KR20200011979A - 비천연 아미노산 함유 단백질 생성을 촉진하는 방법 및 조성물 - Google Patents

비천연 아미노산 함유 단백질 생성을 촉진하는 방법 및 조성물 Download PDF

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Abstract

본원은 게놈 조작 기술을 이용하여 비천연 아미노산 함유 단백질 생성을 촉진하기 위한 세포주를 생성하는 방법 및 조성물을 개시한다.

Description

비천연 아미노산 함유 단백질 생성을 촉진하는 방법 및 조성물
관련 출원의 참조
본원은 2017년 6월 2일에 출원된 미국 가출원 제62/514,754호(발명의 명칭: "비천연 아미노산 함유 단백질 생성을 촉진하는 방법 및 조성물")의 이익을 주장하고, 이 가출원의 내용은 전체로서 본원에 참고로 도입된다.
서열목록
본원은, EFS-웹을 통해 ASCII 포맷으로 제출되었고 전체로서 본원에 참고로 도입된 서열목록을 함유한다. 2018년 5월 29일에 생성된 ASCII 사본은 AMBX_0223_PCT_SL.txt로 명명되고 크기가 13,172 바이트이다.
발명의 분야
본 개시는 비천연 아미노산 함유 폴리펩타이드를 생성하기 위한 세포주의 게놈 조작 및 생성 분야에 관한 것이다. 본 발명은 일반적으로 세포주 생성, 개발, 및 비천연 아미노산 함유 폴리펩타이드 및 단백질의 생성 분야에 관한 것이다.
진핵생물 세포에서의 화학적 오르토고날(orthogonal) 유도 조작된 시스템(EuCODE)의 적용(본원에 각각 참고로 도입된 문헌(Feng et al., (2013), A general approach to site-specific antibody drug conjugates, PNAS 111(5): 1766-1771); 및 USPN 7,083,970(Schultz et al.))은 비천연 아미노산을 함유하는 단백질을 유전적으로 제조하는 데 있어서 돌파구이다. 최근에, 이 기술은 항체 약물 접합(ADC)의 분야에서 빠르게 진보하고 있다(예를 들면, 본원에 각각 참고로 도입된 미국 특허 공보 제20150018530호, 제20150141624호, 제20150152187호 및 제20150152190호 참조). 그러나, 산업에서 비천연 아미노산 함유 단백질의 보다 더 넓은 적용은 포유동물 세포에서 상대적으로 낮은 수율에 의해 저해된다.
관찰결과는 낮은 수율의 단백질 생성에 기여할 가능성이 높은 주요 요인이 상기 시스템에서 과도한 비충전된 tRNA에 의해 야기된 유도 아폽토시스일 것임을 시사한다. 당분야에서 공지되어 있는 바와 같이, 아폽토시스는 생성 공정을 포함하는 세포 배양에서의 다양한 내재성 또는 외재성 요인들에 의해 시작될 수 있다. 낮은 수율의 단백질 생성에 기여하는 다른 문제점은 생물반응기 공정에서 규모 확장 시 내재성 아폽토시스 경로를 활성화시킬 수 있는 세포 스트레스 요인이다. 따라서, 비천연 아미노산 함유 단백질 생성을 촉진하고 증가시키는 개선된 방법 및 조성물에 대한 필요성이 산업에 존재한다. 본 발명의 개시는 하기 개시를 검토할 때 자명할 바와 같이 이 필요성 및 다른 필요성을 다룬다.
본원은 비천연 아미노산 함유 단백질 생성을 촉진하는 방법 및 조성물을 개시한다. 또한, 본원은 비천연 아미노산 함유 단백질 생성을 촉진하는 세포 및 세포주를 개시한다. 한 실시양태에서, 본 발명의 개시는 비천연 아미노산을 단백질 내로 도입하는 세포주를 생성하는 방법으로서, 관심 있는 선택자 코돈(selector codon) 함유 유전자를 발현하는 세포에서 불활성화를 위해 표적화된 하나 이상의 부위 또는 영역을 포함하고, 상기 세포가 오르토고날 아미노아실 tRNA 합성효소(O-RS) 및 오르토고날 억제제 tRNA(O-tRNA)를 포함하는 것인 방법을 제공한다. 또 다른 실시양태에서, 상기 세포 또는 세포주는 진핵생물 세포 또는 세포주이다. 다른 실시양태에서, 상기 세포 또는 세포주는 COS, CHO, VERO, MDCK, WI38, V79, B14AF28-G3, BHK, HaK, NS0, SP2/0-Ag14, HeLa 또는 HEK293으로부터 선택된다. 한 다른 실시양태에서, 상기 세포 또는 세포주는 일시적인, 안정한 세포 집단 또는 안정한 클론 세포주이다. 또 다른 실시양태에서, 상기 세포는 단리된 세포이다. 단리된 세포는 비천연 아미노산이 도입된 단백질을 수득하기 위한 것이다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명은 비천연 아미노산이 도입된 단백질 또는 폴리펩타이드를 포함한다. 다른 실시양태에서, 비천연 아미노산은 부위 특이적으로 도입된다. 다른 실시양태에서, 비천연 아미노산은 파라-아세틸 페닐알라닌, p-니트로페닐알라닌, p-설포티로신, p-카복시페닐알라닌, o-니트로페닐알라닌, m-니트로페닐알라닌, p-보로닐페닐알라닌, o-보로닐페닐알라닌, m-보로닐페닐알라닌, p-아미노페닐알라닌, o-아미노페닐알라닌, m-아미노페닐알라닌, p-아실페닐알라닌, o-아실페닐알라닌, m-아실페닐알라닌, p-OMe 페닐알라닌, o-OMe 페닐알라닌, m-OMe 페닐알라닌, p-설포페닐알라닌, o-설포페닐알라닌, m-설포페닐알라닌, 5-니트로 His, 3-니트로 Tyr, 2-니트로 Tyr, 니트로 치환된 Leu, 니트로 치환된 His, 니트로 치환된 De, 니트로 치환된 Trp, 2-니트로 Trp, 4-니트로 Trp, 5-니트로 Trp, 6-니트로 Trp, 7-니트로 Trp, 3-아미노티로신, 2-아미노티로신, O-설포티로신, 2-설포옥시페닐알라닌, 3-설포옥시페닐알라닌, o-카복시페닐알라닌, m-카복시페닐알라닌, p-아세틸-L-페닐알라닌, p-프로파르길-페닐알라닌, O-메틸-L-티로신, L-3-(2-나프틸)알라닌, 3-메틸-페닐알라닌, O-4-알릴-L-티로신, 4-프로필-L-티로신, 트리-O-아세틸-GlcNAcβ-세린, L-Dopa, 불소첨가된 페닐알라닌, 이소프로필-L-페닐알라닌, p-아지도-L-페닐알라닌, p-아실-L-페닐알라닌, p-벤조일-L-페닐알라닌, L-포스포세린, 포스포노세린, 포스포노티로신, p-요오도-페닐알라닌, p-브로모페닐알라닌, p-아미노-L-페닐알라닌, 이소프로필-L-페닐알라닌 또는 p-프로파르길옥시-페닐알라닌이다. 본 발명의 일부 실시양태에서, 비천연 아미노산은 O-메틸-L-티로신, L-3-(2-나프틸)알라닌, 3-메틸-페닐알라닌, O-4-알릴-L-티로신, 4-프로필-L-티로신, p-프로파르길옥시-L-페닐알라닌, 트리-O-아세틸-GlcNAcβ-세린, L-Dopa, 불소첨가된 페닐알라닌, 이소프로필-L-페닐알라닌, p-아지도-L-페닐알라닌, p-아실-L-페닐알라닌, p-벤조일-L-페닐알라닌, L-포스포세린, 포스포노세린, 포스포노티로신, p-요오도-페닐알라닌, p-브로모페닐알라닌, p-아미노-L-페닐알라닌 또는 이소프로필-L-페닐알라닌으로부터 선택된다.
다른 실시양태에서, 본 발명은 관심 있는 유전자 또는 관심 있는 선택자 코돈 함유 유전자를 제공한다. 선택자 코돈은 넌센스 코돈, 희귀 코돈 또는 4-염기 코돈이다. 또 다른 실시양태에서, 선택자 코돈은 오커(ochre) 코돈, 오팔(opal) 코돈 또는 앰버(amber) 코돈을 포함한다. 일부 실시양태에서, 선택자 코돈은 앰버 코돈이다.
본 발명의 실시양태에서, 관심 있는 유전자 또는 관심 있는 선택자 코돈 함유 유전자는 백신 또는 항체를 포함하는 생물요법 유전자 또는 생성물이다. 관심 있는 유전자 또는 관심 있는 선택자 코돈 함유 유전자는 항체, scFv, scFv 융합 단백질, Fc 융합 단백질, 인자 VII, 인자 VIII 또는 인자 IV이다. 다른 실시양태에서, 관심 있는 유전자 또는 관심 있는 선택자 코돈 함유 유전자는 사이토카인, 인터류킨, 인터페론, 케모카인, 성장 인자, 호르몬, 및 이들의 수용체, 이들의 유사체, 이중특이적 물질 또는 단편이다. 또 다른 실시양태에서, 관심 있는 유전자는 HER2, CD-70, PSMA, 5T4, EGFR, TROP2, CD3, IL-2, IL-3, IL-10, IL-15, GPC3, DLL3, ROR1, 렙틴(leptin), FGF-21, FGF-23, HGH, FcR, 인슐린, TNFR1, TRAIL, EPO, 및 이들의 유사체, 이중특이적 물질 또는 단편이다. 다른 실시양태에서, 관심 있는 유전자 또는 관심 있는 선택자 코돈 함유 유전자는 사이토카인, 성장 인자, 성장 인자 수용체, 인터페론, 인터류킨, 염증 분자, 발암유전자 생성물, 펩타이드 호르몬, 신호 전달도입 분자, 스테로이드 호르몬 수용체, 에리쓰로포이에틴(EPO), 인슐린, 인간 성장 호르몬, 알파-1 항트립신, 안지오스타틴, 항용혈 인자, 항체, 아포지단백질, 아포단백질, 심방 나트륨이뇨 인자, 심방 나트륨이뇨 폴리펩타이드, 심방 펩타이드, C-X-C 케모카인, T39765, NAP-2, ENA-78, Gro-a, Gro-b, Gro-c, IP-10, GCP-2, NAP-4, SDF-1, PF4, MIG, 칼시토닌, c-kit 리간드, 사이토카인, CC 케모카인, 단핵세포 화학유인 단백질-1, 단핵세포 화학유인 단백질-2, 단핵세포 화학유인 단백질-3, 단핵세포 염증 단백질-1 알파, 단핵세포 염증 단백질-1 베타, RANTES, I309, R83915, R91733, HCC1, T58847, D31065, T64262, CD40, CD40 리간드, C-kit 리간드, 콜라겐, 콜로니 자극 인자(CSF), 보체 인자 5a, 보체 저해제, 보체 수용체 1, 사이토카인, DHFR, 상피 호중구 활성화 펩타이드-78, GROα/MGSA, GROβ, GROγ, MIP-1α, MIP-1δ, MCP-1, 표피 성장 인자(EGF), 상피 호중구 활성화 펩타이드, 에리쓰로포이에틴(EPO), 박리 독소, 인자 IX, 인자 VII, 인자 VIII, 인자 X, 섬유모세포 성장 인자(FGF), 피브리노겐, 피브로넥틴, G-CSF, GM-CSF, 글루코세레브로시다제(Glucocerebrosidase), 고나도트로핀(Gonadotropin), 성장 인자, 성장 인자 수용체, 헤지호그(Hedgehog) 단백질, 헤모글로빈, 간세포 성장 인자(HGF), 히루딘(Hirudin), 인간 혈청 알부민, ICAM-1, ICAM-1 수용체, LFA-1, LFA-1 수용체, 인슐린, 인슐린 유사 성장 인자(IGF), IGF-I, IGF-II, 인터페론, IFN-α, IFN-β, IFN-γ, 인터류킨, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, 각질형성세포 성장 인자(KGF), 락토페린, 백혈병 저해 인자, 루시퍼라제(Luciferase), 뉴르투린(Neurturin), 호중구 저해 인자(NIF), 온코스타틴(oncostatin) M, 골형성 단백질, 발암유전자 생성물, 부갑상선 호르몬, PD-ECSF, PDGF, 펩타이드 호르몬, 인간 성장 호르몬, 플레이오트로핀(Pleiotropin), 단백질 A, 단백질 G, 발열성 외독소 A, B 또는 C, 릴랙신(Relaxin), 레닌(Renin), SCF, 가용성 보체 수용체 I, 가용성 I-CAM 1, 가용성 인터류킨 수용체, 가용성 TNF 수용체, 소마토메딘(Somatomedin), 소마토스타틴(Somatostatin), 소마토트로핀(Somatotropin), 스트렙토키나제(Streptokinase), 수퍼항원, 스타필로코커스 장독소, SEA, SEB, SEC1, SEC2, SEC3, SED, SEE, 스테로이드 호르몬 수용체, 수퍼록사이드 디스뮤타제(Superoxide dismutase)(SOD), 독성 쇼크 증후군 독소, 티모신 알파 1, 조직 플라스미노겐 활성화제, 종양 성장 인자(TGF), TGF-α, TGF-β, 종양 괴사 인자, 종양 괴사 인자 알파, 종양 괴사 인자 베타, 종양 괴사 인자 수용체(TNFR), VLA-4 단백질, VCAM-1 단백질, 혈관 내피 성장 인자(VEGEF), 유로키나제(Urokinase), Mos, Ras, Raf, Met, p53, Tat, Fos, Myc, Jun, Myb, Rel, 에스트로겐 수용체, 프로게스테론 수용체, 테스토스테론 수용체, 알도스테론 수용체, LDL 수용체, SCF/c-Kit, CD40L/CD40, VLA-4/VCAM-1, ICAM-1/LFA-1, 히알루린(hyalurin)/CD44 및 코르티코스테론으로 구성된 군으로부터 선택된다.
다른 실시양태에서, 본 발명은 불활성화, 제거, 파괴 또는 넉아웃을 위해 표적화된 하나 이상의 부위 또는 영역을 제공한다. 불활성화를 위해 표적화된 하나 이상의 부위 또는 영역은 GS, Bcl-2, IGFBP4, AQP1, Maf1, eRF1, FUT8, P53, 캐스파제(Caspase)-3, UPF1, Smg1, Smac/DIABLO, Apaf-1, 캐스파제-6, 캐스파제-7, 캐스파제-9, 캐스파제-10, PARP, 알파 포드린(fodrin), NuMA, AIF, CAD, 푸마(Puma), 녹사(Noxa), 14-3-3, 아벤(Aven), Myc 또는 HtrA2/Omi이다. 한 실시양태에서, 불활성화를 위해 표적화된 부위 또는 영역은 외재성 선택 마커 유전자이다. 또 다른 실시양태에서, 선택 마커 유전자는 제오신(Zeocin), 하이그로마이신(Hygromycin) 또는 푸로마이신(Puromycin)이다. 또 다른 실시양태에서, 불활성화를 위해 표적화된 부위 또는 영역은 Bcl-2 부위 또는 영역이다. 또 다른 실시양태에서, 불활성화를 위해 표적화된 부위 또는 영역은 Bax 또는 Bak이다. 다른 실시양태에서, 불활성화를 위해 표적화된 부위 또는 영역은 완전히 또는 부분적으로 불활성화된다. 부분적으로 불활성화되거나, 파괴되거나, 넉아웃되거나 제거된 부위 또는 영역은 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 불활성화되거나, 파괴되거나, 넉아웃되거나 제거된 부위 또는 영역을 포함할 수 있다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명은 비천연 아미노산을 단백질 내로 도입하기 위한 세포 또는 세포주로서, 오르토고날 아미노아실 tRNA 합성효소(O-RS) 및 오르토고날 억제제 tRNA(O-tRNA)를 포함하는 관심 있는 선택자 코돈 함유 유전자를 발현하고 불활성화를 위해 표적화된 하나 이상의 부위 또는 영역을 포함하는 세포 또는 세포주를 제공한다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명은 오르토고날 아미노아실 tRNA 합성효소(O-RS) 및 오르토고날 억제제 tRNA(O-tRNA)를 포함하는, 비천연 아미노산을 단백질 내로 도입하기 위한 세포 또는 세포주로서, 불활성화를 위해 표적화된 하나 이상의 부위 또는 영역을 포함하는 세포 또는 세포주를 제공한다.
다른 실시양태에서, 본 발명은 오르토고날 아미노아실 tRNA 합성효소(O-RS) 및 오르토고날 억제제 tRNA(O-tRNA)를 포함하는 관심 있는 유전자를 발현하는 세포 또는 세포주로서, 불활성화를 위해 표적화된 하나 이상의 부위 또는 영역을 포함하는 세포 또는 세포주를 제공한다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명은 오르토고날 아미노아실 tRNA 합성효소(O-RS) 및 오르토고날 억제제 tRNA(O-tRNA)를 포함하는 세포에서 아폽토시스를 경감시키거나 감소시키는 방법으로서, 상기 세포에서 불활성화를 위해 하나 이상의 전구아폽토시스 부위 또는 영역을 표적화하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명은 세포 또는 세포주의 아폽토시스를 경감시키거나 감소시키기 위한 세포 또는 세포주를 제공한다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명은 비천연 아미노산을 단백질 내로 도입하기 위한 세포를 생성하는 방법으로서, 관심 있는 선택자 코돈 함유 유전자를 발현하는 세포에서 불활성화를 위한 하나 이상의 부위 또는 영역 표적을 불활성화시킬 수 있는 핵산 분자를 제공하는 단계; 및 오르토고날 아미노아실 tRNA 합성효소(O-RS) 및 오르토고날 억제제 tRNA(O-tRNA)를 포함하는 관심 있는 선택자 코돈 함유 유전자를 발현하는 세포 내로 상기 핵산 분자를 도입하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 다른 실시양태에서, 상기 핵산 분자는 서열번호 1 내지 42로부터 선택된다. 또 다른 실시양태에서, 상기 핵산 분자는 불활성화를 위해 표적화된 하나 이상의 부위 또는 영역을 불활성화시킨다. 하나의 다른 실시양태에서, 불활성화를 위해 표적화된 하나 이상의 부위 또는 영역은 동일하거나 상이하다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명은 비천연 아미노산이 도입된 단백질 또는 폴리펩타이드의 수율을 개선하기 위한 방법, 세포 또는 세포주를 제공한다. 일부 실시양태에서, 세포는 일시적인, 안정한 세포 집단 또는 안정한 클론 세포이다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명은 세포에서 아폽토시스를 경감시키거나 감소시키는 방법을 제공한다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명은 부위 특이적으로 도입된 비천연 아미노산을 가진 단백질 또는 폴리펩타이드의 수율을 개선하는 방법을 제공한다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명은 비천연 아미노산을 포함하는 세포주를 생성하는 방법으로서, 오르토고날 아미노아실 tRNA 합성효소(O-RS) 및 오르토고날 억제제 tRNA(O-tRNA)를 포함하는 관심 있는 선택자 코돈 함유 유전자를 발현하는 세포주를 제공하는 단계; 세포에서 하나 이상의 표적 부위를 불활성화시킬 수 있는 핵산 분자를 세포 내로 도입하는 단계; 및 비천연 아미노산을 세포에게 제공하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.
다른 실시양태에서, 본 발명은 비천연 아미노산을 단백질 내로 도입하기 위한 세포를 생성하는 방법으로서, 세포에서 불활성화를 위한 하나 이상의 부위 또는 영역 표적을 불활성화시킬 수 있는 핵산 분자를 제공하는 단계; 및 상기 핵산 분자를, 오르토고날 아미노아실 tRNA 합성효소(O-RS) 및 오르토고날 억제제 tRNA(O-tRNA)를 포함하는 세포 내로 도입하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명은 청구항들 중 임의의 청구항에 따른 단리된 세포 또는 세포주를 제공한다. 다른 실시양태에서, 본 발명은 안정한 세포 또는 세포주를 수득하는 방법으로서, 상기 세포주가 오르토고날 아미노아실 tRNA 합성효소(O-RS) 및 오르토고날 억제제 tRNA(O-tRNA)를 포함하는 것인 방법을 제공한다. 다른 실시양태에서, 안정한 세포 또는 세포주는 플랫폼 또는 생산 세포 또는 세포주이다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명은 생산 세포주 개발을 최적화하는 방법으로서, 상기 세포주가 오르토고날 아미노아실 tRNA 합성효소(O-RS) 및 오르토고날 억제제 tRNA(O-tRNA)를 포함하는 것인 방법을 제공한다. 하나의 다른 실시양태에서, 본 발명은 비천연 아미노산을 포함하는 단리된 폴리펩타이드를 제공한다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명은 비천연 아미노산 함유 단백질의 수율이 세포에서 불활성화를 위해 표적화된 하나 이상의 부위 또는 영역의 불활성화의 부재 하에서의 수율보다 적어도 0.5배 이상 더 큰 것인 세포 또는 세포주를 제공한다.
본 발명의 한 실시양태에서, 하나 이상의 조작된 핵산 분자는 세포주 내로 도입된다. 하나 이상의 조작된 핵산 분자는 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개 또는 10개 이상의 조작된 핵산 분자를 포함할 수 있다. 다른 실시양태에서, 하나 이상의 조작된 핵산 분자는 동일하거나 상이한 표적 부위 또는 영역으로부터 유래한다. 일부 실시양태에서, 조작된 핵산 분자는 세포에서 동일한 표적 부위 또는 영역으로부터의 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개 또는 10개 이상의 조작된 핵산 분자를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 조작된 핵산 분자는 상이한 표적 부위 또는 영역으로부터의 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개 또는 10개 이상의 조작된 핵산 분자를 포함할 수 있다.
다른 실시양태에서, 세포에서 불활성화, 제거, 넉아웃 또는 파괴를 위해 표적화된 하나 이상의 부위 또는 영역을 인식하는 폴리뉴클레오타이드는 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개 또는 10개 이상의 부위 또는 영역을 인식하는 폴리뉴클레오타이드를 포함할 수 있다.
다른 실시양태에서, 세포 또는 세포주가 제공된다. 특정 실시양태에서, 안정한 생산 세포주가 제공된다. 다른 실시양태에서, 세포 또는 세포주는 진핵생물 세포 또는 세포주이다. 다른 실시양태에서, 진핵생물 세포 또는 세포주는 예를 들면, 포유동물 세포, 효모 세포, 진균 세포, 식물 세포, 곤충 세포 중 임의의 세포를 포함할 수 있으나 이들로 한정되지 않는다. 일부 실시양태에서, 진핵생물 세포 또는 세포주는 척추동물 세포 또는 세포주이다. 일부 실시양태에서, 진핵생물 세포 또는 세포주는 포유동물 또는 인간 세포 또는 세포주이다. 다른 실시양태에서, 세포 또는 세포주는 COS, CHO(예를 들면, CHO-S, CHO-K1, CHO-DG44, CHO-DUXB11, CHO-DUKX, CHOK1SV), VERO, MDCK, WI38, V79, B14AF28-G3, BHK, HaK, NS0, SP2/0-Ag14, HeLa, 또는 HEK293(예를 들면, HEK293-F, HEK293-H, HEK293-T) 세포 또는 세포주를 포함할 수 있으나 이들로 한정되지 않는다. 다른 실시양태에서, 세포 또는 세포주는 예를 들면, CHO-S, CHO-K1, CHO-DG44, CHO-DUXB11, CHO-DUKX, CHOK1SV를 포함하는 CHO 세포 또는 세포주이다. 다른 실시양태에서, 세포 또는 세포주는 CHO-K1, MDCK 또는 HEK293 세포 또는 세포주이다. 일부 실시양태에서, 세포 또는 세포주는 CHO-K1 세포 또는 세포주이다.
다른 실시양태에서, 비천연 아미노산 함유 폴리펩타이드 또는 단백질의 수율을 최적화하거나, 향상시키거나, 증가시키거나 개선하는 것은 불활성화, 제거, 파괴 또는 넉아웃을 위해 표적화된 하나 이상의 부위 또는 영역을 인식하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 핵산 분자의 부재 하에서의 수율보다 적어도 0.5배, 적어도 1배, 적어도 2배, 적어도 3배, 적어도 4배, 적어도 5배, 적어도 6배, 적어도 7배, 적어도 8배, 적어도 9배 또는 적어도 10배 이상 더 크게 수율을 최적화하거나, 향상시키거나, 증가시키거나 개선하는 것을 포함할 수 있다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명은 본원에 개시된 방법들 및 세포들 중 임의의 방법 및 세포를 사용함으로써 제조된 백신을 제공한다.
본 발명의 신규 특징은 첨부된 청구범위에 구체적으로 기재되어 있다. 본 발명의 개시의 특징 및 장점은 본 발명의 원리를 이용하는 예시적 실시양태가 기재된 하기 상세한 설명, 및 제공된 첨부된 도면을 참조함으로써 더 잘 이해될 것이다.
도 1의 패널 A 및 B: 비천연 아미노산 함유 단백질을 생성하기 위해 산업 및 제약회사에서 플랫폼 세포주를 사용하는 전략. 도 1은 산업(도 1의 A) 및 제약회사(도 1의 B)에서 플랫폼 세포주 사용의 중요한 역할을 보여준다.
도 2: 고생산 세포주의 개발에 있어서 플랫폼 세포주를 사용하는 일반적인 절차.
도 3의 패널 A 내지 C: 고생산 세포주 개발의 최적화를 위한 전략. 도 3은 FACS 의존적 단일 세포 침착과 같은 여러 양태들로부터의 고생산 세포주 개발의 최적화(도 3의 A), CRISPR 넉아웃(도 3의 B) 및 세포주 개발 공정 최적화(도 3의 C)를 보여준다.
도 4의 패널 A 및 B: 플랫폼 세포주 4E2로부터의 세포에서의 아폽토시스의 관찰. 아넥신(annexin) V 어세이를 이용하여, 파라-아세틸-L-페닐알라닌을 특이적으로 도입하는 유전적으로 도입된 오르토고날 쌍 tRNA/아미노아실-tRNA 합성효소를 함유하는 CHO-S 세포(도 4의 A) 및 플랫폼 세포주 4E2(도 4의 B)의 생존율을 평가하였다. 도 4에 나타낸 바와 같이, CHO-S 세포(생존율은 96%임)에 비해, 4E2는 과도한 아폽토시스를 나타내었다(생존율은 85%임).
도 5: CHO 세포 내의 표적화된 BAX 유전자의 CRISPR gRNA 디자인. 도 5는 CHO 세포 내의 BAX 유전자의 게놈 DNA 서열을 보여주고, 이때 3개의 gRNA 서열들은 주석이 달려 있다. BAX 유전자의 게놈 DNA 서열, 엑손 1 및 엑손 2는 회색 음영으로 표시되어 있다. BAX의 다른 서열은 평범한 글자체로 표시되어 있다. PCR 및 시퀀싱에서 사용된 프라이머는 각각 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머로서 서열의 시작 및 말단에 표시되어 있다.
도 6: CHO 세포 내의 표적화된 BAK 유전자의 CRISPR gRNA 디자인. 도 6은 CHO 세포 내의 BAK 유전자의 게놈 DNA 서열을 보여주고, 이때 2개의 gRNA 서열들은 주석이 달려 있다. BAK 유전자의 게놈 DNA 서열, 엑손 2 및 엑손 3은 회색 음영으로 표시되어 있다. BAK의 다른 서열은 평범한 글자체로 표시되어 있다. PCR 및 시퀀싱에서 사용된 프라이머는 각각 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머로서 서열의 시작 및 말단에 표시되어 있다.
도 7: BAX 또는 BAK CRISPR 구축물. 도 7은 BAX 또는 BAK 넉아웃 실험에서 사용된 CRISPR 플라스미드의 디자인을 보여준다. 진아트(Geneart) CRISPR 뉴클레아제(nuclease) 벡터(pGCNV)는 써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher scientific)(캘리포니아주 샌디에고 소재)으로부터 상업적으로 입수될 수 있는 벡터이다. pGCNV 플라스미드의 완전한 형태는 유전자 부위를 개별적으로 표적화하기 위해 특이적 19-뉴클레오타이드 길이 gRNA 서열을 갖도록 디자인된 올리고 이중체를 위한 틈(slot)을 함유하는 절단 개방된 pGCNV 벡터 내로 올리고 이중체를 삽입함으로써 제조된다(본원의 다른 곳에 있는 표 1 참조).
도 8은 본 발명의 대표적인 비천연 아미노산의 구조를 보여준다.
