KR20200002775A - 증가된 면역억제 내성을 갖는 t 세포 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 재조합 cAMP 포스포디에스테라아제(phosphodiesterase, PDE) 또는 이의 단편, 및 개체의 암세포에 특이적으로 결합하는 항원 수용체를 발현하는 변형된 T 세포 집단의 투여에 의한 개체의 암의 치료에 관한 것이다. 약학적 조성물 및 치료 방법과 함께, 변형된 T 세포 집단 및 변형된 T 세포 집단을 생성하는 방법이 제공된다.

Description

증가된 면역억제 내성을 갖는 T 세포
본 출원은 2016년 9월 23일에 제출된 GB1616238.0의 우선권을 청구하며, 그 내용 및 요소는 모든 목적을 위해 참조로서 본원에 포함된다.
본 발명은 면역억제에 대한 그 내성을 증가시키기 위한 T 세포의 변형 및 면역요법에서의, 예를 들어 암 치료를 위한 변형된 T 세포의 용도에 관한 것이다.
T 세포(또는 T 림프구)는 조직 및 종양 환경 내에 널리 분포되어 있는 것으로 밝혀졌다. T 세포는 세포 표면상의 T 세포 수용체(T cell receptor, TCR)의 존재에 의해 다른 림프구와 구별된다. TCR은 T 세포의 항원-특이적 활성화를 매개하는 다중-서브유닛 막관통 복합체(multi-subunit transmembrane complex)이다. TCR은 주조직 적합성 복합체(major histocompatibility complex, MHC) 분자에 의해 표적 세포 상에 제시된 항원 펩티드 리간드를 인식함으로써 T 세포 상에 항원 특이성을 부여한다.
종양 표적 세포에서 변형 또는 돌연변이된 단백질로부터 유래된 펩티드는 특이적인 TCR을 발현하는 T 세포에 의해 외인성(foreign)인 것으로 인식될 수 있지만, 종양 세포 상의 많은 항원은 단순하게 상향 조절되거나 과발현될 뿐(소위 자가-항원(self-antigen)) 기능적인 T 세포 반응을 유도하지는 않는다. 따라서, 연구는 악성이지만 정상은 아닌 세포 유형에서 발현되거나 또는 높게 발현되는 표적 종양 항원을 확인하는데 초점을 맞추어 왔다. 이러한 표적의 예는 다양한 인간의 암에서 발현되지만 정상 조직에서는 제한된 발현을 보이는 암/고환(cancer/testis, CT) 항원 NY-ESO-1(Chen Y-T et al. Proc Natl Acad Sci USA. 1997; 94(5):1914-1918), 및 매우 한정된 수의 건강한 조직에서 발현되는 CT 항원의 MAGE-A 패밀리(Scanlan M. J. et al. Immunol Rev. 2002; 188:22-32)를 포함한다.
이러한 항원의 확인은 특이적이고 효과적인 암 치료요법을 제공할 가능성이 있는 표적 T 세포-기반의 면역요법의 개발을 촉진하였다(Ho, W.Y. et al. Cancer Cell 2003; 3:1318-1328; Morris, E.C. et al. Clin. Exp. Immunol. 2003; 131:1-7; Rosenberg, S.A. Nature 2001; 411:380-384; Boon, T. and van der Bruggen P. J. Exp. Med. 1996; 183:725-729).
하지만 종양의 미세환경은 종종 면역 억제성이며, 암에 대한 성공적인 면역요법을 방해한다(Rabinovich G.A. et al. Annu Rev Immunol. 2007; 25:267-296). 세포 외 아데노신은 면역 기능의 억제제로 알려져 있다. 종양 내 높은 수준의 아데노신은 항-종양 면역 반응의 회피(evasion)에서 중요한 역할을 하는 것으로 밝혀졌다(Blay J. et al. Cancer Res. 1997; 57:2602-2605; Ohta A. et al. Proc Natl Acad Sci USA. 2006; 103:13132-13137). 종양 내 아데노신이 풍부한 환경은 T 세포 아너지(anergy)를 유도하고(Zarek P.E. et al. Blood 2008; 111:251-259; Ohta A. et al. J Immunol. 2009; 183:5487-5493), 면역억제성 사이토카인(예를 들어, TGF-베타, IL-10)의 생성을 증가시키며(Zarek P.E. et al. supra; Nowak M. et al. Eur J Immunol. 2010; 40:682-687), 항원-제시 세포를 표적으로 함으로써 세포성 면역 반응을 막을 수 있다(Hasko G. et al. Faseb J. 2000;1 4:2065-2074; Panther E. et al. Blood 2003; 101:3985-3990).
