KR20210133340A - 초기 대장암 예방 또는 치료용 조성물 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 초기 대장암 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것으로, 본 발명의 조성물은 대장암 세포의 높은 세포자연사를 유도하고, 대장암 세포를 낮은 줄기세포능을 갖는 세포로 유도하며, 대장암 세포의 G2/M 단계(phase)에서 세포주기 정지를 유도함으로써, 암의 진행을 억제하는 효과를 발휘한다.

Description

초기 대장암 예방 또는 치료용 조성물 {Composition for prevention or treatment of earliest stage colorectal cancer}
본 발명은 초기 대장암 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.
대장암(colorectal cancer; CRC)은 암 진행에 따른 유전자 돌연변이를 확인하기 위해 가장 광범위하게 연구되는 모델 중 하나이다. 대부분의 대장암 발달 모델은 APC(adenomatous polyposis coli)의 소실을 시작으로 하여 KRAS 및 TP53과 같은 다른 드라이버 유전자의 돌연변이의 발생으로 이어지는 흐름을 기초로 한다. APC의 유전자 변형은 APC와 β-카테닌 복합체의 형성을 막아 β-카테닌의 세포질 내 농도를 높인다. 농도가 높아진 β-카테닌은 정식 Wnt 신호 전달 경로의 과잉 활성을 유발하고, 이는 궁극적으로 세포 조절의 항상성 유지에 관한 기능장애로 이어진다. APC 돌연변이로 시작되는 대장암 진행에 관한 연구는 지난 수십 년 동안 발전해 왔지만, 적절한 관찰 및 분석 도구의 부재로 인하여 APC 결함이 발생한 직후에 발생하는 암 발달 개시와 관련한 일련의 과정에 대해서는 아직 알려지지 않은바, 이와 관련한 특성화는 조기 암 검출 및 치료를 위한 예후 마커 및 치료 표적의 확인에 도움이 될 것이다.
암의 초기 발달 단계를 조사하기 위해서는, 암의 개시 동안에 벌어지는 전사의 순간적이고 섬세한 변화를 포착할 수 있어야 한다. 단일 세포 RNA 시퀀싱 (scRNA-seq)은 개별 세포에서의 유전자 발현을 낱낱이 살펴 볼 수 있어 이와 같은 요구를 충족시킬 수 있다. 또한, 발달 및 종양학에 관한 여러 연구에서 단일 세포 RNA 시퀀싱을 사용한 세포 운명 결정 또는 약물 반응을 담당하는 이질성(heterogeneity)을 성공적으로 확인한 바 있다.
그러나 단일 세포 RNA 시퀀싱으로 포착된 mRNA 수준의 모든 사소한 변화들이 반드시 세포 표현형에 결정적인 역할을 수행하는 것은 아니기 때문에, 세포 표현형 조절에 영향을 끼치는 소수의 유전자들을 선별해야 한다. 이러한 유전자를 '핵심 조절 인자(master regulator)'라고 하며 이들의 활동은 일련의 유전자 발현을 유발하여 궁극적으로 유전자 조절 네트워크에 심각한 변화를 초래한다. 이전의 연구에 따르면, 핵심 조절 인자 분석은 암 유전자 조절 네트워크를 유지 및 제어하기 위한 중요한 유전자를 성공적으로 식별하는 것으로 확인한 바 있다.
대한민국 공개특허 제10-2012-0093982호(2012.08.23.)
본 발명은 대장암 발생 초기 단계에 관한 통찰을 제공함과 동시에 암을 비증식 상태로 강제하는 새로운 치료 전략을 제시하고자 한다.
이 발명의 구체적인 목적은 CCDC85B 및 PTTG1 중 선택되는 어느 하나의 유전자 또는 단백질 저해제를 포함하는 대장암 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공하고자 하는 것으로, 특히, 초기 대장암을 예방 또는 치료할 수 있는 약학 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 CCDC85B 및 PTTG1 중 선택되는 어느 하나의 유전자 또는 단백질 저해제를 이용한 인간을 제외한 개체의 대장암 예방 또는 치료 방법 및 대장암의 예방 또는 치료 제제의 스크리닝 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 CCDC85B 및 PTTG1 중 선택되는 어느 하나의 유전자 또는 단백질 저해제를 포함하는 생체 외(in vitro)에서 대장암 세포의 높은 세포자연사, 대장암 세포의 G2/M 단계(phase)에서의 세포주기 정지 유도용 또는 대장암 세포의 줄기세포능 저감용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 CCDC85B 및 PTTG1 중 선택되는 어느 하나의 유전자 또는 단백질 저해제를 포함하는 항암보조제, 및 대장암 예방 또는 개선용 건강기능식품을 제공하는 것이다.
본원발명은 CCDC85B(coiled-coil domain containing 85B) 및 PTTG1(PTTG1 regulator of sister chromatid separation, securin) 중 선택되는 어느 하나의 유전자 또는 단백질 저해제를 포함하는 대장암 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
본 발명의 대장암 예방 또는 치료용 약학 조성물에 있어, 상기 대장암은, 바람직하게 초기 단계(earliest stage)의 대장암인 것이 좋다.
본 발명의 대장암 예방 또는 치료용 약학 조성물에 있어, 상기 대장암은, 바람직하게 APC(adenomatous polyposis coli) 변이암인 것이 좋다.
본 발명의 대장암 예방 또는 치료용 약학 조성물에 있어, 상기 저해제는, 일 예로 CCDC85B(coiled-coil domain containing 85B) 및 PTTG1(PTTG1 regulator of sister chromatid separation, securin) 중 선택되는 어느 하나의 유전자 또는 단백질을 표적으로 하는 siRNA, shRNA, miRNA, 리보자임, 안티센스 핵산, DNA/RNA 키메라 폴리뉴클레오티드, 항체 및 이들을 발현하는 벡터일 수 있다.
이때, 상기 CCDC85B(coiled-coil domain containing 85B) siRNA 저해제는, 바람직하게 서열번호 1의 핵산서열로 구성된 올리고 뉴클레오타이드 및 서열번호 2의 핵산서열로 구성된 올리고 뉴클레오타이드를 모두 포함하는 세트; 또는 서열번호 3의 핵산서열로 구성된 올리고 뉴클레오타이드 및 서열번호 4의 핵산서열로 구성된 올리고 뉴클레오타이드를 모두 포함하는 세트; 중 선택되는 어느 하나인 것이 좋다. 상기 PTTG1(PTTG1 regulator of sister chromatid separation, securin) siRNA 저해제는, 바람직하게 서열번호 5의 핵산서열로 구성된 올리고 뉴클레오타이드 및 서열번호 6의 핵산서열로 구성된 올리고 뉴클레오타이드를 모두 포함하는 세트; 또는 서열번호 7의 핵산서열로 구성된 올리고 뉴클레오타이드 및 서열번호 8의 핵산서열로 구성된 올리고 뉴클레오타이드를 모두 포함하는 세트; 중 선택되는 어느 하나인 것이 좋다.
본 발명의 대장암 예방 또는 치료용 약학 조성물에 있어, 상기 저해제는, 바람직하게 대장암 세포의 높은 세포자연사를 유도하고, 대장암 세포를 낮은 줄기세포능을 갖는 세포로 유도하며, 대장암 세포의 G2/M 단계(phase)에서 세포주기 정지를 유도하는 것이 좋다.
한편, 본 발명은 CCDC85B(coiled-coil domain containing 85B) 및 PTTG1(PTTG1 regulator of sister chromatid separation, securin) 중 선택되는 어느 하나의 유전자 또는 단백질 저해제를 개체에 처리하는 단계;를 포함하는 인간을 제외한 개체의 대장암 예방 또는 치료 방법을 제공한다.
한편, 본 발명은 CCDC85B(coiled-coil domain containing 85B) 및 PTTG1(PTTG1 regulator of sister chromatid separation, securin) 중 선택되는 어느 하나의 유전자 또는 단백질 저해제를 포함하는, 생체 외(in vitro)에서 대장암 세포의 높은 세포자연사, 대장암 세포의 G2/M 단계(phase)에서의 세포주기 정지 유도용 또는 대장암 세포의 줄기세포능 저감용 조성물을 제공한다.
한편, 본 발명은 CCDC85B(coiled-coil domain containing 85B) 및 PTTG1(PTTG1 regulator of sister chromatid separation, securin) 중 선택되는 어느 하나의 유전자 또는 단백질 저해제를 포함하는 대장암 예방 또는 치료용 항암보조제를 제공한다.
한편, 본 발명은 CCDC85B(coiled-coil domain containing 85B) 및 PTTG1(PTTG1 regulator of sister chromatid separation, securin) 중 선택되는 어느 하나의 유전자 또는 단백질 저해제를 포함하는 대장암 예방 또는 개선용 건강기능식품을 제공한다.
한편, 본 발명은 (a) CCDC85B(coiled-coil domain containing 85B) 및 PTTG1(PTTG1 regulator of sister chromatid separation, securin) 중 선택되는 어느 하나를 발현하는 분리된 대장암 세포에 후보물질을 처리하는 단계; (b) 상기 후보물질이 처리된 분리된 암세포에서 CCDC85B(coiled-coil domain containing 85B) 및 PTTG1(PTTG1 regulator of sister chromatid separation, securin) 중 선택되는 어느 하나의 발현 수준을 측정하는 단계; 및 (c) 상기 (b) 단계에서 측정된 CCDC85B(coiled-coil domain containing 85B) 및 PTTG1(PTTG1 regulator of sister chromatid separation, securin) 중 선택되는 어느 하나의 발현 수준이 후보물질이 처리되지 않은 분리된 대장암 세포에 비해 낮은 경우, 상기 후보물질을 대장암의 예방 또는 치료 제제로 사용할 수 있을 것으로 판정하는 단계;를 포함하는 대장암의 예방 또는 치료 제제의 스크리닝 방법을 제공한다.
본 발명의 조성물은 대장암 세포의 높은 세포자연사를 유도하고, 대장암 세포를 낮은 줄기세포능을 갖는 세포로 유도하며, 대장암 세포의 G2/M 단계(phase)에서 세포주기 정지를 유도함으로써, 암의 진행을 억제하는 효과를 발휘한다.