도 9: BAX 또는 BAK가 CRISPR의 이용을 통해 넉아웃된 항-HER2 발현 세포 집단의 서베이어(Surveyor) 어세이. 도 9는 CRISPR을 이용한 BAX 또는 BAK 넉아웃 동안 넉아웃 효율의 서베이어 어세이 분석을 보여준다. 위쪽 밴드의 감소 및 아래쪽 신규 밴드의 출현은 이미지(Image) J 소프트웨어에 의한 스캐닝된 영상의 밀도측정 분석에 의해 정량될 수 있는 효율을 표시한다. CRISPR 넉아웃(KO) 전 및 후 원래의 밴드의 비를 사용하여 넉아웃 효율을 측정하였다. BAX 및 BAK에 대한 넉아웃 효율은 각각 30% 및 70%이므로, 계산된 이중 넉아웃 효율은 대략 21%이었다.
도 10: CRISPR을 이용함으로써 넉아웃된 BAX 및 BAK 유전자를 가진 항-HER2 발현 단일 세포 클론의 DNA 분석. 도 10은 CRISPR을 이용한 BAK 넉아웃 후 20개의 단일 세포 클론들의 DNA 시퀀싱 결과를 보여준다. 위쪽 DNA 서열(Bak-CHO-gDNA1)은 원래의 BAK 유전자의 게놈 영역의 DNA 서열이다. 'ZA_112_K32_BakI-II' 클론만이 원래의 BAK 유전자와 동일한 서열을 가진다. 도면에 표시된 다른 유전자들은 그들의 서열에서 결실 또는 삽입을 가진다.
도 11: CRISPR을 이용한 항-HER2 발현 BAX 넉아웃 클론에서의 BAX 넉아웃 확인의 웨스턴 블롯 분석. BAX는 유전자 넉아웃을 갖지 않고 야생형 BAX 단백질을 발현하는 L082 세포에서 밴드로서 표시되어 있는 21 KD 단백질이다. 잔류 BAX 발현을 보이는 클론 UBB3을 제외한 다른 클론들은 BAX 단백질의 검출가능한 발현을 보이지 않았다.
도 12의 패널 A 및 B: 항-HER2 발현 BAX/BAK 넉아웃 세포주의 아폽토시스 분석. 도 12는 모세포주 L082(도 12의 A) 및 BAX/BAK 이중 넉아웃 세포주 BB15(도 12의 B)의 아넥신 V 아폽토시스 분석을 보여준다. 표에 표시된 바와 같이, BAX 및 BAK 넉아웃 후 세포 생존율은 40%에서 80%까지 개선된다. 동시에, 아폽토시스 세포는 53%에서 17%까지 감소한다.
도 13의 패널 A 내지 D: 회분식(batch) 배양에서 BAX/BAK 넉아웃 세포주 내에서의 항-HER2 항체 생성의 촉진. 도 13은 BAX/BAK 이중 넉아웃 세포주에서의 단백질 생성 변화를 보여준다. 회분식 생산 동안 단백질 생성을 분석한다. 생존 세포 밀도(VCD, 도 13의 A). 세포 생존율(도 13의 B). 회분식 생산(7일) 동안, BAX/BAK 이중 넉아웃 세포주는 150 mg/ℓ에서 270 mg/ℓ까지 역가 증가를 보였다(도 13의 C). 비생산성(Qp)(도 13의 D).
도 14의 패널 A 내지 D. 유가식(fed-batch) 배양에서 BAX/BAK 넉아웃 세포주 내에서의 항-HER2 항체 생성의 촉진. 도 14는 BAX/BAK 이중 넉아웃 세포주에서의 단백질 생성 변화를 보여준다. 유가식 생산 동안 단백질 생성을 분석한다. 생존 세포 밀도(VCD, 도 14의 A). 세포 생존율(도 14의 B). 회분식 생산(14일) 동안, BAX/BAK 이중 넉아웃 세포주는 450 mg/ℓ에서 1500 mg/ℓ까지 역가 증가를 보인다(도 14의 C). 비생산성(Qp)(도 14의 D).
도 15: BAX 또는 BAK가 CRISPR의 이용을 통해 넉아웃된 항-PSMA 발현 세포 집단의 서베이어 어세이. 도 15는 CRISPR을 이용한 BAX 또는 BAK 넉아웃 동안 넉아웃 효율의 서베이어 어세이 분석을 보여준다. CRISPR 넉아웃(KO) 전 및 후 원래의 밴드의 비는 이미지 J 소프트웨어에 의한 스캐닝된 영상의 밀도측정 분석에 의해 정량되었고 넉아웃 효율을 측정하는 데 사용되었다. BAX 및 BAK에 대한 넉아웃 효율은 각각 42% 및 53%이므로, 계산된 이중 넉아웃 효율은 대략 20%이었다.
도 16의 패널 A 및 B: 항-PSMA 발현 클론에서의 BAX 및 BAK 넉아웃 확인의 웨스턴 블롯 분석. CRISPR을 이용하여 항-PSMA 발현 클론에서의 BAX 넉아웃 확인(도 16의 A). 항-PSMA 발현 클론에서의 BAK 넉아웃 확인(도 16의 B). 대조군은 21 KD의 밴드인 야생형 BAX 단백질을 발현하는 L082 세포, 및 항-HER2 발현 BB15 세포 - BAX/BAK 이중 넉아웃이다.
도 17: BAX/BAK 넉아웃 항-PSMA 발현 세포주의 아폽토시스 분석. 도 17은 단일 KO 클론(PSMA-882) 및 비-넉아웃 클론(PSMA-484)에서의 대략 35% 내지 37%에 비해 약 85%의 세포 생존율을 가진 BAX/BAK 이중 넉아웃 세포주 PSMA-192 및 PSMA 719의 아넥신 V 아폽토시스 분석을 보여준다.
도 18의 패널 A 내지 C: 유가식 배양에서 BAX/BAK 넉아웃 세포주 내에서의 항-PSMA 항체 생성의 촉진. 도 18은 BAX/BAK 이중 넉아웃 세포주(예를 들면, 세포주 PSMA-BBKO-192가 표시되어 있음)에서의 단백질 생성 변화를 보여준다. 유가식 생산 동안 단백질 생성을 분석한다. 생존 세포 밀도(VCD, 도 18의 A). 세포 생존율(도 18의 B). 유가식 생산 동안(14일), BAX/BAK 이중 넉아웃 세포주는 500 mg/ℓ에서 1400 mg/ℓ까지 역가 증가를 보였다(도 18의 C).
도 19: BAX 또는 BAK가 CRISPR의 이용을 통해 넉아웃된 항-CD70 발현 세포 집단의 서베이어 어세이. 도 19는 CRISPR을 이용한 BAX 또는 BAK 넉아웃 동안 넉아웃 효율의 서베이어 어세이 분석을 보여준다. CRISPR 넉아웃(KO) 전 및 후 원래의 밴드의 비는 이미지 J 소프트웨어에 의한 스캐닝된 영상의 밀도측정 분석에 의해 정량되었고 넉아웃 효율을 측정하는 데 사용되었다. BAX 및 BAK에 대한 넉아웃 효율은 각각 51% 및 23%이므로, 계산된 이중 넉아웃 효율은 대략 10%이었다.
도 20의 패널 A 및 B: 항-CD70 발현 클론에서의 BAX 및 BAK 넉아웃 확인의 웨스턴 블롯 분석. 항-CD70 발현 클론에서의 BAX 넉아웃 확인(도 20의 A). 항-CD70 발현 클론에서의 BAK 넉아웃 확인(도 20의 B). 21 KD의 밴드인 야생형 BAX 단백질, 및 24 KD의 밴드인 BAK 야생형 단백질을 발현하는 대조군 L082 세포.
도 21: BAX/BAK 넉아웃 항-CD70 발현 세포주의 아폽토시스 분석. 도 21은 18%의 세포 생존율을 가진 모세포주 CD70-MW-108에 비해, 예를 들면, 60%의 세포 생존율을 가진 BAX/BAK 이중 넉아웃 세포주 CD70-BBKO-563의 아넥신 V 아폽토시스 분석을 보여준다. 아폽토시스 세포는 80%에서 40%까지 감소하였다.
도 22의 패널 A 내지 C: 유가식 배양에서 BAX/BAK 넉아웃 세포주 내에서의 항-CD70 항체 생성의 촉진. 도 22는 진탕 플라스크 및 벤치 탑(bench top) 생물반응기에서의 BAX/BAK 이중 넉아웃 항-CD70 발현 세포주의 생성 프로파일을 보여준다. 생존 세포 밀도(VCD, 도 22의 A). 세포 생존율(도 22의 B). 일례로서, BAX/BAK 이중 넉아웃 세포주인 CD70-BBKO-563은 1000 mg/ℓ의 높은 역가를 보였다(도 22의 C).
본 발명을 상세히 기술하기 전에, 본 발명이 당연히 변경될 수 있는 특정 방법, 또는 조성물, 또는 생물학적 시스템으로 한정되지 않는다는 것을 이해해야 한다. 본원에서 사용된 용어가 특정 실시양태만을 기술하기 위한 것이고 한정하기 위한 것이 아니라는 것도 이해해야 한다. 본 명세서 및 첨부된 청구범위에서 사용된 바와 같이, 문맥이 달리 명시하지 않은 한, 단수형 용어는 복수 지시대상을 포함한다. 따라서, 예를 들면, "세포"의 언급은 2개 이상의 세포들의 조합 등을 포함한다.
본 발명의 바람직한 실시양태가 본원에 제시되고 기재되어 있지만, 이러한 실시양태는 예로써만 제공된다는 것이 당분야에서 숙련된 자에게 자명할 것이다. 본 발명을 벗어나지 않으면서 다수의 변이, 변화 및 치환이 당분야에서 숙련된 자에게 인식될 것이다. 본원에 기재된 본 발명의 실시양태의 다양한 대안들이 본 발명을 실시하는 데 사용될 수 있다는 것을 이해해야 한다. 하기 청구범위는 본 발명의 범위를 정의하고 이 청구범위 및 이의 균등물의 범위 내의 방법 및 구조는 이 청구범위에 의해 커버된다.
여기서 또는 하기 본 명세서의 나머지 부분에서 달리 정의되어 있지 않은 한, 본원에서 사용된 모든 기술 용어들 및 과학 용어들은 본 발명이 속하는 분야에서 통상의 기술을 가진 자에 의해 통상적으로 이해되는 의미와 동일한 의미를 가진다.
정의
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "핵산"은 단일 또는 이중 가닥 형태의 데옥시리보뉴클레오타이드, 데옥시리보뉴클레오사이드, 리보뉴클레오사이드 또는 리보뉴클레오타이드 및 이들의 중합체를 지칭한다. 예를 들면, 이러한 핵산 및 핵산 중합체는 (i) 기준 핵산과 유사한 결합 성질을 갖고 천연 생성 뉴클레오타이드와 유사한 방식으로 대사되는 천연 뉴클레오타이드의 유사체; (ii) 안티센스 기술에서 사용되는 DNA의 유사체인 PNA(펩티도핵산)(포스포로티오에이트, 포스포로아미데이트 등)를 포함하나 이들로 한정되지 않는 올리고뉴클레오타이드 유사체; (iii) 이들의 보존적으로 변형된 변이체(축퇴 코돈 치환을 포함하나 이것으로 한정되지 않음), 및 명확히 표시된 상보적 서열들 및 서열을 포함하나 이들로 한정되지 않는다. 예를 들면, 축퇴 코돈 치환은 하나 이상의 선택된(또는 모든) 코돈의 제3 위치가 혼합된 염기 및/또는 데옥시이노신 잔기로 치환되어 있는 서열을 생성함으로써 달성될 수 있다(Batzer et al., Nucleic Acid Res. 19:5081 (1991); Ohtsuka et al., J. Biol. Chem. 260:2605-2608 (1985); and Rossolini et al., Mol. Cell. Probes 8:91-98 (1994)).
용어 "폴리펩타이드", "펩타이드" 및 "단백질"은 아미노산 잔기의 중합체를 지칭하기 위해 본원에서 상호교환가능하게 사용된다. 즉, 폴리펩타이드에 대한 설명은 펩타이드의 설명 및 단백질의 설명에 동등하게 적용되고, 그 반대의 경우도 가능하다. 상기 용어들은 천연 생성 아미노산 중합체뿐만 아니라, 하나 이상의 아미노산 잔기가 비천연 아미노산인 아미노산 중합체에도 적용된다. 추가로, 이러한 "폴리펩타이드", "펩타이드" 및 "단백질"은 전체 길이 단백질을 포함하는 임의의 길이의 아미노산 쇄를 포함하고, 이때 아미노산 잔기는 공유 펩타이드 결합에 의해 결합된다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "오르토고날"은 세포 또는 번역 시스템에 대한 내생성을 가진 상응하는 분자에 비해 감소된 효율로 세포의 내생성 성분과 함께 작용하거나, 세포의 내생성 성분과 함께 작용하지 못하는 분자(예를 들면, 오르토고날 tRNA(O-tRNA) 및/또는 오르토고날 아미노아실 tRNA 합성효소(O-RS))를 지칭한다. tRNA 및 아미노아실-tRNA 합성효소와 관련하여, 오르토고날은 내생성 tRNA 합성효소와 함께 작용하는 내생성 tRNA에 비해 내생성 tRNA 합성효소와 함께 작용하는 오르토고날 tRNA, 또는 내생성 tRNA와 함께 작용하는 내생성 tRNA 합성효소에 비해 내생성 tRNA와 함께 작용하는 오르토고날 아미노아실-tRNA 합성효소의 무능력 또는 감소된 효율, 예를 들면, 20% 미만의 효율, 10% 미만의 효율, 5% 미만의 효율 또는 1% 미만의 효율을 지칭한다. 오르토고날 분자는 세포에서 기능적 내생성 상보적 분자를 결여한다. 예를 들면, 세포 내의 오르토고날 tRNA는 내생성 RS에 의한 내생성 tRNA의 아미노아실화와 비교될 때 감소된 또는 심지어 제로 효율로 세포의 임의의 내생성 RS에 의해 아미노아실화된다. 또 다른 예에서, 오르토고날 RS는 내생성 RS에 의한 내생성 tRNA의 아미노아실화와 비교될 때 감소된 또는 심지어 제로 효율로 관심 있는 세포 내의 임의의 내생성 tRNA를 아미노아실화한다. 제2 오르토고날 분자는 제1 오르토고날 분자와 함께 작용하는 세포 내로 도입될 수 있다. 예를 들면, 오르토고날 tRNA/RS 쌍은 상응하는 tRNA/RS 내생성 쌍의 효율에 비해 일정 효율(예를 들면, 50% 효율, 60% 효율, 70% 효율, 75% 효율, 80% 효율, 90% 효율, 95% 효율, 또는 99% 이상의 효율)로 세포에서 함께 작용하는 도입된 상보적 성분들을 포함한다.
용어 "선택자 코돈"은 번역 과정에서 O-tRNA에 의해 인식되고 내생성 tRNA에 의해 인식되지 않는 코돈을 지칭한다. O-tRNA 안티코돈 루프는 mRNA에서 선택자 코돈을 인식하고 폴리펩타이드 내의 이 부위에서 그의 아미노산, 예를 들면, 비천연 아미노산을 도입한다. 선택자 코돈은 넌센스 코돈, 예컨대, 정지 코돈, 예를 들면, 앰버 코돈, 오커 코돈 및 오팔 코돈; 4개 이상의 염기 코돈; 희귀 코돈; 천연 또는 비천연 염기쌍으로부터 유도된 코돈 등을 포함할 수 있다.
용어 "억제제 tRNA"는 예를 들면, 선택자 코돈에 반응하여 아미노산을 폴리펩타이드 쇄 내로 도입하는 기작을 제공함으로써 소정의 번역 시스템에서 메신저 RNA(mRNA)의 판독을 변경시키는 tRNA이다. 예를 들면, 억제제 tRNA는 예를 들면, 정지 코돈, 4-염기 코돈, 희귀 코돈 등을 통해 판독될 수 있다.
용어 "번역 시스템"은 천연 생성 아미노산을 성장하는 폴리펩타이드 쇄(단백질) 내로 도입하는 성분들의 집합적 세트를 지칭한다. 번역 시스템의 성분은 예를 들면, 리보좀, tRNA, 합성효소, mRNA, 아미노산 등을 포함할 수 있다. 본 발명의 성분(예를 들면, ORS, OtRNA, 비천연 아미노산 등)은 시험관내 또는 생체내 번역 시스템, 예를 들면, 진핵생물 세포, 척추동물 세포, 예를 들면, 효모 세포, 포유동물 세포, 식물 세포, 조류 세포, 진균 세포, 곤충 세포 등에 첨가될 수 있다.
용어 "아미노산"은 천연 생성 아미노산 및 비천연 아미노산뿐만 아니라, 천연 생성 아미노산과 유사한 방식으로 작용하는 아미노산 유사체 및 아미노산 모방물질도 지칭한다. 천연 코딩된 아미노산은 20종의 일반 아미노산들(알라닌, 아르기닌, 아스파라긴, 아스파르트산, 시스테인, 글루타민, 글루탐산, 글리신, 히스티딘, 이소류신, 류신, 라이신, 메티오닌, 페닐알라닌, 프롤린, 세린, 쓰레오닌, 트립토판, 티로신 및 발린) 및 피롤라이신 및 셀레노시스테인이다. 아미노산 유사체는 천연 생성 아미노산과 동일한 기본 화학 구조, 예를 들면, 수소, 카복실 기, 아미노 기 및 R 기에 결합된 α-탄소를 가진 화합물을 지칭한다. 이러한 유사체는 천연 생성 아미노산과 동일한 기본 화학 구조를 여전히 보유하면서 변형된 R 기(예를 들면, 노르류신)를 가질 수 있거나 변형된 펩타이드 골격을 가질 수 있다. 아미노산 유사체의 비한정적 예는 호모세린, 노르류신, 메티오닌, 설폭사이드, 메티오닌 메틸 설포늄을 포함한다.
아미노산 서열의 경우, 코딩된 서열에서 단일 천연 아미노산 및 비천연 아미노산 또는 작은 퍼센트의 천연 아미노산 및 비천연 아미노산을 변경시키거나, 추가하거나 결실시키는 핵산, 펩타이드, 폴리펩타이드 또는 단백질 서열의 개별 치환, 결실 또는 추가는, 변경이 아미노산의 결실, 아미노산의 추가, 또는 화학적으로 유사한 아미노산에 의한 천연 아미노산 및 비천연 아미노산의 치환을 야기하는 경우 "보존적으로 변형된 변이체"이다. 기능적으로 유사한 천연 아미노산을 제공하는 보존적 치환 표는 당분야에서 잘 공지되어 있다. 이러한 보존적으로 변형된 변이체는 본원에 기재된 방법 및 조성물의 다형성 변이체, 종간 상동체 및 대립유전자에 추가되고 이들을 배제하지 않는다.
기능적으로 유사한 아미노산을 제공하는 보존적 치환 표는 당분야에서 통상의 기술을 가진 자에게 공지되어 있다. 하기 8개의 군들은 서로에 대한 보존적 치환인 아미노산을 각각 함유한다: 1) 알라닌(A), 글리신(G); 2) 아스파르트산(D), 글루탐산(E); 3) 아스파라긴(N), 글루타민(Q); 4) 아르기닌(R), 라이신(K); 5) 이소류신(I), 류신(L), 메티오닌(M), 발린(V); 6) 페닐알라닌(F), 티로신(Y), 트립토판(W); 7) 세린(S), 쓰레오닌(T); 및 8) 시스테인(C), 메티오닌(M)(예를 들면, 문헌(Creighton, Proteins: Structures and Molecular Properties (W H Freeman & Co.; 2nd edition (December 1993)) 참조).
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "비천연 아미노산"은 20종의 일반 아미노산들 중 하나, 또는 피롤라이신 또는 셀레노시스테인이 아닌 아미노산을 지칭한다. 용어 "비천연 아미노산"과 동의어로 사용될 수 있는 다른 용어들은 "비천연 코딩된 아미노산", "비천연 아미노산", "비천연 생성 아미노산", 및 이들의 다양하게 하이픈으로 연결된 버전 및 하이픈으로 연결되지 않은 버전이다. 용어 "비천연 아미노산"은 천연 코딩된 아미노산(20종의 일반 아미노산들, 또는 피롤라이신 또는 셀레노시스테인을 포함하나 이들로 한정되지 않음)의 변형에 의해 천연적으로 생성되되, 번역 복합체에 의해 성장하는 폴리펩타이드 쇄 내로 스스로 도입되지 않는 아미노산들을 포함하나 이들로 한정되지 않는다. 천연적으로 코딩되지 않는 천연 생성 아미노산의 예는 N-아세틸글루코사미닐-L-세린, N-아세틸글루코사미닐-L-쓰레오닌 및 O-포스포티로신을 포함하나 이들로 한정되지 않는다. 추가로, 용어 "비천연 아미노산"은 천연적으로 생성되지 않고 합성적으로 수득될 수 있거나 비천연 아미노산의 변형에 의해 수득될 수 있는 아미노산들을 포함하나 이들로 한정되지 않는다. 비천연 아미노산의 반응성 기들은 20종의 정규 아미노산들에 존재하는 작용기로부터 이용될 수 없다는 것이 인지된다. 따라서, 이 반응기들은 특이적으로 및 균질하게 폴리펩타이드 부위를 변형시키는 데 사용될 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "항체"는 피분석물(예컨대, 항원)에 특이적으로 결합하고 인식하는, 면역글로불린 유전자 또는 면역글로불린 유전자들, 또는 이들의 단편에 의해 실질적으로 코딩된 폴리펩타이드를 포함하나 이것으로 한정되지 않는다. 예는 다중클론 항체, 단일클론 항체, 키메라 항체 및 단일 쇄 항체 등을 포함한다. Fab 단편, 및 파지 디스플레이를 포함하는 발현 라이브러리에 의해 생성된 단편을 포함하는 면역글로불린의 단편도 본원에서 사용된 용어 "항체"에 포함된다. 예를 들면, 항체 구조 및 용어에 대해서는 문헌(Paul, Fundamental Immunology, 4th Ed., 1999, Raven Press, New York)을 참조한다. 항체 단편은 전체 길이 형태 이외의 임의의 형태의 항체를 지칭한다. 본원에서 항체 단편은 전체 길이 항체 내에 존재하는 보다 더 작은 성분인 항체, 및 조작된 항체를 포함한다. 항체 단편은 Fv, Fc, Fab 및 (Fab')2, 단일 쇄 Fv(scFv), 디아바디, 트리아바디, 테트라바디, 이기능적 하이브리드 항체, CDR1, CDR2, CDR3, CDR들의 조합, 가변 영역, 프레임워크 영역, 불변 영역, 중쇄, 경쇄 및 가변 영역, 및 대안적 스카폴드 비-항체 분자, 이중특이적 항체 등을 포함하나 이들로 한정되지 않는다(Maynard & Georgiou, 2000, Annu. Rev. Biomed. Eng. 2:339-76; Hudson, 1998, Curr. Opin. Biotechnol. 9:395-402). 또 다른 기능적 하위구조는 펩타이드 링커에 의해 공유결합된 면역글로불린 중쇄 및 경쇄의 가변 영역들로 구성된 단일 쇄 Fv(scFv)이다(S-z Hu et al., 1996, Cancer Research, 56, 3055-3061). 이 작은(Mr 25,000) 단백질은 일반적으로 단일 폴리펩타이드 내의 항원에 대한 특이성 및 친화성을 보유하고 보다 더 큰 항원 특이적 분자를 위한 편리한 구축 블록을 제공할 수 있다. 달리 구체적으로 언급되어 있지 않은 한, 용어 "항체" 또는 "항체들"을 사용하는 문장 및 청구항은 구체적으로 "항체 단편" 및 "항체 단편들"을 포함한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "단리된"은 균질한 또는 불균질한 세포 집단으로부터 세포 또는 클론을 분리하고 제거하는 것을 의미한다. 본 발명의 실시양태에서, 용어 "단리된"은 세포 배양물 또는 세포의 집단으로부터 수득된 단리된 또는 단일 세포를 포함한다. 세포 또는 클론은 관심 있는 원하는 세포 또는 클론에게 일부 선택적 장점을 제공하는 배지에서 배양함으로써 다른 세포 집단 또는 클론 집단에 비해 선택될 수 있다. 예를 들면, 관용적인 세포 배양에 있어서, 특정 성장 인자 및 사이토카인을 첨가함으로써 특정 종류의 세포를 농축할 수 있다. 이것은 당분야에서 숙련된 자에게 잘 공지되어 있는 바와 같이 원하는 세포 또는 클론을 달성하기 위한 특정 계통 및 분화 단계의 집단의 농축, 항생제 또는 특정 성장 저해제를 통해 특정 세포가 성장할 수 있게 하고 다른 세포들의 성장을 저해하는 선택 배지의 사용, 또는 이러한 선택 전략들의 조합을 포함할 수 있다. 예를 들면, 선택 배지는 형질감염된 세포를 단리하는 데 종종 사용된다. 포유동물 세포 선택을 위해 사용되는 통상의 항생제는 블레오마이신, 푸로마이신 및 하이그로마이신을 포함하나 이들로 한정되지 않는다. 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "단리된"은 관심 있는 성분을 관심 없는 성분으로부터 분리하고 제거하는 것도 의미한다. 단리된 물질은 건조된 또는 반건조된 상태로 존재할 수 있거나, 수용액을 포함하나 이것으로 한정되지 않는 용액으로 존재할 수 있다. 단리된 성분은 균질한 상태로 존재할 수 있거나, 단리된 성분은 추가 약학적으로 허용가능한 담체 및/또는 부형제를 포함하는 약학 조성물의 부분일 수 있다. 폴리아크릴아미드 겔 전기영동 또는 고성능 액체 크로마토그래피를 포함하나 이들로 한정되지 않는 분석 화학 기법을 이용하여 순도 및 균질도를 측정할 수 있다. 추가로, 관심 있는 성분이 단리되고 제제에 존재하는 우세한 종일 때, 상기 성분은 본원에서 실질적으로 정제된 것으로서 기재된다. 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "정제된"은 적어도 85%의 순도, 적어도 90%의 순도, 적어도 95%의 순도, 적어도 99% 이상의 순도를 가진 관심 있는 성분을 지칭할 수 있다. 예를 들면, 핵산, 폴리펩타이드 또는 단백질은 이러한 핵산, 폴리펩타이드 또는 단백질이 천연 상태에서 회합되어 있는 세포 성분들 중 적어도 일부를 갖지 않을 때, 또는 상기 핵산, 폴리펩타이드 또는 단백질이 그의 생체내 또는 시험관내 생성의 농도보다 더 큰 수준까지 농축되어 있을 때 "단리되어" 있다. 또한, 예를 들면, 유전자는 이 유전자를 플랭킹하고 관심 있는 유전자 이외의 폴리펩타이드 또는 단백질을 코딩하는 개방 판독 프레임으로부터 분리되어 있을 때 단리되어 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "진핵생물"은 동물(포유동물, 곤충, 파충류, 조류 등을 포함하나 이들로 한정되지 않음), 섬모충류, 식물(단자엽, 쌍자엽 및 조류를 포함하나 이들로 한정되지 않음), 진균, 효모, 편모충류, 미포자충류 및 원생생물을 포함하나 이들로 한정되지 않는 계통발생 도메인 진핵생물계에 속하는 유기체를 지칭한다. 용어 "척추동물" 및 "진핵생물"은 본원에서 상호교환가능하게 사용될 수 있다.
본 발명의 실시양태는 배지 배양물에서 제공된 비천연 아미노산을 CHO 세포 내의 단백질 내로 효율적으로 도입하기 위한 오르토고날 억제제 tRNA/아미노아실-tRNA 합성효소 쌍을 안정하게 발현하도록 CHOK1로부터 생성된 플랫폼 세포주를 제공한다(예를 들면, 문헌(Tian F, et al., 2014) 참조). 생산 세포주는 GS(글루타민 합성효소) 발현 시스템 내에 관심 있는 유전자를 함유하는 앰버 넌센스 코돈을 플랫폼 세포주 숙주 내로 형질감염시킴으로써 비천연 아미노산이 도입된 단백질을 생성하도록 생성될 수 있다. GS 발현 시스템은 제조 세포주를 생성하기 위한 안정한 세포주 개발 동안 숙주 세포의 게놈 내로의 연결된 생성물 유전자의 안정한 통합의 선택을 위한 선택 마커 유전자로서 글루타민 합성효소를 사용한다. 플랫폼 세포주는 잘 특징규명되었고 개선된 비천연 아미노산 도입 효율 및 클론 선택 효율을 갖도록 개발되었다. 플랫폼 세포주는 생물반응기 내로의 신속한 진행을 위해 현탁 성장에 미리 맞추어졌다.
