KR20200009562A - Setdb1 또는 이의 저해제를 포함하는 암세포의 분열 또는 분화 조절용 조성물 - Google Patents

Setdb1 또는 이의 저해제를 포함하는 암세포의 분열 또는 분화 조절용 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 특정 분자 타겟을 이용하여 암세포를 정상세포로 되돌리는 방법에 관한 것으로, 본 발명에 따른 SETDB1은 암의 성장과 분화능을 조절하는 핵심 단백질이며, SETDB1 억제 시 암 세포의 악성이 현저히 감소하고 정상 세포와 같은 상태로의 분화가 촉진됨을 새롭게 확인하였는바, SETDB1은 암의 예방 또는 치료를 위한 신규한 분자 타겟을 제공할 뿐만 아니라, 항암 신약개발에 유용하게 활용될 수 있다.

Description

SETDB1 또는 이의 저해제를 포함하는 암세포의 분열 또는 분화 조절용 조성물{COMPOSITION FOR REGULATING CANCER CELL DIVISION OR DIFFERENTIATION COMPRISING SETDB1 OR SETDB1 INHIBITOR}
본 발명은 특정 분자 타겟을 이용하여 암세포를 정상세포로 되돌리는 방법에 관한 것으로, 구체적으로는 SETDB1(SET domain, bifurcated 1) 또는 이의 저해제를 포함하는 암세포의 분열 또는 분화 조절용 조성물 또는 SETDB1 저해제를 포함하는 암의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.
현재까지 암세포 치료전략은 암세포 사멸 유도에 집중되어 왔다. 하지만 항암제에 대한 암세포의 내성 획득, 암세포 고유의 이질성으로 인하여 암세포 사멸을 유도하는 항암제들은 그 한계에 봉착되어 있다.
이러한 한계를 극복하기 위하여 여러 대안 치료법이 제안되어 왔으며, 그 중 세포 분화를 이용한 암 치료법은 제한적이지만 일부 혈액암에 대해서 효과적으로 적용된 바 있다. 대표적으로, 급성전골수구백혈병에 대한 분화유도 치료제는 개발된 이후 임상에서 80~90%의 완치율을 보여 현재까지 급성전골수구백혈병에 대한 표준치료법으로 사용되고 있다. 이러한 분화유도치료법은 기존 암세포 사멸을 목적으로 하는 암치료법과 비교하여 치료 효과뿐 아니라 부작용도 적은 것으로 알려져 있다. 이는 암세포가 분화되었을 때 암세포의 빠른 성장속도와 다른 조직으로의 전이성 등의 특징이 사라지고, 최종 분화된 정상세포와 같이 세포 분열을 하지 않는 상태가 되기 때문이다. 위와 같은 장점에도 불구하고 현재까지 고형암에 대해서는 효과적인 분자 타겟이 발굴되지 않았으며, 이에 따른 신약 개발도 현저히 부족한 실정이다.
이에 본 발명자들은 암 세포를 정상 세포로 분화시키는 분자 타겟을 발굴하기 위해 노력한 결과 히스톤-리신 N-메틸트랜스페라제(Histone-lysine N-methyltransferase) 중 하나인 SETDB1 유전자가 일부 분화능이 높은 암 세포에서 비정상적으로 과발현되어 암 줄기세포의 분화능을 높게 유지하고 있음을 확인하고, SETDB1을 억제하였을 때 암 세포들이 정상 세포와 유사한 상태로 분화하는 것을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 SETDB1 또는 이의 저해제를 포함하는 암세포의 분열 또는 분화 조절용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 SETDB1 저해제를 포함하는 암의 예방 또는 치료용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 SETDB1 저해제 또는 이의 저해제를 이용한 암 줄기 유사세포로부터 정상세포 또는 정상 유사세포로의 분화 유도 방법 및 암의 예방 또는 치료 제제의 스크리닝 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 SETDB1 또는 이의 저해제를 포함하는 암세포의 분열 또는 분화 조절용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 SETDB1 저해제를 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 SETDB1 저해제를 포함하는 항암보조제를 제공한다.
또한, 본 발명은 SETDB1 저해제를 포함하는 암 예방 또는 개선용 건강기능식품을 제공한다.
또한, 본 발명은 생체 외(In vitro)에서 SETDB1 또는 이의 저해제를 암 줄기 유사세포에 처리하는 단계를 포함하는 암 줄기 유사세포로부터 정상세포 또는 정상 유사 세포로의 분화 유도 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 (a) SETDB1을 발현하는 분리된 암 세포에 후보물질을 처리하는 단계; (b) 상기 후보물질이 처리된 분리된 암 세포에서 SETDB1 발현 수준을 측정하는 단계; 및 (c) 상기 (b) 단계에서 측정된 SETDB1 발현 수준이 후보물질이 처리되지 않은 분리된 암 세포에 비해 낮은 경우, 상기 후보물질을 암의 예방 또는 치료 제제로 사용할 수 있을 것으로 판정하는 단계; 를 포함하는 암의 예방 또는 치료 제제의 스크리닝 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 SETDB1은 암의 성장과 분화능을 조절하는 핵심 단백질이며, SETDB1 억제 시 암 세포의 악성이 현저히 감소하고 정상 세포와 같은 상태로의 분화가 촉진됨을 새롭게 확인하였는바, SETDB1은 암의 예방 또는 치료를 위한 신규한 분자 타겟을 제공할 뿐만 아니라, 항암 신약개발에 유용하게 활용될 수 있다.
도 1은 GEO 데이터베이스, TCGA 데이터베이스에서 추출한 정상 대장 조직 샘플과 대장암 조직 샘플에 대하여 비교분석을 실시한 결과를 나타낸 도이다. 구체적으로, 도 1의 a-c는 정상 조직 및 암 조직의 각 조직-특이적 유전자 세트에 대하여 GSEA(Gene Set Enrichment Analysis)를 수행한 결과를 나타낸 바이올린 플롯(violin plot)이다. 도 1의 d-g는 추론된 가상시간(pseudotime)(x축) 및 SLICER 알고리즘을 사용하여 비선형 차원 축소된 국소 선형 임베딩(linear local embedding, LLE)의 첫번째 차원(y축)을 나타낸 것이다. 각 유전자 세트의 주성분1(Principal Component1, PC1)이 색깔 있는 점으로 표시되었고, PC1에 의해 설명되는 분산의 비율을 하단에 나타내었다. 도 1의 g는 조직-특이적 유전자 세트의 PC1의 평활 곡선(smoothed curve)을 가상시간의 흐름에 따라 나타낸 도이다. 도 1의 h는 전체 세포 집단의 세포주기를 분석하여 산포도(scatter plot)로 나타낸 것이다.
도 2는 정상 대장 세포의 특이적 유전 발현 패턴의 임상적 관련성을 확인한 결과를 나타낸 도이다. 구체적으로, 도 2의 a는 전체 생존율(Overall survival, %) 및 무질병 생존율(Disease free survival, %)에 대한 카플란-마이어 커브(Kaplan-Meier curve)를 나타낸 그래프이며, 도 2의 b는 대장-특이적 유전자 세트의 GSVA 스코어를 박스 플롯으로 나타낸 것으로 각각 종양의 범위(좌측), 림프절로 퍼지는 정도(중앙) 및 원격 전이(distant metastasis)의 존재(우측)를 나타낸다(*P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001).
도 3은 정상 대장 상피 세포의 핵심 전사인자를 확인한 결과를 나타낸 도이다. 구체적으로, 도 3의 a는 MARINA 분석 결과에 따른 핵심 전사인자를 나타낸 도이며, 도 3의 b는 GEO-integrated normal GRN(GEO-paired 정상 데이터 세트로부터 추론된 유전자 조절 네트워크)에 기반한 핵심 전사인자 및 이들의 타겟 유전자를 시각화한 도이다(사각형 노드(node)는 대장-특이적 유전자를 의미). 도 3의 c는 핵심 전사인자와 이의 레귤론(regulon) 간의 피어슨 상관계수를 나타낸 것으로 GEO-paired normal GRN의 레귤론(실선) 및 GEO-integrated normal GRN의 레귤론(파선)을 나타낸 도이다. 도 3의 d는 GEO-paired 데이터 세트에서 핵심 전사인자의 유전자 발현 수준을 비교분석한 결과를 나타낸 도이며, 도 3의 e 내지 f는 GEO-paired normal GRN(좌측) 및 GEO-integrated normal GRN(우측)에서 VIPER 알고리즘을 통해 추론된 핵심 전사인자의 활성도를 나타낸 도이다(*P<5e-2, **P<1e-10, ***P<1e-20).
도 4는 정상 대장 세포의 특이적 유전자 발현 패턴을 조절하는 핵심 전사인자의 활성을 억제하는 잠재적 조절자 또는 원인 유전자(크로마틴 조절자, chromatin regulator)를 선별한 결과를 나타낸 도이다. 도 4의 a는 GO term enrichment 분석을 수행한 결과를 나타낸 도이고, 도 4의 b는 상기 GO term enrichment 분석에서 선별된 크로마틴 조절자 15종에 대한 STRING 데이터베이스 및 CMI 점수 분석 결과를 나타낸 도이다.
도 5는 핵심 전사인자의 활성을 억제하는 원인 유전자(크로마틴 조절자, chromatin regulator)를 스크리닝한 결과를 나타낸 도이다. 구체적으로, 도 5의 a는 Caco2 세포에 8가지 크로마틴 조절자를 각각 siRNA로 형질 감염시킨 후 분화마커 및 줄기세포 관련 유전자의 발현 정도를 분석한 qRT-PCR 결과를 나타낸 도이다. 도 5의 b는 각 siRNA로 형질감염시킨 Caco2의 생장 정도(%)를 시간대별로 나타낸 도이다. 도 5의 c는 레트로바이러스 매개된 유전자 도입 실험의 프로토콜을 나타낸 도이다. 도 5의 d는 유세포분석 결과를 나타낸 도이다(x축: KRT20 발현, y축: FSC(forward-scattered light)). 도 5의 e는 면역형광염색 결과를 나타낸 도이다(적색: KRT20, 녹색: Ki-67, 청색: DAPI)(Scale bar = 50㎛). 도 5의 f는 각 그룹에서 Ki-67 양성 세포를 저배율 공초점 면역형광 이미지로 정량화한 결과를 나타낸 도이다(mean±s.e.m.). 도 5의 g는 SETDB1 넉다운(knockdown) 이후 Caco2, HCT116 및 SW480 셀 라인의 생장 정도(%)를 시간대별로 나타낸 도이다. 도 5의 h는 2주에 걸쳐 콜로니 형성 분석(colony forming assay)을 수행한 결과를 나타낸 도이다(*P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001).
