JP7272967B2 - ナノポアシーケンサー - Google Patents

Description

（関連出願の相互参照）
本出願は、２０１７年６月２０日に出願された米国仮出願第６２／５２２，６２８号の利益を主張し、その内容はその全体が参照により本明細書に組み込まれる。

さまざまなポリヌクレオチドシーケンシング技術が、局所的な支持体表面上または規程の反応チャンバー内で多数の制御反応を実施することを伴う。次に、指定の反応を観察または検出し、その後の分析により、反応に関与するポリヌクレオチドの特性を特定または明らかにすることができる。イオン電流路を提供することができるナノポアを利用する別のポリヌクレオチドシーケンシング技術が開発された。ポリヌクレオチドはナノポアを通過し、ポリヌクレオチドがナノポアを通過すると、ナノポアを通る電流が乱される。通過する各ヌクレオチド、または一連のヌクレオチドは、特徴的な電流を生成し、電流レベルの記録はポリヌクレオチドの配列に相当する。

本明細書に開示されるナノポアシーケンサーの実施例は、シスウェル；トランスウェル；シスウェルとトランスウェルとを流体的に接続するナノポア；ならびにシスウェル内、もしくはトランスウェル内、またはシスウェル内およびトランスウェル内の修飾電解質であって、電解質とカチオン錯化剤とを含む修飾電解質を含む。

本明細書に開示されるナノポアシーケンサーの別の実施例は、シスウェル；トランスウェル；シスウェルとトランスウェルとを流体的に接続するナノポア；ならびにシスウェル内、もしくはトランスウェル内、またはシスウェル内およびトランスウェル内のゲル状高分子電解質を含む。

ナノポアシーケンサーのさらに別の実施例は、シスウェル；トランスウェル；シスウェルとトランスウェルとを流体的に接続するナノポア；シスウェルに接するシスウェル電極構造であって、第１ベース電極と、第１ベース電極に固定された酸化還元固体とを含むシスウェル電極構造；トランスウェルに接するトランスウェル電極構造であって、第２ベース電極と、第２ベース電極に固定された酸化還元固体とを含むトランスウェル電極構造；ならびに第１電極構造および第２電極構造でのそれぞれの酸化還元反応に応じて消費または放出されるカチオンを含む電解質を含む。

本開示の実施例の特徴は、以下の発明を実施するための形態および図面を参照することにより明らかになり、その中で類似の参照番号は、おそらく同一ではないが類似の構成要素に対応する。簡潔にするために、前述の機能を有する参照番号または特徴は、それらが現れる他の図面に関連して説明されている場合とされていない場合がある。
本明細書に開示されるナノポアシーケンサーの実施例の概略部分断面図である。 本明細書に開示されるナノポアシーケンサーの別の実施例の概略部分断面図である。 本明細書に開示される方法の２つの実施例を示す流れ図であり、１つは図１のナノポアシーケンサーを伴い、もう１つは図２のナノポアシーケンサーを伴う。 本明細書に開示されるナノポアシーケンサーのさらに別の実施例の概略部分断面図である。 図４のナノポアシーケンサーを伴う本明細書に開示される方法の別の実施例を示す流れ図である。 図６Ａは、クラウンエーテルが添加されていない２つのナノポアシーケンサー（１、２）の電流（ｉ、ｐＡ）対電圧（Ｖ）を示すグラフである。図６Ｂは、クラウンエーテルが添加されていないナノポアシーケンサー（２）およびシスウェルとトランスウェルの両方にクラウンエーテルが添加されたナノポアシーケンサー（２）の電流（ｉ、ｐＡ）対電圧（Ｖ）を示すグラフである。図６Ｃは、クラウンエーテルが添加されていないナノポアシーケンサー（２）およびクラウンエーテルがシスチャンバーから流入した後の図６Ｂのナノポアシーケンサー（２）の電流（ｉ、ｐＡ）対電圧（Ｖ）を示すグラフである。 図７Ａは、クラウンエーテルが添加されていない１つのスメグマ菌ポーリンＡ（ＭｓｐＡ）孔を通るヘアピン移行のイオン電流（ｐＡ）対時間（ミリ秒）を示すグラフである。図７Ｂは、図７Ａに提示されたデータのヒストグラム（カウント対振幅）である。 図８Ａは、クラウンエーテルが添加された１つのＭｓｐＡ細孔を通るヘアピン移行のイオン電流（ｐＡ）対時間（ミリ秒）を示すグラフである。ならびに図８Ｂは、図８Ａに提示されたデータのヒストグラム（カウント対振幅）である。

（前書き）
第１の態様では、ナノポアシーケンサーは、シスウェル；トランスウェル；シスウェルとトランスウェルとを流体的に接続するナノポア；ならびにシスウェル内、もしくはトランスウェル内、またはシスウェル内およびトランスウェル内の修飾電解質であって、電解質とカチオン錯化剤とを含む修飾電解質を含む。

この第１の態様の一実施例では、修飾電解質はシスウェル内にあり、ナノポアシーケンサーはトランスウェル内に非修飾電解質をさらに含み、非修飾電解質は電解質をカチオン錯化剤なしで含む；または修飾電解質はトランスウェル内にあり、ナノポアシーケンサーはシスウェル内に非修飾電解質をさらに含み、非修飾電解質は電解質をカチオン錯化剤なしで含む。

この第１の態様の別の実施例では、ナノポアシーケンサーは、基板内に画定された複数のトランスウェルをさらに備え、その各々が、それぞれのナノポアによってシスウェルに流体的に接続されており、複数のトランスウェルの密度は、基板のｍｍ^２あたり約１０個のトランスウェル～基板のｍｍ^２あたり約１，０００，０００個のトランスウェルである。

この第１の態様のさらに別の実施例では、電解質は、カリウムカチオンと結合アニオン、ナトリウムアニオンと結合アニオン、またはそれらの組み合わせを含み；カチオン錯化剤は、クラウンエーテル、カリキサレン、およびバリノマイシンからなる群より選択される。

この第１の態様のさらに別の実施例では、修飾電解質は、０ｍＭ超～約５００ｍＭのカチオン錯化剤を含む。

ナノポアシーケンサーのこの第１の態様の任意の特徴を、任意の望ましい様式および／または構成で一緒に組み合わせることができることを理解されたい。

第２の態様では、ナノポアシーケンサーは、シスウェル；トランスウェル；シスウェルとトランスウェルとを流体的に接続するナノポア；ならびにシスウェル内、もしくはトランスウェル内、またはシスウェル内およびトランスウェル内のゲル状高分子電解質を含む。

この第２の態様の一実施例では、高分子電解質はシスウェル内にあり、ナノポアシーケンサーはトランスウェル内に電解質をさらに含む；または高分子電解質はトランスウェル内にあり、ナノポアシーケンサーはシスウェル内に電解質をさらに含む。一実施例では、高分子電解質は、ポリジアリルジメチルアンモニウムクロライド、ポリエチレンイミンのイオン型、直鎖ポリエチレンイミンのイオン型、ポリ（アリルアミン塩酸塩）、およびポリ（４－ビニルピリジン）のイオン型からなる群より選択され；電解質は、カリウムカチオンと結合アニオン、ナトリウムカチオンと結合アニオン、またはそれらの組み合わせを含む。

この第２の態様の別の実施例では、ナノポアシーケンサーは、基板内に画定された複数のトランスウェルをさらに備え、その各々が、それぞれのナノポアによってシスウェルに流体的に接続されており、複数のトランスウェルの密度は、基板のｍｍ^２あたり約１０個のトランスウェル～基板のｍｍ^２あたり約１，０００，０００個のトランスウェルである。

この第２の態様のさらに別の実施例では、高分子電解質はシスウェル内とトランスウェル内の両方に存在し；高分子電解質は、ポリジアリルジメチルアンモニウムクロライド、ポリエチレンイミンのイオン型、直鎖ポリエチレンイミンのイオン型、ポリ（アリルアミン塩酸塩）、およびポリ（４－ビニルピリジン）のイオン型からなる群より選択される。

ナノポアシーケンサーの第２の態様の任意の特徴を、任意の望ましい様式で一緒に組み合わせることができることを理解されたい。さらに、ナノポアシーケンサーの第１の態様ならびに／あるいはナノポアシーケンサーの第２の態様の特徴の任意の組み合わせを一緒に使用することができること、および／またはこれらの態様のいずれかもしくは両方からの任意の特徴を、本明細書に開示される実施例のいずれかと組み合わせることができることを理解されたい。

第３の態様では、ナノポアシーケンサーは、シスウェル；トランスウェル；シスウェルとトランスウェルとを流体的に接続するナノポア；シスウェルに接するシスウェル電極構造であって、第１ベース電極と、第１ベース電極に固定された酸化還元固体とを含むシスウェル電極構造；トランスウェルに接するトランスウェル電極構造であって、第２ベース電極と、第２ベース電極に固定された酸化還元固体とを含むトランスウェル電極構造；ならびにシスウェル電極構造およびトランスウェル電極構造でのそれぞれの酸化還元反応に応じて消費または放出されるカチオンを含む電解質を含む。

この第３の態様の実施例では、酸化還元固体は、テトラシアノキノジメタン（ＴＣＮＱ）、プルシアンブルー、およびポリピロールからなる群より選択される。

この第３の態様の別の実施例では、第１および第２ベース電極は、独立して、グラファイト、白金、金、銀、銅、炭素繊維、ダイヤモンド、およびパラジウムからなる群より選択される。

ナノポアシーケンサーの第３の態様の任意の特徴を、任意の望ましい様式で一緒に組み合わせることができることを理解されたい。さらに、ナノポアシーケンサーの第３の態様ならびに／あるいはナノポアシーケンサーの第２の態様ならびに／あるいはナノポアシーケンサーの第１の態様の特徴の任意の組み合わせを一緒に使用することができること、および／またはこれらの態様の任意の１つもしくは複数からの任意の特徴を、本明細書に開示される実施例のいずれかと組み合わせることができることを理解されたい。

第４の態様では、第１の態様のナノポアシーケンサーを使用する方法は、ナノポアシーケンサーのシスウェルとナノポアシーケンサーのトランスウェルとの間に約－１Ｖ～約１Ｖの電圧バイアスを印加することにより、ナノポアシーケンサーにおける電解質の酸化還元試薬の枯渇を制御することを含む。

この第４の態様の実施例では、本方法は、ナノポアシーケンサーに以下を供給する工程をさらに含む：シスウェル内に修飾電解質、およびトランスウェル内にカチオン錯化剤のない電解質；またはトランスウェル内に修飾電解質、およびシスウェル内にカチオン錯化剤のない電解質。

この第４の態様の別の実施例では、本方法は、以下をさらに含む：カチオン錯化剤を電解質に組み込んで修飾電解質を作る工程と；修正電解質をシスウェル内に、もしくはトランスウェル内に、またはシスウェル内およびトランスウェル内に導入する工程。

この第４の態様のさらに別の実施例では、電解質は、カリウムカチオンと結合アニオン、ナトリウムカチオンと結合アニオン、またはそれらの組み合わせを含み；カチオン錯化剤は、クラウンエーテル、カリキサレン、およびバリノマイシンからなる群より選択される。

本方法の第４の態様の任意の特徴を、任意の望ましい様式で一緒に組み合わせることができることを理解されたい。さらに、本方法の第４の態様ならびに／あるいはナノポアシーケンサーの第３の態様ならびに／あるいはナノポアシーケンサーの第２の態様ならびに／あるいはナノポアシーケンサーの第１の態様の特徴の任意の組み合わせを一緒に使用することができること、および／またはこれらの態様の任意の１つもしくは複数からの任意の特徴を、本明細書に開示される実施例のいずれかと組み合わせることができることを理解されたい。

