KR102347996B1 - 메트포르민을 유효성분으로 포함하는 혈관신생 억제용 약학적 조성물 - Google Patents

메트포르민을 유효성분으로 포함하는 혈관신생 억제용 약학적 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 메트포르민을 유효성분으로 포함하는 혈관신생 억제용 조성물에 관한 것으로서, 위암 세포주에서 PTPRD 유전자의 발현 억제로 인한 CXCL8 단백질 및 혈관신생능 증가를 메트포르민이 억제하는 활성이 있음을 확인함에 따라, 메트포르민을 유효성분을 포함하는 조성물은 PTPRD 유전자의 발현 감소, 낮은 PTPRD 단백질 및 이로 인한 CXCL8 발현 증가와 같은 메커니즘으로 인한 혈관신생을 억제하는 제제로서 사용될 수 있고, 암의 성장, 재발 및 전이와 같은 암의 악성화를 예방, 개선 및 치료를 위한 제제로 제공된다.

Description

메트포르민을 유효성분으로 포함하는 혈관신생 억제용 약학적 조성물{Pharmaceutical compositions for angiogenesis inhibition comprising metformin as an active ingredient}
본 발명은 메트포르민을 유효성분으로 포함하는 혈관신생 억제용 조성물에 관한 것이다.
암의 악성화는 대형병원의 환자들 사망의 주요 원인이며, 전 세계적으로 과반수 이상이 암의 악성화에 의해 사망하기 때문에 암의 치료제 또는 암의 악성화를 억제하는 치료법이 많이 연구되고 있다. 암의 치료법에 있어서도 외과적수술, 방사선 요법, 화학적치료, 면역요법 등이 발달해 왔다. 다양한 종류의 암세포를 이용하여 항암제를 개발하는 연구가 진행되어 왔다.
종래 주로 임상에서 사용되고 있는 항암제제들은 대부분 5-플루오로우라실, 시트라라빈 등과 같은 핵산의 합성 억제제들 또는 알킬화 약품, 미토마이신, 시스플라틴, 프로카바진 등과 같은 핵산과 반응하여 세포독성을 나타내는 물질로 분류할 수 있다. 그러나 이러한 항암제들은 암세포뿐만 아니라 정상세포를 공격하여 심각한 부작용을 유발한다는 단점 때문에 이러한 문제점을 해결할 새로운 암 치료제의 개발이 절실히 요구되고 있다.
혈관신생은 기존의 혈관으로부터 새로운 혈관이 형성되는 과정으로, 정상적인 발생, 즉 태아의 발생(embryonic development), 생식주기(female reproductive cycle), 성장 그리고 상처 치유시 필수적일 뿐 아니라, 각종암, 관절염, 당뇨병성 망막증, 죽상경화증 등의 질병과도 깊은 관련을 맺고 있다. 특히 신생암의 발생과 악성종양으로 발전하는 과정중의 하나인 암의 전이시 혈관신생은 필수적인 과정으로 여겨진다. 혈관신생은 위와 같이 양면성을 가지고 있어서 이에 대한 연구 역시 이것을 억제하는 물질 탐색과 촉진하는(상처의 치료촉진제) 물질 탐색으로 진행되고 있으며 몇가지의 억제제는 항암제로서의 활성검증을 위하여 임상 시험중인 것도 있다.
한편, 역학 연구에 따르면 고혈당증은 특정 악성 종양의 유병률과 사망률을 증가시키는 것으로 보고된 바 있다. 실험적 연구에서 고혈당증이 암 세포의 증식 및 침습을 촉진하고, 세포 자멸 저항성을 유도하며, 암 세포의 화학 저항성을 향상시킬 수 있음을 입증함으로써 이러한 발견을 지지 해왔다. 이에 따라, 항 당뇨병제의 의해 유도된 암세포의 대사 리프로그래밍은 동물 모델에서 유방암 위험의 현저한 감소를 초래한다고 보고되었다. 최근 연구에서는 항당뇨병제를 이용하여 암의 진행을 억제하고 기저 메커니즘을 확인하는 연구가 진행되고 있다.
본 발명자들은 이와 같은 점을 감안하여 항당뇨병제 메트포르민이 암의 악성화와 관련된 혈관신생을 억제하는 메커니즘에 관여하는 것을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
본 발명은 메트포르민을 유효성분으로 포함하는 혈관신생 억제용 조성물에 관한 것으로, 메트포르민이 암세포에서 PTPRD 유전자의 발현 감소, 낮은 PTPRD 단백질 및 CXCL8 발현 증가와 같은 메커니즘으로 인해 유도되는 혈관신생을 억제함으로써, 암의 성장, 재발 및 전이를 억제하여 암의 예방, 개선 및 치료를 위한 제제로 이용할 수 있는 혈관신생 억제제를 제공하는 것이다.
본 발명은 메트포르민 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 혈관신생 억제용 약학적 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 메트포르민을 유효성분으로 포함하는 암의 예방 및 개선을 위한 건강기능 식품 조성물로서, 상기 메트포르민이 암 세포 주변의 혈관신생을 억제함으로써 암의 성장 및 전이를 억제하는 활성을 갖는 것을 특징으로 하는 건강기능 식품 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 메트포르민 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물로서, 상기 약학적 조성물은 암을 갖지 않은 정상보다 (1) PTPRD 유전자의 발현 수준이 낮거나 발현되지 않은 환자; 또는 (2) PTPRD 유전자에 의해 발현되는 단백질의 수준이 낮은 환자에게 투여하기 위한 것이고, 상기 환자는 CXCL8 유전자에 의해 발현되는 단백질의 수준이 암을 갖지 않은 정상보다 높은 환자인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 암 환자에서 분리된 생물학적 시료에서 PTPRD 유전자에 의해 발현되는 단백질의 수준을 측정하는 제1단계; 및 시험물질을 처리한 후 PTPRD 유전자에 의해 발현되는 단백질의 수준이 시험물질을 처리하지 않은 분리된 생물학적 시료의 PTPRD 유전자에 의해 발현되는 단백질의 수준에 비해 증가하면 혈관신생 억제제로 판단하는 제2단계를 포함하는 암세포에 대한 혈관신생 억제제의 스크리닝 방법으로, 상기 암 환자에서 분리된 생물학적 시료에서 CXCL8 유전자에 의해 발현되는 단백질의 수준을 측정하는 제1단계; 및 시험물질을 처리한 후 CXCL8 유전자에 의해 발현되는 단백질의 수준이 시험물질을 처리하지 않은 분리된 생물학적 시료의 CXCL8 유전자에 의해 발현되는 단백질의 수준에 비해 감소하면 혈관신생 억제제로 판단하는 제2단계;를 추가로 포함하는 암세포에 대한 혈관신생 억제제의 스크리닝 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 암 환자에서 분리된 생물학적 시료로부터 PTPRD 유전자의 mRNA 또는 이의 단백질의 발현 수준을 측정하는 제1단계; 및 상기 mRNA 또는 단백질의 발현 수준이 암을 갖지 않은 정상 대조군보다 낮은 수준이면 암의 성장, 재발, 및 전이와 같은 악성화가 진행될 수 있다고 판단하는 제2단계;를 포함하는 암 환자의 예후 예측을 위한 정보 제공 방법으로, 상기 암 환자에서 분리된 생물학적 시료에서 CXCL8 유전자에 의해 발현되는 단백질의 수준을 측정하여 암을 갖지 않은 정상 대조군보다 높은 수준이면 암의 성장, 재발, 및 전이와 같은 악성화가 진행될 수 있다고 판단하는 단계를 포함하는 암 환자의 예후 예측을 위한 정보 제공 방법을 제공한다.
