KR20200024753A - 생체 적합성의 조건화된 세포 배지 조성물 및 그의 용도 - Google Patents

생체 적합성의 조건화된 세포 배지 조성물 및 그의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 부분적으로는, 생체 적합성 중합체 매트릭스 및 i) 세포 배양 배지 및 ii) 세포 배양 배지에서 배양된 하나 이상의 세포에 의해 합성되고 상기 세포로부터 분비된 하나 이상의 작용제를 포함하는 조건화된 세포 배지를 포함하는 생체 적합성 조성물, 및 특히 골 및/또는 잇몸 조직 성장의 조절에 있어서의 그의 치료 용도에 관한 것이다.

Description

생체 적합성의 조건화된 세포 배지 조성물 및 그의 용도
관련 출원에 대한 교차 참조
본원은 2017년 3월 31일에 출원된 미국 특허 가출원 제62/479,733호의 이익을 주장하며; 상기 출원의 전체 내용은 그 전체가 본원에 참고로 포함된다.
발명의 분야
본 발명의 분야는 세포 배양, 치주 및 뼈(골) 적용, 및 의료 생명공학, 특히 배양된 세포로부터 생성된 조건화된 세포 배지가 주입된 중합체 매트릭스를 포함하는 생체 적합성 조성물이다. 섬유모세포(fibroblast) 및 골모세포(osteoblast)와 같은 임의의 다양한 세포를 포함하는 배양된 세포는 세포 배지에서 시험관 내에서 성장하고, 배양 과정에서 배양된 세포는 작용제를 합성하여 세포 배지 내로 분비한다. 작용제를 함유하는 세포 배지를 수집하고, 중합체 매트릭스와 조합하여 생체 적합성 조성물 및 약제학적 제제를 생성한다. 조성물 및 제제는 뼈, 잇몸 또는 조직의 재생; 뼈 성장의 촉진; 피부 세포 및 조직의 회춘; 상처 치유의 자극; 및 치과 관련 질환, 장애 및 병태, 예컨대 치주 및 잇몸 질환의 치료를 포함하지만 이로 제한되지 않는 재생 과정에 사용될 수 있다.
치은염으로부터 보다 심각한 형태의 치주염에 이르기까지 치주 질환은 여전히 심각한 건강상의 문제이며, 미국과 전세계 성인의 치아 손실의 주요 원인이다(E. Reich et al.(1993) Comm . Dent. Oral Epidem . 21:379; J. Angelillo et al. (1996) Comm . Dent. Oral Epidem . 24:336; H. Murray et al. (1997) Int . Dent. J. 47:3-8; R. C Oliver et al. (1998) J. Periodontol. 69:269-278; G. Ong (1998) Int . Dental J. 48:233-238; I. Haddad et al. (1999) Dental J. 49:343-346; E. F. Corbet et al. (2000) Periodontol. 29:122-152; A. Sheiham et al. (2000) Periodontol . 29:104-121; I. Chestnutt et al. (2000) J. Dentist. 28:295-297; U. M. Irfan et al. (2001) J. Int . Acad. Periodontol . 3:14-21). 여러 유형의 치주 질환이 미국 인구의 15-35%에 영향을 미치는 것으로 추정되며, 이는 수천만 명의 환자로 해석되고(J. M. Albandar et al. (1999) J. Peridontol. 70:13-29), 연간 수십억 달러가 소요된다. 또한, 치주 질환은 구강 조직 및 구조적 완전성에 대한 유해한 영향을 넘어선 영향을 갖고, 심혈관 질환, 임신 합병증 및 당뇨병을 포함한 몇몇 전신 병태에 대한 증가된 이환율 및 사망률에 대한 잠재적 위험 인자를 나타낸다(R. C. Page et al. (1998) Ann. Periodontol. 3:108-120; R. I. Garcia et al. (1998) Ann. Periodontol . 3:339-349).
치주염은 플라크의 존재에 의해 염증 과정이 자극되어 임상적 부착 및 치조골의 상실을 유발할 수 있는 감염성 질환이다. 치주 질환의 가장 흔한 형태는 성인에서 관찰되며, 만성 진행을 나타낸다(I. Brook (2003) Gen. Dent. 51:424-428). 치주 질환의 진행은 숙주 반응의 만성 지속성에 의존한다. 구강에 존재하는 수백 개의 박테리아 종 중에서, 단지 소수만이 치주 질환의 병인에 관여한다(S. S. Socransky et al. (2002) Periodontal. 28:12-55). 생물막은 박테리아, 예컨대 포르피로모나스 깅기발리스(Porphyromonas gingivalis), 박테로이데스 포르시투스(Bacteroides forsythus); 및 트레포네마 덴티콜라(Treponema denticola)를 함유할 수 있고, 이들의 존재는 치주 질환의 임상적 특징, 특히 치주낭 깊이 및 탐침시 출혈과 현저히 관련된다(S. S. Socransky et al. (1998) J. Clin . Periodontol . 25:134-144). 이러한 병원성 유기체 중 일부는 치주 조직, 상아질 세관 및 구강의 다른 영역을 침범할 수 있다. 종래의 치주 요법은 치아 구조로부터 유착물을 기계적으로 전단하기 위해 잇몸 틈새에 배치된 치과용 기구를 사용하여 치근 표면으로부터 박테리아의 연질 및 경질 유착물을 기계적으로 제거하는 것을 강조하였다. 그러나, 스케일링 및 치근면 활택술(root planning)은 종종 상기 유착물의 제거에서 단지 부분적으로만 효과적이다. 또한, 쉽게 접근할 수 있는 영역의 경우에도, 제거는 일시적이며, 박테리아가 치근 표면에 다시 대량 서식한다.
치주 부위에서 병독성 박테리아가 번성하기 시작하면, 이들 박테리아는 잇몸선 아래에서 독성 및 병원성 생성물을 분비하여 염증 반응을 유도하고 만성 감염을 일으킬 수 있다. 박테리아 독소가 치조골을 용해함에 따라, 잇몸 및 치조골이 함께 약해져서, 치아의 뿌리를 노출시킬 수 있다. 다른 경우에, 치조골은 약해질 수 있지만, 잇몸은 두툼한 상태를 유지하고 상실된 치조골을 대체한 잔해 주머니 주위에 벽을 형성한다. 두 가지 상황 모두에서, 치아의 뿌리는 공기 또는 자극성 박테리아 독소에 노출되고, 이들은 자발적인 통증 또는 차가운, 뜨거운 또는 달콤하거나 신맛이 나는 음식에 대한 치아 민감성을 유발할 수 있다. 치조골 손실로 인한 손상은 일반적으로 영구적이지만, 적절한 가정 구강 위생을 통해 조기 치주염이 억제될 수 있고, 치아 손실의 위험이 최소화된다. 치조골 손실이 진행되면, 치아를 깨끗하게 유지하기 위해 모다 침습적인 처치가 수행될 수 있다. 치조골 손실이 계속되고 치아 지지대가 손상되면, 치아는 움직일 수 있으며, 결국 손실되거나 발치해야 할 필요가 있다.
치주 질환에 대한 현재 치료는 항미생물 화합물 또는 다양한 비스테로이드성 항염증제(NSAID)를 함유하는 조성물의 사용을 주로 포함한다. 전신 항생제는 치주 요법에 사용되어 왔다(R. J. Genco (1981) J. Periodontal. 52:545-558). 그러나, 전신 전달(예를 들어, 경구 또는 근내)은 전형적으로 잇몸 틈새 영역에 장기간에 걸쳐 충분한 농도의 항생제를 제공하지 못한다. 치주 질환이 진행된 경우, 치주낭을 제거하고 치조골을 재구성하기 위한 외과적 개입이 수행될 수 있다. 외상성 폐색을 제거하기 위해 흔들리는 치아의 고정(splinting) 및 치아 표면의 선택적 재성형이 필요할 수 있다. 이러한 공지된 치료에도 불구하고, 치주 질환을 예방 및 치료하기 위한 개선된 조성물 및 방법이 여전히 요구되고 있다. 특히, 치주염 관련 치조골 손실을 예방 및 치료하는 방법이 매우 바람직하다.
발명의 요약
본 발명은 조건화된 세포 배지가 중합체 매트릭스(예를 들어, 아가로스)와 조합되어 재생 용도를 위한 생체 적합성 조성물 및 약제학적 제제를 생성할 수 있다는 발견에 적어도 부분적으로 기초한다.
한 측면에서, (a) 생체 적합성 중합체 매트릭스 및 (b) i) 세포 배양 배지 및 ii) 세포 배양 배지에서 배양된 하나 이상의 세포에 의해 합성되고 상기 세포로부터 분비된 하나 이상의 작용제를 포함하는 조건화된 세포 배지를 포함하는 생체 적합성 조성물이 제공된다.
본 발명의 임의의 측면에 적용될 수 있고/있거나 본원에서 설명되는 임의의 다른 실시양태와 조합될 수 있는 다수의 실시양태가 추가로 제공된다. 예를 들어, 한 실시양태에서, 세포는 섬유모세포, 예컨대 피부 섬유모세포 및 특히 신생아 피부 섬유모세포이다. 또 다른 실시양태에서, 세포는 골모세포이다. 또 다른 실시양태에서, 세포는 섬유모세포 및 골모세포이다. 또 다른 실시양태에서, 세포는 섬유모세포와 골모세포의 공동 배양물이다. 또 다른 실시양태에서, 세포는 활발히 증식하는 세포이다. 또 다른 실시양태에서, 세포 배양 배지는 기저 세포 배양 배지를 포함하고, 태아 소 혈청(FBS), L-글루타민, 인간 표피 성장 인자(EGF), 염기성 섬유모세포 성장 인자(bFGF) 및 아스코르브산으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 보충제를 추가로 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 기저 세포 배양 배지는 둘베코 변형 이글 배지(DMEM: Dulbecco's modified eagle medium)이다. 다른 실시양태에서, 보충제는 재조합 성장 인자, 예컨대 인간 재조합 성장 인자이다. 또 다른 실시양태에서, 하나 이상의 작용제는 성장 인자를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 하나 이상의 작용제는 혈소판 유래 성장 인자(PDGF), 표피 성장 인자(EGF), 섬유모세포 성장 인자(FGF), 염기성 섬유모세포 성장 인자(bFGF), 혈관 내피 성장 인자(VEGF), 각질세포 성장 인자(KGF), 전환 성장 인자 알파(TGFα), 전환 성장 인자 베타(TGFβ), 전환 성장 인자 베타-1(TGFβ1), 전환 성장 인자 베타-2(TGFβ2), 인슐린 유사 성장 인자(IGF), 신경 성장 인자(NGF), 간세포 성장 인자(HGF), 인슐린, 히드로코르티손, 유로가스트론, 혈소판 유래 상처 치유 인자(PDWHF), 뇌 유래 신경 영양 인자(BDNF), 혈소판 인자 IV(PF IV), 종양 괴사 인자(TF), 과립구 콜로니 자극 인자(GCSF), 콜로니 자극 인자(CSF), 골 형태 형성 단백질(BMP), 오스테오칼신, 오스테오폰틴, 인터류킨-1, 인터류킨-6, 인터류킨-8(IL-8), 인터류킨-11 및 성장 분화 인자(GDF), 또는 이들의 조합으로부터 선택된다. 또 다른 실시양태에서, 세포 배양 배지에서 배양된 하나 이상의 세포에 의해 합성되고 상기 세포로부터 분비된 하나 이상의 작용제는 배양 전의 세포 배양 배지 내의 농도와 비교하여 약 적어도 2배, 약 2배, 약 3배, 약 4배, 약 5배, 약 6배, 약 7배, 약 8배, 약 9배, 약 10배, 약 11배, 약 12배, 약 13배, 약 14배, 약 15배, 약 16배, 약 17배, 약 18배, 약 19배, 약 20배, 약 25배, 약 30배, 약 40배, 약 50배, 약 60배, 약 70배, 약 80배, 약 90배 및 약 100배의 증가로 이루어진 군으로부터 선택되는 농도로 조건화된 배지에 존재한다. 또 다른 실시양태에서, 세포는 세포 배양 배지에서 적어도 24시간, 경우에 따라 적어도 48시간 또는 적어도 72시간 동안 배양된다. 또 다른 실시양태에서, 생체 적합성 조성물은 세포를 포함하지 않는다. 또 다른 실시양태에서, 조건화된 세포 배지는 농축되고, 경우에 따라, 조건화된 세포 배지는 접선 유동 여과에 의해 농축된다. 또 다른 실시양태에서, 중합체 매트릭스는 아가로스, 예컨대 해초로부터 유래된 아가로스이다. 또 다른 실시양태에서, 아가로스는 저 융점 아가로스 또는 초저 융점 아가로스이다. 또 다른 실시양태에서, 아가로스는 약 0.8% 내지 3.0% 중량 대 부피(w:v), 약 0.9% w:v, 약 1.0% w:v, 약 1.1% w:v, 약 1.2% w:v, 약 1.3% w:v, 약 1.4% w:v, 약 1.5% w:v, 약 1.6% w:v, 약 1.7% w:v, 약 1.8% w:v, 약 1.9% w:v, 약 2.0% w:v, 약 2.1% w:v, 약 2.2% w:v, 약 2.3% w:v, 약 2.4% w:v, 약 2.5% w:v, 약 2.6% w:v, 약 2.7% w:v, 약 2.8% w:v, 약 2.9% w:v 및 약 3.0% w:v로 이루어진 군으로부터 선택된다. 또 다른 실시양태에서, 조건화된 세포 배지는 생체 적합성 조성물 부피의 약 50%이다.
또 다른 측면에서, 생체 적합성 조성물을 생성하는 방법이 제공되고, 이 방법은 (a) 세포 배양 배지에서 세포를 배양하는 단계; (b) 세포 배양 배지에서 세포에 의해 합성되고 상기 세포로부터 분비된 하나 이상의 작용제로 조건화된 세포 배양 배지로부터 배양된 세포를 분리하여 조건화된 세포 배지를 생성하는 단계; 및 (c) 조건화된 세포 배지를 생체 적합성 중합체 매트릭스와 혼합하는 단계를 포함한다.
상기 설명한 바와 같이, 본원에서 설명되는 본 발명의 임의의 측면에 대해 수많은 실시양태들이 고려된다. 예를 들어, 한 실시양태에서, 세포는 섬유모세포, 예컨대 피부 섬유모세포 및 특히 신생아 피부 섬유모세포이다. 또 다른 실시양태에서, 세포는 골모세포이다. 또 다른 실시양태에서, 세포는 섬유모세포 및 골모세포이다. 또 다른 실시양태에서, 세포는 섬유모세포와 골모세포의 공동 배양물이다. 또 다른 실시양태에서, 세포는 활발히 증식하는 세포이다. 또 다른 실시양태에서, 세포 배양 배지는 기저 세포 배양 배지를 포함하고, 태아 소 혈청(FBS), L-글루타민, 인간 표피 성장 인자(EGF), 염기성 섬유모세포 성장 인자(bFGF) 및 아스코르브산으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 보충제를 추가로 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 기저 세포 배양 배지는 둘베코 변형 이글 배지(DMEM)이다. 다른 실시양태에서, 보충제는 재조합 성장 인자, 예컨대 인간 재조합 성장 인자이다. 또 다른 실시양태에서, 하나 이상의 작용제는 성장 인자를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 하나 이상의 작용제는 혈소판 유래 성장 인자(PDGF), 표피 성장 인자(EGF), 섬유모세포 성장 인자(FGF), 염기성 섬유모세포 성장 인자(bFGF), 혈관 내피 성장 인자(VEGF), 각질세포 성장 인자(KGF), 전환 성장 인자 알파(TGFα), 전환 성장 인자 베타(TGFβ), 전환 성장 인자 베타-1(TGFβ1), 전환 성장 인자 베타-2(TGFβ2), 인슐린 유사 성장 인자(IGF), 신경 성장 인자(NGF), 간세포 성장 인자(HGF), 인슐린, 히드로코르티손, 유로가스트론, 혈소판 유래 상처 치유 인자(PDWHF), 뇌 유래 신경 영양 인자(BDNF), 혈소판 인자 IV(PF IV), 종양 괴사 인자(TF), 과립구 콜로니 자극 인자(GCSF), 콜로니 자극 인자(CSF), 골 형태 형성 단백질(BMP), 오스테오칼신, 오스테오폰틴, 인터류킨-1, 인터류킨-6, 인터류킨-8(IL-8), 인터류킨-11 및 성장 분화 인자(GDF), 또는 이들의 조합으로부터 선택된다. 또 다른 실시양태에서, 세포 배양 배지에서 배양된 하나 이상의 세포에 의해 합성되고 상기 세포로부터 분비된 하나 이상의 작용제는 배양 전의 세포 배양 배지 내의 농도와 비교하여 약 적어도 2배, 약 3배, 약 4배, 약 5배, 약 6배, 약 7배, 약 8배, 약 9배, 약 10배, 약 11배, 약 12배, 약 13배, 약 14배, 약 15배, 약 16배, 약 17배, 약 18배, 약 19배, 약 20배, 약 25배, 약 30배, 약 40배, 약 50배, 약 60배, 약 70배, 약 80배, 약 90배 및 약 100배의 증가로 이루어진 군으로부터 선택되는 농도로 조건화된 배지에 존재한다. 또 다른 실시양태에서, 세포는 세포 배양 배지에서 적어도 24시간, 경우에 따라 적어도 48시간 또는 적어도 72시간 동안 배양된다. 또 다른 실시양태에서, 생체 적합성 조성물은 세포를 포함하지 않는다. 또 다른 실시양태에서, 조건화된 세포 배지는 조건화된 세포 배지를 생체 적합성 중합체 매트릭스와 혼합하기 전에 농축되고, 경우에 따라, 조건화된 세포 배지는 접선 유동 여과에 의해 농축된다. 또 다른 실시양태에서, 중합체 매트릭스는 아가로스, 예컨대 해초로부터 유래된 아가로스이다. 또 다른 실시양태에서, 아가로스는 저 융점 아가로스 또는 초저 융점 아가로스이다. 또 다른 실시양태에서, 아가로스는 약 0.8% 내지 3.0% 중량 대 부피(w:v), 약 0.9% w:v, 약 1.0% w:v, 약 1.1% w:v, 약 1.2% w:v, 약 1.3% w:v, 약 1.4% w:v, 약 1.5% w:v, 약 1.6% w:v, 약 1.7% w:v, 약 1.8% w:v, 약 1.9% w:v, 약 2.0% w:v, 약 2.1% w:v, 약 2.2% w:v, 약 2.3% w:v, 약 2.4% w:v, 약 2.5% w:v, 약 2.6% w:v, 약 2.7% w:v, 약 2.8% w:v, 약 2.9% w:v 및 약 3.0% w:v로 이루어진 군으로부터 선택된다. 또 다른 실시양태에서, 조건화된 세포 배지는 생체 적합성 조성물 부피의 약 50%이다.
또 다른 측면에서, 본 발명의 생체 적합성 조성물은 약제학적 제제의 제조에 사용될 수 있으며, 경우에 따라 약제학적 제제는 국소적으로 적용되는 치주 치료제이다.
또 다른 측면에서, 대상체에서 골을 성장시키거나 또는 골 흡수를 억제하는 방법이 제공되고, 상기 방법은 유효량의 본 발명의 생체 적합성 조성물을 골 성장 및/또는 골 흡수 억제를 필요로 하는 부위에 투여(처치)하는 단계를 포함하고, 경우에 따라, 상기 방법은 치주 부위에서의 새로운 골 성장의 총 골유착, 수직 골유착 및/또는 측방 골유착을 향상시킨다. 한 실시양태에서, 대상체는 골절, 골 결핍, 전이성 골 질환, 골관절염, 골다공증 및/또는 골용해성 골 질환을 갖는다.