프로스타글란딘 E2(prostaglandin E2, PGE2)는 또한 면역 기능의 억제제인 것으로 알려져 있으며, 선천적(innate) 및 항원-특이적 면역을 억제하는 것으로 널리 입증되었다(Phipps R.P. et al. Immunol Today. 1991; 12:349-352; Harris S.G. et al. Trends Immunol. 2002; 23:144-150).
적대적인(hostile) 종양 환경에 보다 잘 대처할 수 있는 T 세포-기반의 면역요법은 좀 더 효과적인 암 치료요법을 제공하는 데 유용할 것이다.
본 발명자들은 종양 세포를 표적으로 하는 T 세포의 세포독성이 예를 들어, cAMP 포스포디에스테라아제(phosphodiesterase, PDE) 또는 이의 단편의 재조합 발현을 통해 cAMP 신호전달을 억제함으로써 증가될 수 있음을 인식하였다. 따라서, cAMP PDE 또는 이의 단편을 발현하도록 변형된 T 세포는 암 면역요법에서 유용할 수 있다.
본 발명의 양태는 재조합 cAMP 포스포디에스테라아제(PDE) 또는 이의 단편 및 개체 내 암세포에 특이적으로 결합하는 항원 수용체를 발현하는 T 세포 집단을 개체에게 투여하는 단계를 포함하는 개체의 암을 치료하는 방법을 제공한다.
본 발명의 또 다른 양태는
개체로부터 수득된 T 세포 집단을 제공하는 단계, 및
cAMP 포스포디에스테라아제(PDE) 또는 이의 단편을 발현하도록 T 세포를 변형시켜 변형된 T 세포 집단을 생성하는 단계
를 포함하는 변형된 T 세포 집단을 생성하는 방법을 제공한다.
일부 구현예에서, T 세포는 개체로부터 암세포에 특이적으로 결합하는 T 세포 수용체(T cell receptor, TCR)와 같은 내생적(endogenous) 항원 수용체를 발현할 수 있다. 다른 구현예에서, 방법은 개체로부터 암세포에 특이적으로 결합하는 항원 수용체를 발현하도록 T 세포를 변형시키는 단계를 추가로 포함할 수 있다. T 세포는 cAMP PDE 또는 이의 단편을 발현하도록 변형되기 이전, 이후 또는 이와 동시에 항원 수용체를 발현하도록 변형될 수 있다.
변형 이후에, 변형된 T 세포 집단은 증식(expansion), 보관되고/되거나 약학적 조성물로 제형화될 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태는
공여(donor) 개체로부터 수득된 T 세포 집단을 제공하는 단계,
cAMP 포스포디에스테라아제(PDE) 또는 이의 단편을 발현하도록 T 세포를 변형시켜 변형된 T 세포 집단을 생성하는 단계, 및
변형된 T 세포 집단을 수용(recipient) 개체에 투여하는 단계
를 포함하는 개체의 암을 치료하는 방법을 제공한다.
일부 구현예에서, T 세포는 공여 개체로부터 암세포에 특이적으로 결합하는 내생적 항원 수용체를 발현할 수 있다. 다른 구현예에서, 방법은 공여 개체로부터 암세포에 특이적으로 결합하는 항원 수용체를 발현하도록 T 세포를 변형시키는 단계를 추가로 포함할 수 있다. T 세포는 cAMP PDE 또는 이의 단편을 발현하도록 변형되기 이전, 이후 또는 이와 동시에 항원 수용체를 발현하도록 변형될 수 있다.
공여 개체 및 수용 개체는 동일하거나(즉, 자가(autologous) 치료: 변형된 T 세포는 이후에 변형된 T 세포로 치료되는 개체로부터 수득된다), 또는 공여 개체 및 수용 개체는 서로 상이할 수 있다(즉, 동종이계(allogeneic) 치료: 변형된 T 세포는 일 개체로부터 수득되고, 이후에 상이한 개체를 치료하는데 이용된다).