본 발명에 따르면, 위암 세포주에서 PTPRD 유전자의 발현 억제로 인한 CXCL8 단백질 및 혈관신생능 증가를 메트포르민이 억제하는 활성이 있음을 확인함에 따라 메트포르민을 유효성분을 포함하는 조성물이 PTPRD 유전자의 발현 감소, 낮은 PTPRD 단백질 및 CXCL8 발현 증가와 같은 메커니즘으로 인한 혈관신생을 억제하는 제제로서 사용될 수 있고, 암의 성장, 재발 및 전이와 같은 암의 악성화를 예방, 개선 및 치료를 위한 제제로 제공될 수 있다.
도 1은 정상 위 점막 조직 및 위암 조직에서 PTPRD의 발현 수준을 평가하기 위해 면역 염색을 수행한 현미경 사진(A) 및 위암 조직에서 PTPRD의 발현 정도를 고(high), 중(intermediate), 저(low) 3 단계로 분류한 퍼센트를 나타내는 그래프(B)이다. A의 사이즈바는 50 μm이다.
도 2는 위암의 침윤 단계(T1b, T2, T3, T4) 및 림프절 전이 단계(N0, N1, N2, N3)에 따른 PTPRD의 발현을 고(high), 중(intermediate), 저(low) 3 단계로 분류한 퍼센트를 나타내는 그래프이다.
도 3은 Kaplan-Meier 추적기를 사용하여 PTPRD의 고(high), 중(intermediate), 저(low) 3 단계에 따른 위암 수술 이후의 시간에 따른 전체 생존 환자수(A) 및 종양 재발 환자수(B)를 측정한 그래프이다.
도 4는 PTPRD의 발현 수준 고(high), 중(intermediate), 저(low) 3 단계에 따른 위암의 국소 부위, 림프절 및 먼 부위(복막, 간 및 폐와 같은 다른 장기를 포함함)에서의 암 재발율을 비교한 그래프이다.
도 5는 위암 세포주(AGS, KATOIII, SNU1, SNU216, SNU668, GCIY, MKN74)에서 PTPRD 단백질의 발현 유무를 분석(A)하고, PTPRD 단백질이 발현된 위암 세포주의 PTPRD 발현 억제를 위한 렌티바이러스 형질도입 후의 PTPRD 단백질 및 PTPRD 유전자의 mRNA 발현 정도를 측정(B)한 그림이다. shPTPRD는 PTPRD 유전자의 mRNA에 특이적으로 결합하는 shRNA이고 shNS는 비표적 스크램블 shRNA이다.
도 6은 마이크로 어레이 분석 과정을 요약한 그림이다.
도 7은 위암 세포주에서 PTPRD 유전자의 발현 억제 여부에 따른 CXCL8 유전자의 발현을 RT-PCR 및 qRT-PCR로 평가한 도이다. 독립 t-검증(unpaired Student’s t-test)에 따라 *는 p<0.05이고, **는 p<0.01이고, ***는 p<0.001이다.
도 8은 위암 세포주에서 PTPRD 유전자의 발현 억제 여부에 따른 발현된 CXCL8 단백질의 수준(pg/mL)을 시간에 따라 ELISA로 측정한 그래프이다. 독립 t-검증(unpaired Student’s t-test)에 따라 *는 p<0.05이고, **는 p<0.01이고, ***는 p<0.001이다.
도 9는 TCGA 데이터에서 PTPRD mRNA와 CXCL8 mRNA의 역상관관계를 평가한 도이다.
도 10은 위암 세포주 MKN74(A) 및 SNU216(B)에서 PTPRD 유전자의 발현 억제 여부 및 CXCL8 유전자 발현 억제 여부에 따른 암 세포주의 혈관신생능을 평가한 도이다. shPTPRD는 PTPRD 유전자의 mRNA에 특이적으로 결합하는 shRNA이고, shNS는 비표적 스크램블 shRNA이고, CXCL8 siRAN는 CXCL8 유전자의 mRNA에 특이적으로 결합하는 siRNA이고, Con-siRNA는 대조군 siRNA이다. 독립 t-검증(unpaired Student’s t-test)에 따라 *는 p<0.05이고, **는 p<0.01이고, ***는 p<0.001이다. 사이즈바는 100 μm이다.
도 11은 PTPRD 유전자가 발현 억제된 위암 세포주에 ERK 및 STAT3 단백질의 발현 및 활성을 웨스턴 블롯으로 평가한 도이다. U0126는 ERK 억제제이고, S3I-201는 STAT3 억제제이다.
도 12는 PTPRD 유전자가 발현 억제된 위암 세포주 MKN74(A) 및 SNU216(B)에서 ERK 및 STAT3의 억제 여부에 따른 CXCL8 단백질의 수준(pg/mL) 및 CXCL8 유전자 발현 정도(2ΔΔCT)를 측정한 그래프이다. 독립 t-검증(unpaired Student’s t-test)에 따라 *는 p<0.05이고, **는 p<0.01이고, ***는 p<0.001이다.
도 13은 PTPRD 유전자가 발현 억제된 위암 세포주 MKN74 및 SNU216에서 ERK 및 STAT3의 억제 여부에 따른 혈관신생능을 평가한 도이다. 독립 t-검증(unpaired Student’s t-test)에 따라 *는 p<0.05이고, **는 p<0.01이고, ***는 p<0.001이다. 사이즈바는 200 μm이다.
도 14는 PTPRD 유전자가 발현 억제된 위암 세포주 MKN74 및 SNU216에서 메트포르민 처리 농도에 따른 ERK 및 STAT3 단백질의 발현 및 활성을 웨스턴 블롯으로 평가한 도이다.
도 15는 PTPRD 유전자가 발현 억제된 위암 세포주 MKN74 및 SNU216에서 메트포르민 처리 농도에 따른 CXCL8 단백질의 수준(pg/mL) 및 CXCL8 유전자 발현 정도(2ΔΔCT)를 평가한 도이다. 독립 t-검증(unpaired Student’s t-test)에 따라 *는 p<0.05이고, **는 p<0.01이고, ***는 p<0.001이다.
도 16은 PTPRD 유전자가 발현 억제된 위암 세포주 MKN74 및 SNU216에서 메트포르민 처리에 따른 혈관신생능을 평가한 도이다. 독립 t-검증(unpaired Student’s t-test)에 따라 *는 p<0.05이고, **는 p<0.01이고, ***는 p<0.001이다. 사이즈바는 200 μm이다.
도 17은 PTPRD 유전자가 발현 억제된 위암 세포주 MKN74 및 SNU216에서 메트포르민 처리에 따른 암세포의 생존능을 측정한 그래프이다. 독립 t-검증(unpaired Student’s t-test)에 따라 *는 p<0.05이고, **는 p<0.01이고, ***는 p<0.001이다.
도 18은 PTPRD 유전자가 발현 억제된 위암 세포주에서 메트포르민 처리에 따른 PTPRD 단백질 발현 여부, PTPRD 유전자 발현 여부 및 PTPRD 유전자 발현 정도(2ΔΔCT)를 평가한 도이다. 독립 t-검증(unpaired Student’s t-test)에 따라 *는 p<0.05이고, **는 p<0.01이고, ***는 p<0.001이다.
본 명세서에서 사용되는 용어는 본 발명에서의 기능을 고려하면서 가능한 현재 널리 사용되는 일반적인 용어들을 선택하였으나, 이는 당 분야에 종사하는 기술자의 의도 또는 판례, 새로운 기술의 출현 등에 따라 달라질 수 있다. 또한, 특정한 경우는 출원인이 임의로 선정한 용어도 있으며, 이 경우 해당되는 발명의 설명 부분에서 상세히 그 의미를 기재할 것이다. 따라서 본 발명에서 사용되는 용어는 단순한 용어의 명칭이 아닌, 그 용어가 가지는 의미와 본 발명의 전반에 걸친 내용을 토대로 정의되어야 한다.
다르게 정의되지 않는 한, 기술적이거나 과학적인 용어를 포함해서 여기서 사용되는 모든 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가지고 있다. 일반적으로 사용되는 사전에 정의되어 있는 것과 같은 용어들은 관련 기술의 문맥상 가지는 의미와 일치하는 의미를 가지는 것으로 해석되어야 하며, 본 출원에서 명백하게 정의하지 않는 한, 이상적이거나 과도하게 형식적인 의미로 해석되지 않는다.