또 다른 측면에서, 대상체에서 치주 병태를 치료하는 방법이 제공되고, 상기 방법은 유효량의 본 발명의 생체 적합성 조성물을 대상체에서 a) 잇몸 및/또는 골 성장 및/또는 b) 잇몸 침식 및/또는 골 흡수 억제를 필요로 하는 치주 부위에 투여하는 단계를 포함하고, 경우에 따라, 상기 방법은 치주 부위에서의 새로운 골 성장의 총 골유착, 수직 골유착 및/또는 측방 골유착을 향상시킨다.
상기 설명한 바와 같이, 본원에서 설명되는 본 발명의 임의의 측면에 대한 다수의 실시양태가 고려된다. 예를 들어, 한 실시양태에서, 대상체는 치주 질환, 잇몸 염증, 충치, 잇몸 질환, 치은염 및/또는 치주염을 갖는다. 또 다른 실시양태에서, 골 질량이 유지되거나 증가되거나, 골 밀도가 유지되거나 증가되거나, 잇몸 조직이 유지되거나 증가되거나, 또는 이들의 임의의 조합이 가능하다. 또 다른 실시양태에서, a) 잇몸 및/또는 뼈 성장을 촉진하고/하거나, b) 잇몸 침식 및/또는 골 흡수를 억제하는 유효량의 치료제가 대상체에게 투여된다. 또 다른 실시양태에서, 생체 적합성 조성물을 투여하고 치료제를 투여하는 것은 순차적으로 또는 동시에 수행된다. 또 다른 실시양태에서, 치료제는 골 형태 형성 인자, 항흡수제, 골 형성 인자, 연골 유래 형태 형성 단백질, 성장 호르몬, 에스트로겐, 비스포스포네이트, 스타틴, 분화 인자, 진통제, 마취제, 항미생물제, 항박테리아제, 항바이러스제, 항진균제, 항생제, 항염증제, 항산화제, 방부제, 면역 자극제 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 또 다른 실시양태에서, 생체 적합성 조성물은 부위에 국소적으로 투여된다. 또 다른 실시양태에서, 국소 투여는 상처 드레싱, 외과적 폐쇄, 스테이플링(stapling), 접착 스트립, 생체 접착제 또는 잇몸 플랩(gum flap)으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 다른 실시양태에서, 대상체는 인간, 고양이, 개, 말 또는 설치류와 같은 포유동물이다. 또 다른 실시양태에서, 포유동물은 치주의 a) 잇몸 및/또는 골 성장 및/또는 b) 잇몸 침식 및/또는 골 흡수 억제를 필요로 하는 장애의 동물 모델이다.
본 발명의 상기 및 다른 목적, 장점 및 특징은 하기 상세한 설명을 읽은 관련 기술 분야의 통상의 기술자에게 명백할 것이다.
도 1은 각각의 배지 사이에서 세포 크기 또는 형태에 대한 뚜렷한 영향이 없음을 나타내는 세포 형태의 현미경 사진을 도시한 것이다.
도 2는 24시간(hr) 후의 세포 증식 검정을 보여준다. 대조군 배지는 DPBS에 해당한다. 비조건화된 배지는 비조건화된 섬유모세포 및 골모세포 배지의 50:50 혼합물에 해당한다. 조건화된 배지는 섬유모세포 및 골모세포 조건화된 배지의 50:50 혼합물에 해당한다.
도 3a 및 도 3b는 스크래치(scratch) 검정의 현미경 사진을 보여준다. 도 3a는 골모세포 비조건화된 배지를 사용한 스크래치 검정을 도시한 것이다. 24시간의 성장 후, 골모세포는 원래의 갭의 약 40%를 채우도록 성장하였다. 48시간의 성장 후, 골모세포는 대향 측면 사이의 소통이 거의 없는 상태로 원래의 갭의 약 50%를 채우도록 성장하였다. 도 3b는 골모세포 조건화된 배지를 사용한 스크래치 검정을 도시한 것이다. 24시간의 성장 후, 골모세포는 원래의 갭의 약 40%를 채우도록 성장하였다. 48시간의 성장 후, 골모세포는 대향 측면과 소통하면서 원래의 갭의 약 75%를 채우도록 성장하였다.
도 4는 24시간에 이웃 세포에 대한 아가로스 디스크의 파라크린(paracrine) 유사 효과의 현미경 사진을 보여준다. 조건화된 배지를 함유하는 아가로스 디스크는 대조군(PBS) 또는 비조건화된 것(비조건화된 배지)과 비교하여 주변부 주위에 유의하게 더 많은 세포 응집을 가졌다.
도 5는 8주 치료 후의 골 재생의 마이크로 CT 섹션 스캔 이미지를 보여준다.
도 6은 8주 치료 후의 골 성장 및 임플란트-골유착의 마이크로 CT 섹션 스캔 이미지를 보여준다.
발명의 상세한 설명
본 발명은 하나 이상의 배양된 세포(예를 들어, 섬유모세포 및/또는 골모세포)로부터 합성되고 상기 세포로부터 분비된 하나 이상의 배양된 작용제를 포함하는 조건화된 세포 배지가 주입된 중합체 매트릭스(예를 들어, 아가로스)를 포함하는 생체 적합성 조성물을 제공한다. 상기 조성물은 잇몸 성장 및/또는 뼈 성장을 유도하거나 촉진하는 방법뿐만 아니라 대상체(예를 들어, 인간 또는 동물)에서 뼈 악화를 감소시키거나 억제하기 위한 방법에 사용될 수 있다. 이 방법은 일반적으로 유효량의 생체 적합성 조성물을 대상체에게 투여하는 것을 포함한다. 비외과적이고 비침습적이고 안전한 본 발명의 방법은 치주 질환, 골관절염, 전이성 골 질환 및 골 용해성 골 질환을 포함하지만 이에 제한되지 않는, 잇몸 및/또는 골 분해, 잇몸 및/또는 골 악화 및/또는 잇몸 및/또는 골 변성과 관련된 질환 상태 또는 병태의 치료 및/또는 예방에 사용될 수 있다. 상처 치유의 자극, 뼈, 잇몸 또는 조직의 재생, 치주염, 치은염 및 잇몸 질환과 같은 치과 관련 질환, 장애 및 병태의 치료를 포함하지만 이에 제한되지 않는 추가적인 재생 용도가 고려된다. 상기 방법을 수행하는데 사용될 수 있는 생체 적합성 조성물을 포함하는 약제학적 조성물 및 키트가 또한 제공된다.
본원에서 제공되는 생체 적합성 조성물은 회복 시간을 단축하고 과량의 배양된 작용제, 예컨대 사이토카인 및 성장 인자를 포함하는 조건화된 세포 배지를 사용하여 재생 과정에 대한 전체적인 환자 결과를 개선하기 위한 치료 대안/보조제를 의사에게 제공한다. 증식하는 배양된 섬유모세포 및 골모세포로부터 방출된 성장 인자와 같은 배양된 작용제의 불균일 조성물은 각각 잇몸 재생에 관여하는 섬유모세포 증식 및 분화, 및 골 재생에 관여하는 골모세포 증식/성숙을 자극하는 사이토카인 및 성장 인자의 완전한 공급원을 제공한다.
현재까지, 활발하게 증식하는 섬유모세포 또는 골모세포로부터 내생적으로 방출되는 성장 인자를 포함하는 현재 이용가능한 시판되는 제품은 존재하지 않는다. GEM21®(Osteohealth)은 뼈 성장을 촉진하기 위해 재조합 PDGF를 사용하는 시판되는 하나의 제품이지만, 이것은 치과용 뼈 충전 기재로서 사용되는 합성 인산칼슘 성장 인자 강화 매트릭스이다. 에나멜린 및 아멜로블라스틴을 포함하는 단백질 함유 겔인 엠도게인(Emdogain)®(Straumann)과 같은 다른 제품은 치주 질환으로 인한 뼈 결함을 치료하기 위해 법랑질모세포(ameloblast) 활성 및 법랑질 기질 단백질을 촉진할 수 있다.
이러한 기존 제품은 치주 재생 및 뼈 재생과 같은 재생 과정이 복잡한 생물학적 과정임을 인식하지 못한다. 이러한 생물학적 과정에는 기존 제품에 결여된 여러 가지 성장 인자를 수반하고, 따라서 기존 제품은 최적의 결과를 생성하지 못한다.
이와 대조적으로, 본 발명은 배양된 세포, 예컨대 섬유모세포 및 골모세포에 의해 내생적으로 방출되는 성장 인자의 완전한 혼합물을 포함하는 생체 적합성 조성물을 제공한다. 이것의 근거는 잇몸 및 뼈 재생과 같은 재생 과정의 복잡성을 해결하고 또한 하나의 방식을 사용하여 이를 달성할 수 있다는 것이다. 이론에 매이지 않지만, 중합체 매트릭스(예를 들어, 아가로스)의 사용은 외상 또는 골 손실 영역에 대한 노출을 증가시켜 궁극적으로 세포 증식을 증가시키는 성장 인자의 지속 방출을 위한 저장소로서 작용한다.
I. 정의
관사 "a" 및 "an"은 본 명세서에서 관사의 문법적 대상 중 하나 또는 하나 초과(즉, 적어도 이상)를 지칭하기 위해 사용된다. 예를 들어, "요소"는 하나의 요소 또는 하나 초과의 요소를 의미한다.
"약"이라는 용어는 일반적으로 달리 특정되지 않는 한, 언급된 범위의 10% 이내인 값 또는 그 사이의 포괄적인 임의의 범위, 예컨대 언급된 범위보다 5% 더 작은 값 및 8% 더 큰 값 내의 범위 값을 지칭한다.
용어 "골 병태"는 골 질량 및/또는 골 밀도를 증가시키거나, 개선하거나, 촉진하고/하거나, 골 질량 및/또는 골 밀도의 손실을 방지하거나, 억제하거나, 감소시키는 것이 바람직한 임의의 병태를 포함한다. 용어 "골 병태"는 파골세포 및/또는 골모세포의 수를 증가시키거나, 파골세포 및/또는 골모세포의 활성을 증가시키거나, 골 흡수를 증가시키거나, 골수 섬유증을 증가시키거나, 뼈의 칼슘 함량을 변경하는 임의의 병태를 포함한다.
용어 "골 손실"은 골격 질량, 골격의 물질 또는 기질 또는 임의의 성분, 예컨대 칼슘 및 포스페이트가 감소하거나 또는 골절에 저항하는 능력의 측면에서 뼈 또는 치아가 손실, 손상 또는 약화되는 상황을 의미한다. "골 손실"이라는 용어는 또한 골 악화, 골 분해, 골 변성, 골 질량 손실, 골 밀도 손실 및 이들 상태의 임의의 조합을 특징으로 하는 임의의 상황을 포함한다.
용어 "유효량"은 의도된 목적(들)을 달성하기에 충분한 본원에서 제공되는 임의의 양의 분자, 작용제, 인자 및/또는 생체 적합성 조성물을 지칭한다(예를 들어, 상기 목적은 골 손실, 예를 들어, 치주 질환과 관련된 골 손실을 치료 또는 예방하는 것일 수 있다).
"국지적인" 및 "국소"라는 용어는 화합물 또는 조성물의 전달, 투여 또는 적용을 지칭하며, 화합물 또는 조성물이 국지적인 효과를 위한 관심 부위에(예를 들어, 치주 질환과 같은 구강 장애에 대해 구강 내에) 직접 전달, 투여 또는 적용됨을 명시하는 것을 의미한다. 특정 실시양태에서, 국지적인 또는 국소 투여는 조성물 성분의 대상체 혈류 내로의 어떠한 유의한 흡수도 없이 수행된다.
용어 "골모세포"는 뼈 형성을 위한 매트릭스를 분비하는 세포를 지칭한다.
용어 "파골세포"는 성장 및 치유 동안 뼈 조직을 흡수하는 큰 다핵성 골세포를 지칭한다.
용어 "골 전도(성)"은 주변 조직으로부터 골 형성 세포의 성장 및 배향을 위한 환경을 제공하는 화합물, 조성물, 방법 또는 물질의 능력을 지칭한다.
용어 "골 형성(성)"은 골 형성을 야기(예를 들어, 개시, 촉진, 용이, 가속, 향상, 자극 등)하는 화합물, 조성물, 방법 또는 물질의 능력을 지칭한다.
용어 "골 유도(성)"은 전구체 세포, 특히 중간엽 줄기 세포로부터 골모세포의 생성을 유도하는 화합물, 조성물, 방법 또는 물질의 능력을 지칭한다. 골 유도성 화합물, 조성물, 방법 또는 물질은 직접적으로 작용할 수 있거나(예를 들어, 골모세포 분화를 유도하기 위해 전구체 세포와 상호작용하는 성장 인자와 같이), 골 유도성 성장 인자의 생성을 유도함으로써 간접적으로 작용할 수 있다.
용어 "구강 장애"는 "치과 장애"와 교환 가능하게 사용되며, 비정상적으로 낮거나 불충분한 수준의 구강 골(예를 들어, 구강 내의 뼈)에 의해 유발되거나 이를 특징으로 하는 장애, 질환 또는 병태를 포함한다. 예시적인 구강 골은 치조골 및 기저골을 포함한다. 골 질량 또는 골 성장을 증가시킴으로써 본 발명에 따라 치료될 수 있는 구강 질환은 치주 질환, 치조골 손실, 치은염, 골다공증, 골감소증, 구강 골절제, 구강골 골절, 관절염, 골관절염, 절골술 골 손실, 소아 특발성 골 손실 등을 포함하지만, 이로 제한되지 않는다. 본 발명에 따라 치료될 수 있는 파괴성 구강 골 장애는 골다공증, 골감소증, 골관절염 및 신생물성 질환, 방사선 요법 또는 화학 요법에 의해 야기되는 것과 같은 골용해성 병변을 포함하지만, 이로 제한되지 않는다. 또한, 연조직, 상피 및 결합 조직, 예컨대 콜라겐 및 혈관을 포함하는 다른 구강 조직의 재생도 본 발명에 의해 고려된다.
용어 "치주 질환"은 치아를 둘러싸고 지지하는 치주 조직의 모든 질환을 포함한다(예를 들어, 문헌 [D. M. Williams et al., Pathology of Periodontal Disease (1992) Oxford University Press] 참조). 이것은 치은, 백악질, 치주 인대, 치조돌기뼈 및 치아 지지골을 포함한다. 구체적으로, 치주 질환은 치은염 및 치주염을 포함한다. 치은염은 치은 내에 염증이 국한되어 치아와 치은 사이의 뼈에 병변이 발생하지 않는 질환이다. 치주염은 치은 염증이 치주 인대 및 치조골에 도달하는 질환이다. 치료하지 않으면, 치주염은 치아 손실로 이어질 수 있다. 치주 질환은 또한 치주에 영향을 미치는 더 큰 염증성 질환 세트를 포함한다. 예를 들어, 이러한 질환은 치태 유발 치은 질환; 만성(이전의 성인) 치주염; 침습적인 치주염(이전의 조기 발병, 사춘기전, 유년형 또는 급속 진행형 치주염); 괴사성 치주 질환; 치주 농양; 및 수술후 박테리아 감염(특히 피. 깅기발리스(P. gingivalis))에 의해 유발, 전염 및/또는 악화되는 감염)을 포함한다.
용어 "대상체"는 임의의 건강한 동물, 포유동물 또는 인간, 또는 관심 병태(예를 들어, 치주 질환)로 고통받는 임의의 동물, 포유동물 또는 인간을 지칭한다. "대상체"라는 용어는 "환자" 또는 "개체"와 교환 가능하다. 이들은 본 발명의 생체 적합성 조성물의 투여가 그에 대해 유익하지만 질환 상태 또는 병태가 존재할 수도 있고 존재하지 않을 수도 있는, 상기 질환 상태 또는 병태로 고통받을 수 있는 보다 고등한 척추동물, 바람직하게는 인간 또는 또 다른 포유동물(예를 들어, 마우스, 래트, 토끼, 원숭이, 개, 고양이, 돼지, 소, 말 등)을 지칭한다. 많은 실시양태에서, 대상체는 골 병태, 예를 들어 골 손실과 관련된 골 병태를 고통받고 있거나 상기 병태에 취약하다(즉, 높거나 보다 높은 발병 위험을 나타낸다). 특정 실시양태에서, 대상체는 인간이다. 이 용어는 특정 연령을 나타내지 않고, 따라서 성인, 어린이 및 신생아를 포함한다. 다른 실시양태에서, 대상체는 골 손실 및/또는 치주 질환과 같은 관심 장애의 동물 모델이다.
"봉합"이라는 용어는 조직 수복을 달성하기 위해 상처의 가장자리 또는 수술 절개부를 함께 유지하는 스티치(stitch) 또는 일련의 스티치를 지칭한다. 봉합에 의한 치유는 한쪽 끝에 연결된 금속 바늘을 사용하여 조직에 봉합사를 넣어 상처의 가장자리를 함께 모으고, 바늘을 절개부의 양 측면 사이에 연속적으로 통과시켜 상처의 폐쇄를 수동적으로 용이하게 하는 것으로 이루어진다. 봉합은 또한 출혈을 멈추게 하고(지혈) 인체의 장기 및 다른 구조를 복구하기 위한 수술에도 사용된다. 어떤 상황에서, 이들 봉합은 이들이 사용되는 조직의 치유 어려움으로 인해 특히 세심한 주의를 필요로 한다. 결장 벽에, 힘줄에, 및 신경 조직 및 혈관과 관련된 미세 외과 수술에 사용되는 봉합이 바로 그러한 경우이다.
용어 "치료"는 본 명세서에서 (1) 질환 상태 또는 병태의 발병 지연 또는 예방; (2) 임상 병태의 증상의 진행, 심화 또는 악화의 지연 또는 중지, (3) 병태의 증상의 개선; 및/또는 (4) 병태의 치유를 목적으로 하는 처리/방법을 특징으로 한다. 치료는 예방 작용을 위해 병태의 발병 전에 투여될 수 있거나, 치료 작용을 위해 병태의 개시 후에 투여될 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "상처"는 찰과상, 화상, 균열, 마멸, 베인 상처, 당뇨병성 하퇴부 궤양, 열상, 깊게 베인 상처, 장기 이식, 총알 상처, 절개, 하퇴부 궤양, 욕창성 궤양, 화상 흉터, 긁힌 상처, 화상 입은 피부, 상처난 피부, 욕창성 흉터, 자상, 이식, 정맥 궤양, 또는 수술 또는 성형 수술과 관련된 상처와 같은 상처를 지칭한다.
