RU2014149813A - Способ нанопорового секвенирования днк - Google Patents

Abstract

1. Способ нанопорового секвенирования ДНК, включающий пропускание одноцепочечной молекулы через нанометрового размера поры в мембране и измерение электропроводных свойств поры при прохождении через пору нуклеотидов цепи, отличающийся тем, что молекулы нуклеиновых кислот предварительно амплифицируют (например, полимеразной цепной реакцией), разделяют на образцы, каждый образец смешивают с одной из проб, каждая из которых содержит уникальный вариант одноцепочечной молекулы олигонуклеотида, образцы помечают использованными олигонуклеотидами для их различения, проводят в образцах гибридизацию между ДНК и олигонуклеотидами, например, нагреванием раствора до плавления ДНК и последующим охлаждением, затем секвенируют гибридизированые с олигонуклеотидами одноцепочечные молекулы ДНК, для чего пропускают молекулы ДНК через поры в мембране, например, с помощью электрофоретического переноса молекул под действием электрического поля и с помощью измерений определяют факт прохождения через пору нуклеотида одноцепочечного участка молекулы и факт прохождения через пору спаренного нуклеотида двухцепочечного участка молекулы, например, замеряют изменение силы тока через пору, тем самым определяют и различают случаи прохождения нуклеотида на одноцепочечной молекуле и прохождения двухцепочечного участка молекулы или используют поры такого размера, через которые может проходить только одноцепочечная молекула ДНК, в этом случае дополнительно регистрируют скорость движения молекулы и вхождение в пору двухцепочечного участка определяют по замедлению движения молекулы через пору или по остановке движения молекул

Claims (7)

1. Способ нанопорового секвенирования ДНК, включающий пропускание одноцепочечной молекулы через нанометрового размера поры в мембране и измерение электропроводных свойств поры при прохождении через пору нуклеотидов цепи, отличающийся тем, что молекулы нуклеиновых кислот предварительно амплифицируют (например, полимеразной цепной реакцией), разделяют на образцы, каждый образец смешивают с одной из проб, каждая из которых содержит уникальный вариант одноцепочечной молекулы олигонуклеотида, образцы помечают использованными олигонуклеотидами для их различения, проводят в образцах гибридизацию между ДНК и олигонуклеотидами, например, нагреванием раствора до плавления ДНК и последующим охлаждением, затем секвенируют гибридизированые с олигонуклеотидами одноцепочечные молекулы ДНК, для чего пропускают молекулы ДНК через поры в мембране, например, с помощью электрофоретического переноса молекул под действием электрического поля и с помощью измерений определяют факт прохождения через пору нуклеотида одноцепочечного участка молекулы и факт прохождения через пору спаренного нуклеотида двухцепочечного участка молекулы, например, замеряют изменение силы тока через пору, тем самым определяют и различают случаи прохождения нуклеотида на одноцепочечной молекуле и прохождения двухцепочечного участка молекулы или используют поры такого размера, через которые может проходить только одноцепочечная молекула ДНК, в этом случае дополнительно регистрируют скорость движения молекулы и вхождение в пору двухцепочечного участка определяют по замедлению движения молекулы через пору или по остановке движения молекулы, в таком случае повышают разность потенциалов между сторонами мембраны до возобновления движения, после пропускания всей ДНК через пору и проведения измерений для каждого образца имеют последовательности данных о положении на цепи участков неизвестных одиночных нуклеотидов и участков известного состава, комплементарных олигонуклеотиду пробы, использованному для образца, которые используют для восстановления всей последовательности, для чего сопоставляют друг с другом последовательности с разными известными участками, распределяют последовательности по группам вариантов прохождения двух комплементарных нитей двумя разными концами, сравнивают последовательности внутри предполагаемых групп, проводят логический анализ на непротиворечивость наложений внутри групп, перебирают разные варианты распределения по группам или с помощью независимых друг от друга преобразований переворота последовательности и замены всех известных нуклеотидов на комплементарные получают варианты последовательностей, которые

сравнивают друг с другом, проводят логический анализ на непротиворечивость наложений, отбрасывают дубликаты, перебирают разные варианты преобразований переворота и замен нуклеотидов, получают конечный вариант о непротиворечивом наложении друг на друга последовательностей образцов в одну, которая является искомой последовательностью ДНК.

2. Способ чтения ДНК по п. 1, отличающийся тем, что все пробы содержат олигонуклеотиды одинаковой длины.

3. Способ чтения ДНК по п. 2, отличающийся тем, что используют олигонуклеотиды единичной длины, представленные набором из 4 проб, каждая из которых содержит один отличный от других нуклеотид.

4. Способ чтения ДНК по п. 2, отличающийся тем, что используют олигонуклеотиды длиной в два нуклеотида, представленные набором из 16 проб, каждая из которых содержит один отличный от других олигонуклеотид.

5. Способ чтения ДНК по п. 2, отличающийся тем, что используют олигонуклеотиды длиной в три нуклеотида или более (произвольной длины), представленные набором проб в количестве равному числу уникальных комбинаций последовательностей (например, 64 для случая длины три), каждая из которых содержит один отличный от других олигонуклеотид.

6. Способ чтения ДНК по п. 1, отличающийся тем, что в разных пробах используют олигонуклеотиды неодинаковой длины.

7. Способ чтения ДНК по одному из пп. 1-6, отличающийся тем, что после проведения гибридизации с олигонуклеотидами проб в каждый образец для анализа добавляют нуклеотид, содержащий комплементарное гуанину азотистое основание, например, цитозин (нуклеотид дезоксицитидинмонофосфат, дЦМФ).