KR20200006405A - 신규한 화합물, 이의 제조방법 및 이의 용도 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 신규한 화합물, 이의 제조방법 및 이의 용도에 관한 것이다.
Description
본 발명은 신규한 화합물, 이의 제조방법 및 이의 용도에 관한 것보다 상세하게는 멜라닌 생성 억제제로 사용될 수 있는 신규한 화합물, 이의 제조방법 및 이의 용도에 관한 것이다.
피부색 형성 과정인 멜라닌 생성은 각질 세포와 멜라닌 세포 내에 있는 복잡한 분자 조절 네트워크에 의해 조절되어 피부와 모발의 착색을 유발한다. 멜라닌 소체(melanosome)에서의 멜라닌 생합성은 구리-함유 금속 효소 티로시나제에 의해 조절된다. 티로시나제의 존재 하에서 티로신은 일련의 생화학 반응을 통해 멜라닌으로 전환된다. L-티로신 및 L-3,4-디히드록시페닐알라닌(L-DOPA)은 멜라닌 생합성에 관여하는 중요한 기질이다. 주위의 각질형성세포(keratinocyte) 내에서 멜라닌의 존재는 인간 피부색을 결정 짓는 중요한 요소이다.
자외선 노출, α-멜라닌세포-자극 호르몬, 멜라노코르틴 1 수용체 및 아구티-관련 단백질은 멜라닌 생성과 관련된 여러 요인들 중 하나이다. 멜라닌 생성은 세포 위험요소에 해당하며, 안료를 합성하고, 이를 이숙주 세포(recipient cell)에게로 전달하는, 멜라닌 세포 내에 있는 특수 멜라닌 소체에 국한된다. 멜라닌 세포의 비정상적인 증식은 피부암의 일종인 흑색종을 유발한다. 기미 및 염증 후 장애는 치료가 요구되는 과색소침착 장애의 예이다.
또한, 증가된 티로시나제 활성은 도파민 산화에 의해 O-퀴논이 형성될 수 있으며, 이로 인해 신경손상 및 세포사멸이 일어나 신경 퇴행성 질환이 야기될 수 있다. 현재 개발된 과색소침착 장애에 사용되는 약제는 많은 부작용이 있는 것으로 알려져 있다. 따라서, 부작용이 감소된 새로운 멜라닌 생성 억제제의 개발이 필요한 실정이다.
본 발명이 해결하고자 하는 과제는 멜라닌 색소를 저감시킬 수 있는 신규한 화합물 및 이의 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명이 해결하고자 하는 다른 과제는 상기 멜라닌 색소를 저감시킬 수 있는 신규한 화합물의 용도를 제공하는 것이다.
상기한 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 화합물을 제공한다:
[화학식 1]
식 중에서,
R1, R2, R3, R4 및 R5는 서로 동일하거나 또는 상이하고, 각각 독립적으로 수소, 직쇄형 또는 분지형 C1 - 6알킬, 직쇄형 또는 분지형 C1 - 6알콕시, 할로, 트리할로C1-3알킬 및 히드록시 중에서 선택되고,
R6, R7, R8, R9 및 R10은 서로 동일하거나 또는 상이하고, 각각 독립적으로 수소, 히드록시 및 할로 중에서 선택되고,
n은 0 또는 1이다.
본 발명에 의하면, 상기 할로는 플루오로, 클로로, 브로모 및 아이오도로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있다.
본 발명에 의하면, 바람직한 화학식 1의 화합물은 R1, R3 및 R4는 수소이고, R2 및 R5는 각각 독립적으로 직쇄형 또는 분지형 C1 - 6알킬인, 화합물일 수 있다.
본 발명에 의하면, 보다 바람직한 화학식 1의 화합물은 R1, R3 및 R4는 수소이고, R2는 메틸이고, R5는 이소프로필인, 화합물일 수 있다.
본 발명에 의하면, 화학식 1로 표시되는 화합물은,
2-[2-메틸-5-(프로판-2-일)아닐리노]-2-옥소에틸 3-히드록시벤조 에이트;
2-[2-메틸-5-(프로판-2-일)아닐리노]-2-옥소에틸 4-히드록시벤조 에이트;
2-[2-메틸-5-(프로판-2-일)아닐리노]-2-옥소에틸 2,4-디히드록시벤조에이트;
2-[2-메틸-5-(프로판-2-일)아닐리노]-2-옥소에틸 3,4-디히드록시벤조에이트;
2-[2-메틸-5-(프로판-2-일)아닐리노]-2-옥소에틸 3,5-디히드록시벤조에이트;
2-[2-메틸-5-(프로판-2-일)아닐리노]-2-옥소에틸 (2E)-3-페닐프로프-2-에노에이트;
2-[2-메틸-5-(프로판-2-일)아닐리노]-2-옥소에틸 (2E)-3-(2-히드록시페닐)프로프-2-에노에이트;
2-[2-메틸-5-(프로판-2-일)아닐리노]-2-옥소에틸 (2E)-3-(4-히드록시페닐)프로프-2-에노에이트;
2-[2-메틸-5-(프로판-2-일)아닐리노]-2-옥소에틸 (2E)-3-(2,4-히디드록시페닐)프로프-2-에노에이트; 및
2-[2-메틸-5-(프로판-2-일)아닐리노]-2-옥소에틸 (2E)-3-(4-클로로페닐)프로프-2-에노에이트;으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있다.
또한, 본 발명은 하기 화학식 2로 표시되는 화합물을 하기 화학식 3으로 표시되는 화합물과 반응시키는 단계를 포함하는 상기 화학식 1로 표시되는 화합물의 제조방법을 제공한다:
[화학식 2]
[화학식 3]
식 중에서, n, R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7, R8, R9 및 R10은 앞에서 정의한 바와 같다.
본 발명에 의하면, 상기 반응은 염기 및 요오드화칼륨 존재 하의 유기용매 내에서 수행되는 것일 수 있다.
본 발명에 의하면, 상기 화학식 2로 표시되는 화합물은 하기 화학식 4의 화합물을 2-클로로아세틸 클로라이드와 반응시켜 제조된 것일 수 있다.
[화학식 4]
또한, 본 발명은 상기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 티로시나제 과다 발현 또는 멜라닌 과다 생성과 관련된 질환의 치료 또는 예방용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명에 의하면, 티로시나제 과다 발현 또는 멜라닌 과다 생성과 관련된 질환은 피부암, 흑색종, 과색소성 질환, 피부착색, 주근깨, 모반, 이소성몽고반점, 커피반점 및 기미로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 피부 미백용 화장료 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 멜라닌성 색소 집락 감소용 조성물을 제공한다.
본 발명에 따른 화합물은 세포독성이 낮으며, 멜라닌 생성 저해 또는 기 생성된 멜라닌 색소 감소에 효과적이므로 멜라닌 생성과 관련된 질환, 예를 들어 피부암, 흑색종, 과색소 침착, 과색소성 질환, 주근깨 또는 기미와 같은 질환의 치료 또는 예방에 효과적으로 작용할 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 화합물은 세포 독성이 없거나 매우 낮아 피부 자극이 없으며, 멜라닌 생성을 효과적으로 저해할 수 있으므로 피부 미백용 화장료 조성물로 유용하다.
도 1은 화합물 3의 존재 하에서의 티로시나제 저해 활성에 대한 Lineweaver-Burk 플롯이다. 도 1A에서 화합물 3의 농도는 0, 3.125, 6.25 및 12.5μM이었고, 기질 L-DOPA의 농도는 0.125, 0.25, 0.5, 1 및 2 mM이다. 도 1B는 기울기의 플롯이다. 선형 최소 자승법을 사용하여 선을 그렸다.
도 2는 화합물 6의 존재 하에서의 티로시나제 저해 활성에 대한 Lineweaver-Burk 플롯이다. 도 2A에서 화합물 3의 농도는 0, 0.3915 및 0.783 μM이었고, 기질 L-DOPA의 농도는 0.125, 0.25, 0.5, 1 및 2 mM이다. 도 2B는 기울기의 플롯이다. 도 2C는 수직 절편 대 화합물 6의 농도를 측정하여 저해 상수를 결정하였다. 선형 최소 자승법을 사용하여 선을 그렸다.
도 3은 화합물 7의 존재 하에서의 티로시나제 저해 활성에 대한 Lineweaver-Burk 플롯이다. 도 3A에서 화합물 3의 농도는 0, 0.453, 0.965, 1.813 및 3.626 μM이었고, 기질 L-DOPA의 농도는 0.125, 0.25, 0.5, 1 및 2 mM이다. 도 3B는 기울기의 플롯이다. 도 3C는 수직 절편 대 화합물 6의 농도를 측정하여 저해 상수를 결정하였다. 선형 최소 자승법을 사용하여 선을 그렸다.
도 4는 화합물 9의 존재 하에서의 티로시나제 저해 활성에 대한 Lineweaver-Burk 플롯이다. 도 3A에서 화합물 3의 농도는 0, 0.08, 0.16 및 0.32 μM이었고, 기질 L-DOPA의 농도는 0.125, 0.25, 0.5, 1 및 2 mM이다. 도 4B는 기울기의 플롯이다. 선형 최소 자승법을 사용하여 선을 그렸다.