수치 범위는 상기 범위에 정의된 수치를 포함한다. 본 명세서에 걸쳐 주어진 모든 최대의 수치 제한은 낮은 수치 제한이 명확히 쓰여져 있는 것처럼 모든 더 낮은 수치 제한을 포함한다. 본 명세서에 걸쳐 주어진 모든 최소의 수치 제한은 더 높은 수치 제한이 명확히 쓰여져 있는 것처럼 모든 더 높은 수치 제한을 포함한다. 본 명세서에 걸쳐 주어진 모든 수치 제한은 더 좁은 수치 제한이 명확히 쓰여져 있는 것처럼, 더 넓은 수치 범위 내의 더 좋은 모든 수치 범위를 포함할 것이다.
이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.
본 발명은 메트포르민 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 혈관신생 억제용 약학적 조성물을 제공한다.
상기 ‘혈관신생’은 암 세포가 특정 물질을 분비하여 주변으로 혈관이 성장되는 모든 작용을 의미한다. 암 세포가 빠르게 성장하기 위해서는 주변으로 혈관을 형성하여 산소와 영양분을 공급을 받으며, 암의 발병 단계가 지속될수록 암 세포는 다른 장기로 옮겨갈 수 있는 전이능을 갖게 되는데, 이때, 주변으로 형성된 혈관을 이용하게 된다. 따라서 암 세포의 혈관신생 억제용이라 함은 암의 악성화와 전이를 억제할 수 있도록 암의 국소 부위에 투여하여 암의 악성화를 예방, 개선 또는 치료하는 모든 행위로 볼 수 있다.
상기 약학적 조성물은 암을 갖지 않은 정상보다 (1) PTPRD 유전자의 발현 수준이 낮거나 발현되지 않은 환자; 또는 (2) PTPRD 유전자에 의해 발현되는 단백질의 수준이 낮은 환자에게 투여하기 위해 사용될 수 있고, 상기 환자는 CXCL8 유전자에 의해 발현되는 단백질의 수준이 암을 갖지 않은 정상보다 높은 환자일 수 있다.
상기 ‘유전자의 발현 수준’은 유전자의 mRNA에 특이적으로 결합하는 안티센스 올리고뉴클레오티드, 프라이머 쌍 또는 프로브를 이용하여 측정할 수 있으며, 상기 mRNA의 발현 여부를 측정하는 제제는 상기 유전자에 특이적인 안티센스 올리고뉴클레오티드, 프라이머 쌍, 프로브 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택된다. 즉, 핵산의 검출은 유전자를 암호화하는 핵산 분자 또는 상기 핵산 분자의 상보물에 하이브리드화되는 하나 이상의 올리고뉴클레오타이드 프라이머를 사용하는 증폭반응에 의해 수행될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 예컨대, 프라이머를 이용한 mRNA의 검출은 PCR과 같은 증폭 방법을 사용하여 유전자 서열을 증폭한 다음 당 분야에 공지된 방법으로 증폭 여부를 확인함으로써 수행될 수 있으며, RT-PCR, 경쟁적 RT-PCR, 정량적 RT-PCR, RNase 보호 분석법, 노던 블롯, 또는 DNA 칩에 의해 측정될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 "프로브"는 mRNA외 특이적으로 결합을 이룰 수 있는 짧게는 수 염기 내지 길게는 수백 염기에 해당하는 RNA 또는 DNA 등의 핵산 단편을 의미하며 라벨링되어 있어서 특정 mRNA의 존재 유무, 발현양을 확인할 수 있다. 프로브는 올리고뉴클레오타이드(oligonucleotide) 프로브, 단쇄 DNA(single strand DNA) 프로브, 이중쇄 DNA(double strand DNA) 프로브, RNA 프로브 등의 형태로 제작될 수 있다. 적절한 프로브의 선택 및 혼성화 조건은 당해 기술 분야에 공지된 기술에 따라 적절히 선택할 수 있다.
상기 "프라이머"는 짧은 자유 3-말단 수산화기(free 3' hydroxyl group)를 가지는 핵산 서열로 상보적인 템플레이트(template)와 염기쌍을 형성할 수 있고 템플레이트 가닥 복사를 위한 시작 지점으로서 작용하는 짧은 핵산 서열을 말한다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응을 위한 시약(즉, DNA 폴리머라제 또는 역전사효소) 및 상이한 4 가지의 뉴클레오사이드 트리포스페이트의 존재 하에서 DNA 합성을 개시할 수 있다. PCR 조건, 센스 및 안티센스 프라이머의 길이는 당업계에 공지된 기술에 따라 적절히 선택될 수 있다.
상기 ‘유전자에 의해 발현되는 단백질의 수준’은 상기 단백질에 특이적으로 결합하는 항체, 펩타이드 또는 뉴클레오티드를 이용하여 측정할 수 있다.
상기 항체는 다클론 항체, 단클론 항체, 재조합 항체 및 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 완전한 형태뿐만 아니라 및 항체 분자의 기능적인 단편, 예를 들어, Fab, F(ab'), F(ab')2및 Fv를 모두 포함한다. 항체 생산은 본 발명이 속하는 분야에 널리 공지된 기술을 이용하여 용이하게 제조할 수 있고, 제조되어 상업적으로 판매되는 항체를 이용할 수 있다.
또한, 단백질의 수준은 면역분석법 또는 면역염색법에 의해 측정될 수 있다. 상기 방법은 시료에서 상기 바이오마커 단백질 또는 이의 단편을 검출할 수 있는 마이크로칩 또는 자동화된 마이크로어레이 시스템의 형태로 실시될 수 있다.
상기 면역분석법 또는 면역염색법은 방사능면역분석, 방사능면역침전, 면역침전, ELISA, 캡처-ELISA, 억제 또는 경쟁 분석, 샌드위치 분석, 유세포 분석, 면역형광염색 및 면역친화성 정제를 포함할 수 있다.
상기 단백질 수준은 다중 반응 모니터링(multiple reaction monitoring: MRM), 병행 반응 모니터링(parallel reaction monitoring: PRM), sequential windowed data independent acquisition of the total highresolution(SWATH), 선택 반응 모니터링(selected reaction monitoring: SRM) 또는 면역 다중 반응 모니터링(immuno multiple reaction monitoring: iMRM)을 이용하여 측정될 수도 있다. MRM은 물질의 정확한 단편을 결정하여 이를 질량분석기에서 깬 후, 한 번 깨진 이온 중 특정 이온을 한 번 더 선택하여 연속적으로 연결된 검출기를 이용하여 그 수를 얻는 방법이다.
상기 암은 위암, 간암, 대장암, 폐암, 췌장암, 직장암, 전립선암, 난소암, 신장암, 뇌암, 또는 피부암일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 메트포르민(metformin)은 비구아니드(biguanide) 계열의 당뇨병 치료제로, 간에서 포도당이 생성되는 것을 막고 장에서는 포도당의 흡수를 감소시키며 인슐린에 대한 민감성을 개선하는 효과가 있으며, 상업적으로 판매되는 유효성분이 메트포르민인 모든 제품일 수 있다.
본 발명의 메트포르민은 암 세포 주변의 혈관신생을 억제함으로써 암의 성장, 재발, 및 전이를 억제하는 활성을 나타내며, CXCL8 유전자의 발현을 억제하거나, CXCL8 유전자에 의해 발현되는 단백질의 수준을 감소하고, 암 세포를 사멸시키는 활성을 나타내기 때문에, 메트포르민을 유효성분으로 포함하는 조성물은 암의 예방, 개선 또는 치료를 위해 사용될 수 있을 뿐만 아니라, 암의 악성화, 재발 및 전이를 억제하기 위해 사용될 수 있다.