산업 관점에서 볼 때, 플랫폼 세포주는 단계 적절한 물질을 제공하여 약물 개발의 모든 단계를 뒷받침하는 데 사용될 수 있을 뿐만 아니라, 병원에의 생성물의 소개 및 상업화 전에 안정한 잘 특징규명된 생산 세포주(들)를 생성하는 데에도 사용될 수 있다. 따라서, 제약회사에서, 세포주 및 세포 배양 연구진은 교차기능 활동에 밀접히 관여한다. 예를 들면, 발견 팀은 표적을 확인하고 후보 분자를 생성한다. 후보 분자의 발현을 평가하고 개발 연구(정제, 접합 및 분석 방법 개발) 및 기능 어세이를 위한 물질을 제공하여 선도 분자를 확인하기 위해 플랫폼 세포주 숙주에서의 일시적 형질감염 및 안정한 풀 생성을 수행한다. 일단 선도 분자가 선택되면, 바람직한 품질 속성을 가진 고수율 생성물을 생성하기 위해 안정한 세포주를 생성한다. 상위 클론 선택은 산업 표준 제조까지 규모 확장될 수 있는 안정한 잘 특징규명된 생산 세포주를 확인하여 임상 시험 및 상업화를 뒷받침하기 위해 세포주, 공정 개발 및 분석 기능을 수반한다. 세포 배양 공정 개발은 세포주 생성 및 선택으로 시작하고, 고처리율 스크리닝 목적을 위해 96-웰 플레이트, 진탕 플라스크 및 벤치 규모 생물반응기를 포함하는 소규모 시스템에서의 공정 및 배지 최적화가 뒤따른다. 일단 조건이 규정되면, 규모 확장성을 시험하고 임상전 독성학 연구를 위한 물질을 생성하기 위해 상기 공정을 종종 파일럿 규모로 전달한 후, 현행 우수 제조관리 기준(cGMP) 규정 하에서 임상 물질을 생성하기 위해 대규모 제조로 전달한다. 일단 생물학적 생성물의 생성을 위한 상업적 세포 배양 공정의 개발이 연구실 규모 및 파일럿 규모에서 완료되면, 상업화 공정은 공정 특징규명, 규모 확장, 기술 전달 및 제조 공정의 검증으로 시작한다. 세포주 개발, 세포 배양 공정 개발 및 제조를 위한 대다수의 이러한 방법들, 또는 이러한 대안들은 당분야에서 잘 공지되어 있다. 예를 들면, 문헌(Weishou Hu, et al., Cell Culture Process Engineering (2013))을 참조한다.
본 발명에서, 모세포로서 플랫폼 세포주를 사용하여 3개월 내지 4개월 이내에 5 내지 10 PCD로, 그리고 6개월 이내에 20 내지 30 PCD로 생산 세포주를 수득하기 위해 안정한 세포주 개발 전략을 실시하였다. 본원의 실시예도 참조한다. 생산 세포주는 최대 12,000 ℓ 생물반응기 제조 규모를 제공하는 적어도 8주 동안의 안정성 연구를 통과하였다. 성장, 생산성 및 생성물 품질을 기준으로, 마스터 세포 은행(MCB)을 위해 사용된 클론을 선택하였다. 0.5 g/ℓ 또는 500 mg/ℓ를 제공하는 생산 세포주에서 CRISPR/Cas9 게놈 편집 기술을 이용하는 세포주 조작도 세포 성장을 개선하고 부피측정 역가를 1.5 g/ℓ 또는 1500 mg/ℓ까지 증가시키는 것으로 입증되었다. 생산 세포주를 위해 개발된 유가식 공정은 임상 물질 제조를 위한 2000 ℓ 일회용 생물반응기(SUB) 규모에서 규모 확장성을 입증하였다. 따라서, 다른 실시양태에서, 본 발명은 고생산 세포주 개발의 최적화를 제공한다. 고생산 세포주 개발의 이러한 최적화는 FACS 의존적 단일 세포 침착, CRISPR 넉아웃 절차 및 생산 규모 확장을 포함하나 이들로 한정되지 않는, 당분야에서 잘 공지되어 있는 방법 및 기법에 의해 달성될 수 있다.
방법 및 기법
본 발명은 당분야에서 잘 공지되어 있는, 분자생물학, 세포 배양, 생화학 등의 다수의 통상적인 기법들을 이용한다. 세포주 개발, 세포 배양 공정 개발 및 제조를 위한 방법 및 기법은 예를 들면, 문헌(Weishou Hu, et al., Cell Culture Process Engineering (2013))에 잘 기재되어 있다. 분자생물학적 기법을 기술하는 일반 문헌은 문헌(Berger and Kimmel, Guide to Molecular Cloning Techniques, Methods in Enzymology volume 152 Academic Press, Inc., San Diego, CA (Berger)); 문헌(Sambrook et al., Molecular Cloning - A Laboratory Manual (2nd Ed.), Vol. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, 1989 ("Sambrook")); 및 문헌(Current Protocols in Molecular Biology, F.M. Ausubel et al., eds., Current Protocols, a joint venture between Greene Publishing Associates, Inc. and John Wiley & Sons, Inc., (supplemented through 1999) ("Ausubel"))을 포함한다. 이 문헌들은 예를 들면, 비천연 아미노산을 포함하는 단백질의 생성을 위한 선택자 코돈, 오르토고날 tRNA, 오르토고날 합성효소, 및 이들의 쌍을 포함하는 유전자들의 생성과 관련된 벡터, 프로모터 및 많은 다른 관련 논제들의 사용을 기술한다.
다른 절차는 하기 공개문헌들 및 이들에서 인용된 참고문헌에서 발견될 수 있다: 문헌(Ling et al., Approaches to DNA mutagenesis: an overview, Anal Biochem. 254(2): 157-178 (1997)); 문헌(Dale et al., Oligonucleotide-directed random mutagenesis using the phosphorothioate method, Methods Mol. Biol. 57:369-374 (1996)); 문헌(Smith, In vitro mutagenesis, Ann. Rev. Genet. 19:423-462(1985)); 문헌(Botstein & Shortle, Strategies and applications of in vitro mutagenesis, Science 229:1193-1201(1985)); 문헌(Carter, Site-directed mutagenesis, Biochem. J. 237:1-7 (1986)); 문헌(Kunkel, The efficiency of oligonucleotide directed mutagenesis, in Nucleic Acids & Molecular Biology (Eckstein, F. and Lilley, D.M.J. eds., Springer Verlag, Berlin)) (1987)); 문헌(Kunkel, Rapid and efficient site-specific mutagenesis without phenotypic selection, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:488-492 (1985)); 문헌(Kunkel et al., Rapid and efficient site-specific mutagenesis without phenotypic selection, Methods in Enzymol. 154, 367-382 (1987)); 문헌(Bass et al., Mutant Trp repressors with new DNA-binding specificities, Science 242:240-245 (1988)); 문헌(Methods in Enzymol. 100: 468-500 (1983)); 문헌(Methods in Enzymol. 154: 329-350 (1987)); 문헌(Zoller & Smith, Oligonucleotide-directed mutagenesis using M13-derived vectors: an efficient and general procedure for the production of point mutations in any DNA fragment, Nucleic Acids Res. 10:6487-6500 (1982)); 문헌(Zoller & Smith, Oligonucleotide-directed mutagenesis of DNA fragments cloned into M13 vectors, Methods in Enzymol. 100:468-500 (1983)); 문헌(Zoller & Smith, Oligonucleotide-directed mutagenesis: a simple method using two oligonucleotide primers and a single-stranded DNA template, Methods in Enzymol. 154:329-350 (1987)); 문헌(Taylor et al., The use of phosphorothioate-modified DNA in restriction enzyme reactions to prepare nicked DNA, Nucl. Acids Res. 13: 8749-8764 (1985)); 문헌(Taylor et al., The rapid generation of oligonucleotide-directed mutations at high frequency using phosphorothioate-modified DNA, Nucl. Acids Res. 13: 8765-8787 (1985)); 문헌(Nakamaye & Eckstein, Inhibition of restriction endonuclease Nci I cleavage by phosphorothioate groups and its application to oligonucleotide-directed mutagenesis, Nucl. Acids Res. 14: 9679-9698 (1986)); 문헌(Sayers et al., Y-T Exonucleases in phosphorothioate-based oligonucleotide-directed mutagenesis, Nucl. Acids Res. 16:791-802 (1988)); 문헌(Sayers et al., Strand specific cleavage of phosphorothioate-containing DNA by reaction with restriction endonucleases in the presence of ethidium bromide, (1988) Nucl. Acids Res. 16: 803-814); 문헌(Kramer et al., The gapped duplex DNA approach to oligonucleotide-directed mutation construction, Nucl. Acids Res. 12: 9441-9456 (1984)); 문헌(Kramer & Fritz Oligonucleotide-directed construction of mutations via gapped duplex DNA, Methods in Enzymol. 154:350-367 (1987)); 문헌(Kramer et al., Improved enzymatic in vitro reactions in the gapped duplex DNA approach to oligonucleotide-directed construction of mutations, Nucl. Acids Res. 16: 7207 (1988)); 문헌(Fritz et al., Oligonucleotide-directed construction of mutations: a gapped duplex DNA procedure without enzymatic reactions in vitro, Nucl. Acids Res. 16: 6987-6999 (1988)); 문헌(Kramer et al., Point Mismatch Repair, Cell 38:879-887 (1984)); 문헌(Carter et al., Improved oligonucleotide site-directed mutagenesis using M13 vectors, Nucl. Acids Res. 13: 4431-4443 (1985)); 문헌(Carter, Improved oligonucleotide-directed mutagenesis using M13 vectors, Methods in Enzymol. 154: 382-403 (1987)); 문헌(Eghtedarzadeh & Henikoff, Use of oligonucleotides to generate large deletions, Nucl. Acids Res. 14: 5115 (1986)); 문헌(Wells et al., Importance of hydrogen-bond formation in stabilizing the transition state of subtilisin, Phil. Trans. R. Soc. Lond. A 317: 415-423 (1986)); 문헌(Nambiar et al., Total synthesis and cloning of a gene coding for the ribonuclease S protein, Science 223: 1299-1301 (1984)); 문헌(Sakamar and Khorana, Total synthesis and expression of a gene for the α-subunit of bovine rod outer segment guanine nucleotide-binding protein (transducin), Nucl. Acids Res. 14: 6361-6372 (1988)); 문헌(Wells et al., Cassette mutagenesis: an efficient method for generation of multiple mutations at defined sites, Gene 34:315-323 (1985)); 문헌(Grundstrom et al., Oligonucleotide-directed mutagenesis by microscale 'shot-gun' gene synthesis, Nucl. Acids Res. 13: 3305-3316 (1985)); 문헌(Mandecki, Oligonucleotide-directed double-strand break repair in plasmids of Escherichia coli: a method for site-specific mutagenesis, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83:7177-7181 (1986)); 문헌(Arnold, Protein engineering for unusual environments, Current Opinion in Biotechnology 4:450-455 (1993)); 문헌(Sieber, et al., Nature Biotechnology, 19:456-460 (2001). W. P. C. Stemmer, Nature 370, 389-91 (1994)); 및 문헌(I. A. Lorimer, I. Pastan, Nucleic Acids Res. 23, 3067-8 (1995)). 상기 방법들 중 많은 방법들에 대한 추가 상세한 설명은 다양한 돌연변이유발 방법들을 이용한 문제 해결에 유용한 대조군도 기술하는 문헌(Methods in Enzymology Volume 154)에서 발견될 수 있다.
본 발명의 폴리펩타이드 및 단백질을 정제하고 검출하는 다양한 기법들 및 방법들이 당분야에서 공지되어 있다. 이 기법들 및 방법들은 본원에서 인지된 바와 같이 비천연 아미노산을 포함하는 단백질을 검출하고 정제하는 데 적용될 수 있다. 일반적으로, 항체는 ELISA, 웨스턴 블롯팅, 면역화학, 친화성 크로마토그래피 방법, 표면 플라스몬 공명(SPR), 아넥신 V, FACS 및 많은 다른 방법들을 위한 유용한 시약이다. 본원의 참고문헌들은 ELISA 어세이, 웨스턴 블롯, SPR 등을 어떻게 수행하는 지에 대한 상세한 설명을 제공한다. 본 발명의 다른 기법 및 방법은 온전한 질량 분광측정(MS) 및 크기 배제 크로마토그래피(SEC)를 포함할 수 있다. 온전한 질량 분광측정은 단백질의 정확한 질량 및 이의 이소폼(isoform)의 상대적 존재도에 대한 정보를 제공한다. 당분야에서 분자 체 크로마토그래피로서도 공지되어 있는 크기 배제 크로마토그래피(SEC)는 용액 중의 분자들을 이들의 크기 및 일부 경우 분자량에 따라 분리하는 크로마토그래피 방법이다.
게놈 편집 기술
일부 실시양태에서, 본 발명은 유전자 편집 수단을 사용하여 세포에서 표적 부위 또는 영역을 불활성화시키거나, 파괴하거나, 제거하거나 넉아웃시키기 위한 폴리뉴클레오타이드를 제공한다. 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "표적", "위한 표적", "표적화된" 또는 "위해 표적화된" 넉아웃, 제거, 불활성화 또는 파괴는 제거되거나, 불활성화되거나, 파괴되거나 넉아웃되는, 세포 또는 유전자 내의 부위 또는 영역을 의미한다. 여러 유전자 편집 수단들이 표적화된 DNA 이중 가닥 절단(DSB)을 유도함으로써 유전자를 정밀하게 변형시키는 데 이용될 수 있다. 당분야에서 잘 공지되어 있는 이러한 유전자 편집 수단은 징크-핑거 뉴클레아제(ZFN), 전사 활성화제 유사 이펙터 뉴클레아제(TALEN), 및 당분야에서 귀소 엔도뉴클레아제(homing endonuclease)(HE)(Gaj et al, 2013; Guha et al, 2017)로서도 공지되어 있는 메가뉴클레아제(meganuclease)(MN), 및 클러스터링된 규칙적 간격으로 분포된 짧은 팔린드롬성 반복부(CRISPR)를 포함할 수 있으나 이들로 한정되지 않는다. 본 발명의 양태에서, 유전자 편집 수단은 관심 있는 유전자를 발현하는 세포 또는 생산 세포에서 표적 부위 또는 영역을 인식하고 형질감염 후 표적 유전자에서 이중 가닥 절단을 만들도록 구축물을 디자인하는 데 사용되었다.
ZFN은 징크-핑거 DNA 결합 도메인 및 FokI 제한 엔도뉴클레아제로부터의 비특이적 DNA 절단 도메인을 가진 인공 융합 단백질이다. 징크-핑거 도메인은 유전자 편집을 달성할 수 있기 위해 특정 DNA 서열을 인식할 수 있도록 조작될 수 있다. TALEN도 TALE 단백질로부터의 DNA 결합 단백질 및 FokI 제한 엔도뉴클레아제로부터의 비특이적 DNA 절단 도메인으로 구성된 인공 융합 단백질이다. TALE(전사 활성화제 유사 이펙터)는 잔토모나스(Xanthomonas) 세균으로부터의 단백질이고, 이의 DNA 결합 도메인은 특정 DNA 서열에 결합하도록 조작될 수 있다. ZFN과 유사하게, TALEN은 유전자 불활성화를 달성할 수 있도록 DSB를 유도할 수 있다. 당분야에서 귀소 엔도뉴클레아제로서도 공지되어 있는 MN은 이중 가닥 DNA를 생성하는 데 있어서 매우 부위 특이적인 엔도뉴클레아제이다. MN은 18개 내지 44개 염기쌍의 DNA를 인식할 수 있는 큰 부위 특이적 인식 부위를 가진다. NM의 패밀리 구성원들 중에서 LAGLIDADG는 게놈 편집의 적용에 있어서 가장 광범위하게 연구되고 조작된다. 클러스터링된 규칙적 간격으로 분포된 짧은 팔린드롬성 반복부(CRISPR) 기술은 RNA-가이드 뉴클레아제(Cas9는 가장 널리 사용되는 II형 뉴클레아제임)를 사용하여 표적화된 DNA 이중 가닥 절단(DSB)을 형성하는 최신 게놈 편집 기술이다. 세포에서의 표적화된 DSB의 자가 복구 과정 동안, 뉴클레오타이드 결실 및 삽입은 종종 일어나고 표적화된 단백질의 코딩 영역의 상응하는 게놈 서열의 프레임시프트를 초래하고 궁극적으로 그의 기능 상실을 초래한다. CRISPR이 바이러스 침습을 방어하는 데 있어서 원핵생물 세포의 면역 시스템으로서 처음 발견되었을지라도, 게놈 편집 수단으로서 진핵생물 세포에의 그의 적용은 성공적으로 개발되었다(예를 들면, 문헌(Cong, et al, 2013); 문헌(Hsu, et al, 2014); 문헌(Jinek, et al., 2012); 문헌(Ran, et al., 2013) 참조). DSB의 형성을 유도하기 위해 특정 DNA 결합 도메인을 사용하는 다른 게놈 편집 기술, 예컨대, 징크-핑거 뉴클레아제(ZFN) 및 전사 활성화제 유사 이펙터 뉴클레아제(TALEN) 및 메가뉴클레아제(MN)(예를 들면, 미국 특허 제8,597,912호)에 비해, CRISPR 기술은 특정 DNA 서열에의 와슨-크릭(Watson-Crick) 염기 페어링을 이용하는 가이드 RNA(gRNA)의 도움으로 DNA의 절단을 촉진한다.
본원에 기재된 임의의 유전자 편집 수단이 본 발명과 함께 이용될 수 있지만, CRISPR 기술은 다양한 세포들 및 유기체들에 적용될 수 있는 더 효율적인 고도 특이적 기술을 제공하기 때문에 예시된다. 본원의 실시예에 예시된 바와 같이, 관심 있는 유전자를 발현하는 세포에서 넉아웃, 제거, 불활성화 또는 파괴를 위해 부위 또는 영역을 표적화하는 gRNA는 CHO-K1 게놈에 특이적인 온라인 CRISPR gRNA 디자인 수단(월드 와이드 웹(staff.biosustain.dtu.dk/laeb/crispy/) 참조)을 이용함으로써 디자인될 수 있다. 관심 있는 유전자에서 넉아웃될 수 있거나, 제거될 수 있거나, 불활성화될 수 있거나 파괴될 수 있는 부위 또는 영역 표적 유전자의 예는 하기 표 1에 제공되어 있다.
Figure pct00001
Figure pct00002
본 발명의 다른 양태에서, 하기 표 2에 나타낸 올리고뉴클레오타이드를 합성하고 사용하여 상기 표에 개시된 gRNA들의 게놈 DNA 좌위를 증폭하였다. 이 기법들은 문헌에 전체적으로 설명되어 있다. 예를 들면, 문헌(Sambrook et al. MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, Second edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989 and Third edition, 2001), 문헌Ausubel et al., CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John Wiley & Sons, New York, 1987) 및 주기적 업데이트를 참조한다.
Figure pct00003
유전자 편집 표적
본 개시의 실시양태에서, 관심 있는 유전자를 발현하는 세포에서 넉아웃, 파괴, 제거 또는 불활성화를 위해 표적화된 유전자가 제공된다. 본원에서 사용된 바와 같이, 표적화된 넉아웃 유전자, 표적 또는 표적화된 제거 유전자, 표적 또는 표적화된 불활성화 유전자, 또는 표적 또는 표적화된 파괴 유전자에 대한 용어 표적은 유전자 편집에 의한 넉아웃, 제거 또는 불활성화를 위해 표적화된 유전자를 지칭한다. 본 발명의 일부 양태에서, 표적 또는 표적화된 부위 또는 영역은 아폽토시스 경로에 관여한다. 다른 실시양태에서, 본 발명은 세포 또는 세포주에서 넉아웃, 파괴, 제거 또는 불활성화를 위해 표적화된 유전자를 제공한다. 표적화된 넉아웃, 파괴, 제거 또는 불활성화 유전자는 세포 성장, 분화, 조절 등을 조절하는 유전자를 포함할 수 있다. 다른 실시양태에서, 아폽토시스 경로에 관여하는 유전자, 예를 들면, 전구아폽토시스 유전자, 발암유전자 등을 포함하는 관심 있는 유전자를 발현하는 세포에서 넉아웃, 파괴, 제거 또는 불활성화를 위한 표적 유전자. 넉아웃, 파괴, 제거 또는 불활성화를 위한 표적 유전자는 GS, Bcl-2 패밀리, IGFBP4, AQP1, Maf1, eRF1, FUT8, P53, 캐스파제-3, UPF1, Smg1 및 임의의 외재적으로 첨가된 선택 마커 유전자(적용될 수 있는 경우), 예컨대, 제오신, 하이그로마이신, 푸로마이신 등, Smac/DIABLO, Apaf-1, 캐스파제-6, 캐스파제-7, 캐스파제-9, 캐스파제-10, PARP, 알파 포드린, NuMA, AIF, CAD, 푸마, 녹사, 14-3-3, 아벤, Myc, HtrA2/Omi 등을 포함할 수 있으나 이들로 한정되지 않는다. 넉아웃, 파괴, 제거 또는 불활성화를 위한 표적 유전자는 bcl-2 패밀리, 예컨대, Bcl-xl, Bak, Bax, Bcl-xs, Bid, Bim, Bad 및 Bik를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 넉아웃, 파괴, 제거 또는 불활성화를 위한 표적은 BAX 및/또는 BAK이다. 다른 실시양태에서, 표적화된 넉아웃, 파괴, 제거 또는 불활성화 유전자는 전체적으로 또는 부분적으로 넉아웃되거나, 제거되거나 불활성화된다. 부분적으로 불활성화되거나, 파괴되거나, 넉아웃되거나 제거된 유전자는 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 불활성화되거나, 파괴되거나, 넉아웃되거나 제거된 유전자를 포함할 수 있다.
생물요법 유전자
본 발명은 플랫폼 세포주에서 발현된 관심 있는 유전자를 제공한다. 이러한 관심 있는 유전자는 사이토카인, 성장 인자, 호르몬, 인터페론, 인터류킨, 다른 조절 펩타이드 및 단백질, 및 항체를 포함하나 이들로 한정되지 않는 생물요법제일 수 있다. 본 발명의 생물요법제는 유전적으로 조작된 세균, 효모, 진균 또는 세포로부터의 임의의 생물학적 생성물을 포함할 수 있다. 본 발명의 생물요법제는 DNA, RNA, 재조합 DNA, 단백질, 폴리펩타이드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 생물요법제는 본 발명의 임의의 방법 또는 세포에 의해 수득된 백신이다.
다른 실시양태에서, 본 발명은 예를 들면, 알파-1 항트립신, 안지오스타틴, 항용혈 인자, 항체, 아포지단백질, 아포단백질, 심방 나트륨이뇨 인자, 심방 나트륨이뇨 폴리펩타이드, 심방 펩타이드, 칼시토닌, CD40 리간드, C-kit 리간드, 콜라겐, 콜로니 자극 인자(CSF), 보체 인자 5a, 보체 저해제, 보체 수용체 1, 사이토카인(예를 들면, 상피 호중구 활성화 펩타이드-78, GROα/MGSA, GROβ, GROγ, MIP-1α, MIP-1δ, MCP-1), 표피 성장 인자(EGF), 에리쓰로포이에틴("EPO"), 박리 독소 A 및 B, 인자 IX, 인자 VII, 인자 VIII, 인자 X, 섬유모세포 성장 인자(FGF), 피브리노겐, 피브로넥틴, G-CSF, GM-CSF, CD116, M-CSF, CSF-1R, 글루코세레브로시다제, 고나도트로핀, 성장 인자, 헤지호그 단백질(예를 들면, 소닉(Sonic), 인디안(Indian), 디저트(Desert)), 헤모글로빈, 간세포 성장 인자(HGF), 히루딘, 인간 혈청 알부민, 인슐린, 인슐린 유사 성장 인자(IGF), 인터페론(예를 들면, IFN-α, IFN-β, IFN-γ), 각질형성세포 성장 인자(KGF), 락토페린, 백혈병 저해 인자, 루시퍼라제, 뉴르투린, 호중구 저해 인자(NIF), 온코스타틴 M, 골형성 단백질, 부갑상선 호르몬, PD-ECSF, PDGF, 펩타이드 호르몬(예를 들면, 인간 성장 호르몬), 플레이오트로핀, 단백질 A, 단백질 G, 발열성 외독소 A, B 및 C, 릴랙신, 레닌, SCF, 가용성 보체 수용체 I, 가용성 I-CAM 1, 가용성 인터류킨 수용체(IL-1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15), 가용성 TNF 수용체, 소마토메딘, 소마토스타틴, 소마토트로핀, 스트렙토키나제, 수퍼항원, 즉 스타필로코커스 장독소(SEA, SEB, SEC1, SEC2, SEC3, SED, SEE), 수퍼록사이드 디스뮤타제(SOD), 독성 쇼크 증후군 독소(TSST-1), 티모신 알파 1, 조직 플라스미노겐 활성화제, TGF 베타 및 MIF, 혈관 내피 성장 인자(VEGF), 유로키나제 등을 포함하나 이들로 한정되지 않는 관심 있는 유전자를 발현하는 플랫폼 세포 또는 세포주를 제공한다.
다른 실시양태에서, 관심 있는 유전자는 인터류킨, 예컨대, IL-1 및 CD121a, IL-2 및 CD25/CD122/CD137, IL-3 및 CD123, IL-4 및 CD124, IL-5 및 CD125, IL-6 및 CD126, IL-7 및 CD127/CD132, IL-9 및 IL-9R, IL-10 및 CRF2-4, IL-11 및 IL-11R, IL-12 및 IL-12Rβ1c/IL-12Rβ2, IL-13 및 IL-13R, IL-15 및 CD122/CD132, IL-16 및 CD4, IL-17 및 CD217, IL-18 및 IL-1Rrp, IL-19 및 IL-20Rα/IL-10Rβc, IL-21 및 IL-21R/CD132, IL-22 및 IL-22Rαc/IL-10Rβc, IL-23 및 IL-23R, IL-24 및 IL-22Rαc/IL-10Rβc, IL-25 및 IL-17BR, IL-26 및 IL-20Rα/IL-10Rβc, IL-27 및 WSX-1/CD130c, IL-28 및 IL-28Rαc/IL-10Rβc, IL-29 및 IL-28Rαc/IL-10Rβc, IL-30 및 WSX-1/CD130c, IL-31 및 IL31A/OSMR, IL-32, IL-33 및 ST2/IL1RAP, IL-34 및 CSF-1R, IL-35 및 IL-12RB2, IL-36 및 IL-1Rrp2, IL-37 및 IL-18Rα, TSLP 및 TSLPR, LIF 및 LIFR, OSM 및 OSMR 등을 포함할 수 있으나 이들로 한정되지 않는다.
본 발명의 일부 양태에서, 관심 있는 유전자는 종양 괴사 인자 베타(TNF 베타), 종양 괴사 인자 수용체(TNFR), 종양 괴사 인자 알파(TNF 알파) 및 p55/p75, LT-α 및 p55/p75, LT-β 및 p55/p75, CD40L 및 CD40, FasL 및 CD95, CD27L 및 CD27, CD30L 및 CD30, 4-1BBL 및 4-1BB, Trail 및 DR4, RANK-L 및 RNAK, APRIL 및 TAC1, LIGHT 및 HVEM, TWEAK 및 TWEAKR, BAFF 및 TAC1 등을 포함하나 이들로 한정되지 않는 종양 괴사 인자(TNF)를 포함할 수 있다.
관심 있는 유전자는 CXCL1 및 CXCR2, CXCL2 및 CXCR2, CXCL3 및 CXCR2, CXCL4 및 CXCR3B, CXCL5 및 CXCR2, CXCL6 및 CXCR2, CXCL7 및 CXCR1/CXCR2, CXCL8 및 CXCR1/CXCR2, CXCL9 및 CXR3A/3B, CXCL10 및 CXCRA/3B, CXCL11 및 CXCR3A/3B/CRCR7, CXCL12 및 CXCR4/CXCR7, CXCL13 및 CXCR5, CXCL14, CXCL15, CXCL16 및 CXCR6 등을 포함하는 C-X-C 케모카인(예를 들면, T39765, NAP-2, ENA-78, Gro-a, Gro-b, Gro-c, IP-10, GCP-2, NAP-4, SDF-1, PF4, MIG)을 포함할 수 있다. 관심 있는 유전자는 CCL1 및 CCR6, CCL2 및 CCR2, CCL3 및 CCR1/5, CCL4 및 CCR5, CCL5 및 CCR1/CCR3, CCR5, CCL6 및 CCR1, CCL7 및 CCR1/CCR2/CCR3/CCR5, CCL8 및 CCR1/CCR2/CCR5, CCL9 및 CCR1, CCL11 및 CCR3, CCL12 및 CCR2, CCL13 및 CCR2/3, CCL14 및 CCR1/3/5, CCL15 및 CCR1/3, CCL16 및 CCR1/2/5/8, CCL17 및 CCR4, CCL18 및 PITPNM3, CCL19 및 CCR7, CCL20 및 CCR6, CCL21 및 CCR7, CCL22 및 CCR4, CCL23 및 CCR1/FPRL-1, CCL24 및 CCR3, CCL25 및 CCR9, CCL26 및 CCR3, CCL27 및 CCR10, CCL28 및 CCR10을 포함하고 XCL1 및 XCR1, XCL2 및 XCR1, CX3CL1 및 CX3CR1 등을 포함하는 CC 케모카인(예를 들면, 단핵세포 화학유인 단백질-1, 단핵세포 화학유인 단백질-2, 단핵세포 화학유인 단백질-3, 단핵세포 염증 단백질-1 알파, 단핵세포 염증 단백질-1 베타, RANTES, I309, R83915, R91733, HCC1, T58847, D31065, T64262)도 포함할 수 있다.