도 1은 본원발명의 scRNA 시퀀싱 실험 계획 및 분석을 설명한 일련의 모식도이다.
도 2는 대장암의 초기단계에서 진행되는 과정을 조사한 결과이다 (a: 벌크 세포 수준(bulk cell)에서 관련 유전자(APC, MYC, AXIN2)의 발현 확인, b: 단일 세포 수준(single cell)에서 관련 유전자(APC, MYC, AXIN2)의 발현 확인).
도 3은 초기 APC 결핍 세포와 그렇지 않은 세포 사이의 정지 신호 점수 변화를 분석한 결과이다(a: 형질 감염 3일째 세포의 밀도(density), b: 형질 감염 7일째 세포의 밀도(density), c: 생존 상대비, d: 정지 신호 점수 변화).
도 4는 shAPC 처리 단일 세포 샘플에서 군집의 특성을 조사한 결과이다 (a: 군집, b: APC 발현량 차이, c: 정지 신호 구분 (Arr/NArr), d: 기준 분류(HFG: APC High and Fast Growth, LFG: APC Low and Fast Growth, LSG: APC Low and Slow Growth, None: HFG, LFG, LSG에 포함되지 않는 나머지 모두). 도 4의 b에서 0.1 내지 0.3은 특정 프로세스를 대표하는 유전자들로 구성된 유전자 신호의 강도를 정량한 수치로, 유전자 신호가 강할수록 점수가 높다.
도 5는 SG(slow growth) 군집과 FG(fast growth) 군집의 추가적인 생물학적 과정 차이를 확인한 결과이다 (a: 세포자연사(apoptosis) 및 줄기세포능(stemness) 신호 점수 차이, b: 세포자연사 신호(apoptosis signature) 점수, c: 줄기세포능 신호(stemness signature) 점수).
도 6은 metaVIPER을 이용한 핵심 조절 인자 분석을 수행한 결과이다 (a; 1CT 및 1CT-A에서 차등적으로 발현된 유전자 (differentially expressed gene; DEG)를 입력하였을 때 나타나는 핵심 조절 인자의 발현 차이, b; SCENIC에서 추론한 SG 및 FG의 레귤론(regulons)을 입력하였을 때 나타나는 핵심 조절 인자의 발현 차이). metaVIPER는 네트워크를 기반으로 유전자의 전사체 발현량을 입력하면 전사된 단백질이 실제로 얼만큼 발현될지를 추론해주는 알고리즘으로, 도면상의 -4 내지 4는 이 추론된 단백질 발현량을 나타내는 점수이다. 이때, 단백질 발현량이 크면 실제로 기능하는 단백질일 확률이 높다고 판단하여 '핵심 조절 인자'로 특정이 가능하다.
도 7은 SCENIC을 사용하여 SG(slow growth) 군집과 FG(fast growth) 군집의 유전자 조절 네트워크를 조사한 결과이다 (a: FG 레귤론(regulons), b: SG 레귤론(regulons)).
도 8은 타겟 후보군의 유전자 발현 및 단백질 활성을 확인한 결과이다 (a: 유전자 발현 점수 차이, b: 단백질 활성 점수 차이, c: 유전자 발현 수준, d: 단백질 활성 수준). 도 8의 a에서 -3 내지 3은 metaVIPER로 추론된 단백질 발현량이다. 도 8의 b에서 -6 내지 6은 scRNA-seq dataset에서 추출한 타겟 후보군 유전자들의 값으로, 그 값이 높을수록 scRNA-seq dataset에서 유전자가 많이 발현되어 있는 것이다.
도 9는 APC와 목표 후보 간 또는 목표 후보 간 상호 작용을 조사한 결과이다 (a: STRING DB를 사용한 표적 후보와 APC 사이의 최단 경로 길이 조사, b: APC와 표적 간 공통 유전자 비율 조사, c: 목표 후보간의 상호 작용, d: 재선별된 목표 후보간의 상호 작용 e: CCDC85B와 APC의 공통 유전자).
도 10은 CCDC85B와 정지 신호 또는 세포자연사 신호 사이의 상관관계를 조사한 결과이다 (a: CCDC85B의 활성과 정지 신호 점수와의 상관관계, b: CCDC85B의 활성과 세포자연사 신호 점수와의 상관관계, c: CCDC85B의 발현과 정지 신호 점수와의 상관관계, d: CCDC85B의 발현과 세포자연사 신호 점수와의 상관관계).
도 11은 PTTG1과 정지 신호 또는 세포자연사 신호 사이의 상관관계를 조사한 결과이다 (a: PTTG1의 활성과 정지 신호 점수와의 상관관계, b: PTTG1의 활성과 세포자연사 신호 점수와의 상관관계, c: PTTG1의 발현과 정지 신호 점수와의 상관관계, d: PTTG1의 발현과 세포자연사 신호 점수와의 상관관계).
도 12는 1CT-A에서 CCDC85B 간섭이 세포주기 및 줄기세포능에 미치는 영향을 평가한 결과이다 (a: 세포 성장률을 나타낸 그래프, b: 세포 성장률을 확인한 실험 결과, c: 연관 유전자(CCDC85B, PTTG1, APC, MYC, CCND1, CCNE1, CCNA2, CCNB1, LGR5, ASCL2)의 발현).
도 13은 1CT-A에서 PTTG1 간섭이 세포주기 및 줄기세포능에 미치는 영향을 평가한 결과이다 (a: 세포 성장률을 나타낸 그래프, b: 세포 성장률을 확인한 실험 결과, c: 연관 유전자(CCDC85B, PTTG1, APC, MYC, CCND1, CCNE1, CCNA2, CCNB1, LGR5, ASCL2)의 발현).
대장암은 발달 과정이 비교적 잘 알려진 고형암 중 하나이다. 그러나 대장암 발생 시점의 사건들은 그 희귀성과 관찰의 어려움 때문에 아직도 많은 부분이 분명하게 밝혀진 바가 없다. 본 발명은 대장암 발생 초기 단계에서 벌어지는 사건들을 포착하기 위해 정상 대장 세포에서 APC(adenomatous polyposis coli)가 결실된 대장암 발달 초기 모델을 구축하고, 단일 세포 RNA 시퀀싱(sequencing) 기술을 이용하여 대장암 발생 초기의 변화를 추적하였다. 그 결과, APC 결실 이후 단기간 내에 빠른 성장 세포군(FG; Fast Growth)과 느린 성장 세포군(SG; Slow Growth)이 나타나는 것을 발견하였다. 이러한 발견에 따라, 단일 세포 전사체 분석기법과 시스템 생물분석을 이용하여 두 세포군의 특징을 분석하였고, 빠른 성장 세포군이 암 발달 심화에 기여하는 반면 느린 성장 세포군은 더 발달하지 못하고 도태된다는 것을 확인하였다. 따라서, 본 발명은 빠른 성장 세포군을 느린 성장 세포군으로 전환하는 목표를 수립하고, 둘 사이에 차이를 보이는 핵심 조절자를 탐색하여 세포 실험을 통해 그 실제 효과를 검증하였다.
이에, 본원발명은 CCDC85B(coiled-coil domain containing 85B) 및 PTTG1(PTTG1 regulator of sister chromatid separation, securin) 중 선택되는 어느 하나의 유전자 또는 단백질 저해제를 포함하는 대장암 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
본 발명의 대장암 예방 또는 치료용 약학 조성물에 있어, 상기 대장암은, 바람직하게 초기 단계(earliest stage)의 대장암인 것이 좋고, APC(adenomatous polyposis coli) 변이암인 것이 좋다.
APC 단백질은 베타-카테닌(β-catenin) 농도를 조절하고, 세포 접착에 관여하는 E-카드헤린(cadherin)과 상호작용하는 음성 조절자로 알려져 있다. APC의 변이는 모든 암에서 발견되지 않으며, 대장암 그중에서도 특히 초기 대장암의 중요한 지표로 확인된다. 따라서, 본 발명은 초기 단계의 대장암에서 APC 결핍 과정에 관여하는 유전자로 CCDC85B(coiled-coil domain containing 85B) 및 PTTG1(PTTG1 regulator of sister chromatid separation, securin)을 발굴하고, 이의 저해제가 대장암 세포의 높은 세포자연사를 유도하고, 대장암 세포를 낮은 줄기세포능을 갖는 세포로 유도하며, 대장암 세포의 G2/M 단계(phase)에서 세포주기 정지를 유도함으로써, 더 이상의 암의 진행을 억제할 수 있음을 하기 실험을 통해 확인하였다.
이에, 본 발명은 암세포의 사멸을 유도하는 것에 중점을 둔 기존의 치료제와는 차별을 둔 새로운 치료제를 제공하고자 하는 것이다.
본 발명의 대장암 예방 또는 치료용 약학 조성물에 있어, 상기 저해제는, 일 예로 CCDC85B(coiled-coil domain containing 85B) 및 PTTG1(PTTG1 regulator of sister chromatid separation, securin) 중 선택되는 어느 하나의 유전자 또는 단백질을 표적으로 하는 siRNA, shRNA, miRNA, 리보자임, 안티센스 핵산, DNA/RNA 키메라 폴리뉴클레오티드, 항체 및 이들을 발현하는 벡터일 수 있다.
이때, 상기 CCDC85B(coiled-coil domain containing 85B) siRNA 저해제는, 바람직하게 서열번호 1의 핵산서열로 구성된 올리고 뉴클레오타이드 및 서열번호 2의 핵산서열로 구성된 올리고 뉴클레오타이드를 모두 포함하는 세트; 또는 서열번호 3의 핵산서열로 구성된 올리고 뉴클레오타이드 및 서열번호 4의 핵산서열로 구성된 올리고 뉴클레오타이드를 모두 포함하는 세트; 중 선택되는 어느 하나인 것이 좋다. 상기 PTTG1(PTTG1 regulator of sister chromatid separation, securin) siRNA 저해제는, 바람직하게 서열번호 5의 핵산서열로 구성된 올리고 뉴클레오타이드 및 서열번호 6의 핵산서열로 구성된 올리고 뉴클레오타이드를 모두 포함하는 세트; 또는 서열번호 7의 핵산서열로 구성된 올리고 뉴클레오타이드 및 서열번호 8의 핵산서열로 구성된 올리고 뉴클레오타이드를 모두 포함하는 세트; 중 선택되는 어느 하나인 것이 좋다.