본 발명의 또 다른 양태는 암세포에 특이적으로 결합하는 항원 수용체, 및 cAMP 포스포디에스테라아제(PDE) 또는 이의 단편을 발현하는 변형된 T 세포 집단을 제공하며, 여기에서 상기 세포는 cAMP 포스포디에스테라아제(PDE) 또는 이의 단편을 암호화하는 이종(heterologous) 핵산을 포함한다.
항원 수용체는 내생적일 수 있거나, 또는 이종 핵산에 의해 암호화되는 재조합 항원 수용체일 수 있다.
본 발명의 다른 양태는 상술된 변형된 T 세포를 포함하는 약학적 조성물, 변형된 T 세포 또는 약학적 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 치료 방법; 및 치료 방법, 예를 들어 개체의 암 치료 방법에서 사용하기 위한 변형된 T 세포 또는 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 다른 양태는 암세포에 특이적으로 결합하는 항원 수용체를 암호화하는 뉴클레오티드 서열 및 cAMP 포스포디에스테라아제(PDE) 또는 이의 단편을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산, 렌티바이러스 벡터를 비롯한 핵산을 포함하는 벡터, 및 벡터를 포함하는 바이러스입자를 제조하는 방법을 제공한다.
도 1은 PDE4C(도 1a) 또는 PDE7A(도 1b)와 동시에 NY-ESOc259 T 세포 수용체를 발현하는 렌티벡터의 플라스미드 맵을 도시한 것이다.
도 2는 PDE7A를 과발현하는 NY-ESO 특이적 T 세포에 의한 표적 세포 살상 동역학(cell killing kinetic)을 도시한 것이다. 도 2a 및 도 2b(두 공여자로부터의 데이터)는 PDE7A를 과발현하는 NY-ESO 특이적 T 세포가 NY-ESO 특이적 T 세포 단독과 비교하여 A375 흑색종 표적 세포에서 아포토시스(apoptosis)를 유도하는 능력을 증가시킴을 도시한 것이다.
도 3은 NY-ESO 특이적 T 세포에서의 PDE7A의 과발현이 프로스타글란딘 E2의 억제 효과에 대한 내성을 부여함을 도시한 것이다. 도 3a 및 도 3b(두 공여자로부터의 데이터)는 PDE7A를 과발현하는 NY-ESO 특이적 T 세포가 PGE2의 T 세포-억제 효과에 대해 내성이 있으며, 이는 PGE2의 부재 시에 동일한 T 세포가 보여주는 능력과 비교할 만한 A375 흑색종 표적 세포 살상 능력을 입증함을 도시한 것이다.
도 4는 NY-ESO 특이적 T 세포에서의 PDE7A의 과발현이 세포 살상 능력에 대한 포스콜린(forskolin)의 억제 효과에 부분적인 내성을 부여함을 도시한 것이다. 도 4a 및 도 4b(두 공여자로부터의 데이터)는 PDE7A를 과발현하는 NY-ESO 특이적 T 세포가 PDE7A를 과발현하지 않는 NY-ESO 특이적 T 세포(ADB869 T 세포)보다 포스콜린의 존재하에 우수한 살상 능력을 보임을 도시한 것이다.
도 5는 PDE7A를 과발현하는 NY-ESO 특이적 T 세포가 세포 내 cAMP를 증가시키는 매개체(mediator)에 의한 사이토카인 방출의 억제에 대하여 부분적으로 내성이 있음을 도시한 것이다. NY-ESO 특이적 T 세포에서 PDE7A의 과발현은 부분적으로 IFN-γ 분비에 대한 포스콜린(도 5a), 아데노신(도 5b) 및 PGE2(도 5c)의 억제 효과를 극복한다.
도 6은 PDE4C를 과발현하는 NY-ESO 특이적 T 세포가 세포 내 cAMP를 증가시키는 매개체에 의한 사이토카인 방출의 억제에 대하여 부분적으로 내성이 있음을 도시한 것이다. 도 6a 및 도 6b(두 공여자로부터의 데이터)는 NY-ESO 특이적 T 세포에서 PDE4C의 과발현이 부분적으로 IFN-γ 분비에 대한 PGE2 및 포스콜린의 억제 효과를 차단함을 도시한 것이다.