본원에 기재된 방법, 조성물, 전략 및 기법은 특정 종류, 부류 또는 패밀리의 폴리펩타이드 또는 단백질로 한정되지 않는다. 실제로, 사실상 임의의 폴리펩타이드가 본원에 기재된 적어도 하나의 "변형된 또는 비변형된" 비천연 아미노산을 포함하도록 디자인될 수 있거나 변형될 수 있다. 예를 들면, 폴리펩타이드는 본원에 기재된 생물요법 또는 치료 단백질에 대한 상동성을 가질 수 있다. 적어도 하나의 비천연 아미노산을 가진 관심 있는 단백질 또는 폴리펩타이드는 본 발명의 한 특징이다. 본 발명은 본 발명의 조성물 및 방법을 사용함으로써 생성된 적어도 하나의 비천연 아미노산을 가진 폴리펩타이드 또는 단백질도 포함한다. 부형제(예를 들면, 약학적으로 허용가능한 부형제)도 단백질과 함께 존재할 수 있다.
척추동물 세포에서 도입된 적어도 하나의 비천연 아미노산을 가진 관심 있는 단백질 또는 폴리펩타이드를 생성함으로써, 단백질 또는 폴리펩타이드는 전형적으로 척추동물 번역 후 변형을 포함할 것이다. 일부 실시양태에서, 단백질은 적어도 하나의 비천연 아미노산, 및 척추동물 세포에 의해 생체내에서 만들어진 적어도 하나의 번역 후 변형을 포함하고, 이때 상기 번역 후 변형은 원핵생물 세포에 의해 만들어지지 않는다. 예를 들면, 번역 후 변형은 예를 들면, 아세틸화, 아실화, 지질 변형, 팔미토일화, 팔미테이트 추가, 인산화, 당지질 결합 변형, 글리코실화 등을 포함한다.
본 발명의 개시는 선택자 코돈 함유 유전자 또는 관심 있는 유전자를 포함한다. 관심 있는 유전자는 치료 단백질 또는 폴리펩타이드, 세포 성장, 분화, 조절 또는 염증에 관여하는 유전자, 발암유전자 등을 포함할 수 있으나 이들로 한정되지 않는다. 다른 실시양태에서, 본 발명의 개시는 선택자 코돈 함유 항체 유전자를 포함한다. 다른 실시양태에서, 항체는 항-Her2, 항-CD-70, 항-PSMA, 5T4, EGFR, TROP2, CD3, 인터류킨(2, 3, 10을 포함하나 이들로 한정되지 않음), GPC3, DLL3, ROR1, 렙틴, FGF-21 및 FGF-23을 포함하는 FGF 패밀리, HGH, FcR, 인슐린, TNFR1, TRAIL, 에리쓰로포이에틴, 및 이들의 유사체, 이중특이적 물질 및 단편 등을 포함하나 이들로 한정되지 않는 관심 있는 임의의 항체일 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 발명은 선택자 코돈 함유 항체 유전자를 포함한다. 본 발명의 항체는 예를 들면, 다중클론 항체, 단일클론 항체, 키메라 항체, 인간화된 항체, 단일 쇄, Fab 단편, Fab 발현 라이브러리에 의해 생성된 단편 등일 수 있다. 본 발명의 항체는 예를 들면, 항체 의존적 세포 매개 세포독성(ADCC) 또는 보체 매개 용해(CML)에 의한 파괴를 위해 종양 세포를 표적화함으로써 종양 성장을 정지시키는 종양 특이적 MAb들을 포함할 수 있으나 이들로 한정되지 않는다(이들 일반적인 종류의 항체들은 종종 "마법 탄환(magic bullet)"으로서 지칭된다). 일례는 비호지킨 림프종 치료용 항-CD20 MAb인 리툭산(Rituxan)이다(Scott (1998) Rituximab: a new therapeutic monoclonal antibody for non-Hodgkin's lymphoma Cancer Pract 6: 195-7); 종양 성장의 핵심 성분을 방해하는 항체. 헤르셉틴(Herceptin)은 전이성 유방암 치료용 항-HER-2 단일클론 항체이고, 이 작용 기작을 가진 항체의 일례를 제공한다(Baselga et al. (1998) Recombinant humanized anti-HER2 antibody (Herceptin) enhances the antitumor activity of paclitaxel and doxorubicin against HER2/neu overexpressing human breast cancer xenografts [published erratum appears in Cancer Res (1999) 59(8):2020], Cancer Res 58: 2825-31). 또 다른 예는 세포독성 화합물(독소, 방사성핵종 등)을 종양 또는 관심 있는 다른 부위에 직접적으로 전달하기 위한 항체와 관련된다. 예를 들면, 한 적용 Mab는 방사선을 전립선 종양 세포에 직접적으로 표적화하는 90Y-결합된 항체인 CYT-356이다(Deb et al. (1996) Treatment of hormone-refractory prostate cancer with 90Y-CYT-356 monoclonal antibody Clin Cancer Res 2: 1289-97). 다른 예는 항체 유도 효소 프로드러그 요법을 포함할 수 있고, 이때 종양에 함께 위치된 효소는 종양 근처에서 전신 투여된 프로드러그를 활성화시킨다. 예를 들면, 카복시펩티다제 A에 결합된 항-Ep-CAM1 항체는 대장암의 치료를 위해 개발되고 있다(Wolfe et al. (1999) Antibody-directed enzyme prodrug therapy with the T268G mutant of human carboxypeptidase A1: in vitro and in vivo studies with prodrugs of methotrexate and the thymidylate synthase inhibitors GW1031 and GW1843 Bioconjug Chem 10: 38-48). 치료 이익을 위해 정상 세포 기능을 특이적으로 억제하도록 디자인된 다른 항체(예를 들면, 길항제)가 포함될 수 있다. 일례는 급성 장기 이식 거부를 감소시키기 위해 존슨 앤드 존슨(Johnson and Johnson)에 의해 제공된 항-CD3 MAb인 오르토클론(Orthoclone) OKT3이다(Strate et al. (1990) Orthoclone OKT3 as first-line therapy in acute renal allograft rejection Transplant Proc 22: 219-20). 또 다른 부류의 항체는 아고니스트인 항체를 포함할 수 있다. 이 Mab들은 치료 이익을 위해 정상 세포 기능을 특이적으로 향상시키도록 디자인된다. 예를 들면, 신경요법을 위한 아세틸콜린 수용체의 Mab 기반 아고니스트가 개발되고 있다(Xie et al. (1997) Direct demonstration of MuSK involvement in acetylcholine receptor clustering through identification of agonist ScFv Nat. Biotechnol. 15: 768-71). 이 항체들 중 임의의 항체는 하나 이상의 치료 성질(특이성, 결합력, 혈청 반감기 등)을 향상시키기 위해 하나 이상의 비천연 아미노산을 포함하도록 변형될 수 있다. 또 다른 예는 효소의 촉매 능력을 모방하도록 조작된 Ig 서열과 같은 촉매 항체를 포함할 수 있다(Wentworth and Janda (1998) Catalytic antibodies Curr Opin Chem Biol 2: 138-44). 촉매 항체는 관심 있는 하나 이상의 성질을 개선하기 위해 하나 이상의 비천연 아미노산을 포함하도록 변형될 수도 있다.
본 발명의 선택자 코돈은 단백질 생합성 기구의 유전 코돈 프레임워크를 확장시킨다. 예를 들면, 선택자 코돈은 예를 들면, 특유의 3-염기 코돈, 넌센스 코돈, 예컨대, 정지 코돈, 예를 들면, 앰버 코돈(UAG), 오팔 코돈(UGA), 비천연 코돈, 적어도 4-염기 코돈, 희귀 코돈 등을 포함한다. 다수, 예를 들면, 1개 이상, 2개 이상, 3개 이상 등의 선택자 코돈이 원하는 유전자 내로 도입될 수 있다. 유전자는 소정의 선택자 코돈의 다수의 카피를 포함할 수 있거나, 다수의 상이한 선택자 코돈 또는 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 한 실시양태에서, 본 발명의 방법 및 조성물은 본원에 개시된 선택자 코돈 함유 유전자 또는 관심 있는 유전자의 사용을 수반한다. 한 실시양태에서, 본 발명의 방법 및 조성물은 선택자 코돈 함유 항체의 사용을 수반하고, 이때 선택자 코돈은 중쇄, 경쇄 또는 이들 둘 다에 존재할 수 있다. 따라서, 본 발명의 선택자 코돈은 진핵생물 세포 내로의 생체내 비천연 아미노산의 도입을 위한 정지 코돈을 포함한다.
생산 세포
일부 실시양태에서, 본 발명은 관심 있는 유전자를 발현하는 생산 세포, 세포주 및 이들로부터 생성된 클론을 제공한다. 이러한 생산 세포 또는 세포주는 일시적으로 형질감염된 세포 집단, 안정한 벌크 세포 집단(예를 들면, 혼합된 세포 또는 세포의 풀), 안정한 미니 세포 집단(예를 들면, 미니 풀 또는 마스터 웰 집단), 및 (예를 들면, 단일 세포로부터 유래된) 안정한 클론 세포주를 포함하나 이들로 한정되지 않는다. 본원에서 사용된 일시적으로 형질감염된 세포 집단은 관심 있는 유전자가 도입되어 있고 게놈 내로 안정하게 삽입될 수 없는 세포의 풀을 지칭한다. 본원에서 사용된 안정한 세포 또는 안정한 생산 세포주는 관심 있는 유전자가 게놈 내로 도입되어 있고 안정하게 삽입되어 있는 세포를 지칭한다. 안정한 미니 세포 집단은 안정한 벌크 세포 집단보다 더 적은 불균질성을 가질 수 있다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 오르토고날 아미노아실 tRNA 합성효소(O-RS), 오르토고날 억제제 tRNA(O-tRNA), 및 도입된 비천연 아미노산을 가진 관심 있는 선택자 코돈 함유 유전자, 및 표적 넉아웃, 제거, 불활성화 또는 파괴 유전자를 포함하는 안정한 생산 세포주에 관한 것이다. 다른 실시양태에서, 본 발명의 개시는 관심 있는 유전자, 및 표적 넉아웃, 제거, 불활성화 또는 파괴 유전자를 발현하는 생산 세포, 세포주 및 이들로부터 생성된 클론에 관한 것이다. 다른 실시양태에서, 표적 넉아웃, 제거, 불활성화 또는 파괴 유전자는 세포 성장 및 생산성을 촉진하는 데 관여하는 유전자이다. 다른 실시양태에서, 표적 넉아웃, 제거, 불활성화 또는 파괴 유전자는 아폽토시스 경로에 관여하는 유전자, 예를 들면, 전구아폽토시스 유전자이다. 예시적 실시양태에서, 본 발명의 개시는 비천연 도입된 아미노산을 가진 관심 있는 유전자, 및 하나 이상의 표적 넉아웃, 파괴, 제거 또는 불활성화 유전자(예를 들면, BAX 및/또는 BAK)를 발현하는 세포 또는 세포주를 생성하는 방법 및 조성물을 제공한다. 다른 표적 넉아웃 유전자는 미토콘드리아 경로를 통해 아폽토시스 세포 사멸을 조절하는 그의 능력에 대해 당분야에서 잘 공지되어 있는 Bcl-2 패밀리의 단백질들을 포함할 수 있다. Bcl-2 및 이의 상동체들 중 일부, 예컨대, Bcl-xl은 아폽토시스를 억제하는 것으로 공지되어 있다. 다른 공지된 전구아폽토시스 Bcl-2 패밀리 구성원은 Bak, Bax, Bcl-xs, Bid, Bim, Bad 및 Bik를 포함한다. Bax 및/또는 Bak는 적절한 자극을 사용하여 아폽토시스를 유도할 수 있거나 가속화할 수 있다. Bcl-2 패밀리의 단백질들은 상당한 서열 및 구조 상동성을 공유한다. 이 패밀리의 단백질들은 Bcl-2 상동성 도메인으로서 공지되어 있는 최대 4개의 서열 상동성 영역들을 특징으로 한다. 예를 들면, Bax 단백질은 Bcl-2와 고도로 보존된 도메인들을 공유한다. 이 도메인들 중 일부는 아폽토시스 신호에 반응한 세포 생존 또는 세포 사멸에 중요한 것으로 생각되는 Bax/Bcl-2 이종이량체 형성에 관여한다. 활성화 시, Bax는 외부 미토콘드리아 막으로 전위하고, 여기서 올리고머화하고, 막을 투과가능하게 만들고, 사이토크롬 C를 비롯한 여러 사멸 촉진 인자들을 방출한다(Scorrano et al. (2003) Biochem. Biophys. Res. Commun. 304:437-444). Bax는 미토콘드리아로부터 Bax를 격리시키는 Ku70 단백질과의 상호작용을 통해 정상 세포에서 불활성을 갖게 될 수 있다(Sawada et al. (2003) Nat. Cell Biol. 5:320-329). Bax처럼, Bak 유전자 생성물은 적절한 자극의 존재 하에서 아폽토시스 세포 사멸을 향상시킨다. Bak는 세포 사멸도 촉진하고 Bcl-2 아폽토시스 보호를 방해한다. Bak는 다양한 종류의 세포들에서 공지된 강력한 아폽토시스 유도제이다. 따라서, 예시적 방식으로, 본 발명의 개시는 관심 있는 유전자 및 도입된 비천연 아미노산을 발현하는 세포 또는 세포주에서 BAK 유전자 및/또는 BAX 유전자 중 하나 이상의 유전자의 부분적 또는 완전한 불활성화를 가진 생산자 세포주를 생성하는 방법 및 조성물을 제공한다. 관심 있는 유전자를 발현하는 세포에서의 아폽토시스 작용제(예를 들면, BAX 및/또는 BAK)의 불활성화는, 아폽토시스에 대한 내성을 갖고, 예를 들면, 항체를 포함하나 이것으로 한정되지 않는 재조합 단백질 및 재조합 바이러스 벡터의 생성, 및 백신의 제조를 개선하는 세포주를 생성하는 데 이용될 수 있다.
본 개시의 세포주는 재조합 단백질 생성을 위해 사용될 수 있다. 재조합 단백질은 본원의 다른 곳에 개시된 바와 같은 항체, 항원, 치료 단백질을 포함하나 이들로 한정되지 않는다. 일부 실시양태에서, 본 발명은 포유동물, 곤충, 파충류, 새 등 또는 섬모충류, 식물(단자엽, 쌍자엽 및 조류를 포함하나 이들로 한정되지 않음), 진균, 효모, 편모충류, 미포자충류 및 원생생물을 포함하나 이들로 한정되지 않는 진핵생물 또는 척추동물 세포 또는 세포주를 수반한다. 진핵생물 세포는 비천연 아미노산의 생체내 도입을 위해 사용될 수 있다. 세포는 본 발명의 폴리뉴클레오타이드, 또는 본 발명의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 구축물, 예를 들면, 클로닝 벡터 또는 발현 벡터일 수 있는 본 발명의 벡터에 의한 유전적 조작(예를 들면, 형질전환, 형질도입 또는 형질감염)을 위해 사용될 수 있다. 상기 벡터는 예를 들면, 플라스미드, 세균, 바이러스, 네이키드 폴리뉴클레오타이드 또는 접합된 폴리뉴클레오타이드의 형태로 존재할 수 있다. 벡터는 전기천공(From et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 5824 (1985)), 바이러스 벡터에 의한 감염, 작은 비드 또는 입자의 매트릭스 내에 또는 표면 위에 핵산을 가진 작은 입자에 의한 고속 탄환 침투를 포함하는 표준 방법에 의해 세포 및/또는 미생물 내로 도입된다(Klein et al., Nature 327, 70-73 (1987)).
핵산을 세포 내로 도입하는 여러 잘 공지된 방법들이 이용될 수 있고, 이들 중 임의의 방법이 본 발명에서 이용될 수 있다. 이들은 수용 세포와, DNA를 함유하는 세균 원형질체의 융합, 전기천공, 발사체 폭격(projectile bombardment), 및 바이러스 벡터에 의한 감염(이하에서 더 논의됨) 등을 포함한다. 세균 세포를 사용하여, 본 발명의 DNA 구축물을 함유하는 플라스미드의 수를 증폭할 수 있다. 세균은 대수증식기까지 성장하고, 세균 내의 플라스미드는 당분야에서 공지되어 있는 다양한 방법들에 의해 단리될 수 있다(예를 들면, 문헌(Sambrook) 참조). 또한, 무수히 많은 키트들이 세균으로부터의 플라스미드의 정제를 위해 상업적으로 입수될 수 있다(예를 들면, EasyPrep™, FlexiPrep™(둘 다 파마샤 바이오텍(Pharmacia Biotech)); StrataClean™(스트라타진(Stratagene)); 및 QIAprep™(퀴아젠(Qiagen)) 참조). 그 후, 단리되고 정제된 플라스미드를 더 조작하여 세포를 형질감염시키는 데 사용되는 다른 플라스미드를 생성하거나, 관련 벡터 내로 도입하여 유기체를 감염시킨다. 전형적인 벡터는 전사 및 번역 터미네이터, 전사 및 번역 시작 서열, 및 관심 있는 특정 핵산의 발현의 조절에 유용한 프로모터를 함유한다. 벡터는 임의적으로 적어도 하나의 독립적 터미네이터 서열, 진핵생물 또는 원핵생물, 또는 이들 둘 다(예를 들면, 셔틀 벡터)에서의 카세트의 복제를 허용하는 서열, 및 원핵생물 및 척추동물 시스템 둘 다를 위한 선택 마커를 함유하는 일반적인 발현 카세트를 포함한다. 벡터는 원핵생물, 진핵생물, 또는 바람직하게는 이들 둘 다에서의 복제 및 삽입에 적합하다. 문헌(Giliman & Smith, Gene 8:81 (1979)); 문헌(Roberts, et al., Nature, 328:731 (1987)); 문헌(Schneider, B., et al., Protein Expr. Purif. 6435:10 (1995)); 및 문헌(Ausubel, Sambrook, Berger(모두 앞서 인용됨))을 참조한다. 클로닝에 유용한 세균 및 박테리오파지의 카탈로그는 예를 들면, ATCC에 의해 제공된다(예를 들면, ATCC에 의해 공개된 세균 및 박테리오파지의 ATCC 카탈로그(1992)(Gherna et al. (eds))). 시퀀싱, 클로닝 및 분자생물학의 다른 양태에 대한 추가 기본 절차, 및 근본적인 이론적 고려사항도 문헌(Watson et al. (1992) Recombinant DNA Second Edition Scientific American Books, NY)에서 발견된다. 추가로, 본질적으로 임의의 핵산(및 사실상 임의의 표준 또는 비-표준 표지부착된 핵산)은 다양한 상업적 공급원들 중 임의의 상업적 공급원, 예컨대, 미들랜드 서티파이드 리전트 컴파니(Midland Certified Reagent Company)(텍사스주 미들랜드 소재 mcrc.com), 더 그레이트 어메리칸 진 컴파니(The Great American Gene Company)(캘리포니아주 라모나 소재, 월드 와이드 웹(genco.com)에서 입수될 수 있음), 익스프레스진 인코포레이티드(ExpressGen Inc.)(일리노이주 시카고 소재, 월드 와이드 웹(expressgen.com)에서 입수될 수 있음), 오페론 테크놀로지스 인코포레이티드(Operon Technologies Inc.)(캘리포니아주 알라메다 소재) 및 많은 다른 상업적 공급원들로부터 맞춤 또는 표준 주문될 수 있다.
본 발명의 개시의 세포 또는 세포주는 예를 들면, 스크리닝 단계, 프로모터의 활성화 또는 형질전환체의 선택과 같은 활동을 위해 적절하게 변형된 통상적인 영양 배지에서 배양될 수 있다. 이 세포는 임의적으로 형질전환 유기체 내에서 배양될 수 있다. 예를 들면, 세포 단리 및 배양(예를 들면, 후속 핵산 단리)을 위한 다른 유용한 참고문헌은 문헌(Freshney (1994) Culture of Animal Cells, a Manual of Basic Technique, third edition, Wiley-Liss, New York) 및 이 문헌에서 인용된 참고문헌; 문헌(Payne et al. (1992) Plant Cell and Tissue Culture in Liquid Systems John Wiley & Sons, Inc. New York, NY); 문헌(Gamborg and Phillips (eds) (1995) Plant Cell, Tissue and Organ Culture); 문헌(Fundamental Methods Springer Lab Manual, Springer-Verlag (Berlin Heidelberg New York)); 및 문헌(Atlas and Parks (eds) The Handbook of Microbiological Media (1993) CRC Press, Boca Raton, FL)을 포함한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 통상적인 배지 또는 배지들은, 세포를 성장시키고 회수하고/하거나 이러한 세포에 의해 발현되고/되거나 분비된 생성물을 회수하는 데 사용되는 임의의 배양 배지를 지칭한다. 이러한 "배지" 또는 "배지들"은 예를 들면, 세균 숙주 세포, 효모 숙주 세포, 곤충 숙주 세포, 식물 숙주 세포, 진핵 숙주 세포, 포유동물 숙주 세포, CHO 세포, 원핵 숙주 세포, 이. 콜라이(E. coli) 또는 슈도모나스(Pseudomonas) 숙주 세포를 비롯한 임의의 숙주 세포 및 세포 내용물을 지지할 수 있거나 함유할 수 있는 용액, 고체, 반고체 또는 강성 지지체를 포함하나 이들로 한정되지 않는다. 이러한 "배지" 또는 "배지들"은 증식 단계 전 또는 후 배지를 비롯한, 숙주 세포가 성장되고 폴리펩타이드가 분비되는 배지 또는 배지들을 포함하나 이들로 한정되지 않는다. 이러한 "배지" 또는 "배지들"은 숙주 세포 용해물, 예를 들면, 세포 내에서 생성된 폴리펩타이드를 함유하는 완충제 또는 시약도 포함하나 이들로 한정되지 않고, 숙주 세포는 용해되거나 파괴되어 폴리펩타이드를 방출한다. 본 발명의 다른 실시양태에서, 배지는 완전한 세포 배양 배지, 전통적인 세포 배양 배지 또는 화학적으로 규정된 배지일 수 있다. 완전한 세포 배양 배지는 종종 두 주요 카테고리의 성분들을 가진다: 기초 배지 및 성장 보충제. 기초 배지는 당, 아미노산, 비타민, 다양한 염들 등을 비롯한 소분자량 성분으로 구성된 영양분 혼합물이다. 기초 배지는 에너지를 유도하고 새로운 세포 덩어리 및 생성물을 만들기 위한 영양 공급원을 제공할뿐만 아니라, 세포 성장을 허용하기 위해 균형 잡힌 염 농도 및 삼투압농도도 제공한다. 그러나, 기초 배지가 "최적" 성장 조건에 필요한 성장 인자 또는 다른 요인을 함유하지 않기 때문에, 대다수의 세포들은 기초 배지만을 제공받은 경우 성장하지 않을 것이다. 기초 배지에 첨가될 수 있는 성장 보충제는 성장 인자, 인지질, 대두 가수분해물, 혈청 등을 포함한다. 이 보충제는 특정 신호전달 경로를 위한 구성 성분을 제공함으로써 세포 성장을 촉진할 수 있거나, 특수한 영양 요구(예컨대, 콜레스테롤의 전달)를 공급할 수 있고 세포 분화를 유도할 수 있다. 전통적인 세포 배양 배지는 기초 배지 이외에 15%까지 동물 혈청을 함유한다. 혈청은 그의 화학 조성 면에서 매우 복잡한 유체이다. 주로 규정되지 않은 화학 조성을 함유하는 이러한 배지는 복합 배지로서 지칭된다. 산업 공정에서 통상적으로 사용되는 많은 보충제들, 예를 들면, 식물 가수분해물, 대두 인지질도 이 카테고리에 속한다. 이들의 사용으로 인해 배지의 화학 조성은 규정되지 않는다. 화학적으로 규정된 배지는 공지되어 있고 특징규명되어 있는 화학 조성을 가진 성분만을 함유하고, 특정된 모든 그의 화학 종들을 가진다. 상기 배지는 공지되어 있지 않거나 규정되어 있지 않은 조성을 가진 성분들의 임의의 혼합물을 함유하지 않는다. 예를 들면, "지질" 또는 "인지질"은 잘 규정된 화합물이 아니라, 한 부류의 화합물들의 혼합물이고 화학적으로 특정되어 있지 않다. 화학적으로 규정된 배지는 종종 성장 인자, 사이토카인 및 담체 단백질을 함유한다. 따라서, 화학적으로 규정된 배지가 반드시 단백질을 함유하지 않는 것은 아니다.
본 발명의 실시양태에서, 회분식 생산 및 유가식 생산이 이용된다. 회분식 생산 및 유가식 생산을 위한 표준 방법은 당분야에서 잘 이해되어 있다. 회분식 공정에서, 삼투압농도의 제한은 처음에 첨가될 수 있는 영양분의 양을 한정한다. 이 낮은 영양분 수준은 배양이 높은 세포 및 생성물 농도를 달성하지 못하게 한다. 유가식 배양에서, 배지는 영양분 고갈을 방지함으로써 성장기를 연장시키고 궁극적으로 세포 및 생성물 농도를 증가시키기 위해 배양 동안 첨가된다. 매우 단순한 작업부터 고도로 복잡하고 자동화된 작업까지 다양한 유가식 작업들이 현재의 생산 시설에서 이용된다. 회분식 및 유가식 둘 다에서 사용되는 배지는 상업적으로 입수될 수 있거나, 사내에서 개발된 전매특허 배지일 수 있다. 배지의 종류는 주로 규정되지 않은 화학 조성을 함유하는 복합 배지, 또는 공지되어 있고 특징규명되어 있고 특정된 모든 그의 화학 종들을 가진 화학 조성(들)을 가진 성분을 포함하는 화학적으로 규정된 배지일 수 있다. 일부 실시양태에서, 화학적으로 규정된 배지는 공지되어 있고 특징규명되어 있고 특정된 모든 그의 화학 종들을 가진 화학 조성을 가진 성분만을 포함한다. 다른 실시양태에서, 사용되는 배지의 종류는 규정되지 않은 화학 조성 및 화학적으로 규정된 조성을 함유하는 혼합물일 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 규정되지 않은 화학 조성 및 화학적으로 규정된 조성은 각각 99% 내지 90%와 1% 내지 10%, 또는 각각 89% 내지 80%와 11% 내지 20%, 또는 각각 79% 내지 70%와 21% 내지 30%, 또는 각각 69% 내지 60%와 31% 내지 40%, 또는 각각 59% 내지 50%와 41% 내지 50%의 임의의 조합; 또는 각각 1% 내지 10%와 99% 내지 90%, 또는 각각 11% 내지 20%와 89% 내지 80%, 또는 각각 21% 내지 30%와 79% 내지 70%, 또는 각각 31% 내지 40%와 69% 내지 60%, 또는 각각 41% 내지 50%와 59% 내지 50%의 임의의 조합으로 존재할 수 있다. 대다수의 이러한 방법들 또는 대안적 방법들은 숙련된 당업자에게 잘 공지되어 있다. 예를 들면, 문헌(Weishou Hu, et al., Cell Culture Process Engineering (2013))을 참조한다.