본 발명에서 "안티센스 핵산"이란 특정 mRNA의 서열에 상보적인 핵산 서열을 함유하고 있는 DNA 또는 RNA 또는 이들의 유도체를 의미하고, mRNA 내의 상보적인 서열에 결합하여 mRNA의 단백질로의 번역을 저해하는 작용을 한다. 상기 안티센스 서열은 상기 유전자의 mRNA에 상보적이고 상기 mRNA에 결합할 수 있는 DNA 또는 RNA 서열을 의미하며, 상기 mRNA의 번역, 세포질내로의 전위(translocation), 성숙(maturation) 또는 다른 모든 전체적인 생물학적 기능에 대한 필수적인 활성을 저해할 수 있다.
또한, 상기 안티센스 핵산은 효능을 증진시키기 위하여 하나 이상의 염기, 당 또는 골격(backbone)의 위치에서 변형될 수 있다. 핵산 골격은 포스포로티오에이트, 포스포트리에스테르, 메틸 포스포네이트, 단쇄 알킬, 시클로알킬, 단쇄 헤테로아토믹, 헤테로시클릭 당간 결합 등으로 변형될 수 있다. 또한, 안티센스 핵산은 하나 이상의 치환된 당 모이어티(sugar moiety)를 포함할 수 있다. 안티센스 핵산은 변형된 염기를 포함할 수 있다. 변형된 염기에는 하이포크잔틴, 6-메틸아데닌, 5-메틸피리미딘(특히 5-메틸시토신), 5-하이드록시메틸시토신(HMC), 글리코실 HMC, 젠토비오실 HMC, 2-아미노아데닌, 2-티오우라실, 2-티오티민, 5-브로모우라실, 5-하이드록시메틸우라실, 8-아자구아닌, 7-데아자구아닌, N6(6-아미노헥실)아데닌, 2,6-디아미노퓨린 등이 있다. 또한, 상기 안티센스 핵산은 상기 안티센스 핵산의 활성 및 세포 흡착성을 향상시키는 하나 이상의 모이어티(moiety) 또는 컨쥬게이트(conjugate)와 화학적으로 결합될 수 있다. 콜레스테롤 모이어티, 콜레스테릴 모이어티, 콜릭산, 티오에테르, 티오콜레스테롤, 지방성 사슬, 인지질, 폴리아민, 폴리에틸렌 글리콜 사슬, 아다맨탄 아세트산, 팔미틸 모이어티, 옥타데실아민, 헥실아미노카르보닐-옥시콜에스테롤 모이어티 등의 지용성 모이어티 등이 있으며 이에 제한되지 않는다. 상기 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 통상의 방법으로 시험관에서 합성되어 생체 내로 투여하거나 생체 내에서 안티센스 올리고뉴클레오타이드가 합성되도록 할 수 있다.
본 발명에서 "siRNA"란 RNA 방해 또는 유전자 사일런싱을 매개할 수 있는 핵산 분자를 의미한다. siRNA는 표적 유전자의 발현을 억제할 수 있기 때문에 효율적인 유전자 넉다운(knockdown) 방법 또는 유전자치료 방법으로 제공된다.
본 발명의 siRNA 분자는, 센스 가닥(본 발명의 일 구현예에 따르면, 타겟 유전자인 CCDC85B 및 PTTG1 중 선택되는 어느 하나의 유전자의 mRNA 서열에 상응하는 서열)과 안티센스 가닥(상기 mRNA 서열에 상보적인 서열)이 서로 반대쪽에 위치하여 이중쇄를 이루는 구조를 가질 수 있으며, 본 발명의 siRNA 분자는 자기-상보성(self-complementary) 센스 및 안티센스 가닥을 가지는 단일쇄 구조를 가질 수 있다. 나아가 siRNA는 RNA끼리 짝을 이루는 이중사슬 RNA 부분이 완전히 쌍을 이루는 것에 한정되지 않고 미스매치(대응하는 염기가 상보적이지 않음), 벌지(일방의 사슬에 대응하는 염기가 없음) 등에 의하여 쌍을 이루지 않는 부분이 포함될 수 있다. 또한, siRNA 말단 구조는 타겟 유전자의 발현을 RNAi 효과에 의하여 억제할 수 있는 것이면 평활(blunt) 말단 혹은 점착(cohesive) 말단 모두 가능하고, 점착 말단 구조는 3'-말단 돌출 구조와 5'-말단 돌출 구조 모두 가능하다.
siRNA를 제조하는 방법은 시험관에서 siRNA를 직접 합성한 뒤, 형질전환 과정을 거쳐 세포 안으로 도입시키는 방법과 siRNA가 세포 안에서 발현되도록 제조된 siRNA 발현 벡터 또는 PCR-유래의 siRNA 발현 카세트 등을 세포 안으로 형질전환 또는 감염(infection)시키는 방법이 있다.
본 발명의 "shRNA"란 small hairpin RNA 혹은 short hairpin RNA으로 불리며, RNA 간섭으로 유전자를 침묵시킬 수 있는 용도로 사용되는 것이다. 보통 벡터를 이용하여 목적 세포로 도입한다. 이러한 shRNA 헤어핀 구조는 세포 내 다른 물질에 의하여 절단되어 siRNA가 되기도 한다.
본 발명에 따르면, 상기 CCDC85B 및 PTTG1은 대장암 세포에서 비정상적으로 과발현되어 암 줄기세포(또는 암 줄기 유사세포)의 분화능을 높게 유지하고 있으며, CCDC85B 및 PTTG1 중 선택되는 어느 하나의 유전자 또는 단백질 저해제를 사용할 경우, 대장암 세포의 높은 세포자연사를 유도하고, 대장암 세포를 낮은 줄기세포능을 갖는 세포로 유도하며, 대장암 세포의 G2/M 단계(phase)에서 세포주기 정지를 유도할 수 있어, 대장암의 치료에 효과적이다.
이에 따라, 본 발명은 CCDC85B(coiled-coil domain containing 85B) 및 PTTG1(PTTG1 regulator of sister chromatid separation, securin) 중 선택되는 어느 하나의 유전자 또는 단백질 저해제를 포함하는, 생체 외(in vitro)에서 대장암 세포의 높은 세포자연사, 대장암 세포의 G2/M 단계(phase)에서의 세포주기 정지 유도용 또는 대장암 세포의 줄기세포능 저감용 조성물로도 사용할 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 CCDC85B 및 PTTG1 중 선택되는 어느 하나의 유전자 또는 단백질 저해제는 항암제 또는 방사선치료제의 병용투여제로 사용될 수 있으며, 이때 암의 약물 내성 및 재발을 억제하여 치료적 효과를 높일 수 있다.
본 발명에 따른 대장암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물은 추가적으로 다른 항암제와 병용투여할 수 있으며, 이를 통해 암 줄기세포뿐만 아니라 일반적인 암세포까지 치료하는데 사용될 수 있으며, 특히 초기 대장암의 치료에 사용될 수 있고, 상기 약학 조성물은 암의 재발 또는 전이 억제용 약학 조성물로도 사용될 수 있다.
본 발명에서 "암 줄기세포(cancer stem cell)"란 줄기세포 특유의 능력인 자가재생이나 분화능력을 가지고 있는 포괄적인 의미의 암세포를 의미한다. 최근 암세포 내에서 암을 일으킬 수 있는 세포가 따로 존재하고, 이 세포들은 정상 줄기세포의 특성을 가지며 다시 암을 발생시킬 수 있음이 밝혀져, 이러한 세포들은 줄기세포의 특성을 가진다고 하여 암 줄기세포(cancer stem cell)라고 불리고 있다.
본 발명의 용어 "암 줄기세포"는 "암 줄기 유사세포"와 혼용될 수 있으며, 일반적인 암세포로 분화할 수 있는 세포라면 이에 제한되지 않는다.
또한, 상기한 결과에 의하여, 본 발명은 CCDC85B(coiled-coil domain containing 85B) 및 PTTG1(PTTG1 regulator of sister chromatid separation, securin) 중 선택되는 어느 하나의 유전자 또는 단백질 저해제를 개체에 처리하는 단계;를 포함하는 인간을 제외한 개체의 대장암 예방 또는 치료 방법을 제공한다.
본 발명에 있어서 상기 약학적 조성물은 캡슐, 정제, 과립, 주사제, 연고제, 분말 또는 음료 형태임을 특징으로 할 수 있으며, 상기 약학적 조성물은 인간을 대상으로 하는 것을 특징으로 할 수 있다. 상기 약학적 조성물은 이들로 한정되는 것은 아니지만, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 캡슐, 정제, 수성 현탁액 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 약학적 조성물은 약제적으로 허용가능한 담체를 포함할 수 있다. 약제학적으로 허용되는 담체는 경구투여시에는 결합제, 활탁제, 붕해제, 부형제, 가용화제, 분산제, 안정화제, 현탁화제, 색소, 향료 등을 사용할 수 있으며, 주사제의 경우에는 완충제, 보존제, 무통화제, 가용화제, 등장제, 안정화제 등을 혼합하여 사용할 수 있으며, 국소투여용의 경우에는 기제, 부형제, 윤활제, 보존제 등을 사용할 수 있다. 본 발명에 따른 약학적 조성물의 제형은 상술한 바와 같은 약제학적으로 허용되는 담체와 혼합하여 다양하게 제조될 수 있다. 예를 들어, 경구투여 시에는 정제, 트로키, 캡슐, 엘릭서(elixir), 서스펜션, 시럽, 웨이퍼 등의 형태로 제조할 수 있으며, 주사제의 경우에는 단위 투약 앰플 또는 다수회 투약 형태로 제조할 수 있다. 기타, 용액, 현탁액, 정제, 캡슐, 서방형 제제 등으로 제형화할 수 있다.
