KR20200013691A - 나노포어 시퀀서 - Google Patents

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제프리 에스. 피셔
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량량 치앙
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Abstract

예시적 나노포어 시퀀서는 시스 웰, 트랜스 웰, 및 시스 웰 및 트랜스 웰을 유체 흐름 가능하게 연결시키는 나노포어를 포함한다. 하나의 예시적인 시퀀서에서, 개질된 전해질(전해질 및 양이온 착화제를 포함함)은 시스 웰, 또는 트랜스 웰에, 또는 시스 웰 및 트랜스 웰에 존재한다. 다른 예시적 시퀀서에서, 겔 상태 다가전해질은 시스 웰, 또는 트랜스 웰에, 또는 시스 웰 및 트랜스 웰에 존재한다.

Description

나노포어 시퀀서
관련된 출원에 대한 상호 참고
본 출원은 2017년 6월 20일자로 출원된 미국 가출원 제62/522,628호의 이익을 주장하며, 이러한 기초출원의 내용은 전문이 본 명세서에 참고로 원용된다.
다양한 폴리뉴클레오타이드 시퀀싱 기술(sequencing technique)은 국소 지지 표면 상에서 또는 사전규정된 반응 챔버 내에서 다수의 제어된 반응을 수행하는 것을 포함한다. 명시된 반응들은 이후에 관찰되거나 검출될 수 있으며, 후속 분석은 반응에서 수반된 폴리뉴클레오타이드의 성질을 식별하거나 밝히는 데 도움을 줄 수 있다. 이온성 전류를 위한 채널을 제공할 수 있는 나노포어(nanopore)를 사용하는 다른 폴리뉴클레오타이드 시퀀싱 기술이 개발되었다. 폴리뉴클레오타이드는 나노포어를 통해 유도되며, 폴리뉴클레오타이드가 나노포어를 통해 진행할 때, 이는 나노포어를 통해 전류를 방해한다. 각 진행하는 뉴클레오타이드, 또는 일련의 뉴클레오타이드는 특징적인 전류를 산출하며, 전류 수준의 기록은 폴리뉴클레오타이드의 서열에 해당한다.
본 명세서에 개시되는 나노포어 시퀀서(nanopore sequencer)의 일례는 시스 웰(cis well); 트랜스 웰(trans well); 시스 웰 및 트랜스 웰을 유체 흐름 가능하게 연결시키는 나노포어; 및 시스 웰, 또는 트랜스 웰, 또는 시스 웰 및 트랜스 웰에서의, 전해질 및 양이온 착화제(cation complexing agent)를 포함하는 개질된 전해질을 포함한다.
본 명세서에 개시된 나노포어 시퀀서의 다른 예는 시스 웰; 트랜스 웰; 시스 웰 및 트랜스 웰을 유체 흐름 가능하게 연결시키는 나노포어; 및 시스 웰, 또는 트랜스 웰, 또는 시스 웰 및 트랜스 웰에서의 겔 상태의 다가전해질(polyelectrolyte)을 포함한다.
나노포어 시퀀서의 또 다른 예는 시스 웰; 트랜스 웰; 시스 웰 및 트랜스 웰을 유체 흐름 가능하게 연결시키는 나노포어; 시스 웰과 관련된 시스 웰 전극 구조(cis well electrode structure)로서, 제1 베이스 전극 및 제1 베이스 전극에 고정된 레독스 고형물을 포함하는 시스 웰 전극 구조; 트랜스 웰과 관련된 트랜스 웰 전극 구조로서, 제2 베이스 전극 및 제2 베이스 전극에 고정된 레독스 고형물을 포함하는 트랜스 웰 전극 구조; 및 제1 전극 구조 및 제2 전극 구조에서 개개 레독스 반응에 응하여 소모되거나 방출되는 양이온을 포함하는 전해질을 포함한다.
본 개시내용의 예의 특징들은 하기 상세한 설명 및 도면을 참고로 하여 명백하게 될 것이며, 여기서, 유사한 참조 번호는 유사하지만 아마도 동일하지 않은 구성요소에 해당한다. 간결성을 위하여, 이전에 기술된 기능을 갖는 참조 번호 또는 특징부는 이러한 것을 나타내는 다른 도면과 관련하여 기술될 수 있거나 기술되지 않을 수 있다.
도 1은 본 명세서에 개시된 나노포어 시퀀서의 일례의 개략적 및 부분 단면도;
도 2는 본 명세서에 개시된 나노포어 시퀀서의 다른 예의 개략적 및 부분 단면도;
도 3은 본 명세서에 개시된 방법의 2가지 예를 예시한 흐름도로서, 하나는 도 1의 나노포어 시퀀서를 수반하며, 다른 하나는 도 2의 나노포어 시퀀서를 수반함;
도 4는 본 명세서에 개시된 나노포어 시퀀서의 또 다른 예의 개략적 및 부분 단면도;
도 5는 도 4의 나노포어 시퀀서를 수반하는 본 명세서에 개시된 방법의 다른 예를 예시한 흐름도;
도 6a, 도 6b 및 도 6c는 a) 크라운 에터가 첨가되지 않은 2개의 나노포어 시퀀서(1, 2), b) 크라운 에터가 첨가되지 않은 나노포어 시퀀서(2) 및 시스 웰 및 트랜스 웰 둘 다에 크라운 에터가 첨가된 나노포어 시퀀서(2), 및 c) 크라운 에터가 첨가되지 않은 나노포어 시퀀서(2) 및 시스 챔버로부터 크라운 에터가 관류된 후 도 6b로부터의 나노포어 시퀀서(2)에 대한 전류(i. pA) 대 전압(V)을 예시한 그래프;
도 7a는 크라운 에터가 첨가되지 않은 단일 마이코박테륨 스메그마티스 포린 A(Mycobacterium smegmatis porin A; MspA) 포어를 통한 헤어핀 전위에 대한 이온 전류(pA) 대 시간(㎳)을 예시한 그래프;
도 7b는 도 7a에 나타낸 데이터의 막대그래프(계수치 대 진폭);
도 8a는 크라운 에터가 첨가된 단일 MspA 포어를 통한 헤어핀 전위에 대한 이온 전류(pA) 대 시간(㎳)을 예시한 그래프; 및
도 8b는 도 8a에 나타낸 데이터의 막대그래프(계수치 대 진폭).
도입부
제1 양태에서, 나노포어 시퀀서는 시스 웰; 트랜스 웰; 시스 웰 및 트랜스 웰을 유체 흐름 가능하게 연결시키는 나노포어; 및 시스 웰, 또는 트랜스 웰, 또는 시스 웰 및 트랜스 웰에서의, 전해질 및 양이온 착화제를 포함하는 개질된 전해질을 포함한다.
이러한 제1 양태의 일례에서, 개질된 전해질은 시스 웰에 존재하며, 나노포어 시퀀서는 트랜스 웰에 비-개질된 전해질을 더 포함하며, 비-개질된 전해질은 양이온 착화제 없이 전해질을 포함하거나; 개질된 전해질은 트랜스 웰에 존재하며, 나노포어 시퀀서는 시스 웰에 비-개질된 전해질을 더 포함하며, 비-개질된 전해질은 양이온 착화제 없이 전해질을 포함한다.
이러한 제1 양태의 다른 예에서, 나노포어 시퀀서는 기판에 규정된 복수의 트랜스 웰을 더 포함하며, 이들 각각은 개개 나노포어에 의해 시스 웰에 유체 흐름 가능하게 연결되며, 여기서, 복수의 트랜스 웰의 밀도는 기판 1 ㎟당 약 10개의 트랜스 웰 내지 기판 1 ㎟당 약 1,000,000개의 트랜스 웰의 범위이다.
이러한 제1 양태의 또 다른 예에서, 전해질은 칼륨 양이온 및 관련된 음이온, 나트륨 양이온 및 관련된 음이온, 또는 이들의 조합을 포함하며; 양이온 착화제는 크라운 에터, 칼릭사렌(calixarene) 및 발리노마이신(valinomycin)으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
이러한 제1 양태의 또 다른 예에서, 개질된 전해질은 0mM 초과 내지 약 500mM의 양이온 착화제를 포함한다.
나노포어 시퀀서의 이러한 제1 양태의 임의의 특징들이 임의의 요망되는 방식 및/또는 구성에서 함께 결합될 수 있는 것으로 이해되어야 한다.
제2 양태에서, 나노포어 시퀀서는 시스 웰; 트랜스 웰; 시스 웰 및 트랜스 웰을 유체 흐름 가능하게 연결시키는 나노포어; 및 시스 웰, 또는 트랜스 웰, 또는 시스 웰 및 트랜스 웰에서의 겔 상태의 다가전해질을 포함한다.
이러한 제2 양태의 일례에서, 다가전해질은 시스 웰에 존재하며, 나노포어 시퀀서는 트랜스 웰에 전해질을 더 포함하거나; 다가전해질은 트랜스 웰에 존재하며, 나노포어 시퀀서는 시스 웰에 전해질을 더 포함한다. 일례에서, 다가전해질은 폴리다이알릴디메틸암모늄 클로라이드, 이온 형태의 폴리에틸렌이민, 이온 형태의 선형 폴리에틸렌이민, 폴리(알릴아민 하이드로클로라이드), 및 이온 형태의 폴리(4-비닐피리딘)으로 이루어진 군으로부터 선택되며; 전해질은 칼륨 양이온 및 관련된 음이온, 나트륨 양이온 및 관련된 음이온, 또는 이들의 조합을 포함한다.
이러한 제2 양태의 다른 예에서, 나노포어 시퀀서는 기판에 규정된 복수의 트랜스 웰을 더 포함하며, 이들 각각은 개개 나노포어에 의해 시스 웰에 유체 흐름 가능하게 연결되며, 여기서, 복수의 트랜스 웰의 밀도는 기판 1 ㎟당 약 10개의 트랜스 웰 내지 기판 1 ㎟당 약 1,000,000개의 트랜스 웰의 범위이다.
이러한 제2 양태의 또 다른 예에서, 다가전해질은 시스 웰 및 트랜스 웰 둘 다에 존재하며; 다가전해질은 폴리다이알릴디메틸암모늄 클로라이드, 이온 형태의 폴리에틸렌이민, 이온 형태의 선형 폴리에틸렌이민, 폴리(알릴아민 하이드로클로라이드), 및 이온 형태의 폴리(4-비닐피리딘)으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
나노포어 시퀀서의 제2 양태의 임의의 특징들이 임의의 요망되는 방식으로 함께 결합될 수 있는 것으로 이해되어야 한다. 또한, 나노포어 시퀀서의 제1 양태 및/또는 나노포어 시퀀서의 제2 양태의 특징들의 임의의 결합이 함께 사용될 수 있고/있거나, 이러한 양태들 중 어느 하나 또는 둘 다로부터의 임의의 특징들이 본 명세서에 개시된 임의의 예와 결합될 수 있는 것으로 이해되어야 한다.
제3 양태에서, 나노포어 시퀀서는 시스 웰; 트랜스 웰; 시스 웰 및 트랜스 웰을 유체 흐름 가능하게 연결시키는 나노포어; 시스 웰과 관련된 시스 웰 전극 구조로서, 제1 베이스 전극 및 제1 베이스 전극에 고정된 레독스 고형물을 포함하는 시스 웰 전극 구조; 트랜스 웰과 관련된 트랜스 웰 전극 구조로서, 제2 베이스 전극 및 제2 베이스 전극에 고정된 레독스 고형물을 포함하는 트랜스 웰 전극 구조; 및 시스 웰 전극 구조 및 트랜스 웰 전극 구조에서 개개 레독스 반응에 응하여 소모되거나 방출되는 양이온을 포함하는 전해질을 포함한다.
이러한 제3 양태의 일례에서, 레독스 고형물은 테트라사이아노퀴노다이메탄(TCNQ), 프러시안 블루 및 폴리피롤로 이루어진 군으로부터 선택된다.
이러한 제3 양태의 다른 예에서, 제1 베이스 전극 및 제2 베이스 전극은 흑연, 백금, 금, 은, 구리, 탄소 섬유, 다이아몬드 및 팔라듐으로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된다.
나노포어 시퀀서의 제3 양태의 임의의 특징들이 임의의 요망되는 방식으로 함께 결합될 수 있는 것으로 이해되어야 한다. 또한, 나노포어 시퀀서의 제3 양태 및/또는 나노포어 시퀀서의 제2 양태 및/또는 나노포어 시퀀서의 제1 양태의 특징들의 임의의 결합이 함께 사용될 수 있고/있거나 이러한 양태들 중 임의의 하나 이상으로부터의 임의의 특징들이 본 명세서에 개시된 임의의 예와 결합될 수 있는 것으로 이해되어야 한다.
제4 양태에서, 제1 양태에 따른 나노포어 시퀀서를 사용하는 방법은 나노포어 시퀀서의 시스 웰과 나노포어 시퀀서의 트랜스 웰 사이에 약 -1V 내지 약 1V의 범위의 전압 바이어스(voltage bias)를 인가함으로써 나노포어 시퀀서에서 전해질의 레독스 시약의 고갈을 조절하는 것을 포함한다.
이러한 제4 양태의 일례에서, 본 방법은 나노포어 시퀀서에, 시스 웰에서의 개질된 전해질을, 트랜스 웰에서의 양이온 착화제 없는 전해질을, 또는 트랜스 웰에 개질된 전해질 및 시스 웰에서의 양이온 착화제 없는 전해질을 제공하는 것을 더 포함한다.
이러한 제4 양태의 다른 예에서, 본 방법은 개질된 전해질을 형성하기 위해 전해질 내에 양이온 착화제를 도입하고; 시스 웰, 또는 트랜스 웰, 또는 시스 웰 및 트랜스 웰에 개질된 전해질을 도입하는 것을 더 포함한다.
이러한 제4 양태의 또 다른 예에서, 전해질은 칼륨 양이온 및 관련된 음이온, 나트륨 음이온 및 관련된 음이온, 또는 이들의 조합을 포함하며; 양이온 착화제는 크라운 에터, 칼릭사렌, 및 발리노마이신으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 방법의 제4 양태의 임의의 특징들이 임의의 요망되는 방식으로 함께 결합될 수 있는 것으로 이해되어야 한다. 또한, 본 방법의 제4 양태 및/또는 나노포어 시퀀서의 제3 양태 및/또는 나노포어 시퀀서의 제2 양태 및/또는 나노포어 시퀀서의 제1 양태의 특징들의 임의의 결합이 함께 사용될 수 있고/있거나 이러한 양태들 중 임의의 하나 이상으로부터의 임의의 특징들이 본 명세서에 개시된 임의의 예와 결합될 수 있는 것으로 이해되어야 한다.