도 6은 분화된 정상-유사 세포에서의 유전자 발현양상을 확인한 결과를 나타낸 도이다. 구체적으로, 도 6의 a는 SLICER를 이용하여 수행한 LLE의 첫번째 차원을 가상시간의 흐름에 따라 산포도(scatter plot)로 나타낸 것이다. 도 6의 b는 SETDB1 유전자의 예측 발현 수준을 나타낸 도이다. 도 6의 c는 각 조직-특이적 유전자 세트의 PC1을 산포도로 나타낸 것이다. 도 6의 d는 조직-특이적 유전자 세트를 산포도로 나타낸 것이다. 도 6의 e는 대장-특이적 유전자(x축) 및 배아 줄기세포-특이적 유전자(y축)의 bulk RNA-시퀀싱 데이터를 나타낸 도이다. GEO-paired 데이터 세트 및 in vitro 샘플은 서로 다른 형태로 도시하였다.
이하, 본 발명에 대해 상세히 설명한다.
본 발명은 SETDB1 또는 이의 저해제를 포함하는 암세포의 분열 또는 분화 조절용 조성물을 제공한다.
본 발명에 따른 SETDB1(SET domain, bifurcated 1)은 암세포의 분열을 촉진하고 분화를 억제하며, SETDB1의 저해제는 암세포의 분열을 억제하고 분화를 촉진하는 것을 특징으로 한다.
정상적인 체세포의 운명은 핵심 전사인자(transcription factor, TF)에 의해 다른 발달 단계(developmental state)로 전환될 수 있다. 암세포는 조직의 인접한 정상 세포보다 덜 분화된 상태의 특성을 가진다. 이에 본 발명자들은 암세포를 정상 세포처럼 더 분화시켜 정상적인 상태로 유도할 수 있는지 여부를 확인하고자 하였다.
먼저, 본 발명의 일 구현예에서 줄기세포 유사 대장암 세포(또는 대장암 줄기 유사세포)를 분화된 정상 유사 세포로 전환시키는 전사인자를 규명하기 위해 대용량의 공공 유전체데이터를 분석하여 정상 대장 세포와 암세포의 차이가 대장-특이적 유전자 발현량에 있음을 확인하고, 대장암(colorectal cancer, CRC) 세포는 분화능이 높은 배아 및 장 줄기세포 유사 세포부터 정상세포의 유전자 발현과 비슷한 패턴을 갖는 분화된 정상 유사 세포까지의 다양한 발달 단계를 나타냄을 확인하였다. 이를 토대로, 암 성장과 관련하여 중심적인 역할을 하고 있다고 알려진 암 줄기세포를 정상세포로 변화시킴으로써 암의 악성을 제거하는 치료 방법을 제안하고자 하였다. 이를 위하여 정상 대장 조직의 유전체 데이터를 수집, 종합하여 정상 대장 점막 세포의 유전자 조절 네트워크(gene regulatory network, GRN)를 구축하였고, CDX2, ELF3, HNF4G, PPARG 및 VDR가 세포 분화를 조절하는 핵심 전사인자임을 확인하였다. 또한 암세포에서는 이들의 단백질 활성도가 크게 감소하였음을 함께 확인하였다.
나아가, 핵심 전사인자의 단백질 활성도를 억제하는 유전자를 찾기 위해 대장암 환자 조직의 유전체 데이터로부터 원인 유전자를 탐색하였고, 스크리닝 실험을 통해 SETDB1가 그 원인 유전자임을 확인하였다. 상기 SETDB1은 히스톤-리신 N-메틸트랜스페라제(Histone-lysine N-methyltransferase) 중 하나로 히스톤 단백질에 메틸기를 부착하여 특정 유전자의 발현을 억제하는 기능을 가지고 있다고 알려져 있으며, 본 발명자들은 위 유전자가 일부 분화능이 높은 대장암 세포에서 비정상적으로 과발현되어 암 줄기세포(또는 암 줄기 유사세포)의 분화능을 높게 유지하고 있다는 사실을 최초로 규명하였다. 마지막으로, 단일 세포 RNA 시퀀싱(RNA-seq) 및 bulk RNA 시퀀싱 분석을 통해 SETDB1을 억제하였을 때 대장암 세포들이 정상 대장 세포와 유사한 상태(post-mitotic)로 분화하는 것을 확인하였으며 이들의 성장속도가 크게 저해됨을 확인하였다.
본 발명에서 "암 줄기세포(cancer stem cell)"란 줄기세포 특유의 능력인 자가재생이나 분화능력을 가지고 있는 포괄적인 의미의 암세포를 의미한다. 최근 암세포 내에서 암을 일으킬 수 있는 세포가 따로 존재하고, 이 세포들은 정상 줄기세포의 특성을 가지고 있으며 다시 암을 발생시킬 수 있음이 밝혀져, 이러한 세포들은 줄기세포의 특성을 가지고 있다고 하여 암 줄기세포(cancer stem cell)라고 불리고 있다.
본 발명의 용어 “암 줄기세포”는 “암 줄기 유사세포”와 혼용될 수 있으며, 일반적인 암 세포로 분화할 수 있는 세포라면 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 있어서, 상기 SETDB1 저해제는 SETDB1 유전자의 안티센스 올리고뉴클레오티드, siRNA, shRNA, miRNA 및 SETDB1 단백질에 특이적인 항체로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에서 "안티센스 올리고뉴클레오타이드”란 특정 mRNA의 서열에 상보적인 핵산 서열을 함유하고 있는 DNA 또는 RNA 또는 이들의 유도체를 의미하고, mRNA 내의 상보적인 서열에 결합하여 mRNA의 단백질로의 번역을 저해하는 작용을 한다. 상기 안티센스 서열은 상기 유전자의 mRNA에 상보적이고 상기 mRNA에 결합할 수 있는 DNA 또는 RNA 서열을 의미하며, 상기 mRNA의 번역, 세포질내로의 전위(translocation), 성숙(maturation) 또는 다른 모든 전체적인 생물학적 기능에 대한 필수적인 활성을 저해할 수 있다.
또한, 상기 안티센스 핵산은 효능을 증진시키기 위하여 하나 이상의 염기, 당 또는 골격(backbone)의 위치에서 변형될 수 있다. 핵산 골격은 포스포로티오에이트, 포스포트리에스테르, 메틸 포스포네이트, 단쇄 알킬, 시클로알킬, 단쇄 헤테로아토믹, 헤테로시클릭 당간 결합 등으로 변형될 수 있다. 또한, 안티센스 핵산은 하나 이상의 치환된 당 모이어티(sugar moiety)를 포함할 수 있다. 안티센스 핵산은 변형된 염기를 포함할 수 있다. 변형된 염기에는 하이포크잔틴, 6-메틸아데닌, 5-메틸피리미딘(특히 5-메틸시토신), 5-하이드록시메틸시토신(HMC), 글리코실 HMC, 젠토비오실 HMC, 2-아미노아데닌, 2-티오우라실, 2-티오티민, 5-브로모우라실, 5-하이드록시메틸우라실, 8-아자구아닌, 7-데아자구아닌, N6(6-아미노헥실)아데닌, 2,6-디아미노퓨린 등이 있다. 또한, 상기 안티센스 핵산은 상기 안티센스 핵산의 활성 및 세포 흡착성을 향상시키는 하나 이상의 모이어티(moiety) 또는 컨쥬게이트(conjugate)와 화학적으로 결합될 수 있다. 콜레스테롤 모이어티, 콜레스테릴 모이어티, 콜릭산, 티오에테르, 티오콜레스테롤, 지방성 사슬, 인지질, 폴리아민, 폴리에틸렌 글리콜 사슬, 아다맨탄 아세트산, 팔미틸 모이어티, 옥타데실아민, 헥실아미노카르보닐-옥시콜에스테롤 모이어티 등의 지용성 모이어티 등이 있으며 이에 제한되지 않는다. 상기 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 통상의 방법으로 시험관에서 합성되어 생체 내로 투여하거나 생체 내에서 안티센스 올리고뉴클레오타이드가 합성되도록 할 수 있다.
본 발명에서 "siRNA”란 RNA 방해 또는 유전자 사일런싱을 매개할 수 있는 핵산 분자를 의미한다. siRNA는 표적 유전자의 발현을 억제할 수 있기 때문에 효율적인 유전자 넉다운(knockdown) 방법 또는 유전자치료 방법으로 제공된다.
본 발명의 siRNA 분자는, 센스 가닥(본 발명의 일 구현예에 따르면, 타겟 유전자인 SETDB1 유전자의 mRNA 서열에 상응하는 서열)과 안티센스 가닥(상기 mRNA 서열에 상보적인 서열)이 서로 반대쪽에 위치하여 이중쇄를 이루는 구조를 가질 수 있으며, 본 발명의 siRNA 분자는 자기-상보성(self-complementary) 센스 및 안티센스 가닥을 가지는 단일쇄 구조를 가질 수 있다. 나아가 siRNA는 RNA끼리 짝을 이루는 이중사슬 RNA 부분이 완전히 쌍을 이루는 것에 한정되지 않고 미스매치(대응하는 염기가 상보적이지 않음), 벌지(일방의 사슬에 대응하는 염기가 없음) 등에 의하여 쌍을 이루지 않는 부분이 포함될 수 있다. 또한, siRNA 말단 구조는 타겟 유전자의 발현을 RNAi 효과에 의하여 억제할 수 있는 것이면 평활(blunt) 말단 혹은 점착(cohesive) 말단 모두 가능하고, 점착 말단 구조는 3'-말단 돌출 구조와 5'-말단 돌출 구조 모두 가능하다.
siRNA를 제조하는 방법은 시험관에서 siRNA를 직접 합성한 뒤, 형질전환 과정을 거쳐 세포 안으로 도입시키는 방법과 siRNA가 세포 안에서 발현되도록 제조된 siRNA 발현 벡터 또는 PCR-유래의 siRNA 발현 카세트 등을 세포 안으로 형질전환 또는 감염(infection)시키는 방법이 있다.
본 발명에서 “shRNA”란 small hairpin RNA 혹은 short hairpin RNA으로 불리며, RNA 간섭으로 유전자를 침묵시킬 수 있는 용도로 사용되는 것이다. 보통 벡터를 이용하여 목적 세포로 도입한다. 이러한 shRNA 헤어핀 구조는 세포 내 다른 물질에 의하여 절단되어 siRNA가 되기도 한다.