본 발명의 방법 및 조성물은 비천연 아미노산을 함유하거나 포함하는 단백질 또는 폴리펩타이드를 유용한 다량으로 생성하기 위한 고생산 진핵생물 세포 또는 세포주를 제공한다. 한 양태에서, 상기 조성물은 비천연 아미노산을 포함하는 폴리펩타이드 또는 단백질을, 예를 들면, 적어도 10 마이크로그램, 적어도 50 마이크로그램, 적어도 75 마이크로그램, 적어도 100 마이크로그램, 적어도 200 마이크로그램, 적어도 250 마이크로그램, 적어도 500 마이크로그램, 적어도 1 밀리그램 또는 적어도 10 밀리그램 이상, 또는 생체내 단백질 생성 방법에 의해 달성될 수 있는 양으로 임의적으로 포함한다. 또 다른 양태에서, 상기 단백질은 (예를 들면, 약 1 nl 내지 약 100 ℓ의 부피로) 예를 들면, 세포 용해물, 완충제, 약학 완충제 또는 다른 액체 현탁액 중의, 예를 들면, 리터당 적어도 10 마이크로그램의 단백질, 리터당 적어도 50 마이크로그램의 단백질, 리터당 적어도 75 마이크로그램의 단백질, 리터당 적어도 100 마이크로그램의 단백질, 리터당 적어도 200 마이크로그램의 단백질, 리터당 적어도 250 마이크로그램의 단백질, 리터당 적어도 500 마이크로그램의 단백질, 리터당 적어도 1 밀리그램의 단백질, 또는 리터당 적어도 10 마이크로그램의 단백질 이상의 농도로 조성물에 임의적으로 존재한다. 진핵생물 또는 척추동물 세포에서 적어도 하나의 비천연 아미노산을 포함하는 단백질을 다량(예를 들면, 다른 방법, 예를 들면, 시험관내 번역에 의해 전형적으로 가능한 양보다 더 큰 양)으로 생성하는 것은 본 발명의 한 특징이다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 세포는 "숙주 세포"로서도 지칭되는 조작된 또는 재조합 숙주 세포 또는 플랫폼 세포이다. 이러한 플랫폼, 조작된 또는 재조합 숙주 세포, 또는 숙주 세포는 외생성 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 세포를 지칭하고, 이때 외생성 폴리뉴클레오타이드를 세포 내로 삽입하는 데 이용된 방법은 직접적인 흡수, 형질도입, f-교배, 또는 재조합 숙주 세포를 생성하는 것으로 당분야에서 공지되어 있는 다른 방법을 포함하나 이들로 한정되지 않는다. 예를 들면, 이러한 외생성 폴리뉴클레오타이드는 플라스미드를 포함하나 이것으로 한정되지 않는 비삽입된 벡터일 수 있거나, 숙주 게놈 내로 삽입될 수 있다. 본 발명의 다른 양태에서, 관심 있는 유전자를 플랫폼, 조작된 또는 재조합 숙주 세포 내로 형질감염시켜, 항체를 포함하나 이것으로 한정되지 않는 생물요법제를 생성하거나 제조하기 위한 생산 세포주를 생성할 수 있다. 본 발명의 또 다른 실시양태에서, 생산 세포주는 관심 있는 유전자를 가진 세포주이다. 본 발명의 다른 실시양태에서, 침묵되거나, 넉아웃되거나, 제거되거나, 불활성화되거나 파괴된 관심 있는 유전자를 가진 생산 세포주는 플랫폼 세포주가 될 수 있다. 본 발명의 일부 양태에서, 플랫폼 세포는 관심 있는 유전자를 갖지 않으면서 오르토고날 tRNA/RS 시스템을 포함하는 세포주일 수 있다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 조성물은 실질적으로 정제될 수 있다. 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "실질적으로 정제된"은 정제 전에 관심 있는 성분을 정상적으로 동반하거나 이 성분과 상호작용하는 다른 성분을 실질적으로 또는 본질적으로 함유하지 않을 수 있는 관심 있는 성분을 의미한다. 예를 들면, 관심 있는 성분은 관심 있는 성분의 제제가 약 30% 미만, 약 25% 미만, 약 20% 미만, 약 15% 미만, 약 10% 미만, 약 5% 미만, 약 4% 미만, 약 3% 미만, 약 2% 미만 또는 약 1% 미만의 오염 성분을 함유할 때 "실질적으로 정제"될 수 있다. 따라서, "실질적으로 정제된" 관심 있는 성분은 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98% 또는 약 99% 이상의 순도를 가질 수 있다. 예를 들면, 천연 아미노산 폴리펩타이드 또는 비천연 아미노산 폴리펩타이드는 재조합적으로 생성된 천연 아미노산 폴리펩타이드 또는 비천연 아미노산 폴리펩타이드의 경우 천연 세포 또는 숙주 세포로부터 정제될 수 있다. 예를 들면, 천연 아미노산 폴리펩타이드 또는 비천연 아미노산 폴리펩타이드의 제제는 이 제제가 약 30% 미만, 약 25% 미만, 약 20% 미만, 약 15% 미만, 약 10% 미만, 약 5% 미만, 약 4% 미만, 약 3% 미만, 약 2% 미만 또는 약 1% 미만의 오염 물질을 함유할 때 "실질적으로 정제"될 수 있다. 예를 들면, 천연 아미노산 폴리펩타이드 또는 비천연 아미노산 폴리펩타이드가 숙주 세포에 의해 재조합적으로 생성될 때, 천연 아미노산 폴리펩타이드 또는 비천연 아미노산 폴리펩타이드는 세포의 건조 중량의 약 30%, 약 25%, 약 20%, 약 15%, 약 10%, 약 5%, 약 4%, 약 3%, 약 2% 또는 약 1% 이하로 존재할 수 있다. 예를 들면, 천연 아미노산 폴리펩타이드 또는 비천연 아미노산 폴리펩타이드가 숙주 세포에 의해 재조합적으로 생성될 때, 천연 아미노산 폴리펩타이드 또는 비천연 아미노산 폴리펩타이드는 세포의 건조 중량의 약 5 g/ℓ, 약 4 g/ℓ, 약 3 g/ℓ, 약 2 g/ℓ, 약 1 g/ℓ, 약 750 mg/ℓ, 약 500 mg/ℓ, 약 250 mg/ℓ, 약 100 mg/ℓ, 약 50 mg/ℓ, 약 10 mg/ℓ 또는 약 1 mg/ℓ 이하의 양으로 배양 배지에 존재할 수 있다. 예를 들면, "실질적으로 정제된" 천연 아미노산 폴리펩타이드 또는 비천연 아미노산 폴리펩타이드는 SDS/PAGE 분석, RP-HPLC, SEC 및 모세관 전기영동을 포함하나 이들로 한정되지 않는 적절한 방법에 의해 측정될 때 약 30%, 약 35%, 약 40%, 약 45%, 약 50%, 약 55%, 약 60%, 약 65%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95% 또는 약 99% 이상의 순도를 가질 수 있다. 본 발명의 폴리펩타이드 또는 단백질은 부형제(예를 들면, 완충제, 물, 약학적으로 허용가능한 부형제, 그러나 이들로 한정되지 않음)를 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 본 발명의 조작된 핵산, 오르토고날 억제제 tRNA(O-tRNA), 오르토고날 아미노아실 tRNA 합성효소(O-RS), 선택자 코돈 함유 항체 유전자를 포함하는 벡터(예를 들면, 플라스미드, 코스미드, 파지, 바이러스, 그러나 이들로 한정되지 않음)를 제공한다. 한 실시양태에서, 벡터는 발현 벡터이다. 또 다른 실시양태에서, 발현 벡터는 본 발명의 폴리뉴클레오타이드들 중 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 세포는 본 발명의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터를 포함한다. 벡터는 레포터도 포함할 수 있다. 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "레포터"는 관심 있는 시스템의 표적 성분을 선택하는 데 사용될 수 있는 성분을 지칭한다. 예를 들면, 레포터는 형광 스크리닝 마커(예를 들면, 녹색 형광 단백질), 발광 마커(예를 들면, 반딧불이 루시퍼라제 단백질), 친화성 기반 스크리닝 마커 또는 선택 마커 유전자, 예컨대, his3, ura3, leu2, lys2, lacZ, β-gal/lacZ(β-갈락토시다제(galactosidase)), Adh(알코올 데하이드로게나제(dehydrogenase)) 등을 포함할 수 있다.
본 발명의 방법 및 조성물은 유전자, 폴리펩타이드 또는 단백질의 스크리닝 또는 선택을 위한 작용제, 물질 및 마커를 포함할 수 있다. 본원에서 사용된 선택 또는 스크리닝 작용제는 존재할 때 집단으로부터의 특정 성분의 선택/스크리닝을 가능하게 하는 작용제를 지칭한다. 예를 들면, 선택 또는 스크리닝 작용제는 예를 들면, 영양분, 항생제, 광의 파장, 항체, 발현된 폴리뉴클레오타이드(예를 들면, 전사 조절제 단백질) 등을 포함하나 이들로 한정되지 않는다. 선택 작용제는 예를 들면, 농도, 강도 등에 의해 변경될 수 있다. 다른 실시양태에서, 본 발명의 방법 및 조성물은 검출가능한 물질을 포함한다. 검출가능한 물질도 사용될 수 있다. 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "검출가능한 물질"은 활성화되거나, 변경되거나 발현될 때 집단으로부터의 특정 성분의 선택/스크리닝을 가능하게 하는 작용제를 지칭한다. 예를 들면, 검출가능한 물질은 특정 조건, 예를 들면, URA3 레포터의 발현 하에서 검출가능하게 되는 화학적 작용제, 예를 들면, 5-플루오로오로트산(5-FOA), 예를 들면, URA3 레포터를 발현하는 세포를 사멸시키는 독성 생성물일 수 있다. 추가로, 본 발명의 방법, 조성물, 세포 또는 세포주는 양성 및/또는 음성 선택 또는 스크리닝 마커를 포함한다. 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "양성 선택 또는 스크리닝 마커"는 존재할 때, 예를 들면, 발현되거나 활성화될 때 양성 선택 마커를 갖지 않은 세포로부터 양성 선택 마커를 가진 세포를 식별할 수 있게 하는 마커를 지칭한다. 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "음성 선택 또는 스크리닝 마커"는 존재할 때, 예를 들면, 발현되거나 활성화될 때 (예를 들면, 원하는 성질을 가진 세포에 비해) 원하는 성질을 갖지 않는 세포를 식별할 수 있게 하는 마커를 지칭한다.
오르토고날 tRNA 및 오르토고날 아미노아실-tRNA 합성효소
일부 실시양태에서, 본 발명은 오르토고날 아미노아실 tRNA 합성효소(O-RS), 오르토고날 억제제 tRNA(O-tRNA) 및 관심 있는 선택자 코돈 함유 유전자(예를 들면, 항체를 비롯한 생물요법제)를 포함하는 안정한 생산 세포주에 관한 것이다. 유전 코드에 의해 부여된 화학적 제한 이외에, 진핵생물 세포에서 직접적으로 단백질의 구조를 유전적으로 변형시키는 능력은 세포 과정을 프로빙하고 조작하기 위한 강력한 분자 수단을 제공한다. 본 발명은 척추동물 세포에서 유전적으로 코딩된 아미노산의 수를 확장시키는 번역 성분들을 제공한다. 이들은 tRNA(예를 들면, 오르토고날 tRNA(O-tRNA)), 아미노아실-tRNA 합성효소(예를 들면, 오르토고날 합성효소(O-RS), O-tRNA/O-RS의 쌍, 및 비천연 아미노산을 포함한다.
오르토고날 쌍은 O-tRNA, 예를 들면, 억제제 tRNA, 프레임시프트 tRNA 등, 및 O-RS로 구성된다. O-tRNA는 내생성 합성효소에 의해 아실화되지 않고 생체내에서 O-tRNA에 의해 인식되는 선택자 코돈을 포함하는 폴리뉴클레오타이드에 의해 코딩된 단백질 내로의 비천연 아미노산의 도입을 매개할 수 있다. O-RS는 O-tRNA를 인식하고 척추동물 세포에서 우선적으로 O-tRNA를 비천연 아미노산으로 아미노아실화한다. 오르토고날 쌍을 제조하는 방법과 함께 이러한 방법에 의해 생성된 오르토고날 쌍 및 척추동물 세포에서 사용할 오르토고날 쌍의 조성물은 국제 특허출원 공보 제WO 2002/086075호(발명의 명칭: "Methods and compositions for the production of orthogonal tRNA-aminoacyltRNA orthogonal pairs")에 개시되어 있다. 본원에 각각 참고로 도입된 문헌(Forster et al., (2003) Programming peptidomimetic synthetases by translating genetic codes designed de novo PNAS 100(11):6353-6357); 및 문헌(Feng et al., (2003), Expanding tRNA recognition of a tRNA synthetase by a single amino acid change, PNAS 100(10): 5676-5681)도 참조한다. 다수의 오르토고날 tRNA/합성효소 쌍의 개발은 척추동물 세포에서 상이한 코돈들을 사용하여 다수의 비천연 아미노산을 동시에 도입할 수 있게 한다.
오르토고날 tRNA 및 오르토고날 아미노아실-tRNA는 당분야에서 공지되어 있다. 예를 들면, 본원에 각각 참고로 도입된 국제 특허출원 공보 제WO 2008/030612호, 국제 특허출원 공보 제WO 2008/030614호, 국제 특허출원 공보 제WO 2008/030613호, 국제 특허출원 공보 제WO 2006/068802호, 국제 특허출원 공보 제WO 2007/021297호, 국제 특허출원 공보 제WO 2007/070659호, 미국 특허 제8,420,792호, 미국 특허 제9,133,495호, 미국 특허 제7,736,872호, 미국 특허 제7,846,689호, 미국 특허 제7,883,866호, 미국 특허 제7,838,265호, 미국 특허 제7,829,310호, 미국 특허 제7,858,344호, 미국 특허 제7,632,823호 및 미국 특허 제9,586,988호를 참조한다. O-RS의 생성에 대한 추가 상세한 설명은 국제 특허출원 공보 제WO 2002/086075호(발명의 명칭: "Methods and compositions for the production of orthogonal tRNA-aminoacyltRNA synthetase pairs")에서 확인될 수 있다. 문헌(Hamano-Takaku et al., (2000) A mutant Escherichia coli Tyrosyl-tRNA synthetase Utilizes the Unnatural Amino Acid Azatyrosine More Efficiently than Tyrosine, Journal of Biological Chemistry, 275(51):40324-40328); 문헌(Kiga et al. (2002), An engineered Escherichia coli tyrosyl-tRNA synthetase for site-specific incorporation of an unnatural amino acid into proteins in vertebrate translation and its application in a wheat germ cell-free system, PNAS 99(15): 9715-9723); 및 문헌(Francklyn et al., (2002), Aminoacyl-tRNA synthetases: Versatile players in the changing theater of translation; RNA, 8:1363-1372)도 참조한다.
척추동물 세포에서 오르토고날 O-tRNA/O-RS 쌍은 비효율적인 종간 아미노아실화를 가진 상이한 유기체로부터의 한 쌍, 예를 들면, 넌센스 억제제 쌍을 이입함으로써 생성될 수 있다. O-tRNA 및 O-RS는 척추동물 세포에서 효율적으로 발현되고 프로세싱되고, O-tRNA는 핵으로부터 세포질로 효율적으로 이출된다. 예를 들면, 이러한 한 쌍은 이. 콜라이로부터의 티로실-tRNA 합성효소/tRNACUA 쌍이다(예를 들면, 문헌(H. M. Goodman, et al., (1968), Nature 217:1019-24); 및 문헌(D. G. Barker, et al., (1982), FEBS Letters 150:419-23) 참조). 이. 콜라이 티로실-tRNA 합성효소는 사카로마이세스 세레비지애(S. cerevisiae)의 세포질에서 발현될 때 그의 동족 이. 콜라이 tRNACUA를 효율적으로 아미노아실화하나, 사카로마이세스 세레비지애 tRNA를 아미노아실화하지 않는다. 예를 들면, 문헌(H. Edwards, & P. Schimmel, (1990), Molecular & Cellular Biology 10:1633-41); 및 문헌(H. Edwards, et al., (1991), PNAS United States of America 88:1153-6)을 참조한다. 추가로, 이. 콜라이 티로실 tRNACUA는 사카로마이세스 세레비지애 아미노아실-tRNA 합성효소에 대한 좋지 않은 기질이나(예를 들면, 문헌(V. Trezeguet, et al., (1991), Molecular & Cellular Biology 11:2744-51) 참조), 사카로마이세스 세레비지애에서의 단백질 번역에 있어서 효율적으로 작용한다. 예를 들면, 문헌(H. Edwards, & P. Schimmel, (1990) Molecular & Cellular Biology 10:1633-41); 문헌(H. Edwards, et al., (1991), PNAS United States of America 88:1153-6); 및 문헌(V. Trezeguet, et al., (1991), Molecular & Cellular Biology 11:2744-51)을 참조한다. 더욱이, 이. 콜라이 TyrRS는 tRNA에 라이게이션된 비천연 아미노산을 교정하는 편집 기작을 갖지 않는다.
비천연 아미노산
크기, 산도, 친핵성, 수소결합, 소수성, 프로테아제 표적 부위의 접근성, (예를 들면, 단백질 어레이의 경우) 모이어티에 대한 표적 등의 변화를 포함하는, 단백질 구조 및/또는 기능의 변화를 조정하기 위해 비-천연 또는 비천연 아미노산의 도입을 수행할 수 있다. 비천연 아미노산을 포함하는 단백질은 향상된 또는 심지어 전체적으로 새로운 촉매 또는 물리적 성질을 가질 수 있다. 예를 들면, 비천연 아미노산을 단백질 내에 포함시킴으로써 임의적으로 하기 성질을 변형시킨다: 독성, 생체분포, 구조적 성질, 분광학적 성질, 화학적 및/또는 광화학적 성질, 촉매 능력, 반감기(예를 들면, 혈청 반감기), 다른 분자와, 예를 들면, 공유적으로 또는 비공유적으로 반응하는 능력 등. 적어도 하나의 비천연 아미노산을 포함하는 단백질을 포함하는 조성물은 예를 들면, 신규 치료제, 진단제, 촉매 효소, 산업 효소, 결합 단백질(예를 들면, 항체), 및 예를 들면, 단백질 구조 및 기능의 연구에 유용하다. 예를 들면, 문헌(Dougherty, (2000) Unnatural Amino Acids as Probes of Protein Structure and Function, Current Opinion in Chemical Biology, 4:645-652)을 참조한다.
본원에 기재된 방법 및 조성물에서 사용된 비천연 아미노산은 하기 4종의 성질들 중 적어도 하나를 가진다: (1) 비천연 아미노산의 측쇄의 적어도 하나의 작용기는 20종의 일반 유전적으로 코딩된 아미노산들(즉, 알라닌, 아르기닌, 아스파라긴, 아스파르트산, 시스테인, 글루타민, 글루탐산, 글리신, 히스티딘, 이소류신, 류신, 라이신, 메티오닌, 페닐알라닌, 프롤린, 세린, 쓰레오닌, 트립토판, 티로신 및 발린)의 화학적 반응성에 오르토고날하거나, 적어도 비천연 아미노산을 포함하는 폴리펩타이드에 존재하는 천연 생성 아미노산의 화학적 반응성에 오르토고날한 적어도 하나의 특성 및/또는 활성 및/또는 반응성을 갖고; (2) 도입된 비천연 아미노산은 20종의 일반 유전적으로 코딩된 아미노산에 대한 실질적으로 화학적 불활성을 나타내고; (3) 비천연 아미노산은 바람직하게는 천연 생성 아미노산에 비례하는 안정성으로 또는 전형적인 생리학적 조건 하에서 폴리펩타이드 내로 안정하게 도입될 수 있고, 더 바람직하게는 이러한 도입은 생체내 시스템을 통해 일어날 수 있고; (4) 비천연 아미노산은 바람직하게는 비천연 아미노산을 포함하는 폴리펩타이드의 생물학적 성질을 파괴하지 않는 조건 하에서(물론 생물학적 성질의 이러한 파괴가 변형/변환의 목적이 아닌 경우), 또는 변환이 약 4 내지 약 8의 pH에서 수성 조건 하에서 일어날 수 있는 경우, 또는 비천연 아미노산의 반응성 부위가 친전자성 부위인 경우 옥심 작용기, 또는 시약과 반응함으로써 옥심 기로 변환될 수 있는 작용기를 포함한다. 임의의 수의 비천연 아미노산을 폴리펩타이드 내로 도입할 수 있다. 비천연 아미노산은 보호된 또는 차폐된 옥심, 또는 보호된 기의 탈보호 또는 차폐된 기의 탈차폐 후 옥심 기로 변환될 수 있는 보호된 또는 차폐된 기도 포함할 수 있다. 비천연 아미노산은 보호된 기의 탈보호 또는 차폐된 기의 탈차폐 후 카보닐 또는 디카보닐 기로 변환됨으로써, 하이드록실아민 또는 옥심과 반응하여 옥심 기를 형성하도록 이용될 수 있는 보호된 또는 차폐된 카보닐 또는 디카보닐 기도 포함할 수 있다.
본원에 기재된 방법 및 조성물에서 사용될 수 있는 비천연 아미노산은 신규 작용기를 가진 아미노산, 다른 분자와 공유적으로 또는 비공유적으로 상호작용하는 아미노산, 글리코실화된 아미노산, 예컨대, 당 치환된 세린, 다른 탄수화물 변형된 아미노산, 케토 함유 아미노산, 알데하이드 함유 아미노산, 폴리에틸렌 글리콜 또는 다른 폴리에테르를 포함하는 아미노산, 중원자 치환된 아미노산, 화학적으로 절단될 수 있고/있거나 광절단될 수 있는 아미노산, 약 5개 초과 또는 약 10개 초과의 탄소를 포함하나 이들로 한정되지 않는 폴리에테르 또는 장쇄 탄화수소를 포함하나 이들로 한정되지 않는, 천연 아미노산에 비해 연장된 측쇄를 가진 아미노산, 탄소-결합된 당 함유 아미노산, 산화환원 활성 아미노산, 아미노 티오산 함유 아미노산, 및 하나 이상의 독성 모이어티를 포함하는 아미노산을 포함하는 아미노산들을 포함하나 이들로 한정되지 않는다.
일부 실시양태에서, 비천연 아미노산은 사카라이드 모이어티를 포함한다. 이러한 아미노산의 예는 N-아세틸-L-글루코사미닐-L-세린, N-아세틸-L-갈락토사미닐-L-세린, N-아세틸-L-글루코사미닐-L-쓰레오닌, N-아세틸-L-글루코사미닐-L-아스파라긴 및 O-만노사미닐-L-세린을 포함한다. 이러한 아미노산의 예는 아미노산과 사카라이드 사이의 천연 생성 N-결합 또는 O-결합이 알켄, 옥심, 티오에테르, 아미드 등을 포함하나 이들로 한정되지 않는, 자연에서 통상적으로 발견되지 않는 공유결합으로 대체되어 있는 예도 포함한다. 이러한 아미노산의 예는 천연 생성 단백질에서 통상적으로 발견되지 않는 사카라이드, 예컨대, 2-데옥시-글루코스, 2-데옥시갈락토스 등도 포함한다.
비천연 아미노산의 구체적인 예는 p-아세틸-L-페닐알라닌, p-프로파르길옥시페닐알라닌, O-메틸-L-티로신, L-3-(2-나프틸)알라닌, 3-메틸-페닐알라닌, O-4-알릴-L-티로신, 4-프로필-L-티로신, 트리-O-아세틸-GlcNAcβ-세린, L-Dopa, 불소첨가된 페닐알라닌, 이소프로필-L-페닐알라닌, p-아지도-L-페닐알라닌, p-아실-L-페닐알라닌, p-벤조일-L-페닐알라닌, L-포스포세린, 포스포노세린, 포스포노티로신, p-요오도-페닐알라닌, p-브로모페닐알라닌, p-아미노-L-페닐알라닌 및 이소프로필-L-페닐알라닌 등을 포함하나 이들로 한정되지 않는다.
이러한 폴리펩타이드 내로의 비천연 아미노산의 도입을 통해 폴리펩타이드 내로 도입된 화학적 모이어티는 폴리펩타이드의 다양한 장점들 및 조작을 제공한다. 예를 들면, (케토 작용기 또는 알데하이드 작용기를 비롯한) 카보닐 또는 디카보닐 작용기의 특유의 반응성은 생체내에서 및 시험관내에서 다수의 하이드라진 또는 하이드록실아민 함유 시약들 중 임의의 하이드라진 또는 하이드록실아민 함유 시약을 사용한 단백질의 선택적 변형을 가능하게 한다. 중원자 비천연 아미노산은 예를 들면, x-선 구조 데이터의 위상조정에 유용할 수 있다. 비천연 아미노산을 사용한 중원자의 부위 특이적 도입은 중원자에 대한 위치를 선택함에 있어서 선택성 및 유연성도 제공한다. (벤조페논 및 아릴아지드(페닐아지드를 포함하나 이것으로 한정되지 않음) 측쇄를 가진 아미노산들을 포함하나 이들로 한정되지 않는) 광반응성 비천연 아미노산은 예를 들면, 폴리펩타이드의 효율적인 생체내 및 시험관내 광가교결합을 허용한다. 광반응성 비천연 아미노산의 예는 p-아지도-페닐알라닌 및 p-벤조일-페닐알라닌을 포함하나 이들로 한정되지 않는다. 그 다음, 광반응성 비천연 아미노산을 가진 폴리펩타이드는 광반응성 기 제공 일시적 대조군의 여기에 의해 마음대로 가교결합될 수 있다. 비한정적 예에서, 비천연 아미노산의 메틸 기는 핵 자기 공명 및 진동 분광법의 이용을 포함하나 이들로 한정되지 않는, 국소 구조 및 동력학의 프로브로서, 메틸 기를 포함하나 이것으로 한정되지 않는 방사성 표지로 치환될 수 있다.
진핵생물 세포에 의한 비천연 아미노산 흡수는 폴리펩타이드 또는 단백질 내로의 도입을 포함하나 이것으로 한정되지 않는 목적으로 비천연 아미노산을 디자인하고 선택할 때 전형적으로 고려되는 한 문제이다. 예를 들면, α-아미노산의 높은 전하 밀도는 이 화합물이 세포를 투과할 가능성이 거의 없다는 것을 암시한다. 천연 아미노산은 단백질 기반 수송 시스템의 집합체를 통해 진핵생물 세포 내로 흡수될 수 있다. 만약 흡수된다면, 어느 비천연 아미노산이 세포에 의해 흡수되는 지를 평가하는 신속한 스크린을 수행할 수 있다. 예를 들면, 전체로서 본원에 참고로 도입된 미국 특허 공보 제2004/198637호(발명의 명칭: "Protein Arrays"), 및 문헌(Liu, D.R. & Schultz, P.G. (1999) Progress toward the evolution of an organism with an expanded genetic code. Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 96:4780-4785)에 기재된 독성 어세이를 참조한다. 흡수가 다양한 어세이들에 의해 용이하게 분석될지라도, 세포 흡수 경로에 의해 흡수되기 쉬운 비천연 아미노산을 디자인하는 것의 대안은 생체내에서 아미노산을 생성하는 생합성 경로를 제공하는 것이다.
전형적으로, 본원에 기재된 바와 같이 세포 흡수를 통해 생성된 비천연 아미노산은 천연 세포 양을 포함하나 이것으로 한정되지 않는, 효율적인 단백질 생합성에 충분한 농도이되, 다른 아미노산의 농도에 영향을 미치거나 세포 자원을 고갈시킬 정도가 아닌 농도로 생성된다. 이 방식으로 생성된 전형적인 농도는 약 10 mM 내지 약 0.05 mM이다.
아미노산 및 다른 화합물을 생성하는 많은 생합성 경로들이 이미 세포에 존재한다. 특정 비천연 아미노산에 대한 생합성 방법이 세포를 포함하나 이것으로 한정되지 않는 자연에 존재하지 않을 수 있지만, 본원에 기재된 방법 및 조성물은 이러한 방법을 제공한다. 예를 들면, 비천연 아미노산에 대한 생합성 경로는 신규 효소를 첨가하거나 기존 숙주 세포 경로를 변형시킴으로써 숙주 세포에서 생성될 수 있다. 추가 신규 효소는 천연 생성 효소 또는 인공적으로 진화된 효소를 포함한다. 예를 들면, (국제 특허출원 공보 제WO 2002/085923호(발명의 명칭: "In vivo incorporation of unnatural amino acids")에서 일례로서 제시된) p-아미노페닐알라닌의 생합성은 다른 유기체로부터의 공지된 효소들의 조합의 첨가에 의존한다. 이 효소들에 대한 유전자는 이 유전자를 포함하는 플라스미드로 세포를 형질전환시킴으로써 진핵생물 세포 내로 도입될 수 있다. 상기 유전자는 세포에서 발현될 때 원하는 화합물을 합성하는 효소 경로를 제공한다. 임의적으로 첨가된 효소의 종류의 예는 본원에 제공되어 있다. 추가 효소 서열은 예를 들면, 진뱅크에서 확인된다. 인공적으로 진화된 효소는 동일한 방식으로 세포 내로 첨가될 수 있다. 이 방식으로, 세포의 세포 기구 및 자원을 조작하여 비천연 아미노산을 생성한다.
