KR20200026890A - 분리된 세포들의 조성물을 제조하기 위한 조직의 기계적 단편화 장치 및 그에 상응하는 방법 - Google Patents

분리된 세포들의 조성물을 제조하기 위한 조직의 기계적 단편화 장치 및 그에 상응하는 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 특히 지방 흡입술 동안 수득된 조직 샘플로부터 분리된 세포들, 특히 지방 세포의 조성물을 제조하기 위한 조직들의 기계적 단편화를 위한 장치에 관한 것으로, 상기 제조는 상기 장치에서의 상기 조직들의 기계적 단편화의 적어도 하나의 단계를 포함하고, 상기 장치는 전동식 지지대(3) 및 용기(1)를 포함하고, 상기 전동식 지지대(3)는 결합 부재와 고정된 로터를 갖는 모터를 포함하고, 상기 용기(1)는 내부에, 축 방향 회전으로 설정될 수 있는 회전축(9)을 포함하고, 상기 회전축(9)이 회전할 때 상기 용기(1)의 내부를 스위핑(sweeping)할 수 있는 반경 방향 아암(10, 12)들을 포함하며, 상기 전동식 지지대(3) 및 상기 용기(1)는 상기 용기(1)를 상기 전동식 지지대(3)에 고정시킬 수 있는 상호 보완적인 착탈 가능한 체결 수단(11)을 포함하고, 상기 결합 부재 및 상기 회전축(9)은 상기 모터의 로터가 회전할 때 상기 회전축(9)의 축 방향 회전을 가능하게 하도록 구성된다. 본 발명에 따르면, 상기 반경 방향 아암(10, 12)들은 강성 베인형 아암(10)들, 및 특히 나일론 또는 금속으로 제조된 가요성 필라멘트형 아암(12)들의 두 가지 유형이 있다. 방법은 본 발명을 완성시킨다.

Description

분리된 세포들의 조성물을 제조하기 위한 조직의 기계적 단편화 장치 및 그에 상응하는 방법
본 발명은 전형적으로 세포 조성물을 제조하기 위한 장치 분야에 관한 것이다. 보다 특히, 분리된 세포들의 조성물을 제조(preparation)하기 위한 조직의 기계적 단편화(fragmentation)를 위한 장치 및 그 장치를 사용하는 방법에 관한 것이다.
다양한 목적에서, 살아있는 세포들을 인간 또는 동물 신체의 특정 부분에(into) 주사하게 되는 것이 공지되어 있다. 이들 세포는 재생 또는 예를 들어, 통증의 증상 치료(symptomatic treatment)에 의해 손상된 조직 또는 기관에 작용할 수 있는 특성들을 갖는다.
따라서, 이러한 세포, 특히 지방 세포(adipocytes)를 수득하는 방법이 개발되었다. 일반적으로, 이러한 지방 세포를 수득하는 이들 방법은, 조직으로부터 세포를 분리하기 위해, 단백질분해효소(proteases)(콜라겐분해효소(collagenases))의 혼합제(cocktail)에 의한 조직의 세포외 기질(extracellular matrix)의 효소 소화(enzymatic digestion)에 기초한 공통 단계를 갖는다.
공지된 방법들 중에서, 지방 조직에 함유된 특정 세포를 정제하기 위한 방법 및 용구 둘 다를 기술한 국제출원공개공보 WO 2007/034115 A1이 언급될 수 있다.
국제출원공개공보 WO 2015/035221 A1; 미국출원공개공보 US 2005/139704 A1 및 국제출원공개공보 WO 95/09051 A1에 기재된 방법들 또한 공지되어 있다.
이 효소적(enzymatic) 방법에 의한 이러한 세포 분리(cell release)은 효율적이지만, 이러한 유형의 효소적 방법은 조절에 제약(regulatory constraints)을 받게 되며 매우 비싸다.
이러한 제약을 피하기 위해, 효소를 사용하지 않고 지방 세포를 정제할 수 있는 순수한 기계적 방법들이 사용될 수 있다. 대부분의 공지된 기계적 방법들은 조직의 기질 구조로부터 세포를 분리하기 위해 기계적 작용을 사용한다. 이러한 작업들이 가능한 장치들은 클래스(class) II 의료 장치들로 간주된다.
조직 샘플로부터 세포를 제조하는 분야에서, 2014년의 MicroAire사의 StromaCell®시스템이 언급될 수 있는데, 이는 지방흡인물(lipoaspirate)의 밀리 리터당 140,000개의 세포로 지방 조직으로부터의 세포를 기계적으로 분리(isolating)하기 위한 반자동 방법으로 기술되어 있다. 같은 해의 M. Rapisio팀의 논문은 6분 동안 냄비에 진동을 제거한 다음 원심 분리를 통해 지방흡인물의 밀리 리터당 125,000개의 세포 수율로, 즉 전구세포의 5%의 세포를 수집하는 것을 기술하고 있다(Aronowitz 외, SpringerPlus 2015년판).