II. 생체 적합성 조성물 및 생체 적합성 조성물의 제조 방법
배양된 세포(예를 들어, 섬유모세포 및 골모세포 둘 모두)로부터 조건화된 세포 배지가 주입된 중합체 매트릭스(예를 들어, 아가로스)로 이루어진 생체 적합성 조성물이 본원에서 제공된다. 예를 들어, 섬유모세포로부터 조건화된 세포 배지의, 골모세포와 비교한 비율은 5%:95%, 10%:90%, 15%:85%, 20%:80%, 25%:75%, 30%:70%, 35%:65%, 40%:60%, 45%:55%, 50%:50%, 55%:45%, 60%:40%, 65%:35%, 70%:30%, 75%:25%, 80%:20%, 85%:15%, 90%:10%, 95%:5%, 또는 그 초과, 또는 상기 비율 사이의 임의의 범위, 예컨대 40%:60% 내지 60%:40%일 수 있다. 배양된 작용제를 함유하는 조건화된 세포 배지는 염증, 증식 및 성숙 단계를 포함하는 재생 과정을 자극하기 위한 세포 증식 동안 방출되는 성장 인자의 불균일 조성물을 나타낸다. 이와 함께, 활발히 증식하는 세포(예를 들어, 섬유모세포 및 골모세포)로부터 조건화된 배지로 분비된 성장 인자는 치주, 뼈 및 피부 재생 및 재구성과 같은 재생 용도에 필요한 성장 인자 및 단백질의 완전한 혼합물을 나타낸다. 중합체 매트릭스(예를 들어, 아가로스)의 사용은 성장 인자의 외상 부위에 대한 노출을 증가시켜 궁극적으로 세포 증식을 증가시키는, 성장 인자의 지속 방출을 위한 저장소로서 작용한다.
본 발명은 또한 배양된 세포에 의해 생성된 하나 이상의 배양된 작용제를 함유하는 조건화된 세포 배지를 함유하는 조성물 또는 제제의 제조 방법을 제공한다. 이 방법은 세포가 하나 이상의 사이토카인, 성장 인자 및/또는 단백질을 합성하고 이를 배지 내로 분비하도록 세포, 예를 들어 섬유모세포 및/또는 골모세포를 배양하는 단계를 포함한다. 이제 하나 이상의 배양된 작용제를 함유하는 생성된 조건화된 세포 배지를 배양된 세포로부터 분리하고, 중합체 매트릭스와 조합하여 생체 적합성 조성물을 형성한다.
A. 조건화된 세포 배지
"조건화된 세포 배지" 또는 "조건화된 배지"라는 용어는 영양소, 비타민, 호르몬 및 무기 화합물 및 염의 공급원으로서 세포 배양물의 세포에 의해 사용되고, 세포 배양물과 접촉함으로써 세포에 의해 합성되고 배지 내로 분비된 세포 생성물, 또는 "배양된 작용제", 예를 들어 사이토카인, 단백질, 세포외 기질 성분 또는 이들의 임의의 조합이 첨가된 세포 배양 배지를 지칭한다. 조건화는 배지를 조건화하기 위해 일정 시간 동안, 바람직하게는 6시간 내지 3일, 보다 바람직하게는 약 12시간 내지 2일, 예컨대 적어도 약 6시간, 적어도 약 8시간, 적어도 약 10시간, 적어도 약 12시간, 적어도 약 14시간, 적어도 약 16시간, 적어도 약 12시간, 적어도 약 14시간, 적어도 약 16시간, 적어도 약 18시간, 적어도 약 20시간, 적어도 약 22시간, 적어도 약 24시간, 적어도 약 30시간, 적어도 약 36시간, 적어도 약 42시간, 적어도 약 48시간, 적어도 약 54시간, 적어도 약 60시간, 적어도 약 66시간, 적어도 약 72시간, 적어도 약 3일, 적어도 약 4일, 적어도 약 5일, 적어도 약 6일, 적어도 약 7일, 적어도 약 2주, 또는 그 사이의 임의의 범위, 예컨대 24시간 내지 3일 동안 세포와 배지 사이의 접촉, 노출, 교환 및 상호작용시에 세포의 사이토카인, 단백질 및 세포외 기질 성분의 합성 및 신선한 배지로의 분비 작용이다. 조건화된 세포 배지는 배양된 세포를 함유하는 배양 장치로부터 제거되고, 이의 배양된 작용제의 정제를 위해 수집되거나, 또는 본원에서 설명되는 다양한 재생 과정에 사용하기 위한 약학, 미용 또는 상처 치유 조성물로서, 또는 시험관 내 세포 배양에 사용하기 위해 그 전체가 또는 부분적으로 사용된다.
사이토카인은 분화, 증식, 분비 또는 이동성과 같은 세포의 기능 또는 활성에 변화를 주는 단백질이다. 성장 인자는 또한 세포 성장, 증식, 운동성 또는 다른 관련된 세포 사건을 촉진하거나 억제하는 기능 또는 활성의 변화를 일으키는 단백질인 사이토카인의 하위세트이다. 케모카인은 T 세포, B 세포 및 다른 케모카인 반응성 세포를 체내의 특정 조직으로 유인 및 안내하는 사이토카인의 또 다른 하위세트이다. 림포카인은 면역 반응에 관여하는 사이토카인의 또 다른 하위세트이다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "사이토카인"은 성장 인자, 케모카인 및 림포카인을 포함하는 사이토카인을 포함하고, 이들의 정상적인 구조 및 기능에 제한되지 않고, 자연 발생 변이체 및 하이브리드도 포함할 수 있다. 본 발명의 배양된 작용제는 사이토카인, 성장 인자 및 단백질을 포함할 수 있다.
이들의 생성 전체에 걸쳐 및 완전히 형성될 때, 배양된 세포는 다양한 사이토카인 및 다른 물질을 배양된 세포를 담고 있는 배지 내로 분비하는 살아있는 세포를 함유한다. 배양된 세포는 전형적으로 섬유모세포 및 골모세포로 이루어지지만, 임의의 다양한 세포를 포함할 수 있다. 세포를 생성하고 배양하는 과정에서, 섬유모세포 및 골모세포는 천연 조직 및/또는 또는 뼈(예를 들어, 치주 조직 및 뼈)에서 발생하는 것과 유사한 세포-세포 및 세포-기질 상호작용을 위한 조직 유사 환경, 즉 세포외 기질을 포함하는 조직화된 공동 배양물을 제공할 수 있다. 발달하는 세포 배양에서의 이러한 상호 작용은 세포내 기질 발달, 기저막 생성 및 세포 증식 및 분화의 기능을 수행하도록 배양물 내의 다른 세포를 유도하기 위해 사이토카인 발현 및 배지로의 분비의 광범위한 프로파일을 허용한다.
조건화된 배지는 세포 성장, 세포 분열 및 혈관신생에 중요한 공지된 혈소판 유래 성장 인자(PDGF)를 포함하는 성장 인자를 포함할 수 있다. 재조합 PDGF는 현재 뼈 복구 및 재생을 위해 FDA 승인을 받았다. 다른 성장 인자는 표피 성장 인자(EGF), 섬유모세포 성장 인자(FGF), 염기성 섬유모세포 성장 인자(bFGF) 및 혈관 내피 성장 인자(VEGF)를 포함하지만, 이로 제한되지 않고, 이들은 모두 혈관신생, 콜라겐 침착, 과립화 조직 형성 및 상피화를 수반하는 증식 단계(새로운 조직의 성장)에 기여한다. 증식성 골모세포로부터 조건화된 배지는 상기 설명한 바와 같이 증식성 섬유모세포로부터 유사하게 방출된 성장 인자, 및 뼈의 유기 기질을 구성하는 특유한 단백질인 오스테오칼신 및 오스테오폰틴을 포함한다. 배양된 세포에 의해 생성되는 다른 사이토카인 및 성장 인자는 각질세포 성장 인자(KGF), 전환 성장 인자 알파(TGFα), 전환 성장 인자 베타-1(TGFβ1) 및 전환 성장 인자 베타-2(TGFβ2)를 포함하는 전환 성장 인자 베타(TGFβ), 인슐린 유사 성장 인자(IGF), 신경 성장 인자(NGF) 및 간세포 성장 인자(HGF)를 포함하지만, 이로 제한되지 않는다. 추가의 성분은 생물학적 활성제, 예를 들어 인슐린, 히드로코르티손, 유로가스트론, 혈소판 유래 상처 치유 인자(PDWHF), 뇌 유래 신경 영양 인자(BDNF), 혈소판 인자 IV(PF IV), 종양 괴사 인자(TF), 과립구 콜로니 자극 인자(GCSF), 콜로니 자극 인자(CSF), 골 형태 형성 단백질(BMP), 및 성장 분하 인자(GDF)를 포함할 수 있다. 괄호 안의 상기 언급된 용어는 그 앞에 기재된 공식적인 명칭에 대해 관련 기술 분야에서 통상적으로 공지되고 사용되는 약어임에 유의하여야 한다.
인터류킨-1(IL-1), 인터류킨-6(IL-6), 인터류킨-8(IL-8), 인터류킨-11(IL-11)을 포함한 다수의 인터류킨이 또한 배양된 세포에 의해 합성될 수 있고, 이 또한 본 발명의 특징이다. 케모카인 하위 세트에서, 인터류킨은 세포 아폽토시스에 영향을 미친다. 괄호 안의 상기 언급된 용어는 그 앞에 기재된 공식적인 명칭에 대해 관련 기술 분야에서 통상적으로 공지되고 사용되는 약어임에 유의하여야 한다.
본 발명의 배양된 작용제를 포함하는 다른 사이토카인 및 성장 인자는 암피레굴린, 안지오게닌, 안지오포이에틴-2, DTK, EGF-R, ENA-78, FAS, FGF-I, FGF-2, FGF-6, FGF-7, FGF-9, FIT-3 리간드, GCP-2, GM-CSF, GRO-알파, HGF, IGF-I, IGF-2, IGFBP-2, IL-1알파, IL-1베타, L-IRA, IL-6R, 렙틴, MCP-I, MCP-2, M-CSF, 오스테오프로테그린, PIGF, RANTES, 줄기 세포 인자, TGF베타3, TIMP-I, TIMP-2, TRAIL 및 UPAR을 포함하지만, 이로 제한되지 않는다.
본 발명의 조건화된 세포 배지는 골모세포, 섬유모세포, 각질세포, 피부 섬유모세포, 표피 세포, 파골세포, 상피 세포, 내피 세포, 지방세포, 근육세포, 연골세포, 골세포, 뉴런, 성상세포, 희소돌기아교세포, 다능성 줄기 세포, 미분화 줄기 세포, 만능성 줄기 세포, 성체 줄기 세포, 간세포 및 췌장 세포, 또는 이들의 조합을 포함하지만 이로 제한되지 않는 배양된 세포에 의해 생성될 수 있다. 특정 실시양태에서, 세포는 골모세포와 섬유모세포 둘 모두의 공동 배양물로서 함께 배양된다.
본 발명에 사용하기 위한 추가의 세포 유형은 중간엽으로부터 유래될 수 있다. 특정 실시양태에서, 바람직한 세포 유형은 골모세포, 섬유모세포, 간질 세포 및 다른 지지 결합 조직 세포, 또는 가장 바람직한 실시양태에서와 같이 인간 골모세포 및 섬유모세포이다. 인간 섬유모세포 세포주는 신생아 남아 포피, 진피, 힘줄, 폐, 제대, 연골, 요도, 각막 기질, 구강 점막 및 장을 포함하지만 이로 제한되지 않는 다수의 공급원으로부터 유래될 수 있다. 인간 세포는 섬유모세포, 평활근 세포, 연골세포 및 중간엽 기원의 다른 결합 조직 세포를 포함할 수 있지만, 이에 제한될 필요는 없다. 특정 실시양태에서, 조직 구조물의 생성에 사용되는 기질 생성 세포의 기원은 본 발명의 배양 방법을 사용한 후에 세포가 유사하거나 모방해야 하는 조직 유형으로부터 유래될 수 있다. 예를 들어, 다층 시트 구조물은 섬유모세포와 함께 배양되어 살아있는 결합 조직 구조물을 형성하거나; 또는 골격근 구조물을 위해 근 모세포와 함께 배양된다. 하나 초과의 세포 유형이 조직 구조물을 생성하기 위해 사용될 수 있다. 세포 공여자는 발달 단계 및 나이가 다양할 수 있다. 세포는 배아, 신생아 또는 성인을 포함한 보다 나이가 많은 개체의 공여자 조직으로부터 유래될 수 있다. 중간엽 줄기 세포와 같은 배아 전구 세포가 본 발명에서 사용될 수 있고, 원하는 조직으로 분화하도록 유도될 수 있다.
인간 세포가 본 발명에 사용하기에 바람직하지만, 방법에 사용되는 세포는 인간 공급원으로부터의 세포로 제한되지 않는다. 말, 개, 돼지, 소, 고양이, 염소 및 양 공급원을 포함하지만 이로 제한되지 않는 다른 포유동물 종으로부터의 세포가 사용될 수 있다. 뮤린(murine) 세포, 및 설치류 공급원으로부터의 다른 세포가 또한 사용될 수 있다. 또한, 자연적으로, 화학적으로 또는 바이러스로 형질감염된 유전자 조작된 세포가 또한 본 발명에 사용될 수 있다. 하나 초과의 세포 유형을 포함하는 실시양태의 경우, 정상 및 유전자 변형 또는 형질감염된 세포의 혼합물이 사용될 수 있고, 2 이상의 종 또는 조직 공급원의 세포의 혼합물이 사용될 수 있거나, 또는 둘 모두가 사용될 수 있다.
재조합 또는 유전자 조작된 세포는 증가된 수준의 천연 세포 생성물 또는 치료제를 사용한 치료를 필요로 하는 환자를 위한 약물 전달 이식편으로서 작용하는 조직 구조물을 생성하기 위해 조직 구조물의 생산에 사용될 수 있다. 세포는 연속적인 시간 동안 또는 배양물에 존재하는 조건으로 인해 생물학적으로, 화학적으로 또는 열적으로 신호전달될 때 필요에 따라 재조합 세포 생성물, 성장 인자, 호르몬, 펩티드 또는 단백질을 생산할 수 있다. 세포는 또한 '정상'이지만 높은 수준으로 발현되거나 또는 상처 치유 개선, 혈관신생의 촉진 또는 유도를 비롯하여 재생 용도를 위해 치료상 유리한 세포 생성물을 만들기 위해 일부 방식으로 변형된 사이토카인, 성장 인자, 단백질 또는 세포외 기질 성분의 다른 유형을 발현하도록 유전자 조작될 수 있다. 이들 절차는 일반적으로 관련 기술 분야에 공지되어 있으며, 본원에 참조로 포함된 문헌 [Sambrook et al, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY (1989)]에 기재되어 있다. 상기 언급된 모든 유형의 세포는 사이토카인 및/또는 성장 인자와 같은 작용제를 함유하는 조건화된 배지를 합성할 배양된 세포의 생산을 위해 본 발명에 따라 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 배양된 세포 내의 세포는 관심 있는 정상 뼈, 피부 또는 조직에서 발견되는 것과 유사한 배열 및 조성으로 세포를 지지하는 스캐폴드에서 배양된다.
세포 수, 세포 배양 배지의 농도 및 세포 배양 기질 부피는 세포의 증식을 최적화하기 위해 관련 기술 분야에 공지된 방법에 따라 조절될 수 있다. 배양은 또한 세포의 배양을 위해 제어된 온도, 습도 및 가스 혼합물의 충분한 환경 조건을 보장하기 위해 인큐베이터에서 유지될 수 있다. 바람직한 조건은 약 5-10 + 1% CO2의 분위기 및 약 80-90%의 상대 습도(Rh)를 갖는 약 34℃ 내지 약 38℃, 더욱 바람직하게는 37 ± 1℃이다.
배양된 세포는 배지로부터 성분을 대사하고 사이토카인, 성장 인자 및 다른 단백질을 배지 내로 분비할 때 세포에 의해 조건화되는 배양 배지를 접촉시킴으로써 영양이 공급된다. 규정 배지는 화학적으로 규정된 성분을 함유하고 비규정된 동물 장기 또는 조직 추출물, 예를 들어 혈청, 뇌하수체 추출물, 시상하부 추출물, 태반 추출물 또는 배아 추출물 또는 피더 세포에 의해 분비되는 단백질 및 인자가 없는 세포 배양에 사용하기 위한 배양 배지를 의미한다. 일부 실시양태에서, 세포 배양 배지에는 비규정된 성분 및 비인간 공급원으로부터 유래된 규정된 생물학적 성분이 존재하지 않을 수 있다. 비규정된 성분을 첨가하는 것은 바람직하지 않지만, 이들은 조건화된 배지를 생성하기 위해 배양물에 임의의 시점에서 개시된 방법에 따라 사용될 수 있다. 비인간 유래 생물학적 성분이 아닌 성분으로부터 유래된 화학적으로 규정된 성분을 사용하여 배양된 스크리닝된 인간 세포를 이용하여 본 발명을 수행하는 경우, 생성된 조직 구조물은 규정된 인간 뼈, 조직 또는 피부 구조물이다. 본 발명의 조건화된 배지를 생성하기 위해 이러한 구성물을 사용하는 이점은 우발적인 동물 또는 종간 바이러스 오염 및 감염이 조직 구성물 또는 조건화된 배지에 존재할 수 있다는 우려를 제거하는 것이다.
신선하고 미사용된 배양 배지는 다른 성분으로 추가로 보충될 수 있는 영양소를 포함한다. 통상의 기술자는 포유동물 세포 배양 분야에서 적절한 영양소를 결정할 수 있다. 예를 들어, 많은 상업적으로 이용 가능한 영양 공급원이 본 발명의 실시에 유용하다. 여기에는 무기 염, 에너지원, 아미노산 및 B 비타민을 공급하는 시판되는 영양 공급원, 예컨대 둘베코 변형 이글 배지(DMEM); 최소 필수 배지(MEM); M 199; RPMI 1640; 이스코브 변형 둘베코 배지(EDMEM: Iscove's Modified Dulbecco's Medium)가 포함된다. 최소 필수 배지(MEM) 및 M199는 인지질 전구체 및 비필수 아미노산으로 추가로 보충하는 것을 필요로 한다. 추가의 아미노산, 핵산, 효소 보조 인자, 인지질 전구체 및 무기 염을 공급하는 시판되는 비타민 풍부 혼합물에는 햄(Ham) F-12, 햄 F-10, NCTC 109 및 NCTC 135가 포함된다. 농도는 다양하지만, 모든 기본 배지는 세포에 대한 기본 영양 공급원을 글루코스, 아미노산, 비타민 및 무기 이온 형태로 다른 기본 배지 성분과 함께 제공한다.
기본 배지에는 아미노산, 성장 인자 및 호르몬과 같은 성분이 보충될 수 있다. 본 발명의 세포의 배양을 위한 규정된 배양 배지는 그 개시내용이 본원에 참조로 포함된 미국 특허 제5,712,163호(Pareauto) 및 국제 PCT 출원 공개 W095/31473에 기재되어 있다. 문헌 [Ham and McKeehan, Methods in Enzymology (1979) 58:44-93]에 개시된 배지, 또는 문헌 [Bottenstein et al. Methods in Enzymology (1979) 58:94-109]에 기재된 다른 적절한 화학적으로 규정된 배지와 다른 배지가 관련 기술 분야에 알려져 있다. 일반적인 대표적인 보충제가 아래에서 설명된다.
예를 들어, 인슐린은 여러 계대배양에 걸쳐 장기적인 이점을 제공하기 위해 글루코스 및 아미노산의 흡수를 촉진하는 폴리펩티드 호르몬이다. 글루코스 및 아미노산을 흡수하는 세포의 능력이 결과적으로 고갈되고 세포 표현형이 분해될 수 있기 때문에, 인슐린 또는 인슐린 유사 성장 인자(IGF)의 보충은 장기간의 배양에 필요하다. 인슐린 보충은 연속 배양을 위해 권장되며, 바람직하게는 약 0.5 μg/ml 내지 약 50 μg/ml, 보다 바람직하게는 약 5 μg/ml의 농도 범위에서 배지에 제공될 수 있다. IGF-I 또는 IGF-2와 같은 인슐린 유사 성장 인자의 보충을 위한 적절한 농도는 배양을 위해 선택된 세포 유형에 대해 관련 기술 분야의 통상의 기술자에 의해 쉽게 결정될 수 있다.