또한, 본 발명에 있어서, 상기 SETDB1 저해제는 CDX2(Caudal Type Homeobox 2), ELF3(E74 Like ETS Transcription Factor 3), HNF4G(hepatocyte nuclear factor 4 gamma), PPARG(Peroxisome proliferator-activated receptor gamma) 및 VDR(vitamin D receptor)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 단백질의 전사활성을 저해하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 암세포는 암 줄기 유사세포인 것을 특징으로 할 수 있다.
또한, 본 발명은 SETDB1 저해제를 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 암은 고형암일 수 있으며, 바람직하게는 대장암, 직장암, 간암, 위암, 폐암, 유방암 및 췌장암으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있고, 더욱 바람직하게는 대장암 또는 직장암, 가장 바람직하게는 대장암일 수 있으나, 종양의 분화 또는 증식 등 암의 진행이 본 발명에서 기술하는 암 줄기세포에 의존적인 암종이라면 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 있어서, 상기 SETDB1 저해제는 SETDB1 유전자의 안티센스 올리고뉴클레오티드, siRNA, shRNA, miRNA 및 SETDB1 단백질에 특이적인 항체로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서는 상기 shRNA로 서열번호 1 내지 3으로 표시되는 shRNA를 이용하였으며, 바람직하게는 서열번호 1로 표시되는 shRNA를 이용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 본 발명의 일 실시예에서는 상기 siRNA로 서열번호 14 또는 15로 표시되는 siRNA를 이용하였으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 따르면, 상기 SETDB1은 일부 분화능이 높은 암, 바람직하게는 대장암 세포에서 비정상적으로 과발현되어 암 줄기세포(또는 암 줄기 유사세포)의 분화능을 높게 유지하고 있으며, SETDB1 저해제를 사용할 경우 암 세포들이 정상 세포와 유사한 상태(post-mitotic)로 분화하고 이들의 성장속도가 크게 저해된다. 따라서, 본 발명에 따른 SETDB1 저해제를 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물은 암 세포 또는 암 줄기 유사세포의 분화치료에 사용할 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 SETDB1 저해제는 항암제 또는 방사선치료제의 병용투여제로 사용될 수 있으며, 이 때 암의 약물 내성 및 재발을 억제하여 치료적 효과를 높일 수 있다.
본 발명에 따른 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물은 추가적으로 다른 항암제와 병용투여할 수 있으며, 이를 통해 암 줄기세포뿐만 아니라 일반적인 암세포까지 치료하는데 사용될 수 있으며, 상기 약학 조성물은 암의 재발 또는 전이 억제용 약학 조성물로도 사용될 수 있다.
본 발명에 있어서 상기 약학적 조성물은 캡슐, 정제, 과립, 주사제, 연고제, 분말 또는 음료 형태임을 특징으로 할 수 있으며, 상기 약학적 조성물은 인간을 대상으로 하는 것을 특징으로 할 수 있다. 상기 약학적 조성물은 이들로 한정되는 것은 아니지만, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 캡슐, 정제, 수성 현탁액 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 약학적 조성물은 약제적으로 허용가능한 담체를 포함할 수 있다. 약제학적으로 허용되는 담체는 경구투여시에는 결합제, 활탁제, 붕해제, 부형제, 가용화제, 분산제, 안정화제, 현탁화제, 색소, 향료 등을 사용할 수 있으며, 주사제의 경우에는 완충제, 보존제, 무통화제, 가용화제, 등장제, 안정화제 등을 혼합하여 사용할 수 있으며, 국소투여용의 경우에는 기제, 부형제, 윤활제, 보존제 등을 사용할 수 있다. 본 발명에 따른 약학적 조성물의 제형은 상술한 바와 같은 약제학적으로 허용되는 담체와 혼합하여 다양하게 제조될 수 있다. 예를 들어, 경구투여 시에는 정제, 트로키, 캡슐, 엘릭서(elixir), 서스펜션, 시럽, 웨이퍼 등의 형태로 제조할 수 있으며, 주사제의 경우에는 단위 투약 앰플 또는 다수회 투약 형태로 제조할 수 있다. 기타, 용액, 현탁액, 정제, 캡슐, 서방형 제제 등으로 제형할 수 있다.
한편, 제제화에 적합한 담체, 부형제 및 희석제의 예로는, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말디톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 또는 광물유 등이 사용될 수 있다. 또한, 충진제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제, 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여 경로는 이들로 한정되는 것은 아니지만 구강, 정맥내, 근육내, 동맥내, 골수내, 경막내, 심장내, 경피, 피하, 복강내, 비강내, 장관, 국소, 설하 또는 직장이 포함된다. 상기 "비경구"는 피하, 피내, 정맥내, 근육내, 관절내, 활액낭내, 흉골내, 경막내, 병소내 및 두개골 내 주사 또는 주입기술을 포함한다. 본 발명에 따른 약학적 조성물은 또한 직장 투여를 위한 좌제의 형태로 투여될 수 있다.
본 발명에 따른 약학적 조성물은 사용된 특정 유효성분의 활성, 연령, 체중, 일반적인 건강, 성별, 정식, 투여시간, 투여경로, 배출율, 약물 배합 및 예방 또는 치료될 특정 질환의 중증을 포함한 여러 요인에 따라 다양하게 변할 수 있고, 상기 약학 조성물의 투여량은 환자의 상태, 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 바람직하게는 상기 요소를 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여할 수 있으며, 더욱 바람직하게는 1~10000㎍/체중kg/day, 더욱더 바람직하게는 10~1000㎎/체중kg/day의 유효용량으로 하루에 수회 반복 투여될 수 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 SETDB1 저해제를 포함하는 항암보조제를 제공한다.
본 발명에서 "항암보조제"란, 항암제의 항암효과를 개선, 향상 또는 증대시킬 수 있는 제제를 의미한다. 일례로서, 그 자체로는 항암활성을 나타내지 않으나, 항암제와 함께 사용될 경우 상기 항암제의 항암효과를 개선, 향상 또는 증대시킬 수 있는 제제를 항암보조제로서 사용할 수 있다.
다른 예로서, 농도의존적인 항암활성을 나타내는 제제를 그 자체로는 항암활성을 나타내지 않은 수준으로 항암제와 함께 사용할 경우, 상기 항암제의 항암효과를 개선, 향상 또는 증대시킬 수 있는 항암보조제로서 사용할 수 있다. 이 경우, 상기 항암보조제는 처리농도에 따라 항암제 또는 항암보조제로서 사용할 수 있으며, 그 자체로는 항암활성을 나타내지 않는 처리농도 범위에서 항암보조제로 사용할 수 있다.
본 발명에 따른 항암보조제는 항암제의 항암효과를 증대시키기 위해 항암제 또는 항암보조제와 병용 투여될 수 있다. 일례로서, 본 발명의 항암보조제는 독소루비신, 에토포시드(Etoposide), 다우노루비신(Daunorubicin), 미토산트론(Mitoxantrone) 등의 공지된 항암제와 함께 병용 투여될 수 있다.
상기 항암보조제의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 경로를 통해서든 투여될 수 있다. 본 발명의 항암보조제는 목적하는 바에 따라 복강 내 투여, 정맥 내 투여, 근육 내 투여, 피하 투여, 피 내 투여, 경구 투여, 비 내 투여, 폐 내 투여, 직장 내 투여될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 상기 항암보조제는 활성 물질이 표적 세포로 이동할 수 있는 임의의 장치에 의해 투여될 수 있다.
또한, 본 발명은 SETDB1 저해제를 포함하는 암 예방 또는 개선용 건강기능식품을 제공한다.
본 발명에 따른 건강기능식품은 암의 예방 및 개선을 목적으로, 정제, 캅셀, 분말, 과립, 액상, 환 등의 형태로 제조 및 가공할 수 있다.
본 발명에서 “건강기능식품”이란 건강기능식품에 관한 법률 제6727호에 따른 인체에 유용한 기능성을 가진 원료나 성분을 사용하여 제조 및 가공한 식품을 말하며, 인체의 구조 및 기능에 대하여 영양소를 조절하거나 생리학적 작용 등과 같은 보건 용도에 유용한 효과를 얻을 목적으로 섭취하는 것을 의미한다.
본 발명에 따른 건강기능식품은 통상의 식품 첨가물을 포함할 수 있으며, 식품 첨가물로서의 적합 여부는 다른 규정이 없는 한, 식품의약품안전청에 승인된 식품 첨가물 공전의 총칙 및 일반시험법 등에 따라 해당 품목에 관한 규격 및 기준에 의하여 판정한다.
상기 “식품 첨가물 공전”에 수재된 품목으로는 예를 들어, 케톤류, 글리신, 구연산칼슘, 니코틴산, 계피산 등의 화학적 합성물; 감색소, 감초추출물, 결정셀룰로오스, 고량색소, 구아검 등의 천연첨가물; L-글루타민산나트륨제제, 면류첨가알칼리제, 보존료제제, 타르색소제제 등의 혼합제제류 등을 들 수 있다.
예를 들어, 정제 형태의 건강기능식품은 본 발명의 유효성분인 SETDB1의 저해제를 부형제, 결합제, 붕해제 및 다른 첨가제와 혼합한 혼합물을 통상의 방법으로 과립화한 다음, 활택제 등을 넣어 압축성형하거나, 상기 혼합물을 직접 압축 성형할 수 있다. 또한 상기 정제 형태의 건강기능식품은 필요에 따라 교미제 등을 함유할 수도 있다.
캅셀 형태의 건강기능식품 중 경질 캅셀제는 통상의 경질 캅셀에 본 발명의 유효성분인 유효성분인 SETDB1의 저해제를 부형제 등의 첨가제와 혼합한 혼합물을 충진하여 제조할 수 있으며, 연질 캅셀제는 유효성분인 SETDB1의 저해제를 부형제 등의 첨가제와 혼합한 혼합물을 젤라틴과 같은 캅셀기제에 충진하여 제조할 수 있다. 상기 연질 캅셀제는 필요에 따라 글리세린 또는 소르비톨 등의 가소제, 착색제, 보존제 등을 함유할 수 있다.
환 형태의 건강기능식품은 본 발명의 유효성분인 SETDB1의 저해제와 부형제, 결합제, 붕해제 등을 혼합한 혼합물을 기존에 공지된 방법으로 성형하여 조제할 수 있으며, 필요에 따라 백당이나 다른 제피제로 제피할 수 있으며, 또는 전분, 탈크와 같은 물질로 표면을 코팅할 수도 있다.
과립 형태의 건강기능식품은 본 발명의 유효성분인 SETDB1의 저해제와 부형제, 결합제, 붕해제 등을 혼합한 혼합물을 기존에 공지된 방법으로 입상으로 제조할 수 있으며, 필요에 따라 착향제, 교미제 등을 함유할 수 있다.