한편, 제제화에 적합한 담체, 부형제 및 희석제의 예로는, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말디톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 또는 광물유 등이 사용될 수 있다. 또한, 충진제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제, 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여 경로는 이들로 한정되는 것은 아니지만 구강, 정맥내, 근육내, 동맥내, 골수내, 경막내, 심장내, 경피, 피하, 복강내, 비강내, 장관, 국소, 설하 또는 직장이 포함된다. 상기 "비경구"는 피하, 피내, 정맥내, 근육내, 관절내, 활액낭내, 흉골내, 경막내, 병소내 및 두개골 내 주사 또는 주입기술을 포함한다. 본 발명에 따른 약학적 조성물은 또한 직장 투여를 위한 좌제의 형태로 투여될 수 있다.
본 발명에 따른 약학적 조성물은 사용된 특정 유효성분의 활성, 연령, 체중, 일반적인 건강, 성별, 정식, 투여시간, 투여경로, 배출률, 약물 배합 및 예방 또는 치료될 특정 질환의 중증을 포함한 여러 요인에 따라 다양하게 변할 수 있고, 상기 약학 조성물의 투여량은 환자의 상태, 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 바람직하게는 상기 요소를 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여할 수 있으며, 더욱 바람직하게는 1~10000㎍/체중㎏/day, 더욱더 바람직하게는 10~1000㎎/체중㎏/day의 유효용량으로 하루에 수회 반복 투여될 수 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
한편, 본 발명은 CCDC85B(coiled-coil domain containing 85B) 및 PTTG1(PTTG1 regulator of sister chromatid separation, securin) 중 선택되는 어느 하나의 유전자 또는 단백질 저해제를 포함하는 대장암 예방 또는 치료용 항암보조제를 제공한다.
본 발명에서 "항암보조제"란, 항암제의 항암효과를 개선, 향상 또는 증대시킬 수 있는 제제를 의미한다. 일례로서, 그 자체로는 항암활성을 나타내지 않으나, 항암제와 함께 사용될 경우 상기 항암제의 항암효과를 개선, 향상 또는 증대시킬 수 있는 제제를 항암보조제로서 사용할 수 있다.
다른 예로서, 농도의존적인 항암활성을 나타내는 제제를 그 자체로는 항암활성을 나타내지 않은 수준으로 항암제와 함께 사용할 경우, 상기 항암제의 항암 효과를 개선, 향상 또는 증대시킬 수 있는 항암보조제로서 사용할 수 있다. 이 경우, 상기 항암보조제는 처리농도에 따라 항암제 또는 항암보조제로서 사용할 수 있으며, 그 자체로는 항암활성을 나타내지 않는 처리농도 범위에서 항암보조제로 사용할 수 있다.
본 발명에 따른 항암보조제는 항암제의 항암 효과를 증대시키기 위해 항암제 또는 항암보조제와 병용 투여될 수 있다. 일례로서, 본 발명의 항암보조제는 독소루비신, 에토포시드(Etoposide), 다우노루비신(Daunorubicin), 미토산트론(Mitoxantrone) 등의 공지된 항암제와 함께 병용 투여될 수 있다.
상기 항암보조제의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 경로를 통해서든 투여될 수 있다. 본 발명의 항암보조제는 목적하는 바에 따라 복강 내 투여, 정맥 내 투여, 근육 내 투여, 피하 투여, 피 내 투여, 경구 투여, 비 내 투여, 폐 내 투여, 직장 내 투여될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 상기 항암보조제는 활성 물질이 표적 세포로 이동할 수 있는 임의의 장치에 의해 투여될 수 있다.
한편, 본 발명은 CCDC85B(coiled-coil domain containing 85B) 및 PTTG1(PTTG1 regulator of sister chromatid separation, securin) 중 선택되는 어느 하나의 유전자 또는 단백질 저해제를 포함하는 대장암 예방 또는 개선용 건강기능식품을 제공한다.
본 발명에 따른 건강기능식품은 암의 예방 및 개선을 목적으로, 정제, 캅셀, 분말, 과립, 액상, 환 등의 형태로 제조 및 가공할 수 있다.
본 발명에서 "건강기능식품"이란 건강기능식품에 관한 법률 제6727호에 따른 인체에 유용한 기능성을 가진 원료나 성분을 사용하여 제조 및 가공한 식품을 말하며, 인체의 구조 및 기능에 대하여 영양소를 조절하거나 생리학적 작용 등과 같은 보건 용도에 유용한 효과를 얻을 목적으로 섭취하는 것을 의미한다.
본 발명에 따른 건강기능식품은 통상의 식품 첨가물을 포함할 수 있으며, 식품 첨가물로서의 적합 여부는 다른 규정이 없는 한, 식품의약품안전청에 승인된 식품 첨가물 공전의 총칙 및 일반시험법 등에 따라 해당 품목에 관한 규격 및 기준에 의하여 판정한다.
상기 "식품 첨가물 공전"에 수재된 품목으로는 예를 들어, 케톤류, 글리신, 구연산칼슘, 니코틴산, 계피산 등의 화학적 합성물; 감색소, 감초추출물, 결정셀룰로오스, 고량색소, 구아검 등의 천연첨가물; L-글루타민산나트륨제제, 면류첨가알칼리제, 보존료제제, 타르색소제제 등의 혼합제제류 등을 들 수 있다.
예를 들어, 정제 형태의 건강기능식품은 본 발명의 유효성분인 CCDC85B 및 PTTG1 중 선택되는 어느 하나의 유전자 또는 단백질 저해제를 부형제, 결합제, 붕해제 및 다른 첨가제와 혼합한 혼합물을 통상의 방법으로 과립화한 다음, 활택제 등을 넣어 압축성형하거나, 상기 혼합물을 직접 압축 성형할 수 있다. 또한, 상기 정제 형태의 건강기능식품은 필요에 따라 교미제 등을 함유할 수도 있다.
캅셀 형태의 건강기능식품 중 경질 캅셀제는 통상의 경질 캅셀에 본 발명의 유효성분인 유효성분인 CCDC85B 및 PTTG1 중 선택되는 어느 하나의 유전자 또는 단백질 저해제를 부형제 등의 첨가제와 혼합한 혼합물을 충진하여 제조할 수 있으며, 연질 캅셀제는 유효성분인 CCDC85B 및 PTTG1 중 선택되는 어느 하나의 유전자 또는 단백질 저해제를 부형제 등의 첨가제와 혼합한 혼합물을 젤라틴과 같은 캅셀기제에 충진하여 제조할 수 있다. 상기 연질 캅셀제는 필요에 따라 글리세린 또는 소르비톨 등의 가소제, 착색제, 보존제 등을 함유할 수 있다.
환 형태의 건강기능식품은 본 발명의 유효성분인 CCDC85B 및 PTTG1 중 선택되는 어느 하나의 유전자 또는 단백질 저해제와 부형제, 결합제, 붕해제 등을 혼합한 혼합물을 기존에 공지된 방법으로 성형하여 조제할 수 있으며, 필요에 따라 백당이나 다른 제피제로 제피할 수 있으며, 또는 전분, 탈크와 같은 물질로 표면을 코팅할 수도 있다.
과립 형태의 건강기능식품은 본 발명의 유효성분인 CCDC85B 및 PTTG1 중 선택되는 어느 하나의 유전자 또는 단백질 저해제와 부형제, 결합제, 붕해제 등을 혼합한 혼합물을 기존에 공지된 방법으로 입상으로 제조할 수 있으며, 필요에 따라 착향제, 교미제 등을 함유할 수 있다.
상기 건강기능식품은 음료류, 육류, 초코렛, 식품류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 사탕류, 아이스크림류, 알코올 음료류, 비타민 복합제 및 건강보조식품류 등일 수 있다.
한편, 본 발명은 (a) CCDC85B(coiled-coil domain containing 85B) 및 PTTG1(PTTG1 regulator of sister chromatid separation, securin) 중 선택되는 어느 하나를 발현하는 분리된 대장암 세포에 후보물질을 처리하는 단계; (b) 상기 후보물질이 처리된 분리된 암세포에서 CCDC85B(coiled-coil domain containing 85B) 및 PTTG1(PTTG1 regulator of sister chromatid separation, securin) 중 선택되는 어느 하나의 발현 수준을 측정하는 단계; 및 (c) 상기 (b) 단계에서 측정된 CCDC85B(coiled-coil domain containing 85B) 및 PTTG1(PTTG1 regulator of sister chromatid separation, securin) 중 선택되는 어느 하나의 발현 수준이 후보물질이 처리되지 않은 분리된 대장암 세포에 비해 낮은 경우, 상기 후보물질을 대장암의 예방 또는 치료 제제로 사용할 수 있을 것으로 판정하는 단계;를 포함하는 대장암의 예방 또는 치료 제제의 스크리닝 방법을 제공한다.
본 발명의 스크리닝 방법에 따르면, 먼저 상기 유전자 또는 단백질을 포함하는 암세포에 분석하고자 하는 후보물질을 접촉시킬 수 있다. 상기 후보물질은 상기 유전자의 발현량, 단백질의 양 또는 단백질의 활성에 영향을 미치는지의 여부를 검사하기 위하여 스크리닝에서 이용되는 미지의 물질을 의미한다. 상기 시료는 화학물질, 안티센스 올리고뉴클레오티드, 안티센스-RNA, siRNA, shRNA, miRNA, 상기 단백질에 특이적인 항체 또는 천연물 추출물을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
이후, 후보물질이 처리된 세포에서 상기 유전자의 발현량, 단백질의 양 또는 단백질의 활성을 측정할 수 있으며, 측정 결과 상기 유전자의 발현량, 단백질의 양 또는 단백질의 활성이 감소되는 것이 측정되면 상기 후보물질은 암을 치료 또는 예방할 수 있는 제제로 사용할 수 있을 것으로 판정할 수 있다.
