 0.6ml/min으로 설정하였다.

그 결과, 수크로스, 콩가루의 함량에 따른 Lactobacillus salivarius 배양액의 유기산 측정 결과로 citric acid는 0.86~2.39mM, Lactic acid는 46.49~73.33mM, Acetic acid는 4.55~12.87mM 값을 나타내었다. Citric acid는 수크로스 2%, 콩가루 1%일 때 2.39mM로 가장 높으며 Lactic acid는 수크로스 0.5%, 콩가루 1%일 때 73.33mM로 가장 높았다. Acetic acid는 수크로스 1%, 콩가루 1%일 때 12.87mM로 가장 높았다. 전체적으로 보면 수크로스 0.5%, 콩가루가 1%일 때 유기산 생성량이 가장 좋았다. 생장곡선에서 수크로스 0.5%, 콩가루 1%일 때 생장수가 가장 높았고 위의 결과를 보아 균수와 유기산 생산량은 비례하였다(도 26).

또한, 글루로스, 콩가루 함량에 따른 Lactobacillus salivarius 배양액의 유기산 측정 결과로 citric acid는 1.03~2.29mM, Lactic acid는 42..21~61.80mM, Acetic acid는 6.80~8.60mM 값을 나타내었다. Citric acid는 글루로스 0.5%, 콩가루 1%일 때 2.29mM로 가장 높으며 Lactic acid는 글루로스 0.5%, 콩가루 1%일 때 61.80mM로 가장 높았다. Acetic acid는 글루로스 0.5%, 콩가루 1%일 때 8.60mM로 가장 높았다. 전체적으로 보면 글루로스 0.5%, 콩가루가 1%일 때 유기산 생성량이 가장 높지만 수크로스 0.5%, 콩가루 1%에서의 배양액 유기산보다는 유기산 함량이 낮은 것을 확인하였다(도 27).

또한, 수크로스, 콩가루 함량에 따른 Lactobacillus plantarum 배양액의 유기산 측정 결과로 citric acid는 1.27~2.01mM, Lactic acid는 56.44~79.51mM, Acetic acid는 5.89~16.46mM 값을 나타내었다. Citric acid는 수크로스 1%, 콩가루 1%일 때 2.01mM로 가장 높으며 Lactic acid는 수크로스 2%, 콩가루 1%일 때 79.51mM로 가장 높았다. Acetic acid는 수크로스 1%, 콩가루 1%일 때 16.46mM로 가장 높았다. 전체적으로 보면 수크로스 1%, 콩가루가 1%일 때 유기산 생성량이 가장 좋다고 판단된다. 수크로스 함량과는 상관없이 콩가루 함량이 1%일 때 Lactic acid 함량이 높아지는 것을 확인하였다(도 28).

또한, 콩가루 함량이 1%일 때 글루로스의 농도와는 상관없이 Lactic acid, acetic acid, citric acid가 다 높아지는 것을 관찰하였다. citric acid는 0.99~2.18mM, Lactic acid는 51.10~71.51mM, Acetic acid는 4.64~9.87mM 값을 나타내었다. Citric acid는 글루로스 1%, 콩가루 1%일 때 2.18mM로 가장 높으며 Lactic acid는 글루로스 2%, 콩가루 1%일 때 71.51mM로 가장 높았다. Acetic acid는 글루로스 0.5%, 콩가루 1%일 때 9.87mM로 가장 높았다. 전체적으로 보면 글루로스 1%, 콩가루가 1%일 때 유기산 생성량이 가장 좋았다. 글루로스 1%, 콩가루 1%, NaCl 1%가 들어간 배지에서 CFU/ml값이 가장 높았고 유기산 생산량도 높은 걸 보아 생장수와 유기산 생산량은 비례하는 것으로 생각된다(도 29).