도 5는 상이한 농도의 화합물 9에 대하여, L-DOPA의 촉매 활성에 대한 버섯 티로시나제의 다양한 투여량의 효과를 나타낸 그래프이다.
도 6은 제브라피쉬의 색소 침착에 대한 화합물 9의 저해 효과를 확인한 것이다. 태아를 5, 10, 20 및 50 μM의 화합물 9 및 코직산으로 처리하였다. A는 제브라피쉬의 색소 침착을 육안으로 확인한 것이며, B는 색소 제거능을 그래프로 나타낸 것이다.
도 7은 멜라닌 함량에 따른 화합물 9및 코직산의 저해효과를 나타낸 것이다.
도 8은 제브라피쉬 배아(48 hpf)를 다양한 농도의 화합물 9로 처리한 뒤, 아크리딘 오렌지로 염색하여 정상발달 여부를 확인한 결과이다.
도 9는 분자 도킹 착물의 비교결합에너지 값을 나타낸 그래프이다.
도 2는 화합물 6의 존재 하에서의 티로시나제 저해 활성에 대한 Lineweaver-Burk 플롯이다. 도 2A에서 화합물 3의 농도는 0, 0.3915 및 0.783 μM이었고, 기질 L-DOPA의 농도는 0.125, 0.25, 0.5, 1 및 2 mM이다. 도 2B는 기울기의 플롯이다. 도 2C는 수직 절편 대 화합물 6의 농도를 측정하여 저해 상수를 결정하였다. 선형 최소 자승법을 사용하여 선을 그렸다.
도 3은 화합물 7의 존재 하에서의 티로시나제 저해 활성에 대한 Lineweaver-Burk 플롯이다. 도 3A에서 화합물 3의 농도는 0, 0.453, 0.965, 1.813 및 3.626 μM이었고, 기질 L-DOPA의 농도는 0.125, 0.25, 0.5, 1 및 2 mM이다. 도 3B는 기울기의 플롯이다. 도 3C는 수직 절편 대 화합물 6의 농도를 측정하여 저해 상수를 결정하였다. 선형 최소 자승법을 사용하여 선을 그렸다.
도 4는 화합물 9의 존재 하에서의 티로시나제 저해 활성에 대한 Lineweaver-Burk 플롯이다. 도 3A에서 화합물 3의 농도는 0, 0.08, 0.16 및 0.32 μM이었고, 기질 L-DOPA의 농도는 0.125, 0.25, 0.5, 1 및 2 mM이다. 도 4B는 기울기의 플롯이다. 선형 최소 자승법을 사용하여 선을 그렸다.
도 5는 상이한 농도의 화합물 9에 대하여, L-DOPA의 촉매 활성에 대한 버섯 티로시나제의 다양한 투여량의 효과를 나타낸 그래프이다.
도 6은 제브라피쉬의 색소 침착에 대한 화합물 9의 저해 효과를 확인한 것이다. 태아를 5, 10, 20 및 50 μM의 화합물 9 및 코직산으로 처리하였다. A는 제브라피쉬의 색소 침착을 육안으로 확인한 것이며, B는 색소 제거능을 그래프로 나타낸 것이다.
도 7은 멜라닌 함량에 따른 화합물 9및 코직산의 저해효과를 나타낸 것이다.
도 8은 제브라피쉬 배아(48 hpf)를 다양한 농도의 화합물 9로 처리한 뒤, 아크리딘 오렌지로 염색하여 정상발달 여부를 확인한 결과이다.
도 9는 분자 도킹 착물의 비교결합에너지 값을 나타낸 그래프이다.
이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.
본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 화합물을 제공한다:
[화학식 1]
식 중에서,
R1, R2, R3, R4 및 R5는 서로 동일하거나 또는 상이하고, 각각 독립적으로 수소, 직쇄형 또는 분지형 C1 - 6알킬, 직쇄형 또는 분지형 C1 - 6알콕시, 할로, 트리할로C1-3알킬 및 히드록시 중에서 선택되고,
R6, R7, R8, R9 및 R10은 서로 동일하거나 또는 상이하고, 각각 독립적으로 수소, 히드록시 및 할로 중에서 선택되고,
n은 0 또는 1이다.
본 발명에 의하면, 상기 할로는 플루오로, 클로로, 브로모 및 아이오도로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있다.
본 발명에 의하면, n이 0이면 R6, R7, R8, R9 및 R10은 중 적어도 하나는 H가 아닐 수 있다.
본 발명에 의하면, 상기 직쇄형 또는 분지형 C1 - 6알킬은 메틸, 에틸, 프로필, 이소프로필, 부틸, 이소부틸, t-부틸, 펜틸 및 헥실 중에서 선택될 수 있다.
본 발명에 의하면, 상기 직쇄형 또는 분지형 C1 - 6알콕시는 메톡시, 에톡시, 프로폭시, 부틸옥시 펜틸옥시 및 헥실옥시 중에서 선택될 수 있다.
본 발명에 의하면, 상기 트리할로C1 - 3알킬은 트리플루오로메틸 또는 트리플루오로에틸일 수 있다.
본 발명에 의하면, 바람직한 화학식 1의 화합물은 R1, R3 및 R4는 수소이고, R2 및 R5는 각각 독립적으로 직쇄형 또는 분지형 C1 - 6알킬인, 화합물일 수 있고, 보다 바람직한 화학식 1의 화합물은 R1, R3 및 R4는 수소이고, R2는 메틸이고, R5는 이소프로필인, 화합물일 수 있다.
본 발명에 의하면, 특히, 바람직한 화학식 1의 화합물은 R1, R3 및 R4는 수소이고, R2는 메틸이고, R5는 이소프로필이며, R6, R7, R8, R9 및 R10 중에서 적어도 하나, 바람직하게는 두 개의 치환기가 히드록시인 화합물일 수 있다.
본 발명에 의하면, 화학식 1로 표시되는 화합물은,
2-[2-메틸-5-(프로판-2-일)아닐리노]-2-옥소에틸 3-히드록시벤조 에이트;
2-[2-메틸-5-(프로판-2-일)아닐리노]-2-옥소에틸 4-히드록시벤조 에이트;
2-[2-메틸-5-(프로판-2-일)아닐리노]-2-옥소에틸 2,4-디히드록시벤조에이트;
2-[2-메틸-5-(프로판-2-일)아닐리노]-2-옥소에틸 3,4-디히드록시벤조에이트;
2-[2-메틸-5-(프로판-2-일)아닐리노]-2-옥소에틸 3,5-디히드록시벤조에이트;
2-[2-메틸-5-(프로판-2-일)아닐리노]-2-옥소에틸 (2E)-3-페닐프로프-2-에노에이트;
2-[2-메틸-5-(프로판-2-일)아닐리노]-2-옥소에틸 (2E)-3-(2-히드록시페닐)프로프-2-에노에이트;
2-[2-메틸-5-(프로판-2-일)아닐리노]-2-옥소에틸 (2E)-3-(4-히드록시페닐)프로프-2-에노에이트;
2-[2-메틸-5-(프로판-2-일)아닐리노]-2-옥소에틸 (2E)-3-(2,4-히디드록시페닐)프로프-2-에노에이트; 및
2-[2-메틸-5-(프로판-2-일)아닐리노]-2-옥소에틸 (2E)-3-(4-클로로페닐)프로프-2-에노에이트;으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있다.
또한, 본 발명은 하기 화학식 2로 표시되는 화합물을 하기 화학식 3으로 표시되는 화합물과 반응시키는 단계를 포함하는 상기 화학식 1로 표시되는 화합물의 제조방법을 제공한다:
[화학식 2]
[화학식 3]
식 중에서, n, R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7, R8, R9 및 R10은 앞에서 정의한 바와 같다.
본 발명에 의하면, 상기 반응은 염기 및 요오드화칼륨 존재 하의 유기용매 내에서 수행되는 것일 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 유기용매는 탄소수 1 내지 4의 저가알콜, 아세톤, 테트라히드로퓨란, N,N-디메틸포름아미드, 디메틸설폭사이드, 톨루엔, 다이옥산, 아세토니트릴 및 메틸렌클로라이드 중에서 선택되는 것일 수 있으며, 바람직하게는 N,N-디메틸포름아미드일 수 있다.
상기 조건에서 수행되는 경우, 부산물의 함량이 낮고, 반응성이 우수하므로 바람직하다.
본 발명에 의하면, 상기 염기는 트리에틸아민일 수 있다.
본 발명에 의하면, 상기 화학식 2로 표시되는 화합물은 하기 화학식 4의 화합물을 2-클로로아세틸 클로라이드와 반응시켜 제조된 것일 수 있다.
[화학식 4]
본 발명에 의하면, 상기 반응은 염기 존재하의 유기용매에서 수행될 수 있으며, 바람직하게는 -5 내지 10 ℃ 및 무수 디클로로메탄 내에서 수행되는 것일 수 있다. 상기 조건에서 수행되는 경우, 부산물의 함량이 낮고, 반응성이 우수하므로 바람직하다.
