ES2578384T3 - Detección de diferencias genéticas cuantitativas - Google Patents

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Abstract

Un método para la detección de una diferencia cuantitativa entre la cantidad de una primera región objetivo de un ácido nucleico y una segunda región objetivo de un ácido nucleico en una muestra, de forma que la primera región objetivo es un gen o cromosoma cuyo número de copias relativo se va a estudiar, y la segunda región objetivo es un gen o cromosoma diferente presente en un número de copias normal, en el que dicho método comprende las etapas de: (a) proporcionar la muestra que comprende el ácido nucleico; (b) hibridar una o más primeras sondas a la primera región objetivo; (c) hibridar una o más segundas sondas a la segunda región objetivo, de forma que el número y/o la posición de las segundas sondas en la segunda región objetivo difiere del número y/o la posición de las primeras sondas en la primera región objetivo; (d) detectar el número y/o la posición de las primeras sondas identificadas en las moléculas de ácido nucleico de la muestra como un distintivo específico asignable a la presencia de la primera región objetivo; (e) detectar el número y/o la posición de las segundas sondas identificadas en las moléculas de ácido nucleico de la muestra como un distintivo específico asignable a la presencia de la segunda región objetivo; en el que una diferencia entre el número de distintivos específicos obtenidos en la etapa (d) y el número de distintivos específicos obtenidos en la etapa (e) es indicativa de una diferencia cuantitativa entre la cantidad de la primera y la segunda regiones objetivo de un ácido nucleico en la muestra; y en el que las etapas de detección (d) y (e) comprenden un método de detección basado en nanoporos.

Description

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en el que las etapas de detección (d) y (e) comprenden un método de detección basado en nanoporos.
La invención de estos aspectos, por lo tanto, proporciona una aproximación más selectiva para comparar directamente los distintivos totales generados por los ácidos nucleicos en conjunto en una muestra en vez de analizar los ácidos nucleicos a nivel de nucleótidos individuales. Estos aspectos de la invención, por lo tanto, proporcionan métodos que generan muchos menos datos, y por lo tanto mejoran significativamente la eficacia del procedimiento de diagnóstico.
En una realización, la o las primeras sondas y/o la o las segundas sondas comprenden un ácido peptidonucleico (APN), bis-APN o ADN, tal como ADN monocatenario (ssADN). En una realización adicional, la o las primeras sondas y/o la o las segundas sondas comprenden APN o bis-APN. Los ácidos peptidonucleicos (APNs) son una clase importante de análogos artificiales de ácido nucleico que son oligómeros neutros con un esqueleto similar a un péptido sobre el cual se injertan las nucleobases en una secuencia diseñada. Las moléculas de bis-APN consisten en dos oligómeros de APN conectados por un ligador flexible (Singer et al (2010) Nano Lett. 10, 738-742). En una realización adicional, la o las primeras sondas y/o la o las segundas sondas comprenden bis-APN o una variante del mismo (tal como APN pseudocomplementario o y-APN). Sin limitarse por la teoría, se cree que el bis-APN se une a una de las dos cadenas de la región objetivo del ácido nucleico con una elevada afinidad y con especificidad de secuencia en virtud de los pares de bases de Watson-Crick y Hoogsteen. Se apreciará que la hibridación de la o las primeras sondas y/o la o las segundas sondas se llevará a cabo de acuerdo con la metodología conocida.
En una realización, la o las primeras sondas y/o la o las segundas sondas comprenden uno o más oligonucleótidos, tal como un oligonucleótido de 10 a 25 pares de bases, en particular un oligonucleótido de 10 a 15 pares de bases.
En una realización, la o las primeras sondas y/o la o las segundas sondas comprenden una etiqueta o marcador detectable. La presencia de tal etiqueta o marcador aumentará enormemente la capacidad de las etapas de detección (d) y (e) para poder detectar el distintivo asignado a la primera y segunda regiones objetivo. Tal etiqueta o marcador se puede incorporar en la sonda durante la amplificación. Los ejemplos de etiquetas o marcadores adecuados incluyen moléculas y/o partículas fluorescentes, magnéticas o radiactivas. Los ejemplos de fluoróforos adecuados incluyen FAM -6 carboxifluoresceína o TET -tetraclorofluoresceína.
También se describe cuando la etapa de detección de las etapas (d) y (e) comprende un método de detección basado en citometría de flujo, un método de detección basado en la piezoelectricidad o un método de detección basado en una PCR digital.