그 후, 지방 조직 유래(derived) 세포의 분리를 주장하는 장치들이 대량으로 개발되었다. 2015년에 Oberbauer에 의해 10개 이상의 시스템이 발표되었으며(Oberbauer 외, Cell Regeneration 2015년판), 가장 유명한 시스템은 PureGraft(Cytori), Fastem(Corios Soc Coop), Revolve/GID 700(LifeCell사/GID Group Inc), Lipogems(Lipogems International S.p.A.), StromaCell(MicroAire Surgical Instruments LLC) 및 MyStem (MyStem LLC)이다. 2015년에 Cicione팀은 MyStem EVO 기술(Cicione 외, PRS 2015년판)을 통해 세포 분리를 설명하였으며, Domenis팀은 2개의 효소 분해 프로토콜을 통한 Fastem 기술을 비교 연구했다(Domenis 외, Stem Cell Research & Therapy 2015년판).
다음 해에, Lipogems 기술이 보고 되는데, 이 기술은 폐쇄된 시스템에서 볼(balls)을 사용하여 지방 조직을 수동으로 미세 단편화(microfragment)한다. Tremolada팀의 논문(Tremolada 외, Curr Stem Cell Rep 2016년판)은 이미 성형 수술, 일반 수술, 정형외과 수술 뿐 아니라 상악안면(maxillofacial) 수술 분야들에서 이 방법으로 전 세계의 7000명 이상의 환자들을 치료하였다고 주장하고 있다.
2016년에 Conde-Green팀은 지방 조직으로부터의 세포의 기계적 추출에 대한 검토를 수행하였다. 연구들은 주로 생체외(in vitro)에 유지되며, 세포를 분리하기 위해 원심분리, 교반(수동 또는 전기방식) 및 소용돌이를 동시에 사용한다(Conde-Green PRS 2016년판).
마지막으로, Nanofat이라는 이름으로 2013년(Tonnard 외, PRS 2013년판)에 Tonnard에 의해 기술된, 주사기 간 셔플링에 의한 지방 세포 용해로 구성된 유화 기술은 기질 분획으로부터 세포를 추출하는 방법, 그리고 특히 다분화능 세포를 추출하는 방법으로 간주된다(Baynard 외, PRS 2016년판). 그 후, Nanofatprotocol이 Tulip Medical사에 의해 시판되었다.
이 분야의 문헌은 다음을 포함한 많은 기사들을 포함하고 있다.
- Tonnard 외, PRS 2013년판, Nanofat Grafting : 기초 연구 및 임상 응용
- Aronowitz 외, SpringerPlus 2015년판, 지방 조직으로부터 기질 혈관 분획 세포의 기계적 및 효소적 분리
- Oberbauer 외, Cell Regeneration 2015년판, 지방 조직 유래 세포를 위한 효소적 및 비 효소적 분리 시스템 : 최신 기술
- Domenis 외, Stem Cell Research & Therapy 2015년판, 지방 조직 유래 줄기 세포 : 표준 및 세 가지 상업적으로 이용가능한 세포 보조 지방 이식 기술의 체외(in vtro) 및 체내(in vivo) 분석
- Cicione 외, PRS 2015년판, 지방 흡입 흡인물의 유체 부분의 정제를 가능하게 하는 폐쇄 장치의 체외 검증
- Tremolada 외, Curr Stem Cell Rep 2016년판, 지방 조직 및 중간엽 줄기 세포 : 최첨단 기술 및 Lipogems® 기술 개발
- Conde-Green 외, PRS 2016년판, 지방 유래 기질 혈관 분획의 기계적 분리로의 전환 : 향후 기술의 검토
- Banyard 외, PRS 2016년판, 기계적 전단 후 기질 혈관 분획의 표현형 분석이 스트레스 유발 전구체 집단을 밝힘
- Chapput 외, PRS 2016년판, 기계적으로 분리된 간질 혈관 분획은 유효하고 유용한 무 콜라겐분해효소(collagenase free) 대체 기술을 제공한다 : 비교 연구
- Van Dongen 외, JTERM 2017년판, 재생 목적으로 임상 등급 간질 혈관 분획의 분리를 위한 수술 중 절차의 비교 : 체계적 검토.
본 개시를 읽을 때 나타날 최신 기술 및 다른 것들의 상술한 단점들을 해결하기 위해, 본 발명은 샘플링된 조직으로부터의 세포를 분리하기 위한, 특히 조직의 전단(shearing)에 의한 기계적 방법을 구현하도록 작동 가능한 특정 구조를 갖는 믹서기를 제안한다.
보다 특히, 본 발명에 따르면, 특히 지방 흡입술(liposuction) 동안 수득된 조직 샘플로부터 분리된 세포들, 특히 지방 세포들 및/또는 지방 조직에 함유된 세포들의 조성물을 제조하기 위한 조직들의 기계적 단편화를 위한 장치가 제안되며, 상기 제조는 상기 장치에서 상기 조직들을 기계적으로 단편화하는 적어도 하나의 단계를 포함하고, 상기 장치는 전동식 지지대 및 용기를 포함하고, 상기 전동식 지지대는 결합 부재와 일체인 로터를 갖는 모터를 포함하고, 상기 용기는 내부에, 축 방향으로 회전 가능한 회전축(rotary shaft)을 포함하고 상기 회전축이 회전할 때 상기 용기의 내부를 스위핑(sweeping)할 수 있는 반경 방향 아암들을 포함하며, 상기 전동식 지지대 및 상기 용기는 상기 용기를 상기 전동식 지지대에 고정하기 위한 상호 보완적인 착탈 가능한 체결 수단을 포함하고, 상기 결합 부재 및 상기 회전축은 상기 모터 로터가 회전할 때 상기 회전축의 축 방향 회전을 가능하게 하도록 구성된다.