제5 양태에서, 제2 양태에 따른 나노포어 시퀀서를 사용하는 방법은 나노포어 시퀀서의 시스 웰과 나노포어 시퀀서의 트랜스 웰 사이에 약 -1V 내지 약 1V의 범위의 전압 바이어스를 인가함으로써 나노포어 시퀀서에서 다가전해질의 레독스 시약의 고갈을 조절하는 것을 포함한다.
본 방법의 제5 양태의 임의의 특징들이 임의의 요망되는 방식으로 함께 결합될 수 있는 것으로 이해되어야 한다. 또한, 본 방법의 제5 양태 및/또는 본 방법의 제4 양태 및/또는 나노포어 시퀀서의 제3 양태 및/또는 나노포어 시퀀서의 제2 양태 및/또는 나노포어 시퀀서의 제1 양태의 특징들의 임의의 결합이 함께 사용될 수 있고/있거나 이러한 양태들 중 임의의 하나 이상으로부터의 임의의 특징들이 본 명세서에 개시된 임의의 예와 결합될 수 있는 것으로 이해되어야 한다.
제6 양태에서, 제3 양태에 따른 나노포어 시퀀서를 사용하는 방법은 시스 웰 전극 구조에 제1 전압을 인가하여, 나노포어 시퀀서에서 전해질의 양이온을 소모하는 캐소드 반응(cathodic reaction)을 개시하고; 트랜스 웰 전극 구조에 제2 전압을 인가하여, 전해질의 양이온을 방출시키는 애노드 반응(anodic reaction)을 개시함으로써, 나노포어 시퀀서에서 전해질의 레독스 시약의 고갈을 조절하는 것을 포함한다.
제6 양태의 일례에서, 레독스 고형물은 테트라사이아노퀴노다이메탄(TCNQ), 프러시안 블루 및 폴리피롤로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 방법의 제6 양태의 임의의 특징들이 임의의 요망되는 방식으로 함께 결합될 수 있는 것으로 이해되어야 한다. 또한, 본 방법의 제6 양태 및/또는 본 방법의 제5 양태 및/또는 본 방법의 제4 양태 및/또는 나노포어 시퀀서의 제3 양태 및/또는 나노포어 시퀀서의 제2 양태 및/또는 나노포어 시퀀서의 제1 양태의 특징들의 임의의 결합이 함께 사용될 수 있고/있거나 이러한 양태들 중 임의의 하나 이상으로부터의 임의의 특징들이 본 명세서에 개시된 임의의 예와 결합될 수 있는 것으로 이해되어야 한다.
상세한 설명
나노포어 시퀀싱의 기술은 뉴클레오타이드 염기를 구별하기 위해 전류의 변화를 사용한다. 나노포어 시퀀서에서, 하나의 전해질 레독스 시약은 시스템을 통해 패러데이 전류(Faradaic current)를 지지하기 위해 트랜스 웰(또는 챔버) 전극 상에서 일부 소모될 수 있다. 일부 소모된 전해질 레독스 시약은 부분적으로, 나노포어(들)를 통한 이온 수송 억제로 인해 상응하는 시스 웰 전극 상에 효율적으로 보충되지 않을 수 있다. 예를 들어, 클로라이드 음이온은 도금으로 인해 트랜스 측면 상에서 일부 고갈될 수 있고, 시스 측면 상에서 완전히 보충되지 않을 수 있다. 농도 구배는 전해질 레독스 시약(예를 들어, 양이온 및 음이온) 둘 다에 대해 전개되며, 새로운 평형상태는 트랜스 측면 상에서의 훨씬 낮은 농도의 일부 고갈된 시약에서 확립된다. 나노포어를 통한 전해질 레독스 시약 수송 대 트랜스 전극 상의 시약들 중 하나의 일부 소모의 불균형은 전류 드리프트(current drift)를 야기시킬 수 있으며, 이는 뉴클레오타이드 염기들 간을 구별하는 능력에 해로운 영향을 미칠 수 있다.
전해질 레독스 시약의 일부 소모는 전해질 레독스 시약의 출발 농도, 나노포어를 통해 진행하는 전류, 및 트랜스 챔버의 크기(예를 들어, 더 큰 챔버는 일반적으로 더 작은 시약 소모와 관련이 있으며, 더 작은 챔버는 일반적으로 더 큰 시약 소모와 관련이 있음)를 포함하는 여러 인자에 의존한다.
일부 소모는 초기 시약 농도의 감소에 의해 입증될 수 있으며, 여기서, 이러한 감소는 10배보다 크다. 일부 경우에, 이러한 감소는 20배 내지 100배의 범위이다. 예를 들어, 10㎛ 트랜스 웰에서 약 300mM의 초기 클로라이드 농도를 갖는 전해질 중 클로라이드 농도는 약 10mM까지 고갈될 수 있으며, 이에 따라, 초기 농도는 약 30배 감소된다. 다른 예에 대하여, 10㎛ 트랜스 웰에서 약 10mM의 초기 클로라이드 농도를 갖는 전해질의 클로라이드 농도는 약 0.1mM까지 고갈될 수 있으며, 이에 따라, 초기 농도는 약 100배 감소된다. 일부 소모/고갈이 100%에 도달할 수 있지만(즉, 시스템에 잔류하는 전해질 레독스 시약은 0%에 도달함), 일부 소모된 시약의 이러한 낮은 수준에서도 전해질 레독스 시약들 간에 평형상태가 확립될 것으로 이해되어야 한다.
본 명세서에 개시된 나노포어 시퀀서 및 방법의 예는 시퀀서의 트랜스 웰(또는 챔버) 전극(들)에서 전해질 레독스 시약(들)의 일부 소모 또는 고갈을 효과적으로 감소시킨다. 본 명세서에 개시된 예에서, 초기 시약 농도의 감소는 여전히 일어날 수 있다. 그러나, 이러한 감소는 10% 미만이고, 1% 미만일 수 있다. 이와 같이, 더 많은 시약이 (예를 들어, 상기 제공된 예와 비교하여) 시간에 따라 존재하며, 이에 따라, 시약의 소모 또는 고갈이 감소된다. 일부 예는 시퀀서의 나노포어(들)를 통해 전기화학적 패시브 종(electrochemically passive species)(예를 들어, 전해질 양이온)의 확산을 완화시킴으로써 일부 전해질 레독스 시약 소모/고갈을 감소시킨다. 일부 예에서, 전기화학적 패시브 종은 전해질 양이온이다. 양이온의 확산을 완화시키는 것은 전하가 오로지 전해질의 음이온에 의해 운반될 수 있게 한다. (음이온 및 양이온 둘 다에 의해 운반되는 전하와는 상반되게) 전하 운반체로서 오로지 음이온을 사용함으로써, 음이온 공급과 음이온 소모 간의 임의의 전하 불균형은 적어도 감소된다. 결과적으로, 나노포어 시퀀서의 트랜스 웰(들)로부터의 음이온 고갈은 또한 감소된다. 다른 예는 적어도, 음이온을 소모하지 않는 전극 시스템을 도입함으로써 전해질 음이온 소모/고갈을 감소시키지만, 오히려 하나의 전극에서 전해질 양이온을 생성시키고 다른 전극에서 동일한 전해질 양이온을 소모한다.
상기에 언급된 바와 같이, 나노포어 시퀀싱의 기술은 뉴클레오타이드 염기를 구별하기 위해 전류의 변화를 이용한다. 전해질 종의 고갈은 전류의 고갈(또는 요망되지 않는 이동)을 야기시키는데, 이는 뉴클레오타이드 염기에 대한 정확한 전류 판독(current reading)을 얻는 능력에 악영향을 미친다. 트랜스 전극에서 나노포어를 통한 이온 종 수송과 그러한 종의 소모를 균형있게 함으로써, 전류 드리프트는 완화될 수 있으며, 전해질, 트랜스 전극, 및 트랜스 웰의 수명이 증가될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어가 달리 기술하지 않는 한 관련 분야에서 이의 일반적인 의미를 가질 것으로 이해되어야 한다. 본 명세서에서 사용되는 여러 용어 및 이의 의미는 하기에 기술된다.
단수 형태("a", "an", 및 "the")는 문맥이 달리 명확하게 지시하지 않는 한 복수의 지시대상을 포함한다.
용어 포함하는(comprising, including), 함유하는(containing) 및 이러한 형태의 다양한 형태는 서로 동의어이고, 동일하게 넓은 의미를 갖는다. 또한, 반대로 명백하게 기술하지 않는 한, 특정 성질을 갖는 구성요소 또는 복수의 구성요소를 포함하는(comprising, including) 또는 이를 갖는 예는 추가적인 구성요소들이 그러한 성질을 갖는 지의 여부와는 무관하게, 추가적인 구성요소를 포함할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "유체 흐름 가능하게 연결하는(fluidically connecting)", "유체 소통(fluid communication)", "유체 흐름 가능하게 결합된(fluidically coupled)" 등은 액체 또는 가스가 2개의 공간적 영역들 사이에서 흐를 수 있게 하는, 2개의 공간적 영역이 함께 연결된 것을 지칭한다. 예를 들어, 시스 웰은, 전해질의 적어도 일부분이 연결된 웰들 사이에 자유롭게 흐를 수 있도록, 트랜스 웰 또는 복수의 트랜스 웰에 유체 흐름 가능하게 연결될 수 있다. 2개의 공간적 영역은 나노포어를 통해 또는 하나 이상의 밸브, 제한기(restrictor), 또는 시스템을 통한 유체의 흐름을 제어하거나 조절하는 다른 유체 부품을 통해 유체 소통될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "틈새 영역(interstitial region)"은 기판/고체 지지체 또는 멤브레인, 또는 지지체 또는 멤브레인에서의 구역, 또는 표면과 관련된 다른 구역들, 영역들, 피처(feature)들을 분리시키는 표면 상의 구역을 지칭한다. 예를 들어, 멤브레인의 틈새 영역은 어레이의 다른 나노포어로부터 어레이의 하나의 나노포어를 분리시킬 수 있다. 다른 예에 대하여, 기판의 틈새 영역은 다른 트랜스 웰로부터 하나의 트랜스 웰을 분리시킬 수 있다. 서로 분리되는 2개의 구역은 개별적일 수 있으며, 즉, 서로 물리적으로 접촉하지 않을 수 있다. 여러 예에서, 예를 들어, 달리 연속적인 멤브레인에서 규정된 복수의 나노포어에 대한 경우 또는 달리 연속적인 지지체에서 규정된 복수의 웰에 대한 경우와 같이, 틈새 영역은 연속적인 반면 구역들은 개별적이다. 틈새 영역에 의해 제공된 분리는 일부 또는 완전 분리일 수 있다. 틈새 영역은 표면에 규정된 피처의 표면 물질과는 다른 표면 물질을 가질 수 있다. 예를 들어, 틈새 영역에서의 표면 물질은 지질 물질일 수 있으며, 지질 물질에 형성된 나노포어는 틈새 영액에 존재하는 양 또는 농도를 초과하는 폴리펩타이드의 양 또는 농도를 가질 수 있다. 일부 예에서, 폴리펩타이드는 틈새 영역에 존재하지 않을 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "멤브레인"은 여기에 동일한 조성물 또는 상이한 조성물을 함유할 수 있는 2개의 액체/겔 챔버(예를 들어, 시스 웰 및 트랜스 웰)를 분리시키는 비-투과성 또는 반-투과성 배리어 또는 다른 시트를 지칭한다. 임의의 제공된 종에 대한 멤브레인의 투과성은 멤브레인의 특성에 의존적이다. 일부 예에서, 멤브레인은 이온, 전류, 및/또는 유체에 대해 비-투과성일 수 있다. 예를 들어, 지질 멤브레인은 이온에 대해 불투과성일 수 있지만(즉, 이를 통해 어떠한 이온 수송이 가능하지 않음), 물에 대해 적어도 일부 투과성일 수 있다(예를 들어, 물 확산성은 약 40㎛/s 내지 약 100㎛/s의 범위임). 다른 예에 대하여, 고체 상태 멤브레인, 예를 들어, 실리콘 니트라이드는 이온, 전기 전하, 및 유체에 불투과성일 수 있다(즉, 이러한 모든 종의 확산은 0임). 임의의 멤브레인은, 멤브레인이 멤브레인관통 나노포어 개구를 포함할 수 있고, 멤브레인을 가로지르는 전위차를 유지시킬 수 있는 한, 본 개시내용에 따라 사용될 수 있다. 멤브레인은 단층 또는 다층 멤브레인일 수 있다. 다층 멤브레인은 여러 층을 포함하며, 이들 각각은 비-투과성 또는 반-투과성 물질이다.
멤브레인은 생물학적 또는 비-생물학적 기원의 물질로 형성될 수 있다. 생물학적 기원의 물질은 생물학적 환경, 예를 들어, 유기체 또는 세포, 또는 합성적으로 제작된 버젼(version)의 생물학적으로 입수 가능한 구조물로부터 유래되거나 이로부터 단리된 물질을 지칭한다.
생물학적 기원의 물질로부터 제조된 예시적인 멤브레인은 볼라지질(bolalipid)에 의해 형성된 단일층을 포함한다. 생물학적 기원의 물질로부터 제조된 다른 예시적인 멤브레인은 지질 이중층을 포함한다. 적합한 지질 이중층은 예를 들어, 세포의 멤브레인, 소기관의 멤브레인, 리포솜, 평면 지질 이중층, 및 지지된 지질 이중층을 포함한다. 지질 이중층은 예를 들어, 인지질의 2개의 마주하는 층으로부터 형성될 수 있으며, 이는 소수성 내부를 형성하기 위해 이의 소수성 테일 기가 서로에 대해 대면하도록 배열되며, 지질의 친수성 헤드 기는 이중층의 각 측면 상에 수성 환경에 대해 외측으로 대면한다. 지질 이중층은 또한, 예를 들어, 지질 단일층이 계면에 대해 수직인 천공의 어느 한 측면을 지나 수용액/공기 계면 상에서 운반되는 방법에 의해, 형성될 수 있다. 지질은 먼저, 이를 유기 용매에 용해시키고 이후에 한 방울의 용매를 천공의 어느 한 측면 상에 수용액의 표면 상에서 증발시킴으로써 전해질 수용액의 표면에 일반적으로 첨가된다. 유기 용매가 적어도 일부 증발된 직후에, 천공의 어느 한 측면 상의 용액/공기 계면은 이중층이 형성될 때까지 천공을 지나 물리적으로 위 및 아래로 이동된다. 이중층 형성의 다른 적합한 방법은 리포솜 이중층의 팁-딥핑(tip-dipping), 페인팅 이중층, 및 패치-클램핑(patch-clamping)을 포함한다. 지질 이중층을 얻거나 생성하는 임의의 다른 방법이 또한 사용될 수 있다.