상기 약학적 조성물은 크림, 젤, 패취, 분무제, 연고제, 경고제, 로션제, 리니멘트제, 파스타제 및 카타플라스마제로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 외용제 형태로 제형화될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 제형화를 위해 추가로 있는 약학적으로 허용가능한 담체 및 희석제를 포함할 수 있다. 상기 약학적으로 허용가능한 담체 및 희석제는 전분, 당, 및 만니톨과 같은 부형제, 칼슘 포스페이트 등과 같은 충전제 및 증량제, 카르복시메틸셀룰로오스, 히드록시프로필셀룰로오스 등과 같은 셀룰로오스 유도체, 젤라틴, 알긴산염, 및 폴리비닐 피롤리돈 등과 같은 결합제, 활석, 스테아린산 칼슘, 수소화 피마자유 및 폴리에틸렌 글리콜과 같은 윤활제, 포비돈, 크로스포비돈과 같은 붕해제, 폴리소르베이트, 세틸알코올, 및 글리세롤 등과 같은 계면활성제를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 상기 약학적으로 허용가능한 담체 및 희석제는 대상체에게 생물학적 및 생리학적으로 친화적인 것일 수 있다. 희석제의 예로는 염수, 수용성 완충액, 용매 및/또는 분산제(dispersion media)를 들 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 약학적 조성물은 목적하는 방법에 따라 경구 투여하거나 비경구 투여(예를 들어, 정맥 내, 피하, 복강 내 또는 국소에 적용)할 수 있으며, 바람직하게는 경구 투여된다. 또한 본 발명의 약학적 조성물의 투여량은 대상체의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율 및 질환의 중증도 등에 따라 그 범위가 다양하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 메트포르민을 유효성분으로 포함하는 암의 예방 및 개선을 위한 건강기능 식품 조성물로서, 상기 메트포르민이 암 세포 주변의 혈관신생을 억제함으로써 암의 성장, 재발, 및 전이를 억제하는 활성을 갖는 것을 특징으로 하는 건강기능 식품 조성물을 제공한다.
본 발명은 통상적으로 이용되는 식품으로써 일반적으로 사용될 수 있다.
본 발명의 식품 조성물은 건강기능식품으로서 사용될 수 있다. 상기 "건강기능 식품"이라 함은 건강기능 식품에 관한 법률에 따른 인체에 유용한 기능성을 가진 원료나 성분을 사용하여 제조 및 가공한 식품을 의미하며, "기능성"이라 함은 인체의 구조 및 기능에 대하여 영양소를 조절하거나 생리학적 작용 등과 같은 보건 용도에 유용한 효과를 얻을 목적으로 섭취하는 것을 의미한다.
본 발명의 식품 조성물은 통상의 식품 첨가물을 포함할 수 있으며, 상기 "식품 첨가물"로서의 적합 여부는 다른 규정이 없는 한, 식품의약품안전처에 승인된 식품 첨가물 공전의 총칙 및 일반시험법 등에 따라 해당 품목에 관한 규격 및 기준에 의하여 판정한다.
상기 "식품 첨가물 공전"에 수재된 품목으로는 예를 들어, 케톤류, 글리신, 구연산칼륨, 니코틴산, 계피산 등의 화학적 합성물, 감색소, 감초추출물, 결정셀룰로오스, 고량색소, 구아검 등의 천연첨가물, L-글루타민산나트륨 제제, 면류첨가알칼리제, 보존료제제, 타르색소제제 등의 혼합제제류들을 들 수 있다.
본 발명의 식품 조성물은 암의 예방 및/또는 개선을 목적으로, 정제, 캡슐, 분말, 과립, 액상, 환 등의 형태로 제조 및 가공할 수 있다.
예를 들어, 캡슐 형태의 건강기능 식품 중 경질캡슐제는 통상의 경질캡슐에 본 발명에 따른 조성물을 부형제 등의 첨가제와 혼합 및 충진하여 제조할 수 있으며, 연질캡슐제는 본 발명에 따른 조성물으 부형제 등의 첨가제와 혼합하고 젤라틴 등 캡슐기제에 충진하여 제조할 수 있다. 상기 연질캡슐제는 필요에 따라 글리세린 또는 소르비톨 등의 가소제, 착색제, 보존제 등을 함유할 수 있다.
상기 부형제, 결합제, 붕해제, 활택제, 교미제, 착향제 등에 대한 용어 정의는 당업계에 공지된 문헌에 기재된 것으로 그 기능 등이 동일 내지 유사한 것들을 포함한다. 상기 식품의 종류에는 특별한 제한이 없으며, 통상적인 의미에서의 건강기능식품을 모두 포함한다.
본 발명에서 용어 “예방”이란 본 발명에 따른 조성물의 투여로 암의 억제 또는 지연시키는 모든 행위를 말한다. 본 발명에서 용어 “치료”는 본 발명에 따른 조성물의 투여로 암의 증세가 호전되거나 이롭게 변경하는 모든 행위를 말한다. 본 발명에서 "개선"이란 본 발명의 조성물을 개체에 투여하거나 섭취시켜 암의 나쁜 상태를 좋게 하는 모든 행위를 의미한다.
또한, 본 발명은 메트포르민 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물로서, 상기 약학적 조성물은 암을 갖지 않은 정상보다 (1) PTPRD 유전자의 발현 수준이 낮거나 발현되지 않은 환자; 또는 (2) PTPRD 유전자에 의해 발현되는 단백질의 수준이 낮은 환자에게 투여하기 위한 것을 특징으로 하는 약학적 조성물을 제공하며, 상기 환자는 CXCL8 유전자에 의해 발현되는 단백질의 수준이 암을 갖지 않은 정상보다 높은 환자일 수 있다.
또한, 본 발명은 암 환자에서 분리된 생물학적 시료에서 PTPRD 유전자에 의해 발현되는 단백질의 수준을 측정하는 제1단계; 및 시험물질을 처리한 후 PTPRD 유전자에 의해 발현되는 단백질의 수준이 시험물질을 처리하지 않은 분리된 생물학적 시료의 PTPRD 유전자에 의해 발현되는 단백질의 수준에 비해 증가하면 혈관신생 억제제로 판단하는 제2단계를 포함하는 암세포에 대한 혈관신생 억제제의 스크리닝 방법을 제공하며, 상기 암 환자에서 분리된 생물학적 시료에서 CXCL8 유전자에 의해 발현되는 단백질의 수준을 측정하는 단계; 및 시험물질을 처리한 후 CXCL8 유전자에 의해 발현되는 단백질의 수준이 시험물질을 처리하지 않은 분리된 생물학적 시료의 CXCL8 유전자에 의해 발현되는 단백질의 수준에 비해 감소하면 혈관신생 억제제로 판단하는 단계;를 추가로 포함할 수 있다.
상기 ‘생물학적 시료’는 유전자 또는 단백질의 발현이 검출될 수 있는 대상 개체로부터 얻어지는 모든 시료를 의미하며, 구체적으로 본 발명의 기술분야에서 통상적으로 사용되는 방법으로 암 환자에서 분리된 조직, 세포, 전혈, 혈청, 혈장, 타액, 객담, 뇌척수액 또는 뇨와 같은 시료일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 암 환자에서 분리된 생물학적 시료로부터 PTPRD 유전자의 mRNA 또는 이의 단백질의 발현 수준을 측정하는 제1단계; 및 상기 mRNA 또는 단백질의 발현 수준이 암을 갖지 않은 정상 대조군보다 높은 수준이면 암의 성장, 재발, 및 전이와 같은 악성화가 진행될 수 있다고 판단하는 제2단계;를 포함하는 암 환자의 예후 예측을 위한 정보 제공 방법을 제공하고, 상기 암 환자에서 분리된 생물학적 시료에서 CXCL8 유전자에 의해 발현되는 단백질의 수준을 측정하여 암을 갖지 않은 정상 대조군보다 높은 수준이면 암의 성장, 재발, 및 전이와 같은 악성화가 진행될 수 있다고 판단하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
상기 PTPRD 유전자는 단백질 티로신 포스파타제 수용체 델타(Protein tyrosine phosphatase receptor delta)를 암호화하는 유전자로서, 두경부 편평 상피 세포 암 (HNSCC), 폐암, 피부 편평 세포 암종, 교모세포종 및 악성 흑색종을 포함하는 다양한 암에서 유전적(돌연변이, 결실 또는 카피수손실) 또는 후성적(메틸화) 변형에 의해 종종 불활성화되는 것으로 보고된 바 있다. 또한, 상기 PTPRD는 E-캐드헤린 및 β-카테닌의 신호전달을 통해 세포-세포 접착에 관련하는 것으로 알려진 바 있다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실험예 및 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실험예 및 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실험예 및 실시예에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실험예 및 실시예는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.