또한, 본 발명은 상기 화학식 1로 표시되는 화합물은 티로시나제 과다 발현을 억제하고, 멜라닌 생성을 저해할 수 있다. 따라서, 본 발명에 따른 상기 화학식 1로 표시되는 화합물 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분은 티로시나제 과다 발현 또는 멜라닌 과다 생성과 관련된 질환의 치료 또는 예방용 약학적 조성물로 이용될 수 있다.
본 발명에 의하면, 티로시나제 과다 발현 또는 멜라닌 과다 생성과 관련된 질환은 피부암, 흑색종, 과색소성 질환, 피부착색, 주근깨, 모반, 이소성몽고반점, 커피반점 및 기미로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 피부 미백용 화장료 조성물을 제공한다. 본 발명에 따른 화학식 1로 표시되는 화합물은 멜라닌 생성을 저해하거나, 기생성된 멜라닌 색소를 감소시킬 수 있으므로, 피부 미백용 화장료 조성물로서 적합하다.
또한, 본 발명은 상기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 멜라닌성 색소 집락 감소용 조성물을 제공한다.
이하, 바람직한 실시예를 들어 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이에 의하여 제한되지 않는다는 것은 당업계의 통상의 지식을 가진자에게 자명할 것이다.
실시예
시약
2-아미노-p-시멘, 버섯 티로시나아제, L-DOPA 및 기타 필요한 시약은 시그마 알드리치(St Louis, MO, USA)로부터 구입하였다. 융점은 Digimelt MPA 160 융점 장치를 사용하여 측정하였으며, 교정하지 않았다. FTIR 스펙트럼은 Shimadzu FTIR-8400S 분광기 (Kyoto, Japan; υ, cm-1)를 사용하였다. 1H NMR 및 13C NMR 스펙트럼 (DMSO-d)은 Bruker 400 MHz 분광계(Bruker Biospin, Switzerland)를 사용하여 기록하였다. 화학적 이동(δ)은 내부 표준 테트라메틸실란으로부터 백만 분의 일(ppm)다운필드로 기록하였다. 화합물의 순도는 이동상으로 n-헥산 및 에틸아세테이트를 사용하여, 실리카겔 플레이트 상의 박층 크로마토그래피(TLC)로 확인하였다.
후보 화합물의
모델링
단백질 구조 검색
버섯 티로시나제(Agaricus bisporus)의 3차원 결정구조는 단백질 데이터 뱅크(http://www.rcsb.org)에서 검색하였다. 표적 단백질의 에너지 최소화는 UCSF Chimera 1.10.1에서 공액 구배 알고리즘 및 AMBER 힘 장을 사용하여 수행하였다. 입체화학적 특성과 라마찬드란 그래프 및 버섯 티로시나제의 값은 Molprobity 서버로 평가하였으며, 소수성 그래프는 Discovery Studio 4.1 클라이언트로 생성하였다. 나선, 베타 시트, 코일 및 턴의 단백질 구조 및 통계 백분율 값은 VADAR 1.8을 사용하였다. 단백질 구조를 바탕으로 아미드 유도체를 모델링한 뒤, 합성하였다. 합성된 아미드 유도체는 ACD/ChemSketch로 그렸다. 설계된 리간드는 UCSF Chimera 1.10.1으로 최적화하였다. 디자인된 화합물의 생화학적 특성은 Molinspiration (http://www.molinspiration.com/) 및 Molsoft (http://www.molsoft.com/)와 같은 다양한 계산 도구를 이용하여 예측하였다.
분자 도킹
다양한 PyRx 도구를 사용하여 버섯 티로시나제에 대한 디자인된 화합물에 대한 분자 도킹 실험을 수행하였다. 도킹 연구에서 표적 단백질의 활성 영역 내의 배위자의 바람직한 배향을 결정하였다. 도킹 실험을 실행하기 위해 격자 상자 매개 변수 차원 값은 X = 61.0781, Y = 56.3001 및 Z = 63.1015로 조정하고, 가운데 값은 각각 X = -2.9272, Y = 22.0164 및 Z = -32.4883으로 고정하였다. 기본 소모성 값은 단백질-화합물 도킹 복합체의 가장 우수한 결합 고착 자세를 얻기 위해 8로 설정하였다. 모든 화합물을 버섯 티로시나아제의 결정 구조에 대해 개별적으로 도킹시켰다. 도킹된 복합체는 Discovery Studio(4.1) 및 UCSF Chimera 1.10.1을 사용하여 최저 결합 에너지(Kcal/mol) 값과 수소 및 소수성 결합 분석에 대해 추가 평가하였다. 모든 화합물의 2D 그래픽 묘사는 LIGPLOT.43로 수행하였으며, 이를 하기 도 9에 나타내었다.
분자 역학 시뮬레이션
체외 분석, 도킹에너지 및 입체적 자세 분석을 바탕으로, 분자 역학 시뮬레이션을 위해 4종 우수한 복합체(화합물-티로시나제)를 선정하였다. 수용체와 리간드 토폴로지 파일은 각각 GROMOS 53A6 힘 장 및 온라인 PRODRG 서버를 사용하여 작성하였다. 수용체-리간드 복합체를 용매화하고, 9Å 거리에서 조정된 입방 상자 중앙에 놓았다. 시스템의 전하를 중화하기 위해 이온을 추가하였다. 에너지 최소화(nsteps =50,000)는 최급강하법(steepest descent method) (1,000 ps)에 의해 수행되었다. 에너지 계산은 Particle Mesh Ewald 방법으로 수행되었으며, 공유 결합 제한은 선형 구속 해결 알고리즘으로 계산하였다. 분자 역학 실행은 각 단백질-리간드 복합체에 대해 nsteps=750,000으로 15,000 ps로 설정하였으며, 궤도 파일 분석은 Xmgrace 도구(http://plasma-gate.weizmann.ac.il/Grace/)로 수행하였다.
| 화합물번호 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 |
| MW | 327 | 327 | 343 | 343 | 343 | 337 | 353 | 353 | 369 | 371 |
| HBA | 4 | 4 | 5 | 5 | 5 | 3 | 4 | 4 | 5 | 3 |
| HBD | 2 | 2 | 3 | 3 | 3 | 1 | 2 | 2 | 3 | 1 |
| Log P | 2.8 | 3.8 | 3.4 | 3.4 | 3.5 | 4.8 | 4.4 | 4.5 | 4.1 | 4.5 |
| PSA | 61 | 61 | 77 | 76 | 78 | 42 | 59 | 60 | 77 | 42 |
| MV | 328 | 328 | 339 | 341 | 339 | 361 | 372 | 372 | 382 | 378 |
| 약물스코어 | 1.09 | 1.11 | 1.41 | 1.30 | 0.85 | 0.35 | 0.42 | 0.68 | 0.69 | 0.83 |
| RO5 | Yes | Yes | Yes | Yes | Yes | Yes | Yes | Yes | Yes | Yes |
계산에 의해 최적화된 화합물 10종을 합성하였으며, 생성물의 확인은 FTIR, 1H NMR 및 13C NMR 스펙트럼 데이터로 확인하여 하기에 나타내었다.
합성예
1. 2-
클로로
-n-[2-
메틸
-5-(프로판-2-일)
페닐
]
아세트아미드
0℃ 내지 -5℃에서 2-아미노-p-시멘 1(0.01 mol)과 트리에틸아민(0.01 mol)을 클로로아세틸 클로라이드(0.01 mol)와 함께 무수 디클로로메탄(25 mL) 내에서 반응시켰다. 반응 혼합물을 일정 온도에서 1시간 동안 교반하였다. 상기 반응 혼합물을 실온에서 5시간 동안 교반하고, TLC로 반응의 진행을 측정하였다. 상기 혼합물을 5% HCl 및 5% 수산화나트륨 용액으로 세척하고; 유기층을 포화 수성 NaCl로 세척하고, 무수 황산마그네슘으로 건조하고, 여과하고, 용매를 감압하에 제거하였다. 조 2-클로로-N-[2-메틸-5-(프로판-2-일)페닐]아세트아미드 2를 에탄올 내에서 재결정화시켜 바늘형 결정으로 수득하였다: 융점 94-96℃; 수율 82%; Rf=0.54 (n-헥산:에틸아세테이트 2:1); FTIR νmax cm-1 : 3,354 (N-H), 2,987 (sp2 C-H), 2,893 (sp3 C-H), 1,656 (C=O 에스터), 1,598 (C=C 방향족), 1,140 (C-O, 에스터).
실시예
1. 아미드 유도체의 합성 1
실온에서 합성예 1의 화합물(0.01 mol)을 히드록시-치환 벤조산(0.01 mol)과 트리에틸아민(0.01 mol) 및 요오드화칼륨(0.01 mol) 존재하의 디메틸포름아미드(25 mL) 내에서 밤새 교반시켰다. 반응 완료 후, 혼합물을 미세하게 분쇄한 얼음 내에 붓고, 에틸아세테이트(4×25 mL)로 추출하였다. 유기층을 합쳐 5% 염산, 5% 수산화나트륨, 마지막으로 수성 NaCl 용액으로 세척하였다. 유기층을 무수 황산마그네슘으로 건조하고, 여과하고, 감압 하에 용매를 제거하여 조생성물을 수득하였다. 조생성물을 실리카겔 컬럼크로마토그래피(n-헥산:에틸 아세테이트 3:1)으로 정제하였다.