La PCR digital implica múltiples análisis mediante PCR con ácidos nucleicos extremadamente diluidos, de forma que las amplificaciones más positivas reflejan la señal de una molécula molde individual, lo que permite el recuento de las moléculas molde individuales. La proporción de amplificaciones positivas entre el número total de PCRs analizado permite una estimación de la concentración de molde en la muestra original sin diluir. Se ha demostrado que el proceso de PCR digital es de utilidad particular en la detección molecular de la aneuploidía cromosómica fetal (Lo et al, (2007) PNAS 104(32), 13116-13121).
Para el análisis mediante citometría de flujo, se suspenden células o fragmentos de células en disolución y se tiñen con colorantes fluorescentes. En el citómetro de flujo, las células se fuerzan en una corriente estrecha a través de la trayectoria de una fuente de luz intensa, tal como un láser. Las partículas pasan el haz láser en fila india a una velocidad de varios miles por segundo. Cuando las células entran en el punto de luz, dispersan la luz o emiten fluorescencia. A medida que cada partícula pasa a través de la fuente de luz, se cuantifican y se almacenan sus propiedades ópticas. Se puede medir un gran número de células individualmente, y se pueden determinar las propiedades ópticas de una población de células en un tiempo corto. Muchos citómetros de flujo también tienen la capacidad de clasificar las células. Para este propósito, la corriente de la muestra se fragmenta en gotículas después del punto en el que se llevan a cabo las medidas ópticas. A las gotículas que contienen las células deseadas se les administra una carga eléctrica y se desvían en un tubo de recogida mediante la influencia de un campo electrostático.
Aunque la técnica de citometría de flujo se usa habitualmente para la medida y la detección de células, una de las aplicaciones clave de la citometría de flujo es la detección y la medida de ADN, y para evitar dudas se apreciará que los métodos de la invención requieren la citometría de flujo para analizar ADN en vez de células.
En una realización particular, la etapa de detección de las etapas (d) y (e) comprende un método de detección basado en nanoporos como se definió anteriormente en la presente memoria. Sin limitarse por la teoría, un nucleótido de una molécula de ADN que pasa por un nanoporo de una membrana que tiene una corriente baja aplicada a ella dejará un distintivo específico creando un potencial diferencial. Estas señales se registran, y se genera una secuencia de nucleótidos. Los métodos de detección con nanoporos disponibles habitualmente son capaces de reconocer las moléculas de ADN bicatenarias frente a las monocatenarias o las moléculas de ADN tricatenarias (si el marcador de hibridación es una molécula de APN) frente a las bicatenarias. La ventaja de tal técnica reside en la velocidad y la baja cantidad de material analizado.
También se describe cuando la etapa de detección de las etapas (d) y (e) comprende el uso de un método de detección con placa piezoeléctrica, tal como un método de extracción por hibridación basado en microesferas,
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mediante el uso de un método de detección con placa piezoeléctrica para la cuantificación del analito. Sin limitarse por la teoría, se pueden usar moléculas de unión de oligonucleótidos como agentes de captura para unir el oligonucleótido objetivo de la muestra, y extraerlo para el análisis. Las moléculas de unión de oligonucleótidos se pueden unir a microesferas o a biotina u otras moléculas (que incluyen anticuerpos) para ayudar en su papel como agentes de captura.
Si se usan microesferas magnéticas, se puede determinar el número de microesferas magnéticas unidas, y por lo tanto la concentración del analito (oligonucleótido objetivo) de la muestra, por medio de su adherencia a una placa piezoeléctrica, con el cambio consiguiente de la frecuencia de su vibración, que se puede detectar electrónicamente con gran exactitud. Los ejemplos de la metodología de detección piezoeléctrica adecuada se pueden hallar en los documentos US 2009/293590, US 2009/168068, WO 2009/035732, US 2009/282902, WO 2008/019694, US 2006/105471, US 2006/014270, US 2005/186684, WO 2004/001392, WO 2004/001417, WO 2004/001416, WO 01/26138, US 6.161.426, US 5.447.845, WO 2006/119308, WO 2007/030155 y la solicitud de patente del R.U. Nº 1002627.6.