생물학적 기원이 아닌 물질은 또한, 멤브레인으로서 사용될 수 있다. 이러한 물질들 중 일부는 고체 상태 물질이고, 고체 상태 멤브레인을 형성할 수 있으며, 이러한 물질들 중 다른 것은 얇은 액체 필름 또는 멤브레인을 형성할 수 있다. 고체 상태 멤브레인은 단일층, 예를 들어, 지지 기판(즉, 고체 지지체) 상의 코팅 또는 필름, 또는 독립형 구성요소일 수 있다. 고체 상태 멤브레인은 또한, 샌드위치 구성의 다중층 물질의 복합물일 수 있다. 생물학적 기원이 아닌 임의의 물질은, 얻어진 멤브레인이 멤브레인관통 나노포어 개구를 포함할 수 있고, 멤브레인을 가로질러 전위차를 유지할 수 있는 한, 사용될 수 있다. 멤브레인은 유기 물질, 무기 물질, 또는 둘 다를 포함할 수 있다. 적합한 고체 상태 물질의 예는 예를 들어, 마이크로전자 물질, 절연 물질(예를 들어, 질화규소(Si3N4), 산화알루미늄(Al2O3), 및 산화규소(SiO)), 일부 유기 및 무기 폴리머(예를 들어, 폴리아미드, 플라스틱, 예를 들어, 폴리테트라플루오로에틸렌(PTFE), 또는 엘라스토머, 예를 들어, 2-성분 부가-경화 실리콘 고무), 및 유리를 포함한다. 또한, 고체 상태 멤브레인은 그래핀의 단일층으로부터 제조될 수 있으며, 이는 2차원 허니컴 격자(honeycomb lattice) 내에 조밀하게 패킹된 탄소 원자의 원자적으로 얇은 시트, 그래핀의 다중층, 또는 다른 고체 상태 물질의 하나 이상의 층과 혼합된 그래핀의 하나 이상의 층이다. 그래핀-함유 고체 상태 멤브레인은 그래핀 나노리본 또는 그래핀 나노갭인 적어도 하나의 그래핀 층을 포함할 수 있으며, 이는 타겟 폴리뉴클레오타이드를 특징분석하기 위한 전기적 센서로서 사용될 수 있다. 고체 상태 멤브레인은 임의의 적합한 방법에 의해 제조될 수 있다. 일례로서, 그래핀 멤브레인은 화학적 증기 증착(CVD) 또는 또는 흑연으로부터의 박리(exfoliation)를 통해 제조될 수 있다. 사용될 수 있는 적합한 얇은 액체 필름 물질의 예는 디블록 코폴리머, 트리블록 코폴리머, 예를 들어, 양쪽성 PMOXA-PDMS-PMOXA ABA 트리블록 코폴리머를 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "나노포어"는 이온, 전기 전류, 및/또는 유체가 멤브레인의 한 측면에서 멤브레인의 다른 측면으로 교차할 수 있게 하는 멤브레인으로부터 별개이고 이를 가로질러 연장하는 중공 구조물을 의미하는 것으로 의도된다. 예를 들어, 이온 또는 수용성 분자의 통과를 억제하는 멤브레인은 멤브레인의 한 측면에서 멤브레인의 다른 측면으로 이온 또는 수용성 분자의 통과를 허용하기 위해 멤브레인을 가로질러 연장하는 나노포어 구조물을 포함할 수 있다. 나노포어의 직경은 이의 길이에 따라(즉, 멤브레인의 하나의 측면으로부터 멤브레인의 다른 측면까지) 달라질 수 있지만, 임의의 포인트에서, 나노스케일이다(즉, 약 1㎚ 내지 약 100㎚). 나노포어의 예는 예를 들어, 생물학적 나노포어, 고체 상태 나노포어, 및 생물학적 및 고체 상태 하이브리드 나노포어를 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "생물학적 나노포어"는 이의 구조 부분이 생물학적 기원의 물질로부터 제조된 나노포어를 의미하는 것으로 의도된다. 생물학적 기원은 생물학적 환경, 예를 들어, 유기체 또는 세포, 또는 합성적으로 제작된 버젼의 생물학적으로 입수 가능한 구조물로부터 유래되거나 이로부터 단리된 물질을 지칭한다. 생물학적 나노포어는 예를 들어, 폴리펩타이드 나노포어 및 폴리뉴클레오타이드 나노포어를 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "폴리펩타이드 나노포어"는 멤브레인을 가로질러 연장하고, 멤브레인의 한 측면에서 멤브레인의 다른 측면으로 이온, 전기 전류, 및/또는 유체를 흐르게 할 수 있는 폴리펩타이드를 의미하는 것으로 의도된다. 폴리펩타이드 나노포어는 모노머, 호모폴리머, 또는 헤테로폴리머일 수 있다. 폴리펩타이드 나노포어의 구조는 예를 들어, α-나선 번들 나노포어 및 β-배럴 나노포어를 포함한다. 예시적인 폴리펩타이드 나노포어는 α-용혈소, 마이코박테륨 스메그마티스 포린 A(MspA), 그라미시딘 A, 말토포린, OmpF, OmpC, PhoE, Tsx, F-필루스 등을 포함한다. 마이코박테륨 스메그마티스 포린 A(MspA)는 미코박테리아에 의해 행성된 멤브레인 포린이며, 이는 친수성 분자가 박테리움에 진입할 수 있게 한다. MspA는 고블릿(goblet)과 닮고 중심 채널/포어를 함유한 긴밀하게 상호연결된 옥타머 및 멤브레인관통 베타-배럴을 형성한다.
폴리펩타이드 나노포어는 합성적일 수 있다. 합성 폴리펩타이드 나노포어는 자연에서 발생하지 않는 단백질-유사 아미노산 서열을 포함한다. 단백질-유사 아미노산 서열은 존재하는 것으로 알려져 있지만, 단백질을 기초를 형성하지 않는 아미노산의 일부(즉, 비-단백질생성 아미노산)를 포함할 수 있다. 단백질-유사 아미노산 서열은 유기체에서 발현되기 보다는 오히려 인공적으로 합성되고, 이후에 정제/단리될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "폴리뉴클레오타이드 나노포어"는 멤브레인을 가로질러 연장하고, 멤브레인의 한 측면에서 멤브레인의 다른 측면으로 이온, 전기 전류, 및/또는 유체를 흐르게 할 수 있게 하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 것으로 의도된다. 폴리뉴클레오타이드 포어는 예를 들어, 폴리뉴클레오타이드 오리가미(origami)(예를 들어, 나노포어를 생성하기 위한 DNA의 나노스케일 폴딩)를 포함할 수 있다.
또한, 본 명세서에서 사용되는 용어 "고체 상태 나노포어"는 이의 구조 부분이 비-생물학적 기원(즉, 생물학적 기원이 아닌) 물질을 포함하는 것을 의미하는 것으로 의도된다. 고체 상태 나노포어는 무기 또는 유기 물질로 형성될 수 있다. 고체 상태 나노포어는 예를 들어, 질화규소 나노포어, 이산화규소(SiO2) 나노포어, 및 그래핀 나노포어를 포함한다.
본 명세서에 개시된 나노포어는 하이브리드 나노포어일 수 있다. "하이브리드 나노포어"는 생물학적 및 비-생물학적 기원 둘 다의 물질을 포함하는 나노포어를 지칭한다. 하이브리드 나노포어의 예는 폴리펩타이드-고체 상태 하이브리드 나노포어 및 폴리뉴클레오타이드-고체 상태 나노포어를 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "나노포어 시퀀서"는 나노포어 시퀀싱을 위해 사용될 수 있는 본 명세서에 개시된 임의의 장치를 지칭한다. 본 명세서에 개시된 예에서, 나노포어 시퀀싱 동안에, 나노포어는 본 명세서에 개시된 전해질의 예(들)에 침지되며, 멤브레인을 가로질러 전위차가 인가된다. 일례에서, 전위차는 전기적 전위차 또는 전기화학적 전위차이다. 전기적 전위차는 시스 웰 또는 하나 이상의 트랜스 웰에 함유된 전해질의 이온들 중 적어도 하나에 전류를 주입하거나 투여하는 전압 소스를 통해 멤브레인을 통해 부가될 수 있다. 전기화학적 전위차는 전기적 전위와 조합하여 시스 웰 및 트랜스 웰의 이온성 조성의 차이에 의해 확립될 수 있다. 상이한 이온성 조성은 예를 들어, 각 웰에서의 상이한 이온, 또는 각 웰에서의 동일한 이온의 상이한 농도일 수 있다.
나노포어를 가로지르는 전위차의 인가는 나노포어를 통한 핵산의 전위를 강제할 수 있다. 나노포어를 통한 뉴클레오타이드의 전위에 해당하는 하나 이상의 신호가 발생된다. 이에 따라, 타겟 폴리뉴클레오타이드, 또는 모노뉴클레오타이드 또는 타겟 폴리뉴클레오타이드 또는 모노뉴클레오타이드로부터 유도된 프로브가 나노포어를 통해 통과함에 따라, 멤브레인을 가로지르는 전류는 예를 들어, 수축의 염기-의존(또는 프로브 의존) 차단으로 인해 변한다. 전류 변화로부터의 신호는 임의의 다양한 방법에 의해 측정될 수 있다. 각 신호는, 얻어진 신호가 폴리뉴클레오타이드의 특징을 결정하기 위해 사용될 수 있도록, 나노포어에서 뉴클레오타이드(들)(또는 프로브)의 종에 대해 독특하다. 예를 들어, 특징적인 신호를 형성하는 뉴클레오타이드(들)(또는 프로브)의 하나 이상의 종의 동일성이 결정될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 "뉴클레오타이드"는 질소 함유 헤테로시클릭 염기, 당, 및 하나 이상의 포스페이트 기를 포함한다. 뉴클레오타이드는 핵산 서열의 모노머 단위이다. 뉴클레오타이드의 예는 예를 들어, 리보뉴클레오타이드 또는 데옥시리보뉴클레오타이드를 포함한다. 리보뉴클레오타이드(RNA)에서, 당은 리보오스이며, 데옥시리보뉴클레오타이드(DNA)에서, 당은 데옥시리보오스, 즉, 리보오스에서 2' 위치에 존재하는 하이드록실 기가 결여된 당이다. 질소 함유 헤테로시클릭 염기는 푸린 염기 또는 피리미딘 염기일 수 있다. 푸린 염기는 아데닌(A) 및 구아닌(G), 및 이의 개질된 유도체 또는 유사체를 포함한다. 피리미딘 염기는 시토신(C), 티민(T) 및 우라실(U), 이의 개질된 유도체 또는 유사체를 포함한다. 데옥시리보오스의 C-1 원자는 피리미딘의 N-1 또는 푸린의 N-9에 결합된다. 포스페이트 기는 모노-, 디-, 또는 트리-포스페이트 형태로 존재할 수 있다. 이러한 뉴클레오타이드는 천연 뉴클레오타이드이지만, 인공 뉴클레오타이드, 개질된 뉴클레오타이드, 또는 상술된 뉴클레오타이드의 유사체가 또한 사용될 수 있는 것으로 또한 이해되어야 한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "신호"는 정보를 나타내는 지표(indicator)를 의미하는 것으로 의도된다. 신호는 예를 들어, 전기 신호 및 광 신호를 포함한다. 용어 "전기 신호"는 정보를 나타내는 전기적 품질(electrical quality)의 지표를 지칭한다. 지표는 예를 들어, 전류, 전압, 터널링, 저항, 전위, 전압, 전도도, 또는 횡방향 전기 효과(transverse electrical effect)일 수 있다. "전자 전류(electronic current)" 또는 "전기 전류(electric current)"는 전기적 전하의 흐름을 지칭한다. 일례에서, 전기 신호는 나노포어를 통해 진행하는 전기 전류일 수 있으며, 전기적 전위차가 나노포어를 가로질러 인가될 때 전기 전류가 흐를 수 있다.
용어 "기판"은 수성 액체 중에 불용성이고 천공, 포트, 또는 다른 유사한 액체 도관 없이 액체를 진행시킬 수 없는 강성, 고체 지지체이다. 본 명세서에 개시된 예에서, 기판은 그 안에 규정된 웰 또는 챔버를 가질 수 있다. 적합한 기판의 예는 유리 및 개질되거나 작용화된 유리, 플라스틱(아크릴, 폴리스티렌, 및 스티렌과 다른 물질의 코폴리머, 폴리프로필렌, 폴리에틸렌, 폴리부틸렌, 폴리우레탄, 폴리테트라플루오로에틸렌(PTFE)(예를 들어, Chemours로부터의 TEFLON®), 환형 올레핀/사이클로-올레핀 폴리머(COP)(예를 들어, Zeon으로부터의 ZEONOR®), 폴리이미드 등), 나일론, 세라믹, 실리카 또는 실리카-기반 물질, 실리콘 및 개질된 실리콘, 탄소, 금속, 무기 유기, 및 광섬유 번들을 포함한다.
용어 상부, 하부, 상단, 하단, 상(on) 등은 본 명세서에서, 나노포어 시퀀서 및/또는 나노포어 시퀀서의 다양한 성분들을 기술하기 위해 사용된다. 이러한 방향 용어가 특정 방향을 시사하는 것을 의미하지 않고, 성분들 간의 상대적 방향을 지정하기 위해 사용되는 것으로 이해되어야 한다. 방향 용어의 사용은 본 명세서에 개시된 예를 임의의 특정 방향(들)으로 제한하는 것으로 해석되어서는 안 된다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "웰(well)" 및 "챔버"는 동의어로 사용되고, 유체(예를 들어, 액체, 겔, 가스)를 함유할 수 있는 시퀀서에서 규정된 별개의 피처(feature)를 지칭한다. "시스 웰"은 시스 전극을 함유하거나 이에 의해 일부 규정된 공통 챔버이고, 또한, 개개 나노포어를 통해 복수의 트랜스 웰 각각에 유체 흐름 가능하게 연결된다. 시퀀서는 하나의 시스 웰 또는 다수의 시스 웰을 가질 수 있다. 각 "트랜스 웰"은 트랜스 전극 자체를 함유하거나 이에 의해 일부 규정된 단일 챔버이고, 또한, 하나의 시스 웰에 유체 흐름 가능하게 연결된다. 각 트랜스 웰은 각 다른 트랜스 웰과 전기적으로 절연되며, 개개 트랜스 전극은, 트랜스 웰 각각과 관련된 개개 나노포어를 통과하는 전기 신호를 증폭시키기 위해 개개 증폭기(예를 들어, Axopatch 200B 증폭기)에 연결된다. 웰을 적어도 일부 규정하는 기판의 표면에 대해 평행하게 얻어진 웰의 단면은 곡선, 정사각형, 다각형, 쌍곡선, 원뿔, 각진 것 등일 수 있다.