도 7은 NY-ESO 수용체 단독(NY-ESO1c259 TCR), 전장 PDE7A와 결합한 NY-ESO 수용체(NY-ESO1c259 TCR + 전장 PDE7A) 및 절단된(truncated) PDE7A와 결합한 NY-ESO 수용체(NY-ESO1c259 TCR + 절단된 PDE7A)를 이용한 렌티바이러스 형질도입의 결과를 도시한 것이다.
도 8은 전장 및 절단된 PDE7A를 이용한 형질도입 이후에 NY-ESO TCR에 대한 형질도입 효율 및 TCR 발현 수준을 도시한 것이다.
도 9는 PGE2의 존재 및 부재하에 전장 또는 절단된 PDE7A를 과발현하는 NY-ESO 특이적 T 세포에 의한 표적 세포 살상 동역학을 도시한 것이다. 도 9b는 억제제의 부재 시에 모든 구조물에 대한 비교할 만한 살상 능력을 도시한 것이다. 도 9c는 전장 또는 절단된 PDE7A를 과발현하는 NY-ESO 특이적 T 세포가 PDE7A를 과발현하지 않는 NY-ESO 특이적 T 세포보다 PGE2의 존재하에 우수한 살상 능력을 보임을 도시한 것이다.
도 10은 전장 또는 절단된 PDE7A를 과발현하는 NY-ESO 특이적 T 세포가 세포 내 cAMP를 증가시키는 매개체에 의한 사이토카인 방출의 억제에 대하여 부분적으로 내성이 있음을 도시한 것이다. 도 10a 및 도 10b(두 공여자로부터의 데이터)는 NY-ESO 특이적 T 세포에서 전장 또는 절단된 PDE7A의 과발현이 부분적으로 IFN-γ 분비에 대한 PGE2 및 포스콜린의 억제 효과를 차단함을 도시한 것이다.
본 발명은 cAMP PDE 또는 cAMP PDE의 단편의 재조합 발현을 통해 종양의 면역억제성 미세환경에 대한 항-종양 T 세포의 내성을 증가시키는 방법에 관한 것이다. cAMP PDE 또는 이의 단편의 발현을 통해 cAMP 신호 전달을 감소시키는 것은 아데노신 및 프로스타글란딘 E2(PGE2)에 의한 억제에 대해 항-종양 T 세포의 내성을 증가시키는 것으로 본원에 나타난다. 억제에 대해 증가된 내성을 갖는 변형된 T 세포는 비변형된 T 세포에 비하여 증가된 세포독성 및/또는 사이토카인 방출을 보여줄 수 있다. 본원에 기재된 바와 같이 cAMP PDE 또는 cAMP PDE의 단편을 발현하도록 변형된 항-종양 T 세포는 면역요법에서, 예를 들어 암치료를 위한 입양 세포 이식(adoptive cell transfer, ACT)에서 유용할 수 있다.
T 세포(또한 T 림프구로도 불림)는 세포-매개성 면역에서 중심적인 역할을 하는 백혈구이다. T 세포는 세포 표면상의 T 세포 수용체(TCR)의 존재에 의해 다른 림프구와 구별될 수 있다. T 세포에는 여러 유형이 있으며, 각각의 유형은 고유한 기능을 갖는다.
보조 T 세포(T helper cell, TH 세포)는 CD4 표면 당단백질을 발현하기 때문에, CD4+ T 세포로 알려져 있다. CD4+ T 세포는 후천성 면역계(adaptive immune system)에서 중요한 역할을 하며, T 세포 사이토카인을 방출하고 면역 반응을 억제하거나 조절하도록 도움으로써 다른 면역 세포들의 활성을 돕는다. 이들은 세포독성 T 세포의 활성화 및 성장에 필수적이다.