En una realización, el número de las segundas sondas difiere del número de las primeras sondas. Tal diferencia de número permitirá que la primera región objetivo se diferencie de la segunda región objetivo en virtud de un distintivo específico de las medidas de las sondas asociadas a la primera región objetivo que diferirá en número del distintivo específico de las medidas de las sondas asociadas a la segunda región objetivo. Por ejemplo, mediante el uso del método de detección basado en nanoporos descrito anteriormente en la presente memoria, la segunda sonda creará un número determinado de picos de señal característicos de la presencia del número determinado de segundas sondas hibridadas a la segunda región objetivo cuando se hace pasar la muestra a través del nanoporo. Además, la primera sonda creará un número diferenciado de picos de señal característicos de la presencia de un número diferente de primeras sondas hibridadas a la primera región objetivo cuando se hace pasar la muestra a través del nanoporo. El número de sondas en cada región objetivo, por lo tanto, comprende un distintivo específico muy similar a un "código de barras" que permitirá inmediatamente la diferenciación entre la presencia de una primera región objetivo de una segunda región objetivo.
En una realización, la posición de las segundas sondas difiere de la posición de las primeras sondas. Tal diferencia de distancia entre cada una de las sondas permitirá que la primera región objetivo se diferencie de la segunda región objetivo en virtud de un perfil específico de las medidas de las sondas asociadas a la primera región objetivo que diferirá en el perfil del distintivo específico de las medidas de las sondas asociadas a la segunda región objetivo. Por ejemplo, mediante el uso del método de detección basado en nanoporos descrito anteriormente en la presente memoria, la segunda sonda creará un número determinado de picos de señal característicos de la distancia entre el número determinado de segundas sondas hibridadas a la segunda región objetivo cuando se hace pasar la muestra a través del nanoporo. Además, la primera sonda creará un número diferenciado de picos de señal característicos de la presencia de una distancia diferente entre las primeras sondas hibridadas a la primera región objetivo cuando se hace pasar la muestra a través del nanoporo. Como se discutió anteriormente en la presente memoria, la distancia de las sondas en cada región objetivo, por lo tanto, comprende un código de barras que permitirá inmediatamente la diferenciación entre la presencia de una primera región objetivo de una segunda región objetivo.
En una realización, el número y la posición de las segundas sondas difiere del número y la posición de las primeras sondas. Tal diferencia en número y distancia entre cada una de las sondas permitirá que la primera región objetivo se diferencie de la segunda región objetivo en virtud de un perfil específico de las medidas de las sondas asociadas a la primera región objetivo que diferirá en el perfil del distintivo específico de las medidas de las sondas asociadas a la segunda región objetivo. Por ejemplo, mediante el uso del método de detección basado en nanoporos descrito anteriormente en la presente memoria, la segunda sonda creará un número determinado de picos de señal característicos del número y la distancia entre el número determinado de segundas sondas hibridadas a la segunda región objetivo cuando se hace pasar la muestra a través del nanoporo. Además, la primera sonda creará un número diferenciado de picos de señal característicos de la presencia de un número y distancia diferentes entre las primeras sondas hibridadas a la primera región objetivo cuando se hace pasar la muestra a través del nanoporo. Como se discutió anteriormente en la presente memoria, el número y la distancia de las sondas en cada región objetivo, por lo tanto, comprende un código de barras que permitirá inmediatamente la diferenciación entre la presencia de una primera región objetivo de una segunda región objetivo.
Las referencias en la presente memoria a los términos "distintivo" o "código de barras", cuando se aplican al método de detección con nanoporos, se refieren al perfil obtenido de un nucleótido que pasa a través de un poro por medio de la aplicación de un campo eléctrico. Tal perfil puede incluir, por ejemplo, la duración del paso del nucleótido a través del poro junto con la amplitud observada de la corriente durante ese paso. Los distintivos electrónicos se pueden visualizar, por ejemplo, mediante una representación de la corriente (p.ej. pA) frente al tiempo. También se prevé el distintivo electrónico para un ADN, y puede ser, por ejemplo, una representación de la corriente (p.ej. pA) frente al tiempo para que el ADN pase a través del poro por medio de la aplicación de un campo eléctrico.
La invención tiene la ventaja de que se puede detectar una diferencia muy pequeña en el número de copias de un gen o de un cromosoma. La invención puede incrementar la sensibilidad de la detección cuantitativa de un ácido nucleico respecto de los métodos de amplificación de PCR existentes detectando todas y cada una de las moléculas que contienen sondas, y es capaz de diferenciar las moléculas que contienen la primera sonda de las moléculas que
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sumamente conservada en seres humanos) de un ácido nucleico. La segunda región objetivo de un ácido nucleico puede comprender una secuencia de ácido nucleico de cualquier secuencia o gen de copia simple que no está presente en el mismo cromosoma que la primera región objetivo, por ejemplo, SLIT1 o PI3KADP1.