본 명세서에 기술되고 청구범위에 인용된 양태 및 예는 상기 정의를 고려하여 이해될 수 있다.
도 1을 참조하면, 나노포어 시퀀서(10)의 예가 도시된다. 나노포어 시퀀서(10는 시스 웰(14), 트랜스 웰(16), 시스 웰(14) 및 트랜스 웰(16)을 유체 흐름 가능하게 연결하는 나노포어(18), 및 시스 웰(14), 또는 트랜스 웰(16), 또는 시스 웰(14) 및 트랜스 웰(16)에서의 개질된 전해질(20)을 포함한다. 개질된 전해질(20)이 시스 웰(14) 또는 트랜스 웰(16) 중 하나에 존재하는 예에서, 비-개질된 전해질(22)은 트랜스 웰(16) 또는 시스 웰(14) 중 나머지 하나에 존재할 수 있다.
도 1에 도시된 바와 같이, 기판(12)은 그 안에 규정된 복수의 트랜스 웰(16)을 포함할 수 있다. 각 트랜스 웰(16)은 개개 나노포어(18)에 의해 공통 시스 웰(14)에 유체 흐름 가능하게 연결될 수 있다. 도 1에는 하나의 공통 시스 웰(14)이 도시되어 있지만, 시퀀서(10)가 서로 유체적으로 분리되고 기판(12)에 규정된 개개 트랜스 웰(16) 세트에 유체 흐름 가능하게 연결된 수 개의 시스 웰(14)을 포함할 수 있는 것으로 이해되어야 한다. 예를 들어, 단일 기판(12) 상에 다수의 샘플의 측정을 가능하게 하기 위해, 다수의 시스 웰(14)이 요망될 수 있다.
나노포어(들)(18)를 통한 유체 소통은 도 1에서 화살표에 의해 지시된다. 또한, 도 1에 도시된 바와 같이, 멤브레인(24)은 시스 웰(14)과 트랜스 웰(들)(16) 사이의 기판(12) 상에 정위될 수 있으며, 나노포어(들)(18)는 시스 웰(14)과 트랜스 웰(들)(16) 사이에 유체 연결을 확립시키기 위해 멤브레인(24)에 정위되고 이를 통해 연장할 수 있다.
시스 웰(14)은 기판(12)에 연결된 측벽(들)(13)에 의해 기판(12)의 일부분 상에 규정된 유체 챔버이다. 일부 예에서, 측벽(들)(13) 및 기판(12)은 이러한 것(13, 12)이 연속 피스의 물질(예를 들어, 유리 또는 플라스틱)로부터 형성되도록 일체형으로 형성될 수 있다. 다른 예에서, 측벽(들)(13) 및 기판(12)은 서로 커플링되는 별개의 부품일 수 있다. 일례에서, 측벽(들)은 광 패턴화 가능한 폴리머이다.
도 1에 도시된 예에서, 시스 웰(14)은 측벽(들)(13)에 의해 규정된 내부 벽(26, 26'), 시스 전극(30)에 의해 규정된 상부 표면(28), 및 멤브레인(24)에 의해 규정된 하부 표면(28')을 갖는다. 이에 따라, 시스 웰(14)은 시스 전극(30), 기판(12)의 부분, 및 멤브레인(24)에 의해 규정된 공간 내에 형성된다. 하부 표면(28')이 멤브레인(24)에 정위된 나노포어(들)(18)를 통한 개구(들)를 갖는 것으로 이해되어야 한다. 시스 웰(14)은 임의의 적합한 치수를 가질 수 있다. 일례에서, 시스 웰(14)은 약 1㎜×1㎜ 내지 약 5㎜ × 5㎜의 범위이다.
내부 표면이 시스 웰(14)의 상부 표면(28)인 시스 전극(30)은 측벽(들)(13)에 물리적으로 연결될 수 있다. 시스 전극(30)은 예를 들어, 접착제 또는 다른 적합한 고정 메커니즘에 의해, 측벽(들)(13)에 물리적으로 연결될 수 있다. 시스 전극(30)과 측벽(들)(13) 사이의 계면은 시스 웰(14)의 상부 부분을 시일링할 수 있다.
사용되는 시스 전극(30)은 적어도 일부, 개질된 전해질(20)에서의 레독스 커플에 의존적이다. 예로서, 시스 전극(30)은 금(Au), 백금(Pt), 탄소(C)(예를 들어, 흑연, 다이아몬드 등), 팔라듐(Pd), 은(Ag), 구리(Cu) 등일 수 있다. 일례에서, 시스 전극(30)은 은/은 클로라이드(Ag/AgCl) 전극일 수 있다.
시스 웰(14)은 나노포어(들)(18)와 접촉되게 개질된 전해질(20) 또는 비-개질된 전해질(22)을 유지시킬 수 있다. 일례에서, 시스 웰(14)은 나노포어(18)의 어레이와 접촉되고, 이에 따라, 어레이에서 나노포어(18) 각각과 접촉되게 개질된 전극(20) 또는 비-개질된 전해질(22)을 유지시킬 수 있다.
도 1에 예시된 바와 같이, 나노포어 시퀀서(10)는 복수의 트랜스 웰(16)을 포함한다. 각 트랜스 웰(16)은 기판(12)의 일부분에서 규정된 유체 챔버이다. 일반적으로, 트랜스 웰(16)은 기판(12)의 두께를 통해 연장할 수 있고, 기판(12)의 마주하는 단부(예를 들어, 상부 단부(38) 및 하부 단부(40))에 개구를 가질 수 있다. 도 1에 도시된 예에서, 각 트랜스 웰(16)은 기판(12)에 의해 및/또는 기판(12)의 틈새 영역(32)에 의해 규정된 측벽(31, 31'), 트랜스 전극(34)에 의해 규정된 하부 표면(36), 및 멤브레인(24)에 의해 규정된 상부 표면(36')을 갖는다. 이에 따라, 각 트랜스 웰(16)은 트랜스 전극(34)에 의해 규정된 공간, 기판(12)의 다른 부분 및/또는 틈새 영역(32), 및 멤브레인(24) 내에 형성된다. 상부 표면(36')이 멤브레인(24)에 정위된 나노포어(들)(18)를 통한 개구(들)를 갖는 것으로 이해되어야 한다.
내부 표면이 트랜스 웰(16)의 하부 표면(36)인 트랜스 전극(34)은 기판(12)에(예를 들어, 틈새 영역(32)에 또는 기판(12)의 내부 벽에) 물리적으로 연결될 수 있다. 트랜스 전극(34)은 기판(12)을 형성하는 공정에서(예를 들어, 트랜스 웰(16)의 형성 동안) 제작될 수 있다. 기판(12) 및 트랜스 전극(34)을 형성하기 위해 사용될 수 있는 마이크로제작 기술은 리소그래피, 금속 증착 및 리프트오프, 드라이 및/또는 스핀 온 필름 증착, 에칭 등을 포함한다. 트랜스 전극(34)과 기판(12) 사이의 계면은 트랜스 웰(16)의 하부 부분을 시일링할 수 있다.
사용되는 트랜스 전극(34)은 적어도 일부, 개질된 전해질(20)에서 레독스 커플에 따른다. 예로서, 트랜스 전극(34)은 금(Au), 백금(Pt), 탄소(C)(예를 들어, 흑연, 다이아몬드 등), 팔라듐(Pd), 은(Ag), 구리(Cu) 등일 수 있다. 일례에서, 트랜스 전극(34)은 은/은 클로라이드(Ag/AgCl) 전극일 수 있다.
규칙, 반복, 및 불규칙 패턴을 포함하는 트랜스 웰(16)의 여러 상이한 레이아웃이 고려될 수 있다. 일례에서, 트랜스 웰(16)은 밀집 패킹(close packing) 및 개선된 밀도를 위한 육각형 그리드에 배치된다. 다른 레이아웃은 예를 들어, 직선(즉, 직사각형) 레이아웃, 삼각형 레이아웃 등을 포함할 수 있다. 예로서, 레이아웃 또는 패턴은 열 및 칼럼으로 존재하는 트랜스 웰(16)의 x-y 포맷일 수 있다. 일부 다른 예에서, 레이아웃 또는 패턴은 트랜스 웰(16) 및/또는 틈새 영역(32)의 반복 배열일 수 있다. 또 다른 예에서, 레이아웃 또는 패턴은 트랜스 웰(16) 및/또는 틈새 영역(32)의 랜덤 배열일 수 있다. 패턴은 스폿, 포스트, 스트라이프, 스월, 라인, 삼각형, 사각형, 원, 호, 체크, 격자, 대각선, 화살표, 정사각형, 및/또는 크로스-해치를 포함할 수 있다.
레이아웃은 트랜스 웰(16)의 밀도(즉, 기판(12)의 규정된 영역에서의 트랜스 웰(16)의 수)와 관련하여 특징화될 수 있다. 예를 들어, 트랜스 웰(16)은 1 ㎟당 약 10개의 웰 내지 1 ㎟당 약 1,000,000개의 웰 범위의 밀도로 존재할 수 있다. 밀도는 예를 들어, 1 ㎟당 적어도 약 10개, 1 ㎟당 약 5,000개, 1 ㎟당 약 10,000개, 약 100,000개, 또는 그 이상의 밀도를 포함하는 상이한 밀도로 조정될 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 밀도는 1 ㎟당 약 1,000,000개 이하의 웰, 1 ㎟당 약 100,000개, 1 ㎟ 약 10,000개, 1 ㎟당 약 5,000개, 또는 그 미만이도록 조정될 수 있다. 지지체(12)에서 트랜스 웰(16)의 밀도가 상기 범위로부터 선택된 하한치 중 하나와 상한치 중 하나 사이에 존재하는 것으로 또한 이해되어야 한다.
레이아웃은 또한 또는 대안적으로, 평균 피치, 즉, 나노포어(18)의 중심에서 인접한 나노포어(18)의 중심까지의 간격(중심-대-중심 간격)의 측면에서 특징화될 수 있다. 패턴은 평균 피치 주변의 변동 계수가 작도록 규칙적일 수 있거나, 패턴은 불규칙적일 수 있으며, 이러한 경우에, 변동 계수가 비교적 클 수 있다. 일례에서, 평균 피치는 약 100㎚ 내지 약 500㎛의 범위일 수 있다. 평균 피치는 예를 들어, 적어도 약 100㎚, 약 5㎛, 약 10㎛, 약 100㎛, 또는 그 이상일 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 평균 피치는 예를 들어, 최대 약 500㎛, 약 100㎛, 약 50㎛, 약 10㎛, 약 5㎛, 또는 그 미만일 수 있다. 나노포어(18)의 특정 패턴을 포함하는 예시적인 어레이에 대한 평균 피치는 상기 범위로부터 선택된 하한치 중 하나와 상한치 중 하나 사이에 존재할 수 있다. 일례에서, 어레이는 약 10㎛의 평균 피치(중심-대-중심 간격)를 갖는다.
트랜스 웰(16)은 마이크로 웰(마이크로 스케일, 예를 들어, 약 1㎛ 내지 최대 1000㎛까지(1000㎛ 포함)의 적어도 하나의 치수를 가짐) 또는 나노웰(나노스케일, 예를 들어, 약 10㎚ 내지 최대 1000㎚까지(1000㎚ 포함)의 적어도 하나의 치수를 가짐)일 수 있다. 각 웰(16)은 이의 종횡비(예를 들어, 이러한 예에서 깊이 또는 높이에 의해 나누어진 폭 또는 직경)에 의해 특징화될 수 있다.
일례에서, 각 트랜스 웰(16)의 종횡비는 약 1:1 내지 약 1:5의 범위일 수 있다. 다른 예에서, 각 트랜스 웰(16)의 종횡비는 약 1:10 내지 약 1:50의 범위일 수 있다. 일례에서, 트랜스 웰(16)의 종횡비는 약 3.3이다.
깊이/높이 및 폭/직경은 요망되는 종횡비를 얻기 위해 선택될 수 있다. 각 트랜스 웰(16)의 깊이/높이는 적어도 약 0.1㎛, 약 1㎛, 약 10㎛, 약 100㎛, 또는 그 초과일 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 깊이는 최대 약 1,000㎛, 약 100㎛, 약 10㎛, 약 1㎛, 약 0.1㎛, 또는 그 미만일 수 있다. 각 트랜스 웰(16)의 폭/직경은 적어도 약 50㎚, 약 0.1㎛, 약 0.5㎛, 약 1㎛, 약 10㎛, 약 100㎛, 또는 그 초과일 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 폭/직경은 최대 약 1,000㎛, 약 100㎛, 약 10㎛, 약 1㎛, 약 0.5㎛, 약 0.1㎛, 약 50㎚, 또는 그 미만일 수 있다.
각 트랜스 웰(16)은 멤브레인(24)의 적어도 일부분, 및 이와 관련된 나노포어(18)를 수용하기에 충분히 큰 개구(예를 들어, 시스 웰(14)을 대면함)를 갖는다. 예를 들어, 나노포어(18)의 단부는 멤브레인(24)을 통해 및 트랜스 웰(16)의 개구 내로 연장할 수 있다.
시스 웰(14) 및 트랜스 웰(16)은 예를 들어, 포토리소그래피, 나노임프린트 리소그래피, 스탬핑 기술, 엠보싱 기술, 모울딩 기술, 마이크로에칭 기술 등을 포함하는 다양한 기술을 이용하여 제작될 수 있다. 당업자에 의해 인식되는 바와 같이, 사용되는 기술은 지지체(12) 및 측벽(들)(13)의 조성 및 형상에 따를 것이다. 일례에서, 시스 웰(14)은 지지체(12)의 단부(38)에서 측벽(들)(13)에 의해 규정될 수 있으며, 트랜스 웰(16)은 지지체(12)를 통해 규정될 수 있다.
멤브레인(24)은 임의의 본 명세서에 기술된 비-투과성 또는 반-투과성 물질일 수 있다. 멤브레인(24)은 시스 웰(14)과 트랜스 웰(16) 사이에 정위되고, 이에 따라, 웰(14, 16) 사이에 배리어를 제공한다. 멤브레인은 기판(12)의 틈새 영역(32) 상에 정위될 수 있다.
나노포어(들)(18)는 임의의 본 명세서에 기술된 생물학적 나노포어, 고체 상태 나노포어, 및 하이브리드 나노포어일 수 있다. 본 명세서에 언급된 바와 같이, 각 나노포어(18)는 시스 웰(14)에 트랜스 웰(16) 중 개개 하나를 유체 흐름 가능하게 연결한다. 이와 같이, 나노포어(18) 대 트랜스 웰(16)의 비는 1:1이다.