트랜스페린은 철 수송 조절을 위해 배지에 존재한다. 철은 혈청에서 발견되는 필수 미량 원소이다. 철은 그의 유리된 형태로 세포에 유독할 수 있기 때문에, 철은 혈청에서 바람직하게는 약 0.05 내지 약 50 μg/ml, 보다 바람직하게는 약 5 μg/ml의 농도의 트랜스페린에 결합된 세포에 공급될 수 있다.
트리요오도티로닌(T3)은 기본 성분이며, 세포 대사율을 유지하기 위해 배지에 포함되는 갑상선 호르몬의 활성 형태이다. 트리요오도티로닌은 약 0 내지 약 400 pM, 보다 바람직하게는 약 2 내지 약 200 pM, 가장 바람직하게는 약 20 pM의 농도로 배지에 보충될 수 있다.
인지질인 에탄올아민 및 o-포스포릴-에탄올아민 중 하나 또는 둘 모두가 이노시톨 경로 및 지방산 대사에서 전구체로서 첨가될 수 있다. 혈청에서 일반적으로 발견되는 지질의 보충은 무혈청 배지에 필요하다. 에탄올아민 및 o-포스포릴-에탄올아민은 약 10-6 내지 약 10-2 M, 보다 바람직하게는 약 1 x 10-4 M의 농도 범위에서 배지에 제공될 수 있다.
정상적으로는 혈청에 의해 제공되는 셀레늄의 미량 원소를 재보충하기 위해 무혈청 배지에 셀레늄을 첨가할 수 있다. 셀레늄은 약 10-9 내지 약 10-7 M, 가장 바람직하게는 약 5.3 x 10-8 M의 농도 범위로 제공될 수 있다.
아미노산 L-글루타민은 일부 영양소에 존재하며, 존재하지 않거나 불충분한 양으로 존재하는 경우에 첨가될 수 있다. L-글루타민은 또한 글루타맥스(GlutaMAX)-1™(Gibco BRL, 미국 뉴욕주 그랜드 아일랜드 소재)으로 판매되는 것과 같은 안정한 형태로 제공될 수 있다. 글루타맥스-1™은 L-알라닐-L-글루타민의 안정한 디펩티드 형태이며, L-글루타민과 교환 가능하게 사용될 수 있으며, L-글루타민의 대체물로서 등몰 농도로 제공된다. 디펩티드는 보관 시간에 걸쳐 및 인큐베이팅 동안, 배지에서 L-글루타민의 유효 농도의 불확실성을 초래할 수 있는 분해에 대한 안정성을 L-글루타민에 제공한다. 전형적으로, 기본 배지에는 바람직하게는 약 1 mM 내지 약 6 mM, 보다 바람직하게는 약 2 mM 내지 약 5 mM, 가장 바람직하게는 4 mM의 L-글루타민 또는 글루타맥스-1™이 보충된다.
표피 성장 인자(EGF)와 같은 성장 인자 및 bFGF와 같이 본원에서 설명되는 다른 성장 인자가 또한 세포 규모 확대 및 씨딩을 통한 배양의 확립을 돕기 위해 배지에 첨가될 수 있다. 예를 들어, 천연 형태 또는 재조합 형태의 EGF가 사용될 수 있다. 비인간 생물학적 성분을 함유하지 않는 피부 동등물을 제조할 때, EGF의 인간 형태, 천연 또는 재조합체가 배지에 사용하기에 바람직하다. EGF 및/또는 다른 성장 인자는 약 1 내지 약 15 ng/mL, 보다 바람직하게는 약 5 내지 약 10 ng/mL의 농도로 제공될 수 있다.
세포 배양 배지는 전형적으로 하기 실시예에서 제시되는 바와 같이 제조된다. 그러나, 본 발명의 성분은 그의 물리적 특성에 적합한 종래의 방법을 사용하여 제조되고 조립될 수 있음을 이해하여야 한다. 가용성 또는 경제성을 위해 특정 성분들을 적절한 유사체 또는 기능적으로 동등한 작용제로 대체하고 유사한 결과에 도달하는 것이 관련 기술 분야에 잘 알려져 있다. 자연 생성 성장 인자는 본 발명의 수행을 위해 사용될 때 유사한 특성 및 결과를 갖는 재조합 또는 합성 성장 인자로 대체될 수 있다.
본 발명에 따른 세포 배양 배지는 멸균된다. 멸균 성분은 구입하거나 또는 제조 후 여과와 같은 통상적인 절차에 의해 멸균된다. 적절한 무균 절차가 하기 실시예 전체에 걸쳐 사용되었다. 예를 들어, DMEM을 수득한 후, 다른 성분이 추가되어 배지를 완성한다. 4℃에서 보관될 수 있는 영양소를 제외하고 모든 성분의 원액 용액을 -20℃에서 보관할 수 있다. 모든 용액은 원액으로 준비할 수 있다.
신선한 배지를 배양물에 공급하는 방식은 배지를 배양 장치 내로 피펫팅, 디캔팅 또는 펌핑함으로써 수행된다. 배지의 조건화는 배지를 배양된 세포와 충분한 시간 동안, 일반적으로 세포가 신선한 배지로부터 영양소 등을 흡수하거나 섭취하여 사이토카인, 성장 인자 및/또는 단백질을 배지 내로 분비할 수 있도록 약 6시간 내지 3일 또는 그 초과의 시간 동안 접촉시킴으로써 이루어진다. 배양된 세포는 일정한 대사 상태에 있기 때문에, 배지를 조건화하는 데 단지 짧은 시간만이 필요하다. 영양소가 신선한 배지로부터 거의 고갈될 때까지 구조물과 배지가 교환을 위해 서로 접촉하는 것이 바람직하다.
조건화된 배지는 조건화된 배지를 신선한 배지로 교체할 때마다 피펫팅, 흡인, 디캔팅, 배수, 사이퍼닝(siphoning) 또는 펌핑에 의해 배양물로부터 제거 및 수집된다. 조건화된 배지 수집물을 개별 수집물로서 개별적으로 사용하거나 또는 함께 모을 수 있다. 배양된 뼈, 조직 또는 피부 구조물의 발달은 각각의 수집 지점에서 다양한 조건화된 프로파일을 갖는 조건화된 배지를 생성하는 다수의 사건으로 표시된다. 별개의 수집물로서, 조건화된 배지는 특정 치료 적응증 또는 제품에 바람직할 수 있는 특정 분비 인자를 가질 것이다. 수집물을 함께 모아 조합하면, 조건화된 배지는 치료제 또는 제품에 대한 매우 광범한 분비 인자를 가질 것이다.
일단 수집되면, 조건화된 배지는 수집된 그대로 사용되거나, 또는 사용 전에 정제 또는 적용 또는 보관의 용이성을 위해 추가의 처리가 배지에 대해 수행된다. 조건화된 배지는 동결 건조되거나 증발되어 조성물의 액체 또는 물 부분을 제거할 수 있다. 물을 제거하면, 배양된 작용제, 즉 성장 인자, 사이토카인, 단백질 및 세포외 기질 성분을 감소된 부피로 함유하는 조건화된 배지의 결정성 분말 형태가 수득된다. 이 형태는 제제를 희석하지 않고 고용량의 배양된 작용제를 함유하는 제품을 보다 쉽게 제조할 수 있게 하고, 따라서 부피 감소로 인해 보관이 보다 용이해진다.
조건화된 배지는 또한 여과 방법, 특히 분자량 컷오프 또는 일련의 분자량 필터를 사용하는 방법을 사용하여 농축될 수 있다. 분자량 필터의 사용은 알부민과 같은 배지에서 발견되는 큰 성분, 혈청, 세포 및 세포 잔해에서 발견되는 분자량이 큰 특정 성분을 제거한다. 필요하지는 않지만, 더 작은 공극 필터로 여과하기 전에 상기 더 큰 성분을 제거하기 위해 조건화된 배지를 사전 여과하여 후속적으로 사용되는 임의의 필터의 막힘 및 여과 용량의 감소를 방지할 수 있다. 세포 생성물 조성물로부터 염을 제거하기 위해 다른 여과 및 투석 방법이 사용될 수 있다. 예를 들어, 접선 유동 여과를 사용하여 조건화된 배지에서 배양 작용제의 농도를 증가시킬 수 있다. 또한, 접선 유동 여과는 조건화된 배지에서 염 농도를 감소시키기 위해 사용될 수 있다. 염의 농도를 감소시키기 위해, 조건화된 배지의 수성 성분이 제거됨에 따라 수성 성분은 물로 대체된다. 실제로, 배양된 작용제의 농축 및 염 농도의 감소는 배양된 작용제에서 염이 효과적으로 세정되도록 적어도 1회 반복될 수 있다. 배양된 작용제는 추가로 정제, 단편화 또는 접합되어 순수한 사이토카인, 단백질 또는 세포외 기질 조성물을 형성하거나, 특정 조직, 조직 구조 또는 세포 유형으로의 전달을 위해 향상될 수 있다. 배양된 작용제의 정제되고 감소된 염의 측면은 이들을 본 발명의 국소 제제의 제제화에 보다 적합하게 만들고, 따라서 상기 제제화에 바람직하다.
배양된 세포 단독에 의해 생성된 분비된 작용제, 예를 들어 사이토카인 및/또는 성장 인자를 함유하는 조건화된 배지는 세포 배양에 유용하거나, 본원에서 추가로 설명되는 중합체 매트릭스와 조합될 수 있다. 조건화된 배지는 세포 증식 및 활력적인 새로운 뼈 및/또는 잇몸 조직의 생성을 증가시키고 줄기 및 전구 세포의 증식 및 분화, 및 중간엽 분화(예를 들어 중간엽 세포의 골 세포로의 분화)를 조절함으로써 세포주를 성장시키고 유지하는데 사용될 수 있다. 조건화된 배지는 또한 특정 층 또는 방향으로 세포 성장을 억제하거나 자극하기 위한 다른 조직 구성물을 제조하는데 사용된다. 조건화된 배지의 효과는 농도에 의존적이어서, 보다 높은 농도가 보다 낮은 농도보다 더 큰 효과를 생성하는 것으로 생각된다.
B. 중합체 매트릭스
상기한 바와 같이, 본 발명의 생체 적합성 조성물은 배양된 세포로부터 조건화된 세포 배지가 주입된 중합체 매트릭스를 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 중합체 매트릭스는 생분해성일 수 있다. 특정 실시양태에서, 중합체 매트릭스는 폴리사카라이드를 포함할 수 있다. 수성상 증점제로서 다양한 폴리사카라이드가 적합할 수 있다. 이러한 폴리사카라이드의 예는 아가, 아가로스, 알리칼리겐 폴리사카라이드, 알긴, 알긴산, 아카시아 검, 아밀로펙틴, 키틴, 덱스트란, 카시아 검, 셀룰로오스 검, 젤라틴, 젤란 검, 히알루론산, 히드록시에틸 셀룰로오스, 메틸 셀룰로오스, 에틸 셀룰로오스, 펙틴, 스클레로티움 검(sclerotium gum), 잔탄 검, 펙틴, 트레헬로스, 젤라틴 등과 같은 천연 유래 물질을 포함한다. 특정 실시양태에서, 아가로스는 해초 또는 식물성 추출물로부터 추출된 폴리사카라이드 중합체 매트릭스를 포함할 수 있다. 추출물은 전체 조성물의 약 0.0001 내지 10 중량%, 바람직하게는 약 0.0005 내지 8 중량%, 더욱 바람직하게는 약 0.001 내지 5 중량%로 생체 적합성 조성물에 제공될 수 있다. 적합한 식물성 추출물은 효모 발효 추출물, 테르무스 테르모필리스(thermus thermophilis) 발효 추출물, 카멜리나 사티바(camelina sativa) 종자 오일, 보스웰리아 세라타(boswellia serrata) 추출물, 올리브 추출물, 아리보돕시스 탈리아나(aribodopsis thaliana) 추출물, 아카시아 데알바타(acacia dealbata) 추출물, 아케르 사카리눔(acer saccharinum)(사탕 단풍나무), 아시도폴루스(acidopholus), 창포, 칠엽수(aesculus), 아가리쿠스(agaricus), 용설란, 아그리모니아(agrimonia), 조류, 알로에, 감귤류, 브라시카(brassica), 계피, 오렌지, 사과, 블루베리, 크랜베리, 복숭아, 배, 레몬, 라임, 완두콩, 해초, 카페인, 녹차, 카모마일, 버드나무 껍질, 뽕나무, 양귀비, 및 문헌 [CTFA Cosmetic Ingredient Handbook, Eighth Edition, Volume 2]의 1646 내지 1660에 제시된 것을 비롯하여 식물(허브, 뿌리, 꽃, 과일, 종자), 예컨대 꽃, 과일, 채소 등으로부터의 추출물을 포함한다. 추가의 구체적인 예는 글리시리자 글라브라(Glycyrrhiza Glabra), 살릭스 니그라(Salix Nigra), 마크로식스티스 피리페라(Macrocycstis Pyrifera), 피루스 말루스(Pyrus Malus), 삭시프라가 사르멘토사(Saxifraga Sarmentosa), 빌리스 비니페라( Vilis Vinifera), 모루스 니그라( Morus Nigra), 스쿠텔라리아 바이칼렌시스( Scutellaria Baicalensis), 안테미스 노빌리스(Anthemis Nobilis), 살비아 셀라레아(Salvia Selarea), 로스마리누스 오피시아날리스( Rosmarinus Officianalis), 시트루스 메디카 리모눔(Citrus Medica Limonum), 파낙스 긴셍( Panax Ginseng) 및 이들의 혼합물을 포함하지만 이로 제한되지 않는다.
특정 실시양태에서, 생체 적합성 조성물은 하나 이상의 활성 성분의 국소 제어 방출을 제공하도록 제제화된다. 국소 투여에 적합한 임의의 약제학상 허용되는 담체 비히클 또는 제제가 사용될 수 있다. 관련 기술 분야에 공지된 서방형 제제는 코팅된 펠렛, 중합체 제제(예를 들어, 소포 또는 리포솜) 및 미세 입자(예를 들어, 미소구 또는 마이크로캡슐)을 포함하지만, 이로 제한되지 않는다.
제어된 방출을 제공하기 위해 매우 다양한 생분해성 물질이 사용될 수 있다. 제어 방출 물질은 생체 적합성이어야 하고, 안전하고 약제학적으로 허용되는 방식으로 계내에서 분해, 용해 또는 흡수되어 물질이 천연 조직 과정에 의해 투여 부위로부터 적절한 시간(예를 들어, 1년 미만, 6개월 미만, 1개월 미만, 1주일 미만, 1일 미만 또는 몇 시간 미만) 내에 제거된다. 제어 방출 담체는 원치 않는 국소 조직 반응을 일으키거나 전신 또는 국소 독성을 유발하지 않아야 한다.
본 발명의 생체 적합성 조성물에 사용하기 적합한 제어 방출 생분해성 중합체는 폴리락티드, 폴리글리콜리드, 폴리(락티드-co-글리콜리드), 폴리무수물, 폴리오르토에스테르, 폴리카프로락톤, 폴리사카라이드, 폴리포스파젠, 단백질성 중합체 및 이들의 가용성 유도체(예를 들어, 겔화 생분해성 합성 폴리펩티드, 알킬화 콜라겐 및 알킬화 엘라스틴), 폴리사카라이드, 폴리펩티드, 폴리에스테르 및 폴리오르토에스테르의 가용성 유도체를 포함할 수 있다.
특정 실시양태에서, 세포외 기질 단백질은 생체 적합성 스캐폴드를 생성하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 콜라겐은 생분해성 스캐폴드로서 사용하기 위한 일반적인 조성물이다. 콜라겐은 생체 적합성 조성물에 사용하기 위한 가장 바람직한 세포외 기질 조성물이지만, 다른 세포외 기질, 예컨대 콜라겐 패밀리로부터의 섬유상 및 비섬유상 콜라겐인 다른 콜라겐, 예컨대 콜라겐 유형 II, III, IV, V, VI5 VII, VIII5 IX, X5 XI, XII5 XIII, XTV, XV, XVI, XVII, XVIII, XIX5, 또는 엘라스틴, 프로테오글리칸, 예컨대 데코린 또는 비글리칸, 또는 당단백질, 예컨대 테나신, 비트로넥틴, 피브로넥틴, 라미닌, 트롬보스폰딘 I 및 글리코사미노글리칸(GAG), 예컨대 히알루론산(HA)을 포함할 수 있지만 이로 제한되지 않는 다른 기질 단백질이 사용될 수 있다. 진피 기질은 조성 및 구조에서 다양할 수 있다. 콜라겐 스펀지, 생체 적합성, 생분해성, 탈세포화된 진피 또는 콜라겐 겔은 진피 세포에 세포외 기질 성분을 제공하기 보다는, 생분해성 메쉬 부재(예를 들어, 나일론 또는 폴리갈락틴(PGA)) 상에서 배양되어 배양 지지체를 제공하고, 세포 및 그들의 기질이 지지체를 둘러쌀 때까지 세포외 기질을 생성하도록 배양될 수 있다. 특정 실시양태에서, 본원에 참고로 인용된 벨(Bell)의 미국 특허 제4,485,096호에 기재된 것과 같은 콜라겐 겔이 사용될 수 있다. 수축된 콜라겐 겔은 다공성 막상의 다량의 무세포 콜라겐 층 상에 배치되어, 겔을 막에 고정하고 겔의 과도한 방사상 수축을 방지할 수 있다. 다량의 무세포 콜라겐 층을 혼입시키는 방법은 켐프(Kemp) 등의 미국 특허 제5,536,656호, 문헌 [Wilkins, L.M., et al. Biotechnology and Bioengineering (1994) 43:747-756], 및 [Parenteau, N.L. Skin equivalents. In: T. Leigh and F. Watt (eds.), The Keratinocyte Handbook Cambridge University Press, London (1994)]에 기재되어 있고, 이들 문헌의 개시 내용은 본원에 참조로 포함된다. 조직 등가물 및 무세포 수화 콜라겐 겔은 래트 꼬리 힘줄, 송아지 피부 콜라겐 및 송아지 신근 힘줄을 포함하는 피부 및 힘줄로부터 유래된 콜라겐을 사용하여 제조될 수 있다. 다른 콜라겐 공급원이 적합할 것이다. 송아지 공통 발가락 신근 힘줄로부터 유래된 콜라겐 조성물 및 상기 콜라겐 조성물을 유도하는 방법은 켐프의 미국 특허 제5,106,949호에 개시되어 있으며, 이의 개시내용은 본원에 참고로 포함된다.
특정 실시양태에서, 중합체 매트릭스는 아가로스 또는 아가로스 유사 물질을 포함할 수 있다. 아가로스는 몇 가지 이점을 제공한다. 첫째, 아가로스는 모두 천연 물질이고, 일반적으로 해초로부터 유래한다. 비교적 간단한 디사카라이드 반복체로 이루어진 아가로스는 화학적 및 열적 안정성을 제공하고, 따라서 아가로스는 결합 또는 그의 구조 변경의 측면에서 성장 인자 및 단백질과의 임의의 상호작용을 최소화하여 그의 생물학적 활성을 보존하면서 상기 성장 인자 및 단백질의 물리적 저장소로서 기능하는 겔 유사 일관성을 실온에서 유지할 수 있다. 이것은 치주 재생 및 골 성장의 생물학적 과정에 관여하는 성장 인자 및 단백질의 즉각적이고 지속적인 수동 분비를 가능하게 한다. 시간이 지남에 따라, 매트릭스는 용해되고, 흡수될 것이다.