화합물 1: 2-[2-메틸-5-(프로판-2-일)아닐리노]-2-옥소에틸 3-히드록시벤조 에이트
수율 85%; 융점 116-118℃; Rf=0.56 (n-헥산:에틸아세테이트 2:1); FTIR νmax cm-1: 3,354 (N-H), 3,166 (O-H), 2,987 (sp2 C-H), 2,913 (sp3 C-H), 1,735 (C=O 에스터), 1,657 (C=O 아미드), 1,590 (C=C 방향족), 1,149 (C=O, 에스터); 1H NMR (DMSO-d 6, δ ppm): 8.63 (s, 1H, -NH), 7.76 (d, J=6.8 Hz, 1H, H-6), 7.52 (s, 1H, H-2), 7.42 (dd, J=6.8, 7.6 Hz, 1H, H-5), 7.36 (d, J=7.6 Hz, 1H, H-4), 7.14 (d, J=2.4 Hz, 1H, H-3'), 7.05 (d, J=7.6 Hz, 1H, H-4'), 6.96 (s, 1H, H-6'), 4.98 (s, 2H, -CH2), 3.06 (sept, 1H, J=6.5 Hz, H-1"), 2.32 (s, 3H, H-3"), 1.36 (s, 1H, -OH), 1.25 (d, J=6.5 Hz, 6H, H-2"); 13C NMR (CDCl3, δ ppm); 165.6 (C=O 에스터), 162.5 (C=O, 아미드), 152.4 (C-3), 144.7 (C-1'), 138.6 (C-2'), 136.4 (C-5'), 133.6 (C-6), 131.3 (C-2), 129.6 (C-1), 127.6 (C-3'), 124.5 (C-4'), 122.3 (C-6'), 120.8 (C-4), 116.4 (C-5), 60.3 (-CH2), 27.4 (C-1"), 26.5 (C-3"), 20.3 (C-2").
화합물 2: 2-[2-메틸-5-(프로판-2-일)아닐리노]-2-옥소에틸 4-히드록시벤조 에이트
수율 80%; 융점 121-123℃; Rf=0.53 (n-헥산:에틸아세테이트 2:1); FTIR νmax cm-1: 3,332 (N-H), 3,153 (O-H), 2,966 (sp2 C-H), 2,901 (sp3 C-H), 1,732 (C=O 에스터), 1,645 (C=O 아미드), 1,593 (C=C 방향족), 1,148 (C-O, 에스터); 1H NMR (DMSO-d 6, δ ppm): 8.64 (s, 1H, -NH), 8.12 (dd, J=7.6, 2.4 Hz, 2H, H-2, H-6), 7.34 (d, J=2.2 Hz, 1H, H-2'), 7.19 (dd, J=7.6, 2.2 Hz, 1H, H-4'), 7.04 (d, J=7.6, 1H, H-6'), 6.92 (dd, J=7.6, 2.2 Hz, 2H, H-3, H-5), 5.01 (s, 2H, -CH2), 4.93 (s, 1H, -OH), 2.72 (sept, J=6.4 Hz, 1H, H-1"), 2.22 (s, 3H, -H-3"), 1.24 (d, J=6.4 Hz, 6H, H-2"); 13C NMR (DMSO-d 6, δ ppm); 164.5 (C=O 에스터), 160.2 (C=O, 아미드), 154.5 (C-4), 149.7 (C-1'), 139.5 (C-2'), 136.5 (C-5'), 133.6 (C-3, C-5), 130.4 (C-1), 128.3 (C-3'), 126.4 (C-4'), 123.5 (C-6'), 119.4 (C-2, C-6), 61.4 (-CH2), 28.5 (C-1"), 26.8 (C-3"), 21.9 (C-2").
화합물 3: 2-[2-메틸-5-(프로판-2-일)아닐리노]-2-옥소에틸 2,4-디히드록시벤조에이트
수율 78%; 융점 136-138℃; Rf=0.44 (n-헥산:에틸아세테이트 2:1); FTIR νmax cm-1: 3,364 (N-H), 3,163 (O-H), 2,966 (sp2 C-H), 2,895 (sp3 C-H), 1,728 (C=O 에스터), 1,651 (C=O 아미드), 1,590 (C=C 방향족), 1,160 (C-O, 에스터); 1H NMR (DMSO-d 6, δ ppm): 8.64 (s, 1H, -NH), 7.64 (d, J=7.4 Hz, 1H, H-6), 7.19 (d, J=7.4 Hz, 1H, H-5), 7.11 (d, J=2.2 Hz, 1H, H-6'), 6.89 (s, 1H, H-3), 6.42 (d, J=7.6 Hz, 1H, H-3'), 6.31 (dd, J=7.6, 2.2 Hz, 1H, H-4'), 5.11 (s, 2H, -CH2), 4.67 (s, 2H, -OH), 2.850 (sept, J=7.1 Hz, 1H, H-1"), 2.09 (s, 3H, H-3"), 1.13 (d, J=7.1 Hz, 6H, H-2"); 13C NMR (DMSO-d 6, δ ppm); 166.5 (C=O 에스터), 162.1 (C=O 아미드), 160.3 (C-2), 155.6 (C-4), 148.2 (C-1'), 138.5 (C-2'), 136.3 (C-5'), 134.6 (C-6), 129.9 (C-4'), 127.7 (C-3'), 120.8 (C-6'), 112.3 (C-3), 108.3 (C-5), 105.1 (C-1), 59.3 (-CH2), 29.1 (C-1"), 27.5 (C-3"), 20.5 (C-2").
화합물 4: 2-[2-메틸-5-(프로판-2-일)아닐리노]-2-옥소에틸 3,4-디히드록시벤조에이트
수율 76%; 융점 126-128℃; Rf=0.48 (n-헥산:에틸아세테이트 2:1); FTIR νmax cm-1: 3,376 (N-H), 3,171 (O-H), 2,973 (sp2 C-H), 2,905 (sp3 C-H), 1,730 (C=O 에스터), 1,671 (C=O 아미드), 1,592 (C=C 방향족), 1,156 (C-O, 에스터); 1H NMR (DMSO-d 6, δ ppm): 8.45 (s, 1H, -NH), 7.69 (d, J=2.4 Hz, 1H, H-2), 7.52 (dd, J=7.6, 2.4 Hz, 1H, H-6), 7.36 (d, J=7.4 Hz, 1H, H-5), 7.16 (d, J=1.4 Hz, 1H, H-5'), 6.89 (d, J=7.6 Hz, 1H, H-3'), 6.78 (dd, J=7.6, 1.4 Hz, 1H, H-4'), 4.96 (s, 2H, -CH2), 4.40 (s, 2H, -OH), 2.80 (sept, J=5.8 Hz, 1H, H-1"), 2.19 (s, 3H, H-3"), 1.19 (d, J=5.8 Hz, 6H, H-2"); 13C NMR (DMSO-d 6, δ ppm); 169.6 (C=O 에스터), 162.7 (C=O 아미드), 152.3 (C-3), 146.7 (C-4), 142.5 (C-1'), 138.5 (C-2'), 134.5 (C-5'), 131.9 (C-6), 128.6 (C-4'), 123.7 (C-3'), 122.5 (C-6'), 119.6 (C-2), 116.7 (C-5), 114.8 (C-1), 60.2 (-CH2), 29.5 (C-1"), 24.5 (C-3"), 22.3 (C-2").
화합물 5: 2-[2-메틸-5-(프로판-2-일)아닐리노]-2-옥소에틸 3,5-디히드록시벤조에이트
수율 84%; 융점 143-145℃; Rf=0.45 (n-헥산:에틸아세테이트 2:1); FTIR νmax cm-1: 3,385 (N-H), 3,154 (O-H), 2,954 (sp2 C-H), 2,893 (sp3 C-H), 1,731 (C=O 에스터), 1,643 (C=O 아미드), 1,590 (C=C 방향족), 1,160 (C-O, 에스터); 1H NMR (DMSO-d 6, δ ppm): 8.49 (s, 1H, -NH), 7.33 (d, J=7.4 Hz, 1H, H-3'), 7.19 (d, J=7.4 Hz, 1H, H-4'), 6.98 (d, J=1.8 Hz, 2H, H-3, H-5), 6.87 (d, J=1.8 Hz, 1H, H-4), 6.67 (s, 1H, H-6'), 5.02 (s, 2H, -CH2), 4.62 (s, 2H, -OH), 2.83 (sept, J=6.2 Hz, 1H, H-1"), 2.20 (s, 3H, H-3"), 1.12 (d, J=6.2 Hz, 6H, H-2");13C NMR (DMSO-d 6, δ ppm); 169.1 (C=O 에스터), 161.2 (C=O 아미드), 158.3 (C-3, C-5), 155.3 (C-1'), 149.0 (C-2'), 139.1 (C-5'), 133.9 (C-2, C-6), 130.1 (C-4'), 126.3 (C-3'), 123.1 (C-6'), 109.3 (C-4), 108.4 (C-1), 62.7 (-CH2), 25.5 (C-1"), 22.6 (C-3"), 19.6 (C-2").