나노포어(18)는 2개의 개방 단부, 및 2개의 개방 단부를 연결하는 중공 코어 또는 홀을 갖는다. 멤브레인(24) 내에 삽입될 때, 나노포어(18)의 개방 단부 중 하나는 시스 웰(14)을 대면하며, 나노포어(18)의 개방 단부 중 나머지 하나는 트랜스 웰(16)을 대면하고, 트랜스 웰(16)의 개구의 적어도 일부분과 정렬된다. 나노포어(18)의 중공 코어는 웰(14, 16) 간에 유체 연결을 가능하게 한다. 중공 코어의 직경은 약 1㎚ 내지 최대 1㎛의 범위일 수 있고, 나노포어(18)의 길이를 따라 달라질 수 있다. 일부 예에서, 시스 웰(14)을 대면하는 개방 단부는 트랜스 웰(16)을 대면하는 개방 단부보다 더 클 수 있다. 다른 예에서, 시스 웰(14)을 대면하는 개방 단부는 트랜스 웰(16)을 대면하는 개방 단부보다 더 작을 수 있다.
나노포어(들)(18)는 멤브레인(24) 내에 삽입될 수 있거나, 멤브레인(24)은 나노포어(들)(18) 둘레에 형성될 수 있다. 일례에서, 나노포어(18)는 형성된 지질 이중층(멤브레인(24)의 일례) 내에 삽입될 수 있다. 예를 들어, 이의 모노머 형태 또는 폴리머 형태(예를 들어, 옥타머)의 나노포어(18)는 지질 이중층 내에 삽입되고, 멤브레인관통 포어에 조립될 수 있다. 다른 예에서, 나노포어(18)는 지질 이중층 내에 삽입될 요망되는 농도로 지질 이중층의 접지된 측면에 첨가될 수 있다. 또 다른 예에서, 지질 이중층은 폴리테트라플루오로에틸렌(PTFE) 필름에서 천공을 가로질러 형성되고 시스 웰과 트랜스 웰 사이에 정위될 수 있다. 나노포어는 접지된 시스 구획에 첨가될 수 있고, PTFE 천공이 형성된 영역에서 지질 이중층 내에 삽입될 수 있다. 또 다른 예에서, 나노포어(18)는 고체 지지체(예를 들어, 실리콘, 실리콘 옥사이드, 석영, 인듐 주석 옥사이드, 금, 폴리머 등)에 테더링될 수 있다. 나노포어(18) 자체의 일부일 수 있거나 나노포어(18)에 부착될 수 있는 테더링 분자(tethering molecule)는 고체 지지체에 나노포어(18)를 부착시킬 수 있다. 테더링 분자를 통한 부착은 단일 포어(18)가 (예를 들어, 2개의 챔버/웰 사이에) 고정될 수 있게 한다. 지질 이중층은 이후에 나노포어(18) 둘레에 형성될 수 있다.
상기에 언급된 바와 같이, 나노포어 시퀀서(10)의 일부 예는 시스 웰(14) 및 트랜스 웰(16) 둘 다에 개질된 전해질(20)을 포함한다. 다른 예에서, 개질된 전해질(20)은 트랜스 웰(16) 또는 시스 웰(14) 중 어느 하나에 존재한다. 이와 같이, 도 1에 도시된 나노포어 시퀀서(10)는 또한, 2개의 전해질, 즉, 개질된 전해질(20) 및 비-개질된 전해질(22)을 포함할 수 있다.
개질된 전해질(20)은 전해질 및 양이온 착화제를 포함한다. 전해질은 반대 이온(양이온 및 이의 관련된 음이온)으로 해리할 수 있는 임의의 전해질일 수 있다. 예로서, 전해질은 칼륨 양이온(K+) 또는 나트륨 양이온(Na+)으로 해리 가능한 임의의 전해질일 수 있다. 이러한 타입의 전해질은 칼륨 양이온 및 관련된 음이온, 또는 나트륨 양이온 및 관련된 음이온, 또는 이들의 조합을 포함한다. 칼륨-함유 전해질의 예는 염화칼륨(KCl), 칼륨 페리사이아나이드(K3[Fe(CN)6]·3H2O 또는 K4[Fe(CN)6]·3H2O), 또는 다른 칼륨-함유 전해질(예를 들어, 바이카보네이트(KHCO3) 또는 포스페이트(예를 들어, KH2PO4, K2HPO4, K3PO4))를 포함한다. 나트륨-함유 전해질의 예는 염화나트륨(NaCl) 또는 다른 나트륨-함유 전해질, 예를 들어, 중탄산나트륨(NaHCO3), 인산나트륨(예를 들어, NaH2PO4, Na2HPO4 또는 Na3PO4)을 포함한다. 다른 예로서, 전해질은 루테늄-함유 양이온(예를 들어, 루테늄 헥사민, 예를 들어, [Ru(NH3)6]2+ 또는 [Ru(NH3)6]3+)으로 해리할 수 있는 임의의 전해질일 수 있다. 리튬 양이온(Li+), 루비듐 양이온(Rb+), 마그네슘 양이온(Mg+), 또는 칼슘 양이온(Ca+)으로 해리 가능한 전해질이 또한 사용될 수 있다.
개질된 전해질(20)에서 사용되는 양이온 착화제는 사용되는 전해질의 양이온에 의존적이다. 양이온 착화제는 전해질의 양이온을 착화시키기 위해 포함되며, 이에 따라, 양이온 착화제의 중심 공동의 직경은 양이온의 크기를 매칭시키도록 선택된다. "매치(match)"는 양이온이 중심 공동 내에 적합할 수 있고, 양이온 착화제의 원자가 양이온과 착화할 수 있음을 의미한다.
적합한 양이온 착화제의 예는 크라운 에터, 칼릭사렌 및 발리노마이신을 포함한다. 적합한 크라운 에터의 예는 하기를 포함한다:
Figure pct00001
이러한 크라운 에터의 유도체, 예를 들어, 벤조- 또는 다이벤조-15-크라운-5, 벤조- 또는 다이벤조-18-크라운-6, 벤조- 또는 다이벤조-21-크라운-7, 다이사이클로헥사노-18-크라운-6, 다이사이클로헥사노-21-크라운-7 등이 또한 사용될 수 있는 것으로 이해되어야 한다. 아자크라운(예를 들어, 아자-15-크라운-5) 또는 티아크라운이 또한 사용될 수 있다. 적합한 칼릭사렌의 예는 C3Cal-5, C3Cal-6, 및 칼릭스[4]아렌 테트라에스터를 포함한다. 발리노마이신은 하기에 나타낸 바와 같다:
Figure pct00002
매칭 양이온 및 양이온 착화제의 예는 하기 표 1에 나타낸다.
Figure pct00003
개질된 전해질(20)에서 양이온 착화제의 양은 적어도 일부, 양이온에 대한 착화제의 친화력에 따라 달라질 수 있다. 이러한 친화력을 고려하여, 양이온 착화제는 이용 가능한 양이온의 적어도 99%의 착화를 야기시키는 임의의 적합한 양으로 사용될 수 있다. 일반적으로, 양이온 착화제의 몰 농도는 0mM 초과 내지 약 1 M의 범위일 수 있다. 일례에서, 18-크라운-6은 칼륨-함유 전해질에서 약 50mM 내지 약 500mM 범위의 몰 농도로 사용될 수 있다. 보다 특정 예에서, 18-크라운-6은 칼륨-함유 전해질에서 약 300mM의 몰 농도로 사용될 수 있다. 다른 예에서, 칼릭사렌은 칼륨-함유 또는 나트륨-함유 전해질에서 0mM 초과 내지 약 20mM 범위의 몰 농도로 사용될 수 있다. 사용되는 임의의 농도는 전해질에서 양이온 착화제의 용해도에 의존적일 수 있다.
비-개질된 전해질(22)은 양이온 착화제를 함유하지 않는 것을 제외하고 개질된 전해질(20)과 동일한 전해질을 포함한다. 이와 같이, 비-개질된 전해질은 양이온 착화제를 포함할 수 있다.
개질된 전해질(20)이 시스 웰(14) 및 트랜스 웰(16) 내에 도입될 때, 비-개질된 전해질(22)이 사용되지 않는다. 개질된 전해질(20)이 시스 웰(14) 내에 도입될 때, 비-개질된 전해질은 트랜스 웰(16) 내에 도입될 수 있다. 비-개질된 전해질(22)이 시스 웰(14) 내에 도입될 때, 개질된 전해질은 트랜스 웰(16) 내에 도입될 수 있다.
어느 쪽 웰(14 및/또는 16) 내에 개질된 전해질(20)이 도입되든지 간에, 양이온 착화제가 그러한 웰(14 및/또는 16) 내에 이용 가능한 전해질 양이온을 착화할 것이고, 이에 따라, 웰(14 및/또는 16) 밖으로 및 나노포어(들)(18)를 통해 전위하기에 너무 큰 양이온을 제공하는 것으로 이해되어야 한다. 착화된 양이온(들)은 나노포어(들)(18)의 개방 단부들 중 적어도 하나에 거의 동일하거나(예를 들어, 이의 약 5% 내), 이보다 더 큰 직경을 갖는다. 예를 들어, K+ 및 18-크라운-6의 착물은 약 1.15㎚의 직경을 가지며, MspA 나노포어는 약 1.2㎚의 중공 중심 직경(이의 최소 섹션에서)을 갖는다. 착화된 양이온은 나노포어(들)(18)를 통해 맞지 않을 수 있으며, 이에 따라, 나노포어(들)(18)를 통한 양이온 이동은 나노포어 시퀀서(10)의 작업 동안 억제될 것이다. 양이온 이동을 제한함으로써, 전해질의 음이온은 이온성 전류 차이를 형성할 수 있도록 강제되어, 이에 따라, 트랜스 전극(34)에서 음이온 공급과 음이온 소모 사이에 불균형을 적어도 감소시킬 것이다.
도 3을 참조하면, 나노포어 시퀀서(10, 10')의 예를 이용하는 방법(100, 100')의 예(후자는 도 2에 도시됨)가 도시되어 있다. 나노포어 시퀀서(10)를 포함하는 방법(100)의 예는 참조 번호 102 및 104를 포함한다. 참조 번호 102에 도시된 바와 같이, 방법(100)은 나노포어 시퀀서(10)의 시스 웰(14)과 나노포어 시퀀서(10)의 트랜스 웰(16) 사이에 약 -1V 내지 약 1V의 범위의 전압 바이어스를 인가함으로써 나노포어 시퀀서(10)에서 전해질의 레독스 반응물의 고갈을 제어하는 것을 포함하며, 참조 번호 104에 도시된 바와 같이, 전해질 및 양이온 착화제를 포함하는 개질된 전해질(20)은 시스 웰(14), 또는 트랜스 웰(16), 또는 시스 웰(14) 및 트랜스 웰(16)에 존재한다. 인가되는 전압 바이어스는 예를 들어, 비-개질된 전해질(22)과 조합하여 사용될 때, 개질된 전해질(20)의 위치에 의존적일 수 있다. 제공된 범위 내의 임의의 전압 바이어스는 개질된 전해질(20)이 웰(14, 16) 각각에 존재할 때 인가될 수 있다. 이는 이온 운동이 단방향이라는 사실에 기인한 것이며, 이에 따라, 특정 바이어스가 인가될 때 멤브레인(24)의 일측 상에 정위된 착화된 이온은 전류 수송에 영향을 미치지 않을 것이다. 예를 들어, 음 전압 바이어스가 인가될 때, 트랜스 웰(16)에서 착화된 이온은 전류 수송에 영향을 미치지 않는다.
일례에서, 양이온(예를 들어, K+)과 크라운 에터의 착화는 흐르는 전류를 약 2x(2배)의 계수 감소시킴으로써 나노포어를 통해 양이온 수송을 완화시킨다. 전류 흐름의 감소는 약 1x 내지 약 3x 범위일 수 있다.
일부 예에서, 방법(100)은 또한, 시스 웰(14) 및 트랜스 웰(16) 각각에 개질된 전해질(20)을 갖는 나노포어 시퀀서(10)를 제공하는 것을 포함할 수 있다. 다른 예에서, 방법(100)은 또한, 시스 웰(14) 또는 트랜스 웰(16) 중 하나에 개질된 전해질(20)을 가지고 트랜스 웰(16) 또는 시스 웰(14) 중 나머지 하나에 양이온 착화제가 없는 전해질(즉, 비-개질된 전해질(22))을 갖는 나노포어 시퀀서(10)를 제공하는 것을 포함한다.
방법(100)은 또한, 개질된 전해질(20)을 형성하기 위해 양이온 착화제를 전해질 내에 혼입하고, 개질된 전해질(20)을 시스 웰(14) 또는 트랜스 웰(16) 중 하나에 도입하고, 트랜스 웰(16) 또는 시스 웰(14) 중 다른 하나에 양이온 착화제가 없는 전해질(즉, 비-개질된 전해질(22))을 도입하는 것을 포함할 수 있다. 본 명세서에 기술된 바와 같이, 양이온 착화제의 농도는, 적어도 일부, 양이온에 대한 착화제의 친화력에 따라 달라질 수 있다.
방법(100)은 나노포어 시퀀싱 작업 동안 수행될 수 있다. 나노포어(18)를 가로지르는 전기적 전위(즉, 시스 전극(30) 및 트랜스 전극(34)에 의해 전류 소스로서 제공된 바이어스)의 인가는 전하를 운반하는 음이온과 함께 나노포어(18)를 통해 뉴클레오타이드의 전위를 강제한다. 바이어스에 따라, 뉴클레오타이드는 시스 웰(14)로부터 트랜스 웰(16)로, 또는 트랜스 웰(16)로부터 시스 웰(14)로 이동될 수 있다. 뉴클레오타이드가 나노포어(18)를 통해 이동할 때, 예를 들어, 구조의 베이스-의존 차단으로 인해 배리어를 가로지르는 전류가 변한다. 전류 변화로부터의 신호는 증폭기, 또는 다른 공지된 신호 검출 장치를 이용하여 측정될 수 있다.
전압에 대한 범위는 약 -1V 내지 약 1V 이상에서 선택될 수 있다. 전압 극성은 통상적으로, 음으로 하전된 핵산이 나노포어(18) 내로 전기영동적으로 구동되도록 인가된다. 일부 경우에, 적절한 기능을 촉진하기 위해, 전압이 감소될 수 있거나, 극성이 역전될 수 있다.
도 2를 참조하면, 나노포어 시퀀서(10')의 다른 예가 도시되어 있다. 나노포어 시퀀서(10')는 시스 웰(14), 트랜스 웰(16), 시스 웰(14) 및 트랜스 웰(16)을 유체 흐름 가능하게 연결하는 나노포어(18), 및 시스 웰(14), 또는 트랜스 웰(16), 또는 시스 웰(14) 및 트랜스 웰(16)에서의 다가전해질(42)을 포함한다. 다가전해질(42)이 시스 웰(14) 또는 트랜스 웰(16) 중 하나에 존재하는 예에서, 전해질(44)은 트랜스 웰(16) 또는 시스 웰(14) 중 나머지 하나에 존재할 수 있다.