둘째로, 수성 상으로부터 반고체 젤라틴 상으로 전이될 때, 아가로스는 미리 주입된 성장 인자 및 사이토카인이 아가로스 밖으로 수동적으로 확산되어 세포 증식을 자극하고 또한 대사 부산물이 매트릭스의 한 쪽을 가로질러 다른 쪽으로 이동하여 복구 및 성장을 향상시켜 세포가 파라크린과 유사한 효과를 발휘하도록 하는 채널의 네트워크를 형성하는 3차원 메쉬 네트워크를 형성한다.
특정 실시양태에서, 저 융점 아가로스는 그의 화학적 및 열적 안정성 및 단백질의 상호작용(결합 또는 변경)에 대한 그의 불활성으로 인해 바람직한 매트릭스이다. 젤라틴 상태로 냉각될 때, 아가로스 겔은 치주 및 골 재생과 관련된 성장 인자의 즉각적이고 연속적인 방출을 유도하는, 각각의 성장 인자에 대한 물리적 저장소를 나타낸다. 또한, 아가로스 중합체 사슬은 성장 인자 및 다른 자연 발생 사이토카인의 수동 확산을 허용하는 채널의 3차원 메쉬 네트워크를 형성하여, 세포 수준에서의 증식 및 분화에 필요한 세포 대 세포 상호작용의 파라크린 유사 효과를 증대시켜 치주 성장 및 새로운 뼈 형태 형성으로 제시되는 표현형 변화를 야기한다.
특정 실시양태에서, 아가로스는 저 융점 아가로스 또는 심지어 초저 융점 아가로스(론자(Lonza)의 SeaPrep™ 아가로스)일 수 있다. 용어 "저 융점 아가로스"는 일반적으로 약 65℃ 이상의 온도에서 유체로 녹는 아가로스를 지칭한다(예를 들어, UltraPure™ 저 융점 아가로스, ThermoFisher Scientific 참조). 용어 "초저 융점 아가로스"는 일반적으로 약 40-50℃ 이상의 온도에서 유체로 녹는 아가로스를 지칭한다(예를 들어, Agarose A5030, 시그마-알드리치(Sigma-Aldrich) 및 SeaPrep® Agarose, 론자). 이러한 아가로스 조성물은 0.8% 중량 대 부피(w:v), 약 0.9% w:v, 약 1.0% w:v, 약 1.1% w:v, 약 1.2% w:v, 약 1.3% w:v, 약 1.4% w:v, 약 1.5% w:v, 약 1.6% w:v, 약 1.7% w:v, 약 1.8% w:v, 약 1.9% w:v, 약 2.0% w:v, 약 2.1% w:v, 약 2.2% w:v, 약 2.3% w:v, 약 2.4% w:v, 약 2.5% w:v, 약 2.6% w:v, 약 2.7% w:v, 약 2.8% w:v, 약 2.9% w:v, 약 3.0% w:v, 약 3.1% w:v, 약 3.2% w:v, 약 3.3% w:v, 약 3.4% w:v, 약 3.5% w:v, 또는 그 사이의 임의의 범위, 예컨대 약 0.8% w:v 내지 약 3.0% w:v의 농도일 수 있다. 예를 들어, 한 실시양태에서, 아가로스는 분말 형태를 따뜻한 젤라틴 상태로 완전히 용해시키기 위해 최종 1% w:v 농도를 만드는 데 필요한 총 부피의 1/2을 나타내는 부피에 초기에 용해될 수 있다. 혼합물을 37℃ 미만으로 냉각한 후, 나머지 1/2 부피의 조건화된 배양 배지, 예컨대 조건화된 섬유모세포와 골모세포의 50:50 혼합물을 첨가하고 완전히 혼합하여 모든 성분을 완전히 포함시킬 수 있다. 조건화된 섬유모세포/골모세포 배지에 용해된 1% w:v 초저 융점 아가로스의 매트릭스를 추가 사용시까지 아가로스의 중합화를 돕기 위해 4℃로 냉각할 수 있다.
생체 적합성 스캐폴드의 약동학적 방출 프로파일은 원하는 시간에 걸쳐 원하는 치료 효과를 제공하기 위해 1차, 0차, 2상 또는 다중상일 수 있다. 조성물의 성분(들)의 상이한 방출 속도 및/또는 상이한 로딩 백분율을 갖는 중합체의 혼합물을 사용함으로써 바람직한 방출 프로파일을 달성할 수 있다. 코팅된 펠렛, 리포솜, 미소구 및 마이크로캡슐의 제조 방법은 관련 기술 분야에 잘 알려져있다.
본 발명의 생체 적합성 조성물이 형성되면, 조건화된 세포 배지는 총 생체 적합성 조성물의 약 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99%, 또는 그 초과의 중량, 부피, 중량 대 부피 및/또는 중량 대 중량일 수 있다.
III. 생체 적합성 조성물 용도 및 방법
생체 적합성 조성물은 대상체에서 골을 성장시키거나 또는 골 흡수를 억제하는 방법에 사용될 수 있고, 상기 방법은 유효량의 본 발명의 생체 적합성 조성물을 골 성장 및/또는 골 흡수 억제를 필요로 하는 부위에 투여하는 단계를 포함한다. 상기 대상체는 골절, 골 결핍, 전이성 골 질환, 골관절염, 골다공증 및/또는 골용해성 골 질환을 가질 수 있다. 이와 유사하게, 생체 적합성 조성물은 대상체에서 치주 병태를 치료하는 방법에 사용될 수 있으며, 상기 방법은 유효량의 본 발명의 생체 적합성 조성물을 대상체에서 a) 잇몸 및/또는 골 성장 및/또는 b) 잇몸 침식 및/또는 골 흡수 억제를 필요로 하는 치주 부위에 투여하는 단계를 포함한다. 상기 방법으로 치료될 수 있는 유용한 치주 병태는 치주 질환, 잇몸 염증, 충치, 잇몸 질환, 치은염 및 치주염을 포함하지만, 이로 제한되지 않는다. 예를 들어, 생체 적합성 조성물은 국소 적용 치주 치료제로서 사용될 수 있다. 본원에 기재된 방법에 따라 본 발명의 생체 적합성 조성물을 사용하는 경우, 골 질량이 유지되거나 증가될 수 있거나, 골 밀도가 유지되거나 증가될 수 있거나, 잇몸 조직이 유지되거나 증가될 수 있거나, 또는 이들의 임의의 조합이 가능할 수 있다.
본 발명의 방법은 일반적으로 유효량의 생체 적합성 조성물을 대상체에게 투여하는 것을 포함한다. 비외과적이고 비침습적이며 안전한 본 발명의 방법은 골관절염, 전이성 골 질환, 골 용해성 골 질환 및 치아 관련 장애, 예컨대 치주염, 이은염, 잇몸 질환 및 치주 질환을 포함하지만 이에 제한되지 않는, 골 손실, 골 분해, 골 악화 또는 골 변성과 관련된 질환 상태 또는 병태의 치료 및/또는 예방에 사용될 수 있다.
본원에서 제공되는 생체 적합성 조성물은 회복 시간을 단축하고 성장 인자를 사용하여 잇몸 및 골 재생에 대한 전체적인 환자 결과를 개선하기 위한 치료 대안/보조제를 의사에게 제공한다. 증식하는 배양된 섬유모세포 및 골모세포로부터 방출된 성장 인자의 불균일 조성물은 각각 잇몸 재생에 관여하는 섬유모세포 증식 및 분화, 및 골 재생에 관여하는 골모세포 증식/성숙을 자극하는 성장 인자의 완전한 공급원을 제공한다.
본 발명의 방법은 또한 적어도 부분적으로는, 예를 들어 치주염 또는 치주염과 관련된 질환을 비롯하여, 증가된 구강 골 형성으로부터 이익을 얻을 수 있는 구강 병태의 치료 또는 예방에 관한 것이다. 생체 적합성 조성물은 구강 골 형성을 증가시켜, 치주염 또는 치주염과 관련된 질환과 같은 구강 골 형성 증가로부터 이익을 얻을 수 있는 구강 병태를 치료하거나 예방하는 방법에 사용될 수 있다. 이러한 방법은 경구 골 형성 증가가 필요한 구강 표면에 생체 적합성 조성물을 투여하는 것을 포함한다. 경구 투여는 예를 들어 타액선, 타액, 치은, 치태, 치아, 혀, 뺨 조직 등을 포함하지만 이로 제한되지 않는 구강의 표면에 생체 적합성 조성물 및 그에 함유된 활성 성분을 적용함으로써 구강에 적용하는 것을 목표로 한다. 경구 투여되는 작용제는 단독으로, 또는 약제학상 허용되는 담체 및/또는 경구 조성물 전에, 후에 또는 동시에 증가된 경구 골 형성제로부터 이익을 얻을 수 있는 항-구강 장애에 대한 다른 활성 성분과 함께 투여될 수 있다. 연조직, 상피 및 결합 조직, 예컨대 콜라겐 및 혈관을 포함하는 다른 구강 조직의 재생도 본 발명에 의해 고려된다.
일반적으로, 본 발명의 생체 적합성 조성물은 골 공동, 치주낭, 상처 기저부 등과 같은 부위에 직접 또는 간접적으로 적용된다. 일부 실시양태에서, 생체 적합성 조성물은 상처 드레싱에 포함될 수 있다. 생체 적합성 조성물은 자가 이식편(환자로부터 제거되어 동일한 환자의 다른 곳에 다시 적용되는 피부) 또는 잇몸 플랩과 같은 이식편과 함께 보조제로서 사용될 수 있다. 생체 적합성 조성물 또는 이를 포함하는 약제학적 제제는 다수의 공지된 수단 중 임의의 것을 사용하여 물리적인 치주낭 또는 외과적 폐쇄와 같은 관심 접촉 영역에 물리적으로 적용된다. 예를 들어, 봉합사는 수술 부위에 포함시키기 위해 생체 적합성 조성물을 통해 도입될 수 있다. 일부 실시양태에서, 봉합사는 흡수성 실, 비흡수성 실, 천연 실, 합성 실, 단일 필라멘트 실 또는 다중 필라멘트 실일 수 있다. 봉합사는 또한 봉합사가 오염되는 것을 방지하기 위한 살균 물질, 항응고제 또는 면역 반응을 방지하기 위한 자가 세포로 함침될 수 있다.
또 다른 실시양태에서, 생체 적합성 조성물을 함유하는 약제학적 제제는 생체 적합성 조성물과 접촉 표면의 물리적 접촉을 유지하기 위해 생체 접착제를 사용할 수 있다. 이들 생체 적합성 접착제는 일반적으로 다음과 같은 두 가지 범주로 나뉜다: 혈장 단백질로부터 합성된 생물학적 접착제; 및 합성 중합체, 주로 시아노아크릴레이트 및 이의 유도체.
상기 설명한 바와 같이, 상처 드레싱, 외과적 폐쇄, 스테이플링, 접착 스트립, 생체 접착제, 잇몸 플랩 및 기타 물리적 구속 수단을 사용하여 생체 적합성 조성물을 접촉 표면에 고정할 수 있다.
일반적으로, 본 발명의 치료 유효량의 생체 적합성 조성물 또는 이를 포함하는 약제학적 조성물의 투여는 개체의 질환 상태, 연령, 성별 및 체중, 및 개체에서 원하는 반응을 유도하는 펩티드의 능력과 같은 인자에 따라 달라질 수 있다. 투여 요법은 최적의 치료 반응을 제공하도록 조정될 수 있다. 예를 들어, 여러 분할 용량이 매일 투여될 수 있거나 또는 치료 상황의 긴급성에 의해 표시되는 바에 따라 용량은 비례적으로 감소될 수 있다.
예를 들어, 본 발명의 일부 실시양태를 실시함에 있어서, 안전하고 유효한 양의 본 발명의 생체 적합성 조성물은 상기 언급된 구강의 질환 또는 병태의 예방을 위해, 바람직하게는 적어도 1분, 2분, 3분, 4분, 5분, 10분, 20분, 30분, 40분, 50분, 1시간, 2시간, 3시간, 4시간, 5시간, 6시간, 7시간, 8시간, 9시간, 10시간, 11시간, 12시간, 13시간, 14시간, 15시간, 16시간, 17시간, 18시간, 19시간, 20시간, 21시간, 22시간, 23시간, 24시간, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 8일, 9일, 10일 또는 그 초과의 시간 또는 그 사이의 임의의 범위, 예컨대 적어도 약 10분 내지 적어도 약 1시간, 적어도 약 1분 내지 적어도 약 14일 또는 그 초과의 시간 동안 뼈, 뼈 표면, 구강 뼈, 구강 뼈 표면, 구강의 점막 조직, 구강의 치은 조직, 혀, 타액선, 타액 및/또는 치아의 표면, 연조직, 상피 및 결합 조직, 예컨대 콜라겐 및 혈관에 국소적으로 적용될 수 있다. 일반적으로, 생체 적합성 조성물은 잇몸 플랩 또는 뼈 결함과 같은 물리적 치주낭 내에 국소적으로 투여되고, 생체 적합성 중합체 매트릭스가 분해되거나 그렇지 않으면 흡수될 때까지 작용하도록 허용된다. 투여 방법은 하루에 1 내지 약 5회, 바람직하게는 1 내지 3회 재적용되거나 반복될 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 경구 전달은 최대 12개월 동안 1일 1회 내지 수회, 예를 들어 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 7일; 또는 1, 2, 3 또는 4주; 또는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 또는 12개월 이상(또는 그 사이의 임의의 범위) 동안 하루에 1회 내지 수회의 빈도로 수행될 수 있다. 전형적으로, 조성물의 유효량은 약 0.5 내지 약 10그램, 바람직하게는 약 1그램이다.
특정 실시양태에서, 예방제(예를 들어, 생체 적합성 조성물)의 투여는 질환 또는 장애가 예방되거나 대안적으로 그 진행이 지연되도록 치주 질환, 골관절염, 전이성 골 질환 및 골용해성 골 질환을 포함하지만 이로 제한되지 않는, 잇몸 손실, 잇몸 변성, 골 손실, 골 분해, 골 악화, 골 변성 등의 특징적인 증상이 나타나기 전에 수행될 수 있다.
본 발명의 방법은 골 손실/흡수를 예방, 억제 또는 감소시키기 위해 사용될 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 본 발명의 방법은 골 성장을 증가, 향상, 개선 또는 촉진하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 골 분해, 골 변성 및/또는 골 악화를 치료, 예방 또는 지연시키고/시키거나; 골 질량 및/또는 골 밀도를 증가시키거나 유지/안정화하고/하거나; 골 손실, 골 분해, 골 변성 및/또는 골 악화를 역전시키기 위해 특정 방법을 사용할 수 있다. 이것은 잇몸 및 치주골을 포함한 치주 조직 및 구조에도 동일하게 적용된다.
본 발명의 방법은 구강 골 형성을 증가시키기 위해 사용될 수 있고, 상기 질환 또는 장애의 발병 지연 또는 예방, 상기 질환 또는 장애와 관련된 병태의 심화, 악화 또는 중증도의 역전, 완화, 개선, 억제, 진행 둔화 또는 중지를 포함한다.
본원에서 설명되는 생체 적합성 조성물을 사용한 치료는 골 형성 증가, 골 성장 향상 및/또는 잇몸/골 손실 감소로부터 이익을 얻을 수 있는 골 및/또는 치주 장애의 징후 또는 증상 중 하나 또는 전부가 유익한 방식으로 변경되고, 질환의 다른 임상적으로 허용되는 증상 또는 마커가 작용제를 사용한 치료 후에, 예를 들어 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 그 초과로 개선되거나 심지어 호전될 경우, "유효한 치료"로 간주된다. 효능은 또한 입원 또는 의학적 또는 치과적 개입의 필요성에 의해 평가되는 바와 같이 개체의 악화 중지에 의해 측정될 수 있다(즉, 질환의 진행이 정지되거나 적어도 느려짐). 이들 지표를 측정하는 방법은 관련 기술 분야의 통상의 기술자에게 공지되어 있고/있거나, 본원에서 설명된다. 치료는 개체 또는 동물(일부 비제한적인 예는 인간 또는 포유동물을 포함함)에서 질환의 임의의 치료를 포함하고, (1) 질환의 억제, 예를 들어 뼈 및/또는 잇몸 손실의 정지; 또는 (2) 질환 완화, 예를 들어 뼈 및/또는 잇몸 성장의 증가; 및 (3) 뼈 및/또는 치주 장애로부터 합병증이 발생할 가능성의 예방 또는 감소를 포함한다.
일부 실시양태에서, 생체 적합성 조성물은 치주 플랩 수술의 보조물로서 제공된다. 예를 들어, 본 발명의 생체 적합성 조성물은 플랩 아래의 외과적 상처에 적용될 수 있으며, 구강 골 형성 및/또는 잇몸 재생의 유도, 뼈 및/또는 잇몸 성장의 향상 및/또는 뼈 및/또는 잇몸 손실의 방지에 대해 지속적인 수술후 효과를 갖는 것으로 본원에서 결정되었다. 치주 플랩 수술은 병변 부위를 제거하고 치아로부터 퇴적물을 제거하기 위해 유의한 골 손실을 나타내는 만성 치주 병변을 치료하기 위해 통상적으로 수행된다. 일반적으로, 환자가 스케일링 및 치근면 활택술 시술 및/또는 항생제 치료에 반응하지 않는 경우, 치은 절제술 또는 치주 플랩 수술과 같은 치주 수술이 종종 필요하다. 이러한 치료 방법은 관련 기술 분야에 잘 알려져 있다. 예를 들어, 치은 절제술에서, 치과 의사는 감염된 치주낭의 크기를 줄이기 위해 건강하지 않은 잇몸 조직을 재형성한다. 치주낭 크기의 감소는 환자가 일상적인 칫솔질 및 치실에 의해 치주낭을 위생적으로 유지할 수 있게 하여, 박테리아 성장에 유리한 환경을 제거한다. 치주 플랩 수술은 스케일링 및 치근면 활택술 시술이 실패한 경우, 특히 뼈 손실 또는 조직 분리가 존재하는 경우에도 수행된다. 이 시술에서, 잇몸에 절개가 이루어지고, 감염된 부위의 치유를 돕기 위해 주변 치조골이 재구성된다. 종종, 외과적 치료는 본원에서 설명되는 생체 적합성 조성물을 사용하는 보조 방법이 특히 유용하도록 심각한 치주 질환으로 인해 야기되는 파괴된 뼈 및 백악질의 재성장 또는 대체를 자극하는데 불충분하다. 그러나, 상기 설명한 바와 같이, 본 발명의 생체 적합성 조성물은 치주 플랩 수술과 관련이 있든 없든, 이를 필요로 하는 임의의 뼈 또는 치주 구조에 적용되거나 투여될 수 있다.
뼈 및/또는 치주 장애를 치료하기 위한 본원에서 설명되는 임의의 경구 조성물의 효과는 치료 중인 대상체로부터 수득된 2개 이상의 샘플을 비교함으로써 모니터링될 수 있다. 일반적으로, 치료를 시작하기 전에 대상체로부터 제1 샘플 및 치료 동안 하나 이상의 샘플을 얻는 것이 바람직하다. 이러한 용도에서, 요법 전에 구강 장애가 있는 대상체로부터 세포 발현의 기준선을 결정한 다음, 골 형성의 증가, 뼈 성장의 향상 및/또는 골 손실의 감소로부터 이익을 얻을 수 있는 구강 장애가 있는 대상체로부터 세포 발현의 기준선 상태의 변화 또는 뼈 성장의 검출이 치료 과정 동안 모니터링된다. 대안적으로, 치료 동안 수득된 2개 이상의 연속적인 샘플이 치료전 기준선 샘플을 필요로 하지 않으면서 사용될 수 있다.