세포독성 T 세포(cytotoxic T cell, TC 세포, CTL, 살해 T 세포)는 CD8 표면 당단백질을 발현하기 때문에, CD8+ T 세포로 알려져 있다. CD8+ T 세포는 바이러스-감염된 세포 및 종양 세포를 파괴하는 작용을 한다. 대부분의 CD8+ T 세포는 클래스 I MHC 분자(class I MHC molecule)에 의해 감염되거나 손상된 세포의 표면상에 표출되는(displayed) 특이적인 항원을 인식할 수 있는 TCR을 발현한다. 항원 및 MHC 분자에 대한 TCR 및 CD8 당단백질의 특이적 결합은 감염되거나 손상된 세포의 T 세포-매개성 파괴로 이어진다.
본원에 기재된 바와 같은 용도를 위한 T 세포는 CD4+ T 세포; CD8+ T 세포; 또는 CD4+ T 세포 및 CD8+ T 세포일 수 있다. 예를 들어, T 세포는 CD4+ T 세포 및 CD8+ T 세포의 혼합 집단일 수 있다.
본원에 기재된 바와 같은 용도에 적합한 T 세포는 공여 개체로부터 수득될 수 있다. 일부 구현예에서, 공여 개체는 T 세포가 본원에 기재된 바와 같은 변형 및 증식 이후에 투여될 수용 개체와 동일한 사람일 수 있다(자가 치료). 다른 구현예에서, 공여 개체는 T 세포가 본원에 기재된 바와 같은 변형 및 증식 이후에 투여될 수용 개체와는 상이한 사람일 수 있다(동종이계 치료). 예를 들어, 공여 개체는 암을 앓고 있는 수용 개체와 사람 백혈구 항원(human leukocyte antigen, HLA)이 (공여 이전 또는 이후에) 일치하는 건강한 개체일 수 있다.
본원에 기재된 방법은 개체로부터 T 세포를 수득하고/하거나 암에 걸린 개체로부터 수득된 샘플로부터 T 세포를 분리하는 단계를 포함할 수 있다.
T 세포 집단은 혈액 샘플로부터 분리될 수 있다. T 세포를 분리하기 위한 적합한 방법은 당해 기술 분야에서 잘 알려져 있으며, 예를 들어 형광 활성 세포 분류기(fluorescent activated cell sorting, FACS: 예를 들어, Rheinherz et al(1979) PNAS 76 4061를 참조), 세포 패닝(cell panning, 예를 들어 Lum et al(1982) Cell Immunol 72 122를 참조) 및 항체 코팅된 자성 비드(antibody coated magnetic beads)를 이용한 분리(예를 들어, Gaudernack et al 1986 J Immunol Methods 90 179를 참조)를 포함한다. CD4+ 및 CD8+ T 세포는 혈액 샘플로부터 수득된 말초 혈액 단핵구 세포(peripheral blood mononuclear cell, PBMC) 집단으로부터 분리될 수 있다. PBMC는 표준 기법을 이용하여 혈액 샘플로부터 추출될 수 있다. 예를 들어, 피콜(ficoll)은 구배 원심분리와 함께 사용되어(Boyum A. Scand J Clin Lab Invest. 1968; 21(Suppl.97):77-89) 전혈을 혈장의 최상층, 다음으로 PBMC의 층 및 다형핵 세포(polymorphonuclear cell)와 적혈구의 바닥 분획으로 분리할 수 있다. 일부 구현예에서, PBMC는 CD14+ 세포(단핵구)가 고갈되어 있을 수 있다.
분리 이후에, T 세포는 활성화될 수 있다. T 세포를 활성화하는데 적합한 방법은 해당 기술 분야에서 잘 알려져 있다. 예를 들어, 분리된 T 세포는 T 세포 수용체(TCR) 작용제에 노출될 수 있다. 적합한 TCR 작용제는 수지상 세포(dendritic cell)와 같은 항원 제시 세포의 표면상의 클래스 I 또는 II MHC 분자 상에 표출되는 펩티드와 같은 리간드, 및 항-TCR 항체와 같은 가용성 인자를 포함한다.