<실험예> 실험 재료 및 방법
하기의 실험예들은 본 발명에 따른 각각의 실시예에 공통적으로 적용되는 실험예를 제공하기 위한 것이다.
1. 환자 및 조직 샘플
본 실험의 샘플들은 2005년 1월부터 2006년 12월까지 아주대병원에서 위 절제술을 받았고, 종양의 병리학적으로 T1b(submucosal invasion) 이상으로 진단받은 위암 환자로부터 수집된 파라핀 삽입 조직을 사용하였다. 임상 데이터는 환자의 의료 기록에서 검색하였다. 수술 전에 화학 치료 또는 방사선 치료를 받은 환자는 제외하였다. 수술 당시 암 전이가 진행된 환자도 제외되었다. 마지막으로 추가 분석을 위해 총 332 명의 환자가 선정되었다. 본 실험에서 환자의 평균 추적 관찰 기간은 72.4개월이다.
병리학 단계는 미국 암 합동 위원회(American Joint Committee on Cancer (AJCC)) 7판을 기준으로 결정하였고, 전체 생존(Overall survival (OS)) 시간은 수술 날짜로부터 사망 날짜 또는 마지막 추적한 시간으로 정의하였고, 질병 없는 생존(Disease-free survival(DFS)) 시간은 수술 날짜 및 첫 재발 또는 사망 사이의 간격으로 정의하였다.
본 실험은 세계 의료 협회(헬싱키 선언)(World Medical Association (Declaration of Helsinki))의 윤리 강령에 따라 수행되었으며, 아주대학교 병원의 기관 검토위원회(Institutional Review Board of the Ajou University Hospital (AJIRB-MBR-KSP-18-510)에 의해 승인되었다.
2. 면역 조직 화학 및 in situ 혼성화
조직 마이크로어레이(Tissue microarray (TMA)) 분석은 각각의 블록에서 2개의 2 mm 코어를 펀칭한 포르말린-고정 파라핀 삽입 조직에 대해 수행하였다. 면역 조직 화학 염색은 BenchMark XT® 자동 면역 염색제(Ventana Medical Systems, Tucson, AZ, USA)를 사용하고, 항 PTPRD 항체(LSBio, Seattle, WA, USA; 1 : 100)로 포르말린-고정 파라핀-고정 조직의 4 μm 두께 구역에서 수행되었다.
종양 부위의 50% 이상에서 PTPRD에 대한 강한 세포질 염색을 나타내는 종양 및 정상적인 위 점막은 PTPRD의 발현 단계를 고(high)로 분류하고, PTPRD에 대한 세포질 염색 정도가 중간 정도를 갖는 종양은 PTPRD의 발현 단계를 중(intermediate)으로 분류하고, PTPRD에 대한 세포질 염색 정도가 낮거나 없는 종양은 PTPRD의 발현 단계를 저(low)로 분류하였다. 모든 면역 조직 화학(immunohistochemistry (IHC)) 슬라이드는 두 명의 숙련된 병리학자(SK 및 DL)에 의해 독립적으로 분석되었다.
Epstein-Barr virus (EBV) RNA는 제조사의 프로토콜에 따라 Ventana Benchmark in situ hybridization system (Ventana Medical Systems)을 사용하여 자동 EBER 염색법에 의해 검출되었다.
3. 세포주
인간 위암 세포주로서, MKN45, MKN74, SNU1, SNU216, SNU668, AGS 및 NCI-N87을 한국 세포주 은행(Korean Cell Line Bank (KCLB))에서 구매했으며, 10% 소 태아 혈청(fetal bovine serum (FBS)), 1% 페니실린 및 스트렙토마이신이 보충된 RPMI 1640(Hyclone, South Lagan, UT, USA)에서 5% CO2, 가습 대기 조건에서 37℃로 배양되었다. 인간 제대 정맥 내피 세포(Human umbilical vein endothelial cells (HUVECs))는 American Type Culture Collection (ATCC)에서 구입하고, 내피세포 배지(endothelial cell medium (ECM; ScienCell Carlsbad, CA, USA))에서 5% CO2 가습 대기 조건에서 37℃로 배양되었다. 모든 세포는 일반적으로 마이코플라즈마 오염에 대해 테스트되었다.
4. 시약 및 항체
본 실험에 사용된 시약 및 항체은 다음과 같다:: U0126(Enzo Life Sciences, Farmingdale, NY, USA; 20 μM); S3I-201(AdooQ, Irvine, CA, USA; 100 μM); 메트포르민(1,1-dimethylbiguanide hydrochloride; Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA; 1-5 mM); PTPRD(1:500; Aviva Systems Biology, San Diego, CA, USA); 포스포-(p), 총 ERK 및 STAT3(티로신 705 및 세린 727), E-캐드헤린, N-캐드헤린, 비멘틴, snail, slug 에 대한 항체(1:500-1000; Cell Signaling Technology, Danvers, MA, USA), 및 GAPDH(1:10,000; Novus Biologicals, Littleton, CO, USA).
5. 렌티바이러스 형질도입(Lentiviral transduction)
본 실험에 PTPRD shRNA(shPTPRD, 사용된 5 개의 상이한 서열의 박테리아 글리세롤 stocks 형태), 비표적 스크램블 shRNA(shNS) 및 pLKO.1-puro는 시그마 알드리치 (Sigma Aldrich)로부터 구입하였다.
293TN 세포에서 렌티바이러스 생산을 위해 각 DNA 샘플 2 μg을 psPAX2(Sigma Aldrich, 1.5 μg), pMD2.G(Sigma Aldrich, 0.5 μg) 및 E-fection(2 μg/μg DNA)으로 공동 처리하였다. 바이러스를 24 시간 및 48 시간에 수확하고, 렌티바이러스 구축물 및 8 μg/mL 폴리브렌(polybrene)(Chemicon, Billerica, MA, USA)을 사용하여 MKN74 세포를 형질 도입한 후, 퓨로마이신(puromycin) 1 μg/mL으로 선택하여 안정한 세포주를 생성하였다. 5 개의 상이한 shRNA 서열에 의한 PTPRD mRNA 녹다운(knockdown)의 효율을 qRT-PCR에 의해 평가하고, shPTPRD #3을 후속 실험을 위해 선택하였다.
6. DNA 형질 감염(DNA transfection)
SNU216 및 AGS 세포를 7 x 105 세포/웰 농도로 6-웰 플레이트에서 24 시간 동안 배양한 후, 제조업체의 지침에 따라 Lipofectamine 3000 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)을 사용하여 shNS 또는 shPTPRD(SIGM)로 형질 감염하였다.
7. siRNA 형질 감염(siRNA transfection)
세포를 5-7 x 105 세포/웰 농도로 6-웰 플레이트에서 24 시간 동안 배양한 후, 제조업체의 지침에 따라 Lipofectamine 3000(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)을 사용하여 CXCL8 또는 PTPRD siRNA(Bioneer, Daejeon, Korea)로 형질 감염하였다.
8. 웨스턴 블롯(Western blotting)
PRO-PREP 단백질 추출 용액(Intron, Seoul, Korea)에 세포를 용해하였다. 단백질을 SDSP(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide) 젤 전기영동으로 분석하고, PVDF 막으로 옮긴 후, 특정 항체로 프로브하였다. 제조사의 지시(Amersham Biosciences, Boston, MA, USA)에 따라, horseradish peroxidase-conjugated 이차 항체와 enhanced chemiluminescence reagents를 이용하여 단백질 수준을 측정하였다.