第５の態様では、第２の態様のナノポアシーケンサーを使用する方法は、ナノポアシーケンサーのシスウェルとナノポアシーケンサーのトランスウェルとの間に約－１Ｖ～約１Ｖの電圧バイアスを印加することにより、ナノポアシーケンサーにおける高分子電解質の酸化還元試薬の枯渇を制御することを含む。

本方法の第５の態様の任意の特徴を、任意の望ましい様式で一緒に組み合わせることができることを理解されたい。さらに、本方法の第５の態様ならびに／あるいは本方法の第４の態様ならびに／あるいはナノポアシーケンサーの第３の態様ならびに／あるいはナノポアシーケンサーの第２の態様ならびに／あるいはナノポアシーケンサーの第１の態様の特徴の任意の組み合わせを一緒に使用することができること、および／またはこれらの態様の任意の１つもしくは複数からの任意の特徴を、本明細書に開示される実施例のいずれかと組み合わせることができることを理解されたい。

第６の態様では、第３の態様のナノポアシーケンサーを使用する方法は、ナノポアシーケンサー内の電解質の酸化還元試薬の枯渇を以下によって制御することを含む：シスウェル電極構造に第１電圧を印加することにより、ナノポアシーケンサー内の電解質のカチオンを消費するカソード反応を開始すること；およびトランスウェル電極構造に第２電圧を印加することにより、電解質のカチオンを放出するアノード反応を開始すること。

第６の態様の実施例では、酸化還元固体は、テトラシアノキノジメタン（ＴＣＮＱ）、プルシアンブルー、およびポリピロールからなる群より選択される。

本方法の第６の態様の任意の特徴を、任意の望ましい様式で一緒に組み合わせることができることを理解されたい。さらに、本方法の第６の態様ならびに／あるいは本方法の第５の態様ならびに／あるいは本方法の第４の態様ならびに／あるいはナノポアシーケンサーの第３の態様ならびに／あるいはナノポアシーケンサーの第２の態様ならびに／あるいはナノポアシーケンサーの第１の態様の特徴の任意の組み合わせを一緒に使用することができること、および／またはこれらの態様の任意の１つもしくは複数からの任意の特徴を、本明細書に開示される実施例のいずれかと組み合わせることができることを理解されたい。

ナノポアシーケンシングの手法では、電流の変化を利用してヌクレオチド塩基を区別する。ナノポアシーケンサーでは、システムを通るファラデー電流を補助するために、１つの電解質酸化還元試薬がトランスウェル（またはチャンバー）電極で部分的に消費される場合がある。一部にはナノポア（単数または複数）を介したイオン輸送阻害のために、部分的に消費された電解質酸化還元試薬が対応するシスウェル電極に効率的に補充されない場合がある。例えば、塩化物アニオンは、めっきのためにトランス側で部分的に枯渇する場合があり、シス側では完全に補充されない場合がある。電解質酸化還元試薬（カチオンとアニオンなど）の両方で濃度勾配が発生し、トランス側の部分的に枯渇した試薬の濃度がはるかに低くなると新しい平衡が確立される。ナノポアを通る電解質酸化還元試薬輸送とトランス電極上の試薬の１つの部分的消費との不均衡は、電流ドリフトを引き起こす可能性があり、これはヌクレオチド塩基を区別する性能に悪影響を及ぼし得る。

電解質酸化還元試薬の部分的消費は、電解質酸化還元試薬の開始濃度、ナノポアを通過する電流、およびトランスチャンバーのサイズなど、いくつかの要因に左右される（例えば、より大きなチャンバーは一般的に少ない試薬消費に関連付けられ、より小さなチャンバーは一般的により多くの試薬消費に関連付けられる）。

部分的消費は、初期試薬濃度の低下によって証明される場合があり、その低下は１０分の１を超える。場合によっては、低下は２０分の１～１００分の１になる。例えば、１０μｍトランスウェルで約３００ｍＭの初期塩化物濃度を有する電解質の塩化物濃度は約１０ｍＭに低下する可能性があり、したがって初期濃度は約３０分の１に低下する。別の例では、１０μｍトランスウェルで約１０ｍＭの初期塩化物濃度を有する電解質の塩化物濃度は約０．１ｍＭに低下する可能性があり、したがって初期濃度は約１００分の１に低下する。部分的消費／枯渇は１００％に近づく可能性がある（つまり、システム内に残っている電解質酸化還元試薬は０％に近づく）が、そのような低いレベルの部分的に消費された試薬であっても、電解質酸化還元試薬間で平衡が確立されることを理解されたい。

本明細書に開示されるナノポアシーケンサーおよび方法の実施例は、シーケンサーのトランスウェル（またはチャンバー）電極（単数または複数）での電解質酸化還元試薬（単数または複数）の部分的消費または枯渇を効果的に軽減させる。本明細書に開示される実施例では、初期試薬濃度の低下が依然として発生する可能性がある；しかしながら、低下は１０％未満であり、おそらく１％未満である。したがって、時間が経過しても、（例えば、上記の実施例と比較して）より多くの試薬が存在し、したがって試薬の消費または枯渇が軽減する。一部の実施例では、シーケンサーのナノポア（単数または複数）を介した電気化学的に不活性な種（例えば、電解質カチオン）の拡散を緩和することにより、電解質酸化還元試薬の部分的消費／枯渇を軽減させる。一部の実施例では、電気化学的に不活性な種は電解質カチオンである。カチオンの拡散を軽減すると、電荷が電解質のアニオンによってのみ運ばれる。アニオンのみを電荷担体として使用することにより（アニオンとカチオンの両方によって運ばれる電荷とは対照的に）、アニオンの供給とアニオンの消費との間の電荷の不均衡は少なくとも縮小する。その結果、ナノポアシーケンサーのトランスウェル（単数または複数）からのアニオンの枯渇も軽減する。他の実施例では少なくとも、アニオンを消費せず、むしろ一方の電極で電解質カチオンを生成し、他方の電極で同じ電解質カチオンを消費する電極システムを組み込むことにより、電解質アニオンの消費／枯渇を軽減する。

上記のように、ナノポアシーケンシングの手法では、電流の変化を利用してヌクレオチド塩基を区別する。電解質種の枯渇は電流の枯渇（または望ましくないシフト）をもたらし、これはヌクレオチド塩基の正確な電流測定値を取得する性能に悪影響を及ぼす。ナノポアを通過するイオン種の輸送とトランス電極でのその種の消費のバランスをとることにより、電流ドリフトを軽減し、電解質、トランス電極、およびトランスウェルの寿命を延ばすことができる。

本明細書で使用される用語は、別段の定めがない限り、関連技術における通常の意味をとることを理解されたい。本明細書で使用されるいくつかの用語およびそれらの意味を、以下に示す。

単数形の「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」には、文脈から明確に別段の指示がない限り、複数の指示対象が含まれる。

備える、含む、含有するという用語、およびこれらの用語のさまざまな形式は互いに同義語であり、等しく広義であることを意味する。さらに、明示的に別段の記述がない限り、特定の特性を有する１つの要素または複数の要素を備える、含む、または有する実施例は、追加の要素を含むことができ、その追加の要素がその特性を有するかどうかは関係ない。

本明細書で使用する「流体的に接続する」、「流体連通」、「流体的に結合された」などの用語は、液体または気体が２つの空間領域間を流れるように接続された２つの空間領域を指す。例えば、電解質の少なくとも一部が接続されたウェル間を自由に流れるように、シスウェルは１つのトランスウェルまたは複数のトランスウェルに流体的に接続され得る。２つの空間領域は、ナノポアを介して、またはシステムを通る流体の流れを制御もしくは調整する１つもしくは複数の弁、制限器、もしくは他の流体素子を介して流体連通していてもよい。

本明細書で使用する「間隔領域」という用語は、基板／固体支持体もしくは膜における場所、または表面上の場所であって、その支持体もしくは膜もしくは表面に接する他の場所、部位、特徴を分離する領域を指す。例えば、膜の間隔領域は、配列の１つのナノポアをその配列の別のナノポアから分離することができる。別の例として、基板の間隔領域は、あるトランスウェルを別のトランスウェルから分離することができる。互いに分離されている２つの場所は離散的であってよく、すなわち、互いに物理的に接触していない。多くの例では、例えば、本来なら途切れのない膜に画定された複数のナノポアの場合のように、または本来なら途切れのない支持体に画定された複数のウェルの場合のように、間隔領域は途切れがないのに対して、その場所は離散的である。間隔領域によってもたらされる分離は、部分的または完全な分離であり得る。間隔領域には、表面に画定された特徴の表面材料とは異なる表面材料が含まれてもよい。例えば、間隔領域の表面材料は脂質材料であってもよく、脂質材料に形成されたナノポアは、間隔領域に存在する量または濃度を超える量または濃度のポリペプチドを有し得る。いくつかの例では、ポリペプチドは間隔領域に存在しなくてもよい。

本明細書で使用する「膜」という用語は、同じ組成物または異なる組成物をその中に含むことができる２つの液体／ゲルチャンバー（例えば、シスウェルとトランスウェル）を分離する非透過性もしくは半透過性障壁または他のシートを指す。任意の種に対する膜の透過性は、膜の性質によって決まる。いくつかの例では、膜は、イオン、電流、および／または流体に対して非透過性であってもよい。例えば、脂質膜はイオン不透過性であり得る（すなわち、いかなるイオンも輸送しない）が、少なくとも部分的に水透過性であり得る（例えば、水の拡散率は約４０μｍ／ｓ～約１００μｍ／ｓである）。別の例では、窒化ケイ素などの固体膜は、イオン、電荷、および流体に対して不浸透性であり得る（すなわち、これらの種全ての拡散はゼロである）。膜が膜貫通ナノポア開口部を含むことができ、膜をはさんで電位差を維持することができる限り、任意の膜を本開示に従って使用することができる。膜は単層または多層膜であってもよい。多層膜には複数の層が含まれ、各層は非透過性または半透過性の材料である。

膜は、生物または非生物起源の材料で形成され得る。生物起源の材料とは、有機体もしくは細胞などの生物学的環境に由来するもしくはそれらから分離された材料、または生物学的に利用可能な構造の合成的に製造されたバージョンを指す。

生物起源の材料から作られた膜の例には、ボラ脂質によって形成された単層が含まれる。生物起源の材料から作られた別の例の膜には、脂質二重層が含まれる。適切な脂質二重層には、例えば、細胞の膜、細胞小器官の膜、リポソーム、平面脂質二重層、および支持脂質二重層が含まれる。脂質二重層は、例えば、リン脂質の２つの対向する層から形成することができ、それらの疎水性尾部基は互いに向かい合って疎水性内部を形成し、一方で脂質の親水性頭部基は二重層の両側の水性環境に向かって外側を向くように配置される。脂質二重層は、例えば、脂質単層が水溶液／空気界面に、その界面に垂直な開口部のどちらかの側を通って運ばれてくる方法によっても形成され得る。脂質は通常、最初に有機溶媒に溶解し、次に開口部のどちらかの側の水溶液の表面で溶媒の液滴を蒸発させることにより、電解質水溶液の表面に加えられる。有機溶媒が少なくとも部分的に蒸発されると、開口部のいずれの側の溶液／空気界面も、二重層が形成されるまで開口部を通って物理的に行ったり来たり移動する。二重層形成の他の適切な方法には、チップ浸漬、二重層の塗装、およびリポソーム二重層のパッチクランプが含まれる。脂質二重層を得るまたは生成する他の方法も使用され得る。