상기 건강기능식품은 음료류, 육류, 초코렛, 식품류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 사탕류, 아이스크림류, 알코올 음료류, 비타민 복합제 및 건강보조식품류 등일 수 있다.
또한, 본 발명은 생체 외(In vitro)에서 SETDB1 또는 이의 저해제를 암 줄기 유사세포에 처리하는 단계를 포함하는 암 줄기 유사세포로부터 정상세포 또는 정상 유사 세포로의 분화 유도 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 (a) SETDB1을 발현하는 분리된 암 세포에 후보물질을 처리하는 단계; (b) 상기 후보물질이 처리된 분리된 암 세포에서 SETDB1 발현 수준을 측정하는 단계; 및 (c) 상기 (b) 단계에서 측정된 SETDB1 발현 수준이 후보물질이 처리되지 않은 분리된 암 세포에 비해 낮은 경우, 상기 후보물질을 암의 예방 또는 치료 제제로 사용할 수 있을 것으로 판정하는 단계; 를 포함하는 암의 예방 또는 치료 제제의 스크리닝 방법을 제공한다.
본 발명의 스크리닝 방법에 따르면, 먼저 상기 유전자 또는 단백질을 포함하는 암 세포에 분석하고자 하는 후보물질을 접촉시킬 수 있다. 상기 후보물질은 상기 유전자의 발현량, 단백질의 양 또는 단백질의 활성에 영향을 미치는지의 여부를 검사하기 위하여 스크리닝에서 이용되는 미지의 물질을 의미한다. 상기 시료는 화학물질, 안티센스 올리고뉴클레오티드, 안티센스-RNA, siRNA, shRNA, miRNA, 상기 단백질에 특이적인 항체 또는 천연물 추출물을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
이후, 후보물질이 처리된 세포에서 상기 유전자의 발현량, 단백질의 양 또는 단백질의 활성을 측정할 수 있으며, 측정 결과 상기 유전자의 발현량, 단백질의 양 또는 단백질의 활성이 감소되는 것이 측정되면 상기 후보물질은 암을 치료 또는 예방할 수 있는 제제로 사용할 수 있을 것으로 판정할 수 있다.
본 발명에 있어서, 유전자의 발현 수준 또는 단백질의 양을 측정하는 방법은 공지의 기술을 이용하여 생물학적 시료로부터 mRNA 또는 단백질을 분리하는 공지의 공정을 포함하여 수행될 수 있다. 본 발명에서 상기 "생물학적 시료"란 암의 발생 또는 진행 정도에 따른 상기 유전자의 발현 수준 또는 단백질의 수준이 정상 대조군과는 다른, 생체로부터 채취된 시료를 말하며, 상기 시료로는 예를 들면, 조직, 세포, 혈액, 혈청, 혈장, 타액 및 뇨 등이 포함될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 유전자의 발현 수준 측정은 바람직하게는 mRNA의 수준을 측정하는 것이며, mRNA의 수준을 측정하는 방법으로는 역전사 중합효소연쇄반응(RT-PCR), 실시간 역전사 중합효소연쇄반응, RNase 보호 분석법, 노던 블럿 및 DNA 칩 등이 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 단백질 수준의 측정은 항체를 이용할 수 있는데, 이러한 경우 생물학적 시료 내의 상기 마커 단백질과 이에 특이적인 항체는 결합물, 즉, 항원-항체 복합체를 형성하며, 항원-항체 복합체의 형성량은 검출 라벨 (detection label)의 시그널의 크기를 통해서 정량적으로 측정할 수 있다. 이러한 검출 라벨은 효소, 형광물, 리간드, 발광물, 미소입자(microparticle), 레독스 분자 및 방사선 동위원소로 이루어진 그룹 중에서 선택할 수 있으며, 이에 제한되지 않는다. 단백질 수준을 측정하기 위한 분석 방법으로는 웨스턴 블랏, ELISA, 방사선면역분석, 방사선 면역 확산법, 오우크테로니 면역 확산법, 로케트 면역전기영동, 조직면역 염색, 면역침전 분석법, 보체 고정분석법, FACS, 단백질 칩 등이 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 명세서에서 달리 정의되지 않은 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상적으로 사용되는 의미를 갖는 것이다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
재료 및 방법
세포 배양
Caco2, HCT116, SW480, SW620 인간 대장암 세포는 10% FBS 및 항생제 (페니실린 100units/mL, 스트렙토마이신 100μg/ml, 펀지존(Fungizone) 0.25μg/ml)(Life Technologies Corp.)가 첨가된 DMEM 배지에서 37℃, 5% CO2 조건으로 배양하였다. 레트로바이러스 형질도입을 위해서는 형질도입 후 3일 동안 퓨로마이신 2μg/ml를 첨가하여 배양하였고, 이후 기간 동안 퓨로마이신 1μg/ml를 첨가하여 배양하였다. 형질도입 3일 후, PPARG 및 VDR을 활성화시키기 위해 트로글리타존(Troglitazone; 10 uM, T2573, Sigma Aldrich) 및 1α,25-디하이드록시비타민 D3(1α,25-Dihydroxyvitamin D3; 25 nM, D1530, Sigma Aldrich)를 첨가하였다. 이후 실험에서 이를 보충된 분화 배지(supplemented differentiation medium)로 사용하였다.
유전자 발현 데이터 프로세싱
Affymetrix GeneChip Human Genome U133 Plus 2.0(GEO-integrated 정상 데이터 세트, n=318; GSE71571, GSE23194, GSE37364, GSE41328, GSE33114, GSE23878, GSE20916, GSE15960, GSE9254, GSE4183, GSE8671, GSE11831, GSE32323, GSE9348, GSE4107, GSE10714, GSE18105)을 이용하여 GEO(Gene Expression Omnibus) 데이터베이스로부터 17개의 독립된 정상 대장 점막의 유전자 발현 데이터를 수집하였다. 상기 데이터는 R(affy, sva package)을 사용하여 RMA(robust multi-array average) 방법으로 정규화 및 ComBat 방법으로 배치 조절(batch-corrected)되었다. 또한, Affymetrix GeneChip Human Genome U133 Plus 2.0(GEO-integrated 대장암 데이터 세트, n=2,166; GSE33113, GSE13067, GSE13294, GSE14333, GSE17536, GSE20916, GSE2109, GSE23878, GSE35896, GSE37892, GSE39582)을 이용하여 KFSYSCC 데이터 세트로부터 11개의 대장암 샘플의 유전자 발현 데이터를 수집하여 동일한 방법으로 처리하였다. 또한, Affymetrix Human Genome U219 Array(GEO-paired 데이터 세트, n=196; GSE44076)를 이용하여 98개의 인접한 정상 대장 점막 및 이의 암 조직의 paired 데이터를 사용하였다.
TCGA 데이터의 경우, 전사체(transcriptome) 데이터를 'TCGAbiolinks'(TCGA 데이터 세트, n=698)를 통해 GDC 데이터 포털로부터 다운 받은 ‘HTSeq- Fragments Per Kilobase of transcript per Million mapped reads upper quartile(FPKM-UQ)' 포맷으로 사용하였다. 단일 세포 RNA-seq 데이터 세트는 GEO 데이터베이스(단일-세포 RNA-seq 데이터 세트, n=432; GSE81861)로부터 다운받았고, 이전 연구(Li, H. et al. 2017)에서 기재한 바와 같이 상피 샘플을 선택적으로 사용하였다.
상기 데이터는 SMARTer Ultra-Low RNA Kit for Illumina(Clontech, 634948)를 사용하여 분석하였고, HiSeq 2000 platform(Illumina)을 사용하여 시퀀싱하였다. QC(quality control) 과정 후, 암 세포 및 이에 대응되는 정상 점막 세포로 이루어진 총 1,591개의 세포 중 626개의 세포가 유지되었다. 검출 가능할 정도로 발현된 유전자를 추가적으로 필터링하기 위해, 전체 샘플의 1/10 미만으로 측정된 유전자는 제거하였다.
유전자 세트
조직-특이적 유전자 세트는 Human Protein Atlas(HPA), Genotype-Tissue Expression project(GTEx) 및 Functional Annotation of the Mammalian Genome(FANTOM) project로부터 수득하여 사용하였다. 상세하게는, HPA로부터 각 조직에 대하여 “elevated genes(유전자 고발현)”로 분류되는 조직-특이적 유전자 리스트를 제공받아 사용하였고, GTEx로부터 다른 조직과 비교하여 특정 조직에서 적어도 5배 이상 높은 발현을 나타내는 조직-특이적 유전자 세트를 선택하여 사용하였다. 또한, 상기와 같은 방법에 근거하여 FANTOM5의 유전자 발현 데이터로부터 조직-특이적 유전자 세트를 정의하였다. 줄기/전구세포 관련 유전자 세트는 각각 이전 연구(Ben-Porath, I. et al. 2008; Wong, D. J. et al. 2008; Li, H. et al. 2017; Loh, K. M. et al. 2014; Kim, J. et al. 2010; Xie, R. et al. 2013)로부터 제공받아 사용하였다.
DEG 분석
R(siggenes package)을 이용하여 SAM(significance analysis of microarrays) 방법으로 DEG(Differentially expressed gene) 분석을 수행하였다. 델타 값은 GEO-integrated(delta=8.1) 및 GEO-paired(delta=15.9) 데이터 세트에서 FDR(false discovery rate)이 0이 되도록, TCGA 데이터 세트(delta=9.9)에서는 1.0e-06보다 낮도록 설정되었다. 상기 3 종류의 데이터 세트 모두에서 정상 대장 점막에서 대장암 조직보다 높은 발현을 보이는 공통 유전자는 정상-특이적(normal-specific) 유전자로 정의하였다.
GSEA 분석
GSEA(Gene Set enrichment analysis, 유전자 세트 증폭 분석)는 R(GSVA package) 및 Broad Institute로부터 제공받은 GSEA code를 이용하여 수행하였다. GSVA는 비모수적, 비지도 방법으로 클래스 라벨(class label) 없이 샘플들 간의 gene set enrichment 변화값을 평가한다. 각 샘플은 독립적으로 평가되었으며, 정상 및 암 샘플들은 데이터 세트 상에서 비교평가하였다. 통계적 유의성은 R(limma package)을 사용한 moderated t-test의 P value로 결정하였다. GSEA 분석을 통해 3 종류 셀 라인의 RNA-seq 데이터를 분석하고, ES(Enrichment score) 및 P-value를 계산하여 통계적으로 유의미한 발현양상이 비슷한지 다른지를 확인하였다.