본 발명에 따르면, 반경 방향 아암들은 베인형 아암들 및 필라멘트형 아암들의 두 가지 유형이다.
개별적으로 또는 모든 기술적으로 가능한 조합들에 따라 취해진 본 발명에 따른 장치의 다른 비 제한적이고 유리한 특징들은 다음과 같다 :
- 상기 용기는 금속성이고,
- 상기 용기는 플라스틱 재료로 만들어지고,
- 상기 플라스틱 재료는 폴리머(polymeric)이고.
- 상기 용기는 반투명하고,
- 상기 용기는 투명하고,
- 상기 결합 부재는 회전축을 모터 로터에 착탈 가능하게 및 회전 결합시킬 수 있고,
- 상기 용기는 액체에 대해 불투과성(impermeable)이고,
- 상기 용기는 2개의 관통공을 포함하고, 제1 관통공은 필터에 의해 폐쇄되고, 제2 관통공은 자동 밀봉 격막에 의해 폐쇄되며, 상기 자동 밀봉 격막은 중공의 니들(meedle) 또는 트로카(trocar) 또는 캐뉼라(cannula)에 의해 천공될 수 있고 기체들, 액체들, 입자들 및 세포들에 대해 불투과성이 되도록 상기 니들 또는 상기 트로타 또는 상기 캐뉼라의 제거시 자동으로 밀봉되며,
- 상기 자동 밀봉 격막은 실리콘 밸브이고,
- 상기 제2 관통공은 또한 분리 가능한 플러그 또는 캡(cap)에 의해 외부에 대해 폐쇄되고,
- 대안으로서, 상기 자동 밀봉 격막은 자동 폐쇄 밸브 또는 플랩이고,
- 상기 회전축의 적어도 일부는 금속성이고,
- 상기 회전축의 적어도 일부는 플라스틱 재료로 만들어지고,
- 상기 회전축은 금속성이고,
- 상기 회전축은 플라스틱 재료로 만들어지고,
- 상기 회전축은 금속 및 플라스틱 재료로 만들어지고,
- 상기 베인형 아암들은 플라스틱 재료 또는 금속으로 만들어지고,
- 상기 필라멘트형 아암들은 플라스틱 재료, 특히 나일론 또는 이와 동등한 것으로 만들어지고,
- 상기 필라멘트형 아암들은 금속성이고,
- 상기 베인형 아암들은 실질적으로 직선형의 반경 방향 연장부를 가지고,
- 상기 베인형 아암들은 곡선형의 반경 방향 연장부를 가지고,
- 상기 베인형 아암들 중 적어도 하나는 반경 방향 연장부에 실질적으로 수직인 평면으로 연장되는 하나 이상의 융기부(ridge)를 포함하고,
- 상기 베인형 아암들은 원형, 타원형, 정사각형, 직사각형, 다각형, 스핀들형, T형 단면들 중에서 선택된 횡단면을 가지고,
- 상기 베인형 아암들은 직선형, 곡선형, 나선형 단면들 중에서 선택된 종단면을 가지고,
- 상기 필라멘트형 아암들은 원형, 타원형, 정사각형, 직사각형, 다각형 단면들 중에서 선택된 횡단면을 가지고,
- 상기 베인형 아암들은 강성이고 상기 필라멘트형 아암들은 가요성이며,
- 적어도 하나의 베인형 아암 세그먼트(segment)는 가요성이고,
- 상기 베인형 아암의 적어도 일부는 상기 회전축에 연결되고,
- 상기 베인형 아암들 및 상기 필라멘트형 아암들은 모두 강성이고,
- 상기 회전축은 수평이고, 상기 용기는 원통형 또는 직선형의 절두 원추형이고, 원통형 또는 절두 원추형 측벽에 의해 분리된 제1 수직 단부벽 및 제2 수직 단부벽을 가지며, 상기 회전축은 상기 측벽에 동축(coaxial)이고,
- 상기 회전축은 수평에 대해 경사져 있지만 수직은 아니고, 상기 용기는 원통형 또는 직선형의 절두 원추형이고, 원통형 또는 절두 원추형 측벽에 의해 분리된 제1 수직 단부벽 및 제2 상부 수직 단부벽을 가지며,
- 상기 회전축은 수직이고, 상기 용기는 원통형 또는 직선형의 절두 원추형이고, 하부 바닥 벽, 상부벽 및 원통형 또는 절두 원추형 상승 측벽을 가지며, 상기 회전축은 측벽의 중심에 있고 측벽과 동축에 있으며, 그리고 상기 베인형 아암들은 상기 회전축의 하부에 배열되는 반면, 상기 필라멘트형 아암들은 상기 베인형 아암들 위에 배열되며,
- 상기 회전축은 단일편(single-piece)이고,
- 상기 회전축은 함께 조립된 여러 개의 부품들로 구성되고,
- 상기 지지대는 모터 및 결합 부재를 포함하고 상기 지지체의 전동부(motorized portion)를 형성하는 부분을 가지며,
- 상기 용기가 상기 전동식 지지대에 체결될 때, 상기 지지대의 전동부는 상기 용기 위에 배치되고, 상기 회전축은 상기 결합 부재에 의해 상기 용기의 상부까지 구동되며, 상기 용기의 바닥 벽은 연속적이고, 상기 전동식 지지대는 상기 전동부가 상기 용기를 덮도록, 특히 일반적인 수평의 U 또는 Z 형상을 가지며,
- 상기 용기가 상기 전동식 지지대에 체결될 때, 상기 지지대의 전동부는 상기 용기 위에 배치되고, 상기 회전축은 상기 결합 부재에 의해 상기 용기의 바닥까지 구동되며, 상기 용기의 바닥 벽은 상기 회전축의 통과를 위한 관통공을 포함하고, 상기 통과공은 밀봉되며,
- 상기 결합 부재는 상기 회전축과 직접 접촉하는 기계적 결합을 제공하고,
- 상기 결합 부재는 상기 회전축과의 원격 자기 결합(remote magnetic coupling)을 제공하며, 이는 상기 회전축이 상기 용기 벽을 통과하지 않는다는 사실에 기인하여 상기 회전축에 대한 밀봉을 피하며,