生物起源ではない材料も膜として使用され得る。これらの材料のいくつかは固体材料であり、固体膜を形成することができ、これらの材料の他は薄い液体フィルムまたは膜を形成することができる。固体膜は、支持基板（すなわち、固体支持体）上のコーティングもしくはフィルムなどの単層、または自立素子であり得る。固体膜は、サンドイッチ構成の多層材料の複合体であってもよい。結果として生じる膜が膜貫通ナノポア開口部を含むことができ、膜をはさんで電位差を維持することができる限り、生物起源ではない任意の材料を使用してもよい。膜は、有機材料、無機材料、またはその両方を含んでもよい。適切な固体材料の例には、例えば、マイクロエレクトロニクス材料、絶縁材料（例えば、窒化ケイ素（Ｓｉ_３Ｎ_４）、酸化アルミニウム（Ａｌ_２Ｏ_３）、酸化ケイ素（ＳｉＯ））、いくつかの有機および無機ポリマー（例えば、ポリアミド、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）などのプラスチック、または２成分付加硬化型シリコーンゴムなどのエラストマー）、およびガラスが含まれる。加えて、固体膜は、グラフェンの単層から作成することができ、それは、２次元ハニカム格子に密に詰められた炭素原子の原子的に薄いシート、グラフェンの多層、または他の固体材料の１つもしくは複数の層と混合したグラフェンの１つもしくは複数の層である。グラフェン含有固体膜は、グラフェンナノリボンまたはグラフェンナノギャップである少なくとも１つのグラフェン層を含むことができ、これは、標的ポリヌクレオチドを特徴付けるための電気センサーとして使用することができる。固体膜は、任意の適切な方法で作成することができる。例として、グラフェン膜は、化学気相成長法（ＣＶＤ）またはグラファイトからの剥離のいずれかによって調製することができる。使用され得る適切な薄い液体フィルム材料の例には、ジブロックコポリマー、トリブロックコポリマー、例えば両親媒性ＰＭＯＸＡ－ＰＤＭＳ－ＰＭＯＸＡ ＡＢＡトリブロックコポリマーなどが含まれる。

本明細書で使用される「ナノポア」という用語は、イオン、電流、および／または流体が膜の片側から膜の反対側へ渡ることを可能にする、膜とは別個の、膜を横切って延びる中空構造意味するものとする。例えば、イオンまたは水溶性分子の通過を阻害する膜は、膜の片側から膜の反対側へのイオンまたは水溶性分子の通過を可能にする、膜を横切って延びるナノポア構造を含むことができる。ナノポアの直径は、その長さ（つまり、膜の片側から膜の反対側まで）に沿って変化する可能性があるが、どの時点でもナノスケールにある（つまり、約１ｎｍ～約１００ｎｍ）。ナノポアの例には、例えば、生物学的ナノポア、固体ナノポア、ならびに生物学的固体ハイブリッドナノポアが含まれる。

本明細書で使用される「生物学的ナノポア」という用語は、その構造部分が生物起源の材料から作られているナノポア意味するものとする。生物起源とは、有機体もしくは細胞などの生物学的環境に由来するもしくはそれらから分離された材料、または生物学的に利用可能な構造の合成的に製造されたバージョンを指す。生物学的ナノポアには、例えば、ポリペプチドナノポアおよびポリヌクレオチドナノポアが含まれる。

本明細書で使用される「ポリペプチドナノポア」という用語は、膜を横切って延び、イオン、電流、および／または流体が膜の片側から膜の反対側へ流れることを可能にするポリペプチド意味するものとする。ポリペプチドナノポアは、モノマー、ホモポリマー、またはヘテロポリマーであり得る。ポリペプチドナノポアの構造には、例えば、αヘリックス束ナノポアおよびβバレルナノポアが含まれる。ポリペプチドナノポアの例には、α－ヘモリシン、スメグマ菌ポーリンＡ（ＭｓｐＡ）、グラミシジンＡ、マルトポリン、ＯｍｐＦ、ＯｍｐＣ、ＰｈｏＥ、Ｔｓｘ、Ｆ線毛などが含まれる。スメグマ菌ポーリンＡ（ＭｓｐＡ）は、マイコバクテリアによって生成される膜ポーリンであり、これにより親水性分子が細菌に侵入することができる。ＭｓｐＡは、密に相互接続した八量体と、ゴブレット様で、中央チャネル／ポアを含む膜貫通ベータバレルを形成する。

ポリペプチドナノポアは合成であってもよい。合成ポリペプチドナノポアには、自然界には存在しないタンパク質様アミノ酸配列が含まれている。タンパク質様アミノ酸配列は、存在することが知られているが、タンパク質の基礎を形成しないアミノ酸（すなわち、タンパク質を構成しないアミノ酸）の一部を含み得る。タンパク質様アミノ酸配列は、有機体で発現させるのではなく、人工的に合成し、精製／単離することができる。

本明細書で使用される「ポリヌクレオチドナノポア」という用語は、膜を横切って延び、イオン、電流、および／または流体が膜の片側から膜の反対側へ流れることを可能にするポリヌクレオチドを含むことを意図している。ポリヌクレオチドポアは、例えば、ポリヌクレオチド折り紙（例えば、ナノポアを作製するためのＤＮＡのナノスケール折り畳み）を含むことができる。

また、本明細書で使用される「固体ナノポア」という用語は、その構造部分が非生物起源の（すなわち、生物起源ではない）材料を含むナノポアを意味するものとする。固体ナノポアは、無機または有機材料で形成することができる。固体ナノポアには、例えば、窒化ケイ素ナノポア、二酸化ケイ素（ＳｉＯ_２）ナノポア、およびグラフェンナノポアが含まれる。

本明細書に開示されるナノポアは、ハイブリッドナノポアであってもよい。「ハイブリッドナノポア」は、生物起源および非生物起源の両方の材料を含むナノポアを指す。ハイブリッドナノポアの例には、ポリペプチド固体ハイブリッドナノポアおよびポリヌクレオチド固体ナノポアが含まれる。

本明細書で使用される「ナノポアシーケンサー」という用語は、ナノポアシーケンシングに使用され得る本明細書で開示されるデバイスのいずれかを指す。本明細書に開示される実施例では、ナノポアシーケンシング中に、ナノポアが本明細書に開示される電解質の実施例（単数または複数）に浸漬され、電位差が膜をはさんで加えられる。一例では、電位差は電気的電位差または電気化学的電位差である。シスウェルまたはトランスウェルの１つもしくは複数に含まれる電解質のイオンの少なくとも１つに電流を注入するまたは加える電圧源を介して、膜をはさんで電気的電位差をかけることができる。電気化学的電位差は、電位と組み合わせたシスおよびトランスウェルのイオン組成の違いによって確立することができる。異なるイオン組成は、例えば、各ウェル内の異なるイオン、または各ウェル内の同じイオンの異なる濃度であり得る。

ナノポアをはさんで電位差を加えると、ナノポアを介した核酸の移行を強制することができる。ナノポアを通るヌクレオチドの移行に対応する１つまたは複数のシグナルが生じる。したがって、標的ポリヌクレオチドが、あるいは標的ポリヌクレオチドもしくはモノヌクレオチドに由来するモノヌクレオチドまたはプローブがナノポアを通過すると、例えば、そのくびれの塩基依存的（またはプローブ依存的）閉塞により膜を横切る電流が変化する。電流の変化からのシグナルは、さまざまな方法のいずれかを使用して測定することができる。各シグナルは、ナノポア内のヌクレオチド（単数もしくは複数）（またはプローブ）の種に固有のものであるため、結果として生じるシグナルを使用してポリヌクレオチドの特性を決定することができる。例えば、特徴的なシグナルを生成するヌクレオチド（単数もしくは複数）（またはプローブ）の１つまたは複数の種の同一性を決定することができる。

本明細書で使用する「ヌクレオチド」は、窒素含有複素環式塩基、糖、および１つまたは複数のリン酸基を含む。ヌクレオチドは、核酸配列の単量体単位である。ヌクレオチドの例には、例えば、リボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドが含まれる。リボヌクレオチド（ＲＮＡ）では、糖はリボースであり、デオキシリボヌクレオチド（ＤＮＡ）では、糖はデオキシリボース、つまり、リボースの２’位に存在するヒドロキシル基を欠く糖である。窒素含有複素環式塩基は、プリン塩基またはピリミジン塩基であり得る。プリン塩基には、アデニン（Ａ）およびグアニン（Ｇ）、およびそれらの修飾誘導体または類似体が含まれる。ピリミジン塩基には、シトシン（Ｃ）、チミン（Ｔ）、およびウラシル（Ｕ）、ならびにそれらの修飾誘導体または類似体が含まれる。デオキシリボースのＣ－１原子は、ピリミジンのＮ－１またはプリンのＮ－９に結合している。リン酸基は、モノ、ジ、またはトリリン酸型であり得る。これらのヌクレオチドは天然のヌクレオチドであるが、非天然のヌクレオチド、修飾ヌクレオチド、または前述のヌクレオチドの類似体も使用することができることをさらに理解されたい。

本明細書で使用される「シグナル」という用語は、情報を表す指標を意味するものとする。シグナルには、例えば、電気シグナルおよび光シグナルが含まれる。「電気シグナル」という用語は、情報を表す電気的品質の指標を指す。指標は、例えば、電流、電圧、トンネリング、抵抗、電位、電圧、コンダクタンス、または横方向の電気的効果であり得る。「電子電流」または「電流」は、電荷の流れを指す。一例では、電気シグナルは、ナノポアを通過する電流であり得、電位差がナノポアをはさんで加えられると電流が流れ得る。

「基板」という用語は、水性液体に不溶であり、開口部、ポート、または他の類似の液体導管がないと液体を通過させることができない硬い固体支持体を指す。本明細書に開示される例では、基板は、その中に画定されたウェルまたはチャンバーを有し得る。適切な基板の例には、ガラスおよび改質もしくは機能化ガラス、プラスチック（アクリル、ポリスチレンおよびスチレンと他の材料のコポリマー、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリブチレン、ポリウレタン、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）（Ｃｈｅｍｏｕｒｓ製のＴＥＦＬＯＮ（登録商標）など）、環状オレフィン／シクロオレフィンポリマー（ＣＯＰ）（Ｚｅｏｎ製のＺＥＯＮＯＲ（登録商標）など）、ポリイミドなど）、ナイロン、セラミック、シリカまたはシリカベースの材料、シリコンおよび改質シリコン、炭素、金属、無機ガラス、ならびに光ファイバー束が含まれる。

最上部、底部、下部、上部、上になどの用語は、本明細書において、ナノポアシーケンサーおよび／またはナノポアシーケンサーのさまざまな構成要素を説明するために使用される。これらの方向を示す用語は、特定の方向を意味するものではなく、構成要素間の相対的な方向性を指定するために使用されることを理解されたい。方向を示す用語の使用は、本明細書に開示された実施例を特定の方向（単数または複数）に限定するものと解釈されるべきではない。