< 실시예 6> 혼합곡물 추출물에서 장내유용 균주의 생장 분석

혼합곡물(메밀, 옥수수, 수수, 검은콩, 흑미) 추출물을 제조하기 위하여 5가지의 곡물을 각각 동일 비율(1:1:1:1:1)로 혼합하였다. 혼합한 곡물 추출물을 증류수와 1:1로 혼합하고 글루코스 1%, 콩가루 1%, NaCl 1%를 첨가시켜 Lactobacillus plantarum을 배양할 배지를 만들었다. 혼합곡물추출물을 증류수와 1:1로 혼합한 후 수크로스 0.5%, 콩가루 1%, NaCl 1%를 첨가하여 Lactobacillus salivarius를 배양할 배지를 만들었다. 두 배지에 각각 Lactobacillus salivarius와 Lactobacillus plantarum 균주를 1% 접종하였고 37℃, 48시간, 130rpm으로 shaking incubator에 배양하였다. 생장 곡선 측정은 4, 8, 12, 18, 24, 36, 48시간마다 측정하였다. 발효조건 탐색 및 유기산 측정을 통해 얻은 결과로 혼합비를 선정하였고 균주가 부착이 가능 곡물 5가지(메밀, 흑미, 옥수수, 수수, 검은콩)에 글루코스 또는 수크로스, NaCl, 콩가루를 첨가하여 배지를 생성 후 균주 Lactobacillus salivarius와 Lactobacillus plantarum를 배양하였다. 또한, 옥수수 단독 추출물도 상기와 같은 방법으로 제조 및 균주를 배양하였다.

그 결과, Lactobacillus plantarum은 글루로스 1%, 콩가루 1%, NaCl 1%에서 배양한 결과와 혼합곡물추출물에 글루로스 1%, 콩가루 1%, NaCl 1% 첨가하여 배양했을 때의 결과를 비교해보면 혼합곡물추출물에서 CFU/ml 값이 더 높았다. 옥수수 추출물에서는 18시간 이후로 생균수가 급격히 감소하는 것에 비해 혼합곡물추출물에서는 균주 생균수가 거의 일정하게 유지되었다(도 30).

또한, Lactobacillus salivarius는 수크로스 0.5%, 콩가루 1%, NaCl 1%에서 배양한 결과와 혼합곡물추출물에 수크로스 0.5%, 콩가루 1%, NaCl 1%를 첨가하여 배양하였때 결과를 비교해보면 혼합곡물추출물이 CFU/ml값이 더 높았으며 48시간까지 생균수를 유지하였다(도 30).

< 실시예 7> 혼합곡물 추출물에서 장내유용 균주의 생장 분석

혼합곡물추출물 배지를 48시간 배양한 후 원심분리(10000rpm,4°C,3분)하였다. 원심분리한 배양액을 filter paper를 사용하여 감압여과를 하고 감압여과 후 90℃에서 10분간 water bath에 중탕하여 균주를 사멸시켜주었다. 중탕한 발효액을 0.45μm syringe filter에 여과시켜준 후 vial에 주입해 측정하였다.

standard 유기산은 Citric acid, Lactic acid, Acetic acid를 사용하였으며 농도를 100, 50, 25, 12.5, 6.25, 3.125, 1.5625mM로 희석시켜 HPLC로 측정하였다. 이동상은 0.008N 황산을 사용하였으며 유속은 0.6ml/min으로 설정하였다.

그 결과, Lactobacillus plantarum이 생성한 유기산 citric acid는 1.93mM, Lactic acid는 106.89mM, acetic acid는 11.55mM이며 Lactobacillus salivarius가 생성한 유기산 citric acid는 2.77mM, Lactic acid는 92.73mM, Acetic acid는 8.22mM로 측정하였다. Lacbacillus plantarum이 옥수수추출물에서 생산한 유기산을 비교해보았을 때, citric acid를 제외하고 Lactic acid, Acetic acid를 더 많이 생산하였다. Lactobacillus salivarius는 acetic acid를 제외하고 옥수수 추출물보다 Lactic acid, citric acid 함량이 더 높았다(도 31).

Claims (5)

1. 균주 및 곡물을 포함하는 신바이오틱 조성물에 있어서,
   상기 균주는 Lactobacillus salivarius 및 Lactobacillus plantarum로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 균주이고,
   상기 곡물은 옥수수, 수수, 검은콩, 메밀 및 흑미로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 곡물인 것인 신바이오틱 조성물.
2. 제1항에 있어서, 상기 균주 및 곡물의 중량비는 1:1인 것인 신바이오틱 조성물.
3. 제1항에 있어서, 상기 옥수수, 수수, 검은콩, 메밀 및 흑미의 중량비는 1:1:1:1:1인 것인 신바이오틱 조성물.
4. 제1항에 있어서, 상기 균주는 상기 곡물에 부착되어 있는 것인 신바이오틱 조성물.
5. 제1항의 신바이오틱 조성물을 배양하는 단계를 포함하는 유기산의 제조방법.
   

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