- 상기 모터 로터는 상기 회전축의 일부이고, 상기 결합은 상기 전동식 지지대의 모터의 스테이터(stator)와 상기 용기의 상기 회전축 상의 로터 사이의 전자기(electromagnetic)이며, 이는 상기 회전축이 상기 용기 벽을 통과하지 않는다는 사실에 기인하여 상기 회전축의 밀봉을 피하며,
- 상기 하부 바닥 벽과 상기 상승 측벽은 일체형이고,
- 상기 상부 벽은 상기 용기의 뚜껑을 형성하고,
- 상기 상부 벽은 상기 상승 측벽의 상단(top)에 추가되고,
- 상기 상부 벽은 상기 상승 측벽의 상단으로부터 제거 가능하고,
- 상기 용기는 절두 원추형이고, 바닥 벽면의 직경이 43 mm이고 상부 벽면의 직경이 54 mm이며,
- 상기 용기의 유효 체적 100 cc당 유효 체적 높이(useful volume height)는 70.7 mm이고,
- 상기 용기의 전체 높이는 97.5 mm이고,
- 각각의 베인형 아암은 적어도 하나의 비스듬한(bevelled) 종방향 에지를 가지며, 상기 적어도 하나의 비스듬한 에지는 먼저 상기 회전축이 회전할 때 상기 용기의 내부를 가장 먼저 스위핑(sweeping)하는 아암의 측면에 있고,
- 상기 비스듬한 에지는 날카로운 에지이고,
- 상기 비스듬한 에지는 오목부들(indentations)을 더 포함하고,
- 각각의 필라멘트형 아암은 나일론 또는 금속 와이어로 구성되고,
- 상기 나일론 또는 금속 와이어들의 직경은 0.5 mm 내지 3 mm이고,
- 상기 나일론 또는 금속 와이어들은 상기 회전축 높이를 따라 엇갈리게 배치되고, 두 개의 인접한 와이어 스테이지들(wire stages) 사이의 거리는 높이에 따라 일정하며,
- 상기 나일론 또는 금속 와이어들은 상기 회전축 높이를 따라 엇갈리게 배치되고, 두 개의 인접한 와이어 스테이지들 사이의 거리는 높이에 따라 달라지며,
- 상기 나일론 또는 금속 와이어들은 상기 회전축 높이를 따라 엇갈리게 배치되고, 두 개의 인접한 와이어 스테이지들 사이의 거리는 5 mm 내지 20 mm이며,
- 상기 나일론 또는 금속 와이어들은 상기 회전축 높이를 따라 수직으로 정렬되고,
- 상기 나일론 또는 금속 와이어들은 상기 회전축 높이를 따라 나선형으로 정렬되고,
- 상기 용기의 원통형 또는 절두 원추형 상승 측벽은 내부에 세레이션들(serrations)을 포함하고,
- 상기 용기는 액체에 대해 불투과성이며, 상기 상부 벽은 두 개의 관통공을 포함하고, 제1 관통공은 필터에 의해 폐쇄되고, 제2 관통공은 자동 밀봉 격막(self-sealing septum)에 의해 폐쇄되며, 상기 자동 밀봉 격막은 피어싱 튜브(piercing tubing)에 의해 천공될 수 있고 피어싱 튜브의 제거시 자동으로 밀봉되어 완전히 불투과성이 될 수 있으며,
- 상기 피어싱 튜브는 중공의 니들 또는 트로카 또는 캐뉼라이고,
- 상기 자동 밀봉 격막은 탄성중합체(elastomer)로 만들어지고,
- 상기 자동 밀봉 격막은 실리콘 밸브이고,
- 상기 상부 벽의 2개의 관통공들 중 적어도 하나는 외부에 찢어질 수 있는 멤브레인 씰(tearable membrane seal)로 덮여 있고,
- 상기 상부 벽의 2개의 관통공들 중 적어도 하나는 외부에 제거가능한 캡(cap)으로 덮여 있고,
- 상기 용기의 상기 상부 벽은 제거가능한 뚜껑이고,
- 회전축이 있는 상기 용기는 일회용이며,
- 회전축이 있는 상기 용기는 멸균 가능(sterilizable)하고,
- 상기 전동식 지지대는 상기 모터 로터의 회전 속도를 제어하는 시스템을 포함하며,
- 상기 전동식 지지대는 상기 모터 로터의 회전 속도를 측정하는 시스템을 포함하며,
- 상기 전동식 지지대는 상기 모터 로터의 회전에 대한 저항 토크(resisting torque)를 측정하는 시스템을 포함하며,
- 상기 전동식 지지대는 상기 용기의 존재를 감지하는 시스템을 포함하며,
- 상기 모터 로터의 회전 속도를 제어하는 시스템은 다음의 작용들, 즉 일정한 방향으로의 회전, 다른 방향들로의 회전, 일정한 속도에서의 회전, 가변적인 속도에서의 회전, 속도 진화 프로그램에 따른 여러 속도들 중 적어도 하나에서의 회전 중 적어도 하나를 허용하도록 구성되며, 상기 프로그램은 상기 전동식 지지대의 측정 시스템에 의해 수행된 측정 결과들에 적응(conditioned)된 단계들을 포함할 수 있고,
- 상기 전동식 지지대는 사기 모터 로터의 회전 지속 시간(duration of rotation)을 조정하기 위한 타이머를 포함하고,
- 상기 전동식 지지대는 상기 용기의 온도를 조절하기 위한 열 조절 수단(heat regulation means)을 포함하고,
- 바람직하게는, 상기 전동식 지지대는 미리 설정된 회전 속도 조절 시스템 및 회전 지속 시간 타이머를 포함하되, 상기 장치는 자동이며 사용자는 속도 또는 지속 시간을 조정할 수 없다.