생존율 분석
TCGA에서 633 명의 대장암 환자 생존율 데이터를 제공받아 카플란-마이어(Kaplan-Meier) 방법을 수행하였다. 전체 생존율 및 무질병 생존율에 대한 임상적 정보는 cBioPortal에서 다운받아 사용하였다. 대장-특이적 유전자 세트의 GSVA 점수의 중앙값에 따라 환자들을 두 그룹으로 분류하였다. 또한, 상기 그룹을 다시 SETDB1 유전자 발현 수준의 제3 사분위수(quantile)로 분류하였다. 분석에는 R(survival package)을 사용하였으며, 통계적 유의성은 로그순위법(log-rank test)으로 평가하여 제시하였다.
단일 세포 RNA 시퀀싱 데이터의 주성분 분석( PCA )
상태-특이적(state-specific) 유전자 발현 프로파일을 로버스트하게(robustly) 측정하기 위하여, 결측치 대체 알고리즘(MAGIC)을 적용하여 중도탈락(dropout)을 대체하고 상태-특이적 유전자 세트에 대한 주성분 분석(Principal component analysis, PCA)을 수행하였다. 대장-특이적, 장 줄기세포-특이적 및 배아 줄기세포-특이적 유전자 세트와 관련하여, 각각 독립적으로 PCA를 수행하고 PC1을 대표값으로 사용하였다.
가상시간( pseudotime ) 분석
대장암의 세포 궤적(cellular trajectories)을 재구성하기 위하여, SLICER(Selective locally linear inference of cellular expression relationships) 알고리즘 및 Monocle2를 사용하였다. SLICER는 샘플간 지오데식(geodesic) 거리를 계산하는 국소 선형 임베딩 알고리즘을 사용하여 비선형적 차원 축소를 수행한다. SLICER를 통한 차원 축소에는 전체 단일 세포 RNA 시퀀싱 데이터의 1/10보다 많게 측정된 유전자를 사용하였다. Monocle2의 경우, 정상 및 암 샘플 간에 서로 다르게 발현된 유전자들을 0.01의 q value로 결정하였다. Monocle2를 수행하기 위하여 DDRTree(Discriminative Dimensionality Reduction with Trees) 방법을 사용하였다.
세포주기 분석
세포주기에서 G1/S 및 G2/M을 대표하는 유전자 세트는 이전 연구(Tirosh, I. et al. 2016)에서 정의된 것을 사용하였다. 각 유전자 세트의 평균 발현량을 계산하고, 3.0 이상의 평균 발현량으로 각 기(phase)의 세포들을 결정하였다. 이는 할당된 샘플 및 남은 샘플들을 통계적으로 비교했을 때 각각 P value 1.5e-10 및 2.0e-16으로 나타났다.
전사 엔트로피(transcription entropy) 분석
단일 세포 RNA-seq 데이터를 리드 수(read counts) 포맷으로 사용하였다. 중간값 정규화는 R(RaceID2 알고리즘)을 사용하여 수행하였다. 전사 엔트로피는 정보 엔트로피(information entropy)에 대한 일반 공식으로 정의되며, 여기서 각 확률은 세포에서 단일 유전자의 전사물(transcrips)의 수를 나타낸다. 분석은 이전 연구(Grun, D. et al. 2016)에 기재된 바와 같이 수행하였다.
네트워크 추론 및 핵심 전사인자 규명
맥락 의존적(context specific) 유전자 조절 네트워크(gene regulatory networks, GRNs)를 추론하기 위하여, ARACNE 알고리즘을 사용하여 각 데이터 세트의 상호정보량을 계산하였다. 이 때, 이전 연구(Carro, M. S. et al. 2010)에서 규명되고, FANTOM에 의해 정의된 전사인자 목록을 사용하였다. GEO-integrated 정상 데이터 및 GEO-paired 정상 데이터로부터 GRN을 추론하고, 이를 각각 GEO-integrated normal GRN 및 GEO-paired normal GRN으로 지칭하였다. 정상 대장 상피 세포의 주요 조절자(master regulator)를 규명하기 위하여, P value 컷오프 1e-10으로 하여 MARINA(Master Regulator Inference Algorithm)를 사용하였다. GEO-integrated normal GRN 및 GEO-paired normal GRN에 대하여, 추론된 타겟 유전자가 각각 대장 조직-특이적 유전자 및 정상-특이적 유전자에서 현저하게 증폭된 전사인자를 규명하였다. 대장-특이적 유전자 및 정상-특이적 유전자를 표적 유전자로 포함하는 공통 전사인자를 정상 대장 상피 세포의 핵심 전사인자로 정의하였다. 전사인자의 전사 활성(transcriptional activity)은 VIPER(Virtual Inference of Protein activity by Enriched Regulon analysis)를 이용하여 측정하였다. 단일 샘플 VIPER 방법으로 계산된 정규화된 ES(Enrichment Score)값으로 전사 활성을 판단하였다.
추론된 GRN을 통한 조절자(modulator)의 규명
잠재적 조절자 또는 원인 유전자(potential modulator)를 규명하기 위하여, 다음과 같은 기준을 정립하였다: 1) 대장-특이적 유전자와의 음성 조절 작용(negative regulatory interaction), 2) 핵심 전사인자와 단백질-단백질 상호작용 및 3) 조절자의 유전자 발현 의존적으로 핵심 전사인자 및 이의 타겟 유전자 간의 조절 작용 변화를 유도. 대장-특이적 유전자의 발현에 대한 잠재적 조절자의 음성 조절을 측정하기 위하여 VIPER 알고리즘을 사용하였다. GEO-integrated 암 데이터 세트에서 ARACNE 알고리즘을 사용하여 단백질(GO: 0006464, cellular protein modification process, n=2,477)로 구성된 조절 네트워크를 재구성하였다. 추정상의 조절자(putative modulator)를 정의하기 위하여, 대장-특이적 유전자 세트에서 다중 샘플(multiple sample) 버전의 VIPER를 사용하여 대장-특이적 유전자와 현저한 조절 작용(regulatory interaction)을 나타내는 단백질을 선별하였다(P value 0.01 이하). 단백질-단백질 상호작용을 평가하기 위하여 STRING 데이터베이스를 사용하였다. 각 잠재적 조절자의 상호작용 점수는 각 조절자와 5개의 핵심 전사인자의 'combined interaction scores' 값을 합산함으로써 계산되었다. 각 잠재적 조절자와 핵심 전사인자 간의 조절 작용 변화를 확인하기 위하여, P value 컷오프 threshold를 1e-05로 하는 MINDy(Modulator Inference by Network Dynamics) 알고리즘을 사용하여 CMI(Conditional Mutual Information)를 평가하였다. 구체적으로, GEO-integrated 암 데이터에서 잠재적 조절자의 가장 높은 유전자 발현을 보이는 300개의 샘플 및 잠재적 조절자의 가장 낮은 유전자 발현을 보이는 300개의 샘플을 사용하였다. 데이터 세트 중 가장 많은 수의 샘플을 가진 GEO-integrated normal GRN을 사용하였다.
유세포 분석(Flow cytometry )
In vitro 배양 세포를 4% PFA로 고정하고 제조자의 프로토콜에 따라(Cat. No. 554714, BD Biosciences) KRT20 항체(13063S, Cell Signaling) 및 FITC-항 토끼 IgG(554020, BD Pharmingen)로 염색하였다. 세포 내 면역형광 염색 세포로부터 RNA를 분리하기 위해 1:100 RNasin Plus RNase 저해제(N2615, Promega)를 사용하여 RNase 없는 조건에서 실험을 수행하고, MARIS 프로토콜에 따라 세포 내 분류(intracellular sorting)를 수행하였다. 유세포 분석은 FACS Jazz(BD Biosciences) 및 BD FACSDiva 소프트웨어를 사용하여 수행하였다.
면역형광 염색( Immunofluorescence )
면역형광 염색을 위하여 암 세포를 4%(vol/vol) 포름알데히드에 15분 동안 고정시킨 후 2% BSA와 0.1% Triton-X100/PBS 용액으로 1시간 동안 블로킹(blocking)하고, 1차 항체 KRT20(13063S, Cell Signaling) 및 Ki-67(11882S, Cell Signaling)를 염색 버퍼(staining buffer)로 1:200으로 희석하여 4℃에서 밤새 배양하였다. 이후 PBS로 세척하고, 2차 항체(ab150113, ab150080)를 염색 버퍼로 1:300으로 희석하여 1시간 동안 배양하였다. DAPI는 공초점 현미경 분석 1시간 전에 염색하였다. 이미징은 Nikon A1R 공초점 현미경(Nikon Instruments) 및 디지털 줌 Nikon 이미징 소프트웨어(NIS-element AR)를 사용하여 수행하였다. 이미지 분석은 Nikon 이미징 소프트웨어(NIS-element AR)를 사용하여 수행하였고, Ki-67 양성 세포의 수는 MATLAB을 사용하여 계수하였다.
siRNA , shRNA 넉다운 (knockdown)
EHMT2, HDAC2, KAT2A, KDM1A, PRMT1, SETDB1, SMYD2 및 SMYD3에 대한 siRNA는 이전 연구에서 제공받은 서열에 따라 합성하여(Bioneer) 사용하였다. 대조군으로는 scramble siRNA(Bioneer)을 사용하였고, 감염은 Lipofectamine RNAiMAX(Invitrogen)을 사용하여 수행하였다. 레트로바이러스-매개된 shRNA는 Sigma-Aldrich로부터 구매하여 사용하였다. 사용한 모든 SETDB1에 대한 shRNA 및 siRNA의 서열 정보는 하기 표 1 및 표 2에 나타내었다.
이름 서열 (5' - 3') 서열번호
shSETDB1#1 CCGGGCTCAGATGATAACTTCTGTACTCGAGTACAGAAGTTATCATCTGAGCTTTTTG 1
shSETDB1#2 CCGGGCTCAGATGATAACTTCTGTACTCGAGTACAGAAGTTATCATCTGAGCTTTTTTG 2
shSETDB1#3 CCGGAGTTAGAGACATGGGTAATACCTCGAGGTATTACCCATGTCTCTAACTTTTTTG 3
이름 서열 (5' - 3') 서열번호
EHMT2-S CACACACCGACCAGAGA 4
EHMT2-AS UCUCUGGUCGGUGUGUG 5
HDAC2-S CGGGGCAACAACA 6
HDAC2-AS UGUUGUUGCCCCG 7
KAT2A-S GGAAAUGCAUCCUGCAGAU 8
KAT2A-AS AUCUGCAGGAUGCAUUUCC 9
KDM1A-S CACAAGGAAAGCAGAAGA 10
KDM1A-AS UCUUCUGCUUUCCUUGUG 11
PRMT1-S GGACAUGACAUCCAAAGAU 12
PRMT1-AS AUCUUUGGAUGUCAUGUCC 13
SETDB1-S CGGGGGCGCCAAAACAA 14
SETDB1-AS UUGUUUUGGCGCCCCCG 15
SMYD2-S GAUUUGAUUCAGAGUGACA 16
SMYD2-AS UGUCACUCUGAAUCAAAUC 17
SMYD3-S AGCCUGAUUGAAGAUUUGA 18
SMYD3-AS UCAAAUCUUCAAUCAGGCU 19
플라스미드 제작
CDX2, ELF3, HNF4G, PPARG 및 VDR의 외인성 발현(extrinsic expression)을 위해 각 유전자의 전장 cDNA를 인간 대장 cDNA 라이브러리(Clontech)로부터 RT-PCR로 증폭시켰다. 각 cDNA는 pLentiM1.4 렌티바이러스 벡터에 연결하고 시퀀싱으로 확인하였다.