本明細書で使用される「ウェル」および「チャンバー」という用語は同義語として使用され、シーケンサーにおいて画定された、流体（例えば、液体、ゲル、気体）を含むことができる離散的特徴を指す。「シスウェル」は、シス電極を含むか、またはそれによって部分的に画定された共通チャンバーであり、それぞれのナノポアを介して複数のトランスウェルのそれぞれに流体的に接続されている。シーケンサーは、１つのシスウェルまたは複数のシスウェルを有し得る。各「トランスウェル」は、独自のトランス電極を含むか、またはそれによって部分的に画定された単一チャンバーであり、また１つのシスウェルに流体的に接続されている。各トランスウェルは、トランスウェル同士では電気的に絶縁されており、それぞれのトランス電極はそれぞれの増幅器（例えば、Ａｘｏｐａｔｃｈ ２００Ｂ増幅器）に接続され、トランスウェルのそれぞれに接するそれぞれのナノポアを通過する電気シグナルを増幅する。少なくとも部分的にウェルを画定する基板の表面に平行に取られたウェルの断面は、曲線状、正方形、多角形、双曲型、円錐形、角形などであり得る。

本明細書に記載され、特許請求の範囲に列挙される態様および実施例は、上記の定義を考慮して理解することができる。

ここで図１を参照すると、ナノポアシーケンサー１０の実施例が示されている。ナノポアシーケンサー１０は、シスウェル１４、トランスウェル１６、シスウェル１４とトランスウェル１６とを流体的に接続するナノポア１８、ならびにシスウェル１４内、もしくはトランスウェル１６内、またはシスウェルおよびトランスウェル１４、１６内の修飾電解質２０を含む。修飾電解質２０がシスウェル１４またはトランスウェル１６のうちの１つにある実施例では、非修飾電解質２２は、他のトランスウェル１６またはシスウェル１４に存在し得る。

図１に示されるように、基板１２は、その中に画定された複数のトランスウェル１６を含み得る。トランスウェル１６のそれぞれは、それぞれのナノポア１８によって共通シスウェル１４に流体的に接続され得る。図１には１つの共通シスウェル１４が示されているが、シーケンサー１０は、互いに流体的に隔離され、基板１２に画定されたそれぞれのトランスウェル１６のセットに流体的に接続されたいくつかのシスウェル１４を含み得ることを理解されたい。例えば、単一の基板１２上の複数の試料の測定を可能にするために、複数のシスウェル１４が望ましい場合がある。

ナノポア（単数または複数）１８を通る流体連通は、図１の矢印によって示される。また、図１に示されるように、膜２４は、シスウェル１４とトランスウェル（単数または複数）１６との間の基板１２上に配置されてもよく、ナノポア（単数または複数）１８は、膜２４に配置され、膜２４を貫通して延び、シスウェル１４とトランスウェル（単数または複数）１６との間に流体接続を確立することができる。

シスウェル１４は、基板１２に接続する側壁（単数または複数）１３によって基板１２の一部に画定された流体チャンバーである。いくつかの実施例では、側壁（単数または複数）１３および基板１２は、それら１３、１２が材料（例えば、ガラスまたはプラスチック）の連続部品から形成されるように、一体となって形成され得る。他の実施例では、側壁（単数または複数）１３および基板１２は、互いに連結した別個の構成要素であり得る。一実施例では、側壁（単数または複数）は光パターン化可能なポリマーである。

図１に示される実施例では、シスウェル１４は、側壁（単数または複数）１３によって画定された内壁２６、２６’と、シス電極３０によって画定された上面２８と、膜２４とによって画定された下面２８’とを有する。したがって、シスウェル１４は、シス電極３０と、基板１２の一部と、膜２４とによって画定された空間内に形成される。下面２８’は、膜２４に配置されたナノポア（単数または複数）１８を通る開口部（単数または複数）を有することを理解されたい。シスウェル１４は、任意の適切な寸法を有し得る。一実施例では、シスウェル１４は、約１ｍｍ×１ｍｍ～約５ｍｍ×５ｍｍである。

シス電極３０は、その内面がシスウェル１４の上面２８であり、側壁（単数または複数）１３に物理的に接続されていてもよい。シス電極３０は、例えば、接着剤または別の適切な締結構造によって、側壁（単数または複数）１３に物理的に接続されていてもよい。シス電極３０と側壁（単数または複数）１３との間の接触面は、シスウェル１４の上部を密封し得る。

使用されるシス電極３０は、少なくとも部分的に、修飾電解質２０中の酸化還元対によって決まる。例として、シス電極３０は、金（Ａｕ）、白金（Ｐｔ）、炭素（Ｃ）（例えば、グラファイト、ダイヤモンドなど）、パラジウム（Ｐｄ）、銀（Ａｇ）、銅（Ｃｕ）などであり得る。一実施例では、シス電極３０は、銀／塩化銀（Ａｇ／ＡｇＣｌ）電極であり得る。

シスウェル１４は、修飾電解質２０または非修飾電解質２２を、ナノポア（単数または複数）１８と接触した状態に維持することができる。一実施例では、シスウェル１４はナノポア１８の配列と接触しており、したがって、修飾電極２０または非修飾電解質２２を、配列内の各ナノポア１８と接触した状態に維持することができる。

図１に示されるように、ナノポアシーケンサー１０は、複数のトランスウェル１６を含む。各トランスウェル１６は、基板１２の一部に画定された流体チャンバーである。通常、トランスウェル１６は、基板１２の厚さを貫通して延びてもよく、基板１２の対向する端部（例えば、上端部３８および下端部４０）に開口部を有してもよい。図１に示される実施例では、各トランスウェル１６は、基板１２によっておよび／または基板１２の間隔領域３２によって画定された側壁３１、３１’と、トランス電極３４によって画定された下面３６と、膜２４とによって画定された上面３６’とを有する。したがって、各トランスウェル１６は、トランス電極３４と、基板１２の他の部分および／または間隔領域３２と、膜２４とによって画定された空間内に形成される。上面３６’は、膜２４に配置されたナノポア（単数または複数）１８を通る開口部（単数または複数）を有することを理解されたい。

トランス電極３４は、その内面がトランスウェル１６の下面３６であり、基板１２に（例えば、間隔領域３２にまたは基板１２の内壁に）物理的に接続されていてもよい。基板１２を形成するプロセスで（例えば、トランスウェル１６の形成中に）、トランス電極３４を作ることができる。基板１２およびトランス電極３４を形成するために使用され得る微細加工技術には、リソグラフィ、金属蒸着およびリフトオフ、乾燥および／またはスピンオンフィルム蒸着、エッチングなどが含まれる。トランス電極３４と基板１２との間の接触面は、トランスウェル１６の下部を密封し得る。

使用されるトランス電極３４は、少なくとも部分的に、修飾電解質２０中の酸化還元対によって決まる。例として、トランス電極３４は、金（Ａｕ）、白金（Ｐｔ）、炭素（Ｃ）（例えば、グラファイト、ダイヤモンドなど）、パラジウム（Ｐｄ）、銀（Ａｇ）、銅（Ｃｕ）などであり得る。一実施例では、トランス電極３４は、銀／塩化銀（Ａｇ／ＡｇＣｌ）電極であり得る。

規則的、反復的、および非規則的パターンを含む、トランスウェル１６の多くの異なるレイアウトが想定され得る。一実施例では、トランスウェル１６は、密な充填と密度改善のために六角形グリッドに配置される。他のレイアウトには、例えば、直線（すなわち、長方形）レイアウト、三角形レイアウトなどが含まれ得る。例として、レイアウトまたはパターンを、行と列の形にあるトランスウェル１６のｘ－ｙ形式にすることができる。いくつかの他の実施例では、レイアウトまたはパターンは、トランスウェル１６および／または間隔領域３２の繰り返し配置であり得る。さらに他の実施例では、レイアウトまたはパターンは、トランスウェル１６および／または間隔領域３２のランダム配置であり得る。パターンには、スポット、柱、ストライプ、渦巻き、線、三角形、長方形、円、円弧、チェック、格子縞、対角線、矢印、正方形、および／またはクロスハッチが含まれ得る。

レイアウトは、トランスウェル１６の密度（すなわち、基板１２の画定された場所内のトランスウェル１６の数）に関して特徴付けられてもよい。例えば、トランスウェル１６は、１ｍｍ^２あたり約１０ウェル～１ｍｍ^２あたり約１，０００，０００ウェルの密度で存在し得る。密度は、例えば、少なくとも１ｍｍ^２あたり約１０個、１ｍｍ^２あたり約５，０００個、１ｍｍ^２あたり約１０，０００個、１ｍｍ^２あたり約１０万個、またはそれ以上の密度を含む異なる密度に調整することができる。代替的または追加的に、密度は、１ｍｍ^２あたり約１，０００，０００ウェル以下、１ｍｍ^２あたり約１０万個、１ｍｍ^２あたり約１０，０００個、１ｍｍ^２あたり約５，０００個、またはそれ以下になるように調整することができる。さらに、支持体１２におけるトランスウェル１６の密度は、上記の範囲から選択される低値の１つ～高値の１つとの間であり得ることが理解されるべきである。

レイアウトは、さらにまたは代わりに、平均ピッチ、すなわち、ナノポア１８の中心から隣接するナノポア１８の中心までの間隔（中心間間隔）に関して特徴付けられてもよい。パターンは、平均ピッチの周りの変動係数が小さくなるように規則的であるか、またはパターンは不規則であってもよく、その場合、変動係数は比較的大きくなる可能性がある。一実施例では、平均ピッチは約１００ｎｍ～約５００μｍであり得る。平均ピッチは、例えば、少なくとも約１００ｎｍ、約５μｍ、約１０μｍ、約１００μｍ、またはそれ以上であり得る。代替的または追加的に、平均ピッチは、例えば、最大で約５００μｍ、約１００μｍ、約５０μｍ、約１０μｍ、約５μｍ、またはそれ以下であり得る。ナノポア１８の特定のパターンを含む例示的な配列の平均ピッチは、上記の範囲から選択される低値の１つ～高値の１つとの間であり得る。一実施例では、配列の平均ピッチ（中心間間隔）は約１０μｍである。

トランスウェル１６は、マイクロウェル（ミクロンスケール、例えば、約１μｍ～１０００μｍ未満で少なくとも１つの寸法を含む）またはナノウェル（ナノスケール、例えば、約１０ｎｍ～１０００ｎｍ未満で少なくとも１つの寸法を有する）であってもよい。各ウェル１６は、そのアスペクト比（例えば、この例では、幅または直径を深さまたは高さで割ったもの）によって特徴付けられてもよい。

一実施例では、各トランスウェル１６のアスペクト比は、約１：１～約１：５であり得る。別の実施例では、各トランスウェル１６のアスペクト比は約１：１０～約１：５０であり得る。一実施例では、トランスウェル１６のアスペクト比は約３．３である。

望ましいアスペクト比を得るために、深さ／高さおよび幅／直径を選択することができる。各トランスウェル１６の深さ／高さは、少なくとも約０．１μｍ、約１μｍ、約１０μｍ、約１００μｍ、またはそれ以上であり得る。代替的または追加的に、深さは最大で約１，０００μｍ、約１００μｍ、約１０μｍ、約１μｍ、約０．１μｍ、またはそれ以下であり得る。各トランスウェル１６の幅／直径は、少なくとも約５０ｎｍ、約０．１μｍ、約０．５μｍ、約１μｍ、約１０μｍ、約１００μｍ、またはそれ以上であり得る。代替的または追加的に、幅／直径は最大で約１，０００μｍ、約１００μｍ、約１０μｍ、約１μｍ、約０．５μｍ、約０．１μｍ、約５０ｎｍ、またはそれ以下であり得る。