본 발명은 또한, 특히 지방 흡입술 동안 수득된 조직 샘플로부터 분리된 세포들, 특히 지방 세포들 및/또는 지방 조직에 함유된 세포들의 조성물을 제조하는 방법으로서, 상기 제조는 장치에서의 상기 조직들의 기계적 단편화의 적어도 하나의 단계를 포함하고, 상기 장치는 전동식 지지대 및 용기를 포함하고, 상기 전동식 지지대는 결합 부재와 일체인 로터를 갖는 모터를 포함하고, 상기 용기는 내부에, 축 방향으로 회전가능한 회전축을 포함하고 그리고 상기 회전축이 회전할 때 상기 용기의 내부를 스위핑(sweeping)할 수 있는 반경 방향 아암들을 포함하며, 상기 전동식 지지대 및 상기 용기는 상기 용기를 상기 전동식 지지대에 고정하기 위한 상호 보완적인 착탈 가능한 체결 수단을 포함하고, 상기 결합 부재 및 상기 회전축은 상기 모터 로터가 회전할 때 상기 회전축의 축 방향 회전을 가능하게 하도록 구성되는 방법을 제안한다.
상기 방법에 따르면, 상술한 청구항들 중 어느 한 항에 따른 장치는 상기 조직들의 단편화를 위한 구성을 가지며, 상기 샘플링된 조직은 상기 용기 내로 도입되고, 상기 모터는 전원이 켜지며, 상기 용기는 상기 결합 부재가 상기 회전축을 회전시킬 수 있도록 미리 상기 전동식 지지대에 체결된 후, 모터가 정지된 후 상기 용기 내용물의 적어도 일부가 수집된다.
상기 방법의 변형들에 있어서, 가능한 한 함께 결합된다:
- 상기 회전축의 회전은 항상 동일한 방향으로 수행되며,
- 상기 회전축의 회전은 한 방향으로 수행된 후 다른 방향으로 교대로 수행되며,
- 상기 회전축의 회전은 적어도 360°에 걸쳐 번갈아 수행되며,
- 상기 회전축의 회전은 360°이상에 걸쳐 번갈아 수행된다.
비 제한적인 예시들을 통해 주어진 첨부 도면들에 대한 다음의 설명은 본 발명이 무엇으로 이루어지고 어떻게 실현될 수 있는지를 잘 이해하게 할 것이다.
첨부된 도면들에서:
도 1은 본 발명의 용기의 회전축을 통과하는 축 방향 수직 단면을 도시하고,
도 2는 도 1의 용기의 평면도를 도시하고,
도 3은 도 1의 용기의 반경 방향 단면을 도시하고, 그리고
도 4는 본 발명의 장치를 사용하여 분리된 세포의 조성물을 제조하는 서로 다른 단계들을 도식화한 도면이다.
장치
본 발명에서 실현된 샘플 조직(sampled tissue)의 기계적 처리 용액의 틀 내에서, 조직으로부터 세포를 분리하는 것은 믹서기 내에서 조직이 받게 되는 마찰력 및 전단력에 기초한다.
바람직하게는, 이 믹서기는 지방 조직을 분쇄하고 지방 조직을 구성하는 세포, 주로 SVF(Stromal Vascular Fraction; 기질혈관분획)의 세포를 얻기 위한 것이지만, 다른 조직들 또는 기관들에 함유된 세포들을 정제하는데 사용될 수도 있다.
본 발명의 믹서기는 주로 2개의 구성요소, 즉 전동식 지지대로 지칭되는, 전기 모터를 포함하는 지지대, 및 전동식 지지대 상에 적용가능한 용기를 포함한다. 전동식 지지대는 용기가 전동식 지지대에 체결될 때 용기 내부의 회전축(rotary shaft)을 회전시킬 수 있는 모터를 포함하고, 상기 회전축은 반경 방향의 아암(arm)들을 포함한다. 용기는 전동식 지지대에 착탈가능하게 체결되며, 회전 구동체로부터 분리가능한 결합 수단(coupling means)은 전동식 지지대와 용기의 회전축 사이에 설치된다.