RNA 분리, 정량적 RT- PCR 및 RNA 시퀀싱
RNA는 RNA-spin 키트(INTRON)를 사용하여 추출하고, Diaster RT 키트(Solgent) 및 2X Taq premix(Solgent)를 제조사의 프로토콜에 따라 사용하여 cDNA를 합성하였다. 역전사 후, SYBR Master Mix(GeNet Bio)와 함께 QuantStudio5(Applied Biosystems)를 사용하여 정량적 PCR을 수행하였다. PCR 반응물을 서로 독립적인 3개의 복제물로 실시하고, β-액틴의 mRNA 발현을 이용해 정규화하였다. RT-PCR에 사용한 모든 프라이머의 서열은 하기 표 3에 나타내었다.
이름 서열 (5' - 3') 서열번호
AQP8-F GCC ATC AAT GAG AAG ACA AAG G 20
AQP8-R CAC CTA ATG AGC AGT CCA ACA A 21
B-actin-F AGA GCT ACG AGC TGC CTG AC 22
B-actin-R AGC ACT GTG TTG GCG TAC AG 23
CA1-F CCA AAC ATG ACA CCT CTC TGA A 24
CA1-R AGC TCG GCA GAA TAT TTG ACT C 25
CD44-F CTG CCG CTT TGC AGG TGT A 26
CD44-R CAT TGT GGG CAA GGT GCT ATT 27
CDX2-F TTC ACT ACA GTC GCT ACA TCA CC 28
CDX2-R TCT GGG ACA CTT CTC AGA GGA C 29
CEACAM5-F CAG ATC AGG GGA AAA TCT GAA C 30
CEACAM5-R TCG TGA CTG TGG TCC TAT TGA G 31
EHMT2-F TGC GTG CTG TTA TTC CTG TC 32
EHMT2-R TGA TCT TCT CTG TGC GGA TG 33
ELF3-F CAA AGA GTA CTG GGA CTG TCT CG 34
ELF3-R CTC AGC TTC TCG TAG GTC ATG TT 35
FABP1-F GCA GAG CCA GGA AAA CTT TG 36
FABP1-R TCT CCC CTG TCA TTG TCT CC 37
FABP2-F AAG CTT GCA GCT CAT GAC AA 38
FABP2-R TCC ATT GTC TGT CCG TTT GA 39
GAPDH-F TGA TGA CAT CAA GAA GGT GGT GAA G 40
GAPDH-R TCC TTG GAG GCC ATG TGG GCC AT 41
HDAC2-F GAG GTG GCT ACA CAA TCC GTA 42
HDAC2-R ACA CCA GGT GCA TGA GGT AAC 43
HNF4G-F GTT TCT TCA GAC GCA GCA TTC 44
HNF4G-R AAC TTC AGC TTG TGC CAG TGT 45
KAT2A-F GCT GAC CAC GTA TCC CAC TT 46
KAT2A-R ATG CAT TTC CGC AGT AGC TT 47
KDM1A-F TCA ACT CTC TCC CTT AAG CAC TG 48
KDM1A-R CAC AGC TAT CAC TTC ACA TCC TG 49
KRT20-F ACG CCA GAA CAA CGA ATA CC 50
KRT20-R ACG ACC TTG CCA TCC ACT AC 51
LGR5-F CTC CCA GGT CTG GTG TGT TG 52
LGR5-R GAG GTC TAG GTA GGA GGT GAA G 53
MYC-F GGC TCC TGG CAA AAG GTC A 54
MYC-R CTG CGT AGT TGT GCT GAT GT 55
PPARG-F ATC TCT CCG TAA TGG AAG ACC A 56
PPARG-R AGG CTC TTC ATG AGG CTT ATT G 57
PRMT1-F ACC GCA ACT CCA TGT TTC A 58
PRMT1-R CCA CCT TCC CCT TGA TGA T 59
SETDB1-F CCG GCC TAC AGA AAT AAT TGA G 60
SETDB1-R CAA GGT TCC TTT ATG CAG ATC C 61
SMYD2-F GTG TAC CAC CAA GGA CAA GGA T 62
SMYD2-R AGA TCT CCA GCA GCT CAC TAG G 63
SMYD3-F AGA ACT GAA GGC ACA CTG GAA 64
SMYD3-R TTC ATC ACT TGA ACC CCT CTG 65
VDR-F AGA TGA CCC TTC TGT GAC CCT A 66
VDR-R ATG GCA CTT GAC TTC AGC AGT A 67
레트로바이러스 생산 및 형질도입(transduction)
레트로바이러스-매개된 유전자 전달을 위해 HEK293T 세포를 제조사의 프로토콜에 따라 Lipofectamine(Invitrogen)을 사용하여 각 관련 렌티바이러스 플라스미드 및 패키징 플라스미드(pLP1, pLP2 및 pLP/VSV-G; Invitrogen)로 형질감염시켰다. 48시간의 형질감염 후 배지를 수집하고, 0.22μm 셀룰로오스 아세테이트 필터로 여과하였다. 이후, 바이러스를 함유하는 배지를 90분 동안 25,000 r.p.m.으로 원심분리하였다(Optima L90K, Beckman). 렌티바이러스로 패키징된 CDX2, ELF3, HNF4G, PPARG 및 VDR을 4μg/ml 폴리브린(polybrene)이 첨가된 완전 DMEM 2ml에서 농축시킨 후 HCT116 및 SW480 세포주에 감염시켰다. 렌티바이러스로 패키징된 shSETDB1은 농축 없이 Caco2, HCT116 및 W480에 감염시켰다.
콜로니 형성 분석
콜로니 형성 분석을 위하여, 6-웰 플레이트에 500개의 세포를 시딩하고 Troglitazone(10μM, T2573; Sigma Aldrich) 및 1α,25-Dihydroxyvitamin D3(25nM, D1530; Sigma Aldrich)이 첨가된 배지에서 14일 동안 배양하였다. 세포들을 3.7% 파라포름알데히드에 15분 동안 고정시킨 후, 0.5% 크리스탈 바이올렛 용액으로 1시간 동안 염색하였다. 증류수로 세척 및 건조 후 이미지를 수득하였다.
세포 생장 분석
세포 생장을 분석하기 위하여, 형질감염된 세포들을 96-웰 플레이트(5 x 103 cells/well)에 시딩하고 IncuCyte ZOOM(Essen Bioscience)을 사용하여 3시간 마다 촬영하였다. 세포 수(confluence)는 IncuCyte ZOOM 2016A 소프트웨어를 사용하여 분석하였다.
마이크로어레이 ( Microarray ) 분석
Caco2, HCT116, SW480 및 SW620의 경우, 단일 샘플에서 마이크로어레이 분석을 수행하였다. RNA-spin 키트(INTRON)를 사용하여 총 RNA를 추출하였고, RNA 순도(purity)와 보존상태(integrity)는 ND-1000 분광광도계(NanoDrop), Agilent 2100 Bioanalyzer(Agilent Technologies)를 사용하여 평가하였다. 단편화된 cRNA는 45℃에서 16시간 동안 Affymetrix GeneChip Human Genome U133 Plus 2.0 Gene Expression Array에 혼성화 하였다. 혼성화된 어레이를 GeneChip Fluidics Station 450에서 세척 및 염색하고 GCS3000 Scanner(Affymetrix)를 이용하여 스캔하였다. 신호값은 Affymetrix® GeneChip™ 소프트웨어를 사용하여 계산되었으며, 데이터는 RMA 방법으로 정규화하였다.
Bulk RNA 시퀀싱 분석
RNA-spin 키트(INTRON)을 사용하여 총 RNA를 추출하였고, RNA 품질은 RNA 6000 Nano Chip(Agilent Technologies)을 사용하여 Agilent 2100 bioanalyzer로 평가하였다. RNA 정량은 ND-2000 분광광도계(Thermo Inc.)로 수행하였으며, 샘플당 RNA 500ng을 라이브러리 제작에 사용하였다. 라이브러리 제작에는 QuantSeq 3' mRNA-Seq Library Prep 키트(Lexogen Inc.)를 사용하였으며, 라이브러리는 Illumina NextSeq 500(Illumina Inc.)을 사용하여 싱글-엔드(single-end) 시퀀싱하였다. 리드(read)는 Bowtie2를 사용하여 정렬하였고, Bedtools로 추산된 리드 수(read counts)는 이후 R(edgeR package)을 사용하여 Quantile-Quantile 정규화 방법을 기반으로 처리되었다.
단일 세포 RNA 시퀀싱 분석
SETDB1을 타겟으로 하는 shRNA 및 shScramble을 안정적으로 발현한 Caco2 세포에 대하여, 10X Genomics Chromium machine을 사용하여 단일 세포를 분리하고 cDNA를 준비하였다. 나노리터 수준의 단일 세포 Gel Bead-In-EMulsions(GEMs)을 제작하기 위하여 Chromium Single Cell Instrument 위에 3000개의 세포를 로딩하였다. 그 다음, 바코드화된 cDNA를 PCR을 수행하여 증폭시켰으며 version 1 Chromium Single Cell 3' Library, Gel beads 및 Multiplex 키트(10X Genomics)를 사용하여 단일 세포 RNA 시퀀싱 라이브러리를 제작하였다. 라이브러리들은 qPCR을 통해 정량화되었으며, TapeStation D1000 ScreenTape (Agilent Technologies, Waldbronn, Germany)를 이용하여 품질을 확인하였다. 인덱싱된 라이브러리들은 HiSeq2500 platform(Illumina)를 사용하여 시퀀싱하였다.