各トランスウェル１６は、膜２４の少なくとも一部およびそれに接するナノポア１８を収容するのに十分な大きさの開口部（例えば、シスウェル１４に面するもの）を有する。例えば、ナノポア１８の端部は、膜２４を通ってトランスウェル１６の開口部へ延びていてもよい。

シスウェル１４およびトランスウェル１６は、例えば、フォトリソグラフィ、ナノインプリントリソグラフィ、スタンピング技術、エンボス技術、成形技術、マイクロエッチング技術などを含む様々な技術を使用して作ることができる。当業者には理解されるように、使用される技術は、支持体１２および側壁（単数または複数）１３の組成および形状によって決まる。一実施例では、シスウェル１４は、支持体１２の端部３８で側壁（単数または複数）１３によって画定され得、トランスウェル１６は、支持体１２を介して画定され得る。

膜２４は、本明細書に記載の非透過性または半透過性材料のいずれかであり得る。膜２４は、シスウェル１４とトランスウェル１６との間に配置され、したがって、ウェル１４、１６の間に障壁を提供する。膜は、基板１２の間隔領域３２に配置され得る。

ナノポア（単数または複数）１８は、本明細書に記載の生物学的ナノポア、固体ナノポア、およびハイブリッドナノポアのいずれかであり得る。本明細書で言及されるように、各ナノポア１８は、トランスウェル１６のそれぞれをシスウェル１４に流体的に接続する。したがって、ナノポア１８とトランスウェル１６との比は１：１である。

ナノポア１８は、２つの開口端と、その２つの開口端を接続する中空のコアまたは穴とを有する。膜２４に挿入されると、ナノポア１８の開口端の一方はシスウェル１４に面し、ナノポア１８の開口端の他方はトランスウェル１６に面し、トランスウェル１６の開口部の少なくとも一部と整列する。ナノポア１８の中空コアは、ウェル１４、１６間の流体接続を可能にする。中空コアの直径は、約１ｎｍ～１μｍであり得、ナノポア１８の長さに沿って変化し得る。いくつかの例では、シスウェル１４に面する開口端は、トランスウェル１６に面する開口端より大きくてもよい。他の例では、シスウェル１４に面する開口端は、トランスウェル１６に面する開口端より小さくてもよい。

ナノポ（単数または複数）１８を膜２４に挿入してもよく、または膜２４をナノポア（単数または複数）１８の周りに形成してもよい。一実施例では、ナノポア１８は、形成された脂質二重層（膜２４の一例）に自ら挿入し得る。例えば、モノマー形態またはポリマー形態（例えば、八量体）のナノポア１８は脂質二重層に自ら挿入し、膜貫通ポアに組み立てることができる。別の実施例では、ナノポア１８を、脂質二重層に挿入するのに望ましい濃度で、脂質二重層の接地側に追加してもよい。さらに別の例では、脂質二重層を、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）フィルムの開口部をはさんで形成し、シスウェルとトランスウェルとの間に配置してもよい。ナノポアは、接地されたシス区画に追加されてもよく、ＰＴＦＥ開口部が形成された場所で脂質二重層に自ら挿入し得る。なおさらなる実施例では、ナノポア１８は、固体支持体（例えば、シリコン、酸化ケイ素、石英、酸化インジウムスズ、金、ポリマーなど）に連結されてもよい。連結分子は、ナノポア１８自体の一部であっても、ナノポア１８に付着していてもよく、ナノポア１８を固体支持体に付着させることができる。連結分子を介した付着は、単一のポア１８を（例えば、２つのチャンバー／ウェルの間に）固定化させるものであり得る。次に、ナノポア１８の周りに脂質二重層を形成することができる。

上述のように、ナノポアシーケンサー１０のいくつかの例は、シスウェル１４内とトランスウェル１６内の両方に修飾電解質２０を含む。他の実施例では、修飾電解質２０は、トランスウェル１６内またはシスウェル１４内のいずれかにある。したがって、図１に示されるナノポアシーケンサー１０は、２つの電解質、すなわち修飾電解質２０と非修飾電解質２２とを含むこともできる。

修飾電解質２０は、電解質とカチオン錯化剤とを含む。電解質は、対イオン（カチオンおよびその結合アニオン）に解離することができる任意の電解質であり得る。例として、電解質は、カリウムカチオン（Ｋ^＋）またはナトリウムカチオン（Ｎａ^＋）に解離することができる任意の電解質であり得る。このタイプの電解質は、カリウムカチオンと結合アニオン、もしくはナトリウムカチオンと結合アニオン、またはそれらの組み合わせを含む。カリウム含有電解質の例には、塩化カリウム（ＫＣｌ）、フェリシアン化カリウム（Ｋ_３［Ｆｅ（ＣＮ）_６］・３Ｈ_２ＯまたはＫ_４［Ｆｅ（ＣＮ）_６］・３Ｈ_２Ｏ）、または他のカリウム含有電解質（例えば、重炭酸塩（ＫＨＣＯ_３）もしくはリン酸塩（例えば、ＫＨ_２ＰＯ_４、Ｋ_２ＨＰＯ_４、Ｋ_３ＰＯ_４）が含まれる。ナトリウム含有電解質の例には、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）または他のナトリウム含有電解質、例えば重炭酸ナトリウム（ＮａＨＣＯ_３）、リン酸ナトリウム（例えば、ＮａＨ_２ＰＯ_４、Ｎａ_２ＨＰＯ_４またはＮａ_３ＰＯ_４）が含まれる。別の例として、電解質は、ルテニウム含有カチオン（例えば、［Ｒｕ（ＮＨ_３）_６］^２＋または［Ｒｕ（ＮＨ_３）_６］^３＋などのルテニウムヘキサミン）に解離することができる任意の電解質であり得る。リチウムカチオン（Ｌｉ^＋）、ルビジウムカチオン（Ｒｂ^＋）、マグネシウムカチオン（Ｍｇ^＋）、またはカルシウムカチオン（Ｃａ^＋）に解離できる電解質も使用され得る。

修飾電解質２０で使用されるカチオン錯化剤は、使用される電解質のカチオンによって決まる。カチオン錯化剤は、電解質のカチオンを錯化するために含まれ、したがって、カチオン錯化剤の中心空洞の直径は、カチオンのサイズに一致するように選択される。「一致」とは、カチオンが中心空洞内に収まり、カチオン錯化剤の原子がカチオンと錯体を形成することができることを意味する。

適切なカチオン錯化剤の例には、クラウンエーテル、カリキサレン、およびバリノマイシンが含まれる。適切なクラウンエーテルの例には、以下が含まれる：

これらのクラウンエーテルの誘導体、例えばベンゾ－またはジベンゾ－１５－クラウン－５、ベンゾ－またはジベンゾ－１８－クラウン－６、ベンゾ－またはジベンゾ－２１－クラウン－７、ジシクロヘキサノ－１８－クラウン－６、ジシクロヘキサノ－２１－クラウン－７なども使用することができることを理解されたい。アザクラウン（例えば、アザ－１５－クラウン－５）またはチアクラウンも使用することができる。適切なカリックスアレーンの例には、Ｃ_３Ｃａｌ－５、Ｃ_３Ｃａｌ－６、およびカリックス［４］アレーンテトラエステルが含まれる。バリノマイシンを以下に示す：

一致するカチオンとカチオン錯化剤の例を、表１に示す。

修飾電解質２０中のカチオン錯化剤の量は、少なくとも部分的に、カチオンに対する錯化剤の親和性に応じて変化し得る。この親和性を考慮して、カチオン錯化剤は、利用可能なカチオンの少なくとも９９％の錯体形成をもたらす任意の適切な量で使用され得る。通常、カチオン錯化剤のモル濃度は、０ｍＭより大きく約１Ｍまでの範囲であり得る。一実施例では、１８－クラウン－６は、約５０ｍＭ～約５００ｍＭのモル濃度でカリウム含有電解質に使用され得る。より具体的な例では、１８－クラウン－６を約３００ｍＭのモル濃度でカリウム含有電解質に使用することができる。別の実施例では、カリックスアレーンは、カリウム含有またはナトリウム含有電解質において、０ｍＭより大きく約２０ｍＭまでの範囲のモル濃度で使用され得る。使用される濃度はいずれも、電解質中のカチオン錯化剤の溶解度によって決まり得る。

非修飾電解質２２は、修飾電解質２０と同じ電解質を、カチオン錯化剤なしで含む。そのため、非修飾電解質はカチオン錯化剤を含まない。

修飾電解質２０をシスウェル１４およびトランスウェル１６に導入する際、非修飾電解質２２は使用しない。修飾電解質２０をシスウェル１４に導入すると、非修飾電解質をトランスウェル１６に導入することができる。非修飾電解質２２をシスウエル１４に導入すると、修飾電解質をトランスウェル１６に導入することができる。

修飾電解質２０が１４および／または１６のどちらのウェルに導入されても、カチオン錯化剤はそのウェル１４および／または１６内で利用可能な電解質カチオンを錯化するため、カチオンがかさばりすぎて、そのウェル１４および／または１６からナノポア（単数または複数）１８を通って移行することができないことを理解されたい。錯化されたカチオン（単数または複数）の直径は、ナノポア（単数または複数）１８の開口端の少なくとも１つとほぼ同一（例えば、約５％以内）であるか、それより大きい。例えば、Ｋ^＋と１８－クラウン－６の錯体の直径は約１．１５ｎｍであり、ＭｓｐＡナノポアの（その最小断面での）中空中心径は約１．２ｎｍである。錯化したカチオンは、ナノポア（単数または複数）１８を通り抜けることができず、したがって、ナノポア（単数または複数）１８を通るカチオン輸送は、ナノポアシーケンサー１０の動作中に抑制される。カチオン輸送を制限することにより、電解質のアニオンは、イオン電流の差を補うことを余儀なくされ、したがって、少なくともトランス電極３４でのアニオン供給とアニオン消費との間の不均衡が縮小される。

ここで図３を参照すると、ナノポアシーケンサー１０、１０’（後者は図２に示されている）の実施例を利用する方法１００、１００’の実施例が示されている。ナノポアシーケンサー１０を伴う方法１００の実施例は、参照番号１０２および１０４を含む。参照番号１０２に示されるように、方法１００は、ナノポアシーケンサー１０のシスウェル１４とナノポアシーケンサー１０のトランスウェル１６との間に約－１Ｖ～約１Ｖの電圧バイアスを印加することにより、ナノポアシーケンサー１０における電解質の酸化還元試薬の枯渇を制御することを伴い、参照番号１０４に示されるように、電解質とカチオン錯化剤とを含む修飾電解質２０は、シスウェル１４内、もしくはトランスウェル１６内、またはシスウェルおよびトランスウェル１４、１６内に存在する。印加される電圧バイアスは、例えば、非修飾電解質２２と組み合わせて使用される場合の修飾電解質２０の位置によって決まり得る。所定の範囲内の任意の電圧バイアスを、修飾電解質２０がウェル１４、１６のそれぞれに存在するときに印加することができる。これは、イオン運動が一方向であり、したがって、特定のバイアスが印加されたときに膜２４の片側に配置された錯化イオンは、電流輸送に影響を与えないという事実による。例えば、負の電圧バイアスが印加されると、トランスウェル１６内の錯化イオンは電流輸送に影響を与えない。