회전축의 회전 속도는 바람직하게는 약 4000 rpm(분당 회전수)이며, 이는 세포 수 및 생존능력(viability) 측면에서 세포 정제의 최적 수율을 제공한다. 변형예들에서는, 2000 내지 8000 rpm으로 구성된 회전 속도가 제공되며, 믹서기는 모터 로터의 회전 속도 및 그에 따른 회전축의 회전 속도를 조정하기 위한 수단을 포함할 수 있다.
용기의 중심(central)/동축(coaxial)에 있고, 본 발명에서 실질적으로 절두 원추(frustoconical) 형상인 회전축은 지방 조직의 대류(convection)를 위해 그 기부(base)에 반경 방향의 베인(vane)들을 구비한다. 또한, 회전축을 따라, 나일론 또는 금속 와이어들이 조직의 효율적인 절단 및 분할을 보장하기 위해 회전축에 수직방향으로/반경방향으로 체결된다. 나일론 또는 금속 와이어들의 직경은 0.5 mm 내지 3 mm로 구성된다. 나일론 또는 금속 와이어들의 수는 3개 내지 15개로 구성된다.
나일론 또는 금속 와이어들에 의한 조직의 절단을 최적화하기 위해, 세레이션(serration)들이 용기의 내부면에 삽입될 수 있다. 세레이션들의 수는 2개 내지 12개로 구성될 수 있으며, 그것들의 두께는 1 mm 내지 6 mm로 구성될 수 있다. 세레이션들의 존재는 최적의 혼합을 가능하게 하는 조직들의 난류(turbulent flow)를 생성하는 것을 가능하게 한다. 그럼에도 불구하고, 이들 세레이션은 세레이션들 없이 세포를 수득할 수 있다는 점에서 선택적이지만, 그것들의 존재는 세포 제조 수율을 상당히 증가시킨다.
용기의 상부에는 본 발명의 실시 동안 조직의 오염을 감소시킬 수 있는 2개의 장치를 포함하는 뚜껑(lid)이 있다. 첫 번째 장치는 뚜껑을 통과하는 통기구이며, 0.22 ㎛의 필터가 제공되어 감염성(infectious) 입자 또는 불활성 입자가 없는 공기의 교환을 가능케 한다. 두 번째 장치는 캐뉼라(cannula)의 통과에 부수적으로 수반하는 외부 공기를 통과시키지 않으면서 캐뉼라의 통과를 가능케 하는 밸브 또는 격막(septum)이다. 바람직하게는, 이 밸브 또는 이 격막은 3 mm 캐뉼라, 전형적으로 지방 흡입 캐뉼라(liposuction cannula)가 통과하게 한다. 그러나, 이 사용가능한 캐뉼라 직경은 1 mm 내지 5 mm일 수 있다. 이 밸브 또는 이 격벽은 지방 흡입술로부터 나오는 지방 조직이 분쇄되기 위해 용기로 직접 들어가게 하고 믹서기에서 혼합한 후 균질액(homogenate)을 샘플링할 수 있게 한다.
따라서, 바람직하게는, 용기는, 실리콘 밸브이며 중공 캐뉼라의 통과를 수용하는 직경 1 내지 5 mm의 격막에 의해 폐쇄되며, 상기 캐뉼라의 제거 시에 격막에 의해 자동으로 폐쇄된다. 이 실리콘 밸브는 외부 공기와 밸브의 장기적인 직접 접촉을 방지하기 위해 외부/상부 플러그(external/top plug)로 완성될 수 있다. 이 비-천공(non-pierced) 실리콘 밸브는, 특히 용기로부터 외측 방향으로 액체들(liquids), 입자들(particles) 및 세포들(cells)을 통과시키지 않는다(impermeable). 실리콘 밸브와 플러그는 두 방향으로 기체 + 액체 + 입자들 + 세포들을 통과시키지 않는다.
도 1 내지 도 3에는 본 발명의 용기(1)의 회전축의 바닥까지의 수직 이용 및 구동에 관한 일 예가 도시되어 있다. 이 용기는 본 발명에서 절두 원추형 상승 측벽(frustoconical rising lateral wall;4)에 의해 상방향으로 연장되는 바닥 벽(8)을 갖는 절두 원추형 일체형 보울(bowl)로 구성된다. 용기(1)의 측벽(4)의 내부면은 세레이션(19)들을 포함한다. 회전축(9)은 중앙에 배치되고, 측벽(4)에 동축이며, 본 발명에서 여러 부품들의 조립으로 형성된다. 회전축(9)은 밀봉 방식으로 바닥 벽(8)을 통과하며, 그 하단에는 전기 모터를 포함하는 지지대(3)(도 4 참조)의 상호 보완적인 결합 부재(도시되지 않음)에 빠르게 결합하기 위한 수단(7)을 포함하며, 용기는 지지대 상에 착탈 가능하게 체결될 수 있다.