도 2에 도시된 바와 같이, 기판(12)은 그 안에 규정된 복수의 트랜스 웰(16)을 포함할 수 있고, 시스 웰(14)을 적어도 부분적으로 규정하는 측벽(들)(13)에 연결될 수 있다. 트랜스 웰(16) 각각은 개개 나노포어(18)에 의해 공통 시스 웰(14)에 유체 흐름 가능하게 연결될 수 있다. 도 2에 하나의 공통 시스 웰(14)이 도시되어 있지만, 시퀀서(10')가 서로 유체적으로 분리되고 기판(12)에서 규정된 트랜스 웰(16)의 개개 세트에 유체 흐름 가능하게 연결된 수 개의 시스 웰(14)을 포함할 수 있는 것으로 이해되어야 한다. 다수의 시스 웰(14)은, 예를 들어, 단일 기판(12) 상에 다수의 샘플의 측정을 가능하게 하기 위해, 요망될 수 있다.
나노포어(들)(18)를 통한 유체 소통은 도 2에서 화살표로 표시된다. 또한, 도 2에 도시된 바와 같이, 멤브레인(24)은 시스 웰(14)과 트랜스 웰(들)(16) 사이의 기판(12) 상에 정위될 수 있으며, 나노포어(들)(18)는 시스 웰(14)과 트랜스 웰(들)(16) 간에 유체 연결을 설정하기 위해 멤브레인(24)에 정위되고 이를 통해 연장할 수 있다.
나노포어 시퀀서(10')의 시스 웰(14) 및 트랜스 웰(16)은 나노포어 시퀀서(10)에 대해 본 명세서에 기술된 것과 동일한 방식으로 및 동일한 구성(예를 들어, 치수, 레이아웃(layout) 등)으로 규정될 수 있다. 또한, 시스 전극(30) 및 트랜스 전극(들)(34)은 측벽(들)(13) 및 기판(12)에 각각 물리적으로 연결될 수 있고, 시스 웰(14)의 상부 표면(28) 및 트랜스 웰(들)(16)의 하부 표면(36)을 각각 규정할 수 있다.
나노포어 시퀀서(10')에서, 시스 웰(14)은 나노포어(들)(18)와 접촉하여 전해질(44) 또는 다가전해질(42)을 유지할 수 있다. 일례에서, 시스 웰(14)은 나노포어(18)의 어레이와 접촉되고, 이에 따라, 어레이에서 각 나노포어(18)와 접촉하여 전해질(44) 또는 다가전해질(42)을 유지할 수 있다. 또한, 나노포어 시퀀서(10')에서, 각 트랜스 웰(16)은 멤브레인(24)의 적어도 일부분 및 이와 관련된 나노포어(18)를 수용하기에 충분히 큰 (예를 들어, 시스 웰(14)을 대면함) 개구를 갖는다. 예를 들어, 나노포어(18)의 단부는 멤브레인(24)을 통해 및 트랜스 웰(16)의 개구 내로 연장할 수 있다.
본 명세서에 기술된 임의의 멤브레인(24) 및 나노포어(18)는 나노포어 시퀀서(10')용으로 사용될 수 있다.
상기에 언급된 바와 같이, 나노포어 시퀀서(10')의 일부 예는 시스 웰(14) 및 트랜스 웰(16) 둘 다에 다가전해질(42)을 포함한다. 다른 예에서, 다가전해질(42)은 트랜스 웰(16) 또는 시스 웰(14) 중 어느 하나에 존재한다. 이와 같이, 도 2에 도시된 나노포어 시퀀서(10')는 2개의 전해질, 즉, 다가전해질(42) 및 전해질(42)을 포함할 수 있다. 도 2의 예에서, 다가전해질(42)은 트랜스 웰(16)에 존재하며, 다가전해질(42) 또는 전해질(44)은 시스 웰(14)에 존재한다.
다가전해질(42)은 반대 전하의 이온의 커플링으로 인해 전류를 전도시킬 수 있는 겔 상태의 하전된 폴리머이다. 본 명세서에 개시된 예에서, 다가전해질(42)은 음으로 하전된 이온(즉, 음이온)과 커플링하는 양으로 하전된 골격을 갖는다. 양이온이 다가전해질(42)의 골격의 일부이기 때문에, 이러한 것은 웰(16 또는 14) 밖으로 및 나노포어(들)(18)를 통해 용이하게 전위하지 못할 수 있다. 적합한 다가전해질(42)의 예는 폴리다이알릴디메틸암모늄 클로라이드(PDDA), 이온 형태의 폴리에틸렌이민(PEI), 이온 형태의 선형 폴리에틸렌이민(LPEI), 폴리(알릴아민 하이드로클로라이드)(PAH), 및 이온 형태의 폴리(4-비닐피리딘)(P4VP)으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 예시적인 구조는 하기에 도시되어 있다:
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이러한 예에서, 선형 폴리에틸렌이민(LPEI)에서 -NH2 +는 Cl-에 배위되며, 폴리(4-비닐피리딘)(P4VP)에서 -NH+는 Cl-에 배위된다(즉, 폴리(4-비닐피리딘 하이드로클로라이드)). 폴리(4-비닐피리딘)(P4VP)의 이온 형태의 다른 예는 폴리(4-비닐피리딘) 메틸 클로라이드이며, 여기서, 폴리(4-비닐피리딘)에서 -N+CH3은 Cl-에 배위된다. 웰(14, 16) 중 다른 하나에서 사용되는 전해질(44) 및 트랜스 전극(34) 상의 전기화학적 반응의 특성에 따라, 클로라이드와는 다른 음이온이 사용될 수 있다. 트랜스 측면 상에서 전해질 균형을 보존하는 것이 요망되며, 이에 따라, 트랜스 전극(34)에 의해 소모되거나 생성된 이온이 다가전해질(42)에 매칭되어야 한다.
다가전해질(42)이 나노포어(18)를 통해 자유 전해질 정도로 용이하게 바뀌지 않을 수 있지만, 나노포어(18)는 하전된 폴리머(예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜(PEG), DNA)를 전위시키는 것으로 나타났다. 이에 따라, 비-선형 다가전해질(42)은 포어(18)를 통해 다가전해질(42)의 전위를 추가로 방해시키기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 분지된-PEI 또는 다가전해질(42)과 가교 가능한 기를 갖는 모노머의 코폴리머.
트랜스 웰(들)(16)에 포함될 때, 다가전해질(42)은 또한, 멤브레인(24)(예를 들어, 지질 이중층)의 기계적 지지 및 구조적 안정성을 개선시킬 수 있다.
포함할 때, 전해질(42)은 반대 이온(양이온 및 이의 관련된 음이온)으로 해리 가능한 임의의 전해질일 수 있다. 예로서, 전해질은 칼륨 양이온(K+) 또는 나트륨 양이온(Na+)으로 해리 가능한 임의의 전해질일 수 있다. 이러한 타입의 전해질은 칼륨 양이온 및 관련된 음이온, 또는 나트륨 양이온 및 관련된 음이온, 또는 이들의 조합을 포함한다. 칼륨-함유 전해질의 예는 염화칼륨(KCl), 칼륨 페리사이아나이드(K3[Fe(CN)6]·3H2O 또는 K4[Fe(CN)6]·3H2O), 또는 다른 칼륨-함유 전해질(예를 들어, 바이카보네이트(KHCO3) 또는 포스페이트(예를 들어, KH2PO4, K2HPO4, K3PO4)를 포함한다. 나트륨-함유 전해질의 예는 염화나트륨(NaCl) 또는 다른 나트륨-함유 전해질, 예를 들어, 중탄산나트륨(NaHCO3) 또는 인산나트륨(예를 들어, NaH2PO4, Na2HPO4, Na3PO4)를 포함한다. 다른 예로서, 전해질은 루테늄-함유 양이온(예를 들어, 루테늄 헥사민, 예를 들어, [Ru(NH3)6]2+ 또는 [Ru(NH3)6]3+)으로 해리 가능한 임의의 전해질일 수 있다. 리튬 양이온(Li+), 루비듐 양이온(Rb+), 마그네슘 양이온(Mg+), 또는 칼슘 양이온(Ca+)으로 해리 가능한 전해질이 또한 사용될 수 있다.
나노포어 시퀀서(10')의 일례에서, 다가전해질(42)은 시스 웰(14) 및 트랜스 웰(16) 둘 다에 존재하며, 다가전해질(42)은 폴리다이알릴디메틸암모늄 클로라이드, 이온 형태의 폴리에틸렌이민, 이온 형태의 선형 폴리에틸렌이민, 폴리(알릴아민 하이드로클로라이드), 및 이온 형태의 폴리(4-비닐피리딘)으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
나노포어 시퀀서(10')의 다른 예에서, 다가전해질(42)은 폴리다이알릴디메틸암모늄 클로라이드, 이온 형태의 폴리에틸렌이민, 이온 형태의 선형 폴리에틸렌이민, 폴리(알릴아민 하이드로클로라이드), 및 이온 형태의 폴리(4-비닐피리딘)으로 이루어진 군으로부터 선택되며; 전해질(42)은 칼륨 양이온 및 관련된 음이온, 또는 나트륨 양이온 및 관련된 음이온, 또는 이들의 조합을 포함한다.
도 3을 다시 참조하면, 나노포어 시퀀서(10')를 포함하는 방법(100')의 예는 참조 번호 102 및 106을 포함한다. 참조 번호 102로 나타낸 바와 같이, 방법(100')은 나노포어 시퀀서(10')의 시스 웰(14)과 나노포어 시퀀서(10')의 트랜스 웰(16) 사이에 약 -1V 내지 약 1V의 범위의 전압 바이어스를 인가함으로써 나노포어 시퀀서(10')에서 전해질의 레독스 반응물의 고갈을 조절하는 것을 포함하며, 참조 번호 106으로 나타낸 바와 같이, 다가전해질(42)은 시스 웰(14), 또는 트랜스 웰(16), 또는 시스 웰(14) 및 트랜스 웰(16)에 존재한다. 트랜스 측면 상에서 전해질 균형을 보존하는 임의의 전압 바이어스가 인가될 수 있다.
일부 예에서, 방법(100')은 시스 웰(14) 및 트랜스 웰(16) 각각에서 겔 상태의 다가전해질(42)을 갖는 나노포어 시퀀서(10')를 제공하는 것을 포함할 수 있다. 다른 예에서, 방법(100')은 또한, 시스 웰(14) 또는 트랜스 웰(16) 중 하나에서 겔 상태의 다가전해질(42)을 갖는, 및 트랜스 웰(16) 또는 시스 웰(14) 중 다른 하나에서 전해질(44)을 갖는 나노포어 시퀀서(10')를 제공하는 것을 포함할 수 있다.
방법(100')은 또한, 시스 웰(14), 또는 트랜스 웰(들)(16), 또는 시스 웰(14) 및 트랜스 웰(16) 둘 다에 다가전해질(42)(겔 상태)을 도입하는 것을 포함할 수 있다. 다가전해질(42)이 웰(14 또는 16) 중 어느 하나에 있을 때, 방법(100')은 트랜스 웰(16) 또는 시스 웰(14) 중 다른 하나에 전해질(44)을 도입하는 것을 포함할 수 있다.
방법(100')은 나노포어 시퀀싱 작업 동안 수행될 수 있다. 나노포어(18)를 가로지르는 전기적 전위(즉, 전류 소스로서 시스 전극(30) 및 트랜스 전극(34)에 의해 제공된 사전결정된 바이어스)의 인가는 전하를 운반하는 음이온과 함께 나노포어(18)를 통한 뉴클레오타이드의 전위를 강제한다. 바이어스에 따라, 뉴클레오타이드는 시스 웰(14)로부터 트랜스 웰(16)로, 또는 트랜스 웰(16)로부터 시스 웰(14)로 이동될 수 있다. 뉴클레오타이드가 나노포어(18)를 통해 통과함에 따라, 배리어를 가로지르는 전류는 예를 들어, 압축의 염기-기반 차단을 인해 변한다. 전류 변화로부터의 신호는 증폭기, 또는 다른 공지된 신호 검출 장치를 이용하여 측정될 수 있다.
전압에 대한 범위는 약 -1V 내지 약 1V 이상으로부터 선택될 수 있다. 전압 극성은 통상적으로, 음으로 하전된 핵산이 나노포어(18) 내로 전기영동적으로 유도되도록 인가된다. 일부 경우에, 적절한 기능을 촉진시키기 위해, 전압이 감소될 수 있거나, 극성이 역전될 수 있다.
이제 도 4를 참조하면, 나노포어 시퀀서(10")의 또 다른 예가 도시된다. 나노포어 시퀀서(10")는 시스 웰(14'), 트랜스 웰(16'), 및 시스 웰(14') 및 트랜스 웰(16')을 유체 흐름 가능하게 연결시키는 나노포어(18), 시스 웰(14')과 관련된 시스 웰 전극 구조(47)(제1 베이스 전극(30'), 및 제1 베이스 전극(30')에 고정된 레독스 고형물(48)을 포함하는 시스 웰 전극 구조(47)), 트랜스 웰(16')과 관련된 트랜스 웰 전극 구조(50)(제2 베이스 전극(34'), 및 제2 베이스 전극(34')에 고정된 레독스 고형물(48)을 포함하는 트랜스 웰 전극 구조(50)), 및 시스 웰 전극 구조(47) 및 트랜스 웰 전극 구조(50)에서 개개 레독스 반응에 응하여 소모되거나 방출되는 양이온을 포함하는 전해질(46)을 포함한다.
도 4에 도시된 바와 같이, 기판(12)은 그 안에 규정된 복수의 트랜스 웰(16')을 포함할 수 있다. 각 트랜스 웰(16')은 개개 나노포어(18)에 의해 공통 시스 웰(14')에 유체 흐름 가능하게 연결될 수 있다. 도 4에 하나의 공통 시스 웰(14')이 도시되어 있지만, 시퀀서(10")가 서로 유체적으로 분리되고 기판(12)에 규정된 개개 트랜스 웰(16') 세트에 유체 흐름 가능하게 연결된 수 개의 시스 웰(14)을 포함할 수 있는 것으로 이해되어야 한다. 다수의 시스 웰(14')은 예를 들어, 단일 기판(12) 상에서 다수의 샘플의 측정을 가능하게 하기 위해, 요망될 수 있다.
나노포어(들)(18)를 통한 유체 소통은 도 4에서 화살표에 의해 지시된다. 또한, 도 4에 도시된 바와 같이, 멤브레인(24)은 시스 웰(14')과 트랜스 웰(들)(16') 사이에 정위될 수 있으며, 나노포어(들)(18)는 시스 웰(14)과 트랜스 웰(들)(16) 간의 유체 연결을 확립시키기 위해 멤브레인(24)에 정위되고, 이를 통해 연장할 수 있다.