一実施例では、カチオン（例えば、Ｋ^＋）とクラウンエーテルとの錯体形成は、流れる電流を約２分の１（２分の１）減らすことにより、ナノポアを通るカチオン輸送を緩和する。電流の減少は、約１倍～約３分の１になり得る。

いくつかの実施例では、方法１００はまた、ナノポアシーケンサー１０のシスウェル１４内およびトランスウェル１６内のそれぞれに修飾電解質２０を供給する工程を含んでもよい。他の実施例では、方法１００はまた、ナノポアシーケンサー１０のシスウェル１４内またはトランスウェル１６内の１つに修飾電解質２０を、他のトランスウェル１６内またはシスウェル１４内にカチオン錯化剤のない電解質（すなわち、非修飾電解質２２）を供給する工程を含んでもよい。

方法１００はまた、カチオン錯化剤を電解質に組み込んで修飾電解質２０を作る工程と、シスウェル１４内またはトランスウェル１６内の１つに修正電解質２０を導入する工程と、他のトランスウェル１６内またはシスウェル１４内にカチオン錯化剤のない電解質（すなわち、非修飾電解質２２）を導入する工程とを含んでもよい。本明細書に記載されるように、カチオン錯化剤の濃度は、少なくとも部分的に、錯化剤のカチオンへの親和性に応じて変化し得る。

方法１００は、ナノポアシーケンシング動作中に実施することができる。ナノポア１８をはさんだ電位の印加（すなわち、電流源としてのシスおよびトランス電極３０、３４によって供給されるバイアス）は、電荷を運ぶアニオンとともにナノポア１８を通るヌクレオチドの移行を強制する。バイアスに応じて、ヌクレオチドはシスウェル１４からトランスウェル１６に、またはトランスウェル１６からシスウェル１４に輸送され得る。ヌクレオチドがナノポア１８を通過すると、例えば、そのくびれの塩基依存的閉塞などにより、障壁を通る電流が変化する。電流の変化からのシグナルは、増幅器、または別の既知シグナル検出デバイスを使用して測定することができる。

電圧の範囲は、約－１Ｖ～約１Ｖ以上まで選択することができる。電圧極性は通常、負に帯電した核酸を電気泳動によりナノポア１８に追い込むように印加される。場合によっては、電圧を下げるか、極性を逆にすることで、適切な機能を促進することができる。

ここで図２を参照すると、ナノポアシーケンサー１０’の別の実施例が示されている。ナノポアシーケンサー１０’は、シスウェル１４、トランスウェル１６、シスウェル１４とトランスウェル１６とを流体的に接続するナノポア１８、ならびにシスウェル１４内、もしくはトランスウェル１６内、またはシスウェルおよびトランスウェル内１４，１６の高分子電解質４２を含む。高分子電解質４２がシスウェル１４またはトランスウェル１６のうちの１つにある実施例では、電解質４４は、他のトランスウェル１６またはシスウェル１４に存在し得る。

図２に示されるように、基板１２は、その中に画定された複数のトランスウェル１６を含むことができ、シスウェル１４を少なくとも部分的に画定する側壁（単数または複数）１３に接続され得る。トランスウェル１６のそれぞれは、それぞれのナノポア１８によって共通シスウェル１４に流体的に接続され得る。図２には１つの共通シスウェル１４が示されているが、シーケンサー１０’は、互いに流体的に隔離され、基板１２に画定されたそれぞれのトランスウェル１６のセットに流体的に接続されたいくつかのシスウェル１４を含み得ることを理解されたい。例えば、単一の基板１２上の複数の試料の測定を可能にするために、複数のシスウェル１４が望ましい場合がある。

ナノポア（単数または複数）１８を通る流体連通は、図２の矢印によって示される。また、図２に示されるように、膜２４は、シスウェル１４とトランスウェル（単数または複数）１６との間の基板１２上に配置されてもよく、ナノポア（単数または複数）１８は、膜２４に配置され、膜２４を貫通して延び、シスウェル１４とトランスウェル（単数または複数）１６との間に流体接続を確立することができる。

ナノポアシーケンサー１０’のシスウェル１４およびトランスウェル１６は、ナノポアシーケンサー１０について本明細書に記載されるのと同じ方法および同じ構成（例えば、寸法、レイアウトなど）で画定され得る。さらに、シス電極３０およびトランス電極（単数または複数）３４は、それぞれ、側壁（単数または複数）１３および基板１２に物理的に接続することができ、それぞれ、シスウェル１４の上面２８およびトランスウェル（単数または複数）１６の下面３６を画定し得る。

ナノポアシーケンサー１０’では、シスウェル１４は、電解質４４または高分子電解質４２を、ナノポア（単数または複数）１８と接触した状態に維持することができる。一実施例では、シスウェル１４はナノポア１８の配列と接触しており、したがって、電解質４４または高分子電解質４２を、配列内の各ナノポア１８と接触した状態に維持することができる。また、ナノポアシーケンサー１０’において、各トランスウェル１６は、膜２４の少なくとも一部およびそれに接するナノポア１８を収容するのに十分な大きさの開口部（例えば、シスウェル１４に面するもの）を有する。例えば、ナノポア１８の端部は、膜２４を通ってトランスウェル１６の開口部へ延びていてもよい。

本明細書に記載の膜２４およびナノポア１８のいずれも、ナノポアシーケンサー１０’に使用することができる。

上述のように、ナノポアシーケンサー１０’のいくつかの実施例は、シスウェル１４内とトランスウェル１６内の両方に高分子電解質４２を含む。他の例では、高分子電解質４２は、トランスウェル１６内またはシスウェル１４内のいずれかにある。したがって、図２に示されるナノポアシーケンサー１０’は、２つの電解質、すなわち高分子電解質４２と電解質４２とを含むことができる。図２の実施例では、高分子電解質４２はトランスウェル１６内に存在し、高分子電解質４２または電解質４４はシスウェル１４内に存在する。

高分子電解質４２は、ゲル状の荷電ポリマーであり、反対の電荷のイオンの結合により電流を伝導することができる。本明細書に開示される実施例では、高分子電解質４２は、負に帯電したイオン（すなわち、アニオン）と結合する正に帯電した骨格を有する。カチオンは高分子電解質４２の骨格の一部であるため、それらはそのウェル１６または１４からナノポア（単数または複数）１８を通って容易に移行しない場合がある。適切な高分子電解質４２の実施例は、ポリジアリルジメチルアンモニウムクロライド（ＰＤＤＡ）、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）のイオン型、直鎖ポリエチレンイミン（ＬＰＥＩ）のイオン型、ポリ（アリルアミン塩酸塩）（ＰＡＨ）、およびポリ（４－ビニルピリジン）（Ｐ４ＶＰ）のイオン型からなる群より選択される。いくつかの例示構造を以下に示す：

これらの例では、直鎖ポリエチレンイミン（ＬＰＥＩ）の－ＮＨ^２＋はＣｌ^－に配位し、ポリ（４－ビニルピリジン）（Ｐ４ＶＰ）の－ＮＨ^＋はＣｌ^－に配位する（すなわち、ポリ（４－ビニルピリジン塩酸塩））。ポリ（４－ビニルピリジン）（Ｐ４ＶＰ）のイオン型の別の例は、ポリ(4-ビニルピリジン) メチルクロリドであり、ポリ（４－ビニルピリジン）の－Ｎ^＋ＣＨ_３はＣｌ^－に配位している。他のウェル１４、１６で使用される電解質４４およびトランス電極３４上の電気化学反応の性質に応じて、塩化物以外のアニオンを使用することができる。トランス側の電解質平衡を維持することが望ましいため、トランス電極３４によって消費または生成されるイオンは高分子電解質４２と一致する必要がある。

高分子電解質４２は、遊離電解質ほど容易にはナノポア１８を通過しないかもしれないが、ナノポア１８は荷電ポリマー（例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ＤＮＡ）を移行させることが示されている。したがって、非線形高分子電解質４２を使用して、ポア１８を通る高分子電解質４２の移行をさらに妨ぐことができる。例えば、分岐ＰＥＩまたは高分子電解質４２と架橋性基を有するモノマーとのコポリマー。

トランスウェル（単数または複数）１６に含まれる場合、高分子電解質４２は、膜２４（例えば、脂質二重層）の機械的支持および構造的安定性を改善することもできる場合がある。

含まれる場合、電解質４２は、対イオン（カチオンおよびその結合アニオン）に解離することができる任意の電解質であり得る。例として、電解質は、カリウムカチオン（Ｋ^＋）またはナトリウムカチオン（Ｎａ^＋）に解離することができる任意の電解質であり得る。このタイプの電解質は、カリウムカチオンと結合アニオン、もしくはナトリウムカチオンと結合アニオン、またはそれらの組み合わせを含む。カリウム含有電解質の例には、塩化カリウム（ＫＣｌ）、フェリシアン化カリウム（Ｋ_３［Ｆｅ（ＣＮ）_６］・３Ｈ_２ＯまたはＫ_４［Ｆｅ（ＣＮ）_６］・３Ｈ_２Ｏ）、または他のカリウム含有電解質（例えば、重炭酸塩（ＫＨＣＯ_３）もしくはリン酸塩（例えば、ＫＨ_２ＰＯ_４、Ｋ_２ＨＰＯ_４、Ｋ_３ＰＯ_４）が含まれる。ナトリウム含有電解質の例には、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）または他のナトリウム含有電解質、例えば重炭酸ナトリウム（ＮａＨＣＯ_３）、リン酸ナトリウム（例えば、ＮａＨ_２ＰＯ_４、Ｎａ_２ＨＰＯ_４、Ｎａ_３ＰＯ_４）が含まれる。別の例として、電解質は、ルテニウム含有カチオン（例えば、［Ｒｕ（ＮＨ_３）_６］^２＋または［Ｒｕ（ＮＨ_３）_６］^３＋などのルテニウムヘキサミン）に解離することができる任意の電解質であり得る。リチウムカチオン（Ｌｉ^＋）、ルビジウムカチオン（Ｒｂ^＋）、マグネシウムカチオン（Ｍｇ^＋）、またはカルシウムカチオン（Ｃａ^＋）に解離できる電解質も使用され得る。

ナノポアシーケンサー１０’の実施例では、高分子電解質４２はシスウェルとトランスウェル１４、１６内の両方に存在し、高分子電解質４２は、ポリジアリルジメチルアンモニウムクロライド、ポリエチレンイミンのイオン型、直鎖ポリエチレンイミンのイオン型、ポリ（アリルアミン塩酸塩）、およびポリ（４－ビニルピリジン）のイオン型からなる群より選択される。

ナノポアシーケンサー１０’の別の実施例では、高分子電解質４２は、ポリジアリルジメチルアンモニウムクロライド、ポリエチレンイミンのイオン型、直鎖ポリエチレンイミンのイオン型、ポリ（アリルアミン塩酸塩）、およびポリ（４－ビニルピリジン）のイオン型からなる群より選択され；電解質４２は、カリウムカチオンと結合アニオン、もしくはナトリウムカチオンと結合アニオン、またはそれらの組み合わせを含む。

再び図３を参照すると、ナノポアシーケンサー１０’を伴う方法１００’の実施例は、参照番号１０２および１０６を含む。参照番号１０２に示されるように、方法１００’は、ナノポアシーケンサー１０’のシスウェル１４とナノポアシーケンサー１０’のトランスウェル１６との間に約－１Ｖ～約１Ｖの電圧バイアスを印加することにより、ナノポアシーケンサー１０’における電解質の酸化還元試薬の枯渇を制御することを伴い、参照番号１０６に示されるように、高分子電解質４２は、シスウェル１４内、もしくはトランスウェル１６内、またはシスウェルおよびトランスウェル１４、１６内に存在する。トランス側の電解質平衡を維持する任意の電圧バイアスを印加することができる。