다양한 방법들이 생합성 경로에서 사용될 신규 효소의 생성 또는 기존 경로의 진화를 위해 이용될 수 있다. 예를 들면, 맥시젠 인코포레이티드(Maxygen, Inc.)에 의해 개발된 반복 재조합(월드 와이드 웹(maxygen.com)에서 입수될 수 있음)을 포함하나 이것으로 한정되지 않는 반복 재조합을 이용하여 신규 효소 및 경로를 개발할 수 있다. 예를 들면, 문헌(Stemmer (1994), Rapid evolution of a protein in vitro by DNA shuffling, Nature 370(4):389-391); 및 문헌(Stemmer, (1994), DNA shuffling by random fragmentation and reassembly: In vitro recombination for molecular evolution, Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 91:10747-10751)을 참조한다. 유사하게, 세포에서 비천연 아미노산을 생성하기 위해 경로를 조작하는 것을 포함하나 이것으로 한정되지 않는 대사 경로 조작을 위해 제넨코르(Genencor)에 의해 개발된 디자인패쓰(DesignPath)™(월드 와이드 웹(genencor.com)에서 입수될 수 있음)를 임의적으로 이용한다. 이 기술은 기능 유전체학, 분자 진화 및 디자인을 통해 확인된 신규 유전자들을 포함하나 이들로 한정되지 않는 신규 유전자들의 조합을 사용하여 숙주 유기체에서 기존 경로를 재구축한다. 다이버사 코포레이션(Diversa Corporation)(월드 와이드 웹(diversa.com)에서 입수가능함)은 비천연 아미노산을 생합성적으로 생성하기 위해 신규 경로를 생성하는 것을 포함하나 이것으로 한정되지 않는 목적으로 유전자 및 유전자 경로의 라이브러리를 신속히 스크리닝하는 기술도 제공한다.
전형적으로, 본원에 기재된 바와 같이 조작된 생합성 경로에 의해 생성된 비천연 아미노산은 천연 세포 양을 포함하나 이것으로 한정되지 않는, 효율적인 단백질 생합성에 충분한 농도이되, 다른 아미노산의 농도에 영향을 미치거나 세포 자원을 고갈시킬 정도가 아닌 농도로 생성된다. 이 방식으로 생체내에서 생성된 전형적인 농도는 약 10 mM 내지 약 0.05 mM이다. 일단 세포가 특정 경로를 위해 요구된 효소를 생성하기 위해 사용된 유전자를 포함하는 플라스미드로 형질전환되고 비천연 아미노산이 생성되면, 생체내 선택을 임의적으로 이용하여, 리보좀 단백질 생합성 및 세포 성장 둘 다를 위한 비천연 아미노산의 생성을 더 최적화한다. 본원에 기재된 비천연 아미노산은 당분야에 기재된 방법을 이용함으로써, 또는 본원에 기재된 기법을 이용함으로써, 또는 이들을 병용함으로써 합성될 수 있다.
생성물 특징규명
생물요법제의 포괄적인 특징규명은 규제 관청에 의해 설정된 안전성 기준을 충족시키고 단백질 약물 효능을 보장하는 것을 돕는 데 필요하다. 약물 개발 및 제조의 모든 단계들 전체에서 생물약학 특징규명이 요구된다. 따라서, 생성물 품질 및 생산성이 종종 클론 및 세포 배양 조건 둘 다에 의존하기 때문에 정확한 클론이 선택되는 것을 보장하기 위해 세포주 개발, 조작 및 세포 배양 공정 개발의 각각의 단계 동안 생성물 품질을 모니터링하는 것이 가장 중요하다. 클론 선택 공정 동안, 클론 특이적일 가능성이 높은 생성물 품질 파라미터가 강조된다. 이 파라미터는 예를 들면, 효소 사용 공정, 예컨대, 글리코실화 및 단백질용해성 절단, 및 유전적 문제, 예컨대, 돌연변이, 프레임시프트 및 스플라이스를 포함하나 이들로 한정되지 않는다. 생물학적 활성에 기여하는 것으로 공지되어 있는 분자 파라미터도 강조된다. 예를 들면, 항체 의존적 세포 세포독성(ADCC)은 푸코실화에 의존하고, 보체 의존적 세포독성(CDC)은 갈락토실화에 의존한다. 화학적 변형, 예컨대, 산화 또는 탈아미드화의 정도에 있어서 클론들 사이의 관찰된 차이는 정제 공정 최적화 또는 세포 배양 공정 파라미터의 조절을 통해 좁혀질 수 있거나 제거될 수 있고, 덜 유의미할 것이다(Lewis et al, 2010).
본 발명의 실시양태에서, 생물요법제를 발현하는 세포 또는 세포주의 생성물 품질에 대한 CRISPR-Cas9 게놈 편집 및 단일 세포 클로닝의 영향이 조사된다. CRISPR-Cas9 조작된 세포의 클론 선택 동안 평가된 생성물 품질 속성은 분자 통합성, 응집, 글리코실화 및 전하 불균질성을 포함할 수 있으나 이들로 한정되지 않는다. 분자 통합성은 클론 의존적이고 유전적 문제 또는 단백질용해성 절단에 의해 야기될 수 있다. 당분야에서 숙련된 자에게 모두 잘 공지되어 있는 다양한 방법들, 기법들 및 어세이들을 이용하여, 아미노산 서열 돌연변이 또는 절두된 항체를 피하기 위한 기준으로 분자 통합성을 평가할 수 있다. 이러한 방법들, 기법들 및 어세이들은 cDNA 시퀀싱, 펩타이드 맵핑, CE-SDS 또는 SDS-PAGE를 포함할 수 있으나 이들로 한정되지 않는다. 응집은 예를 들면, 크기 배제 크로마토그래피(SEC)를 이용함으로써 측정될 수 있다. 이 분석을 위한 기준은 면역원성을 나타낼 수 있는 고도의 응집을 피하는 것이다. 일부 수준의 응집은 세포 배양 공정 최적화에 의해 감소될 수 있거나 정제 공정 최적화를 통해 제거될 수 있다. 글리코실화는 세포주에 강하게 의존하는 또 다른 중요한 분자적 및 번역 후 속성이다. 당분야에서 잘 공지되어 있는 HPLC 또는 CE 기반 글리칸 어세이는 고도의 비정상적 글리코실화 형태를 피하는 것을 목적으로 클론 선택 단계에서 글리코실화 평가를 위해 통상적으로 이용된다. 화학적 변형(들)으로 인해 생길 수 있는 전하 불균질성은 세포 배양 공정에 강하게 의존하므로, 클론 선택 단계 동안 덜 유의미한 역할을 가진다. 따라서, 본 발명의 개시의 실시양태에서, 예를 들면, 항-Her2, 항-CD70 또는 항-PSMA 발현 세포 또는 세포주를 포함하나 이들로 한정되지 않는, 본 발명의 생물요법제를 발현하는 세포 또는 세포주의 클론 특이적 생성물 품질 파라미터를 확인하는 방법, 기법 및 어세이가 제공된다.
온전한 질량 분광측정(MS)은 단백질의 정확한 질량 및 이의 이소폼의 상대적 존재도에 대한 정보를 제공한다. 분자 체 크로마토그래피로서도 공지되어 있는 크기 배제 크로마토그래피(SEC)는 용액 중의 분자들을 이들의 크기 및 일부 경우 분자량에 따라 분리하는 크로마토그래피 방법이다. 본 발명에서, MS는 생성된 조작된 클론 및 모세포주에 대한 일차 아미노산 서열이 mAb의 식별을 확인하는 데 있어서 cDNA 서열로부터 유추된 아미노산 서열과 동일하다는 것을 입증하는 데 이용되었다. SEC도 생성된 단일클론 항체(mAb)의 순도 및 제조 일관성의 측정을 위해 변형되고 이용되었다.
키트
키트가 본 발명의 성분들 중 임의의 성분을 함유하는 하나 이상의 용기를 포함하는 경우 키트도 본 발명의 한 특징이다. 키트는 오르토고날 아미노아실 tRNA 합성효소(O-RS), 및/또는 오르토고날 억제제 tRNA(O-tRNA), 및/또는 관심 있는 선택자 코돈 함유 유전자를 포함하거나 코딩하는 하나 이상의 조작된 핵산 분자 또는 폴리뉴클레오타이드 서열을 함유할 수 있다. 키트는 적어도 하나의 비천연 아미노산을 포함할 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 키트는 오르토고날 아미노아실 tRNA 합성효소(O-RS), 오르토고날 억제제 tRNA(O-tRNA) 또는 관심 있는 선택자 코돈 함유 유전자와 함께 또는 따로 세포 또는 세포주를 함유할 수 있다. 본원에 개시된 임의의 성분 및 물질은 하나 이상의 용기 내에 따로 또는 함께 제공될 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 키트는 관심 있는 폴리펩타이드 또는 단백질을 생성하기 위한 설명 자료도 포함한다.
실시예
본원에 기재된 실시예 및 실시양태는 예시 목적을 위한 것일 뿐이고 이러한 실시예 및 실시양태에 비추어 볼 때 다양한 변형 또는 변화가 당분야에서 숙련된 자에게 암시될 것이고 본원의 사상 및 관점, 및 첨부된 청구범위 내에 포함되어야 한다는 것이 이해된다.
실시예 1: 약물 개발 산업에서 발견부터 제조까지 플랫폼 세포주 조작을 이용하는 전략
산업 관점에서 볼 때, 플랫폼 세포주는 단계 적절한 물질을 제공함으로써 약물 개발의 모든 단계를 뒷받침할 뿐만 아니라, 병원에의 생성물의 소개 및 상업화 전에 안정한 잘 특징규명된 생산 세포주도 생성한다(도 1). 약물 개발의 모든 단계를 효율적으로 뒷받침하기 위해, 일시적인, 안정한 벌크 풀, 안정한 세포주를 포함하는 물질을 제공하기 위해 개발된 다수의 방식들을 도 1에 예시된 바와 같이 개발하였다. 항체 후보 분자 선택을 위해, 일시적인 발현을 이용하여 소량의 생성물을 신속히 제공하였다. 안정한 벌크 풀은 8주 이내에 IND를 가능하게 하는 독성학 연구(100 내지 200 g)까지 개발가능성 연구(정제, 제제화, 분석 방법 개발)를 위해 다량의 물질을 제공하기 위한 대안이다. 일단 선도 분자가 확인되면, 안정한 세포주를 최대 1.5 g/ℓ의 역가로 6개월 이내에 생성하였다. 이것은 임상 시험 및 잠재적 상업화를 뒷받침한다.
실시예 2: 고생산 세포주의 개발에 있어서 플랫폼 세포주를 사용하는 일반적인 절차
도 2는 안정한 세포주 개발을 위한 순서도를 보여준다. 본 발명자들은 이 전략을 이용하여, 산업 표준 제조까지 규모 확장될 수 있는 고생산 안정한 잘 특징규명된 생산 세포주를 생성함으로써, 치료제의 원하는 안전성 및 효능 프로파일을 유지하면서 임상 시험 및 상업화를 뒷받침하였다. 관심 있는 유전자(GOI) 및 선택 마커(들)를 보유하는 포유동물 발현 벡터를 조작된 CHO 플랫폼 세포주 내로 형질감염시켜, 96-웰에서 미니-풀(MP)을 생성하였다. 선택 및 스크리닝 후, 클론 세포주를 유도하기 위해 FACS에 이은 고해상 영상화를 이용하여 웰당 단일 세포로서 상위 MP를 플레이팅하였다. 단일 세포로부터 유도된 세포주를 스크리닝하였고, 공정 개발을 위해 상위 클론을 세포 배양 연구진에게 전달하였다. 임상 물질을 제조하기 위한 최종 클론 선택은 성장, 생산성 및 PQ를 기준으로 수행되었다. 전체 CLD 공정은 6개월이 소요되고, 세포 특이적 생산성은 하루에 세포당 20 내지 30 피코그램이었다. 12,000 ℓ 생물반응기 제조를 뒷받침할 정도로 10주 초과의 기간 동안 안정하지만, 세포주 및 유가식 공정은 계속되는 임상 시험을 뒷받침하기 위해 현재까지 2000 ℓ까지 규모 확장될 수 있다.
실시예 3: 고생산 세포주 개발의 최적화
고생산 세포주 개발의 최적화는 여러 양태들, 예컨대, FACS 의존적 단일 세포 침착(도 3의 A), CRISPR 넉아웃 절차(도 3의 B) 및 세포주 개발 공정 최적화(도 3의 C)로부터 달성될 수 있다.
규제 안내서(ICH Q5D)는 세포주 개발 동안 "단일 세포 전구체로부터" 세포 기질을 클로닝하도록 지시한다. 지난 수년에 걸쳐, 클론성의 높은 확신을 제공할 것이라는 기대가 FDA 및 산업에 의해 확립되었다(Kennett, 2014; Novak, 2017; Welch, 2017). FDA는 충분히 낮은 시딩 밀도(<0.5개 세포/웰)에서 2 라운드의 제한 희석 클로닝(LDC)이, 세포주가 클론 세포주일 허용가능한 가능성을 제공한다고 제안하였다. 보다 최근에, 충분한 뒷받침 정당화, 예컨대, 영상화 기술의 이용과 함께 FACS 또는 LDC를 통한 1 라운드의 클로닝은 검증된 방법을 이용할 때 클론성의 허용가능한 확신을 제공하였다. 따라서, 본 발명자들은 타임 라인을 단축하고 클론성의 확신을 위한 규제 요건을 충족하기 위해 세포주 개발 공정에서 1 라운드의 클로닝 단계로서 고해상 영상화와 커플링된 FACS 단일 세포 침착(FACS SCD)을 변형시키고 검증하였다.
여기에 나타낸 바와 같이(도 3의 A), FACS SCD는 전통적인 제한 희석 클로닝(LDC)에 비해 필적할만한 침착 및 과다성장률을 생성하였다. 그러나, FACS 방법을 이용한 단일클론 과다성장 단리의 효율(웰의 총수로 나누어진, 단일 세포로부터 유래한 콜로니를 함유하는 웰의 수의 비)은 LDC를 이용한 단일클론 과다성장 단리의 효율의 1.5배이므로(49% 대 32%), 영상화 및 스크리닝 시 상당한 시간 및 자원을 절약한다. 각각의 웰에 대한 철저한 영상 분석과 함께 FACS 기계사용 및 원심분리 g-힘 변경의 광범위한 최적화를 수행하여 상기 방법을 검증하였다. 단일 세포로부터 유래한 콜로니의 단일클론성의 가능성은 >99.5%인 것으로 관찰되었다.
원하는 생성물 품질을 유지하면서 세포 성장 및 생산성을 개선하기 위해 CRISRR-cas9 게놈 편집 기술을 이용한 생산 세포주의 유전적 조작을 시험하여 일군의 유전자들을 표적화하였다. CRISPR 넉아웃 절차는 도 3의 B에 예시되어 있다. 웹 기반 표적 발견 수단인 CRISPy를 이용하여, CHO-K1 세포에서 제로 표적이탈로 바람직하게는 초기 엑손에서 gRNA 표적 서열을 용이하게 확인하였다. gRNA를 Cas9의 CHO 코돈 최적화된 버전과 함께 발현되도록 포유동물 발현 벡터 pGNCV 내에 클로닝하였다. 생산 세포주를 벡터 pGNCV로 형질감염시켜 세포의 풀을 생성한 후, 클로닝하여 유전자 넉아웃을 가진 단일 세포 단리물을 확인하였다. 다수의 프로젝트들의 복합 결과로부터의 indel(삽입/결실) 빈도는 세포의 풀 및 단일 세포 단리물에 대해 각각 30% 내지 90% 및 50% 내지 80%이었다. 웨스턴 블롯은 DNA 시퀀싱에 의해 검증된 넉아웃 단일 세포 단리물에 대한 넉아웃 효율을 50% 내지 90%로서 재확인시켜주었다. cGMP 제조를 위한 생산 클론을 선택하기 위해 생산성, 성장, 아폽토시스 어세이 및 생성물 품질에 대해 넉아웃 단일 세포 클론을 더 평가하였다. 생산 세포주를 사용하여, 넉아웃을 위해 사용된 검증된 표적을 시험하였다. 이것은 생산성 및 성장의 평가에 유리한 것으로 입증되었고, 플랫폼 세포주 숙주에서 CRISPR을 이용하여 파괴함으로써, 향후 관심 있는 유전자에 대한 고생산 세포주 단리의 효율을 증가시키는 데에 적용될 수 있었다.
세포주 개발 공정도 플랫폼 세포주 진전과 함께 최적화되었다. 숙주로서 제1 플랫폼 세포주를 사용하여, 역가 0.5 내지 1 g/ℓ를 생성하는 생산 세포주를 생성하기 위해 3개 또는 4개의 단계들(또는 9개월 내지 12개월)이 요구되었다(도 3의 C). 본 세포주 개발 공정은 도 2에 예시된 바와 같이 개선된 플랫폼 세포주 및 1-단계 클로닝으로 인해 2개 단계 또는 6개월까지 단축되었다.
실시예 4: 플랫폼 세포주는 배양물에서 과도한 아폽토시스를 나타낸다.
아넥신 V 어세이를 이용하여, CHO-S 세포, 및 파라-아세틸-L-페닐알라닌에 특이적인 유전적으로 도입된 오르토고날 쌍의 tRNA/아미노아실-tRNA 합성효소를 함유하는 플랫폼 세포주 4E2의 생존율을 평가하였다. 도 4에 나타낸 바와 같이, CHO-S 세포(생존율은 96%임)에 비해, 4E2는 과도한 아폽토시스를 나타내었다(생존율은 85%임). 관찰결과는 (예를 들면, 비천연 아미노산 파라-아세틸알라닌인 pAF에 특이적인) 도입된 tRNA 합성효소 및 tRNA 쌍을 가진 4E2 세포가 그의 대응물 세포인 CHO-S 세포보다 과도한 아폽토시스를 나타내었다는 것을 보여준다.
실시예 5: BAX-CRISPR 및 BAK-CRISPR 구축물의 디자인 및 제조
BAX 또는 BAK 유전자 내의 표적 부위를 인식하고 형질감염 후 CHO 세포에서 이중 가닥 절단을 만들도록 CRISPR 구축물을 디자인하였다. 예시적 디자인은 도 5, 6 및 7에 표시되어 있다.
순차적인 또는 동시적인 절차를 이용하여 유전자의 넉아웃을 수행할 수 있다. BAX 및 BAK 이중 넉아웃도 순차적인 넉아웃 절차에 의해 달성될 수 있다. 일반적으로, 제1 단계는 3개의 BAX 표적화된 gRNA 구축물들을 항-HER2 발현 세포주에 적용하는 것이다. 동시적인 넉아웃 절차에서 이용된 하기 유사한 생성 후, BAX 넉아웃을 가진 세포주를 단리한다. 이 세포주를 사용하여, 2개의 BAK 표적화된 gRNA 구축물들을 적용하여 BAK 넉아웃을 달성한다. 게놈 DNA 시퀀싱에 의한 검증 후, BAX 및 BAK 이중 넉아웃 세포주는 이러한 순차적 절차에 의해 달성되는 것으로 확인된다.
CHO 세포 내의 표적화된 BAX 유전자의 CRISPR gRNA 디자인은 도 5에 예시되어 있다. 표시된 바와 같이, CHO-K1 게놈에 특이적인 온라인 CRISPR gRNA 디자인 수단(월드 와이드 웹(staff.biosustain.dtu.dk/laeb/crispy/) 참조)을 이용하여 CHO 세포에서 BAX 유전자를 표적화하는 3개의 gRNA 부위들을 디자인하였다. BAX 유전자의 게놈 DNA 서열, 엑손 1 및 엑손 2는 회색 음영으로 표시되어 있다. BAX의 다른 서열은 평범한 글자체로 표시되어 있다. PCR 시퀀싱에서 사용된 프라이머는 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머로서 각각 서열의 시작 및 말단에 표시되어 있다. 표 1에 나타낸 바와 같이, 3개의 BAX 부위들(도 7에 나타낸 바와 같이, 각각은 19-뉴클레오타이드 길이 서열을 갖고, -NGG PAM(프로토스페이서 인접 모티프) 서열은 절단 개방되고 2개의 스티키(sticky) 말단을 가진 플라스미드 pGCNV의 성질로 인해 디자인 동안 누락됨)은 다음과 같다: 부위-I(AGGCACTCGCTCAACTTCG)(서열번호 1), 부위-II(TGAGTGTGACCGGCTGTTG)(서열번호 2) 및 부위-III (TTTCATCCATGTATCGAGCT)(서열번호 3).
도 6에 표시된 바와 같이, CRISPR을 이용하여, CHO 세포 내의 표적화된 BAK 유전자의 gRNA를 디자인하였다. 도 6은 CHO 세포 내의 BAK 유전자의 게놈 DNA 서열을 보여주고, 이때 2개의 gRNA 서열들은 주석이 달려 있다. BAK 유전자의 게놈 DNA 서열, 엑손 2 및 엑손 3은 회색 음영으로 표시되어 있다. BAK의 다른 서열은 평범한 글자체로 표시되어 있다. PCR 시퀀싱에서 사용된 프라이머는 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머로서 각각 서열의 시작 및 말단에 표시되어 있다. 표 1에 표시된 3개의 BAK 부위들은 다음과 같다: (서열번호 4) BAK-IGAACAAATTGTCCATCTCG 엑손 2, (서열번호 5) BAK-IIATGCTGTAAGAACGGGAGT 엑손 3, (서열번호 6) BAK-IIIGAAGCCGGTCAAACCACGT 엑손 3.
상업적으로 입수가능한 벡터인 진아트 CRISPR 뉴클레아제 벡터(pGCNV)(써모 피셔 사이언티픽)를 사용하여 BAX 또는 BAK 넉아웃 실험에서 사용된 CRISPR 플라스미드도 도 7에 표시된 바와 같이 디자인하였다. 올리고 이중체를 위한 틈을 함유하고 유전자 부위를 개별적으로 표적화하기 위해 특이적 19-뉴클레오타이드 길이 gRNA 서열을 갖도록 디자인된 절단 개방된 pGCNV 벡터 내로 올리고 이중체를 삽입함으로써 pGCNV 플라스미드의 완전한 형태를 제조하였다.
pGCNV 내로 삽입될 수 있는 올리고 이중체를 형성하기 위해, 하기 표 3에 개시된 다섯(5)개의 올리고 쌍들을 합성하였다.
Figure pct00004
이중 가닥 올리고뉴클레오타이드를 생성하기 위해, 각각의 올리고 쌍을 4분 동안 95℃에서 올리고뉴클레오타이드 어닐링 완충제에서 50 μM의 최종 농도로 항온처리한 후, 5분 내지 10분 동안 25℃까지 냉각시킨다. 10배 희석(5 μM) 후, 라이게이션 절차에서 올리고뉴클레오타이드 이중체를 사용할 수 있다. 로슈(Roche) 신속 라이게이션 키트(로슈)를 사용하여 라이게이션을 수행할 수 있다. 3 ㎕의 pGCNV 벡터, 1 ㎕의 올리고 이중체, 2 ㎕의 DNA 희석 완충제, 4 ㎕의 물, 10 ㎕의 T4 DNA 리가제 완충제 및 1 ㎕의 T4 리가제를 함유하는 21 ㎕ 반응에서, 반응 혼합물을 5분 동안 실온에서 항온처리하였다. 3 ㎕의 라이게이션 혼합물을 이. 콜라이의 형질전환에 사용하여 양성 클론에 대해 스크리닝할 수 있다.
실시예 6: 본 발명에서 사용된 비천연 아미노산의 예
본 발명은 본원의 다른 곳에서 논의된 오르토고날 아미노아실-tRNA 합성효소/전달 RNA 쌍을 사용하여 비정규 또는 비천연 아미노산을 관심 있는 유전자에 부위 특이적으로 도입하는 것을 수반한다. 도 8은 사용될 수 있는 대표적인 다수의 비천연 아미노산들을 제공한다. 예시적 방식으로, 하나의 이러한 비천연 아미노산 파라-아세틸-L-페닐알라닌(pAF)을 배양 배지에 첨가하여, pAF의 부위 특이적 도입으로 관심 있는 완전히 조립된 유전자, 예를 들면, 단일클론 항체를 비롯한 생물요법제의 생성을 시작하였다.
실시예 7: BAX/BAK 결핍 항-HER2 발현 세포주의 생성 및 분석
CRISPR 기술을 이용하여 BAX 및 BAK의 동시적 제거를 수행하였다. 3개의 BAX 표적화된 gRNA 구축물들 및 2개의 BAK 표적화된 gRNA 구축물들을 사용하여, 항-HER2 발현 세포주 L082에 대한 일시적 형질감염을 수행하였다. 전기천공으로 플라스미드의 형질감염을 수행하였다. 전기천공 동안, 6백만 개의 세포들을 100 ㎕의 전기천공 용액에서 2 ㎍의 DNA 플라스미드와 혼합하였다. 프로그램 U-023을 사용하여 아막사 뉴클레오펙터(Amaxa Nucleofector) II(론자(Lonza))에서 세포를 형질감염시키고 0.5 ㎖의 따뜻한 배지에 회수하였다. 실시예 3에 개시된 바와 같이 넉아웃 효율을 측정하기 위해 세포의 형질감염된 풀에 대한 서베이어를 수행하였다(도 3의 B). 2개의 BAK 표적화된 gRNA 구축물들과 함께 3개의 BAX 표적화된 gRNA 구축물들을 동시에 사용하여 형질감염시킨 지 7일 후, 제한 희석 방법을 이용하여 세포를 96-웰 플레이트에서 0.5개 세포/웰의 시딩 밀도로 단일 클론으로 서브클로닝하였다. 96-웰 플레이트에서 각각의 단일 세포를 약 2주 내지 3주 동안 성장시켜, 추가 유전적 분석을 위해 사용될 충분한 수의 세포를 생성하였다. 단일 세포로부터 유래한 클론을 선택하였고, 표적화된 DNA 시퀀싱으로 생산성, 성장 및 유전형분석에 대해 96-웰, 24-웰 및 24-딥웰을 통해 스크리닝하였다.
실시예 8: BAX 및 BAK 결핍 항-HER2 발현 클론의 DNA 분석
BAX 및 BAK 불활성화된 CHO 세포를 생성하였고 유전자 수준에서 분석하였다. BAK 부위를 표적화하는 3개의 상이한 gRNA 서열들을 코딩하는 3개의 플라스미드들을, pAF-RS 및 pAF-tRNA와 함께 항-HER2 유전자 또는 이의 단편을 갖도록 조작된 CHO 세포 유래의 안정한 세포주 내로 함께 형질감염시켰다. 형질감염시킨 지 72시간 후, 게놈 DNA를 단리하였고, 올리고 K-I-II-F 및 K-I-II-R(표 2; 5'-CAGACAGCCTTCTCTTGCT-3'(서열번호 45) 및 5'-AGAGCTCCTGAGAGGCATGA-3'(서열번호 46))를 사용하여 BAK 좌위의 부분을 PCR 증폭하였다. 푸전 하이-피델리티(Phusion High-Fidelity) PCR 마스터 혼합물(뉴 잉글랜드 바이오랩스(New England Biolabs), 매사추세츠주 입스위치 소재)을 사용하여 PCR을 수행하였다. 조건은 다음과 같았다: 2분 동안 95℃에서 초기 변성 후, 20초 동안 95℃ 변성, 그 다음 60℃에서 30초 어닐링 단계, 및 그 다음 72℃에서 1분 연장을 이용하여 30 주기의 PCR을 수행하였다. 30 주기 후, 반응물을 5분 동안 72℃에서 항온처리한 후, 4℃에서 무기한으로 항온처리하였다. 넉아웃 효율을 평가하기 위해 PCR 생성물을 서베이어 어세이 분석에서 사용하였다. IDT(인티그레이티드 DNA 테크놀로지(Integrated DNA Technology), 캘리포니아주 샌디에고 소재)로부터의 서베이어 돌연변이 검출 키트를 사용하여 서베이어 어세이 검출을 수행하였다. 가열된 올리고 혼합물의 천연 냉각 절차를 모방하기 위해 열순환기를 이용하여 이종이중체를 형성하였다. 하기 절차를 이종이중체의 형성에 이용하였다: 10분 동안 95℃, 그 다음 95℃부터 85℃까지 냉각(-2.0℃/s), 1분 동안 85℃ 항온처리; 85℃부터 75℃까지 냉각(-0.3℃/s), 1분 동안 75℃ 항온처리; 75℃부터 65℃까지 냉각(-0.3℃/s), 1분 동안 65℃ 항온처리; 65℃부터 55℃까지 냉각(-0.3℃/s), 1분 동안 55℃ 항온처리; 55℃부터 45℃까지 냉각(-0.3℃/s), 1분 동안 45℃ 항온처리; 45℃부터 35℃까지 냉각(-0.3℃/s), 1분 동안 35℃ 항온처리; 35℃부터 25℃까지 냉각(-0.3℃/s), 1분 동안 25℃ 항온처리; 및 그 후, 4℃에서 무기한. 이종이중체 DNA(20 ㎕)를 60분 동안 42℃에서 1 ㎕의 서베이어 인핸서 S(2 ㎕) 및 서베이어 뉴클레아제 S(1 ㎕)와 함께 항온처리하였다. 1% 아가로스 겔 위에서 10 ㎕의 분해된 샘플을 10 ㎕의 분해되지 않은 샘플과 나란히 런닝시켰다. 도 9에 나타낸 바와 같이, 실시예 3에 개시된 바와 같이 넉아웃 효율을 측정하기 위해 세포의 형질감염된 풀에 대해 서베이어 어세이를 수행하였다(도 3의 B). 항-HER2 발현 세포 집단에서 넉아웃 효율의 분석을 수행하였다. 위쪽 밴드의 감소 및 아래쪽 신규 밴드의 출현은 이미지 J 소프트웨어에 의한 스캐닝된 영상의 밀도측정 분석에 의해 정량될 수 있는 효율을 표시한다. CRISPR KO 전 및 후 원래의 밴드의 비를 사용하여 넉아웃 효율을 측정하였다. BAX 및 BAK에 대한 넉아웃 효율은 각각 30% 및 70%이었으므로, 계산된 이중 넉아웃 효율은 대략 21%이었다.