9. 세포 증식 분석(Cell proliferation assay)
세포 증식은 EZ-Cytox cell viability assay kit(Daeil Lab Service, Seoul, Korea)를 사용하여 측정하였다. 5 x 104 세포를 12-웰 플레이트에 접종하고, 세포를 1 일, 3 일 또는 5 일 동안 배양한 후, 배양 배지 300 μL을 EZ-Cytox 용액 30 μL으로 처리하고, 37℃에서 2 시간 동안 배양하였다. Synergy H1 hybrid multi-mode microplate reader(BioTeK, Winooski, VT, USA)을 이용하여 450 nm에서 흡광도를 측정하였다.
10. 트랜스 웰 이동/침윤 분석(Transwell migration/invasion assay)
8-μm 기공(Corning, Lowell, MA, USA) 및 Matrigel (BD Biosciences, San Diego, CA, USA)을 함유하는 트랜스 웰을 침습 분석에 사용하였다. 배양 배지에서 shNS 또는 shPTPRD으로 형질 감염된 MKN74 및 SNU216 세포 2.5 x 105 세포/웰 농도로 이동시키고, 5 x 105 세포/웰 농도는 침윤 분석을 위해 상부 트랜스 웰 챔버에 씨딩하고, 2 일 동안 배양하였다. 세포를 100% 메탄올로 고정시키고, 헤마톡실린/에오신으로 염색하였다. 필터의 상부 표면에 남아있는 세포를 면봉으로 제거하고, 필터를 커버 슬립에 장착하고 이미지를 100 배 확대하여 촬영하였다. Image J 소프트웨어를 사용하여 각각의 웰의 5 개의 상이한 필드에서 세포를 계수하였다.
11. RT-PCR/qRT-PCR
제조업체의 지침에 따라 TRIzol 시약(Invitrogen)을 사용하여 세포에서 총 RNA를 추출하였다. RNA는 Accu-Power RT PreMix(Bioneer)를 사용하여 역전사되었다. 이어서, 생성된 cDNA 샘플 1 μg/mL을 AccuPower PCR PreMix(Bioneer)를 사용하여 증폭하였다. RT-PCR 생성물을 2% 아가로스 겔에서 분해하고 SYBR® Safe DNA 겔 염색(Invitrogen)으로 염색하였다. cDNA 샘플에 대한 qPCR은 Thermal Cycler Dice Real Time System III(Takara)에서 SYBR Premix Ex Taq (Takara Bio, Shiga, Japan)를 사용하여 수행하였다. 표적 유전자의 상대 mRNA 수준을 β-액틴 mRNA 기준으로 평가하고, 비교 Ct 방법(ΔΔCt)을 사용하여 분석하였다. RT-PCR 및 qRT-PCR에 사용된 프라이머 서열 정보는 하기 표 1과 같다.
유전자 염기서열 (5’-3’) 서열번호
PTPRD F CTG GTT GCT TCA TCG TCA TAG A 1
R GTT CCT CTG GGC TCT CAT TAA A 2
CXCL8 F CCA CCG GAG CAC TCC ATA AG 3
R GAT GGT TCC TTC CGG TGG TT 4
β-actin F GGG TCA GAA GGA TTC CTA TG 5
R GGT CTC AAA CAT GAT CTG GG 6
12. ELISA
각각의 배지를 회수하고, 분석까지 -20℃에서 보관하였다. 배양 배지에서 IL-8(CXCL8 유전자로 발현되는 단백질)의 농도는 제조사의 지시에 따라 ELISA (R&D Systems, Abingdon, UK)로 평가하였다. Synergy H1 hybrid multi-mode microplate reader를 이용하여 450 nm에서 흡광도를 측정하였다.
13. 혈관 형성 분석(Tube formation assay)
게놈 DNA 추출 키트(Qiagen, Valencia, CA, USA)를 이용하여 제조사의 지시에 따라 말초 혈액 백혈구로부터 게놈 DNA를 추출하였다. 게놈 DNA의 바이설파이트 변형(Bisulfite modification)은 EZ DNA 메틸화 키트(ZymoResearch, Irvine, CA, USA)를 사용하여 수행하였다. PTPRD 메틸화 특이적 PCR에 사용된 프라이머 서열은 하기 표 2와 같다.
구분 염기서열 (5’-3’) 서열번호
메틸화 F AGG AGT CGG GAG TCG TTT ATC 7
R CAA AAA TAA AAT CTT CTT TTC CGA A 8
비-메틸화 F AGG AGT TGG GAG TTG TTT ATT 9
R ATT TCA AAA ATA AAA TCT TCT TTT CCA 10
14. TCGA 데이터
위 선암종(TCGA)에서 PTPRD 및 CXCL8 mRNA 발현 수준에 관한 데이터를 cBioPortal(www.cbioportal.org)로 추출하였다.
15. 통계 분석
통계 분석은 SPSS ver.22 (IBM Corp., Armonk, NY, USA)를 사용하여 수행되었다. Spearman의 상관 검정, 카이 제곱 검정, Fisher의 정확한 검정 또는 독립 t-검증(unpaired Student’s t-test)을 적절하게 사용하였다. Kaplan-Meier 방법과 로그 순위 테스트를 사용하여 생존 분석을 수행하였다. 독립 t-검증(unpaired Student’s t-test)에 따라 *는 p<0.05이고, **는 p<0.01이고, ***는 p<0.001로 정의하였다. 0.05 미만의 p 값은 통계적으로 유의한 것으로 간주하고, 모든 p 값은 양방향이다.
실시예 1. 암의 진행 단계 및 전이 단계에 따른 PTPRD 발현 정도 평가
PTPRD 발현 정도가 암의 진행 단계 및 전이 단계에 미치는 영향을 평가하기 위해, 정상 위 점막 샘플과 332 개의 위암 조직에서 PTPRD의 IHC 분석을 진행하였다.
정상 위 점막 조직 및 위암 조직에서 PTPRD의 발현을 세포질 면역 염색으로 평가해본 결과, 도 1에 나타난 바와 같이 정상적인 위 점막에서는 PTPRD에 대한 세포질 염색이 강하게 나타난 반면, 대부분의 위암 조직에서는 PTPRD의 발현 수준이 감소되어 나타났고, 위암 조직에서 PTPRD의 발현 정도를 고(high), 중(intermediate), 저(low) 3 단계로 퍼센트 분류한 결과, 위암 조직의 69%(230건)에서는 PTPRD의 발현 수준이 감소되어 나타났다.
위암의 침윤 단계(T1b, T2, T3, T4) 및 림프절 전이 단계(N0, N1, N2, N3)에 따라 PTPRD의 발현 수준을 분류해본 결과, 도 2에 나타난 바와 같이 침윤 단계와 림프절 전이 단계가 높아질수록 PTPRD의 발현 정도가 감소된 위암 조직의 퍼센트가 증가하였다.
Kaplan-Meier 추적기를 사용하여 PTPRD 발현 수준에 따라 위암 수술 이후 전체 생존 환자수 및 위암 재발 환자수를 측정해본 결과, 도 3에 나타난 바와 같이 PTPRD 발현 수준이 낮을수록 OS 시간이 감소하고, 위암의 재발률이 증가하는 것으로 나타났으며, 상기 결과는 PTPRD의 발현 수준에 따라 위암 환자의 예후를 예측할 수 있다는 것을 입증해 주었다.
또한, 위암 치료 시술 이후에 환자에서 PTPRD의 발현 수준에 따른 위암 국소 부위, 림프절 및 먼 부위에서 위암 재발 패턴을 연구하였고, 도 4에 나타난 바와 같이 PTPRD의 발현 수준이 낮을수록 국소 부위 및 림프절에서 암 재발률이 높은 비율로 나타나는 경향이 있었으며, 복막, 간 및 폐와 같이 먼 부위에서 암 전이가 높게 나타났다. 상기 결과는 PTPRD의 발현 수준이 낮을수록 위암의 재발 가능성이 높으며, 림프절이다 다른 장기로 암이 전이될 경향이 있다는 것을 시사한다.