치료 중인 대상체에서 하나 이상의 뼈 및/또는 치주 장애(들)가 개선되고 있는지의 여부는 관련 기술 분야에 공지된 검정에 따라 결정될 수 있다. 예를 들어, 다음 지표들이 모니터링될 수 있다: 1) 잇몸/뼈 성장 및/또는 잇몸/뼈 밀도의 증가; 2) 잇몸/골 손실의 감소 및/또는 잇몸/뼈 밀도 손실의 반전; 3) 치아 움직임의 감소; 4) 알칼리성 포스파타제(ALP), 콜라겐 타입 I, 오스테오칼신, 오스테오폰틴, Cbfa1/Runx2, gsc, Dlx1, DlxS, Msx1, Cart1, Hoxa1, Hoxa2, Hoxa3, Hoxb1, rae28, Twist, AP-2, Mf1, Pax1, Pax3, Pax9, TBX3, TBX4, TBXS, 및 브라큐리(Brachyury)와 같은 잇몸, 골모세포 또는 뼈 특이적 유전자의 증가(유전자 발현, 효소 활성, 면역조직화학 등에 의해 결정됨; Olsen et al. Annu . Rev. Cell. Dev . Biol . (2000) 16:191); 5) 치주낭 크기의 감소; 6) 잇몸 부착 수준의 증가; 7) 치아 손실의 감소; 8) 치주 염증의 감소; 9) 치주 질환 진행 단계의 감소; 및 이들의 조합.
본 발명의 방법에서, 생체 적합성 조성물은 예방 작용을 위해 골 손실과 관련된 병리생리학적 병태의 발병 전에 투여될 수 있거나, 또는 치료 작용을 위해 병태의 발생 후에 투여될 수 있다.
일반적으로, 본 발명의 방법을 사용하여 치료될 수 있는 척추동물 대상체(인간 또는 다른 포유동물)는 골 손실과 관련된 질환 또는 병태로 고통받거나 또는 골 손실과 관련된 질환 또는 병태에 취약하다(예를 들어, 상기 질환 또는 병태가 발생할 높은 또는 보다 높은 위험을 보이거나, 골 손실을 유발하거나, 야기하거나, 골 손실과 관련하는 것으로 알려진 질환 상태 또는 병태로 진단된다).
본 발명의 방법을 사용하여 치료 및/또는 예방될 수 있는 골 손실과 관련된 질환 상태 및 병태는 예를 들어 골 질량 손실 및/또는 골 밀도 손실로 이어지는 골 분해, 골 악화 또는 골 변성을 특징으로 하거나, 이를 수반하거나, 이와 연관되거나, 또는 이를 유도하는 임의의 병태를 포함한다. 이러한 병태의 예는 치주염과 같은 치주 질환; 골절 또는 골 결핍; 골관절염; 전이성 골 질환; 및 골 용해성 골 질환을 포함하지만, 이로 제한되지 않는다. 이러한 병태의 다른 예는 비제한적으로, 암 및 종양(예를 들어, 골육종 및 다발성 골수종), 신장 질환(급성 신부전, 만성 신부전, 신장성 골 이영양증 및 신장 재관류 손상 포함), 신장 질환 및 조기 난소 부전을 포함한다. 따라서, 본 발명의 방법은 골 손실을 예방하고, 골 결손을 채우고, 골절, 이식편 및 뼈-인공 삽입물의 신속한 유착을 자극하고, 골다공성 골의 강화를 촉진하기 위해 사용될 수 있다.
본 발명의 특정 방법에서, 생체 적합성 조성물은 a) 잇몸 및/또는 뼈 성장을 촉진하고/하거나, b) 잇몸 침식 및/또는 골 흡수를 억제하는 적어도 하나의 치료제와 조합하여 투여된다. 예를 들어, 이러한 치료제는 골 형태 형성 인자, 항흡수제, 골 형성 인자, 연골 유래 형태 형성 단백질, 성장 호르몬, 에스트로겐, 비포스포네이트, 스타틴, 분화 인자 또는 이들의 조합일 수 있다.
본 발명의 일부 방법에서, 생체 적합성 조성물은 하나 이상의 추가의 치료제와 조합하여 투여된다. 추가의 치료제의 예는 진통제, 마취제, 항미생물제, 항박테리아제, 항바이러스제, 항진균제, 항생제, 항염증제, 항산화제, 방부제, 면역 자극제 및 이들의 조합을 포함하지만, 이로 제한되지 않는다. 예를 들어, 이러한 치료제는 항미생물성 화합물 및/또는 비스테로이드성 항염증제(NSAID)일 수 있다. 특정 실시양태에서, 추가의 치료제 또는 치료제들은 COX-2 억제제, 예컨대 선택적 COX-2 억제제, 예를 들어 셀레콕시브, 로페콕시브 및/또는 발데콕시브이다. 이러한 실시양태에서, 생체 적합성 조성물 및 다른 치료제는 순차적으로 또는 동시에 투여될 수 있다.
대안적으로 또는 추가로, 생체 적합성 조성물은 의학적 절차와 조합하여(즉, 전에, 동시에 및/또는 후에) 투여될 수 있다. 예를 들어, 의학적 절차는 치주낭을 제거하고/하거나 뼈를 재구성하기 위한 외과적 개입일 수 있거나, 또는 치주 질환으로 고통받는 대상체에서 치아 표면의 선택적 재형성일 수 있다. 대안적으로, 의학적 절차는 뼈 이식, 외과적 종양 제거 등일 수 있다.
이러한 추가의 치료제는 신체 내에 자연적으로 존재하는 것 및/또는 골 성장/형성을 겪는 부위에서 자연적으로 분비되고 골 형성 과정의 하나 이상의 단계에서 역할을 수행하는 것일 수 있다. 관련 기술 분야의 통상의 기술자에게 명백한 바와 같이, 이들 치료제 또는 생체 분자의 변이체, 합성 유사체, 유도체, 및 활성 부분은 천연 생체 분자와 실질적으로 동일한 유형의 특성/활성을 보이는 한 본 발명의 조성물에 대안으로 사용될 수 있다. 이러한 변이체, 합성 유사체, 유도체 또는 활성 부분은 용어 "치료적 생체 분자"의 범위 내에 있는 것으로 의도된다.
치료제 또는 생체 분자는 포유동물 조직으로부터 추출될 수 있고, 본 발명에서 조질 상태로 또는 정제 후에 사용될 수 있다. 대안적으로, 이들은 화학적으로 또는 통상적인 유전자 조작 기술, 예컨대 합성 유전자 또는 부위 특이적 돌연변이 유발에 의해 변경된 유전자의 발현을 통해 제조될 수 있다.
골 질량 또는 골 밀도를 증가시키는 치료제 또는 생체 분자는 성장 인자, 예를 들어, IGF-1, IGF-2, 대식세포 성장 인자, 혈소판 유래 성장 인자(PDGF), 섬유모세포 성장 인자(FGF), 표피 성장 인자(EGF), 전환 성장 인자(TGF), 연골 유래 형태 형성 단백질(CDMP-1, CDMP-2, CDMP-3) 및 결합 조직 활성화 펩티드(CTAP), 미네랄(예를 들어, 칼슘, 알루미늄, 스트론튬 및 플루오라이드), 비타민(예를 들어, 비타민 D3), 호르몬(예를 들어, 부갑상선 호르몬(PTH) 및 부갑상선 호르몬 관련 단백질(PTHrP)); 프로스타글란딘(예를 들어, PDG1, PDG2, PGE2, PGE1 및 PGF2); 15-리폭시게나제의 억제제; 덱사메타손; 스타틴; 및 골 형태 형성 단백질(예를 들어, BMP-2, BMP-4 및 BMP-7)을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다.
특정 실시양태에서, 치료제 또는 생체 분자는 전환 성장 인자 베타(TGF-β)일 수 있다. TGF-β는 광범위한 생물학적 과정에 연루되어 있으며(J. Massague, Annu . Rev. Cell. Biol . (1990) 6: 597-641) 배아 발생, 성인 조직 복구 및 면역 억제 동안 주요 사건에서 핵심적인 역할을 하는 세포외 폴리펩티드이다(M. B. Sporn et al.Cell. Biol . (1992) 119: 1017-1021; S. W. Wahl, J. Clin . Immunol . (1992) 12: 61-74; D. M. Kingsley, Genes Dev . (1994) 8: 133-146). TGF-β는 골모세포의 증식 및 분화를 유발하는 것으로 알려져 있다(M. Centrella et al., J. Bone Join. Surg . (1991) 73: 1418-1428; T. A. Mustoe et al. Science, 1987, 237: 1333-1336; L. S. Beck et al. J. Bone Miner. Res. (1991) 6: 961-968). TGF-β는 또한 골 형성의 초기 단계에서 중요한 역할을 수행하는 것으로 알려져 있다(S. Dieudonne et al. J. Cell. Biochem . (1999) 76: 231-243). 본 발명의 조성물에 사용되는 TGF-β는 재조합 세포 배양물로부터 생성될 수 있다. 대안적으로, TGF-β는 임의의 적합한 방법을 사용하여 혈소판 또는 임의의 다른 포유동물 조직으로부터 유래될 수 있다. 바람직하게는, TGF-β는 인간 조직으로부터 유래된다. 그러나, TGF-β는 종 특이적이지 않기 때문에, 대안적으로, 뼈 또는 돼지 공급원과 같은 동물 공급원으로부터 유래될 수 있다. 특정 경우에, TGF-β는 바람직하게는 예를 들어 순차적 겔 여과, 양이온 교환 크로마토그래피 또는 고성능 액체 크로마토그래피를 사용하여 필수 균질성으로 정제된다.
다른 실시양태에서, 치료제 또는 생체 분자는 골 형태 형성 단백질(BMP)이다. BMP는 연골 세포 및 골 형성 세포로 분화되도록 만능성 세포를 자극하고 골 재생에서 중요한 역할을 수행하는 것으로 보고된 뼈 형성 단백질이다(M. R. Urist Science (1965) 150: 893-899; M. R. Urist et alJ . Dent. Res. (1971) 50: 1392-1406; J. M. Wozney Mol . Reprod . Dev . (1992) 32: 160-167; J. M. Wozney et al. Science (1988) 242: 1528-1534; I. One et al. Craniofac . Surg . (1996) 7: 418-425). 본 발명에 사용될 수 있는 BMP는 BMP-1, BMP-2α, BMP-2β, BMP-3β, MP-4, BMP-5, BMP-6, BMP-7, BMP-8β, BMP-9, BMP-10, BMP-11, BMP-12, BMP-13, BMP-14, 및 BMP-15를 포함하지만, 이로 제한되지 않는다.
또 다른 실시양태에서, 조성물은 조성물의 적용 부위 내 및 주위에서 용해된 칼슘(Ca2+) 및 포스페이트(PO4 -)의 가용성 농도를 국소적으로 향상시키기 위해 칼슘 및 포스페이트 공급원을 포함한다. 칼슘 공급원 및 포스페이트 공급원은 동일한 물질일 수 있거나 또는 상이한 물질일 수 있다. 본 발명에 사용하기 적합한 칼슘 공급원은 임의의 산성 칼슘 염, 예를 들어 인산칼슘 염(예를 들어, 제1 인산칼슘, 인산칼슘 이수화물(디칼(dical)로도 알려짐), 및 피로인산칼슘) 또는 시트르산칼슘 염을 포함한다. 본 발명에 사용하기 적합한 포스페이트 공급원은 인산칼슘 염(예를 들어, 산성 인산칼슘 염) 및 인산나트륨 염과 같은 임의의 포스페이트 염을 포함한다. 산성 인산칼슘 염의 예는 인산수소 이수화물, 제1 인산칼슘 및 피로인산칼슘을 포함한다.
또 다른 실시양태에서, 치료제 또는 생체 분자는 스타틴이다. 용어 "스타틴"및 "HMG-CoA 리덕타제 억제제"는 본원에서 교환 가능하게 사용되고, 효소 3-히드록시-3-메틸글루타릴 코엔자임 A(HMG-CoA) 리덕타제를 억제하는 화합물을 지칭한다. HMG-CoA 리덕타제는 세포의 콜레스테롤 생합성에 관련된 주요 속도 제한 효소이다. 스타틴은 새로운 뼈를 생성하는 세포인 골모세포의 생성을 강화하고, 골모세포의 분화를 향상시킨다(E. Harris et al. Mol . Cell. Diff . (1995) 3: 137-147; G. Mundy et al., Science (1999) 286: 19464949). 특히, 스타틴은 전신적으로 또는 골절 부위에서 BMP 생산을 촉진하는 것으로 나타났다(미국 특허 제6,022,887호; 제6,080,779호; 및 제6,376,476호). 본 발명에 사용하기 적합한 스타틴의 예는 다음을 포함하지만, 이로 제한되지 않는다: 로바스타틴, 프라바스타틴, 벨로스타틴, 심바스타틴, 플루바스타틴, 세리바스타틴, 메바스타틴, 달바스타틴, 플루인도스타틴, 아토르바스타틴, 이들의 프로드러그, 또는 이들의 생리학상 허용되는 염.
본 발명에 사용될 수 있는 골 손실/흡수를 방지하는 작용제는 프로게스틴, 에스트로겐, 에스트로겐/프로게스틴 조합, 에스트론, 에스트리올, 17α- 또는 17β-에티닐 에스트라디올, SB242784, 폴리포스포네이트 및 비스포스포네이트를 포함하지만, 이로 제한되지 않는다. 시판되는 비스포스포네이트는 에티트로네이트, 클로드로네이트, 틸루드로네이트, 알렌드로네이트, 파미드로네이트 및 이반드로네이트를 포함한다.
일부 실시양태에서, 수술 또는 손상 후 점막의 표면을 치료하는데 유용한 작용제 및/또는 조직에서 혈관신생을 촉진하는 작용제가 유용하다.
본 발명에 사용하기 적합한 진통제는 비스테로이드성 항염증제(NSAID)를 포함한다. NSAID는 진통, 해열 및 항염증 활성을 갖는다. 이들은 시클로옥시게나제(COX) 억제를 통해 프로스타글란딘의 합성을 방해함으로써 그의 진통 효과를 제공하도록 말초에서 작용한다. 아스피린 및 다른 살리실레이트를 포함하는 많은 상이한 유형의 NSAID가 존재한다. 대표적인 예는 이부프로펜, 나프록센, 술린닥, 디클로페낙, 피록시캄, 케토프로펜, 디플루니살, 나부메톤, 에토돌락, 옥사프로진 및 인도메타신을 포함하지만, 이로 제한되지 않는다. 더 강력한 NSAID 중 일부는 신체의 고통스러운 부위에 대한 국소 적용을 위한 국소 제품으로 개발되었다.
마취제, 예컨대 자일로카인, 리도카인 또는 벤조카인(또는 아래에서 설명되는 것과 같은 다른 약물)은 진통제가 완전히 효과적이 될 때까지 즉각적이지만 단기적인 통증 완화를 제공하기 위해 본 발명의 진통제 조성물에 첨가될 수 있다. 본 발명의 실시에 사용하기 적합한 마취제는 나트륨 채널 차단제를 포함한다. 나트륨 채널 차단제는 나트륨 이온(Na+)에 대한 흥분성 세포막의 투과성을 감소시키거나 큰 일시적인 증가를 방지함으로써 신경 펄스의 생성 및 전도를 방지한다.
나트륨 채널 차단제의 예는 다음을 포함하지만, 이로 제한되지 않는다: 암부카인, 아몰라논, 아밀카인, 베녹시네이트, 벤조카인, 베톡시카인, 비페나민, 부피바카인, 부타카인, 부탐벤, 부타닐리카인, 부테타민, 부톡시카인, 카르티카인, 클로로프로카인, 코카에틸렌, 코카인, 시클로메틸카인, 디부카인, 디메티소퀸, 디메토카인, 디페로돈, 디클로닌, 에코고니딘, 에코고닌, 에티도카인, 유프로신, 펜날코민, 포르모카인, 헥실카인, 히드록시테테라카인, 이소부틸 p-아미노벤조에이트, 류시노카인, 레복사드롤, 리도카인, 메피바카인, 메프릴카인, 메타부톡시카인, 메틸 클로라이드, 미르테카인, 나에파인, 옥타카인, 오르토카인, 옥세타자인, 파렌톡시카인, 페나카인, 페놀, 피페로카인, 피리도카인, 폴리도칸올, 프라목신, 프릴로카인, 프로카인, 프로파노카인, 프로파라카인, 프로피포카인, 프로폭시카인, 슈도코카인, 피로카인, 로피바카인, 살리실 알코올, 테트라카인, 톨리카인, 트리메카인, 졸라민, 및 이들의 활성 유도체, 프로드러그, 유사체, 약제학상 허용되는 염 또는 혼합물.
본 발명의 생체 적합성 조성물은 또한 항감염 활성을 갖는 화합물, 분자 또는 약물(즉, 이들은 감염 위험을 감소시키거나, 감염을 예방하거나, 감염을 저해, 억제, 퇴치 또는 치료할 수 있음)을 포함하는 항감염제와 함께 조합되거나 함께 사용될 수 있다. 특정 실시양태에서, 이들 화합물, 분자 또는 약물은 국소 적용시 항감염 활성을 갖는다. 본 발명에 사용하기 적합한 항감염제는 살균제, 항미생물제, 항생제, 항박테리아제, 항바이러스제, 항진균제, 항원생동물제, 면역 자극제 및 이들의 임의의 조합을 포함하지만, 이로 제한되지 않는다.
항바이러스제는 바이러스 감염을 예방하고/하거나 부위에서 바이러스 역가를 감소시키기 위해 조성물에 존재할 수 있다. 적합한 항바이러스제는 RNA 합성 억제제, 단백질 합성 억제제, 면역 자극제 및 프로테아제 억제제를 포함한다. 항바이러스제는 예를 들어 아시클로비르, 아만타딘 히드로클로라이드, 포스카르네트 나트륨, 가네이클로비르 나트륨, 페놀, 리바비린, 비다라빈 및 지도부딘으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
항진균제는 매우 다양한 치료제로부터 선택될 수 있다. 예를 들어, 락트산(즉, 2-히드록시프로판산)은 병원체의 성장을 억제하는 것으로 알려진 항진균제이다. 소르브산(즉, 2,4-헥사디엔산)은 칸디다 알비칸스(Candida albicans)를 죽이는 천연 항진균제이다. 다른 항진균제는 다음을 포함하지만, 이로 제한되지 않는다: 암포테리신 B, 시클로피록스, 클로트리마졸, 에닐코나졸, 에코나졸, 플루코나졸, 그리세오풀빈, 할로그로핀, 인트로코나졸, 케토코나졸, 미코나졸, 나프티핀, 니스타틴, 옥시코나졸, 술코나졸, 티아벤다졸, 테르비나핀, 톨나프테이트, 운데실렌산, 마페니드, 은 술파디아진 및 카르볼-푸쉬신.