실시예
2. 아미드 유도체의 합성 2
합성예 2와 동일한 방법으로 합성예 1의 화합물(0.01 mol)을 신남산 유도체와 반응시켰다.
화합물 6: 2-[2-메틸-5-(프로판-2-일)아닐리노]-2-옥소에틸 (2E)-3-페닐프로프-2-에노에이트
수율 86%; 융점 138-140℃; Rf=0.62 (n-헥산:에틸아세테이트 2:1); FTIR νmax cm-1: 3,381 (N-H), 2,951 (sp2 C-H), 2,898 (sp3 C-H), 1,729 (C=O 에스터), 1,665 (C=O 아미드), 1,597 (C=C 방향족), 1,148 (C-O, 에스터); 1H NMR (DMSO-d 6, δ ppm): 8.21 (s, 1H, -NH), 7.62 (d, J=16.0 Hz, 1H, H-2), 7.48 (dd, J=7.2, 2.4 Hz, 2H, H-2', H-6'), 7.35-7.39 (m, 3H, H-3', H-4', H-5'), 7.15 (d, J=7.2 Hz, 1H, H-3"), 7.01 (d, J=7.2 Hz, 1H, H-4"), 6.91 (s, 1H, H-6"), 6.61 (d, J=16.0 Hz, 1H, H-1), 4.97 (s, 2H, -CH2), 2.81 (sept, J=6.8 Hz, 1H, H-1'"), 2.28 (s, 3H, H-3'"), 1.21 (d, J=6.8 Hz, 6H, H-2'"); 13C NMR (DMSO-d 6, δ ppm); 166.8 (C=O 에스터), 160.5 (C=O, 아미드), 151.3 (C-1"), 140.9 (C-2), 137.2 (C-2"), 135.3 (C-5"), 130.3 (C-2', C-6'), 128.4 (C-3', C-5'), 124.8 (C-4'), 123.5 (C-1'), 121.2 (C-3"), 119.2 (C-4"), 115.2 (C-6"), 60.5 (-CH2), 27.8 (C-1'"), 24.6 (C-3'"), 19.5 (C-2'").
화합물 7: 2-[2-메틸-5-(프로판-2-일)아닐리노]-2-옥소에틸 (2E)-3-(2-히드록시페닐)프로프-2-에노에이트
수율 82%; 융점 190-192℃; Rf=0.54 (n-헥산:에틸아세테이트 2:1); FTIR νmax cm-1: 3,365 (N-H), 3,138 (O-H), 2,965 (sp2 C-H), 2,895 (sp3 C-H), 1,738 (C=O 에스터), 1,673 (C=O 아미드), 1,595 (C=C 방향족), 1,162 (C-O, 에스터); 1H NMR (DMSO-d 6, δ ppm): 8.24 (s, 1H, -NH), 7.83 (d, J=16.0 Hz, 1H, H-2), 7.62 (d, J=7.6, Hz, 2H, H-6'), 7.58 (dd, J=7.6, 2.2 Hz, 1H, H-4'), 7.42 (dd, J=7.6, 2.4 Hz, 2H, H-5'), 7.38 (d, J=7.6 Hz, 1H, H-3'), 7.18 (d, J=7.4 Hz, 1H, H-3"), 7.09 (d, J=7.4 Hz, 1H, H-4"), 6.91 (s, 1H, H-6"), 6.56 (d, J=16.0 Hz, 1H, H-1), 5.02 (s, 2H, -CH2), 3.13 (sept, J=7.1 Hz, 1H, H-1'"), 2.31 (s, 3H, H-3'"), 1.21 (d, J=7.1 Hz, 6H, H-2'"); 13C NMR (DMSO-d 6, δ ppm); 165.9 (C=O 에스터), 162.2 (C=O, 아미드), 156.8 (C-1"), 147.2 (C-2), 141.3 (C-2"), 138.9 (C-5"), 129.4 (C-3', C-5'), 127.3 (C-4'), 125.2 (C-1'), 121.5 (C-3"), 119.4 (C-4"), 114.3 (C-2', C-6'), 111.1 (C-6"), 62.4 (-CH2), 28.4 (C-1'"), 25.4 (C-3'"), 21.8 (C-2'").
화합물 8: 2-[2-메틸-5-(프로판-2-일)아닐리노]-2-옥소에틸 (2E)-3-(4-히드록시페닐)프로프-2-에노에이트
수율 84%; 융점 206-208℃; Rf=0.52 (n-헥산:에틸아세테이트 2:1); FTIR νmax cm-1: 3,363 (N-H), 3,193 (O-H), 2,975 (sp2 C-H), 2,898 (sp3 C-H), 1,725 (C=O 에스터), 1,652 (C=O 아미드), 1,596 (C=C 방향족), 1,166 (C-O, 에스터); 1H NMR (DMSO-d 6, δ ppm): 8.78 (s, 1H, -NH), 7.62 (d, J=16.0 Hz, 1H, H-2), 7.53 (dd, J=7.4, 2.2 Hz, 2H, H-2', H-6'), 7.39 (dd, J=7.4, 2.2 Hz, 2H, H-3', 5'), 7.19 (d, J=7.6 Hz, 1H, H-3"), 7.08 (d, J=7.6 Hz, 1H, H-4"), 6.98 (s, 1H, H-6"), 6.68 (d, J=16.0 Hz, 1H, H-1), 4.99 (s, 2H, -CH2), 2.98 (sept, J=6.2 Hz, 1H, H-1'"), 2.31 (s, 3H, H-3'"), 1.21 (d, J=6.2 Hz, 6H, H-2'"); 13C NMR (DMSO-d 6, δ ppm); 166.3 (C=O 에스터), 161.3 (C=O, 아미드), 156.5 (C-1"), 142.8 (C-2), 139.5 (C-2"), 136.4 (C-5"), 132.5 (C-3', C-5'), 130.4 (C-4'), 127.3 (C-1'), 121.6 (C-3"), 119.4 (C-4"), 117.5 (C-2', C-6'), 112.7 (C-6"), 62.4 (-CH2), 28.4 (C-1'"), 25.5 (C-3'"), 21.4 (C-2'").
화합물 9: 2-[2-메틸-5-(프로판-2-일)아닐리노]-2-옥소에틸 (2E)-3-(2,4-히디드록시페닐)프로프-2-에노에이트
수율 76%; 융점 224-226℃; Rf=0.44 (n-헥산:에틸아세테이트 2:1); FTIR νmax cm-1: 3,387 (N-H), 3,158 (O-H), 2,958 (sp2 C-H), 2,890 (sp3 C-H), 1,735 (C=O 에스터), 1,648 (C=O 아미드), 1,598 (C=C 방향족), 1,168 (C-O, 에스터); 1H NMR (DMSO-d 6, δ ppm): 8.89 (s, 1H, -NH), 7.78 (d, J=16.0 Hz, 1H, H-2), 7.49 (d, J=7.2 Hz, 1H, H-6'), 7.43 (d, J=7.2 Hz, 1H, H-5'), 7.39 (s, 1H, H-3'), 7.19 (d, J=7.2 Hz, 1H, H-3"), 7.02 (d, J=6.6 Hz, 1H, H-4"), 6.94 (s, 1H, H-6"), 6.62 (d, J=16.0 Hz, 1H, H-1), 5.01 (s, 2H, -CH2), 3.21 (sept, J=6.8 Hz, 1H, H-1'"), 2.35 (s, 3H, H-3'"), 1.31 (d, J=7.2 Hz, 6H, H-2'"); 13C NMR (DMSO-d 6, δ ppm); 166.3 (C=O 에스터), 160.2 (C=O, 아미드), 157.6 (C-1"), 147.9 (C-2), 146.2 (C-2"), 137.5 (C-5"), 130.5 (C-3'), 127.1 (C-5'), 126.4 (C-4'), 127.2 (C-1'), 125.5 (C-3"), 123.2 (C-4"), 121.6 (C-2'), 118.5 (C-6'), 112.7 (C-6"), 62.4 (-CH2), 27.3 (C-1'"), 26.3 (C-3'"), 21.3 (C-2'").