본 발명에 있어, 유전자의 발현 수준 또는 단백질의 양을 측정하는 방법은 공지의 기술을 이용하여 생물학적 시료로부터 mRNA 또는 단백질을 분리하는 공지의 공정을 포함하여 수행될 수 있다. 본 발명에서 상기 "생물학적 시료"란 암의 발생 또는 진행 정도에 따른 상기 유전자의 발현 수준 또는 단백질의 수준이 정상 대조군과는 다른, 생체로부터 채취된 시료를 말하며, 상기 시료로는 예를 들면, 조직, 세포, 혈액, 혈청, 혈장, 타액 및 뇨 등이 포함될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 유전자의 발현 수준 측정은 바람직하게는 mRNA의 수준을 측정하는 것이며, mRNA의 수준을 측정하는 방법으로는 역전사 중합효소연쇄반응(RT-PCR), 실시간 역전사 중합효소연쇄반응, RNase 보호 분석법, 노던 블럿 및 DNA 칩 등이 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 단백질 수준의 측정은 항체를 이용할 수 있는데, 이러한 경우 생물학적 시료 내의 상기 마커 단백질과 이에 특이적인 항체는 결합물, 즉, 항원-항체 복합체를 형성하며, 항원-항체 복합체의 형성량은 검출 라벨 (detection label)의 시그널의 크기를 통해서 정량적으로 측정할 수 있다. 이러한 검출 라벨은 효소, 형광물, 리간드, 발광물, 미소입자(microparticle), 레독스 분자 및 방사선 동위원소로 이루어진 그룹 중에서 선택할 수 있으며, 이에 제한되지 않는다. 단백질 수준을 측정하기 위한 분석 방법으로는 웨스턴 블랏, ELISA, 방사선면역분석, 방사선 면역 확산법, 오우크테로니 면역 확산법, 로케트 면역전기영동, 조직면역 염색, 면역침전 분석법, 보체 고정분석법, FACS, 단백질 칩 등이 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 내용을 하기 실시예 또는 실험예를 통해 더욱 상세히 설명하기로 한다. 다만, 본 발명의 권리범위가 하기 실시예 및 실험예에만 한정되는 것은 아니고, 그와 등가의 기술적 사상의 변형까지를 포함한다.
재료 및 방법
세포 배양
Jerry W. Shay (University of Texas, Texas, Dallas, USA)로부터 제공받은 무한증식 인간 결장 상피세포(immortalized human colon epithelial cells)인, HCEC-1CT 및 HCEC-1CT의 야생형(wild type) APC를 shRNA로 넉다운(knowkdown)하여 제조한 안정된 세포주인 HCEC-1CT-A 세포를 basal X 배지(DMEM:M199, 4:1; WelGENE Inc., Gyeongsan, korea)에서 배양하였다. 이후, 20ng/㎖의 표피성장인자(epidermal growth factor), 1㎎/㎖의 하이드로코르티손(hydrocortisone), 10㎎/㎖의 인슐린(insulin), 2㎎/㎖의 트랜스페린(transferrin), 5nM의 아셀란산나트륨(sodium selenite), 2% FBS와 항생제를 첨가하였다. 상기 항생제는 100units/㎖의 페니실린(penicillin), 100units/㎖의 스트렙토마이신(stereptomycin) 및 0.25㎍/㎖의 펀지존(fungizone)을 혼합하여 사용하였다. 그 후, 세포를 37℃, 5% CO2를 함유한 가습된 상태에서 배양하였다. 상기 "HCEC-1CT-A 세포"는 "초기 대장암 세포 모델"로써 하기 실험에 이용되었다.
shRNA의 형질 감염 및 형질 도입
렌티바이러스(lentivirus) 생산을 위하여, 리포펙타민 (Inpotrogen, Waltham, MA, USA)을 이용하여 제품의 프로토콜에 따라, APC (shAPC; TRCN0000244294, Sigma) 및 packaging mix (pLP1, pLP2 및 pLP / VSVG)를 표적으로 하는 shRNA로 HEK 293T 세포를 형질감염(transfection)시켰다. 이후, 바이러스 상청액을 수집하고, 4㎍/㎖의 폴르브렌(polybrene, Sigma)을 처리하였다. 감염된 세포는 수확 전에 500ng/㎖의 퓨로마이신(puromycin)으로 선별하였다. 스크램블된(scrambled) shRNA (shScr)로 감염된 HCEC-1CT 세포를 대조군으로 제작하고, shAPC 샘플과 동일한 기간 동안 배양하였다.
siRNA의 형질 감염
대조군 siRNA (siControl), CCDC85B siRNA (siCCDC85B-1 및 siCCDC85B-2) 및 PTTG1 siRNA (siPTTG1-1 및 siPTTG1-2) 올리고 뉴클레오티드 (BIONEER Corporation, Daejeon, South Korea)를 sense-anitsense 이중 형태로 합성하였고, 하기 표 1에 나타내었다.
siRNA name Target gene Sense siRNA Sequence
(5'→3') 		Antisense siRNA Sequence
(5'→3')
siCCDC85B-1 CCDC85B 서열번호 1 GAGGUUCGAAGCUCCUAGU 서열번호 2 ACUAGGAGCUUCGAACCUC
siCCDC85B-2 CCDC85B 서열번호 3 GAUUGGCUGUCCUUCCAUA 서열번호 4 UAUGGAAGGACAGCCAAUC
siPTTG1-1 PTTG1 서열번호 5 AGCACCAGAUUGCGCACCU 서열번호 6 AGGUGCGCAAUCUGGUGCU
siPTTG1-2 PTTG1 서열번호 7 GUUGAAUUGCCACCUGUUU 서열번호 8 AAACAGGUGGCAAUUCAAC
한편, siRNA 형질 감염을 위해, 제품의 프로토콜에 따라 siRNA와 RNAiMAX (Thermo Fisher Scientific)의 최종 농도가 2μM 인 혼합물을 60㎜ 배양 접시에서 배양된 표적 세포에 처리하였다. 혼합물 처리 24시간 후, 성장 곡선 확인 및 RNA 수득을 위하여, 형질 감염된 세포를 24웰 플레이트 및 60mm 배양 접시에서 각각 계대배양하였다.
총 RNA 추출 및 qRT - PCR 수행
제품의 프로토콜에 따라 RNA-spin™ Total RNA Extraction Kit (iNtRON Biotechnology, Gyeonggi, South Korea)를 사용하여 세포에서 전체 RNA를 추출하고, 오염된 게놈 DNA를 제거하기 위해 RNase-free DNase I (Thermo Fisher Scientific)을 처리하였다. 이후, DiaStar RT Kit (Solgent, Daejeon, Korea) 및 PCR system (Veriti 96 well Thermal Cycler; Applied Biosystems, Waltham, MA, USA)을 이용하여, 역전사 (Reverse transcription)에 의해 전체 RNA로부터 cDNA를 합성하였다. 또한, 하기 표 2의 프라이머를 이용하여, QuantStudio 5 real-time PCR system (Applied Biosystems)에서 qRT-PCR 분석을 수행하였다.
Target gene Forward primer sequence
(5'→3') 		Reverse primer sequence
(5'→3')
β actin AGAGCTACGAGCTGCCTGAG AGCACTGTGTTGGCGTACAG
APC GCCCACGAATTCTAAAACCA TTGTCCTGCCTCGAGAGATT
MYC GTCAAGAGGCGAACACAC TTGGACGGACAGGATGTA
CCDC85B TCATGCAGGAGGTGAATCGGCA AGTCCAGGAAGCAGCAGAGGTC
PTTG1 GGACCCCTCAAACAAAAACA GAGAGGCACTCCACTCAAGG
CCNA2 CTCTACACAGTCACGGGACAAAG CTGTGGTGCTTTGAGGTAGGTC
CCNB1 TTGGTGTCACTGCCATGTTT CCGACCCAGACCAAAGTTTA
CCND1 GCTGCGAAGTGGAAACCATC CCTCCTTCTGCACACATTTGA
CCNE1 TGTGTCCTGGATGTTGACTGCC CTCTATGTCGCACCACTGATACC
LGR5 CTCCCAGGTCTGGTGTGT GAGGTCTAGGTAGGAGGTGAAG
ASCL2 CGCCTACTCGTCGGACGA GCCGCTCGCTCGGCTTCCG
단일 세포 RNA 시퀀싱( scRNA - seq )
단일 세포 RNA 시퀀싱(scRNA-seq)을 위하여, HCEC-1CT 세포에 shAPC 및 shScr이 각각 형질감염된 세포를 형질감염 3일째와 7일째에 수확하였다. 이후, 단일 세포 라이브러리 제조 전, 얼음 상에서 PBS에 저장하였다. 단일 세포 RNA 시퀀싱은 제품의 프로토콜에 따라 10× Genomics Chromium V3 kit를 사용하여 수행하였다. scRNA-seq 데이터는 CellRanger 3.1.0을 이용하여 hR38을 따라 정렬시키고, Seurat 3.1 R toolkit로 처리하였다.
초기 전처리 과정은 scRNA-seq 데이터를 이용하여 Seurat의 표준 전처리 작업 흐름(standard preprocessing workflow)에 따라 수행하였다. 건강하지 않은 세포가 매우 적은 수의 유전자(<250)를 갖거나, 매우 많은 수의 유전자(>2,500)를 가지며, 미토콘드리아 게놈의 오염(>5%) 경향이 있다는 가정하에 죽은세포와 다중세포는 제외하였다. 이후, scRNA-seq datasets의 노이즈를 제거하기 위하여, DCA(deep count autoencoder)를 사용하여 결측지 보정(data imputation)을 추가로 수행하였다. 세포주기 이질성에 따른 영향은 Seurat 매뉴얼에 따라 세포주기 점수 회귀(regression)에 의해 배제되었다.
scRNA - seq 데이터 분석
1. 빠른 성장(fast growth; FG ) 및 느린 성장(slow growth; SG ) 모집단의 클러스터
단일 세포 데이터 세트의 비지도(unsupervised) 클러스터를 Seurat의 FindClusters 함수에 따른 SNN(shared nearest neighbor) 모듈화 최적화를 통해 수행하였다. 또한, 클러스터를 UMAP(uniform manifold approximation and projection) 차원축소(dimensionality reduction)를 이용해 시각화하였다.