いくつかの例では、方法１００’は、ナノポアシーケンサー１０’のシスウェル１４内およびトランスウェル１６内のそれぞれにゲル状高分子電解質４２を供給する工程を含んでもよい。他の実施例では、方法１００’はまた、ナノポアシーケンサー１０’のシスウェル１４内またはトランスウェル１６内の１つにゲル状高分子電解質４２を、他のトランスウェル１６内またはシスウェル１４内に電解質４４を供給する工程を含んでもよい。

方法１００’はまた、高分子電解質４２を（ゲル状態で）シスウェル１４内に、もしくはトランスウェル（単数または複数）１６内に、またはシスウェルおよびトランスウェル１４、１６内の両方に導入する工程を含んでもよい。高分子電解質４２がウェル１４または１６のうちの１つにある場合、方法１００’は、他のトランスウェル１６またはシスウェル１４に電解質４４を導入する工程を含んでもよい。

方法１００’は、ナノポアシーケンシング動作中に実施することができる。ナノポア１８をはさんだ電位の印加（すなわち、電流源としてのシスおよびトランス電極３０、３４によって供給される所定のバイアス）は、電荷を運ぶアニオンとともにナノポア１８を通るヌクレオチドの移行を強制する。バイアスに応じて、ヌクレオチドはシスウェル１４からトランスウェル１６に、またはトランスウェル１６からシスウェル１４に輸送され得る。ヌクレオチドがナノポア１８を通過すると、例えば、そのくびれの塩基依存的閉塞などにより、障壁を通る電流が変化する。電流の変化からのシグナルは、増幅器、または別の既知シグナル検出デバイスを使用して測定することができる。

電圧の範囲は、約－１Ｖ～約１Ｖ以上まで選択することができる。電圧極性は通常、負に帯電した核酸を電気泳動によりナノポア１８に追い込むように印加される。場合によっては、電圧を下げるか、極性を逆にすることで、適切な機能を促進することができる。

ここで図４を参照すると、ナノポアシーケンサー１０’’のさらに別の実施例が示されている。ナノポアシーケンサー１０’’は、シスウェル１４’、トランスウェル１６’、シスウェル１４’とトランスウェル１６’とを流体的に接続するナノポア１８、シスウェル１４’に接するシスウェル電極構造４７（第１ベース電極３０’と、第１ベース電極３０’に固定された酸化還元固体４８とを含むシスウェル電極構造４７）；トランスウェル１６’に接するトランスウェル電極構造５０（第２ベース電極３４’と、第２ベース電極３４’に固定された酸化還元固体４８とを含むトランスウェル電極構造５０）；ならびにシスウェル電極構造４７およびトランスウェル電極構造５０でのそれぞれの酸化還元反応に応じて消費または放出されるカチオンを含む電解質４６を含む。

図４に示されるように、基板１２は、その中に画定された複数のトランスウェル１６’を含み得る。トランスウェル１６’のそれぞれは、それぞれのナノポア１８によって共通シスウェル１４’に流体的に接続され得る。図４には１つの共通シスウェル１４’が示されているが、シーケンサー１０’’は、互いに流体的に隔離され、基板１２に画定されたそれぞれのトランスウェル１６’のセットに流体的に接続されたいくつかのシスウェル１４を含み得ることを理解されたい。例えば、単一の基板１２上の複数の試料の測定を可能にするために、複数のシスウェル１４’が望ましい場合がある。

ナノポア（単数または複数）１８を通る流体連通は、図４の矢印によって示される。また、図４に示されるように、膜２４は、シスウェル１４’とトランスウェル（単数または複数）１６’との間に配置されてもよく、ナノポア（単数または複数）１８は、膜２４に配置され、膜２４を貫通して延び、シスウェル１４とトランスウェル（単数または複数）１６との間に流体接続を確立することができる。

ナノポアシーケンサー１０’のシスウェル１４’およびトランスウェル１６’は、ナノポアシーケンサー１０のシスウェル１４およびトランスウェル１６について本明細書に記載されるのと同じ構成（例えば、寸法、レイアウトなど）で画定され得る。

この実施例では、シスウェル１４’は、側壁（単数または複数）１３’によって画定された内壁２６、２６’と、シスウェル電極構造４７の酸化還元固体４８によって画定された上面２８と、膜２４とによって画定された下面２８’とを有する。したがって、シスウェル１４’は、シスウェル電極構造４７の酸化還元固体４８と、側壁（単数または複数）１３’と、膜２４とによって画定された空間内に形成される。

シスウェル電極構造４７は、側壁（単数または複数）１３’に物理的に接続されていてもよい。シスウェル電極構造４７は、例えば、接着剤または別の適切な締結構造によって、側壁（単数または複数）１３’に物理的に接続されていてもよい。シスウェル電極構造４７と側壁（単数または複数）１３’との間の接触面は、シスウェル１４’の上部を密封し得る。

上述のように、シスウェル電極構造４７は、第１ベース電極３０’と、第１ベース電極３０’に固定された酸化還元固体４８とを含む。第１ベース電極３０’は、グラファイト、白金、金、銀、銅、炭素繊維、ダイヤモンド、およびパラジウムからなる群より選択される材料を含むか、または場合によってはそれから構成されていてもよい。酸化還元固体４８は、テトラシアノキノジメタン（ＴＣＮＱ）、プルシアンブルー（固体電極として、例えばグルコースセンサーにおいて使用され得る）、およびポリピロールからなる群より選択され得る。

図４に示されるように、ナノポアシーケンサー１０’’は、複数のトランスウェル１６’を含む。各トランスウェル１６’は、膜２４の少なくとも一部およびそれに接するナノポア１８を収容するのに十分な大きさの開口部（例えば、シスウェル１４’に面するもの）を有する。例えば、ナノポア１８の端部は、膜２４を通ってトランスウェル１６’の開口部へ延びていてもよい。

各トランスウェル１６’は、基板１２に画定された流体チャンバーである。図４に示される実施例では、各トランスウェル１６’は、基板１２によっておよび／または基板１２の間隔領域３２によって画定された側壁３１、３１’と、トランスウェル電極構造５０の酸化還元固体４８によって画定された下面３６と、膜２４とによって画定された上面３６’とを有する。したがって、各トランスウェル１６’は、トランスウェル電極構造５０の酸化還元固体４８と、基板１２の他の部分および／または間隔領域３２と、膜２４とによって画定された空間内に形成される。上面３６’は、膜２４に配置されたナノポア（単数または複数）１８を通る開口部（単数または複数）を有することを理解されたい。

トランスウェル電極構造５０は、基板１２に物理的に接続されていてもよく、基板１２を形成するプロセスで（例えば、トランスウェル１６’の形成中に）作ることができる。基板１２およびトランス電極３４’を形成するために使用され得る微細加工技術には、リソグラフィ、金属蒸着およびリフトオフ、乾燥および／またはスピンオンフィルム蒸着、エッチングなどが含まれる。トランスウェル電極構造５０と基板１２との間の接触面は、トランスウェル１６’の下部を密封し得る。

上述のように、トランスウェル電極構造５０は、第２ベース電極３４’と、第２ベース電極３４’に固定された酸化還元固体４８とを含む。第２ベース電極３４’上の酸化還元固体４８は、第１ベース電極３０’に固定された酸化還元固体４８と同じタイプである。したがって、第２ベース電極３４’上の酸化還元固体４８は、テトラシアノキノジメタン（ＴＣＮＱ）、プルシアンブルー、およびポリピロールからなる群より選択され得る。ベース電極３４’は、ベース電極３０’と同じ材料であっても、異なるタイプの材料であってもよい。したがって、第２ベース電極３４’は、グラファイト、白金、金、銀、銅、炭素繊維、ダイヤモンド、およびパラジウムからなる群より選択される材料を含むか、または場合によっては、それから構成されていてもよい。

酸化還元固体４８は、任意の適切な化学的または電気化学的蒸着プロセスを使用して、それぞれのベース電極３０’、３４’上に蒸着され得る。例として、プルシアンブルーは、第二鉄（Ｆｅ^３＋）およびフェリシアン化物（［Ｆｅ^３＋（ＣＮ）_６］^３－）イオンの混合物を含む水溶液から、開回路状態で自発的に、または還元的電気化学駆動力を加えることにより蒸着することができる。

酸化還元固体４８の厚さは、約１０ｎｍ～約１０μｍの厚さを有し得る。一例として、ＴＣＮＱ酸化還元固体は、約１００ｎｍ～５μｍの厚さのフィルムであり得る。いくつかの厚さ範囲が提供されているが、厚さは、部分的に、蒸着プロセスの所与の制限および長時間のシーケンサー操作を維持するための一定量の酸化還元固体に望まれることに依存し得ることを理解されたい。

本明細書に記載の膜２４およびナノポア１８のいずれも、ナノポアシーケンサー１０’’に使用することができる。

ナノポアシーケンサー１０’’の電解質４６は、電解質４４について提供される例のいずれかであり得る。要するに、電解質４６は、対イオン（カチオンとその結合アニオン）に解離することができる任意の電解質であり得、そのカチオンはまた、ベース電極３０’、３４’上の酸化還元固体４８によって放出および消費されることができる。ある場合には、電解質４６は電解質４４の１つの水溶液である。ナノポアシーケンサー１０’’のこの実施例では、電解質４６はシスウェル１４’およびトランスウェル（単数または複数）１６’に存在する。したがって、シスウェル１４’およびトランスウェル（単数または複数）１６’は、電解質４６をナノポア（単数または複数）１８と接触した状態に維持することができる。

酸化還元固体４８は、シスウェル１４’およびトランスウェル（単数または複数）１６’において水が分解しない電位窓で使用される電解質４６中で酸化還元活性である。本明細書に開示される酸化還元固体４８の例は、比較的低い電位（例えば、－１Ｖ～１Ｖ）で酸化還元反応を引き起こす。酸化還元固体４８は、（負電位にさらされたときに）電解質４６のカチオンを消費するカソード反応（例えば、以下の式１）を起こすことができ、（正電位にさらされたときに）カチオンを電解質４６に放出するアノード反応（例えば、以下の式２）を起こすことができる。一例として、それぞれのベース電極３０’、３４’に固定されたＴＣＮＱ酸化還元固体４８を有する電極構造４７、５０が関与する酸化還元反応は、以下を伴う：
ＴＣＮＱ_（固体）＋ｅ^－＋Ｋ^＋ _{（水溶液）}→（Ｋ^＋ＴＣＮＱ^－）_（固体） （式１）
（Ｋ＋ＴＣＮＱ^－）_（固体）→ＴＣＮＱ_（固体）＋ｅ^－＋Ｋ^＋ _{（水溶液）} （式２）。

これらの反応が適切な電位の印加により誘発されることで、カチオン（例えば、Ｋ^＋）はトランスウェル（単数または複数）１６’で放出され、シスウェル１４’で消費される。これにより、トランスウェル（単数または複数）１６’におけるアニオンの枯渇が解消される。

ここで図５を参照すると、ナノポアシーケンサー１０’’を伴う方法２００の実施例は、ナノポアシーケンサー１０’’内の電解質４６の酸化還元反応物の枯渇を以下によって制御することを伴う：シスウェル電極構造４７に第１電圧を印加することにより、ナノポアシーケンサー１０’’内の電解質４６のカチオンを消費するカソード反応を開始すること（参照番号２０２に示されるように）；トランスウェル電極構造５０に第２電圧を印加することにより、電解質４６のカチオンを放出するアノード反応を開始すること。