단일 세포 RNA 시퀀싱 데이터의 전처리 및 QC (Quality Control)
Raw FASTQ 파일을 hg19 human genome assembly에 정렬하고 10X Genomics Cell Ranger 파이프라인(https ://support. 10xgenomics .com/single- cellgene -expression/software/downloads/latest)을 표준 설정으로 사용하여 두 샘플을 집단화하였다. 총 카운트가 20,000 이하이거나 발현된 유전자의 수가 3,000 이하인 세포들은 배제되었다. QC 수행 후, shSETDB1 샘플의 453개 세포 및 shScramble 샘플의 654개 세포를 수득하였다. 세포 특이적 편차를 조정하기 위해 scater package를 사용하여 라이브러리 사이즈 정규화를 수행하고, 이후 분석에서는 로그 변환된 정규화된 표현값을 사용하였다.
실시예 1. 정상 대장 조직 샘플 및 대장암 조직 샘플의 비교분석
GEO 데이터베이스, TCGA 데이터베이스에서 추출한 약 600개의 정상 대장 조직 샘플과 약 3000개의 대장암 조직 샘플에 대하여 GSEA(Gene Set Enrichment Analysis)를 수행하였다. 대장(Colon)-특이적 유전자 세트는 Human Protein Atlas에서, 장 줄기세포(intestinal stem cell, ISC)-특이적 유전자 세트 및 배아 줄기 세포(embryonic stem cell, ESC)-특이적 유전자 세트는 이전 연구로부터 제공받아 사용하였다(Li et al. 및 Wong et al.). P-value는 이표본 비율 검정(two-sample proportion test)을 수행하여 도출하였다(*P<1e-10, **P<1e-30, ***P<1e-50). 또한, 단일 세포 RNA-seq 데이터로부터 세포 궤적을 추론하기 위해 SLICER를 이용한 국소 선형 임베딩(local linear embedding, LLE)을 수행하였다. 또한, 각 유전자의 발현 패턴을 분류하기 위해 주성분 분석(principal component analysis, PCA)을 수행하여 특징을 추출하였다. 나아가, 전체 세포 집단의 세포주기를 분석하여 산포도(scatter plot)로 나타내었다. 그 결과를 도 1에 나타내었다.
도 1에 나타낸 바와 같이, 모든 데이터 세트에서 암 샘플의 가장 명백한 특징은 대장-특이적 유전자 세트의 발현 감소임을 확인하였다(도 1의 a-c). 또한, 단일 세포 분석을 통하여 대장 조직 내에 분화능이 높은 암 줄기세포와 분화능이 사라진 분화암세포가 있음을 확인하였다(도 1의 d-g). 또한, 세포분열을 하고 있는 세포들은 분화능이 높은 암줄기세포에 국한되어 있음을 확인하였다(도 1의 h).
실시예 2. 정상 대장 세포의 특이적 유전 발현 패턴의 임상적 관련성 확인
정상 대장 세포의 특이적 유전 발현 패턴이 임상적 관점에서 관련이 있는지 확인하였다. 구체적으로, 카플란-마이어(Kaplan-Meier) 방법을 이용하여 전체 생존율(n=623, P-value=0.011) 및 무질병 생존율(n=623, P-value=0.0011)을 분석하였다. 대장-특이적 유전자 세트의 GSVA 스코어는 중앙값을 컷오프(cutoff)로 하여 높음(colon high) 또는 낮음(colon low)으로 이분화시켰다. 또한, TCGA에 의해 평가된 TNM 병기 결정 시스템에 근거한 대장-특이적 유전자 세트의 GSVA 점수를 박스 플롯으로 나타내었다. 대장-특이적 유전자 세트는 실시예 1에서 기재한 바와 같이 Human Protein Atlas로부터 제공받아 사용하였다. 그 결과를 도 2에 나타내었다.
도 2에 나타낸 바와 같이, 대장암 세포와는 달리 정상 대장 세포에서 높게 유지되는 대장 특이적 유전자들의 발현도가 높을수록 환자의 생존 확률이 높음을 확인하였다(도 2의 a). 또한, 대장 특이적 유전자들의 발현도가 환자의 원발암 크기와 반비례 관계를 가지고 있음을 확인하였다(도 2의 b).
실시예 3. 정상 대장 세포의 핵심 전사인자 규명 및 발현도와 활성도 분석
공공 유전체데이터를 통해 추론된 두 개의 독립된 유전자 조절 네트워크로부터 정상 대장 세포의 핵심 전사인자를 규명하고, 이의 발현도와 활성도를 비교 분석하였다. 구체적으로, GEO(Gene Expression Omnibus)-integrated 정상 데이터 세트(GEO-intergrated normal GRN) 및 GEO-paired 정상 데이터 세트(GEO-paired normal GRN)로부터 추론된 유전자 조절 네트워크(gene regulatory network, GRN)를 각각 사용하여 MARINA 분석을 통해 대장-특이적 유전자 및 정상 유전자를 조절하는 핵심 전사인자를 도출하였으며(도 3의 a), GEO-integrated normal GRN을 기반으로 하여 상기 핵심 전사인자와 이들의 타겟 유전자를 시각화하였다(도 3의 b). 각 노드(node)는 Student's t-test(unpaired, two-tailed)로 검정된 정상 및 암 세포간 차이의 통계학적 유의성에 기반하여 서로 다른 색으로 표시되었다.
또한, GEO-paired 정상 유전자 조절 네트워크 각 핵심 전사인자 및 이의 레귤론(regulon, 전사인자의 타겟 유전자로 추론된 유전자 집단) 간의 피어슨 상관 계수를 히스토그램으로 나타내었다(도 3의 c). 나아가, GEO-paired 데이터 세트에서 핵심 전사인자의 유전자 발현 수준을 비교하고, GEO-paired normal GRN 및 GEO-integrated normal GRN에서 VIPER 알고리즘을 통해 추론된 핵심 전사인자의 활성도를 분석하였다(도 3의 d-f). 그 결과를 도 3에 나타내었다.
도 3에 나타낸 바와 같이, MARINA 분석을 수행한 결과 P-value가 1e-10보다 낮은 정상 대장 세포 전사인자인 CDX2, ELF3, HNF4G, PPARG, VDR가 분화된 정상 대장세포의 특이적 유전자 발현패턴을 결정하는 핵심 전사인자임을 확인하였다(도 3의 a-b). 또한, 상기 핵심 전사인자들의 발현도 및 활성도는 정상세포에 비해 대장암세포에서 현저히 줄어 들어 있음을 확인하였다(도 3의 c-f).
실시예 4. 전사인자의 활성을 억제하는 원인 유전자 탐색
상기 실시예 3에서 확인한 바와 같이, 정상 대장 세포 전사인자가 대장암 세포에서 중요한 역할을 하는바, 다음으로 정상 대장 세포의 특이적 유전자 발현 패턴을 조절하는 핵심 전사인자의 활성을 억제하는 잠재적 조절자 또는 원인 유전자(크로마틴 조절자, chromatin regulator)를 탐색하고 그 결과를 도 4에 나타내었다.
도 4에 나타낸 바와 같이, 먼저 대장 관련 유전자 발현과 음의 상관관계를 보인 유전자들 사이의 GO term enrichment 분석을 수행하여 15개의 잠재적 조절자를 선별하였다(도 4의 a). 그 중 STRING 데이터베이스 및 각 잠재적 조절자와 핵심 전사인자 간의 조절 작용 변화를 평가한 CMI 점수 분석 결과에 따라 높은 유전자 발현량을 나타낸 8개의 잠재적 조절자를 선별하였다(도 4의 b).
그 다음, 대장 유래 대장직장 선암종(colorectal adenocarcinoma) 세포이자 상피 세포인 Caco2 세포에 8가지 크로마틴 조절자를 상기 표 2에 기재된 siRNA(siEHMT2, siHDAC2, siKAT2A, siKDM1A, siPRMT1, siSETDB1, siSMYD2, siSMYD3)로 각각 형질감염시킨 후 분화 마커 및 줄기세포 관련 유전자의 발현 정도를 분석하기 위해 qRT-PCR을 수행하였다(n=3, mean±s.e.m.). 상기 qRT-PCR 분석 결과 가장 높은 넉다운 효율을 보인 SETDB1를 최종 조절자로 선별하였다. 레트로바이러스 매개된 shRNA 간섭에 의한 SETDB1의 장기간 억제 효과를 확인하기 위하여 Caco2 세포뿐만 아니라, 다섯 개의 핵심 전사인자를 모두 과발현하는 대장암 세포주인 HCT116 및 SW480에 대한 실험을 설계하고, 유세포 분석을 통해 세포 분화 상태에 대한 SETDB1 결핍의 효과를 확인하였다. shRNA는 상기 표 1에 기재된 서열번호 1의 shRNA를 사용하였다. 나아가, 분화된 정상 유사 세포의 표현형적 특징을 결정하기 위하여 면역형광염색 및 콜로니 형성 분석을 수행하였다. 그 결과를 도 5에 나타내었다.
도 5에 나타낸 바와 같이, SETDB1의 발현을 억제하였을 때 KRT20, FABP1, FABP2, CEACAM5 등의 분화 마커의 발현량이 크게 증가하고 동시에 LGR5, CD44, MYC와 같은 줄기세포 관련 유전자들의 발현량은 크게 감소함을 확인하였다(도 5의 a). 또한, 실시간 세포 촬영 이미지를 통해 SETDB1의 발현 억제시 대장암세포의 분열 속도가 크게 저해됨을 확인하였다(도 5의 b). 도 5의 c에 나타낸 실험 프로토콜에 따라 SETDB1의 발현을 장기간 억제하면 암세포 분화가 유도됨을 유세포 분석을 통해 확인하였다(도 5의 d). 공초점 현미경 이미지 및 콜로니 분석을 통해 KRT20 분화 마커를 발현하는 분화된 암세포들은 더 이상 성장하지 않음을 단일 세포 수준에서 확인(도 5의 e-f)하였고, 군집레벨에서도 SETDB1 발현 억제된 암세포들의 성장이 억제됨을 확인하였다(도 5의 g-h).
상기 RNA 간섭 실험을 통한 스크리닝 결과를 통해, SETDB1 유전자는 정상 대장 세포의 특이적 유전자 발현 패턴을 조절하는 핵심 전사인자의 활성 억제에 주요한 역할을 수행하며, 5개의 핵심 전사인자를 발현하는 대장암 세포주에서 SETDB1의 넉다운은 세포를 줄기세포 유사 표현형에서 post-mitotic 상태로 분화하도록 유도함을 확인하였다.