또한, Seurat의 CellCycleScoring 함수 및 세포주기 마커로 알려진 유전자를 이용하여, 각 세포의 세포주기 점수를 부여하였다. 이후, 각 세포를 세포주기 점수에 따라 G2M, S 또는 G1 단계로 분류하였다. Seurat의 CellCycleScoring 함수는 단일 세포의 G2M 및 S phase의 점수를 정량화한 것이다.
각 세포의 정지신호 점수를 MSigDB에 소개된 세포주기 정지 관련 유전자 세트를 이용하여 Seurat의 AddModuleScore에 따라 정량하였다. MSigDB에 소개된 세포주기 정지 관련 유전자 세트는 Gene Ontology(Go) 용어 GO_REFULATION_OF_CELL_CYCLE_ARREST에서 설정한 유전자로 가장 일반적인 범위를 나타낸다.
이 유전자 세트는 세포주기 정지의 속도, 빈도 또는 정도를 조절하는 임의의 공정과 관련된 107개의 유전자를 포함하며, 이 과정은 정상 단계 중 하나에서 세포주기가 정지되는 과정이다. 정지신호 점수가 전체 단일 세포의 1/5보다 높은 경우 Arr(arrested)로 지칭하고, 그렇지 않은 경우 NArr(non-arrested)로 지칭하였다. 첫 번째 삼분위수 (first tertiles; 1/3되는 지점)보다 낮은 APC 수준을 갖는 단일 세포는 낮은 low APC라 지칭하고, 첫 번째 삼분위수 (first tertiles; 1/3되는 지점)보다 높은 APC 수준을 갖는 단일 세포는 high APC라 지칭하였다. low APC 및 Arr은, 느린 성장 부분집단(slow growth subpopulation; SG)으로 정의한 반면, high APC 및 NArr은, 빠른 성장 부분집단(fast growth subpopulation; FG)으로 정의하였다. 즉, APC 레벨이 낮으면서 정지신호(arrest signature)가 높은 "SG"와 APC 레벨이 높으면서 정지신호(arrest signature)가 낮은 "FG"로 특정한 것이다.
따라서, 하기에서는 낮은 APC 수준 느린 성장 부분집단(LSG)과 SG를, 낮은 APC 수준 빠른 성장 부분집단(LFG)과 FG를 상호 동의어로 사용하기로 한다.
2. 느린 성장 모집단의 분석
느린 성장 모집단(SG) 세포의 세포자연사(apoptosis) 신호 점수는 Gene Ontology(Go) 용어, GO_REFULATION_OF_CELL_CYCLE_APOPROSIS에서 설정한 유전자 세트를 이용하였고, 상기한 '1. 빠른 성장(fast growth; FG) 및 느린 성장(slow growth; SG) 모집단의 클러스터'에서 설정한 정지 신호 점수와 동일한 방식으로 정량하였다.
느린 성장 모집단(SG) 세포의 줄기세포능(stemness) 신호 점수는 TCGAbiolinks R toolkit에서 제공하는 TCGAanalyze_Stemnes 함수를 이용해 정량하였다. TCGAbiolinks R toolkit는 mRNAsi 줄기세포능 지수(index)를 생성하는 키트이다. 이때, 사용된 줄기세포능 신호는 PCBC_stemSig으로, PCBC_stemSig는 PCBC(progenitor cell biology constrium)의 자료(data)를 이용하여 계산된 기본 줄기세포능 신호이다.
3. VIPER를 이용한 단백질 활성 추론
SG와 FG의 유지를 제어하는 핵심 인자(master regulator)를 특정하기 위하여 VIPER(virtual inference of protein-activity by enriched regulon) 분석을 수행하였다.
단일 세포 데이터 세트는 조직 컨텍스트(context)가 없기 때문에, 여기서는 조직-특정적 규제 정보 없이 네트워크를 추론하는 metaVIPER를 사용했다. 이를 위하여, 우선 결장 직장암 세포의 네트워크는 RTN 패키지에 의한 TCGA (The Cancer Genome Atlas)로부터의 환자 발현 데이터 세트에서 추론되었다. 이어서, 관심 유전자를 포함하는 입력과 함께 CRC 네트워크에서 metaVIPER 분석을 수행하였다. 이때, 사용된 입력 유전자리스트는 SG와 FG 사이에서 차등적으로 발현된 유전자 (diffrentially expressed genes; DEG)의 리스트 및 SCENIC에 의해 생성된 레귤론리스트(regulon list)이다.
4. SCENIC를 이용한 유전자 조절 네트워크의 재구성
SG와 FG의 유전자 조절 네트워크를 생성하기 위하여, pySCENIC version 0.9.19를 이용하여 SCENIC(single-cell regulatory network inference and clustering) 분석을 수행하였다.
해당 보조 데이터 세트(corresponding auxiliary datasets)는 SCENIC 분석을 위해 사용되었고, 이를 위하여, cisTargetDB version 9에서 제공하는 hg38 및 인간 TF 바인딩 모티프(human TF binding motif)의 게놈 버전을 이용하였으며, 100bp up, 500bP up, 10kb up 및 10kb down 인간 cisTarget을 분석하였다. 또한, 해당 보조 데이터 세트(corresponding auxiliary datasets)는 1,390의 유전자를 포함하는 선별된 인간 TF의 리스트에 사용되었다. 이에 따른 레귤론리스트는 SG와 FG 사이의 활성차이를 보이기 위하여 VIPER 분석에 이용되었다.
5. 목표의 선정
metaVIPER 결과와 SCENIC 레귤론(regulons)으로부터 생성된 분자 표적 후보(molecular target candidates)를 SG와 FG 사이의 t-테스트(P <0.01)를 통해 선별하였다. 이후, SG에서 하향 조절된 유전자를 선별하기 위한 관련 유전자를 이용하여, 계층적 군집화(hierarchical clustering)를 수행하였다.
분자 표적 후보들은 SG와 FG의 평균 활동성(activity) 및 발현 수준의 차이에 따라 순위를 매겼다. 차이가 큰 것은 SG와 FG의 구별에 더 큰 영향을 미치는 주된 조절 인자로 간주하고, 활동성과 발현 수준의 차이가 큰 유전자를 선택하였다. 발현 수준은 SG와 FG 사이의 구별이 덜 명확하기 때문에, 발현 수준 차이에 대한 임계값은 1/3로 설정하였고, 활동성 차이에 대한 임계값은 1/6로 설정하였다.
다음으로, 'SG를 유지하기 위해 표적이 APC의 효과를 커버해야한다'는 이론적 근거하에, 선별된 표적 후보가 APC와 어떻게 밀접하게 관련되어 있는지를 조사하였다. 따라서, STRING DB version 11에서 SCENIC에 의해 생성된 APC, CTNNB1, WNT, 후보자 자체 및 이들의 하류 표적 유전자 리스트를 포함하는 입력 리스트를 사용하여 APC와 표적 후보 사이의 최단 경로 길이를 조사하였다. 또한, VIPER을 사용하여 상기 '3. VIPER를 이용한 단백질 활성 추론'에 기재된, TCGA 데이터베이스의 CRC 환자로부터 유추된 유전자 조절 네트워크로부터 표적 후보가 APC와 공유하는 유전자의 양을 정량하였다.
이후, MINDy (Modulator Inference by Network Dynamics)에서 표적 후보 내의 상호 작용을 탐색함으로써, 후보 TF(transcription factors)와 해당 조절자로 구성된 네트워크를 생성하였다. 다른 표적 후보와 가장 조밀하게 연결된 TF는 가장 강력한 핵심 조절 인자로 간주하였다. 즉, 동등한 수준으로 FG와 SG를 구분해주는 표적 후보 중 서로 연결 관계가 강한 것들은 어떤 특정 생물학적 프로세스를 위해 디자인된, FG 대 SG의 구분과 인과적 영향을 끼치는 것으로 가정한 것이다. 또한, Cytoscape version 3.7.1을 이용하여 네트워크를 시각화하였다. 도 1에 scRNA 시퀀싱 실험 계획 및 분석을 설명한 일련의 모식도를 나타내었다.
[ 실시예 1: scRNA 시퀀싱(sequencing) 데이터를 사용한 식별 분자 표적화 ]
1.1 단일 세포 RNA 시퀀싱( scRNA -sequencing)에서 느린 성장의 클러스터 확인
1.1.1 암의 초기 단계에서 진행되는 과정 조사
암의 초기 단계에서 진행되는 복잡한 과정을 조사하기 위하여, 초기 대장암 (CRC) 발달 모델을 확립하고, 단일 세포 RNA 시퀀싱 (scRNA-sequencing; scRNA-seq)을 수행하였으며, scRNA-seq 데이터 세트를 분석하였다. scRNA-seq는 APC 및 scrambled shRNA를 표적으로 하는 shRNA인 shAPC 및 shScr를 각각 HCEC-1CT (1CT) 세포에 형질도입 후 3일째 및 7일째 되는 날에 수행되었다.
이후, 단일 세포 라이브러리 준비 후 나머지 세포(대부분의 세포; bulk cell)의 qRT-PCR을 수행하고(도 2의 a), scRNA-seq의 발현 수준을 이용하여(도 2의 b) APC와 같은 여러 마커와 MYC 및 AXIN2를 포함한 APC의 다운스트림 표적들과 관련된 유전자의 발현을 확인하였다. 이는 동일하게 준비한 세포 샘플로 얻은 scRNA-seq과 bulk qRT-PCR의 결과를 비교하기 위함이다.
도 2에 나타난 바와 같이, APC 수준은 shScr 샘플과 비교할 때, shAPC 샘플의 벌크 수준 세포(bulk cell) 및 단일 세포 데이터에서 최소 50%가량 감소하였다. MYC 수준은 shAPC 샘플의 벌크 데이터에서 약간 증가하였으며, AXIN2 수준은 shAPC 샘플의 벌크 데이터에서 매우 높은 수준의 증가를 보였다. 그러나 MYC 및 AXIN2 발현 수준은 scRNA-seq 데이터에서 혼선되는 경향이있다.