方法２００は、ナノウェルシーケンサー１０’’に、電極構造４７、５０と、シスウェル１４’およびトランスウェル１６’のそれぞれへの電解質４６とを供給することも含み得る。方法２００は、シスウェル１４’およびトランスウェル１６’のそれぞれに電解質４６を導入することも含み得る。

方法２００は、ナノポアシーケンシング動作中に実施することができる。ナノポア１８をはさんだ電位の印加（すなわち、電流源としての第１および第２電極構造４７、５０によって供給される所定のバイアス）は、電荷を運ぶカチオンおよび／またはアニオンとともにナノポア１８を通るヌクレオチドの移行を強制する。バイアスに応じて、ヌクレオチドはシスウェル１４’からトランスウェル１６’に、またはトランスウェル１６’からシスウェル１４’に輸送され得る。ヌクレオチドがナノポア１８を通過すると、例えば、そのくびれの塩基依存的閉塞などにより、障壁を通る電流が変化する。電流の変化からのシグナルは、増幅器、または別の既知シグナル検出デバイスを使用して測定することができる。

電圧の範囲は、約－１Ｖ～約１．５Ｖ以上まで選択することができる。一実施例では、酸化還元固体４８としてＴＣＮＱを使用してシーケンサー１０’’を動作させるために適切な電圧範囲は、約０．４Ｖ～約１．２Ｖである。これは、第１および第２ベース電極３０’、３４’間に印加される電圧差に相当する。電圧極性は、負に帯電した核酸を電気泳動によりナノポア１８に追い込むように印加され得る。場合によっては、電圧を下げるか、極性を逆にすることで、適切な機能を促進することができる。

本開示をさらに説明するために、本明細書に実施例を挙げる。これらの実施例は例示の目的で提供されており、本開示の範囲を限定するものとして解釈されるべきではないことを理解されたい。

（非限定的な実動する実施例）
（実施例１）
単一のシスウェルおよび単一のトランスウェルを有する２つのナノポアシーケンサー（本明細書ではそれぞれ「１」または「ポア１」および「２」または「ポア２」と呼ぶ）を調製した。クラウンエーテルを添加していない塩化カリウムを、シーケンサー１、２のシスおよびトランスウェルに導入した。ナノポアシーケンサー１、２のそれぞれには、シスウェルとトランスウェルとの間の脂質二重層膜に配置されたＭｓｐＡナノポアが含まれていた。

ナノポアシーケンサー１、２のそれぞれにおけるナノポアのそれぞれにさまざまな電位を印加し、電流を測定した。結果を図６Ａに示す。ナノポアシーケンサー１（ポア１）は逆バイアス時に非対称応答を示し、これは「ゲーティング」として知られている；ナノポアシーケンサー２（ポア２）は対称応答を示した。

塩化カリウムは、ナノポアシーケンサー２のシスおよびトランスウェル両方から流入された。クラウンエーテル、１８－クラウン－６を塩化カリウムに４００ｍＭで加え、この電解質をナノポアシーケンサー２のシスおよびトランスウェルに導入した。ナノポアシーケンサー２のナノポアをはさんでさまざまな電位を印加し、電流を測定した。結果を図６Ｂに示す。図６Ｂは、比較のために図６Ａのナノポアシーケンサー２（クラウンエーテルなし）の結果も示している。クラウンエーテルを追加すると、ナノポアシーケンサー２は、順方向と逆方向の両方のバイアス電流の抑制を示した。負のバイアスと正のバイアスの両方での伝導の減少により、１８－クラウン－６がＭｓｐＡナノポアを通るＫ^＋輸送を妨害したことが確認された。この結果は、Ｋ^＋イオンとクラウンエーテルの錯体形成のために、流れる電流が予想では２分の１に減少することにより、ナノポアを通るＫ^＋イオンの輸送が妨げられることを示唆している。

次に、クラウンエーテルを含む塩化カリウムをナノポアシーケンサー２のシスウェルから流入した。シスおよびトランスウェルは脂質層によって分離されているため、クラウンエーテルを加えた塩化カリウムはナノポアシーケンサー２のトランスウェルに留まった。ナノポアシーケンサー２のナノポアをはさんでさまざまな電位を印加し、電流を測定した。結果を、図６Ｃの「ポア２－流入」と表示された線で示す。図６Ｃは、比較のために図６Ａのナノポアシーケンサー２（クラウンエーテルなし）の結果も示している。クラウンエーテルを流入した後のナノポアシーケンサー２のＩＶ曲線（図６Ｃで「ポア２－流入」と表示された線）は、ほぼ標準状態（図６Ｃで「ポア２」と表示された線）に戻った。いくつかの残留効果が、逆バイアス下の電流輸送に観察され、これは、トランスウェルに閉じ込められたままの少量のクラウンエーテルと一致していた。

（実施例２）
移行実験では、８７ヌクレオチド塩基と６６℃の融解温度のヘアピン構造を持つオリゴマーを使用した。２つのナノポアシーケンサーを使用した。それぞれには、単一のシスウェルと単一のトランスウェル、およびシスウェルとトランスウェルとの間の脂質二重層膜に配置されたＭｓｐＡナノポアがあった。

比較シーケンサーでは、クラウンエーテルを添加していない塩化カリウムをシスおよびトランスウェルに導入した。実施例シーケンサーでは、４００ｍＭの１８－クラウン６を添加した塩化カリウムを、シスおよびトランスウェルに導入した。それぞれのオリゴマーは、比較シーケンサーと実施例シーケンサーで移行した。

比較シーケンサーのイオン電流対時間の結果を図７Ａに示し、結果のヒストグラムを図７Ｂに示す。比較シーケンサーの場合、開放ポア電流は１０７．５ｐＡであり、中間閉塞電流は７３．５ｐＡ（６８％）であった。図７Ａの２０ｐＡ～５０ｐＡの読み取り値は、ヘアピンＤＮＡオリゴマーが解凍し、移行が停止する深い閉塞に対応すると考えられている。ヒストグラムでは、この深い閉塞は振幅７０～８０の間に見られると考えられている。

実施例シーケンサーのイオン電流対時間の結果を図８Ａに示し、結果のヒストグラムを図８Ｂに示す。実施例シーケンサーの場合、開放ポア電流は８８．５ｐＡであり、中間閉塞電流は５７．５ｐＡ（６５％）であった。図８Ａに示すように、２０ｐＡ～５０ｐＡの読み取り値の数が減少している。 Ｋ^＋イオンの錯体形成により、ＤＮＡが容易に解凍され、その結果、深い閉塞が減少すると考えられている。図８Ｂでは、振幅７０～８０の間にシグナルがないことが観察され、これはまた、深い閉塞が低減または排除されているという見解を支持する。

全体的に、実施例シーケンサーの電流レベルシフトは、ナノポアを通る伝導へのＫ^＋イオンの寄与の減少と一致している。これにより、Ｃｌ^－イオンの枯渇が減少すると考えられている。

（補注）
前述の概念および以下でより詳細に説明する追加の概念の全ての組み合わせは（そのような概念が相互に矛盾しない限り）、本明細書で開示される本発明の主題の一部であることが理解されるであろう。特に、本開示の最後に現れる特許請求される主題の全ての組み合わせは、本明細書で開示される本発明の主題の一部であると考えられる。また、本明細書で明示的に使用される用語は、参照により組み込まれる任意の開示に現れる場合もあり、本明細書で開示される特定の概念と最も一致する意味が与えられるべきであることも理解されたい。

明細書全体にわたる「一実施例」、「別の実施例」、「実施例」などへの言及は、実施例に関連して説明された特定の要素（例えば、機能、構造、および／または特徴）が、本明細書で説明される少なくとも１つの実施例に含まれており、他の実施例には存在してもしなくてもよいことを意味する。加えて、文脈が明確に別段の指示をしない限り、任意の実施例について説明された要素は、様々な実施例において任意の適切な方法で組み合わせることができることを理解されたい。

本明細書で提供される範囲は、明言された範囲および明言された範囲内の任意の値または部分的範囲を含むことを理解されたい。例えば、約５０ｍＭ～約５００ｍＭの範囲は、明示的に記載された約５０ｍＭ～約５００ｍＭの際限を含むだけでなく、約１００ｍＭ、約３３５ｍＭ、約４００．５ｍＭ、約４９０ｍＭなどの個々の値、および約７５ｍＭ～約４７５ｍＭ、約２００ｍＭ～約３００ｍＭなどの部分的範囲なども含むと解釈されるべきである。さらに、「約」および／または「実質的に」を使用して値を説明する際、これは、明言された値からのわずかな変動（最大＋／－１０％）を包含することを意味する。

いくつかの実施例を詳細に説明したが、開示された実施例は修正できることを理解されたい。したがって、前述の説明は非限定的であると見なされるべきである。

Claims (8)

1. 以下を含む、ナノポアシーケンサー：
   シスウェル；
   トランスウェル；
   前記シスウェルと前記トランスウェルとを流体的に接続するナノポア；ならびに
   前記トランスウェル内の修飾電解質であって、
   ここで、前記修飾電解質がカチオンとカチオンを錯化するためのカチオン錯化剤とを含み、
   前記カチオン錯化剤は前記シスウェル中になく、
   錯化されたカチオンの直径が前記ナノポアの開口端より大きい。
2. 基板内に画定された複数の前記トランスウェルをさらに備え、その各々が、それぞれのナノポアによって前記シスウェルに流体的に接続されており、前記複数のトランスウェルの密度が、前記基板のｍｍ^２あたり約１０個のトランスウェル～前記基板のｍｍ^２あたり約１，０００，０００個のトランスウェルである、請求項１に記載のナノポアシーケンサー。
3. 請求項１に記載のナノポアシーケンサーであって、
   前記カチオンが、カリウムカチオン、ナトリウムカチオン、またはそれらの組み合わせを含み；
   前記カチオン錯化剤が、クラウンエーテル、カリキサレン、バリノマイシン、およびそれらの誘導体からなる群より選択される、ナノポアシーケンサー。
4. 前記修飾電解質が、０ｍＭ超～約５００ｍＭの前記カチオン錯化剤を含む、請求項１に記載のナノポアシーケンサー。
5. 前記シスウェル内に前記カチオン及び結合アニオンを含む、請求項１～４のいずれか一項に記載のナノポアシーケンサー。
6. 請求項１～５のいずれか一項に記載のナノポアシーケンサーを使用する方法であって、
   前記ナノポアシーケンサーの前記シスウェルと前記ナノポアシーケンサーの前記トランスウェルとの間に約－１Ｖ～約１Ｖの電圧バイアスを印加することにより、前記ナノポアシーケンサーにおけるアニオンの枯渇を制御することを含む、方法。
7. 以下をさらに含む、請求項６に記載の方法：
   前記カチオン錯化剤を前記カチオンに組み込んで前記修飾電解質を作る工程と；
   前記修飾電解質を前記トランスウェル内に導入する工程。
8. 請求項６に記載の方法であって：
   前記カチオンが、カリウムカチオン、ナトリウムカチオン、またはそれらの組み合わせを含み；
   前記カチオン錯化剤が、クラウンエーテル、カリキサレン、バリノマイシン、及びそれらの誘導体からなる群より選択される、方法。

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