La primera y/o segunda regiones objetivo de un ácido nucleico pueden tener una longitud de entre alrededor de 10 y alrededor de 8000 pares de bases; o una longitud de entre alrededor de 20 y alrededor de 2000 pares de bases; o una longitud de entre alrededor de 50 y alrededor de 1000 pares de bases. La primera y/o segunda regiones objetivo de un ácido nucleico pueden tener una longitud menor de 500 pares de bases, de manera alternativa una longitud menor de 300 pares de bases, y de manera alternativa una longitud menor de 200 pares de bases. La primera y/o segunda regiones objetivo de un ácido nucleico pueden tener una longitud de entre alrededor de 100 y alrededor de 200 pares de bases. En una realización, la primera y segunda regiones objetivo de un ácido nucleico son similares en longitud, tal como dentro del 10%, de manera alternativa dentro del 20%, entre sí.
En una realización, la primera y segunda secuencias objetivo tienen longitudes diferentes.
La primera y segunda secuencias objetivo pueden incluir diferentes marcadores que permiten distinguirlas. Por ejemplo, la primera secuencia puede portar un primer fluoróforo y la segunda secuencia puede portar un segundo fluoróforo, en los que el primer y segundo fluoróforos pueden ser diferentes.
En algunos casos, solamente parte de un cromosoma está en un número de copias en exceso (p.ej. trisomía parcial)
o en un número de copias reducido (p.ej. deleción o monosomía), así, es ventajoso seleccionar una región particular que se sabe que está en un número de copias en exceso o en un número de copias reducido, y que provoca síntomas de una anormalidad cromosómica o enfermedad relacionada.
La detección de una anormalidad en un número de copias de un cromosoma puede comprender la detección y/o el diagnóstico de una afección que es una anormalidad cromosómica numérica hereditaria.
La detección de una anormalidad en un número de copias de un cromosoma puede comprender la detección y/o el diagnóstico de una afección seleccionada del grupo que comprende el síndrome de Down (trisomía 21), síndrome de Edwards (trisomía 18), síndrome de Patau (trisomía 13), trisomía 9, síndrome de Warkany (trisomía 8), síndrome del ojo de gato (4 copias del cromosoma 22), trisomía 22, y trisomía 16. Además, o de manera alternativa, la detección de una anormalidad en el número de copias de un gen, de un cromosoma, o de parte de un cromosoma, puede comprender la detección y/o el diagnóstico de una afección seleccionada del grupo que comprende el síndrome de Wolf-Hirschhorn (4p-), síndrome de Cri du chat (5p-), síndrome de Williams-Beuren (7-), síndrome de Jacobsen (11), síndrome de Miller-Dieker (17-), síndrome de Smith-Magenis (17-), síndrome de deleción 22q11.2 (también conocido como síndrome velocardiofacial, síndrome de DiGeorge, síndrome de anomalía facial conotruncal, aplasia tímica congénita, y síndrome de Strong), síndrome de Angelman (15-), y síndrome de Prader-Willi (15-).
Además, o de manera alternativa, la detección de una anormalidad en el número de copias de un cromosoma puede comprender la detección y/o el diagnóstico de una afección seleccionada del grupo que comprende el síndrome de Turner (síndrome de Ullrich-Turner o monosomía X), síndrome de Klinefelter, síndrome 47,XXY o XXY, síndrome 48,XXYY, síndrome 49 XXXXY, síndrome Triple 25 X, síndrome XXXX (también denominado tetrasomía X, cuádruple X, o 48,XXXX), síndrome XXXXX (también denominado pentasomía X o 49,XXXXX), y síndrome XYY.