단일 세포 함유 96-웰 플레이트의 중복된 플레이트를 사용하여 게놈 DNA 단리 및 DNA 시퀀싱을 수행하였다. 퀵익스랙트(QuickExtract) 용액을 게놈 DNA의 고처리율 단리에 사용하였다. 배양물로부터 150 ㎕의 세포 배양 상청액을 제거한 후, 150 ㎕의 퀵익스랙트 용액을 첨가하였다. 10분 동안 실온에서 용해시킨 후, 가열 블록 위에서 6분 동안 65℃에서 가열한 다음, 2분 동안 98℃에서 가열하기 위해 세포 용해물을 새로운 마이크로튜브로 옮겼다.
게놈 DNA 추출물을 PCR 증폭에 사용하였다. 그 다음, PCR 생성물을 정제하고 시퀀싱하였다. 벡터 NTI 소프트웨어 스위트의 정렬 수단을 이용하여 시퀀싱 결과를 분석하였다. 월드 와이드 웹(CHOgenome.org)에서 입수된 유전자(이 경우, BAK 유전자)의 게놈 서열을 정렬 분석 동안 야생형 서열로서 사용하였다. 도 10은 CRISPR을 이용한 BAK 넉아웃 후 20개의 단일 세포 클론들의 DNA 시퀀싱 결과를 보여준다. 위쪽 DNA 서열(Bak-CHO-gDNA1)은 원래의 BAK 유전자의 게놈 영역의 DNA 서열이다. 'ZA_112_K32_BakI-II' 클론만이 원래의 BAK 유전자와 동일한 서열을 가진다. 표시된 다른 유전자들은 이들의 서열에서 결실 또는 삽입을 가진다. 유사한 관찰결과가 BAX에서 인지되었다(데이터는 표시되어 있지 않음).
실시예 9: 항-HER2 발현 클론에서의 BAX 및 BAK 넉아웃의 단백질 분석
웨스턴 블롯 분석을 이용하여 BAX 단백질 발현에 대해 BAX 및 BAK 넉아웃 항-HER2 발현 단일 세포 유래의 세포주를 시험하였다(도 11). 프로테아제 억제제(시그마(Sigma) 정제, 시그마)를 함유하는 100 ㎕ RIPA 완충제(아브캄(Abcam))에 재현탁함으로써, 6백만 개의 BAX/BAK 이중 넉아웃 세포주들로부터의 용해물을 제조하였다. 용해물을 1시간 동안 얼음 위에서 항온처리한 후, 20분 동안 12,000 rpm에서 원심분리하였다. 단백질 농도를 BCA 키트(피어스(Pierce))로 측정하였다. 웨스턴 블롯을 위해 20 ㎍의 단백질을 사용하였다. 상이한 세포주들로부터의 단백질 추출물을 항-BAX 항체(아브캄)로 프로빙하였다. 도 11에 나타낸 바와 같이, BAX/BAK 이중 넉아웃 세포주, 예컨대, BB15, BB12 및 BBS19는 임의의 검출가능한 BAX 단백질을 발현하지 않았다. 대조적으로, 양성 대조군 세포주인 L082는 전체 길이 BAX인 21 KD 단백질의 발현을 보였다. UBB3 세포주는 유전자 시퀀싱에 의해 유전적으로 BAX 결핍 세포주인 것으로 특징규명되었을지라도 잔류 BAX를 발현하였다는 것이 인지된다.
실시예 10: 아폽토시스는 BAX/BAK 결핍 항-HER2 발현 세포주에서 방해된다.
BAX/BAK 이중 넉아웃 세포주를 아폽토시스에 대한 그의 내성에 대해 시험하였다. 유가식 절차 동안 아폽토시스 내성의 성질을 평가하였다. 유가식 절차에서 12일째 날 세포의 아넥신 V 염색의 유세포분석을 수행하였다. 비디 바이오사이언시스(BD Biosciences)로부터의 FITC 아넥신 V 아폽토시스 검출 키트를 사용한 표준 프로토콜을 제조자의 권장된 조건 하에서 수행하였다. 세포를 아폽토시스 어세이 동안 4개의 단계들 및/또는 집단들로 나눌 수 있다: 정상 생존 세포 단계(사분면 3, Q3), 아폽토시스의 초기 단계(사분면 4, Q4), 아폽토시스의 후기 단계(사분면 2, Q2), 및 사멸된 세포 단계(사분면 1, Q1). 도 12의 A에 나타낸 바와 같이, 넉아웃을 갖지 않은 정상(대조군) L082 세포는 Q4(11.8%) 및 Q2(41.8%)에 표시된 바와 같이 심각한 아폽토시스를 보였다. 대조적으로, BAX/BAK 이중 넉아웃 세포주(BB15)는 도 12의 B에 표시된 바와 같이 훨씬 더 개선된 생존율(Q3, 80.9%) 및 아폽토시스에 대한 내성(Q4, 13.2%; Q2, 3.5%)을 보였다. 따라서, 아폽토시스 세포는 53%부터 17%까지 감소하는 것으로 관찰되었다.
실시예 11: 재조합 단백질의 생성은 BAX/BAK 결핍 항-HER2 발현 세포주에서 증가된다.
항체의 생성을 회분식 절차 및 유가식 절차 둘 다에에서 평가하였다(각각 도 13 및 도 14). 회분식 배양 조건 하에서, 비천연 아미노산 pAF를 3일째 날에 배양 배지에 첨가하여, pAF의 부위 특이적 도입을 가진 완전히 조립된 항-HER2 항체의 생성을 시작하였다. 항-아폽토시스 조작의 경우 예상된 바와 같이, 넉아웃 세포의 생존 세포 밀도(VCD)에 의해 측정된 피크 세포 밀도(도 13의 A)는 모세포보다 25% 더 높고, 생성 시간(도 13의 B)은 모세포의 생성 시간인 7일부터 10일까지 연장되었다. 놀랍게도, 넉아웃 세포의 7일째 날 매일 Qp(도 13의 D)는 아마도 항-아폽토시스 조작으로부터 비롯된 유지된 세포 활성으로 인해 모세포에 비해 50%까지 개선되었다. BAX/BAK 이중 넉아웃 세포주는 생성 7일째 날 모세포에 비해 역가의 1.8배 증가(270 mg/ℓ 대 150 mg/ℓ)를 보였다(도 13의 C).
유사한 경향이 유가식 배양 조건 하에서 관찰되었고(도 14), 도 14의 A에 표시된 피크 세포 밀도(VCD)에 기반한 성장의 개선, 생성 시간(도 14의 B) 및 세포 특이적 생산성(도 14의 D)의 조합은 BAX/BAK 이중 넉아웃 세포주(도 14의 C)에 대한 역가의 3.3배 증가를 유발하여, 모세포주(L082, 450 mg/ℓ)에 비해 1500 mg/ℓ의 역가를 가진 BB15 클론을 보여준다.
실시예 12: BAX/BAK 결핍 항-HER2 발현 세포주의 생성물 품질
항-HER2 발현 모세포주 및 BAX/BAK 이중 넉아웃 항-HER2 발현 세포주로부터 유가식 생산에 의해 생성된 샘플을 사용하여, 생성물 품질을 온전한 질량 분광측정(MS) 및 크기 배제 크로마토그래피(SEC)로 분석하였다(표 4). 조작된 클론 및 모세포주의 일차 아미노산 서열은 cDNA 서열로부터 유추된 서열과 동일함으로써, mAb의 식별을 확인시켜준다는 것을 MS로 관찰하였다(데이터는 표시되어 있지 않음).
Figure pct00005
표 4에 나타낸 바와 같이, 모세포주 및 BAX/BAK 이중 넉아웃 항-HER2 발현 세포주로부터 유가식 생산에 의해 생성된 샘플을 사용하여 생성물 품질을 분석하였다. MS에 의해 평가된 당형태(glycoform) 프로파일은 넉아웃 전(HER2-L082)과 후(HER2-BB15)에 필적할만하였고, 클론 선택 단계에서 mAb에 대한 정상 분포 범위 내에 있었다. SEC는 고분자량(HMW) 응집체 및 저분자량(LMW) 분해된 종의 퍼센트가 둘 다 5%보다 더 낮았고 조작 전과 후에 필적할만하였다는 것을 보여주었는데, 이것은 넉아웃 및 단일 세포 클로닝 절차가 생성물의 순도에 부정적으로 영향을 미치지 않았다는 것을 시사한다.
실시예 13: BAX/BAK 결핍 항-PSMA 발현 세포주의 생성
3개의 BAX 표적화된 gRNA 구축물들 및 2개의 BAK 표적화된 gRNA 구축물들을 항-PSMA 발현 세포주 KO183 내로 형질감염시킴으로써 CRISRP 기술을 이용한 BAX 및 BAK의 동시적 제거를 수행하였다. 이 실험에서 사용된 BAX 및 BAK 구축물들을, 상기 실시예들에 기재되고 도 5 내지 7 및 표 1 내지 3에 예시된 바와 같이 디자인하고 제조하였다. 항-PSMA에 대한 넉아웃 실험에서 사용된 CRISPR 플라스미드도 상업적으로 입수가능한 벡터인 진아트 CRISPR 뉴클레아제 벡터(pGCNV)(써모 피셔 사이언티픽)를 사용하여 도 7에 표시된 바와 같이 디자인하였다. pGCNV 내로 삽입된 올리고 이중체는 서열번호 83 내지 서열번호 92의 다섯(5) 쌍의 합성된 올리고들을 포함하였다.
BAX 부위를 표적화하는 3개의 상이한 gRNA 서열들을 코딩하는 3개의 플라스미드들 및 BAK 부위를 표적화하는 2개의 상이한 gRNA 서열들을 코딩하는 2개의 플라스미드들을, pAF-RS 및 pAF-tRNA와 함께 항-PSMA 유전자 또는 이의 단편을 갖도록 조작된 CHO 세포 유래의 안정한 세포주 내로 함께 형질감염시켰다. 형질감염시킨 지 72시간 후, 게놈 DNA를 단리하였고, 실시예 8에 기재된 바와 같이 서열번호 45 및 46의 올리고들을 사용하여 BAK 좌위의 부분을 PCR 증폭하였다. 서열번호 43 및 44의 올리고들을 대신 사용하여 BAX 좌위를 PCR 증폭하였다. BAX 및 BAK 결핍 항-PSMA 발현 클론의 DNA 분석을 상기 실시예들에 기재된 바와 같이 수행하였다. 도 15에 나타낸 바와 같이, CRISPR 편집 기술을 기반으로 항-PSMA 발현 세포 집단에서 넉아웃 효율을 측정하기 위해 서베이어 어세이를 수행하였다. CRISPR KO 전 및 후 원래의 밴드의 비를 사용하여 넉아웃 효율을 측정하였다. Bax및 Bak에 대한 넉아웃 효율은 각각 42% 및 53%이었으므로, 계산된 이중 넉아웃 효율은 대략 20%이었다.
7일 후, FACS를 이용하여 세포의 형질감염된 풀을 40개의 플레이트 내로 1개 세포/웰의 시딩 밀도로 서브클로닝하였다. 영상에 의해 확인된 대략 1000개의 단일 세포 유래의 클론들을 선택하였고, 표적화된 DNA 시퀀싱으로 생산성, 성장 및 유전형분석에 대해 96-웰, 24-웰 및 24-딥웰을 통해 스크리닝하였다.
BAX 및 BAK 결핍 항-PSMA 발현 클론의 DNA 분석을 실시예 8에 기재된 바와 같이 수행하였다(데이터는 표시되어 있지 않음). 2개월 안정성 연구로 성장 및 생산성을 더 평가하고 웨스턴 블롯팅으로 넉아웃 상태를 확인하기 위해, 상위 KO183 BAX/BAK 이중 KO 클론들(KO183 BB KO)을 선택하였다.
도 16에 나타낸 바와 같이, 웨스턴 블롯을 이용함으로써 항-PSMA 발현 클론에서의 BAX 및 BAK 넉아웃의 단백질 분석을 평가하였다. 프로테아제 억제제(시그마 정제, 시그마)를 함유하는 100 ㎕ RIPA 완충제(아브캄)에 재현탁함으로써, 6백만 개의 BAX/BAK 이중 넉아웃 세포주들로부터의 용해물을 제조하였다. 용해물을 1시간 동안 얼음 위에서 항온처리한 후, 20분 동안 12,000 rpm에서 원심분리하였다. 단백질 농도를 BCA 키트(피어스)로 측정하였다. 웨스턴 블롯을 위해 20 ㎍의 단백질을 사용하였다. 상이한 세포주들로부터의 단백질 추출물을 항-BAX 항체(아브캄)로 프로빙하였다.
도 16의 A는 CRISPR을 이용함으로써 조작된 항-PSMA 발현 클론에서 BAX 넉아웃을 보여준다. 도 16의 B는 CRISPR을 이용함으로써 조작된 항-PSMA 발현 클론에서 BAK 넉아웃을 보여준다. 표시된 상위 15개의 클론들 중 5개의 클론들은 BAX/BAK 이중 넉아웃이었다. L082는 야생형 또는 전체 길이 BAX인 21 KD 단백질 및 야생형 BAK인 24 KD 단백질을 발현하는 양성 대조군 세포주이다. 항-HER2 발현 BB15 세포를 이중 넉아웃 대조군으로서 사용하였다.
아넥신 V 결합 아폽토시스 어세이로 본 발명의 항-PSMA 발현 클론에서 아폽토시스의 분석을 더 수행하였다. 도 17에 나타낸 바와 같이, BAX/BAK 이중 넉아웃 클론, 예를 들면, PSMA-192 및 PSMA-719는 단일 넉아웃 클론, 예를 들면, PSMA-882, 및 비-넉아웃 클론, 예를 들면, PSMA-484에서 관찰된 대략 35% 내지 37%에 비해 약 85%의 세포 생존율을 보였다.
실시예 14: 재조합 단백질의 생성은 BAX/BAK 결핍 항-PSMA 발현 클론에서 증가된다.
웨스턴 블롯팅 및 아넥신 V 분석에 의한 항-PSMA 발현 BAX 및 BAK 클론의 분석을 기반으로, 추가 최적화를 위해 다수의 안정한 클론들을 선택하였다. 각각에 대해 관찰된 고생산성, 강력한 성장 및 2개월 안정성을 기반으로 역가를 개선하기 위한 공정 최적화를 위해 3개의 안정한 클론들 192, 719(둘 다 BAX/BAK 넉아웃을 가짐) 및 882(BAK 넉아웃)를 선택하였다.
항체의 생성을 도 18에 표시된 유가식 공정에서 평가하였다. 유가식 배양 조건 하에서, BAX/BAK 이중 넉아웃 세포주(PSMA-BBKO-192)는 생성 10일째 날에 역가의 3배 증가(1400 mg/ℓ 대 500 mg/ℓ)를 보였다(도 18의 C). 동시에, 생존율도 90% 넘게 상당히 개선되었다(도 18의 B). 비-조작된 세포주 PSMA-S-164를 대조군으로서 사용하였다.
실시예 15: BAX/BAK 결핍 항-PSMA 발현 세포주의 생성물 품질
표 5에 개시된 바와 같이 항-PSMA 발현 대조군 세포주(PSMA-S-164) 및 BAX/BAK 이중 넉아웃 항-PSMA 발현 세포주(PSMA-BBKO-192)로부터 유가식 생산에 의해 생성된 샘플을 사용하여 온전한 질량 분광측정(MS) 및 크기 배제 크로마토그래피(SEC)로 생성물 품질을 분석하였다. 조작된 클론 및 모세포주의 일차 아미노산 서열은 cDNA 서열로부터 유추된 서열과 동일함으로써, mAb의 식별을 확인시켜준다는 것을 MS로 관찰하였다(데이터는 표시되어 있지 않음).
Figure pct00006
표 5에 나타낸 바와 같이, MS에 의해 평가된 당형태 프로파일은 비-조작된 세포주(PSMA-S-164)와 BAX/BAK 이중 넉아웃 세포주(PSMA-BBKO-192) 사이에 필적할만하였고 클론 선택 단계에서 mAb에 대한 정상 분포 범위 내에 있었다. SEC는 고분자량(HMW) 응집체의 퍼센트를 측정하였고, nrCE-SDS는 저분자량(LMW) 분해된 종의 퍼센트를 측정하였다. HMW 응집체 및 LMW 분해된 종 둘 다가 5%보다 더 낮았고 항-PSMA 발현 비-조작된 세포주와 조작된 세포주 사이에 필적할만하였다. 이 품질 프로파일은 CRISPR-Cas9 조작 및 후속 단일 세포 클로닝이 항-PSMA 발현 세포주의 생성물 품질에 불리하게 영향을 미치지 않았다는 것을 시사한다.
실시예 16: BAX/BAK 결핍 항-CD70 발현 세포주의 생성
3개의 BAX 표적화된 gRNA 구축물들 및 2개의 BAK 표적화된 gRNA 구축물들을 항-CD70 발현 미니-풀 세포 집단(CD70-MW-108) 내로 형질감염시킴으로써 CRISRP-Cas9 편집 기술을 이용한 BAX 및 BAK의 동시적 제거를 수행하였다. 이 실험에서 사용된 BAX 및 BAK 구축물을, 상기 실시예에 기재되고 도 5 내지 7 및 표 1 내지 3에 예시된 바와 같이 디자인하고 제조하였다. 항-CD70에 대한 넉아웃 실험에서 사용된 CRISPR 플라스미드도 상업적으로 입수가능한 벡터인 진아트 CRISPR 뉴클레아제 벡터(pGCNV)(써모 피셔 사이언티픽)를 사용하여 도 7에 표시된 바와 같이 디자인하였다. pGCNV 내로 삽입된 올리고 이중체는 서열번호 83 내지 서열번호 92의 다섯(5) 쌍의 합성된 올리고들을 포함하였다.
BAX 부위를 표적화하는 3개의 상이한 gRNA 서열들을 코딩하는 3개의 플라스미드들 및 BAK 부위를 표적화하는 2개의 상이한 gRNA 서열들을 코딩하는 2개의 플라스미드들을, pAF-RS 및 pAF-tRNA와 함께 항-PSMA 유전자 또는 이의 단편을 갖도록 조작된 CHO 세포 유래의 안정한 세포주 내로 함께 형질감염시켰다. 형질감염시킨 지 72시간 후, 게놈 DNA를 단리하였고, 실시예 5에 기재된 바와 같이 서열번호 45 및 46의 올리고들을 사용하여 BAK 좌위의 부분을 PCR 증폭하였다. 서열번호 43 및 44의 올리고들을 대신 사용하여 BAX 좌위를 PCR 증폭하였다. 도 19에 나타낸 바와 같이, CRISPR 편집 기술을 기반으로 항-CD70 발현 세포 집단에서 넉아웃 효율을 측정하기 위해 서베이어 어세이를 수행하였다. CRISPR KO 전 및 후 원래의 밴드의 비를, 이미지 J 소프트웨어에 의한 스캐닝된 영상의 밀도측정 분석으로 정량하고 넉아웃 효율을 측정하는 데 사용하였다. BAX 및 BAK에 대한 넉아웃 효율은 각각 51% 및 23%이었으므로, 계산된 이중 넉아웃 효율은 대략 10%이었다. 비특이적 밴드가 이 어세이에서 관찰되었다. 이 밴드는 세포 집단의 미니-풀 성질에 기인할 수 있을 것으로 생각된다.
7일 후, FACS를 이용하여 세포의 형질감염된 풀을 40개의 플레이트 내로 1개 세포/웰의 시딩 밀도로 서브클로닝하였다. 영상에 의해 확인된 대략 1000개의 단일 세포 유래의 클론들을 선택하였고, 표적화된 DNA 시퀀싱으로 생산성, 성장 및 유전형분석에 대해 96-웰, 24-웰 및 24-딥웰을 통해 스크리닝하였다. BAX 및 BAK 결핍 항-CD70 발현 클론의 DNA 분석을 실시예 8에 기재된 바와 같이 수행하였다(데이터는 표시되어 있지 않음). 2개월 안정성 연구로 성장 및 생산성을 더 평가하고 웨스턴 블롯팅으로 넉아웃 상태를 확인하기 위해 생성된 다수의 항-CD70 발현 클론들로부터 BAX/BAK 이중 넉아웃 클론을 선택하였다.
도 20에 표시된 바와 같이, 웨스턴 블롯을 이용하여 항-CD70 발현 클론에서 BAX 및 BAK 넉아웃의 단백질 분석을 평가하였다. 프로테아제 억제제(시그마 정제, 시그마)를 함유하는 100 ㎕ RIPA 완충제(아브캄)에 재현탁함으로써, 6백만 개의 BAX/BAK 이중 넉아웃 세포주들로부터의 용해물을 제조하였다. 용해물을 1시간 동안 얼음 위에서 항온처리한 후, 20분 동안 12,000 rpm에서 원심분리하였다. 단백질 농도를 BCA 키트(피어스)로 측정하였다. 웨스턴 블롯을 위해 20 ㎍의 단백질을 사용하였다. 상이한 세포주들로부터의 단백질 추출물을 항-BAX 항체(아브캄)로 프로빙하였다. 도 20의 A는 CRISPR을 이용함으로써 조작된 항-CD70 발현 클론에서 BAX 넉아웃을 보여준다. 도 20의 B에 나타낸 바와 같이, CRISPR을 이용함으로써 조작된 항-CD70 발현 클론에서 BAK 넉아웃이 다수의 클론들에서 관찰되었다. 표시된 상위 13개의 클론들 중 8개의 클론들은 BAX/BAK 이중 넉아웃이었다. 클론 108 모세포주는 잔류 BAK 단백질 발현을 보유하였다는 것을 주목한다. L082는 21 KD 단백질인 야생형 또는 전체 길이 BAX 및 24 KD의 밴드로 나타나는 BAK 야생형 단백질을 발현하는 양성 대조군 세포주이다.
아넥신 V 결합 아폽토시스 어세이로 본 발명의 항-CD70 발현 클론에서 아폽토시스의 분석을 추가로 수행하였다. 도 21에 나타낸 바와 같이, BAX/BAK 이중 넉아웃 클론, 예를 들면, CD70-BBKO-563은 모세포주 CD70-MW-108에서 관찰된 대략 18%에 비해 약 60%의 세포 생존율을 보였다. 동시에, 아폽토시스 세포는 각각의 세포주에 대해 Q2 및 Q4로부터 관찰된 바와 같이 80%부터 40%까지 감소하였다.
실시예 17: 재조합 단백질의 생성은 BAX/BAK 결핍 항-CD70 발현 클론에서 증가된다.
웨스턴 블롯팅 및 아넥신 V 분석에 의한 항-CD70 발현 BAX 및 BAK 클론의 분석을 기반으로, 추가 최적화를 위해 다수의 안정한 클론들을 선택하였다. 각각에 대해 관찰된 고생산성, 강력한 성장 및 2개월 안정성을 기반으로 역가를 개선하기 위한 공정 최적화를 위해 BAX/BAK 넉아웃을 가진 아홉(9)개의 안정한 클론들을 선택하였다.
항체의 생성을 도 22에 표시된 유가식 공정에서 평가하였다. 유가식 배양 조건 하에서, 항-CD70 발현 BAX/BAK 이중 넉아웃 세포주(CD70-BBKO-563)는 생성 14일째 날에 진탕 플라스크 및 벤치 탑 생물반응기 조건 둘 다에서 1000 mg/ℓ의 역가를 보였다(도 22의 C). 진탕 플라스크 및 벤치 탑 생물반응기 조건 둘 다 하에서 세포 생존율(도 22의 B)은 약 90%이었다. 종합하건대, 진탕 플라스크 및 생물반응기 조건 하에서 생성 프로파일, VCD, 생존율 및 역가는 필적할만하였고 공정이 규모 확장될 수 있다는 것을 뒷받침한다. 분석된 필적할만한 생산성 및 성장 프로파일을 기반으로 생물반응기 조건 및 공정 하에서 추가 연구를 수행하였다. 이 연구는 CRISPR 기술을 이용하여 아폽토시스를 제어하거나 조절하는 유전자를 넉아웃시킴으로써 생물반응기의 조건 하에서 세포 성장에 영향을 미치는 아폽토시스 스트레스 요인을 제어하는 본 발명의 실시양태를 뒷받침한다.
실시예 18: BAX/BAK 결핍 항-CD70 발현 세포주의 생성물 품질
표 6에 개시된 바와 같이 생물반응기 및 진탕 플라스크 조건 하에서 항-CD70 발현 BAX/BAK 이중 넉아웃 세포주로부터 유가식 생산에 의해 생성된 샘플을 사용하여 온전한 질량 분광측정(MS) 및 크기 배제 크로마토그래피(SEC)로 생성물 품질을 분석하였다.
Figure pct00007
표 5에 나타낸 바와 같이, MS에 의해 평가된 당형태 프로파일은 진탕 플라스크 조건과 생물반응기 조건 사이에 필적할만하였고 클론 선택 단계에서 mAb에 대한 정상 분포 범위 내에 있었다. SEC는 고분자량(HMW) 응집체의 퍼센트 및 저분자량(LMW) 분해된 종의 퍼센트를 측정하였다. HMW 응집체 및 LMW 분해된 종 둘 다가 클론 선택 단계에서 정상 범위 내에 있었다. 5%보다 약간 더 높은 HMW가 정제 후 2% 내지 3%까지 감소된 것으로 관찰되었다(데이터는 표시되어 있지 않음). 이 품질 프로파일은 CRISPR 및 후속 단일 세포 클로닝이 항-CD70 발현 세포주의 생성물 품질에 불리하게 영향을 미치지 않았다는 것을 시사한다. 진탕 플라스크 조건에서의 생성물 품질 속성과 일치된, 생물반응기 조건에서의 생성물 품질 속성(응집체, 통합성 및 당형태)은 공정이 규모 확장될 수 있다는 것을 입증한다는 것도 인지되었다.
본원에 기재된 방법 및 조성물은 본원에 기재된 특정 방법, 프로토콜, 세포주, 구축물 및 시약으로 한정되지 않으므로, 변경될 수 있다는 것을 이해해야 한다. 본원에서 사용된 용어는 특정 실시양태만을 기술하기 위한 것이고, 청구범위에 의해서만 한정될, 본원에 기재된 방법 및 조성물의 범위를 한정하기 위한 것이 아니라는 것도 이해해야 한다.
본 명세서 및 첨부된 청구범위에서 사용된 바와 같이, 문맥이 달리 명시하지 않은 한, 단수형은 복수 지시대상을 포함한다.
달리 정의되어 있지 않은 한, 본원에서 사용된 모든 기술 용어들 및 과학 용어들은 본원에 개시되고 기재된 본 발명이 속하는 분야에서 통상의 기술을 가진 자에게 통상적으로 이해되는 의미와 동일한 의미를 가진다. 본원에 기재된 방법, 디바이스 및 물질과 유사하거나 동등한 임의의 방법, 디바이스 및 물질이 본원에 기재된 본 발명의 실시 또는 시험에 사용될 수 있을지라도, 바람직한 방법, 디바이스 및 물질이 기재되어 있다.