나노포어 시퀀서(10')의 시스 웰(14') 및 트랜스 웰(16')은 나노포어 시퀀서(10)의 시스 웰(14) 및 트랜스 웰(16)에 대해 본 명세서에 기술된 바와 동일한 구성(예를 들어, 치수, 레이아웃 등)으로 규정될 수 있다.
이러한 예에서, 시스 웰(14')은 측벽(들)(13')에 의해 규정된 내부 벽(26, 26'), 시스 웰 전극 구조(47)의 레독스 고형물(48)에 의해 규정된 상부 표면(28), 및 멤브레인(24)에 의해 규정된 하부 표면(28')을 갖는다. 이에 따라, 시스 웰(14')은 시스 웰 전극 구조(47)의 레독스 고형물(48), 측벽(들)(13'), 및 멤브레인(24)에 의해 규정된 공간 내에 형성된다.
시스 웰 전극 구조(47)는 측벽(들)(13')에 물리적으로 연결될 수 있다. 시스 웰 전극 구조(47)는 예를 들어, 접착제 또는 다른 적합한 고정 메커니즘에 의해, 측벽(들)(13')에 물리적으로 연결될 수 있다. 시스 웰 전극 구조(47)와 측벽(들)(13') 사이의 계면은 시스 웰(14')의 상부 부분을 시일링할 수 있다.
상기에 언급된 바와 같이, 시스 웰 전극 구조(47)는 제1 베이스 전극(30'), 및 제1 베이스 전극(30')에 고정된 레독스 고형물(48)을 포함한다. 제1 베이스 전극(30')은 흑연, 백금, 금, 은, 구리, 탄소 섬유, 다이아몬드, 및 팔라듐으로 이루어진 군으로부터 선택된 물질을 포함할 수 있거나, 일부 경우에, 이러한 물질로 이루어질 수 있다. 레독스 고형물(48)은 테트라사이아노퀴노다이메탄(TCNQ), 프러시안 블루(예를 들어, 글루코스 센서에서, 고체 상태 전극으로서 사용될 수 있음) 및 폴리피롤로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
도 4에 예시된 바와 같이, 나노포어 시퀀서(10")는 복수의 트랜스 웰(16')을 포함한다. 각 트랜스 웰(16')은 멤브레인(24)의 적어도 일부분 및 이와 관련된 나노포어(18)를 수용하기에 충분히 큰 개구(예를 들어, 시스 웰(14')을 대면함)를 갖는다. 예를 들어, 나노포어(18)의 단부는 멤브레인(24)을 통해 및 트랜스 웰(16')의 개구 내로 연장할 수 있다.
각 트랜스 웰(16')은 기판(12)에 규정된 유체 챔버이다. 도 4에 도시된 예에서, 각 트랜스 웰(16')은 기판(12)에 의해 및/또는 기판(12)의 틈새 영역(32)에 의해 규정된 측벽(31, 31'), 트랜스 웰 전극 구조(50)의 레독스 고형물(48)에 의해 규정된 하부 표면(36), 및 멤브레인(24)에 의해 규정된 상부 표면(36')을 갖는다. 이에 따라, 각 트랜스 웰(16')은 랜스 웰 전극 구조(50)의 레독스 고형물(48), 기판(12)의 다른 부분 및/또는 틈새 영역(32), 및 멤브레인(24)에 의해 규정된 공간 내에 형성된다. 상부 표면(36')이 멤브레인(24)에 정위된 나노포어(들)(18)를 통해 개구(들)를 갖는 것으로 이해되어야 한다.
트랜스 웰 전극 구조(50)는 기판(12)에 물리적으로 연결될 수 있고, 기판(12)을 형성하는 공정에서(예를 들어, 트랜스 웰(16')의 형성 동안) 제작될 수 있다. 기판(12) 및 트랜스 전극(34')을 형성하기 위해 사용될 수 있는 마이크로제작 기술은 리소그래피, 금속 증착 및 리프트오프(liftoff), 드라이 및/또는 스핀 온 필름 증착, 에칭 등을 포함한다. 트랜스 웰 전극 구조(50)와 기판(12) 사이의 계면은 트랜스 웰(16')의 하부 부분을 시일링할 수 있다.
상기에 언급된 바와 같이, 트랜스 웰 전극 구조(50)는 제2 베이스 전극(34'), 및 제2 베이스 전극(34')에 고정된 레독스 고형물(48)을 포함한다. 제2 베이스 전극(34') 상의 레독스 고형물(48)은 제1 베이스 전극(30') 상에 고정된 동일한 타입의 레독스 고형물(48)이다. 이와 같이, 제2 베이스 전극(34') 상의 레독스 고형물(48)은 테트라사이아노퀴노다이메탄(TCNQ), 프러시안 블루 및 폴리피롤로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 베이스 전극(34')은 베이스 전극(30')과 동일한 물질 또는 이와는 상이한 타입의 물질일 수 있다. 이와 같이, 제2 베이스 전극(34')은 흑연, 백금, 금, 은, 구리, 탄소 섬유, 다이아몬드, 및 팔라듐으로 이루어진 군으로부터 선택된 물질을 포함할 수 있거나, 일부 경우에, 이러한 물질로 이루어질 수 있다.
레독스 고형물(48)은 임의의 적합한 화학적 또는 전기화학적 증착 공정을 이용하여 개개 베이스 전극(30', 34') 상에 증착될 수 있다. 일례로서, 프러시안 블루는 페릭(Fe3 +) 및 페리사이아나이드([Fe3 +(CN)6]3 -) 이온의 혼합물을 함유한 수용액으로부터, 개방-회로 체제(open-circuit regime)에서 동시에, 또는 환원성 전기화학적 구동력을 가함으로써 증착될 수 있다.
레독스 고형물(48)의 두께는 약 10㎚ 내지 약 10㎛ 범위의 두께를 가질 수 있다. 일례로서, TCNQ 레독스 고형물은 약 100㎚ 내지 5㎛ 범위의 두꺼운 필름일 수 있다. 수 개의 두께 범위가 제공될 수 있지만, 두께가, 부분적으로, 증착 공정의 제공된 한계 및 장기간 시퀀서 작동을 유지하기 위해 특정 양의 레독스 고형물에 대한 요구에 의존적일 수 있는 것으로 이해되어야 한다.
본 명세서에 기술된 임의의 멤브레인(24) 및 나노포어(18)는 나노포어 시퀀서(10")를 위해 사용될 수 있다.
나노포어 시퀀서(10")의 전해질(46)은 전해질(44)에 대해 제공된 임의의 예일 수 있다. 간단히 말해서, 전해질(46)은 반대 이온(양이온 및 이의 관련된 음이온)으로 해리할 수 있는 임의의 전해질일 수 있으며, 여기서, 양이온은 또한, 베이스 전극(30', 34') 상의 레독스 고형물(48)에 의해 방출되고 소모될 수 있다. 일부 경우에, 전해질(46)은 전해질(44) 중 하나의 수용액이다. 나노포어 시퀀서(10")의 이러한 예에서, 전해질(46)은 시스 웰(14') 및 트랜스 웰(들)(16')에 존재한다. 이와 같이, 시스 웰(14') 및 트랜스 웰(들)(16')은 나노포어(들)(18)와 접촉하게 전해질(46)을 유지시킬 수 있다.
레독스 고형물(48)은 물이 파괴되지 않는 전위 윈도우(potential window)에서 시스 웰(14') 및 트랜스 웰(들)(16')에서 사용되는 전해질(46)에서 레독스 활성적이다. 본 명세서에 개시된 레독스 고형물(48)의 예는 비교적 낮은 전위(예를 들어, -1V 내지 1V)에서 레독스 반응을 일으킨다. 레독스 고형물(48)은 전해질(46)의 양이온을 소모하는 캐소드 반응(음 전위에 노출될 때)을 일으킬 수 있으며(예를 들어, 하기 반응식 1), 전해질(46)에 양이온을 방출시키는 애노드 반응(양 전위에 노출될 때)을 일으킬 수 있다(예를 들어, 하기 반응식 2). 일례로서, 개개 베이스 전극(30', 34') 상에 고정된 TCNQ 레독스 고형물(48)을 갖는 전극 구조(47, 50)를 포함하는 레독스 반응은 하기를 포함한다:
TCNQ(고체) + e- + K+ (aq) → (K+TCNQ-)(고체) (반응식 1)
(K+TCNQ-)(고체) → TCNQ(고체) + e- + K+ (aq) (반응식 2).
이러한 반응은 양이온(예를 들어, K+)이 트랜스 웰(들)(16')에서 방출되고 시스 웰(14')에서 소모되도록 적절한 전위의 인가에 의해 유도될 수 있다. 이는 트랜스 웰(들)(16')에서 음이온 고갈을 제거할 것이다.
도 5를 참조하면, 나노포어 시퀀서(10")를 포함하는 방법(200)의 예는 시스 웰 전극 구조(47)에 제1 전압을 인가하여 나노포어 시퀀서(10")(참조 번호 202에 도시된 바와 같음)에서 전해질(46)의 양이온을 소모하는 캐소드 반응을 개시하고, 트랜스 웰 전극 구조(50)에 제2 전압을 인가하여 전해질(46)의 양이온을 방출하는 애노드 반응을 개시함으로써, 나노포어 시퀀서(10")에서 전해질(46)의 레독스 반응물의 고갈을 조절하는 것을 포함한다.
방법(200)은 또한, 시스 웰(14') 및 트랜스 웰(16') 각각에 전극 구조(47, 50) 및 전해질(46)을 갖는 나노포어 시퀀서(10")를 제공하는 것을 포함할 수 있다. 방법(200)은 또한, 시스 웰(14') 및 트랜스 웰(16') 각각에 전해질(46)을 도입하는 것을 포함할 수 있다.
방법(200)은 나노포어 시퀀싱 작업 동안 수행될 수 있다. 나노포어(18)를 가로지르는 전기 전위(즉, 전류 소스로서 제1 전극 구조(47) 및 제2 전극 구조(50)에 의해 제공된 사전결정된 바이어스)는 전하를 운반하는 양이온 및/또는 음이온과 함께 나노포어(18)를 통한 뉴클레오타이드의 전위를 강제한다. 바이어스에 따라, 뉴클레오타이드는 시스 웰(14')에서 트랜스 웰(16')로, 또는 트랜스 웰(16')에서 시스 웰(14')로 이송될 수 있다. 뉴클레오타이드가 나노포어(18)를 통해 통과함에 따라, 배리어를 가로지르는 전류는 예를 들어, 구조의 염기-의존 차단으로 인해 변한다. 전류 변화로부터의 신호는 증폭기, 또는 다른 공지된 신호 검출 장치를 이용하여 측정될 수 있다.
전압에 대한 범위는 약 -1V 내지 약 1.5 V 이상에서 선택될 수 있다. 일례에서, 레독스 고형물(48)로서 TCNQ를 사용하여 시퀀서(10")를 작동시키기 위한 적합한 전압 범위는 약 0.4 V 내지 약 1.2 V이다. 이는 제1 베이스 전극(30')과 제2 베이스 전극(34') 사이에 인가된 전압 차에 해당한다. 전압 극성은, 음으로 하전된 핵산이 나노포어(18) 내로 전기영동적으로 유도되도록 인가될 수 있다. 일부 경우에, 적절한 기능을 촉진시키기 위해, 전압이 감소될 수 있거나, 극성이 역전될 수 있다.
본 개시내용을 추가로 예시하기 위하여, 본 명세서에 실시예가 제공된다. 이러한 실시예가 예시적인 목적을 위해 제공되고, 본 개시내용의 범위를 제한하는 것으로서 해석되지 않는 것으로 이해되어야 한다.
비제한적인 실시예
실시예 1
단일 시스 웰 및 단일 트랜스 웰을 갖는 2개의 나노포어 시퀀서(본 명세서에서 각각 "1" 또는 "포어 1" 및 "2" 또는 "포어 2"로서 지칭됨)를 제조하였다. 어떠한 크라운 에터도 없이, 염화칼륨을 시퀀서의 시스 웰(1) 및 트랜스 웰(2) 내에 도입하였다. 각 나노포어 시퀀서(1, 2)는 시스 웰과 트랜스 웰 사이의 지질 이중층 멤브레인에 정위된 MsPA 나노포어를 포함하였다.
다양한 전압 전위를 나노포어 시퀀서(1, 2) 각각에 나노포어 각각을 가로질러 인가하였고, 전류를 측정하였다. 결과는 도 6a에 도시되어 있다. 나노포어 시퀀서(1)(포어 1)는 "게이팅(gating)"으로서 공지된, 역-바이어스될 때 비대칭 반응을 나타내었으며, 나노포어 시퀀서(2)(포어 2)는 대칭 반응을 나타내었다.
염화칼륨을 나노포어 시퀀서(2)의 시스 웰 및 트랜스 웰 둘 다로부터 관류시켰다. 크라운 에터, 18-크라운-6을 400mM로 염화칼륨에 첨가하였으며, 이러한 전해질을 나노포어 시퀀서(2)의 시스 웰 및 트랜스 웰 내에 도입하였다. 다양한 전압 전위를 나노포어 시퀀서(2)에서의 나노포어를 가로질러 인가하였으며, 전류를 측정하였다. 결과는 도 6b에 도시되어 있다. 도 6b는 또한, 비교를 위해 도 6a(크라운 에터가 없음)로부터의 나노포어 시퀀서(2)에 대한 결과를 도시한 것이다. 크라운 에터가 첨가되었을 때, 나노포어 시퀀서(2)는 포워드 및 리버스 바이어스 방향 둘 다에서 전류의 억제를 나타내었다. 네가티브 바이어스 및 포지티브 바이어스 둘 다에서의 전도의 감소는, 18-크라운-6이 MspA 나노포어를 통한 K+ 수송을 지연시켰음을 확인하였다. 이러한 결과는, 크라운 에터와 K+ 이온의 착화가 흐르는 전류를 2x의 기대 인자만큼 감소시킴으로써 나노포어를 통한 K+ 이온 수송을 지연시킴을 시사한다.