화합물 10: 2-[2-메틸-5-(프로판-2-일)아닐리노]-2-옥소에틸 (2E)-3-(4-클로로페닐)프로프-2-에노에이트
수율 86%; 융점 139-141℃; Rf=0.62 (n-헥산:에틸아세테이트 2:1); FTIR νmax cm-1: 3,365 (N-H), 2,967 (sp2 C-H), 2,898 (sp3 C-H), 1,735 (C=O 에스터), 1,656 (C=O 아미드), 1,598 (C=C 방향족), 1,148 (C-O, 에스터); 1H NMR (DMSO-d 6, δ ppm): 8.24 (s, 1H, -NH), 7.82 (d, J=16.0 Hz, 1H, H-2), 7.51 (d, J=7.6 Hz, 2H, H-2', 6'), 7.36 (d, J=7.6 Hz, 1H, H-3"), 7.16 (d, J=7.6 Hz, 1H, H-4"), 6.98 (s, 1H, H-6"), 6.77 (d, J=7.6 Hz, 2H, H-3', H-5'), 6.48 (d, J=16.0 Hz, 1H, H-1), 5.01 (s, 2H, -CH2), 3.11 (sept, J=5.8 Hz, 1H, H-1'"), 2.48 (s, 3H, H-3'"), 1.19 (d, J=5.8 Hz, 6H, H-2'"); 13C NMR (CDCl3, δ ppm); 167.6 (C=O 에스터), 161.3 (C=O, 아미드), 153.4 (C-1"), 148.8 (C-2), 137.6 (C-2"), 134.6 (C-5"), 131.8 (C-2', C-6'), 129.5 (C-3', C-5'), 127.9 (C-4'), 124.5 (C-1'), 122.5 (C-3"), 120.4 (C-4"), 118.3 (C-6"), 62.9 (-CH2), 29.4 (C-1'"), 25.6 (C-3'"), 22.3 (C-2'").
시험예 1. 버섯 티로시나제 저해 분석
종래 기술(J Enzyme Inhib Med Chem. 2015;30(6): 874-883)에 따른 방법으로 버섯 티로시나제 저해 분석을 수행하였다.
구체적으로, 인산염 완충액(20 mM, pH 6.8), 버섯 티로시나아제 20μL(30 U/mL) 및 저해제 용액 20 ㎕를 96-웰 마이크로플레이트의 웰 내에 넣었다. 실온에서 10분 동안 전배양(preincubation) 후, L-DOPA(3,4-dihydroxyphenylalanine) 20 μL(0.85 mM)를 첨가하고, 분석 플레이트를 25℃에서 20분간 추가 배양하였다. 그 후, 마이크로 플레이트 판독기(Optimax Max Tunable, Sunnyvale, CA, USA)를 사용하여 도파크롬의 흡광도를 475 nm에서 측정하였다. 코직산을 기준 저해제로 사용하고, 인산염 완충액을 음성 대조군으로 사용하였다. 시험 화합물에 의한 저해 정도는 50% 저해(IC50)를 달성하는데 필요한 농도의 백분율로 나타내었다. 3회 독립 실험에서 각 농도를 분석하였다. IC50 값은 데이터 분석 및 그래프 작성 소프트웨어(Origin 8.6, 64-bit)을 통해서 결정되었다.
티로시나제 저해 백분율은 다음 식을 사용하여 계산된다:
식 중에서, B 및 S는 각각 블랭크와 시료의 흡광도이다.
본 발명에 따라 합성된 아미드 유도체는 표준 약물보다 우수한 티로시나제 저해 활성을 나타내는 것을 확인하였으며 이를 표 2에 나타내었다. 신남산 모이어티를 갖는 히드록실화 아미드는 벤조산 모이어티를 갖는 화합물보다 높은 티로시나제 저해활성을 보여주었다. 2,4-디히드록시 치환 신남산 모이어티를 갖는 화합물 9의 IC50 값은 0.15 μM이었고, 이는 우수한 티로시나제 억제 활성을 보여준다. 반면, 표준 약물인 코직산의 IC50 값은 17.20 μM으로 나타났다. 이는 본 발명에 따라 디자인된 화합물 9가 표준 유도체와 비교하여 더 높은 엘라스타제 억제 잠재력이 있음을 의미한다. 상기 결과를 통해 페닐 고리에서 히드록실기의 치환이 티로시나제 저해 활성에 결정적인 요소임을 확인하였다.
시험예 2. 엘라스타제 저해 분석
종래기술(Biochemistry. 1996; 35(28): 9090-9096 및 Acta Pol Pharm. 2010; 67(2): 145-150)에 따른 방법으로 돼지 췌장의 엘라스타제를 사용하여 엘라스타제 저해분석을 수행하였으며, 표 2에 나타내었다. 기질(N-숙시닐-Ala-Ala-Ala-p-니트로아닐리드)로부터 엘라스타제로 가수분해된 p-니트로아닐린 방출량을 410 nm에서 흡광도를 측정하여 결정하였다.
구체적으로, 0.8 mM N-숙시닐-Ala-Ala-Ala-p-니트로아닐리드 2M Tris-HCl 완충액(pH 8.0) 용액을 제조하고, 상기 완충액(130 μL)을 96-웰 마이크로플레이트 내의 시험 샘플(10 μL)에 첨가하였다. 상기 마이크로플레이트를 25 ℃에서 10 분간 전배양(preincubation) 후, 엘라스타제(0.0375 unit / mL) 스탁 용액(10 μL)을 첨가하였다. 효소 첨가 후, 마이크로플레이트를 25 ℃에서 30 분간 보관하고, 마이크로플레이트 판독기를 이용하여 410nm에서 흡광도를 측정하였다. 모든 실험을 3 회 실시하였고, 엘라스타제 저해 활성은 하기 식에 따라 계산하였다:
식 중에서, ODcontrol은 대조군의 광학 밀도이고, ODsample은 시료의 광학 밀도이다. 엘라스타제의 표준 저해제로서, 올레아놀산을 사용하였다.
| 화합물 | 티로시나제 활성 IC50(μM) | 엘라스타제 활성 IC50(μM) |
| 1 | 10.97±1.3 | 41.88±7.5 |
| 2 | 17.98±2.5 | 81.85±15.2 |
| 3 | 1.80±0.31 | 32.93±9.4 |
| 4 | 10.96±1.8 | 24.31±5.7 |
| 5 | 20.20±4.9 | 33.73±7.2 |
| 6 | 0.78±0.09 | 5.01±1.8 |
| 7 | 1.81±0.4 | 13.32±3.2 |
| 8 | 1.41±0.1 | 23.32±4.2 |
| 9 | 0.15±0.01 | 3.73±0.5 |
| 10 | 16.71±3.1 | 35.80±8.2 |
| 코직산 | 17.20±2.6 | |
| 올레아놀산 | 1.69±0.05 |
시험예 3. 인간 티로시나제 저해 분석
세포 배양 및
티로시나제의
준비
A375 인간 흑색종 세포는 American Type Culture Collection(ATCC, Rockville, MD, USA)로부터 수득하였다.
A375 세포를 L-글루타민, 10%(v/v) 태아 소 혈청(Invitrogen), 50 μg/mL 스트렙토마이신(Sigma-Aldrich), 50 units/mL 페니실린(Sigma-Aldrich)이 보충된 둘베코 수정 이글 배지(Invitrogen, Burlington, ON, Canada) 내에서 성장시키고, 티로시나제 유도를 위해 L-티로신 200μM을 보충하였다. 세포 배양물을 37℃, 5% CO2 가습 분위기하에서 배양하였다. 세포를 인산염 완충 염수(PBS)로 조직 배양 플레이트를 긁어내고, 4℃의 PBS 내에서 균질화시켰다. 균질액은 10분간 1,000×g으로 원심분리하였다. 침전물을 얼음 상의 PBS 내에서 초음파 처리시키고, 혼합물을 30분간 10,000×g으로 원심분리 하였다. 티로시나제를 함유하는 상등액을 저해효과 측정에 사용하였다.
티로시나제
저해 분석
합성 아미드의 티로시나제 저해 활성은 알려진 방법을 일부 변형하여 사용하였다. 분석 반응 혼합물(200 μL)은 0.33 M 인산염 완충액(pH 7.0) 내에 3.3 mM L-DOPA와 저해제의 존재 및 부재하에서의 효소를 포함하였다. 티로시나제 15 또는 20 유닛을 사용하여 저해%를 측정하였다. 반응 혼합물을 37℃에서 10분간 배양하고, 마이크로플레이트 판독기(OPTI Max, Tunable)를 사용하여 475 nm에서 흡광도를 기록하였다. 효소의 1 유닛은 앞에서와 동일한 조건에서 475 nm에서 분당 흡광도 값을 0.001씩 증가시키는 효소의 양으로 정의된다. 실험 결과를 하기 표 3에 나타내었다.
티로시나제 저해 분석에서 화합물 9가 50μg/mL에서 91.9 % 저해활성을 나타내는 것을 확인하였다. 이는 화합물 9가 표준 약물인 코직산(72.9% 저해)에 비해 인간 타이로신 분해효소를 효과적으로 억제할 수 있음을 보여준다. 이러한 결과를 통해서도 페닐 모이어티에서 히드록실로 치환되는 경우 효소의 활성 부위와 더욱 효과적으로 상호 작용하는 것을 방해할 수 있음을 확인하였다.