종합하면, 상기 결과들은 위암의 진행 단계에 따라 PTPRD의 발현 수준이 낮게 나타나는 경향이 있으며, PTPRD의 발현 수준이 낮을수록 암 수술 이후에도 암이 재발하는 경향이 있고, 림프절이나 다른 장기로 암이 전이될 경향이 나타나는 것을 고려해 볼 때, 암에서 PTPRD의 발현 수준이 낮을 수록 암의 악성화가 진행될 수 있고, 암의 치료를 진행하더라도 암이 재발되거나 다른 장기로 전이되는 등의 예후를 예측할 수 있다는 것을 시사한다.
실시예 2. 암 세포주에서 PTPRD 발현 상실에 따른 CXCL8 발현 평가
위암 세포주에서 PTPRD 상실에 따른 분자유전학적 메커니즘의 변화를 확인하기 위해, 위암 세포주인 AGS, KATOIII, SNU1, SNU216, SNU668, GCIY, MKN74에서 PTPRD 단백질이 발현되는 세포주를 선정하였다 (도 5A).
PTPRD 단백질이 발현되는 위암 세포주인 MKN74 및 SNU216를 선정하고, PTPRD 발현을 녹다운 하기 위해서 shRNA를 이용하였다. 비표적 스크램블 shRNA인 shNS를 대조군으로 이용하였으며, PTPRD 유전자의 mRNA에 특이적으로 결합하는 shRNA(shPTPRD)로 PTPRD 유전자 발현을 녹다운하여 위암 세포주 MKN74 및 SNU216에서 PTPRD 유전자의 발현이 감소하고 PTPRD 단백질 수준이 감소되는 것을 확인하였다(도 5B).
PTPRD 발현 상실에 따른 위암 세포의 분자유전학적인 메커니즘을 구체적으로 분석하기 위해서 shNS 또는 shPTPRD로 형질 감염된 MKN74 세포를 Affymetrix microarray를 사용하여 마이크로 어레이 분석을 실행하였다. 438 개의 차별적으로 발현된 유전자(differentially expressed genes)에서 KEGG 경로를 분석하였다. KEGG 경로 분석에서 사이토카인-사이토카인 수용체의 상호작용이 가장 현저하게 변경되었으며, 도 6에 나타난 바와 같이, 10개의 유전자가 사이토카인-사이토카인 수용체의 상호 작용 경로에 관여하였고 그 중 CXCL8이 가장 큰 변화를 나타냈다. CXCL8은 암 성장 및 전이를 촉진하는 혈관 형성 인자로 알려진 바 있으며, 상기 결과는 PTPRD와 CXCL8 연계가 암 전이와 관련될 수 있다는 것을 시사한다.
PTPRD의 발현 수준에 따라 CXCL8 발현이 조절하는지 확인하기 위해, PTPRD가 발현되는 위암 세포주 MKN74, AGS, SNU216에서 shNS 또는 shPTPRD로 형질 도입을 하여 CXCL8 발현 수준을 확인하고, 암 세포로부터 수집된 조건부 배지에 함유된 CXCL8 단백질 함량을 ELISA로 측정하였다. 도 7 및 8에 나타난 바와 같이, shPTPRD로 PTPRD 발현이 상실된 암 세포주에서 CXCL8 발현이 증가하였고, shPTPRD로 PTPRD 발현이 상실된 암 세포주에서 시간이 지남에 따라 CXCL8 단백질 분비가 증가하였다. TCGA 데이터(n=265)를 사용하여 위암 샘플에서 PTPRD mRNA 발현과 CXCL8 mRNA 발현 사이의 유의한 역상관을 확인하였다(도 9).
상기 결과들을 종합하면, 위암 세포에서 PTPRD 발현 상실은 CXCL8 단백질 분비를 증가하는 메커니즘으로 이어진다는 것을 입증한다.
실시예 3. PTPRD 발현이 상실된 암 세포에서 CXCL8 발현 수준에 따른 혈관 신생 평가
PTPRD 발현이 상실된 암 세포에서 CXCL8 발현 수준에 따른 혈관 신생 여부를 평가하기 위해, in vitro에서 혈관 형성 여부를 분석하였다.
HUVECs의 혈관 형성 능력은 보중체-부족 배지에서 크게 손상된 바면, rhCXCL8를 첨가한 결과 혈관 형성 능력이 크게 증가하였으며, CXCL8이 강력한 전혈관 신생 효과를 갖는다는 것이 보고된 바 있다. PTPRD 발현이 상실된 암 세포가 혈관 신생을 유도하는지를 확인하기 위해 shNS 또는 shPTPRD로 형질 감염된 MKN74 및 SNU216 암 세포로부터 수집된 조건부 배지를 보중체-부족 배지에서 배양된 HUVECs에 처리하고 혈관 형성 여부를 확인하였다.
도 10에 나타난 바와 같이, shRNA 형질 감염된 암세포로부터 수집된 조건부 배지는 혈관 형성을 증가시키지 않았고, shPTPRD 형질 감염되어 PTPRD 발현이 상실된 암세포로부터 수집된 조건부 배지는 HUVECs의 혈관 형성 능력을 현저히 증가시켰다. 또한, shPTPRD 형질 감염되어 PTPRD 발현이 상실된 암세포를 siCXCL8로 형질 감염하여 CXCL8 발현을 상실하게 하였을 때, 혈관 형성 능력이 현저히 감소하였다.
상기 결과는 위암 세포에서 PTPRD 발현 상실로 유도되는 CXCL8 단백질 분비 증가가 암 세포 주변의 혈관신생을 유도한다는 것을 입증한다.
실시예 4. PTPRD 발현이 상실된 암 세포에서 CXCL8 발현 증가의 메커니즘 확인
암 세포에서 PTPRD 발현 상실에 따라 CXCL8 발현 증가 메커니즘을 연구하기 위해서 ERK 및 STAT3의 발현 및 활성을 평가하였다. STAT3은 PTPRD의 직접적 기질이며, STAT3과 ERK가 CXCL8을 조절한다고 보고된 바 있다.
PTPRD의 손실에 의해 유도된 CXCL8 발현이 STAT3 또는 ERK에 의해 매개되는지 여부를 확인하기 위해, 웨스턴 블롯을 이용하여 PTPRD 발현이 상실된 암세포에서 STAT3의 활성형인 p-STAT3과 ERK의 활성형인 p-ERK의 발현 수준을 측정하였다. 도 11에 나타난 바와 같이, PTPRD 발현 상실은 ERK 및 STAT3의 인산화를 증가시켰다.
도 12에 나타난 바와 같이, PTPRD 발현 상실에 따라 증가된 CXCL8 발현은 ERK 억제제인 U0126와 STAT3 억제제인 S31-201를 처리함에 따라 감소되는 경향으로 나타났으며, CXCL8 단백질의 분비 수준도 현저히 감소하였다. 또한, 도 13에 나타난 바와 같이, PTPRD 발현이 상실된 암 세포주에 ERK 억제제인 U0126와 STAT3 억제제인 S31-201를 처리함에 따라 증가된 혈관 형성능이 현저하게 감소하였다.
상기 결과들은 암 세포주에서 PTPRD 발현 상실이 ERK 및 STAT3의 인산화를 증가시키고, ERK 및 STAT3에 의해 CXCL8의 발현이 증가하여 암세포 주변의 혈관 형성을 유도한다는 것을 입증한다.
실시예 5. PTPRD 발현이 상실된 암 세포에서 메트포르민 처리에 따른 혈관 형성에 미치는 영향
암 세포에서 메트포르민이 암 세포의 혈관신생에 미치는 영향을 확인하기 위해, PTPRD 발현이 상실된 암 세포에 메트포르민을 처리하고 혈관신생에 관련된 메커니즘의 변화를 확인하였다.