항-TCR 항체는 εCD3, αCD3 또는 αCD28과 같은 TCR의 구성요소에 특이적으로 결합할 수 있다. TCR 자극에 적합한 항-TCR 항체는 해당 기술 분야에서 잘 알려져 있으며(예를 들어, OKT3), 상업적인 공급자(예를 들어, eBioscience CO USA)로부터 입수 가능하다. 일부 구현예에서, T 세포는 항-αCD3 항체 및 IL2에 노출됨으로써 활성화될 수 있다. 더 바람직하게는, T 세포는 항-αCD3 항체 및 항-αCD28 항체에 노출됨으로써 활성화된다. 활성화는 CD14+ 단핵구의 존재 또는 부재하에 발생할 수 있다. 바람직하게는, T 세포는 항-CD3 및 항-CD28 항체가 코팅된 비드로 활성화될 수 있다. 예를 들어, CD4+ 및/또는 CD8+ 세포를 포함하는 PBMC 또는 T 세포 서브셋은 항체가 코팅된 비드, 예를 들어 다이나비즈® 인간 T-활성화제 CD3/CD28(Dynabeads® Human T-Activator CD3/CD28, ThermoFisher Scientific)과 같은 항-CD3 및 항-CD28 항체로 코팅된 자성 비드를 이용하여, 피더 세포(feeder cell)(항원 제시 세포) 또는 항원이 없이도 활성화될 수 있다.
분리 및 활성화 이후에, T 세포는 고리형 아데노신 1인산(cyclic adenosine monophosphate, cAMP) 포스포디에스테라아제(phosphodiesterase, PDE) 또는 cAMP PDE의 단편을 발현하도록 변형될 수 있다.
cAMP PDE 또는 이의 단편은 인산디에스테르 결합을 가수분해하고, 아데노신 3', 5'-고리형 인산(고리형 아데노신 1인산, cAMP)을 아데노신 5'-인산(아데노신 1인산, AMP)으로의 분해를 촉진하고(EC3.1.4.17; EC 3.1.4.53), 및/또는 cAMP 의존성 단백질 키나아제(protein kinase, PKA)를 직접적으로 억제함으로써(예를 들어 Han et al.(2006) JBC 281 22 15050-15057을 참조) 세포 내에서 cAMP 신호전달을 억제한다. 예를 들어, cAMP PDE 또는 cAMP PDE 단편은 (i) cAMP 의존성 단백질 키나아제(PKA)의 촉매성(C) 서브유닛을 억제하거나, (ii) cAMP의 분해를 촉진하거나, 또는 (iii) (i) 및 (ii)를 모두 할 수 있다.
적합한 cAMP PDE는 해당 기술 분야에서 잘 알려져 있으며, PDE1, PDE2, PDE3, PDE4, PDE7, PDE8, PDE10 및 PDE11을 포함한다. 일부 바람직한 구현예에서, cAMP PDE는 PDE4 또는 PDE7일 수 있다.
PDE7은 PDE7A(유전자 ID 5150)를 포함할 수 있고, 데이터베이스 참조번호 CCDS56538.1; NP_001229247.1 GI: 334085277(서열번호 1) 또는 CCDS34901.1; NP_002594.1 GI: 24429566을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
PDE4는 PDE4A(유전자 ID 5141) 및 PDE4C(유전자 ID 5143)를 포함할 수 있다. PDE4A는 데이터베이스 참조번호 CCDS45961.1; NP_001104777.1 GI: 162329608(서열번호 2)을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있고, PDE4C는 데이터베이스 참조번호 CCDS12373.1; NP_000914.2 GI: 115529445(서열번호 3)를 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
다른 cAMP PDE의 아미노산 서열은 해당 기술 분야에서 잘 알려져 있으며, 공용 데이터베이스에서 입수 가능하다.
cAMP PDE는 본원에 인용된 cAMP PDE 참조 아미노산 서열을 포함할 수 있거나, 또는 이의 변이체일 수 있다. 변이체는 참조 아미노산 서열에 대해 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 서열 동일성(identity)을 갖는 아미노산 서열을 가질 수 있다.