시험예 4. 자유 라디칼 소거능 분석
아미드 유도체의 자유 라디칼 소거능은 알려진 방법을 일부 변형하여 사용하였다. 분석 용액은 100 μL의 DPPH (150 μM)와 20 μL 농도의 시험 화합물로 구성되었고, 부피는 DMSO가있는 각 웰에 200 μL. 이어서, 반응 혼합물을 실온에서 30 분 동안 인큐베이션 하였다. 아스코르브산을 기준저해제로 사용하였다. 분석 측정은 마이크로플레이트 판독기(OPTIMax, Tunable)를 사용하여, 517 nm에서 수행하였다. 반응 속도를 비교하였고, 시험 저해제의 존재에 의해 야기된 저해율을 계산하였다. 각각의 농도는 3회의 독립적인 실험에서 3회 실행하여 분석되었다. 실험 결과를 하기 표 3에 나타내었다.
| 화합물 | 인간 티로시나제 저해% | 자유 라디칼 소거 저해% |
| 1 | 61.25±3.9 | 25.23±1.0 |
| 2 | 53.83±5.3 | 1.70±0.5 |
| 3 | 66.67±6.4 | 2.4±0.6 |
| 4 | 56.85±6.5 | 91.78±2.0 |
| 5 | 54.62±5.8 | 7.12±0.8 |
| 6 | 82.35±8.5 | 1.39±0.5 |
| 7 | 53.70±4.2 | 1.15±0.4 |
| 8 | 55.83±5.7 | 8.51±1.0 |
| 9 | 91.87±8.43 | 23.51±2.0 |
| 10 | 57.40±4.92 | 7.50±1.0 |
| 코직산 | 72.94±5.92 | |
| 올레아놀산 | 95.60±1.0 |
시험예 5. 티로시나제 저해 동력학 분석
화합물 3, 6, 7, 9에 대한 티로시나제 저해 동력학 분석을 실시하였다.
실험에 사용된 화합물의 농도는 다음과 같다: 화합물 3(0, 3.125, 6.25 및 12.5μM), 화합물 6(0, 0.3915 및 0.783 μM), 화합물 7(0, 0.453, 0.965, 1.813 및 3.626 μM), 화합물 9(0, 0.08, 0.16 및 0.32 μM).
기질 L-DOPA 농도는 모든 동력학 연구에서 0.0625와 2 mM 사이였다. 전배양 및 측정 시간은 버섯 티로시나제 저해 분석 방법과 동일하게 수행하엿다. 최대 초기 속도(Maximal initial velocity)는 30초 간격으로 효소를 첨가한 뒤, 5분까지 흡광도 초기 선형 부분으로 결정하였다. 저해 유형은 Lineweaver-Burk 플롯을 사용하여 결정하였다. 효소 저해제(EI) 해리 상수 Ki는 1/V 대 저해제 농도의 2차 플롯에 의해 결정되는 반면, 효소-기질-저해제(ESI)-해리 상수 Ki'은 차단제 대 저헤제 농도에 의해 결정되었다. 효소 농도(4, 6, 8, 10, 15 및 20 ㎍ / mL) 대 화합물 9의 상이한 농도에 대해서도 EI 복합체의 가역 동력학을 결정하였다.
도 1은 화합물 3의 존재 하에서의 티로시나제 저해 활성에 대한 Lineweaver-Burk 플롯이다. 도 1A에서 화합물 3의 농도는 0, 3.125, 6.25 및 12.5μM이었고, 기질 L-DOPA의 농도는 0.125, 0.25, 0.5, 1 및 2mM이다. 도 1B는 기울기의 플롯이다. 선형 최소 자승법을 사용하여 선을 그렸다.
도 2는 화합물 6의 존재 하에서의 티로시나제 저해 활성에 대한 Lineweaver-Burk 플롯이다. 도 2A에서 화합물 3의 농도는 0, 0.3915 및 0.783 μM이었고, 기질 L-DOPA의 농도는 0.125, 0.25, 0.5, 1 및 2 mM이다. 도 2B는 기울기의 플롯이다. 도 2C는 수직 절편 대 화합물 6의 농도를 측정하여 저해 상수를 결정하였다. 선형 최소 자승법을 사용하여 선을 그렸다.
도 3은 화합물 7의 존재 하에서의 티로시나제 저해 활성에 대한 Lineweaver-Burk 플롯이다. 도 3A에서 화합물 3의 농도는0, 0.453, 0.965, 1.813 및 3.626 μM이었고, 기질 L-DOPA의 농도는 0.125, 0.25, 0.5, 1 및 2 mM이다. 도 3B는 기울기의 플롯이다. 도 3C는 수직 절편 대 화합물 6의 농도를 측정하여 저해 상수를 결정하였다. 선형 최소 자승법을 사용하여 선을 그렸다.
도 2A 및 도 3A는 화합물 6 및 7이 제2사분면 내에서 교차하는 것을 보여준다. 분석 결과, 화합물 6 및 7의 농도가 증가함에 따라 Km이 증가하고, 따라서, Vmax는 감소하는 것으로 나타났다. 화합물 6 및 7의 이러한 거동은 경쟁적으로 EI 복합체를 형성하고, 비 경쟁적으로 ESI 복합체를 차단하는 두 가지 경로에 의해 티로시나제를 억제한다는 것을 나타냈다.
도 1A 및 도 4A에서 화합물 6 및 9은 Lineweaver-Burk 플롯은 X축 상의 동일한 지점에서 교차된 직선 계열을 보여준다. 분석 결과 1/Vmax는 새로운 값으로 증가하였으나, Km은 화합물 6 및 9의 농도가 증가한 결과와 동일하게 유지되었다. 이러한 거동은 화합물 6 및 9이 티로시나제를 비 경쟁적으로 저해하여 EI 복합체를형성한다는 것을 보여준다.
다양한 농도(0.0, 0.08, 0.16 및 0.32 μM)에서 화합물 9에 의한 버섯 티로시나제의 저해 메카니즘을 조사하였다. 도 5는 본 발명에 따른 화합물 5의 티로시나제 저해 효과가 비가역적임을 보여준다. 이러한 결과는 화합물 9가 이핵 활성 부위에 비가역적으로 결합함으로서 효소를 효과적으로 저해하기 때문이다.
| 화합물 | 용량 (μM) |
V max (ΔA/초) |
K m (mM) |
저해타입 | 저해 | Ki (μM) | Ki'(μM) | ||||
| 3 | 0.0 | 5.090×10- 6 | 0.138 | 비경쟁 |
|
0.188 |
|
||||
| 3.125 | 2.545×10- 6 | 0.138 | |||||||||
| 6.25 | 1.696×10- 6 | 0.138 | |||||||||
| 12.5 | 1.288×10- 6 | 0.138 | |||||||||
| 6 |
0.0 | 5.621×10- 6 | 0.112 | 혼합저해 |
|
0.84 |
1.4 |
||||
| 0.3915 | 4.294×10- 6 | 0.126 | |||||||||
| 0.783 | 3.909×10- 6 | 0.136 | |||||||||
| 7 | 0.0 | 5.555×10-7 | 0.089 | 혼합저해 |
|
2.2 |
3.8 |
||||
| 0.453 | 4.819×10-7 | 0.108 | |||||||||
| 0.965 | 3.947×10-7 | 0.119 | |||||||||
| 1.813 | 3.067×10-7 | 0.123 | |||||||||
| 3.626 | 2.592×10-7 | 0.131 | |||||||||
| 9 | 0.0 | 1.161×10-5 | 0.217 | 비경쟁 |
비가역 |
0.217 |
|
||||
| 0.08 | 9.598×10-6 | 0.217 | |||||||||
| 0.16 | 6.233×10-6 | 0.217 | |||||||||
| 0.32 | 4.787×10-6 | 0.217 | |||||||||
시험예 6. 제브라피쉬 내에서 생체 내 탈색소 분석
Zebrafish는 인간과 유사한 유전자 서열 시스템을 가지고 있기 때문에, 매우 중요한 척추 동물 모델이다. 제브라피쉬 생체 내 탈색소 분석은 종래 기술(Pigment Cell Res. 2007; 20(2): 120-127)에 따른 방법으로 수행하였다.
제브라피쉬
사육
성체 야생형 제브라피쉬(Danio rerio)는 시판되는 것을 구입한 다음, 28.5℃에서 14시간 광 조건, 10시간 암-조건의 광주기를 사용하여 표준 실험 조건에서 1개월 동안 적응시켰다. 물고기에게 매일 2회 건조 식품 및 살아있는 염수 새우(brine shrimp) 유생을 먹였다. 이들은 일정한 화학적, 생물학적, 기계적 물 여과 및 폭기 하에 항온 탱크에서 사육하였다. 아침에 빛을 켜서 유도시킨 자연 산란으로 배아를 얻었다. 배아 수집은 30분 이내에 완료되었다. 모든 절차는 "실험동물 관리 원칙"(NIH publication no 85-23, revised 1985)에 설명된 바와 같이 수행하였으며, 연구는 공주 국립대학교의 기관 검토위원회의 승인을 받았다(IRB No 2011-2).
복합 치료 및 표현형 기반 평가
수집된 동기화된 배아는 96-웰 플레이트 안에 피펫으로 배열시켰다: E3 배지(NaCl 5 mM, KCl 0.17 mM, CaCl2 0.33 mM 및 MgSO4 0.33 mM) 200 μL와 함께 웰 당 2~3개의 배아. 가장 강력한 화합물 9 용액(0.1% DMSO 중)을 E3 배지에 9 내지 72 hpf(수정 후 수시간, 총 노출은 63 시간)로 첨가하였다. 양성 대조군은 코직산으로 처리하였다. 융모막이 제거된(Dechorionated) 태아를 오목한(depression) 슬라이드 상의 1% 메틸 셀룰로오스 내에 고정(mounted)한 뒤, 트리카인메탄설포네이트 MS-222 용액 내에서 마취시키고, 입체현미경(SMZ745T; Nikon, Shinagawa, Japan)을 사용하여 사진을 찍어 관찰하였다. 픽셀 측정은 ImageJ 소프트웨어 패키지(National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA)를 사용하여 수행하였다.