도 14 및 15에 나타난 바와 같이, PTPRD 발현이 상실된 암세포에서 메트포르민의 처리 농도에 따라 STAT3 및 ERK의 인산화가 감소되는 것으로 나타났으며, CXCL8 유전자의 발현 및 CXCL8 단백질 수준이 감소하는 것으로 나타났다.
도 16에 나타난 바와 같이, PTPRD 발현이 상실된 암세포에 메트포르민을 처리한 결과, 암세포의 조건부 배지가 HUVECs의 혈관 형성 능력을 향상시키지 못하는 것으로 확인되었으며, 이러한 결과는 암 세포에 메트포르민을 처리하면, 암 세포 주변의 혈관 형성 유도를 억제하는 효과가 있다는 것을 입증한다.
또한, 도 17에 나타난 바와 같이, 암 세포에 메트포르민을 처리한 결과 세포 생존율을 감소하였으며, 메트포르민이 암 세포를 사멸시키는 효과가 있다는 것을 확인하였다.
상기 결과들을 종합하면, 메트포르민은 PTPRD 발현이 상실로 유도되는 혈관형성능을 억제하는 효과가 있으며, 메트포르민이 암 세포 주변의 혈관형성을 억제하기 때문에 암의 성장, 재발 및 전이와 같은 암의 악성화를 예방 또는 치료하는 효과가 있다는 것을 입증한다.
실시예 6. PTPRD 발현이 상실된 암 세포에서 메트포르민 처리에 따른 PTPRD 발현에 미치는 영향
PTPRD 발현이 상실된 암 세포에 메트포르민을 처리하고 PTPRD 발현 및 PTPRD 단백질의 수준을 측정하였다. 도 18에 나타난 바와 같이, shPTPRD로 PTPRD 발현이 상실된 암 세포에 메트포르민을 처리한 결과 PTPRD 발현 및 PTPRD 단백질이 증가하는 것으로 확인되었다.
상기 결과는 메트포르민은 PTPRD 발현이 감소된 암 세포의 PTPRD의 발현을 증가시켜 혈관신생을 억제하기 때문에 암 세포의 성장, 재발, 및 전이와 같은 악성화를 억제함으로, 메트포르민을 유효성분으로 포함하는 조성물이 혈관신생 억제제로서 암의 예방 또는 치료에 활용될 수 있음을 시사한다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 즉, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다.
<110> Ajou University <120> Pharmaceutical compositions for angiogenesis inhibition comprising metformin as an active ingredient <130> ADP-2020-0029 <160> 10 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PTPRD_f <400> 1 ctggttgctt catcgtcata ga 22 <210> 2 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PTPRD_r <400> 2 gttcctctgg gctctcatta aa 22 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CXCL8_f <400> 3 ccaccggagc actccataag 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CXCL8_r <400> 4 gatggttcct tccggtggtt 20 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> actin_f <400> 5 gggtcagaag gattcctatg 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> actin_r <400> 6 ggtctcaaac atgatctggg 20 <210> 7 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> methyl_f <400> 7 aggagtcggg agtcgtttat c 21 <210> 8 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> methyl_r <400> 8 caaaaataaa atcttctttt ccgaa 25 <210> 9 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> unmethyl_f <400> 9 aggagttggg agttgtttat t 21 <210> 10 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> unmethyl_r <400> 10 atttcaaaaa taaaatcttc ttttcca 27

Claims (14)

  1. 메트포르민 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 혈관신생 억제용 약학적 조성물로서,
    상기 약학적 조성물은 정상보다 (1) PTPRD 유전자의 발현 수준이 낮거나 발현되지 않은 환자; 또는 (2) PTPRD 유전자에 의해 발현되는 단백질의 수준이 낮은 환자에게 투여하기 위한 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  2. 삭제
  3. 제1항에 있어서, 상기 환자는 CXCL8 유전자에 의해 발현되는 단백질의 수준이 암을 갖지 않은 정상보다 높은 환자인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  4. 제1항에 있어서, 상기 암은 위암, 간암, 대장암, 폐암, 췌장암, 직장암, 전립선암, 난소암, 신장암, 뇌암, 또는 피부암인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  5. 제1항에 있어서, 상기 메트포르민이 암 세포 주변의 혈관신생을 억제함으로써 암의 성장, 재발, 및 전이를 억제하는 활성을 갖는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  6. 제1항에 있어서, 상기 메트포르민은 CXCL8 유전자의 발현을 억제하거나, CXCL8 유전자에 의해 발현되는 단백질의 수준을 감소하는 활성을 갖는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  7. 제1항에 있어서, 상기 메트포르민은 암 세포를 사멸시키는 활성을 갖는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  8. 메트포르민을 유효성분으로 포함하는 암의 예방 및 개선을 위한 건강기능 식품 조성물로서, 상기 메트포르민이 암 세포 주변의 혈관신생을 억제함으로써 암의 성장, 재발, 및 전이를 억제하는 활성을 갖는 것을 특징으로 하는 건강기능 식품 조성물로서,
    상기 건강기능 식품 조성물은 암을 갖지 않은 정상보다 (1) PTPRD 유전자의 발현 수준이 낮거나 발현되지 않은 환자; 또는 (2) PTPRD 유전자에 의해 발현되는 단백질의 수준이 낮은 환자에게 투여하기 위한 것을 특징으로 하는 건강기능 식품 조성물.
  9. 메트포르민 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물로서,상기 약학적 조성물은 암을 갖지 않은 정상보다 (1) PTPRD 유전자의 발현 수준이 낮거나 발현되지 않은 환자; 또는 (2) PTPRD 유전자에 의해 발현되는 단백질의 수준이 낮은 환자에게 투여하기 위한 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  10. 제9항에 있어서, 상기 환자는 CXCL8 유전자에 의해 발현되는 단백질의 수준이 암을 갖지 않은 정상보다 높은 환자인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  11. 암 환자에서 분리된 생물학적 시료에서 PTPRD 유전자에 의해 발현되는 단백질의 수준을 측정하는 제1단계; 및시험물질을 처리한 후 PTPRD 유전자에 의해 발현되는 단백질의 수준이 시험물질을 처리하지 않은 분리된 생물학적 시료의 PTPRD 유전자에 의해 발현되는 단백질의 수준에 비해 증가하면 혈관신생 억제제로 판단하는 제2단계를 포함하는 암세포에 대한 혈관신생 억제제의 스크리닝 방법.
  12. 제11항에 있어서, 상기 암 환자에서 분리된 생물학적 시료에서 CXCL8 유전자에 의해 발현되는 단백질의 수준을 측정하는 단계; 및시험물질을 처리한 후 CXCL8 유전자에 의해 발현되는 단백질의 수준이 시험물질을 처리하지 않은 분리된 생물학적 시료의 CXCL8 유전자에 의해 발현되는 단백질의 수준에 비해 감소하면 혈관신생 억제제로 판단하는 단계;를 추가로 포함하는 암세포에 대한 혈관신생 억제제의 스크리닝 방법.
  13. 암 환자에서 분리된 생물학적 시료로부터 PTPRD 유전자의 mRNA 또는 이의 단백질의 발현 수준을 측정하는 제1단계; 및 상기 mRNA 또는 단백질의 발현 수준이 암을 갖지 않은 정상 대조군보다 낮은 수준이면 암의 성장, 재발, 및 전이와 같은 악성화가 진행될 수 있다고 판단하는 제2단계;를 포함하는 암 환자의 예후 예측을 위한 정보 제공 방법.
  14. 제13항에 있어서, 상기 암 환자에서 분리된 생물학적 시료에서 CXCL8 유전자에 의해 발현되는 단백질의 수준을 측정하여 암을 갖지 않은 정상 대조군보다 높은 수준이면 암의 성장, 재발, 및 전이와 같은 악성화가 진행될 수 있다고 판단하는 단계를 추가로 포함하는 암 환자의 예후 예측을 위한 정보 제공 방법.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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