항생제 및 다른 항미생물제는 다음으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다: 바시트라신; 세팔로스포린(예를 들어, 세파드록실, 세파졸린, 세팔렉신, 세팔로틴, 세파피린, 세프라딘, 세파클로르, 세파만돌, 세포니시드, 세포라니드, 세폭시틴, 세푸록심, 세포페라존, 세포탁심, 세포테탄, 세프타지딤, 세프티족심, 세프트리악손 및 메로페넴); 시클로세린; 포스포마이신, 페니실린(예를 들어, 암디노실린, 암피실린, 아목시실린, 아즐로실린, 바카미피실린, 벤자틴 페니실린 G, 카르베니실린, 클록사실린, 시클라실린, 디클록사실린, 메티실린, 메즐로실린, 나프실린, 옥사실린, 페니실린, 페니실린 V, 피페라실린, 및 티카르실린); 리스토세틴; 반코마이신; 콜리스틴; 노보비오신; 폴리믹신(예를 들어, 콜리스틴, 콜리스티마테이트 및 폴리믹신 B); 아미노글리코시드(예를 들어, 아미카신, 겐타미신, 카나마이신, 네오마이신, 네틸미신, 파로모마이신, 스펙티노마이신, 스트렙토마이신 및 토브라마이신), 테트라사이클린(예를 들어, 데메클로사이클린, 독시사이클린, 메타사이클린, 미노사이클린 및 옥시테트라사이클린); 카르바페넴(예를 들어, 이미페넴); 모노박탐(예를 들어, 아즈트레오남); 클로람페니콜; 클린다마이신; 시클로헥시미드; 푸시딘; 린코마이신; 푸로마이신; 리팜피신; 다른 스트렙토마이신; 마크롤리드(예를 들어, 에리트로마이신 및 올레안도마이신); 플루오로퀴놀론; 악티노마이신; 에탐부톨; 5-플루오로시토신; 그리세오풀빈; 리파마이신; 술폰아미드(예를 들어, 술파시틴, 술파디아진, 술피속사졸, 술파메톡사졸, 술파메티졸 및 술파피리딘); 및 트리메토프림.
다른 적합한 항박테리아제는 다음을 포함하지만, 이로 제한되지 않는다: 비스무트 함유 화합물(예컨대, 비스무트 알루미네이트, 비스무트 서브시트레이트, 비스무트 서브갈레이트 및 비스무트 서브살리실레이트); 니트로푸란(예를 들어, 니트로푸라존, 니트로푸란토인 및 푸로졸리돈); 메트로니다졸; 티니다졸; 니모라졸; 및 벤조산.
방부제는 벤즈알코늄 클로라이드, 클로르헥시딘, 벤조일 퍼옥시드, 과산화수소, 헥사클로로펜, 페놀, 레조르시놀 및 세틸피리디늄 클로라이드로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
본 발명의 조성물에 사용하기 적합한 면역 자극제는 인터류킨 1 효능제, 인터류킨 2 효능제, 인터페론 효능제, RNA 합성 억제제 및 T 세포 자극제와 같은 광범위한 치료제로부터 선택될 수 있다.
본 발명에서 사용하기 위한 항염증제는 항염증 활성을 갖는 화합물, 분자 또는 약물이다(즉, 이들은 염증의 지속 기간 및/또는 중증도를 억제하거나 감소시킬 수 있고/있거나, 조직의 손상을 억제하거나 감소시킬 수 있고/있거나, 홍반, 부종, 조직 허혈, 열 등과 같은 염증의 징후 중 적어도 하나를 완화시킬 수 있다). 특정 실시양태에서, 이들 화합물, 분자 또는 약물은 국소 적용될 때 항염증 활성을 갖는다.
본 발명에서 사용하기 적합한 항염증제는 매우 다양한 스테로이드성 및 비스테로이드성 항염증제로부터 선택될 수 있다. NSAID의 예는 위에서 찾을 수 있다. 스테로이드성 항염증제의 예는 다음을 포함하지만, 이로 제한되지 않는다: 아클로메타손 디프로피오네이트, 플루니솔리드, 플루티카손, 부데소니드, 트리암시놀론, 트리암시놀린 아세토나이드, 베클로메타손 디프로피오네이트, 베타메타손 발레레이트, 베타메타손 디프로피오네이트, 히드로코르티손, 코르티손, 덱사메타손, 메메타손 푸로네이트, 프레드디손, 메틸프레드니솔론 아세포네이트 및 프레드니솔론.
항염증제는 대안적으로 또는 추가로 항산화 활성을 나타내는 매우 다양한 화합물, 분자 및 약물로부터 선택될 수 있다. 항산화제는 조직에 대한 산화 손상을 예방하거나 줄일 수 있는 작용제이다. 항산화제는 비타민 A(레티날), 비타민 B(3,4-디데히드로레티놀), 비타민 C(D-아스코르브산, L-아스코르브산), α-카로텐, β-카로텐, γ-카로텐, δ-카로텐, 비타민 E(α-토코페롤), β-토코페롤, γ-토코페롤, δ-토코페롤, 토코퀴논, 토코트리에놀, 부틸화 히드록시 아니솔, 시스테인, 및 이들의 활성 유도체, 유사체, 전구체, 프로드러그, 약제학적으로 허용되는 염 또는 혼합물로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다.
본 발명의 조성물에 존재하는 치료제(들) 골 형성 인자, 성장 호르몬, 진통제, 항염증제의 양은 특정 치료제에 대해 권장되거나 허용되는 투여량, 및 치료되는 골 손실의 유형 및 조성물 내의 다른 성분/구성 요소의 존재 및 특성에 따라 달라질 수 있다. 특정 실시양태에서, 존재하는 치료제의 양은 국소 투여를 통해 원하는 결과를 얻는데 필요한 통상적인 투여량이다. 이러한 투여량은 공지되어 있거나 약학 또는 의료 분야의 통상의 기술자에 의해 용이하게 결정된다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 조건화된 세포 배지 및 생체 적합성 조성물은 약제학상 허용되는 담체 또는 부형제를 혼합함으로써 약제학적 조성물로서 제제화된다. 본 발명의 생체 적합성 조성물을 포함하는 약제학적 조성물은 일반적인 약제학적 실무에 따라 제제화될 수 있다(예를 들어, 문헌 ["Remington's Pharmaceutical Sciences" and "Encyclopedia of Pharmaceutical Technology", J. Swarbrick, and J. C. Boylan (Eds.), Marcel Dekker, Inc: New York, 1988] 참조). 예를 들어, "약제학상 허용되는 담체"는 약제학상 허용되는 물질, 조성물 또는 비히클, 예컨대 본 발명의 화학 물질을 하나의 기관 또는 신체의 일부에서 다른 기관 또는 신체의 일부로 운반 또는 수송하는 것과 관련되는 액체 또는 고체 충전제, 희석제, 부형제, 용매 또는 캡슐화 물질을 지칭한다. 각각의 담체는 제제의 다른 성분과 상용성이고 대상체에게 해를 끼치지 않는다는 점에서 "허용 가능"해야 한다. 약제학상 허용되는 담체로서 작용할 수 있는 물질의 일부 예는 다음을 포함한다: (1) 당, 예컨대 락토스, 글루코스 및 수크로스; (2) 전분, 예컨대 옥수수 전분 및 감자 전분; (3) 셀룰로스 및 그의 유도체, 예컨대 나트륨 카르복시메틸 셀룰로스, 에틸 셀룰로스 및 셀룰로스 아세테이트; (4) 분말 트라가칸트; (5) 맥아; (6) 젤라틴; (7) 활석; (8) 부형제, 예컨대 코코아 버터 및 좌제 왁스; (9) 오일, 예컨대 땅콩유, 면실유, 잇꽃유, 참기름, 올리브유, 옥수수유 및 대두유; (10) 글리콜, 예컨대 프로필렌 글리콜; (11) 폴리올, 예컨대 글리세린, 소르비톨, 만니톨 및 폴리에틸렌 글리콜; (12) 에스테르, 예컨대 에틸 올레에이트 및 에틸 라우레이트; (13) 아가; (14) 완충제, 예컨대 수산화마그네슘 및 수산화알루미늄; (15) 알긴산; (16) 발열원이 없는 물; (17) 등장성 염수; (18) 링거액; (19) 에틸 알코올; (20) 포스페이트 완충 용액; 및 (21) 약제학적 제제에 사용되는 다른 비독성 상용성 물질.
일부 실시양태에서, 조건화된 세포 배지는 생체 적합성 중합체 매트릭스와 함께 제제화되지 않고 단독으로 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 조건화된 세포 배지는 생체 적합성 중합체 매트릭스와 함께 제제로 사용될 수 있다. 조건화된 세포 배지가 단독으로 사용되는지 또는 생체 적합성 중합체와 함께 사용되는지에 관계없이, 생성된 조성물은 예를 들어 관심 있는 전달 부위에 직접 투여함으로써 단독으로 사용될 수 있다. 대안적으로, 일부 실시양태에서, 조건화된 세포 배지가 단독으로 사용되는지 또는 생체 적합성 중합체와 함께 사용되는지에 관계없이, 생성된 조성물은 추가의 매트릭스 물질과 함께 및/또는 추가의 매트릭스 물질 내에서 제제로 사용될 수 있다. 매트릭스 재료의 선택은 생체 적합성, 생분해성, 기계적 특성, 미용상 외관 및 계면 특성에 기초한다. 대표적인 비제한적인 매트릭스는 황산칼슘, 인산삼칼슘, 히드록시아파타이트, 폴리락트산 및 폴리무수물을 비롯한 생분해성 및 화학적으로 정의된 물질을 포함한다. 다른 매트릭스 물질은 뼈 또는 진피 콜라겐과 같이 생분해성이고 생물학적으로 잘 정의되어 있는 것이다. 다른 매트릭스는 순수한 단백질 또는 세포외 매트릭스 성분으로 이루어진다. 다른 대표적인 매트릭스는 소결된 히드록시아파타이트, 바이오글래스, 알루미네이트 또는 다른 세라믹과 같이 비생분해성이고 화학적으로 정의된 것이다. 매트릭스는 폴리락트산 및 히드록시아파타이트 또는 콜라겐 및 인산삼칼슘과 같이 상기 언급된 임의의 유형의 물질의 조합으로 이루어질 수 있다. 바이오세라믹은 칼슘-알루미네이트-포스페이트와 같은 조성 및 세공 크기, 입자 크기, 입자 형태 및 생분해성을 변화시키는 가공에서 변경될 수 있다. 이론에 매이지 않지만, 본 발명에 포함된 생체 적합성 중합체 매트릭스로 제제화된 조건화된 세포 배지는 시간이 지남에 따라 조건화된 세포 배지의 방출을 조절하는 생체 적합성 중합체 매트릭스의 능력에 의해 생체 적합성 중합체 매트릭스가 없는 조건화된 배지에 비해, 골 성장(예를 들어, 총 골유착, 수직 골유착 및/또는 측방 골유착 등) 및 골 흡수의 억제를 유도하기 위해 실질적으로 더 적은 매트릭스 물질이 사용될 수 있도록 허용하는 것으로 생각된다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 병치된 뼈 및 다른 조직과의 결합(즉, 골유착)을 비롯하여 뼈에 대한 원하는 효과를 갖는 조성물의 용량은 생체 적합성 중합체가 없는 조성물에 비해 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 31%, 32%, 33%, 1/3, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 그 사이의 임의의 범위, 예컨대 30%-40%의 적은 양을 사용하여 유지된다.
IV. 키트
다른 측면에서, 본 발명은 본 발명의 생체 적합성 조성물 또는 이를 포함하는 약제학적 조성물을 포함하는 키트를 제공한다. 특정 실시양태에서, 생체 적합성 조성물에는 키트에서 적어도 하나의 치료제가 제공된다. 적어도 하나의 치료제는 개별적으로 또는 혼합물로 제공될 수 있다.
예를 들어, 키트는 2개의 개별 용기를 포함할 수 있으며, 제1 용기는 생체 적합성 조성물을 포함하고, 제2 용기는 치료제 또는 그의 조성물을 포함한다. 키트는 대안적으로 2개의 개별 용기를 포함할 수 있으며, 제1 용기는 생체 적합성 조성물 및 치료제를 포함하는 혼합물 또는 조성물을 포함하고, 제2 용기는 즉시 사용 가능 조성물을 얻기 위해 사용 전에 제1 용기에 첨가되도록 의도된 적합한 매질을 포함한다. 대안적으로 또는 추가로, 키트는 생체 적합성 조성물 및 치료제를 포함하는 혼합물 또는 조성물 및 제1 조성물의 혼합물 또는 조성물을 적용하는데 사용되는 도구(예를 들어, 브러시, 주사기, 스패츌러)를 포함하는 용기로 이루어질 수 있다.
특정 실시양태에서, 개별 용기(예를 들어, 바이알, 앰퓰, 플라스크, 병, 좁은 팁을 갖는 튜브)는 상업적 용도를 위해 밀폐된 상태로 유지된다.
키트는 본 발명에 따른 생체 적합성 조성물 및 치료제(및 임의의 다른 추가의 작용제 및 시약)를 사용하기 위한 설명서를 추가로 포함할 수 있다. 본 발명의 하나 이상의 방법에 따라 키트를 사용하기 위한 설명서는 적응증, 바람직한 투여 방식(들), 바람직한 요법(들), 바람직한 투여량, 잠재적 부작용 등에 대한 정보를 포함할 수 있다. 키트는 또한 의약품의 제조, 사용 또는 판매를 규제하는 정부 기관(예를 들어, FDA)에 의해 규정된 형태의 통지를 포함할 수 있다. 바코드, 무선 주파수, ID 태그 등과 같은 식별자가 키트 내에 또는 키트 상에 존재할 수 있다. 식별자는 예를 들어 품질 관리, 재고 관리, 워크스테이션 사이의 이동 추적 등의 목적으로 키트를 고유하게 식별하는 데 사용될 수 있다. 본 발명의 특정 실시양태에서, 키트는 정부 기관(예를 들어, FDA) 승인 의약품에 대해 요구되는 우수 의약품 제조 관리 기준에 따라 제조될 수 있다.
예시
본 발명은 하기 실시예에 의해 추가로 설명되며, 이는 제한적인 것으로 해석되지 않아야 한다.
실시예 1: 실시예 2-3의 재료 및 방법
A. 시험관 내 연구
이 연구에서는 인간 1차 신생아 피부 섬유모세포 및 인간 1차 골모세포를 사용하였다. 섬유모세포의 경우, 대략 500밀리리터(mL)의 DMEM 기저 세포 배양 배지는 태아 소 혈청(FBS)(4.6% v:v), 글루타맥스™(1.1% v:v), 재조합 인간 표피 성장 인자(2.25 마이크로그램), 및 재조합 인간 염기성 섬유모세포 성장 인자(0.68 마이크로그램)를 함유한다. 골모세포 1차 배지는 약 500 mL의 총 부피에 대해 아스코르브산(2.75 mg), 글루타맥스™(1% v:v) 및 FBS(9.8% v:v)가 보충된 DMEM 기저 세포 배양 배지를 함유한다.
섬유모세포 배지(배지 A) 및 골모세포 배지(배지 B)를 각각 증식성 섬유모세포 및 골모세포에 첨가하고, 세포 배양물을 수거 전에 24시간 동안 5% CO2에서 37℃의 가습 챔버에서 인큐베이팅하였다. 조건화된 세포 배지(배지 C)는 섬유모세포 및 골모세포 조건화된 배지의 50:50 혼합물로서 생성되었다.
B. 중합체 매트릭스
중합체 매트릭스는 1% w:v의 농도로 초저 융점 아가로스(론자의 SeaPrep™ 아가로스)를 포함하고, 아가로스는 분말 형태를 따뜻한 젤라틴 상태로 완전히 용해시키기 위해 1% w:v의 최종 농도를 만들기 위해 필요한 총 부피의 1/2을 나타내는 부피에 초기에 용해하였다. 혼합물을 37℃ 미만으로 냉각한 후, 나머지 1/2 부피의 배지 C(조건화된 섬유모세포 및 골모세포의 50:50 혼합물)를 첨가하고, 완전히 혼합하여 모든 성분을 완전히 혼입시켰다. 조건화된 섬유모세포/골모세포 배지에 용해된 1% w:v 초저 융점 아가로스의 매트릭스를 추가로 사용될 때까지 아가로스의 중합을 돕기 위해 4℃로 냉각하였다.
C. 형태
골모세포를 기저 골모세포 성장 배지에서 6웰 플레이트 상에 밤새 씨딩하였다. 배지를 흡인하고, 부착 세포를 각각의 배지를 첨가하기 전에 dPBS로 세척하였다. 올림푸스(Olympus) CK2 도립 현미경을 사용하여 10X에서 관찰하기 전에 세포를 추가로 24시간 동안 성장시켰다.
D. 세포 증식 검정
셀타이터(CellTiter) 96® 에이퀴어스 원 솔루션(AQueous One Solution) 세포 증식 검정을 사용하여 24시간 및 48시간 시점에서 생존 세포의 수를 결정하였다. 간단히 설명하면, 대략 2 x 104개의 세포를 1차 골모세포 성장 배지에서 96웰 플레이트 상에 밤새 플레이팅하였다. 세포를 24시간 동안 씨딩한 후, 성장 배지를 흡인하고, dPBS로 세척하였다. dPBS를 흡인한 후, 100 ㎕의 각각의 배지를 개별 웰에 첨가하였다. 검정 시점은 각각의 성장 배지의 첨가 후 대략 24시간 및 48시간이었다. 490 nm에서의 흡광도는 세포 성장의 함수로서 기록되었다.
E. 스크래치 검정
골모세포를 기저 섬유모세포 성장 배지에서 6웰 플레이트 상에 밤새 씨딩하였다. 피펫 팁을 사용하여 각각의 밀집(confluent) 웰에서 물리적 분리를 수행하였다. 이어서, 기저 배지를 흡인한 후, dPBS로 세척하였다. 이어서, 각각의 배지를 각각의 웰에 첨가하고, 추가로 24시간 동안 성장시켰다. 올림푸스 CK2 도립 현미경을 사용하여 이미지를 얻었다.
F. 생체 내 연구
모든 동물 실험은 실험 동물의 관리 및 사용에 대한 콜럼비아 유니버시티(Columbia University) ILAR 지침 및 미국 농무부(United States Department of Agriculture)가 관리하는 동물 복지법 규정에 따라 수행되었다. 동물 복지법 규정에 따라 요구되는 바와 같이, 모든 실험 절차는 IACUC의 승인을 받았다.
총 8마리의 개가 연구에 이용되었다. 각각의 개 대상체에서, 발치/임플란트 부위로서 정의된 총 8개의 결함이 사용되었다. 8개의 결함을 다음과 같이 2개의 그룹으로 나누었다: 그룹 1: 수직 뼈 결함(5 mm) + 4개의 임플란트 + 뼈 이식, 및 그룹 2: 수직 뼈 결함(5 mm) + 4개의 임플란트 + 뼈 이식 + (성장 인자; DentaPro: 상기 실시예 1에서 설명한 바와 같이 저 융점 아가로스가 없는 섬유모세포/골모세포 조건화된 배지 단독, PeriOSM: 상기 실시예 1에서 설명한 바와 같이 섬유모세포/골모세포 조건화된 배지 + 저 융점 아가로스).
동물 대상체는 일련의 총 3회의 수술을 받았다. 특히, 초기 수술은 발치 및 발치와(extraction socket)의 완전한 치유를 허용하기 위한 12주의 치유로 이루어졌다. 이어서, 표준화된 골 결함(20 x 5 mm; 길이 x 높이)을 생성하고 성장 인자를 갖거나 갖지 않는 골 임플란트 및 뼈 이식 물질(히드록시아파타이트)의 삽입하기 위한 제2 수술 절차가 이어졌다. 동물을 임플란트 삽입/뼈 결함 후 측정된 바와 같이 4주 및 8주 시점에 동물을 희생시키고, 마이크로 컴퓨터 단층 촬영(마이크로 CT) 및 표준 조직학적 과정을 통해 분석하였다.