Además, o de manera alternativa, la detección de una anormalidad en el número de copias de un gen o de un cromosoma puede comprender la detección y/o el diagnóstico de una afección seleccionada de cualquiera del grupo enumerado en la Tabla 1:
Tabla 1 Anormalidades Cromosómicas y Enfermedad
Anormalidad Cromosómica
Asociación a Enfermedad
X,Y
XO síndrome de Turner
XXY
síndrome de Klinefelter
XYY
síndrome de Doble Y
XXX
síndrome de Trisomía X
XXXX
síndrome de Cuatro X
deleción Xp21
síndrome de Duchenne/Becker, hipoplasia suprarrenal congénita, enfermedad granulomatosa crónica
deleción Xp22
deficiencia de esteroide sulfatasa
deleción Xq26
enfermedad linfoproliferativa asociada a X
1
1p-(somático) neuroblastoma
monosomía
trisomía
2
monosomía
trisomía 2q
retraso del crecimiento, retraso del desarrollo y mental, y anormalidades físicas leves
3
monosomía
trisomía (somática)
linfoma no Hodgkin
4
monosomía
trisomía (somática)
leucemia no linfocítica aguda (LNLA)
5
5p- Cri du chat; síndrome de Lejeune
5q-(somático)
síndrome mielodisplásico
monosomía
trisomía
6
monosomía
trisomía (somática)
sarcoma de células claras
7
deleción 7q11.23 síndrome de William
monosomía
síndrome de monosomía 7 de la infancia; somático: adenomas corticales renales; síndrome mielodisplásico
trisomía
8
deleción 8q24.1 síndrome de Langer-Giedon
monosomía
trisomía
síndrome mielodisplásico; síndrome de Warkany; somático: leucemia mielógena crónica
9
monosomía 9p síndrome de Alfi
monosomía
trisomía parcial 9p
síndrome de Rethore
trisomía
síndrome de trisomía 9 completa; síndrome de trisomía 9 en mosaico
10
monosomía
trisomía (somática)
LLA o LNLA
11
11p- Aniridia; tumor de Wilms
11q
síndrome de Jacobson
monosomía (somática)
linajes mieloides afectados (LNLA, SMD)
trisomía
12
monosomía
Trisomía (somática)
LLC, tumor de células granulosas infantil (TCGI)
13
13q síndrome 13q-; síndrome de Orbeli
deleción 13q14
retinoblastoma
monosomía
trisomía
síndrome de Patau
14
monosomía
trisomía (somática)
trastornos mieloides (SMD, LNLA, LMC atípica)
15
deleción 15q11-q13 síndrome de Prader-Willi, de Angelman
monosomía
trisomía (somática)
linajes mieloides y linfoides afectados, p.ej., SMD, LNLA, LLA, LLC)
16
deleción 16q13.3 Rubenstein-Taybi
monosomía
trisomía (somática)
carcinomas de células renales papilares (malignos)
17
17p-(somático) síndrome 17p en neoplasias malignas mieloides
deleción 17q11.2
Smith-Magenis
17q13.3
Miller-Dieker
monosomía
trisomía (somática)
adenomas corticales renales
trisomía 17p11.2-12
síndrome de Charcot-Marie Tooth Tipo 1; HNPP
18
18p síndrome de monosomía parcial 18p o síndrome de Grouchy-Lamy-Thieffry
18q
síndrome de Grouchy-Lamy-Salmon-Landry
monosomía
Trisomía
síndrome de Edwards
19
monosomía
trisomía
20
20p síndrome de trisomía 20p
deleción 20p11.2-12
Alagille
20q
somático: SMD, LNLA, policitemia vera, leucemia neutrofílica crónica
monosomía
trisomía (somática)
carcinomas de células renales papilares (malignos)
21
monosomía
trisomía
síndrome de Down
22
deleción 22q11.2 síndrome de DiGeorge, síndrome velocardiofacial, síndrome de anomalía facial conotruncal, síndrome de Opitz G/BBB autosómico dominante, síndrome cardiofacial de Caylor
monosomía
trisomía
síndrome de trisomía 22 completa
La detección de una anormalidad en el número de copias de un gen puede comprender la detección y/o el diagnóstico de una afección relacionada con el cáncer.
La detección de una anormalidad en un número de copias de un gen puede comprender la detección y/o el 5 diagnóstico de una afección seleccionada del grupo que comprende el cáncer de mama, leucemia, cáncer de pulmón, tumores neurológicos, linfomas, cáncer de próstata y cáncer testicular.
Además, o de manera alternativa, la detección de una anormalidad en un número de copias de un gen puede comprender la detección y/o el diagnóstico de una afección provocada o asociada a un número de copias adicionales o a un número de copias reducido de un gen.
10 La invención proporciona el uso del método de la invención, como se describió anteriormente, para determinar si un individuo tiene un incremento o una disminución en el número de copias de un gen o de un cromosoma.
También se describe un método de diagnóstico para determinar si un individuo tiene un incremento o una disminución en el número de copias de un gen o de un cromosoma llevando a cabo cualquier método de la invención de la presente memoria.
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