실시예 5. SETDB1 억제에 따른 분화된 정상-유사 세포에서의 유전자 발현양상 확인
SETDB1 억제에 따라 정상 분화된 대장 세포와 같은 유전체 발현 프로파일(global gene expression profile)이 생성되는지 여부를 확인하기 위하여, 단일 세포 RNA-seq 및 bulk RNA-seq 분석을 수행하였다. 단일 세포 RNA-seq 분석을 위해서는 shSETDB1 및 shScramble을 도입한 Caco2 세포를 사용하여 각각 453개 및 654개의 세포를 수득하였다. shScramble-Naive 샘플을 제외한 모든 in vitro 샘플은 분화 조건(differentiation condition)에서 배양하였다. 그 결과를 도 6에 나타내었다.
도 6에 나타낸 바와 같이, SETDB1의 발현을 일주일간 억제하면 해당 세포들에서 대장-특이적 유전자들의 발현이 다시 증가하고, 배아 줄기세포-특이적 유전자 및 장 줄기세포-특이적 유전자들의 발현은 감소함을 확인하였다(도 6의 a-d). 또한, 환자 데이터와 비교하였을 때 분화된 암세포가 정상세포와 함께 분류되는 것을 통해 성공적으로 암이 정상화 되었음을 확인하였다(도 6의 e). 이를 통해, RNA-시퀸싱을 통해 분화된 암세포가 정상 대장 세포의 발현 패턴을 성공적으로 회복하였음을 확인하였다.
상기 결과를 통하여, 본 발명에 따른 SETDB1은 고형암의 일종인 대장암 세포의 성장과 분화능을 조절하는 핵심 단백질이며, 이를 억제 시 대장암 세포의 악성이 현저히 감소하여 정상세포와 같은 상태로 변화함을 확인하였다. 따라서, SETDB1 및 이의 저해제를 포함하는 암세포의 분열 또는 분화 조절용 조성물은 SETDB1을 대상으로 한 새로운 표적 치료법 및 항암제 등의 신약 개발에 응용될 수 있어 관련 산업 분야에 큰 파급효과를 가져올 것으로 기대된다.
비록 본 발명이 상기에 언급된 바람직한 실시예로서 설명되었으나, 발명의 요지와 범위로부터 벗어남이 없이 다양한 수정이나 변형을 하는 것이 가능하다. 또한 첨부된 청구 범위는 본 발명의 요지에 속하는 이러한 수정이나 변형을 포함한다.
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RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HDAC2-AS <400> 7 uguuguugcc ccg 13 <210> 8 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KAT2A-S <400> 8 ggaaaugcau ccugcagau 19 <210> 9 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KAT2A-AS <400> 9 aucugcagga ugcauuucc 19 <210> 10 <211> 18 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KDM1A-S <400> 10 cacaaggaaa gcagaaga 18 <210> 11 <211> 18 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KDM1A-AS <400> 11 ucuucugcuu uccuugug 18 <210> 12 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PRMT1-S <400> 12 ggacaugaca uccaaagau 19 <210> 13 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PRMT1-AS <400> 13 aucuuuggau gucaugucc 19 <210> 14 <211> 17 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SETDB1-S <400> 14 cgggggcgcc aaaacaa 17 <210> 15 <211> 17 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SETDB1-AS <400> 15 uuguuuuggc gcccccg 17 <210> 16 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SMYD2-S <400> 16 gauuugauuc agagugaca 19 <210> 17 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SMYD2-AS <400> 17 ugucacucug aaucaaauc 19 <210> 18 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SMYD3-S <400> 18 agccugauug aagauuuga 19 <210> 19 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SMYD3-AS <400> 19 ucaaaucuuc aaucaggcu 19 <210> 20 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AQP8-F <400> 20 gccatcaatg agaagacaaa gg 22 <210> 21 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AQP8-R <400> 21 cacctaatga gcagtccaac aa 22 <210> 22 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> B-actin-F <400> 22 agagctacga gctgcctgac 20 <210> 23 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> B-actin-R <400> 23 agcactgtgt tggcgtacag 20 <210> 24 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CA1-F <400> 24 ccaaacatga cacctctctg aa 22 <210> 25 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CA1-R <400> 25 agctcggcag aatatttgac tc 22 <210> 26 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CD44-F <400> 26 ctgccgcttt gcaggtgta 19 <210> 27 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CD44-R <400> 27 cattgtgggc aaggtgctat t 21 <210> 28 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CDX2-F <400> 28 ttcactacag tcgctacatc acc 23 <210> 29 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CDX2-R <400> 29 tctgggacac ttctcagagg ac 22 <210> 30 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CEACAM5-F <400> 30 cagatcaggg gaaaatctga ac 22 <210> 31 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CEACAM5-R <400> 31 tcgtgactgt ggtcctattg ag 22 <210> 32 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EHMT2-F <400> 32 tgcgtgctgt tattcctgtc 20 <210> 33 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EHMT2-R <400> 33 tgatcttctc tgtgcggatg 20 <210> 34 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ELF3-F <400> 34 caaagagtac tgggactgtc tcg 23 <210> 35 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ELF3-R <400> 35 ctcagcttct cgtaggtcat gtt 23 <210> 36 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FABP1-F <400> 36 gcagagccag gaaaactttg 20 <210> 37 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FABP1-R <400> 37 tctcccctgt cattgtctcc 20 <210> 38 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FABP2-F <400> 38 aagcttgcag ctcatgacaa 20 <210> 39 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FABP2-R <400> 39 tccattgtct gtccgtttga 20 <210> 40 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GAPDH-F <400> 40 tgatgacatc aagaaggtgg tgaag 25 <210> 41 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GAPDH-R <400> 41 tccttggagg ccatgtgggc cat 23 <210> 42 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HDAC2-F <400> 42 gaggtggcta cacaatccgt a 21 <210> 43 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HDAC2-R <400> 43 acaccaggtg catgaggtaa c 21 <210> 44 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HNF4G-F <400> 44 gtttcttcag acgcagcatt c 21 <210> 45 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HNF4G-R <400> 45 aacttcagct tgtgccagtg t 21 <210> 46 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KAT2A-F <400> 46 gctgaccacg tatcccactt 20 <210> 47 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KAT2A-R <400> 47 atgcatttcc gcagtagctt 20 <210> 48 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KDM1A-F <400> 48 tcaactctct cccttaagca ctg 23 <210> 49 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KDM1A-R <400> 49 cacagctatc acttcacatc ctg 23 <210> 50 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KRT20-F <400> 50 acgccagaac aacgaatacc 20 <210> 51 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KRT20-R <400> 51 acgaccttgc catccactac 20 <210> 52 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LGR5-F <400> 52 ctcccaggtc tggtgtgttg 20 <210> 53 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LGR5-R <400> 53 gaggtctagg taggaggtga ag 22 <210> 54 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MYC-F <400> 54 ggctcctggc aaaaggtca 19 <210> 55 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MYC-R <400> 55 ctgcgtagtt gtgctgatgt 20 <210> 56 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PPARG-F <400> 56 atctctccgt aatggaagac ca 22 <210> 57 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PPARG-R <400> 57 aggctcttca tgaggcttat tg 22 <210> 58 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PRMT1-F <400> 58 accgcaactc catgtttca 19 <210> 59 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PRMT1-R <400> 59 ccaccttccc cttgatgat 19 <210> 60 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SETDB1-F <400> 60 ccggcctaca gaaataattg ag 22 <210> 61 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SETDB1-R <400> 61 caaggttcct ttatgcagat cc 22 <210> 62 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SMYD2-F <400> 62 gtgtaccacc aaggacaagg at 22 <210> 63 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SMYD2-R <400> 63 agatctccag cagctcacta gg 22 <210> 64 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SMYD3-F <400> 64 agaactgaag gcacactgga a 21 <210> 65 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SMYD3-R <400> 65 ttcatcactt gaacccctct g 21 <210> 66 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VDR-F <400> 66 agatgaccct tctgtgaccc ta 22 <210> 67 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VDR-R <400> 67 atggcacttg acttcagcag ta 22

Claims (13)

  1. SETDB1(SET domain, bifurcated 1) 또는 이의 저해제를 포함하는 암세포의 분열 또는 분화 조절용 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 SETDB1 저해제는 SETDB1 유전자의 안티센스 올리고뉴클레오티드, siRNA, shRNA, miRNA 및 SETDB1 단백질에 특이적인 항체로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는, 암세포의 분열 또는 분화 조절용 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 SETDB1 저해제는 CDX2(Caudal Type Homeobox 2), ELF3(E74 Like ETS Transcription Factor 3), HNF4G(hepatocyte nuclear factor 4 gamma), PPARG(Peroxisome proliferator-activated receptor gamma) 및 VDR(vitamin D receptor)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 단백질의 전사활성을 저해하는 것을 특징으로 하는, 암세포의 분열 또는 분화 조절용 조성물.
  4. 제1항에 있어서, 상기 암세포는 암 줄기 유사세포인 것을 특징으로 하는, 암세포의 분열 또는 분화 조절용 조성물.
  5. SETDB1 저해제를 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  6. 제5항에 있어서, 상기 암은 대장암, 직장암, 간암, 위암, 폐암, 유방암 및 췌장암으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는, 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  7. 제5항에 있어서, 상기 SETDB1 저해제는 SETDB1 유전자의 안티센스 올리고뉴클레오티드, siRNA, shRNA, miRNA 및 SETDB1 단백질에 특이적인 항체로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는, 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  8. 제5항에 있어서, 상기 약학적 조성물은 암 세포 또는 암 줄기 유사세포의 분화치료에 사용하는 것을 특징으로 하는, 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  9. 제5항에 있어서, 상기 약학적 조성물은 항암제 또는 방사선치료제의 병용투여제로 사용하는 것을 특징으로 하는, 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  10. SETDB1 저해제를 포함하는 항암보조제.
  11. SETDB1 저해제를 포함하는 암 예방 또는 개선용 건강기능식품.
  12. 생체 외(In vitro)에서 SETDB1 또는 이의 저해제를 암 줄기 유사세포에 처리하는 단계를 포함하는 암 줄기 유사세포로부터 정상세포 또는 정상 유사 세포로의 분화 유도 방법.
  13. (a) SETDB1을 발현하는 분리된 암 세포에 후보물질을 처리하는 단계;
    (b) 상기 후보물질이 처리된 분리된 암 세포에서 SETDB1 발현 수준을 측정하는 단계; 및
    (c) 상기 (b) 단계에서 측정된 SETDB1 발현 수준이 후보물질이 처리되지 않은 분리된 암 세포에 비해 낮은 경우, 상기 후보물질을 암의 예방 또는 치료 제제로 사용할 수 있을 것으로 판정하는 단계; 를 포함하는 암의 예방 또는 치료 제제의 스크리닝 방법.
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