본원에서 언급된 모든 공개문헌들 및 특허들은 예를 들면, 기재된 본 발명과 관련하여 사용될, 상기 공개문헌들에 기재된 구축물 및 방법을 기술하고 개시하는 것을 목적으로 전체로서 본원에 참고로 도입된다. 본원에서 논의된 공개문헌들은 본원의 출원일 전에 그들의 개시에 대해서만 제공된다. 본원의 어느 것도 본원에 기재된 발명자들이 선행 발명을 통해 또는 임의의 다른 이유로 이러한 개시보다 앞설 자격이 없다는 것을 인정하는 의미로서 해석되어서는 안 된다.
상기 발명이 명료함 및 이해를 목적으로 다소 상세히 기재되어 있지만, 본 발명의 진정한 범위를 벗어나지 않으면서 형태 및 세부사항을 다양하게 변화시킬 수 있다는 것은 본 개시를 읽은 당분야의 숙련된 자에게 명확할 것이다. 예를 들면, 본원에 기재된 모든 기법들 및 장치들은 다양한 조합으로 사용될 수 있다. 본원에 기재된 실시예 및 실시양태가 예시 목적을 위한 것일 뿐이고 이러한 실시예 및 실시양태에 비추어 볼 때 다양한 변형 또는 변화가 당분야에서 숙련된 자에게 암시될 것이고 본원의 사상 및 범위, 및 첨부된 청구범위 내에 포함되어야 한다는 것이 이해된다.
참조에 의한 도입
본원에서 인용된 모든 공개문헌들, 특허들, 특허출원들 및/또는 다른 문헌들은 각각의 개별 공개문헌, 특허, 특허출원 및/또는 다른 문헌이 모든 목적을 위해 참고로 도입되는 것으로 개별적으로 표시되어 있는 것처럼 동일한 정도로 모든 목적을 위해 전체로서 참고로 도입된다.
SEQUENCE LISTING <110> Ambrx, Inc Chen, Sigeng Lu, Yingchun Tian, Feng <120> Methods and Compositions for Generation of High Producer Cell Lines to Promote Unnatural Amino Acid-Containing Protein Production <130> AMBX-0223.00PCT <150> US62/514,754 <151> 2017-06-02 <160> 92 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 19 <212> DNA <213> CHO <400> 1 aggcactcgc tcaacttct 19 <210> 2 <211> 19 <212> DNA <213> CHO <400> 2 tgagtgtgac cggctgttg 19 <210> 3 <211> 19 <212> DNA <213> CHO <400> 3 tttcatccag tatcgagct 19 <210> 4 <211> 19 <212> DNA <213> CHO <400> 4 gaacaaattg tccatctcg 19 <210> 5 <211> 19 <212> DNA <213> CHO <400> 5 atgctgtaag aacgggagt 19 <210> 6 <211> 19 <212> DNA <213> CHO <400> 6 gaagccggtc aaaccacgt 19 <210> 7 <211> 19 <212> DNA <213> CHO <400> 7 tcatggattg gccagtaac 19 <210> 8 <211> 19 <212> DNA <213> CHO <400> 8 ccactgggcg agacggtgc 19 <210> 9 <211> 19 <212> DNA <213> CHO <400> 9 gaagcaccgg tcctggatc 19 <210> 10 <211> 19 <212> DNA <213> CHO <400> 10 agctctgtag gtggcgcac 19 <210> 11 <211> 19 <212> DNA <213> CHO <400> 11 tgacatatgc ctcggtaat 19 <210> 12 <211> 19 <212> DNA <213> CHO <400> 12 taatcggtgg accccgaat 19 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> CHO <400> 13 aacaggagta tactctcttg 20 <210> 14 <211> 21 <212> DNA <213> CHO <400> 14 cgccagacaa agcctatcgc a 21 <210> 15 <211> 20 <212> DNA <213> CHO <400> 15 agcctacgat cccaaggggg 20 <210> 16 <211> 19 <212> DNA <213> CHO <400> 16 gcctcctcga tgtgcctgg 19 <210> 17 <211> 19 <212> DNA <213> CHO <400> 17 cattgtccag gtccccctt 19 <210> 18 <211> 19 <212> DNA <213> CHO <400> 18 acaatgcccg tcgtctgac 19 <210> 19 <211> 19 <212> DNA <213> CHO <400> 19 tgaccctgtt catcagcgc 19 <210> 20 <211> 19 <212> DNA <213> CHO <400> 20 tcagcgcggt ccaggacca 19 <210> 21 <211> 19 <212> DNA <213> CHO <400> 21 tccaggacca ggtggtgcc 19 <210> 22 <211> 19 <212> DNA <213> CHO <400> 22 tcgatgagct gatgctttg 19 <210> 23 <211> 19 <212> DNA <213> CHO <400> 23 agctgatgct ttgggccga 19 <210> 24 <211> 19 <212> DNA <213> CHO <400> 24 gaggactgcc ccgaagtcc 19 <210> 25 <211> 19 <212> DNA <213> CHO <400> 25 ggcggtgttc gccgagatc 19 <210> 26 <211> 19 <212> DNA <213> CHO <400> 26 ccgagatcgg cccgcgcat 19 <210> 27 <211> 19 <212> DNA <213> CHO <400> 27 gcgcatggcc gagttgagc 19 <210> 28 <211> 19 <212> DNA <213> CHO <400> 28 cagggcctcg gccgagcct 19 <210> 29 <211> 19 <212> DNA <213> CHO <400> 29 cccgctgccg cccccctgt 19 <210> 30 <211> 19 <212> DNA <213> CHO <400> 30 ggcttgggga tgccctgcg 19 <210> 31 <211> 19 <212> DNA <213> CHO <400> 31 tacatcatcg cccagtgtg 19 <210> 32 <211> 19 <212> DNA <213> CHO <400> 32 agcttcttct tgaattcgc 19 <210> 33 <211> 19 <212> DNA <213> CHO <400> 33 atgaagacga agagggtca 19 <210> 34 <211> 19 <212> DNA <213> CHO <400> 34 agatgcccat attattggc 19 <210> 35 <211> 19 <212> DNA <213> CHO <400> 35 atctggactc agacccctt 19 <210> 36 <211> 19 <212> DNA <213> CHO <400> 36 gcaggcaatg cattggact 19 <210> 37 <211> 19 <212> DNA <213> CHO <400> 37 ctctttttgg cacgctcca 19 <210> 38 <211> 19 <212> DNA <213> CHO <400> 38 atccacagtg aatttgtgc 19 <210> 39 <211> 19 <212> DNA <213> CHO <400> 39 cgttttgccc gtttaagaa 19 <210> 40 <211> 20 <212> DNA <213> CHO <400> 40 gcagatatgt tattctccgc 20 <210> 41 <211> 20 <212> DNA <213> CHO <400> 41 gatccgtcca caaccttggc 20 <210> 42 <211> 20 <212> DNA <213> CHO <400> 42 gataaactgc aatctggttg 20 <210> 43 <211> 20 <212> DNA <213> CHO <400> 43 agggttatga gcctccctag 20 <210> 44 <211> 20 <212> DNA <213> CHO <400> 44 ggctaccatg taaagagacc 20 <210> 45 <211> 19 <212> DNA <213> CHO <400> 45 cagacagcct tctcttgct 19 <210> 46 <211> 20 <212> DNA <213> CHO <400> 46 agagctcctg agaggcatga 20 <210> 47 <211> 19 <212> DNA <213> CHO <400> 47 tttcacgctg tgacaccca 19 <210> 48 <211> 20 <212> DNA <213> CHO <400> 48 cagaaccaca ccaagaattg 20 <210> 49 <211> 20 <212> DNA <213> CHO <400> 49 tgtttaggac cttcggtttc 20 <210> 50 <211> 20 <212> DNA <213> CHO <400> 50 atgtcaaggg cactatagac 20 <210> 51 <211> 19 <212> DNA <213> CHO <400> 51 cccaacgcaa gagaccttc 19 <210> 52 <211> 20 <212> DNA <213> CHO <400> 52 agagtgaacc tcagcgcacg 20 <210> 53 <211> 20 <212> DNA <213> CHO <400> 53 agtgaaagag agaggagagg 20 <210> 54 <211> 22 <212> DNA <213> CHO <400> 54 gatgaagtga agttgctcta cc 22 <210> 55 <211> 20 <212> DNA <213> CHO <400> 55 ctacgcaagg cacgaggttc 20 <210> 56 <211> 20 <212> DNA <213> CHO <400> 56 ataagcctct gctactccag 20 <210> 57 <211> 21 <212> DNA <213> CHO <400> 57 cacttgaaca aaggcatcaa g 21 <210> 58 <211> 21 <212> DNA <213> CHO <400> 58 tctcattgag aaggcatgtg c 21 <210> 59 <211> 20 <212> DNA <213> CHO <400> 59 gggaattcca aataggaccc 20 <210> 60 <211> 20 <212> DNA <213> CHO <400> 60 ctgctcggga aggttatgtt 20 <210> 61 <211> 21 <212> DNA <213> CHO <400> 61 atggccaagt tgaccagtgc c 21 <210> 62 <211> 21 <212> DNA <213> CHO <400> 62 tcagtcctgc tcctcggcca c 21 <210> 63 <211> 21 <212> DNA <213> CHO <400> 63 atgaaaaagc ctgaactcac c 21 <210> 64 <211> 21 <212> DNA <213> CHO <400> 64 tcattcctct gccctcggac g 21 <210> 65 <211> 21 <212> DNA <213> CHO <400> 65 atgaccgagt acaagcccac g 21 <210> 66 <211> 21 <212> DNA <213> CHO <400> 66 agtccgtggc ccgaacgccc a 21 <210> 67 <211> 21 <212> DNA <213> CHO <400> 67 ggcagcgcgt cagccccctg c 21 <210> 68 <211> 21 <212> DNA <213> CHO <400> 68 tcagtgccag ttttcttggc t 21 <210> 69 <211> 21 <212> DNA <213> CHO <400> 69 gctgaggggg cagcaagctg c 21 <210> 70 <211> 21 <212> DNA <213> CHO <400> 70 ctgcccagcc cgaggaggca g 21 <210> 71 <211> 21 <212> DNA <213> CHO <400> 71 atgaagctac tcgagaactc c 21 <210> 72 <211> 21 <212> DNA <213> CHO <400> 72 tttcatcctc accaccctgg c 21 <210> 73 <211> 21 <212> DNA <213> CHO <400> 73 caggtgggct cacatctttg c 21 <210> 74 <211> 21 <212> DNA <213> CHO <400> 74 tcacatacag atcactggaa c 21 <210> 75 <211> 21 <212> DNA <213> CHO <400> 75 tcatactgtg ttgagtggga c 21 <210> 76 <211> 21 <212> DNA <213> CHO <400> 76 ccacactaga gagcccacaa c 21 <210> 77 <211> 24 <212> DNA <213> CHO <400> 77 atgccatcat atatcgtgag catc 24 <210> 78 <211> 23 <212> DNA <213> CHO <400> 78 aaacaagctt gttccctaac tag 23 <210> 79 <211> 22 <212> DNA <213> CHO <400> 79 aggagtgtag tgtagtgatg at 22 <210> 80 <211> 21 <212> DNA <213> CHO <400> 80 atttgctctg ctgccctaac t 21 <210> 81 <211> 21 <212> DNA <213> CHO <400> 81 tgacagcaat ggactgttct c 21 <210> 82 <211> 22 <212> DNA <213> CHO <400> 82 cagcttcagg atatgtaggg ta 22 <210> 83 <211> 24 <212> DNA <213> CHO <400> 83 aggcactcgc tcaacttcgg tttt 24 <210> 84 <211> 24 <212> DNA <213> CHO <400> 84 cgaagttgag cgagtgcctc ggtg 24 <210> 85 <211> 24 <212> DNA <213> CHO <400> 85 tgagtgtgac cggctgttgg tttt 24 <210> 86 <211> 25 <212> DNA <213> CHO <400> 86 caacagcgcc tcacactcac cggtg 25 <210> 87 <211> 25 <212> DNA <213> CHO <400> 87 tttcatccat gtatcgagct gtttt 25 <210> 88 <211> 25 <212> DNA <213> CHO <400> 88 agctcgatac tggatgaaga cggtg 25 <210> 89 <211> 24 <212> DNA <213> CHO <400> 89 gaacaaattg tccatctcgg tttt 24 <210> 90 <211> 24 <212> DNA <213> CHO <400> 90 cgagatggac aatttgttcc ggtg 24 <210> 91 <211> 24 <212> DNA <213> CHO <400> 91 atgctgtaag aacgggagtg tttt 24 <210> 92 <211> 25 <212> DNA <213> CHO <400> 92 cactcccgtt cttacagcat cggtg 25

Claims (59)

  1. 비천연 아미노산을 단백질 내로 도입하기 위한 세포주를 생성하는 방법으로서, 관심 있는 선택자 코돈(selector codon) 함유 유전자를 발현하는 세포에서 불활성화를 위해 표적화된 하나 이상의 부위 또는 영역을 포함하고, 상기 세포가 오르토고날(orthogonal) 아미노아실 tRNA 합성효소(O-RS) 및 오르토고날 억제제 tRNA(O-tRNA)를 포함하는 것인, 비천연 아미노산을 단백질 내로 도입하기 위한 세포주를 생성하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 세포 또는 세포주가 진핵생물 세포 또는 세포주인 방법.
  3. 제1항에 있어서, 세포 또는 세포주가 COS, CHO, VERO, MDCK, WI38, V79, B14AF28-G3, BHK, HaK, NS0, SP2/0-Ag14, HeLa 또는 HEK293으로부터 선택된 것인 방법.
  4. 제1항에 있어서, 비천연 아미노산이 O-메틸-L-티로신, L-3-(2-나프틸)알라닌, 3-메틸-페닐알라닌, O-4-알릴-L-티로신, 4-프로필-L-티로신, p-프로파르길옥시-L-페닐알라닌, 트리-O-아세틸-GlcNAcβ-세린, L-Dopa, 불소첨가된 페닐알라닌, 이소프로필-L-페닐알라닌, p-아지도-L-페닐알라닌, p-아실-L-페닐알라닌, p-벤조일-L-페닐알라닌, L-포스포세린, 포스포노세린, 포스포노티로신, p-요오도-페닐알라닌, p-브로모페닐알라닌, p-아미노-L-페닐알라닌 또는 이소프로필-L-페닐알라닌으로부터 선택된 것인 방법.
  5. 제1항에 있어서, 관심 있는 유전자가 생물요법 유전자 또는 생성물인 방법.
  6. 제1항에 있어서, 생물요법 유전자 또는 생성물이 백신인 방법.
  7. 제1항에 있어서, 관심 있는 유전자가 항체, scFv, scFv 융합 단백질, Fc 융합 단백질, 인자 VII, 인자 VIII 또는 인자 IV인 방법.
  8. 제1항에 있어서, 관심 있는 유전자가 항체인 방법.
  9. 제1항에 있어서, 관심 있는 유전자가 사이토카인, 인터류킨, 인터페론, 케모카인, 성장 인자, 호르몬, 및 이들의 수용체, 이들의 유사체, 이중특이적 물질 또는 단편인 방법.
  10. 제1항에 있어서, 관심 있는 유전자가 HER2, CD-70, PSMA, 5T4, EGFR, TROP2, CD3, IL-2, IL-3, IL-10, IL-15, GPC3, DLL3, ROR1, 렙틴(leptin), FGF-21, FGF-23, HGH, FcR, 인슐린, TNFR1, TRAIL, EPO, 및 이들의 유사체, 이중특이적 물질 또는 단편인 방법.
  11. 제1항에 있어서, 불활성화를 위해 표적화된 하나 이상의 부위 또는 영역이 GS, Bcl-2, IGFBP4, AQP1, Maf1, eRF1, FUT8, P53, 캐스파제(Caspase)-3, UPF1, Smg1, Smac/DIABLO, Apaf-1, 캐스파제-6, 캐스파제-7, 캐스파제-9, 캐스파제-10, PARP, 알파 포드린(fodrin), NuMA, AIF, CAD, 푸마(Puma), 녹사(Noxa), 14-3-3, 아벤(Aven), Myc 또는 HtrA2/Omi인 방법.
  12. 제1항에 있어서, 불활성화를 위해 표적화된 부위 또는 영역이 외재성 선택 마커 유전자인 방법.
  13. 제1항에 있어서, 선택 마커 유전자가 제오신(Zeocin), 하이그로마이신(Hygromycin) 또는 푸로마이신(Puromycin)인 방법.
  14. 제1항에 있어서, 불활성화를 위해 표적화된 부위 또는 영역이 Bcl-2 부위 또는 영역인 방법.
  15. 제1항에 있어서, 불활성화를 위해 표적화된 부위 또는 영역이 Bax 또는 Bak인 방법.
  16. 제1항에 있어서, 불활성화를 위해 표적화된 부위 또는 영역을 전체적으로 또는 부분적으로 불활성화시키는 것인 방법.
  17. 제1항에 있어서, 선택자 코돈이 넌센스 코돈, 희귀 코돈 또는 4-염기 코돈인 방법.
  18. 제15항에 있어서, 선택자 코돈이 오커(ochre) 코돈, 오팔(opal) 코돈 또는 앰버(amber) 코돈을 포함하는 것인 방법.
  19. 제1항에 있어서, 비천연 아미노산이 도입된 단백질 또는 폴리펩타이드를 포함하는 방법.
  20. 제1항에 있어서, 비천연 아미노산을 부위 특이적으로 도입하는 것인 방법.
  21. 제1항에 있어서, 세포 또는 세포주가 일시적인, 안정한 세포 집단 또는 안정한 클론 세포주인 방법.
  22. 제1항에 있어서, 세포 또는 세포주에서 아폽토시스를 경감시키거나 감소시키는 방법.
  23. 제1항에 있어서, 비천연 아미노산이 도입된 단백질 또는 폴리펩타이드의 수율을 개선하는 방법.
  24. 제1항의 방법에 따른 단리된 세포.
  25. 제22항에 있어서, 비천연 아미노산이 도입된 단백질을 수득하기 위한 단리된 세포.
  26. 비천연 아미노산을 단백질 내로 도입하기 위한 세포 또는 세포주로서, 세포가, 오르토고날 아미노아실 tRNA 합성효소(O-RS) 및 오르토고날 억제제 tRNA(O-tRNA)를 포함하는 관심 있는 선택자 코돈 함유 유전자를 발현하고, 상기 세포는 불활성화를 위해 표적화된 하나 이상의 부위 또는 영역을 포함하는 세포 또는 세포주.
  27. 오르토고날 아미노아실 tRNA 합성효소(O-RS) 및 오르토고날 억제제 tRNA(O-tRNA)를 포함하는, 비천연 아미노산을 단백질 내로 도입하기 위한 세포 또는 세포주로서, 상기 세포는 불활성화를 위해 표적화된 하나 이상의 부위 또는 영역을 포함하는 세포 또는 세포주.
  28. 오르토고날 아미노아실 tRNA 합성효소(O-RS) 및 오르토고날 억제제 tRNA(O-tRNA)를 포함하는 관심 있는 유전자를 발현하는 세포 또는 세포주로서, 상기 세포는 불활성화를 위해 표적화된 하나 이상의 부위 또는 영역을 포함하는 세포 또는 세포주.
  29. 오르토고날 아미노아실 tRNA 합성효소(O-RS) 및 오르토고날 억제제 tRNA(O-tRNA)를 포함하는 세포에서 아폽토시스를 경감시키거나 감소시키는 방법으로서, 상기 세포에서 하나 이상의 전구아폽토시스 부위 또는 영역의 불활성화를 위해 표적화하는 단계를 포함하는 방법.
  30. 비천연 아미노산을 단백질 내로 도입하기 위한 세포를 생성하는 방법으로서, 관심 있는 선택자 코돈 함유 유전자를 발현하는 세포에서 불활성화를 위한 하나 이상의 부위 또는 영역 표적을 불활성화시킬 수 있는 핵산 분자를 제공하는 단계; 및 상기 핵산 분자를, 오르토고날 아미노아실 tRNA 합성효소(O-RS) 및 오르토고날 억제제 tRNA(O-tRNA)를 포함하는 관심 있는 선택자 코돈 함유 유전자를 발현하는 세포 내로 도입하는 단계를 포함하는, 비천연 아미노산을 단백질 내로 도입하기 위한 세포를 생성하는 방법.
  31. 제30항에 있어서, 핵산 분자가 서열번호 1 내지 42로부터 선택된 것인 방법.
  32. 제30항에 있어서, 핵산 분자가 불활성화를 위해 표적화된 하나 이상의 부위 또는 영역을 불활성화시키는 것인 방법.
  33. 제30항에 있어서, 불활성화를 위해 표적화된 하나 이상의 부위 또는 영역이 동일하거나 상이한 것인 방법.
  34. 제30항에 있어서, 불활성화를 위해 표적화된 부위 또는 영역이 GS, Bcl-2 패밀리, IGFBP4, AQP1, Maf1, eRF1, FUT8, P53, 캐스파제-3, UPF1, Smg1, 제오신, 하이그로마이신, 푸로마이신, Smac/DIABLO, Apaf-1, 캐스파제-6, 캐스파제-7, 캐스파제-9, 캐스파제-10, PARP, 알파 포드린, NuMA, AIF, CAD, 푸마, 녹사, 14-3-3, 아벤, Myc 또는 HtrA2/Omi인 방법.
  35. 제30항에 있어서, 불활성화를 위해 표적화된 부위 또는 영역이 외재성 선택 마커 유전자인 방법.
  36. 제30항에 있어서, 선택 마커 유전자가 제오신, 하이그로마이신 또는 푸로마이신인 방법.
  37. 제30항에 있어서, 불활성화를 위해 표적화된 부위 또는 영역이 Bcl-2 부위 또는 영역인 방법.
  38. 제30항에 있어서, 불활성화를 위해 표적화된 부위 또는 영역이 Bax 또는 Bak인 방법.
  39. 제30항에 있어서, 불활성화를 위해 표적화된 부위 또는 영역을 전체적으로 또는 부분적으로 불활성화시키는 것인 방법.
  40. 제30항에 있어서, 세포가 일시적인, 안정한 세포 집단 또는 안정한 클론 세포인 방법.
  41. 제30항에 있어서, 세포에서 아폽토시스를 경감시키거나 감소시키는 방법.
  42. 제30항에 있어서, 부위 특이적으로 도입된 비천연 아미노산을 가진 단백질 또는 폴리펩타이드의 수율을 개선하는 방법.
  43. 제30항에 있어서, 비천연 아미노산이 O-메틸-L-티로신, L-3-(2-나프틸)알라닌, 3-메틸-페닐알라닌, O-4-알릴-L-티로신, 4-프로필-L-티로신, p-프로파르길옥시-L-페닐알라닌, 트리-O-아세틸-GlcNAcβ-세린, L-Dopa, 불소첨가된 페닐알라닌, 이소프로필-L-페닐알라닌, p-아지도-L-페닐알라닌, p-아실-L-페닐알라닌, p-벤조일-L-페닐알라닌, L-포스포세린, 포스포노세린, 포스포노티로신, p-요오도-페닐알라닌, p-브로모페닐알라닌, p-아미노-L-페닐알라닌, 또는 이소프로필-L-페닐알라닌, 파라-아세틸 페닐알라닌, p-니트로페닐알라닌, p-설포티로신, p-카복시페닐알라닌, o-니트로페닐알라닌, m-니트로페닐알라닌, p-보로닐페닐알라닌, o-보로닐페닐알라닌, m-보로닐페닐알라닌, p-아미노페닐알라닌, o-아미노페닐알라닌, m-아미노페닐알라닌, p-아실페닐알라닌, o-아실페닐알라닌, m-아실페닐알라닌, p-OMe 페닐알라닌, o-OMe 페닐알라닌, m-OMe 페닐알라닌, p-설포페닐알라닌, o-설포페닐알라닌, m-설포페닐알라닌, 5-니트로 His, 3-니트로 Tyr, 2-니트로 Tyr, 니트로 치환된 Leu, 니트로 치환된 His, 니트로 치환된 De, 니트로 치환된 Trp, 2-니트로 Trp, 4-니트로 Trp, 5-니트로 Trp, 6-니트로 Trp, 7-니트로 Trp, 3-아미노티로신, 2-아미노티로신, O-설포티로신, 2-설포옥시페닐알라닌, 3-설포옥시페닐알라닌, o-카복시페닐알라닌, m-카복시페닐알라닌, p-아세틸-L-페닐알라닌, p-프로파르길-페닐알라닌, O-메틸-L-티로신, L-3-(2-나프틸)알라닌, 3-메틸-페닐알라닌, O-4-알릴-L-티로신, 4-프로필-L-티로신, 트리-O-아세틸-GlcNAcβ-세린, L-Dopa, 불소첨가된 페닐알라닌, 이소프로필-L-페닐알라닌, p-아지도-L-페닐알라닌, p-아실-L-페닐알라닌, p-벤조일-L-페닐알라닌, L-포스포세린, 포스포노세린, 포스포노티로신, p-요오도-페닐알라닌, p-브로모페닐알라닌, p-아미노-L-페닐알라닌, 이소프로필-L-페닐알라닌 또는 p-프로파르길옥시-페닐알라닌인 방법.
  44. 제30항에 있어서, 세포가 COS, CHO, VERO, MDCK, WI38, V79, B14AF28-G3, BHK, HaK, NS0, SP2/0-Ag14, HeLa 또는 HEK293인 방법.
  45. 제30항의 방법에 따른 단리된 세포.
  46. 비천연 아미노산을 포함하는 세포주를 생성하는 방법으로서, 오르토고날 아미노아실 tRNA 합성효소(O-RS) 및 오르토고날 억제제 tRNA(O-tRNA)를 포함하는 관심 있는 선택자 코돈 함유 유전자를 발현하는 세포주를 제공하는 단계; 세포에서 하나 이상의 표적 부위를 불활성화시킬 수 있는 핵산 분자를 세포 내로 도입하는 단계; 및 비천연 아미노산을 세포에게 제공하는 단계를 포함하는, 비천연 아미노산을 포함하는 세포주를 생성하는 방법.
  47. 비천연 아미노산을 단백질 내로 도입하기 위한 세포를 생성하는 방법으로서, 세포에서 불활성화를 위한 하나 이상의 부위 또는 영역 표적을 불활성화시킬 수 있는 핵산 분자를 제공하는 단계; 및 상기 핵산 분자를, 오르토고날 아미노아실 tRNA 합성효소(O-RS) 및 오르토고날 억제제 tRNA(O-tRNA)를 포함하는 세포 내로 도입하는 단계를 포함하는, 비천연 아미노산을 단백질 내로 도입하기 위한 세포를 생성하는 방법.
  48. 제1항 내지 제47항 중 어느 한 항에 따른 단리된 세포 또는 세포주.
  49. 제1항에 있어서, 안정한 세포 또는 세포주를 수득하는 방법으로서, 상기 세포주는 오르토고날 아미노아실 tRNA 합성효소(O-RS) 및 오르토고날 억제제 tRNA(O-tRNA)를 포함하는 것인 방법.
  50. 제49항에 있어서, 안정한 세포 또는 세포주가 플랫폼 또는 생산 세포 또는 세포주인 방법.
  51. 제1항에 있어서, 생산 세포주 개발을 최적화하는 방법으로서, 상기 세포주가 오르토고날 아미노아실 tRNA 합성효소(O-RS) 및 오르토고날 억제제 tRNA(O-tRNA)를 포함하는 것인 방법.
  52. 제1항에 있어서, 세포 또는 세포주에서 비천연 아미노산 함유 폴리펩타이드의 수율을 최적화하는 방법.
  53. 제1항에 있어서, 세포 또는 세포주에서 아폽토시스를 감소시키는 방법.
  54. 비천연 아미노산을 포함하는, 제1항에 따른 단리된 폴리펩타이드.
  55. 제1항에 따른 단리된 세포 또는 세포주.
  56. 제28항에 있어서, 비천연 아미노산 함유 단백질 또는 폴리펩타이드를 생성하기 위한 단리된 세포 또는 세포주.
  57. 제1항에 있어서, 비천연 아미노산 함유 단백질의 수율이 세포에서 불활성화를 위해 표적화된 하나 이상의 부위 또는 영역의 불활성화의 부재 하에서의 수율보다 적어도 0.5배 이상 더 큰 것인 세포 또는 세포주.
  58. 제26항 내지 제28항 중 어느 한 항의 백신.
  59. 제1항 내지 제58항 중 어느 한 항의 방법에 의해 수득된 백신.
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