전동식 지지대(3)(도 4 참조)는 작동 파라미터들, 특히 온/오프, 지속 시간 및/또는 회전 속도의 조정을 위한 수단(13, 14)을 포함한다. 이 착탈가능한 체결을 가능하게 하기 위해, 전동식 지지대의 체결 수단과 상호 보완적인 체결 수단(11)이 구비되며, 이 경우에는 1/4 회전 스크류가 구비된다. 바닥 벽(8)을 통한 회전축(9)의 통로의 밀봉은 O-링 씰(2)을 구비함으로써 달성된다.
좁은 하부 기저부(lower base) 및 넓은 상단부(top)를 갖는 절두 원추형 보울은 뚜껑을 형성하는 상부 벽(5)에 의해 상부에서 폐쇄된다. 이 뚜껑(5)은 본 실시예에서 고정되며(clipped), 제거되도록 의도되지 않는다. 뚜껑은 용접될 수도 있다. 변형 실시예에서, 이 뚜껑은 제거 가능하다. 뚜껑(5)은 2개의 관통공을 포함한다. 제1 관통공(17)은 0.22㎛의 필터 및 격자(18)에 의해 폐쇄된다. 제2 관통공(20)은 3 mm 직경의 자동 폐쇄(self-closing) 밸브(16)에 의해 폐쇄되고, 자동 폐쇄 밸브는 폐쇄될 때 완전한 밀봉을 보장한다. 이 플랩(flap;16)은 캐뉼라가 제2 관통공(20) 내로 도입될 때 통로를 제공한다. 실리콘 밸브 유형의 자동 밀봉 격막의 경우, 통로는 캐뉼라의 제거 후 닫히게 된다. 제2 관통공(20)은 외부에 착탈식 캡으로 덮여 있다.
회전축(9)은 두 가지 유형의 반경 방향 아암(10, 12)을 포함한다. 회전축의 바닥을 향해 단단한 베인형 아암(10)들, 및 이들 베인형 아암 위에 나일론 또는 금속으로 만들어진 가요성의 또는 연질의 필라멘트형 아암(12)이 배치된다. 베인형 아암(10)들은 아암(10)의 반경 방향 연장에 실질적으로 직각인 수직 평면으로 연장되는 융기부(ridge;6)들을 포함할 수 있다. 반경 방향 아암들, 특히 필라멘트 아암(12)들은 회전축(9)의 높이에 걸쳐 엇갈려 있고 회전축의 높이 전체에 각지게 분포(angularly distributed)된다.
방법
원하는 세포 조성물을 수득하는 단계들은 도 4에 도식화되어 있다.
먼저, 단계 A에서, 지방 조직의 샘플링이 흡인 주사기(22) 또는 자동 진공 흡인 장치에 의해 환자(21)에게 수행되었다. 단계 B에서, 지방 조직은 주사기(22)의 캐뉼라를 제2 관통공(20)을 통해 통과시킴으로써 용기(1) 내로 주입된다. 조직의 용기 내로의 주입 동안, 용기(1) 내부에 과압(over-pressurized)된 공기는 필터(15)를 통과시킴으로써 제1 관통공(17)을 통해 배출된다. 단계 C에서, 주사기(22)는 용기(1)로부터 제거된다. 단계(D)에서, 용기(1)는 전동식 지지대(3)에 체결되고, 전동식 지지대의 모터는 조직을 파괴하고 세포를 분리하는 용기(1)의 회전축(9)을 회전시키기 위해 활성화된다. 작동 파라미터들은 전동식 지지대의 조정 수단(13, 14)에 의해 조정된다. 단계 E에서, 분해된 조직의 세포 및 다른 요소들은 제2 관통공(20)을 통해 주입된 주사기 캐뉼라(23) 내로 수집된다. 단계 F에서, 주사기(23)를 통한 흡인 동안, 외부 공기는 필터(15)를 통과함으로써 제1 관통공(17)를 통해 용기로 유입될 수 있다. 단계 G에서는, 단계 H에서의 재주입을 위한 원하는 세포를 선택하기 위해 원심 분리가 수행된다.
샘플링된 지방 조직에 기초하여, 본 발명의 믹서기는 콜라겐분해효소를 사용하여 프로토콜(protocol)에 의해 수득된 것에 가까운 SVF(Stromal Vascular Fraction; 기질혈관분획)로 지칭되는 세포 조성물을 수득할 수 있게 한다.
전형적으로, 정량적 관점에서, 25ml의 지방 조직을 기초로 하여, 약 200,000개의 생존 세포가 얻어진다. 정성적 관점에서, 본 발명의 믹서기의 사용은 전구 세포(progenitor cells)(과엽 줄기 세포(Mesenchymal Stem Cells)) 및 혈관주위세포(pericytes)로 간주되는 세포를 수집하는 정제된 세포들의 총 수에 대해 표현형(phenotype) CD34+, CD31-, CD45-를 갖는 세포들의 약 17%를 수득할 수 있게 한다. 이러한 비율은 콜라겐분해효소(19%)의 사용에 기초하여 정제 프로토콜에 의해 수득된 것과 매우 유사하다.