크라운 에터와 함께 염화칼륨을 이후에, 나노포어 시퀀서(2)의 시스 웰로부터 관류시켰다. 시스 웰 및 트랜스 웰이 지질 층에 의해 분리되었기 때문에, 크라운 에터가 첨가된 염화칼륨는 나노포어 시퀀서(2)의 트랜스 웰에 잔류하였다. 다양한 전압 전위를 나노포어 시퀀서(2)에서의 나노포어를 가로질러 인가하고, 전류를 측정하였다. 결과는 도 6c에 도시되어 있으며, 라인에서 "포어 2 - 관류됨"으로 라벨링되어 있다. 도 6c는 또한, 비교를 위해 도 6a(크라운 에터를 가지지 않음)로부터 나노포어 시퀀서(2)에 대한 결과를 도시한 것이다. 크라운 에터가 관류된 후 나노포어 시퀀서(2)의 IV 곡선(도 6c에서 "포어 2 - 관류됨"으로 라벨링된 라인)은 표준 상태(도 6c에서 "포어 2"로 라벨링된 라인)로 거의 되돌아왔다. 일부 잔류 효과는 리버스 바이어스 하에서 전류 이동 시에 관찰되었으며, 이는 트랜스 웰에 트랩핑되어 잔류하는 소량의 크라운 에터와 일치하였다.
실시예 2
87개의 뉴클레오타이드 염기 및 66℃의 용융 온도를 갖는 헤어핀 구조를 갖는 올리고머를 전위 실험에서 사용하였다. 2개의 나노포어 시퀀서를 사용하였다. 각각은 단일 시스 웰 및 단일 트랜스 웰, 및 시스 웰과 트랜스 웰 사이의 지질 이중층 멤브레인에 정위된 MspA 나노포어를 갖는다.
비교 시퀀서에서, 어떠한 크라운 에터 없이 여기에 첨가된 염화칼륨을 시스 웰 및 트랜스 웰 내에 도입하였다. 실시예 시퀀서에서, 400mM 18-크라운 6이 첨가된 염화칼륨을 시스 웰 및 트랜스 웰 내에 도입하였다. 예시적인 올리고머를 비교 시퀀서 및 실시예 시퀀서를 통해 전위시켰다.
비교 시퀀서에 대한 이온 전류 대 시간 결과는 도 7a에 도시되어 있으며, 결과의 막대그래프는 도 7b에 도시되어 있다. 비교 시퀀서를 위하여, 개방 포어 전류는 107.5 pA이며, 중간 차단 전류는 73.5 pA(68%)였다. 도 7a에서 20 pA 내지 50 pA의 판독값은 깊은 차단(deep blockade)에 해당하는 것으로 사료되는데, 여기서, 헤어핀 DNA 올리고머는 압축을 풀고, 전위에서 스톨(stall)이 존재한다. 막대그래프에서, 이러한 깊은 차단이 70 내지 80의 진폭에서 나타나는 것으로 여겨진다.
실시예 시퀀서에 대한 이온 전류 대 시간 결과는 도 8a에 도시되어 있으며, 결과의 막대그래프는 도 8b에 도시되어 있다. 실시예 시퀀서에 대하여, 개방 포어 전류는 88.5 pA였으며, 중간 차단 전류는 57.5 pA(65%)였다. 도 8a에 도시된 바와 같이, 20 pA 내지 50 pA의 판독값의 감소된 수가 존재한다. K+ 이온의 착화가 DNA가 압축을 더욱 용이하게 풀려져서, 깊은 차단을 감소시키는 것으로 여겨진다. 도 8b에서, 70 내지 80의 진폭의 신호가 존재하지 않는 것으로 관찰되며, 또한, 깊은 차단이 감소되거나 제거된다는 개념을 지지한다.
전체적으로, 실시예 시퀀서의 전류 수준 이동은 나노포어를 통한 전도에 대한 K+ 이온의 기여의 감소와 일치한다. 이러한 것이 또한, Cl- 이온 고갈을 감소시킬 것으로 여겨진다.
추가적인 사항(Additional Note)
상기 개념 및 하기에서 더욱 상세히 논의된 추가적인 개념(단, 이러한 개념은 서로 불일치하지 않음)의 모든 조합이 본 명세서에 개시된 본 발명의 주제의 일부로서 고려되는 것으로 인식되어야 한다. 특히, 이러한 개시내용의 마지막에 나타낸 청구된 주제의 모든 조합은 본 명세서에 개시된 본 발명의 주제의 일부인 것으로 고려된다. 또한, 임의의 개시내용에서 참고로 포함될 수 있는 본 명세서에 명시적으로 이용되는 용어가 본 명세서에 개시된 특정 개념과 가장 일치하는 의미가 부여되어야 하는 것으로 인식되어야 한다.
"일례", "다른 예", "예" 등에 대한 사양 전반에 대한 언급은, 예와 관련하여 기술된 특정 구성요소(예를 들어, 특성, 구조 및/또는 특징)가 본 명세서에 기술된 적어도 하나의 예에 포함되고 다른 예에 존재할 수 있거나 존재하지 않을 수 있음을 의미한다. 또한, 임의의 예에 대한 기술된 구성요소가 문맥이 달리 명확하게 지시하지 않는 한, 다양한 예에서 임의의 적합한 방식으로 조합될 수 있는 것으로 이해되어야 한다.
본 명세서에 제공된 범위가 기술된 범위 및 기술된 범위 내의 임의의 수치 또는 하위-범위를 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 예를 들어, 약 50mM 내지 약 500mM의 범위는 약 50mM 내지 약 500mM의 명시적으로 인용된 한계를 포함할 뿐만 아니라, 개개 수치, 예를 들어, 약 100mM, 약 335mM, 약 400.5mM, 약 490mM 등, 및 하위-범위, 예를 들어, 약 75mM 내지 약 475mM, 약 200mM 내지 약 300mM 등을 포함하는 것으로 해석되어야 한다. 또한, "약" 및/또는 "실질적으로"가 수치를 기술하기 위해 사용될 때, 이는 기술된 수치로부터의 최소 편차(± 10% 이하)를 포함하는 것을 의미한다.
여러 예가 상세히 기술되어 있지만, 개시된 예가 변형될 수 있는 것으로 이해되어야 한다. 이에 따라, 상기 설명은 비-제한적인 것으로 고려된다.

Claims (20)

  1. 나노포어 시퀀서(nanopore sequencer)로서,
    시스 웰(cis well);
    트랜스 웰(trans well);
    상기 시스 웰 및 상기 트랜스 웰을 유체 흐름 가능하게 연결하는 나노포어(nanopore); 및
    상기 시스 웰, 또는 상기 트랜스 웰, 또는 상기 시스 웰 및 트랜스 웰에서의 개질된 전해질로서, 전해질 및 양이온 착화제(cation complexing agent)를 포함하는 개질된 전해질을 포함하는, 나노포어 시퀀서.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 개질된 전해질은 상기 시스 웰에 존재하고, 상기 나노포어 시퀀서는 상기 트랜스 웰에서의 비-개질된 전해질을 더 포함하되, 상기 비-개질된 전해질은 상기 양이온 착화제 없이 상기 전해질을 포함하거나; 또는
    상기 개질된 전해질은 상기 트랜스 웰에 존재하고, 상기 나노포어 시퀀서는 상기 시스 웰에서의 상기 비-개질된 전해질을 더 포함하되, 상기 비-개질된 전해질은 상기 양이온 착화제 없이 상기 전해질을 포함하는, 나노포어 시퀀서.
  3. 제1항에 있어서, 기판에 규정된 복수의 상기 트랜스 웰을 더 포함하되, 상기 트랜스 웰의 각각은 개개 나노포어에 의해 상기 시스 웰에 유체 흐름 가능하게 연결되고, 상기 복수의 트랜스 웰의 밀도는 상기 기판 1 ㎟당 약 10개의 트랜스 웰 내지 상기 기판 1 ㎟당 약 1,000,000개의 트랜스 웰의 범위인, 나노포어 시퀀서.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 전해질이 칼륨 양이온 및 관련된 음이온, 나트륨 음이온 및 상기 관련된 음이온, 또는 이들의 조합을 포함하고; 그리고
    상기 양이온 착화제가 크라운 에터, 칼릭사렌(calixarene) 및 발리노마이신(valinomycin)으로 이루어진 군으로부터 선택된, 나노포어 시퀀서.
  5. 제1항에 있어서, 상기 개질된 전해질은 0mM 초과 내지 약 500mM의 상기 양이온 착화제를 포함하는, 나노포어 시퀀서.
  6. 제1항의 나노포어 시퀀서를 사용하는 방법으로서,
    상기 나노포어 시퀀서의 시스 웰과 상기 나노포어 시퀀서의 트랜스 웰 사이에 약 -1V 내지 약 1V의 범위의 전압 바이어스를 인가함으로써 상기 나노포어 시퀀서에서 전해질의 레독스 시약(redox reagent)의 고갈을 조절하는 단계를 포함하는, 나노포어 시퀀서를 사용하는 방법.
  7. 제6항에 있어서, 상기 나노포어 시퀀서에,
    상기 시스 웰에서의 개질된 전해질, 및 상기 트랜스 웰에서의 양이온 착화제가 없는 전해질을; 또는
    상기 트랜스 웰에서의 상기 개질된 전해질, 및 상기 시스 웰에서의 상기 양이온 착화제가 없는 상기 전해질을
    제공하는 단계를 더 포함하는, 나노포어 시퀀서를 사용하는 방법.
  8. 제6항에 있어서,
    상기 개질된 전해질을 형성하기 위해 상기 전해질 내에 양이온 착화제를 혼입시키는 단계; 및
    상기 시스 웰, 또는 상기 트랜스 웰, 또는 상기 시스 웰 및 트랜스 웰에 상기 개질된 전해질을 도입하는 단계를 더 포함하는, 나노포어 시퀀서를 사용하는 방법.
  9. 제6항에 있어서,
    상기 전해질은 칼륨 양이온 및 관련된 음이온, 나트륨 음이온 및 상기 관련된 음이온, 또는 이들의 조합을 포함하고; 그리고
    상기 양이온 착화제는 크라운 에터, 칼릭사렌 및 발리노마이신으로 이루어진 군으로부터 선택된, 나노포어 시퀀서를 사용하는 방법.
  10. 시스 웰;
    트랜스 웰;
    상기 시스 웰 및 상기 트랜스 웰을 유체 흐름 가능하게 연결시키는 나노포어; 및
    상기 시스 웰, 또는 상기 트랜스 웰, 또는 상기 시스 웰 및 트랜스 웰에서의 겔 상태의 다가전해질을 포함하는, 나노포어 시퀀서.
  11. 제10항에 있어서,
    상기 다가전해질은 상기 시스 웰에 존재하고, 상기 나노포어 시퀀서는 상기 트랜스 웰에 전해질을 더 포함하거나; 또는
    상기 다가전해질은 상기 트랜스 웰에 존재하고, 상기 나노포어 시퀀서는 상기 시스 웰에서의 전해질을 더 포함하는, 나노포어 시퀀서.
  12. 제11항에 있어서,
    상기 다가전해질은 폴리다이알릴디메틸암모늄 클로라이드, 이온 형태의 폴리에틸렌이민, 이온 형태의 선형 폴리에틸렌이민, 폴리(알릴아민 하이드로클로라이드), 및 이온 형태의 폴리(4-비닐피리딘)으로 이루어진 군으로부터 선택되며; 그리고
    상기 전해질은 칼륨 양이온 및 관련된 음이온, 나트륨 음이온 및 상기 관련된 음이온, 또는 이들의 조합을 포함하는, 나노포어 시퀀서.
  13. 제10항에 있어서, 기판에서 규정된 복수의 상기 트랜스 웰을 더 포함하되, 상기 트랜스 웰의 각각은 개개 나노포어에 의해 상기 시스 웰에 유체 흐름 가능하게 연결되고, 상기 복수의 트랜스 웰의 밀도가 상기 기판 1 ㎟당 약 10개의 트랜스 웰 내지 상기 기판 1 ㎟당 약 1,000,000개의 트랜스 웰의 범위인, 나노포어 시퀀서.
  14. 제10항에 있어서,
    상기 다가전해질은 상기 시스 웰 및 트랜스 웰 둘 다에 존재하고; 그리고
    상기 다가전해질은 폴리다이알릴디메틸암모늄 클로라이드, 이온 형태의 폴리에틸렌이민, 이온 형태의 선형 폴리에틸렌이민, 폴리(알릴아민 하이드로클로라이드), 및 이온 형태의 폴리(4-비닐피리딘)으로 이루어진 군으로부터 선택된, 나노포어 시퀀서.
  15. 제10항의 나노포어 시퀀서를 사용하는 방법으로서,
    상기 나노포어 시퀀서의 시스 웰과 상기 나노포어 시퀀서의 트랜스 웰 사이에 약 -1V 내지 약 1V의 범위의 전압 바이어스를 인가함으로써 상기 나노포어 시퀀서에서의 다가전해질의 레독스 시약의 고갈을 조절하는 단계를 포함하는 방법.
  16. 나노포어 시퀀서로서,
    시스 웰;
    트랜스 웰;
    상기 시스 웰 및 상기 트랜스 웰을 유체 흐름 가능하게 연결시키는 나노포어;
    상기 시스 웰과 관련된 시스 웰 전극 구조로서, 제1 베이스 전극 및 상기 제1 베이스 전극에 고정된 레독스 고형물을 포함하는, 상기 시스 웰 전극 구조;
    상기 트랜스 웰과 관련된 트랜스 웰 전극 구조로서, 제2 베이스 전극 및 상기 제2 베이스 전극에 고정된 상기 레독스 고형물을 포함하는, 상기 트랜스 웰 전극 구조; 및
    상기 시스 웰 전극 구조 및 상기 트랜스 웰 전극 구조에서 개개 레독스 반응에 응하여 소모되거나 방출되는 양이온을 포함하는 전해질을 포함하는, 나노포어 시퀀서.
  17. 제16항에 있어서, 상기 레독스 고형물은 테트라사이아노퀴노다이메탄(TCNQ), 프러시안 블루(Prussian blue) 및 폴리피롤로 이루어진 군으로부터 선택된, 나노포어 시퀀서.
  18. 제16항에 있어서, 상기 제1 베이스 전극 및 상기 제2 베이스 전극은 흑연, 백금, 금, 은, 구리, 탄소 섬유, 다이아몬드, 및 팔라듐으로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된, 나노포어 시퀀서.
  19. 제16항의 나노포어 시퀀서를 사용하는 방법으로서,
    시스 웰 전극 구조에 제1 전압을 인가하여, 나노포어 시퀀서에서 전해질의 양이온을 소모하는 캐소드 반응(cathodic reaction)을 개시하고;
    트랜스 웰 전극 구조에 제2 전압을 인가하여, 상기 전해질의 상기 양이온을 방출시키는 애노드 반응(anodic reaction)을 개시함으로써,
    상기 나노포어 시퀀서에서의 상기 전해질의 레독스 시약의 고갈을 조절하는 단계를 포함하는, 나노포어 시퀀서를 사용하는 방법.
  20. 제19항에 있어서, 레독스 고형물이 테트라사이아노퀴노다이메탄(TCNQ), 프러시안 블루 및 폴리피롤로 이루어진 군으로부터 선택되는, 나노포어 시퀀서를 사용하는 방법.
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