또한, 초기 APC 결핍 세포와 그렇지 않은 세포 사이에 정지 신호 점수의 변화를 분석하였고, 도 3에 나타난 바와 같이, shScr 샘플과 비교하였을 때, shAPC 샘플에서 정지 신호 점수증가를 발견하였다. 이러한 정지 신호 점수의 변화는 3일차 및 7일차 샘플에서 모두 나타났으며, 7일차 샘플에서 정지 신호 점수의 변화가 더욱 명확하게 나타났다.
1.1.2 APC가 하향 조절된 세포에서 정지 신호 증가를 유도하는 근원 파악
APC가 하향 조절된 세포에서 정지 신호 증가를 유도하는 근원을 파악하기 위하여, 이를 담당하는 소집단이 있다고 가정하고, shAPC 단일 세포 샘플에서 클러스터의 특성을 조사하였다. 도 4에 나타난 바와 같이, 11개의 군집이 확인되었고, 4가지 기준으로 분류하였다. 상기 4가지 기준은 APC 수준이 높고 빠른 성장을 보이는 HFG, APC 수준이 낮고 빠른 성장을 보이는 LFG, APC 수준이 낮고 느린 성장을 보이는 LSG 및 상기 3가지 기준에 해당되지 않는 None으로 표시하였다. 상기한 기준은 세포의 세포주기 단계, 정지신호 및 APC 수준을 포함하였다. 11개 군집의 특성을 하기 표 3에 나타내었다.
Cluster Cell phase Growth APC level Criteria
G1 G2M S Arr NArr
0 384 21 6 209 202 -0.699 None
1 233 102 42 79 298 -0.621 None
2 253 19 19 28 263 -0.666 LFG
3 211 66 9 68 218 -0.56 None
4 205 22 35 58 204 -0.461 None
5 201 42 8 40 211 -0.732 LFG
6 215 23 4 60 182 -0.349 None
7 117 51 36 17 187 -0.455 HFG
8 113 3 4 4 116 -0.673 LFG
9 1 89 17 106 1 -0.782 LSG
10 79 3 8 33 57 -0.667 None
상기 표 3에 의하면, 1개의 HFG 군집 (클러스터 7), 3개의 LFG 군집 (클러스터 2, 5, 8) 및 1개의 LSG 군집 (클러스터 9)가 확인되었다. 본 발명에서는 APC 하향 조절에 의해 영향을 받는 세포에 중점을 두고 있는바, HFG 군집은 이하의 분석에서 제외하였고, LSG와 LFG를 각각 SG 및 FG로 간편하게 지칭하기로 하였다.
1.1.3 SG와 FG의 추가적인 생물학적 과정 차이 확인
SG와 FG가 단순히 정지 신호 이외에 세포자연사(apoptosis) 및 줄기세포능(stemness)와 같은 추가적인 생물학적 과정에 차이를 보이는지를 조사하였다. 도 5에 나타난 바와 같이, SG는 FG보다 더 높은 세포자연사 신호 및 더 낮은 줄기세포능 신호를 보이는 것으로 확인되었다. 이러한 결과는 SG가 더 이상의 악성 종양을 발생시키지 않으면서 세포자멸사가 유도될 것임을 나타낸다.
1.2 초기 종양을 억제하기 위한 표적 후보 선정
1.2.1 FG를 SG로 유도할 수 있는 전사 인자를 확인
FG가 후기 암을 진행시키는 동안 SG가 소멸을 진행할 것이라는 가정하에, FG를 SG로 유도할 수 있는 전사 인자를 확인하기 위하여 핵심 조절 인자 분석을 수행함으로써, APC 결핍 세포의 대부분이 세포자연사를 겪도록 하였다.
도 6의 a에 나타난 바와 같이, 1CT와 1CT-A(knockdown of wild type APC) 사이의 848개의 차등 발현 유전자 (DEG)를 metaVIPER 분석에 공급하여, SG 또는 FG에서 단백질 활성을 갖는 412개의 유전자를 생성하였다.
또한, 추가 핵심 조절 인자 분석에 앞서, SCENIC를 사용하여 FG 및 SG의 유전자 조절 네트워크를 조사함으로써, 2개의 모집단이 다르게 조직화된 유전자 조절 구조를 갖는지 확인하였다. 이때, SG 레귤론(regulons) 및 FG 레귤론(regulons)은 SCENIC에서 추론하는 레귤론 및 DEGs에서 단백질 활동 유전자 레귤론의 공통유전자로서 정의하였다. 도 7에 나타난 바와 같이, SCENIC 추론에 의한 FG 레귤론은 E2F7, FOXN2, TFAP4, FOXK2, NFIX, RARA 및 HMGA1으로 구성(도 7의 a)되는 반면, SG 레귤론은 ARNTL2, YBX1, ZNF513, HINFP, PPARG, TEF, TEAD4, ZNF766 및 NR1D1으로 구성(도 7의 b)되는 것으로 나타났다.
SG 레귤론 및 FG 레귤론은 레귤론의 표적 유전자를 포함하도록 확장하였고 1,411개의 유전자의 레귤론 리스트를 생성하기 위해 병합하였다. 도 6의 b에 나타난 바와 같이, 이 조절 리스트를 다시 metaVIPER에 공급하고 SG에서 다른 활동 패턴을 갖는 3개의 유전자 클러스터를 생성하였다.
이후, 도 8에 나타난 바와 같이, 통계적으로 유의미한, SG에서 하향 조절된 유전자만을 취하고, SG와 FG 간의 발현 및 활성의 차이 수준을 정렬하여 다시 필터링하였다.
1.2.2 표적 후보의 범위 감축
도 9에 나타난 바와 같이, 표적 후보의 범위를 좁히기 위하여, APC와 목표 후보 간 또는 목표 후보 간 상호 작용을 조사하였다. 이를 위하여, 첫 번째로, STRING DB를 사용하여 표적 후보와 APC 사이의 최단 경로 길이를 조사하여, APC와 연결된 3개의 유전자 그룹을 확인하였다. 최단 경로 길이가 2인 유전자 그룹은 HDAC2, RUVBL1 및 RUVBL2로 확인되었고, 최단 경로 길이가 3인 유전자 그룹은 CCDC85B, ELOB, ELOC, ILF2, PFN1 및 PTTG1로 확인되었으며, 최단 경로 길이가 4인 유전자 그룹은 DNTTIP2 및 PA2G4로 확인되었다(도 9의 a).
두 번째로, APC와 얼마나 많은 표적 유전자를 공유하는지 평가하여 APC 간의 표적 상호 작용을 조사한 결과, CCDC85B는 가장 밀도가 높은 APC 레귤론 공유 유전자 중 하나인 것으로 확인되었다(도 9의 b).
또한, APC와의 최단 경로를 갖는 HDAC2, RUVBL1, RUVBL2는 불필요한 기능 또는 일반성 부족의 이유로 이후의 분석에서 제외되었다. HDAC2는 불필요한 기능(redundant fuction)을 갖는 것으로 알려져 있기 때문에, 초기 암 발생에 대한 마커로 선택되기에는 어려움이 있다. 또한, 1CT는 텔로머라아제(telomerase)를 hTERT 유전자를 조작함으로써 제작된 세포주인데, RUVBL1과 RUVBL2가 이러한 텔로머라이제 생분해를 주요 기능으로 삼고 있기 때문에 일반적인 표적이 아닌 1CT 콘덱스트(context) 특정 표적인 것으로 의심된다. 따라서, 이들 다음으로 APC와 가까운 최단 경로 길이가 3인 유전자가 최단 경로 길이가 2인 유전자 대신 표적으로 고려되었다. 이 최단 경로 길이가 3인 유전자들 사이의 관계를 파악하기 위하여, 이들 사이를 중계하는 조절자(modulator)를 MINDy로 추론하였다(도 9의 c 및 d).
이는, 후보들 사이의 연결이 긴밀할수록 특정 프로세스 수행을 위해 의도적으로 디자인된 유전자일 것이라는 가정을 확인하기 위한 과정으로, 후보들이 모두 전사인자이기 때문에 전사인자들을 연결하는 조절자(modulator)들이 어떻게 전사인자들을 잇는지 확인한 것이다.
6개의 후보 중 CCDC85B와 PTTG1만이 서로 직접적으로 연결되어 있음이 MINDy에 의해 확인되었다. 조밀하게 연결된 핵심 조절 인자(master regulators)가 덜 조밀한 상호작용(밀도가 상대적으로 낮은)을 갖는 핵심 조절 인자에 비해 SG 또는 FG에서 생물학적 프로세스를 조절할 가능성이 높다는 가정하에, 최종 목표 후보로 CCDC85B 및 PTTG1을 선택하였다.
CCDC85B와 APC는 124개의 유전자를 공유하고(도 9의 e), 그들의 공유 유전자는 거대 분자 생합성 과정의 조절 및 RNA 대사의 조절과 같은 필수 생물학적 과정의 참여자이므로, CCDC85B를 주요 대상 후보로 간주하였다. APC와 CCDC85B 간의 공유 유전자 표적의 GO 용어 분석표를 하기 표 4에 나타내었다.