Claims (10)

  1. 특히 지방 흡입술 동안 수득된 조직 샘플로부터 분리된 세포들, 특히 지방 세포 및/또는 지방 조직에 함유된 세포들의 조성물을 제조하기 위한 조직들의 기계적 단편화를 위한 장치로서,
    상기 제조는 상기 장치에서 상기 조직들을 기계적으로 단편화하는 적어도 하나의 단계를 포함하고,
    상기 장치는 전동식 지지대(3) 및 용기(1)를 포함하고,
    상기 전동식 지지대(3)는 결합 부재와 일체인 로터를 갖는 모터를 포함하고,
    상기 용기(1)는 내부에, 축 방향으로 회전가능한 회전축(9)을 포함하고, 상기 회전축(9)이 회전할 때 상기 용기(1)의 내부를 스위핑(sweeping)할 수 있는 반경 방향 아암(10, 12)들을 포함하며,
    상기 전동식 지지대(3) 및 상기 용기(1)는 상기 용기(1)를 상기 전동식 지지대(3)에 고정하기 위한 상호 보완적인 착탈 가능한 체결 수단(11)을 포함하고,
    상기 결합 부재 및 상기 회전축(9)은 상기 모터 로터가 회전할 때 상기 회전축(9)의 축 방향 회전을 가능하게 하도록 구성되며,
    상기 반경 방향 아암(10, 12)들은 베인형 아암(10)들 및 필라멘트형 아암(12)들의 두 가지 유형인 것을 특징으로 하는 장치.
  2. 제 1항에 있어서,
    상기 베인형 아암(10)은 강성이고, 상기 필라멘트형 아암(12)은 가요성인 것을 특징으로 하는 장치.
  3. 제 1항 또는 제 2항에 있어서,
    상기 회전축(9)는 수직이고, 상기 용기(1)는 하부 바닥 벽(8), 상부 벽(5) 및 원통형 또는 절두 원추형 상승 측벽(4)을 갖는 원통형 또는 직선형의 절두 원추형이고, 상기 회전축(9)은 측벽(4)의 중심에 있고 측벽(4)과 동축에 있으며, 상기 베인형 아암(10)들은 상기 회전축(9)의 하부에 배열되는 반면, 상기 필라멘트형 아암(12)들은 상기 베인형 아암(10)들 위에 배열되는 것을 특징으로 하는 장치.
  4. 제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 있어서,
    각각의 베인형 아암(10)은 적어도 하나의 비스듬한 종방향 에지를 가지며, 상기 적어도 하나의 비스듬한 에지는 상기 회전축(9)이 회전할 때 가장 먼저 상기 용기의 내부를 스위핑하는 상기 아암의 측면 상에 있는 것을 특징으로 하는 장치.
  5. 제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 항에 있어서,
    각각의 필라멘트형 아암(12)은 나일론 또는 금속 와이어로 구성되는 것을 특징으로 하는 장치.
  6. 제 5항에 있어서,
    상기 나일론 또는 금속 와이어는 0.5 mm 내지 3 mm의 직경을 갖는 것을 특징으로 하는 장치.
  7. 제 3항 내지 제 6항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 용기(1)의 원통형 또는 절두 원추형 상승 측벽(4)은 내부에 세레이션들을 포함하는 것을 특징으로 하는 장치.
  8. 제 3항 내지 제 7항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 용기(1)는 액체에 대해 불투과성이고, 상기 상부 벽(5)은 2개의 관통공을 포함하고, 제1 관통공(17)은 필터(15)에 의해 폐쇄되고, 제2 관통공(20)은 피어싱 튜브(piercing tubing)에 의해 관통될 수 있고 완전 불투과성인 방식으로 상기 피어싱 튜브의 제거시에 자동으로 밀봉되는 자동 밀봉 격막에 의해 폐쇄되는 것을 특징으로 하는 장치.
  9. 제 8항에 있어서, 대안으로서, 상기 자동 밀봉 격막은 자동 폐쇄 밸브(16) 또는 플랩인 것을 특징으로 하는 장치.
  10. 특히 지방 흡입술 동안 수득된 조직 샘플로부터 분리된 세포들, 특히 지방 세포 및/또는 지방 조직에 함유된 세포들의 조성물을 제조하는 방법으로서,
    상기 제조는 상기 장치에서의 상기 조직들의 기계적 단편화의 적어도 하나의 단계를 포함하고,
    상기 장치는 전동식 지지대(3) 및 용기(1)를 포함하고,
    상기 전동식 지지대(3)는 결합 부재와 일체인 로터를 갖는 모터를 포함하고,
    상기 용기(1)는 내부에, 축 방향으로 회전가능한 회전축(9)을 포함하고, 상기 회전축(9)이 회전할 때 상기 용기의 내부를 스위핑(sweeping)할 수 있는 반경 방향 아암(10, 12)들을 포함하며,
    상기 전동식 지지대(3) 및 상기 용기(1)는 상기 용기(1)를 상기 전동식 지지대(3)에 고정하기 위한 상호 보완적인 착탈 가능한 체결 수단(11)을 포함하고,
    상기 결합 부재 및 상기 회전축(9)은 상기 모터 로터가 회전할 때 상기 회전축(9)의 축 방향 회전을 가능하게 하도록 구성되며,
    제 1항 내지 제 9항 중 어느 한 항에 따른 장치는 상기 조직들의 단편화를 위한 구성을 가지며, 상기 샘플링된 조직은 상기 결합 부재가 상기 회전축(9)을 회전시킬 수 있도록 미리 전동식 지지대(3)에 체결된 용기(1) 내로 도입되고, 상기 모터는 전원이 온(ON)되며, 모터가 정지된 후 상기 용기(1) 내용물의 적어도 일부가 수집되는 것을 특징으로 하는 방법.
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