실시예 2: 생체 적합성 조성물은 세포에 긍정적인 영향을 미친다.
아가로스의 파라크린 유사 효과를 분석하기 위해, 1% w:v 농도의 고화된 아가로스를 직경 1 cm의 디스크로 절단하였다. 6웰 플레이트의 단일 웰에서, PBS, 비조건화된 배지 또는 조건화된 배지를 함유하는 3개의 디스크를 각각 함께 배치하였지만, 동일한 웰에서 서로 이격시키고 골모세포를 첨가하기 전에 부착시켰다. 조건화된 골모세포 기저 배지를 세포를 덮기 위해 첨가하였으나, 아가로스 디스크를 대체하였다. 세포를 37℃ 및 5% CO2에서 24시간 동안 성장시켰다. 이어서, 각각의 디스크 주위의 세포 거동을 관찰하기 위해 이미지를 촬영하였다.
조건화된 배지를 함유하는 고화된 아가로스 디스크는 다음과 같이 생성되었다: 간단히 설명하면, 아가로스는 분말 형태를 따뜻한 젤라틴 상태로 완전히 용해시키기 위해 1% w:v의 최종 농도를 만들기 위해 필요한 총 부피의 1/2을 나타내는 ddH20의 부피에서 초기에 가열하였다. 혼합물을 37℃ 미만으로 냉각한 후, 나머지 1/2 부피의 조건화된 배양 배지, 예컨대 조건화된 섬유모세포와 골모세포 배지의 50:50 혼합물을 첨가하고, 완전히 혼합하여 모든 성분을 완전히 혼입시켰다. 이어서, 조건화된 섬유모세포/골모세포 배지에 용해된 1% w:v 초저 융점 아가로스의 매트릭스를 1 cm까지의 두께로 페트리 접시에 부었다. 이어서, 접시를 추가로 사용될 때까지 아가로스의 중합을 돕기 위해 4℃로 냉각하였다. 아가로스 디스크를 고화되도록 한 후, 직경 1.5 cm 이하의 환상 디스크를 추가의 실험을 위해 단리하였다.
비조건화된 배지를 조건화된 배지와 비교할 때, 세포 크기 또는 형태에는 눈에 띄는 차이가 없었다(도 1). 다른 2개의 배지(즉, 비조건화된 배지 및 조건화된 배지)와 비교하여 DPBS의 음성 대조군 사이에는 유의한 차이가 존재한다.
형광 기반 검정에 기초하여, 조건화된 배지는 비조건화된 배지 및 대조 배지와 비교하여 최고 수준의 세포 증식을 유발하였다(도 2).
비조건화된 배지와 대조적으로 골모세포 조건화된 배지는 상처 치유를 가속화하였다(도 3).
조건화된 배지가 주입된 아가로스는 아마도 성장 인자가 매트릭스로부터 방출되는 수동 확산으로 인해 보다 강력한 화학 유인 효과를 발휘하는 것으로 보인다(도 4). 이러한 특징은 본원에서 설명되는 생체 적합성 조성물의 임상 적용 및 물리적으로 비워진 공간(예를 들어, 치과용 임플란트와 인접한 잇몸 라인 사이의)을 채우고 세포가 생체 적합성 조성물의 중합체 매트릭스로 이동하도록 자극하는 능력과 관련하여 중요한 특징을 나타낸다. 중합체 매트릭스가 용해됨에 따라, 중합체 매트릭스의 어느 한쪽으로부터의 세포가 함께 모일 수 있다.
실시예 3: 생체 내에서 생체 적합성 조성물의 치주 효과
우측(대조군) 및 좌측(실험) 하악 소구치 영역이 사용된 송곳니 동물 모델을 사용하여 새로운 골 재생 및 치과 임플란트 골유착에 대한 DentaPro 및 PeriOSM의 효과를 평가하기 위해 생체 내 연구를 수행하였다. 도 5는 8주 후에 대조군과 비교한, DentaPro 및 PeriOSM을 사용한 유의한 골 재생을 보여준다. 유사하게, 도 6은 8주 후에 임플란트 골유착의 결과(예를 들어, 골 성장 및 임플란트-골 유착 높이의 차이)를 보여준다. 특히, 도 6은 DentaPro 및 PeriOSM 둘 모두를 사용한 치료가 대조군에 비해 유의한 골유착(원)을 보여주었다. 또한, DentaPro와 PeriOSM 둘 모두는 대조군에 비해 유의한 수직 골유착(표지되지 않은 막대)을 나타냈다. 또한, PeriOSM은 DentaPro 및 대조군에 비해 히드록시아파타이트 매트릭스 양의 3분의 1만을 사용함에도 불구하고 예상치 못하게 약간 개선된 수직 골유착 및 유의한 새로운 측면 골 성장을 나타냈다.
참조에 의한 통합
본원 전체에 걸쳐 인용된 모든 참고 문헌, 특허 출원, 특허 및 공개된 특허 출원의 내용 및 도면 및 서열 목록은 본원에 참조로 포함된다.
균등물
관련 기술 분야의 통상의 기술자는 본원에서 설명되는 본 발명의 특정 실시양태에 대한 많은 균등물을 인식하거나 단지 통상적인 실험을 사용하여 확인할 수 있을 것이다. 이러한 균등물은 다음의 청구범위에 의해 포함되는 것으로 의도된다.

Claims (60)

  1. (a) 생체 적합성 중합체 매트릭스; 및
    (b) i) 세포 배양 배지 및 ii) 세포 배양 배지에서 배양된 하나 이상의 세포에 의해 합성되고 상기 세포로부터 분비된 하나 이상의 작용제를 포함하는 조건화된 세포 배지
    를 포함하는 생체 적합성 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 세포가 섬유모세포인 조성물.
  3. 제2항에 있어서, 섬유모세포가 피부 섬유모세포인 조성물.
  4. 제3항에 있어서, 피부 섬유모세포가 신생아 피부 섬유모세포인 조성물.
  5. 제1항에 있어서, 세포가 골모세포인 조성물.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 세포가 섬유모세포 및 골모세포인 조성물.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 세포가 섬유모세포 및 골모세포의 공동 배양물인 조성물.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 세포가 활발히 증식하는 세포인 조성물.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 세포 배양 배지가 기저 세포 배양 배지를 포함하고, 태아 소 혈청(FBS), L-글루타민, 인간 표피 성장 인자(EGF), 염기성 섬유모세포 성장 인자(bFGF) 및 아스코르브산으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 보충제를 추가로 포함하는 것인 조성물.
  10. 제9항에 있어서, 기저 세포 배양 배지가 둘베코 변형 이글 배지(DMEM)인 조성물.
  11. 제9항 또는 제10항에 있어서, 보충제가 재조합 성장 인자인 조성물.
  12. 제11항에 있어서, 재조합 성장 인자가 인간 재조합 성장 인자인 조성물.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 작용제가 성장 인자를 포함하는 것인 조성물.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 작용제가 혈소판 유래 성장 인자(PDGF), 표피 성장 인자(EGF), 섬유모세포 성장 인자(FGF), 염기성 섬유모세포 성장 인자(bFGF), 혈관 내피 성장 인자(VEGF), 각질세포 성장 인자(KGF), 전환 성장 인자 알파(TGFα), 전환 성장 인자 베타(TGFβ), 전환 성장 인자 베타-1(TGFβ1), 전환 성장 인자 베타-2(TGFβ2), 인슐린 유사 성장 인자(IGF), 신경 성장 인자(NGF), 간세포 성장 인자(HGF), 인슐린, 히드로코르티손, 유로가스트론, 혈소판 유래 상처 치유 인자(PDWHF), 뇌 유래 신경 영양 인자(BDNF), 혈소판 인자 IV(PF IV), 종양 괴사 인자(TF), 과립구 콜로니 자극 인자(GCSF), 콜로니 자극 인자(CSF), 골 형태 형성 단백질(BMP), 오스테오칼신, 오스테오폰틴, 인터류킨-1, 인터류킨-6, 인터류킨-8(IL-8), 인터류킨-11 및 성장 분화 인자(GDF), 또는 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 조성물.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 세포 배양 배지에서 배양된 하나 이상의 세포에 의해 합성되고 상기 세포로부터 분비된 하나 이상의 작용제가 배양 전의 세포 배양 배지 내의 농도와 비교하여 약 적어도 2배, 약 2배, 약 3배, 약 4배, 약 5배, 약 6배, 약 7배, 약 8배, 약 9배, 약 10배, 약 11배, 약 12배, 약 13배, 약 14배, 약 15배, 약 16배, 약 17배, 약 18배, 약 19배, 약 20배, 약 25배, 약 30배, 약 40배, 약 50배, 약 60배, 약 70배, 약 80배, 약 90배 및 약 100배의 증가로 이루어진 군으로부터 선택되는 농도로 조건화된 배지에 존재하는 것인 조성물.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 세포가 세포 배양 배지에서 적어도 24시간 동안, 경우에 따라 적어도 48시간 동안 또는 적어도 72시간 동안 배양되는 것인 조성물.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 생체 적합성 조성물이 세포를 포함하지 않는 것인 조성물.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 조건화된 세포 배지가 농축되고, 경우에 따라, 조건화된 세포 배지가 접선 유동 여과에 의해 농축되는 것인 조성물.
  19. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 중합체 매트릭스가 아가로스인 조성물.
  20. 제19항에 있어서, 아가로스가 해초로부터 유래되는 것인 조성물.
  21. 제19항 또는 제20항에 있어서, 아가로스가 저 융점 아가로스 또는 초저 융점 아가로스인 조성물.
  22. 제19항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 아가로스가 약 0.8% 내지 3.0% 중량 대 부피(w:v), 약 0.9% w:v, 약 1.0% w:v, 약 1.1% w:v, 약 1.2% w:v, 약 1.3% w:v, 약 1.4% w:v, 약 1.5% w:v, 약 1.6% w:v, 약 1.7% w:v, 약 1.8% w:v, 약 1.9% w:v, 약 2.0% w:v, 약 2.1% w:v, 약 2.2% w:v, 약 2.3% w:v, 약 2.4% w:v, 약 2.5% w:v, 약 2.6% w:v, 약 2.7% w:v, 약 2.8% w:v, 약 2.9% w:v 및 약 3.0% w:v로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 조성물.
  23. 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 조건화된 세포 배지가 생체 적합성 조성물 부피의 약 50%인 조성물.
  24. (a) 세포 배양 배지에서 세포를 배양하는 단계;
    (b) 세포 배양 배지에서 세포에 의해 합성되고 상기 세포로부터 분비된 하나 이상의 작용제로 조건화된 세포 배양 배지로부터 배양된 세포를 분리하여 조건화된 세포 배지를 생성하는 단계; 및
    (c) 조건화된 세포 배지를 생체 적합성 중합체 매트릭스와 혼합하는 단계
    를 포함하는, 생체 적합성 조성물을 생성하는 방법.
  25. 제24항에 있어서, 세포가 섬유모세포인 방법.
  26. 제25항에 있어서, 섬유모세포가 피부 섬유모세포인 방법.
  27. 제26항에 있어서, 피부 섬유모세포가 신생아 피부 섬유모세포인 방법.
  28. 제25항에 있어서, 세포가 골모세포인 방법.
  29. 제24항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 세포가 섬유모세포 및 골모세포인 방법.
  30. 제24항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 세포가 섬유모세포 및 골모세포의 공동 배양물인 방법.
  31. 제24항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 세포가 활발히 증식하는 세포인 방법.
  32. 제24항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 세포 배양 배지가 기저 세포 배양 배지를 포함하고, 태아 소 혈청(FBS), L-글루타민, 인간 표피 성장 인자(EGF), 염기성 섬유모세포 성장 인자(bFGF) 및 아스코르브산으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 보충제를 추가로 포함하는 것인 방법.
  33. 제32항에 있어서, 기저 세포 배양 배지가 둘베코 변형 이글 배지(DMEM)인 방법.
  34. 제32항 또는 제33항에 있어서, 보충제가 재조합 성장 인자인 방법.
  35. 제34항에 있어서, 재조합 성장 인자가 인간 재조합 성장 인자인 방법.
  36. 제24항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 작용제가 성장 인자를 포함하는 것인 방법.
  37. 제24항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 작용제가 혈소판 유래 성장 인자(PDGF), 표피 성장 인자(EGF), 섬유모세포 성장 인자(FGF), 염기성 섬유모세포 성장 인자(bFGF), 혈관 내피 성장 인자(VEGF), 각질세포 성장 인자(KGF), 전환 성장 인자 알파(TGFα), 전환 성장 인자 베타(TGFβ), 전환 성장 인자 베타-1(TGFβ1), 전환 성장 인자 베타-2(TGFβ2), 인슐린 유사 성장 인자(IGF), 신경 성장 인자(NGF), 간세포 성장 인자(HGF), 인슐린, 히드로코르티손, 유로가스트론, 혈소판 유래 상처 치유 인자(PDWHF), 뇌 유래 신경 영양 인자(BDNF), 혈소판 인자 IV(PF IV), 종양 괴사 인자(TF), 과립구 콜로니 자극 인자(GCSF), 콜로니 자극 인자(CSF), 골 형태 형성 단백질(BMP), 오스테오칼신, 오스테오폰틴, 인터류킨-1, 인터류킨-6, 인터류킨-8(IL-8), 인터류킨-11 및 성장 분화 인자(GDF), 또는 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  38. 제24항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 세포 배양 배지에서 배양된 하나 이상의 세포에 의해 합성되고 상기 세포로부터 분비된 하나 이상의 작용제가 배양 전의 세포 배양 배지 내의 농도와 비교하여 약 적어도 2배, 약 3배, 약 4배, 약 5배, 약 6배, 약 7배, 약 8배, 약 9배, 약 10배, 약 11배, 약 12배, 약 13배, 약 14배, 약 15배, 약 16배, 약 17배, 약 18배, 약 19배, 약 20배, 약 25배, 약 30배, 약 40배, 약 50배, 약 60배, 약 70배, 약 80배, 약 90배 및 약 100배의 증가로 이루어진 군으로부터 선택되는 농도로 조건화된 배지에 존재하는 것인 방법.
  39. 제24항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 세포가 세포 배양 배지에서 적어도 24시간 동안, 경우에 따라 적어도 48시간 동안 또는 적어도 72시간 동안 배양되는 것인 방법.
  40. 제24항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 생체 적합성 조성물이 세포를 포함하지 않는 것인 방법.
  41. 제24항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 조건화된 세포 배지가 조건화된 세포 배지를 생체 적합성 중합체 매트릭스와 혼합하기 전에 농축되고, 경우에 따라, 조건화된 세포 배지가 접선 유동 여과에 의해 농축되는 것인 방법.
  42. 제24항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 중합체 매트릭스가 아가로스인 방법.
  43. 제42항에 있어서, 아가로스가 해초로부터 유래되는 것인 방법.
  44. 제42항 또는 제43항에 있어서, 아가로스가 저 융점 아가로스 또는 초저 융점 아가로스인 방법.
  45. 제42항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, 아가로스가 약 0.8% 내지 3.0% 중량 대 부피(w:v), 약 0.9% w:v, 약 1.0% w:v, 약 1.1% w:v, 약 1.2% w:v, 약 1.3% w:v, 약 1.4% w:v, 약 1.5% w:v, 약 1.6% w:v, 약 1.7% w:v, 약 1.8% w:v, 약 1.9% w:v, 약 2.0% w:v, 약 2.1% w:v, 약 2.2% w:v, 약 2.3% w:v, 약 2.4% w:v, 약 2.5% w:v, 약 2.6% w:v, 약 2.7% w:v, 약 2.8% w:v, 약 2.9% w:v 및 약 3.0% w:v로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  46. 제24항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, 조건화된 세포 배지가 생체 적합성 조성물 부피의 약 50%로 존재하는 것인 방법.
  47. 약제학적 제제의 제조에 있어서의 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항의 생체 적합성 조성물의 용도로서, 경우에 따라 상기 약제학적 제제는 국소 적용되는 치주 치료제인 용도.
  48. 대상체에서 골을 성장시키거나 또는 골 흡수를 억제하는 방법으로서, 상기 방법은 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항의 생체 적합성 조성물의 유효량을 대상체에서의 골 성장 및/또는 골 흡수 억제를 필요로 하는 부위에 투여하는 단계를 포함하고, 경우에 따라, 상기 방법은 골 성장 및/또는 골 흡수 억제 부위에서의 새로운 골 성장의 총 골유착, 수직 골유착 및/또는 측방 골유착을 향상시키는 것인 방법.
  49. 제48항에 있어서, 대상체가 골절, 골 결핍, 전이성 골 질환, 골관절염, 골다공증 및/또는 골용해성 골 질환을 갖는 것인 방법.
  50. 대상체에서 치주 병태를 치료하는 방법으로서, 상기 방법은 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항의 생체 적합성 조성물의 유효량을 대상체에서의 a) 잇몸 및/또는 골 성장 및/또는 b) 잇몸 침식 및/또는 골 흡수 억제를 필요로 하는 치주 부위에 투여하는 단계를 포함하고, 경우에 따라, 상기 방법은 치주 부위에서의 새로운 골 성장의 총 골유착, 수직 골유착 및/또는 측방 골유착을 향상시키는 것인 방법.
  51. 제50항에 있어서, 대상체가 치주 질환, 잇몸 염증, 충치, 잇몸 질환, 치은염 및/또는 치주염을 갖는 것인 방법.
  52. 제48항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서, 골 질량이 유지 또는 증가되거나, 골 밀도가 유지 또는 증가되거나, 잇몸 조직이 유지 또는 증가되거나, 또는 이들의 임의의 조합인 방법.
  53. 제48항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서, a) 잇몸 및/또는 골 성장을 촉진하고/하거나, b) 잇몸 침식 및/또는 골 흡수를 억제하는 유효량의 치료제를 대상체에게 투여하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  54. 제53항에 있어서, 상기 생체 적합성 조성물의 투여와 상기 치료제의 투여가 순차적 또는 동시적인 방법.
  55. 제53항 또는 제54항에 있어서, 상기 치료제가 골 형태 형성 인자, 항흡수제, 골 형성 인자, 연골 유래 형태 형성 단백질, 성장 호르몬, 에스트로겐, 비스포스포네이트, 스타틴, 분화 인자, 진통제, 마취제, 항미생물제, 항박테리아제, 항바이러스제, 항진균제, 항생제, 항염증제, 항산화제, 방부제, 면역 자극제 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  56. 제48항 내지 제55항 중 어느 한 항에 있어서, 생체 적합성 조성물이 부위에 국소 투여되는 것인 방법.
  57. 제56항에 있어서, 국소 투여가 상처 드레싱, 외과적 폐쇄, 스테이플링, 접착 스트립, 생체 접착제 또는 잇몸 플랩으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  58. 제48항 내지 제57항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체가 포유동물인 방법.
  59. 제58항에 있어서, 포유동물이 인간, 고양이, 개, 말 또는 설치류인 방법.
  60. 제58항에 있어서, 포유동물이 치주의 a) 잇몸 및/또는 골 성장 및/또는 b) 잇몸 침식 및/또는 골 흡수 억제를 필요로 하는 장애의 동물 모델인 방법.
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