GO biological process complete Fold enrichment FDR
regulation of macromolecule biosynthetic process (GO:0010556) 2.08 1.82E-04
regulation of cellular metabolic process (GO:0031323) 1.81 1.92E-04
regulation of nucleobase-containing compound metabolic process (GO:0019219) 2.09 2.19E-04
regulation of macromolecule metabolic process (GO:0060255) 1.8 2.22E-04
regulation of nitrogen compound metabolic process (GO:0051171) 1.81 2.23E-04
regulation of metabolic process (GO:0019222) 1.78 2.31E-04
regulation of primary metabolic process (GO:0080090) 1.78 2.56E-04
regulation of RNA metabolic process (GO:0051252) 2.1 3.37E-04
regulation of gene expression (GO:0010468) 1.96 5.38E-04
regulation of biosynthetic process (GO:0009889) 1.98 5.75E-04
organelle organization (GO:0006996) 2.13 6.33E-04
chromatin organization (GO:0006325) 4.04 1.72E-03
regulation of cellular biosynthetic process (GO:0031326) 1.94 1.88E-03
regulation of cellular process (GO:0050794) 1.4 2.01E-03
regulation of cellular macromolecule biosynthetic process (GO:2000112) 1.99 2.01E-03
cellular macromolecule metabolic process (GO:0044260) 1.79 3.29E-03
protein modification process (GO:0036211) 2.09 3.32E-03
biological regulation (GO:0065007) 1.33 3.37E-03
regulation of RNA biosynthetic process (GO:2001141) 2.01 3.42E-03
cellular protein modification process (GO:0006464) 2.09 3.49E-03
1.2.3 표적 후보와 SG 특성의 관련성 평가
표적 후보가 SG의 특성과 관계가 있음을 확인하기 위해, 표적 후보의 발현 또는 활성과 세포자연사 신호 또는 정지 신호 사이의 상관관계를 조사하였다. 도 10에 나타난 바와 같이, CCDC85B의 활성 및 발현 모두는 정지 신호 및 세포자연사 신호 점수와 음의 상관관계를 가짐을 확인하였다. 이러한 결과는 CCDC85B의 하향 조절이 세포주기를 느리게 할 수 있음을 의미한다. 한편, 도 11에 나타난 바와 같이, PTTG1의 발현 또는 활성과 세포자연사 신호 또는 정지 신호 점수와의 관계는 CCDC85B의 경우와 유사한 것으로 나타났다.
[ 실시예 2: 시험관 내 표적 검증]
2.1 1CT -A에서 CCDC85B 간섭이 세포주기 및 줄기세포능에 미치는 영향 평가
표적 후보가 암 진행을 방해할 수 있는지를 검증하기 위해, siRNA를 사용하여 CCDC85B 및 PTTG1의 시험관 내 녹다운을 수행하고, 성장률 및 전사체 수준의 변화를 확인하였다.
도 12에 나타난 바와 같이, CCDC85B를 표적으로 하는 siRNA(siCCDC85B)를 사용하자 1CT-A의 세포 성장률이 크게 감소하였다(도 12의 a 및 b). APC 및 MYC의 상대 mRNA 수준은 siCCDC85B 형질 감염에 의해 영향을 받지 않은 반면, CCDC85B 및 PTTG1의 mRNA 수준은 감소하였다(도 12의 c).
한편, CCDC85B가 어떤 사이클린(cyclin)에 영향을 미치는지 알아보기 위하여, 다양한 사이클린의 수준 변화를 조사하였다. 도 12의 c에 의하면, Cyclin A2와 Cyclin B1이 siCCDC85B에 의해 감소하였으므로, CCDC85B가 G2/M 단계에서 작용할 수 있다고 가정했다. 이는, 흥미롭게도 상기 표 3에 나타난 바와 같이, 대부분의 SG가 단일 세포 데이터에 머물렀던 세포 단계와 일치하는 결과이다.
2.2 1CT -A에서 PTTG1 간섭이 세포주기 및 줄기세포능에 미치는 영향 평가
PTTG1이 CCDC85B와 함께 기능하는 것으로 의심되기 때문에, 1CT-A에 siRNA (siPTTG1)를 처리함으로써, 세포주기 및 줄기세포능에 대한 PTTG1 간섭의 효과를 조사하였다. 도 13의 a 및 b에 나타난 바와 같이, 세포주기는 정지되었고 siCCDC85B 결과와 동일하게 Cyclin A2와 Cyclin B1이 주요 영향을 받는 사이클린으로 나타났다.
또한, 도 12의 c 및 도 13의 c에 의하면, siPTTG1 형질 감염은 CCDC85B에 비하여 PTTG1의 발현 수준을 크게 감소시키는 반면, siCCDC85B 형질 감염은 CCDC85B 및 PTTG1 모두의 수준을 동등한 정도로 감소시켰다. 대표적인 줄기세포능 마커인 LGR5와 ASCL2는 PTTG1이 교란되었을 때 중요하지 않은 변화를 보인 반면, CCDC85B가 교란되었을 때는 뚜렷한 감소를 나타내었다. 이러한 결과는, CCDC85B과 PTTG1이 세포주기의 정지신호를 높임으로써 세포주기를 느리게 하고, 특히 CCDC85B는 줄기세포능을 억제함으로써 악성 종양으로의 발달을 저지할 수 있음을 보여준다.
<110> Korea Advanced Institute of Science and Technology <120> Composition for prevention or treatment of earliest stage colorectal cancer <130> KIST1_41P <160> 8 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> This is sense siRNA sequence of siCCDC85B-1 <400> 1 gagguucgaa gcuccuagu 19 <210> 2 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> This is antisense siRNA sequence of siCCDC85B-1 <400> 2 acuaggagcu ucgaaccuc 19 <210> 3 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> This is sense siRNA sequence of siCCDC85B-2 <400> 3 gauuggcugu ccuuccaua 19 <210> 4 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> This is antisense siRNA sequence of siCCDC85B-2 <400> 4 uauggaagga cagccaauc 19 <210> 5 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> This is sense siRNA sequence of siPTTG1-1 <400> 5 agcaccagau ugcgcaccu 19 <210> 6 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> This is antisense siRNA sequence of siPTTG1-1 <400> 6 aggugcgcaa ucuggugcu 19 <210> 7 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> This is sense siRNA sequence of siPTTG1-2 <400> 7 guugaauugc caccuguuu 19 <210> 8 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> This is antisense siRNA sequence of siPTTG1-2 <400> 8 aaacaggugg caauucaac 19

Claims (12)

  1. CCDC85B(coiled-coil domain containing 85B) 및 PTTG1(PTTG1 regulator of sister chromatid separation, securin) 중 선택되는 어느 하나의 유전자 또는 단백질 저해제를 포함하는 대장암 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 대장암은,
    초기 단계(earliest stage)의 대장암인 것을 특징으로 하는 대장암 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 대장암은,
    APC(adenomatous polyposis coli) 변이암인 것을 특징으로 하는 대장암 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 저해제는,
    CCDC85B(coiled-coil domain containing 85B) 및 PTTG1(PTTG1 regulator of sister chromatid separation, securin) 중 선택되는 어느 하나의 유전자 또는 단백질을 표적으로 하는 siRNA, shRNA, miRNA, 리보자임, 안티센스 핵산, DNA/RNA 키메라 폴리뉴클레오티드, 항체 및 이들을 발현하는 벡터인 것을 특징으로 하는 대장암 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 CCDC85B(coiled-coil domain containing 85B) siRNA 저해제는,
    서열번호 1의 핵산서열로 구성된 올리고 뉴클레오타이드 및 서열번호 2의 핵산서열로 구성된 올리고 뉴클레오타이드를 모두 포함하는 세트; 또는 서열번호 3의 핵산서열로 구성된 올리고 뉴클레오타이드 및 서열번호 4의 핵산서열로 구성된 올리고 뉴클레오타이드를 모두 포함하는 세트; 중 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 대장암 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  6. 제4항에 있어서,
    상기 PTTG1(PTTG1 regulator of sister chromatid separation, securin) siRNA 저해제는,
    서열번호 5의 핵산서열로 구성된 올리고 뉴클레오타이드 및 서열번호 6의 핵산서열로 구성된 올리고 뉴클레오타이드를 모두 포함하는 세트; 또는 서열번호 7의 핵산서열로 구성된 올리고 뉴클레오타이드 및 서열번호 8의 핵산서열로 구성된 올리고 뉴클레오타이드를 모두 포함하는 세트; 중 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 대장암 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 저해제는,
    대장암 세포의 높은 세포자연사를 유도하고, 대장암 세포를 낮은 줄기세포능을 갖는 세포로 유도하며, 대장암 세포의 G2/M 단계(phase)에서 세포주기 정지를 유도하는 것을 특징으로 하는 대장암 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  8. CCDC85B(coiled-coil domain containing 85B) 및 PTTG1(PTTG1 regulator of sister chromatid separation, securin) 중 선택되는 어느 하나의 유전자 또는 단백질 저해제를 개체에 처리하는 단계;를 포함하는 인간을 제외한 개체의 대장암 예방 또는 치료 방법.
  9. CCDC85B(coiled-coil domain containing 85B) 및 PTTG1(PTTG1 regulator of sister chromatid separation, securin) 중 선택되는 어느 하나의 유전자 또는 단백질 저해제를 포함하는, 생체 외(in vitro)에서 대장암 세포의 높은 세포자연사, 대장암 세포의 G2/M 단계(phase)에서의 세포주기 정지 유도용 또는 대장암 세포의 줄기세포능 저감용 조성물.
  10. CCDC85B(coiled-coil domain containing 85B) 및 PTTG1(PTTG1 regulator of sister chromatid separation, securin) 중 선택되는 어느 하나의 유전자 또는 단백질 저해제를 포함하는 대장암 예방 또는 치료용 항암보조제.
  11. CCDC85B(coiled-coil domain containing 85B) 및 PTTG1(PTTG1 regulator of sister chromatid separation, securin) 중 선택되는 어느 하나의 유전자 또는 단백질 저해제를 포함하는 대장암 예방 또는 개선용 건강기능식품.
  12. (a) CCDC85B(coiled-coil domain containing 85B) 및 PTTG1(PTTG1 regulator of sister chromatid separation, securin) 중 선택되는 어느 하나를 발현하는 분리된 대장암 세포에 후보물질을 처리하는 단계;
    (b) 상기 후보물질이 처리된 분리된 암세포에서 CCDC85B(coiled-coil domain containing 85B) 및 PTTG1(PTTG1 regulator of sister chromatid separation, securin) 중 선택되는 어느 하나의 발현 수준을 측정하는 단계; 및
    (c) 상기 (b) 단계에서 측정된 CCDC85B(coiled-coil domain containing 85B) 및 PTTG1(PTTG1 regulator of sister chromatid separation, securin) 중 선택되는 어느 하나의 발현 수준이 후보물질이 처리되지 않은 분리된 대장암 세포에 비해 낮은 경우, 상기 후보물질을 대장암의 예방 또는 치료 제제로 사용할 수 있을 것으로 판정하는 단계;를 포함하는 대장암의 예방 또는 치료 제제의 스크리닝 방법.
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