50μM에서 화합물 9는 색소 침착 수준을 약 57.3 %로 현저히 감소시켰으며(P<0.05, 도 6), 양성 대조군인 코직산은 색소 침착 수준을 24.2% 감소시켰다. 뿐만 아니라, 화합물 9는 10 및 20μM에서도 코직산보다 더 우수한 탈색 효과를 나타냈었다.
제브라피쉬
내에서의 멜라닌 함량 측정
멜라닌 함량은 제브라피쉬 배아 추출물을 사용하여 측정하였다. 생체 내 색소 침착 결과를 기준으로 50 μM 용량을 선택하여 멜라닌 함량을 측정하였다. 수집된 동기화된 배아는 접시에 드로퍼를 사용하여 배열하였다: 20±2 배아를 접시 안에 배열하고, E3 배지 3 mL 내에 화합물 9 및 비교 약물 코직산 50 μM을 처리하였다. 72 hpf 후 트리카인메탄설포네이트 MS-222 용액 내에서 배아를 마취시켰다. 마취 후, 배아를 E3 배지로 3회 세척하고, 모든 처리 및 비처리 배아에서 눈(eye)을 제거하였다. 배아 추출물(펠렛)을 균질화 및 원심분리하여 준비하고, 펠렛을 1N NaOH 1 mL 내에 넣고, 100℃에서 10분간 용해시켰다. 멜라닌 수준은 405 nm 흡광도에서 측정하였고, 그 결과를 합성 멜라닌 표준곡선과 비교하였다. 모든 실험은 3회 반복 실시하였다.
비처리 배아 및 대조 약물에 비해 화합물 9 50 μM로 처리된 제브라피쉬 배아에서 멜라닌 함량이 유의하게 (P<0.001) 감소하였다. 도 7에 나타낸 바와 같이, 코직산은 제브라피쉬 태아의 멜라닌 함량을 약간 감소시켰지만, 화합물 9는 멜라닌 함량을 크게 감소시켰다.
제브라피쉬
독성 분석
화합물 처리에 앞서, 48 hpf 배아를 프로나제(pronase)를 사용하여 15분 동안 효소적으로 융모막을 제거(dechorionate)시키고(스트렙토마이신 그리세우스로부터의 프로테아제 3 mg/mL; Sigma-Aldrich), 이어서 E3 배지로 3번 헹구고, 2 내지 3개의 배아를 200 μL의 E3 배지가 들어있는 96-웰 플레이트 내에 분배하였다. 태아를 10, 20 및 50 μM 용량의 화합물로 처리하고, 태아를 28℃에서 72시간 더 유지하였다. 5일째에 유충의 생존율을 평가하였고, 실험기간 동안에 유충에게 음식을 제공하지 않았다. 세포 사멸적 세포 사망 정도를 평가하기 위해서, 처리 3일 후(총 5일) 배아를 E3 배지 내에서 30분 동안 아크리딘 오렌지 1 μg/mL로 염색하였다. 과량의 염료는 E3 배지로 3회 세척하여 제거하였다. 배아는 마취되었고, 사진은 "생체 내 탈색소 제브라피쉬 분석" 부분에서 설명한 대로 촬영하였다.
48 hpf 후 유충을 10, 20 및 50 μM의 화합물 9로 처리하여 급성 독성을 결정하였고, 물고기를 아크리딘 오렌지로 염색하여 처리 3일 후 검사하였다. 유충은 정상적으로 세포 사멸의 증거가 없는 제브라피쉬로 성장했다. 도 8에 나타낸 바와 같이, 사망한 제브라피쉬는 없었으며, 이는 본 발명의 화합물이 급성 독성을 나타내지 않는, 안전한 약물이라는 점을 보여준다.
상기한 결과들은 본 발명에 따른 화합물은 독성이 없으며, 멜라닌 생성 저해제로서 우수하다는 점을 입증한다. 특히, 화합물 9는 티로시나제와 비가역적인 복합체를 형성함으로써, 코직산에 비해 현저히 향상된 티로시나제 저해 활성을 나타내고, 멜라닌 함량을 감소시키는데 효과적이다.
Claims (11)
- 하기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이들의 약학적으로 허용가능한 염:
[화학식 1]
식 중에서,
R1, R2, R3, R4 및 R5는 서로 동일하거나 또는 상이하고, 각각 독립적으로 수소, 직쇄형 또는 분지형 C1 - 6알킬, 직쇄형 또는 분지형 C1 - 6알콕시, 할로, 트리할로C1-3알킬 및 히드록시 중에서 선택되고,
R6, R7, R8, R9 및 R10은 서로 동일하거나 또는 상이하고, 각각 독립적으로 수소, 히드록시 및 할로 중에서 선택되고,
n은 0 또는 1이다. - 제1항에 있어서,
R1, R3 및 R4는 수소이고,
R2 및 R5는 각각 독립적으로 직쇄형 또는 분지형 C1 - 6알킬인, 화합물 또는 이들의 약학적으로 허용가능한 염. - 제1항에 있어서,
R1, R3 및 R4는 수소이고,
R2는 메틸이고,
R5는 이소프로필인, 화합물 또는 이들의 약학적으로 허용가능한 염. - 제1항에 있어서,
n은 0이면 R6, R7, R8, R9 및 R10은 중 적어도 하나는 H가 아닌, 화합물 또는 이들의 약학적으로 허용가능한 염. - 제1항에 있어서,
화학식 1로 표시되는 화합물은,
2-[2-메틸-5-(프로판-2-일)아닐리노]-2-옥소에틸 3-히드록시벤조 에이트;
2-[2-메틸-5-(프로판-2-일)아닐리노]-2-옥소에틸 4-히드록시벤조 에이트;
2-[2-메틸-5-(프로판-2-일)아닐리노]-2-옥소에틸 2,4-디히드록시벤조에이트;
2-[2-메틸-5-(프로판-2-일)아닐리노]-2-옥소에틸 3,4-디히드록시벤조에이트;
2-[2-메틸-5-(프로판-2-일)아닐리노]-2-옥소에틸 3,5-디히드록시벤조에이트;
2-[2-메틸-5-(프로판-2-일)아닐리노]-2-옥소에틸 (2E)-3-페닐프로프-2-에노에이트;
2-[2-메틸-5-(프로판-2-일)아닐리노]-2-옥소에틸 (2E)-3-(2-히드록시페닐)프로프-2-에노에이트;
2-[2-메틸-5-(프로판-2-일)아닐리노]-2-옥소에틸 (2E)-3-(4-히드록시페닐)프로프-2-에노에이트;
2-[2-메틸-5-(프로판-2-일)아닐리노]-2-옥소에틸 (2E)-3-(2,4-히디드록시페닐)프로프-2-에노에이트; 및
2-[2-메틸-5-(프로판-2-일)아닐리노]-2-옥소에틸 (2E)-3-(4-클로로페닐)프로프-2-에노에이트;으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 화합물 또는 이들의 약학적으로 허용가능한 염. - 하기 화학식 2로 표시되는 화합물을 하기 화학식 3으로 표시되는 화합물과 반응시키는 단계를 포함하는 하기 화학식 1로 표시되는 화합물의 제조방법:
[화학식 1]
[화학식 2]
[화학식 3]
식 중에서,
R1, R2, R3, R4 및 R5는 서로 동일하거나 또는 상이하고, 각각 독립적으로 수소, 직쇄형 또는 분지형 C1 - 6알킬, 직쇄형 또는 분지형 C1 - 6알콕시, 할로, 트리할로C1-3알킬 및 히드록시 중에서 선택되고,
R6, R7, R8, R9 및 R10은 서로 동일하거나 또는 상이하고, 각각 독립적으로 수소, 히드록시 및 할로 중에서 선택되고,
n은 0 또는 1이다. - 제6항에 있어서,
상기 화학식 2로 표시되는 화합물은 하기 화학식 4의 화합물을 2-클로로아세틸 클로라이드와 반응시켜 제조된 것인, 제조방법.
[화학식 4]
- 제6항에 있어서,
상기 반응은 염기 및 요오드화칼륨 존재 하의 유기용매 내에서 수행되는 것인, 제조방법. - 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 따른 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함하는 티로시나제 과다 발현 또는 멜라닌 과다 생성과 관련된 질환의 치료 또는 예방용 약학적 조성물.
- 제9항에 있어서,
티로시나제 과다 발현 또는 멜라닌 과다 생성과 관련된 질환은 피부암, 흑색종, 과색소성 질환, 피부착색, 주근깨, 모반, 이소성몽고반점, 커피반점 및 기미로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 약학적 조성물. - 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 따른 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함하는 피부 미백용 화장료 조성물.
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- 2018-07-10 KR KR1020180080104A patent/KR20200006405A/ko not_active Application Discontinuation
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