아미노산 서열 동일성은 일반적으로 알고리즘 GAP(GCG Wisconsin PackageTM, Accelrys, San Diego CA)를 참조하여 정의된다. GAP는 일치(match)의 수를 최대화하고 갭(gap)의 수를 최소화하는 두 개의 완전한 서열을 정렬하기 위해 니들맨-분쉬(Needleman & Wunsch) 알고리즘을 이용한다(J. Mol. Biol.(48): 444-453(1970)). 일반적으로, 갭 생성 패널티(gap creation penalty) = 12점 및 갭 확장 패널티(gap extension penalty) = 4점과 함께 기본 매개변수가 사용된다. GAP의 이용은 바람직할 수 있지만, 다른 알고리즘, 예를 들어 BLAST, psiBLAST 또는 TBLASTN(Altschul et al.(1990) J. Mol . Biol. 215: 405-410의 방법을 이용), FASTA(Pearson and Lipman(1988) PNAS USA 85: 2444-2448의 방법을 이용), 또는 일반적으로 기본 매개변수를 사용하는 스미스-워터맨(Smith-Waterman) 알고리즘(Smith and Waterman(1981) J. Mol Biol . 147: 195-197)이 이용될 수 있다.
특정한 아미노산 서열 변이체는 1개의 아미노산, 2개, 3개, 4개, 5-10개, 10-20개 또는 20-30개의 아미노산의 삽입, 첨가, 치환 또는 결실에 의해 참조 서열과 다를 수 있다. 일부 구현예에서, 변이체 서열은 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개 이상의 잔기가 삽입, 결손 또는 치환된 참조 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어, 최대 15, 최대 20, 최대 30 또는 최대 40개의 잔기가 삽입, 결손 또는 치환될 수 있다.
일부 바람직한 구현예에서, 변이체는 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개 이상의 보존적 치환(conservative substitution)에 의해 참조 서열과 다를 수 있다. 보존적 치환은 아미노산을 유사한 특성을 가진 다른 아미노산으로 치환하는 것을 포함한다. 예를 들어, 지방족 잔기는 또 다른 지방족 잔기로 치환될 수 있거나; 비극성 잔기는 또 다른 비극성 잔기로 치환될 수 있거나; 산성 잔기는 또 다른 산성 잔기로 치환될 수 있거나; 염기성 잔기는 또 다른 염기성 잔기로 치환될 수 있거나; 극성 잔기는 또 다른 극성 잔기로 치환될 수 있거나; 방향족 잔기는 또 다른 방향족 잔기로 치환될 수 있다. 보존적 치환은 예를 들어, 하기의 그룹 내의 아미노산 사이에 있을 수 있다:
(i) 알라닌 및 글리신;
(ii) 글루탐산, 아스파르트산, 글루타민 및 아스파라긴;
(iii) 아르기닌 및 리신;
(iv) 아스파라긴, 글루타민, 글루탐산 및 아스파르트산;
(v) 이소류신, 류신 및 발린;
(vi) 페닐알라닌, 티로신 및 트립토판;
(vii) 세린, 트레오닌 및 시스테인.
cAMP PDE의 단편은 전장(full-length) 미만의 cAMP PDE 서열을 함유하지만, cAMP 신호전달 억제 활성의 일부 또는 전체를 유지하는 절단된 서열이다. 단편은 cAMP PDE 활성을 나타내는 촉매 단편일 수 있거나, 또는 더 바람직하게는 비-촉매 단편, 예를 들어 cAMP 의존성 단백질 키나아제(PKA)를 억제하는 단편일 수 있다. 전장 cAMP PDE 서열의 단편은 전장 cAMP PDE 서열에서 적어도 40개의 아미노산, 적어도 50개의 아미노산 또는 적어도 60개의 인접한(contiguous) 아미노산을 포함할 수 있다. 단편은 60개 이하, 100개 이하, 200개 이하 또는 300개 이하의 아미노산 잔기를 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, cAMP PDE는 cAMP 의존성 단백질 키나아제(PKA)의 촉매성(C) 서브유닛과 결합하고 이를 억제할 수 있다. 적합한 단편은 가기질(pseudosubstrate) 부위, 예를 들어 RRGAI 모티프를 포함하는, 16-22개 아미노산 반복 서열, 바람직하게는 약 18개 아미노산의 하나 이상의 카피를 포함할 수 있다. 적합한 반복 서열은 하기의 아미노산 서열을 가질 수 있다:
P(V/N)P(Q/R)(H/Q)(V/L)(L/S)(S/Q)RRGAIS(F/Y)(S/S)SS
반복 서열의 예는 하기의 서열번호 4에서 강조된다. 전장 cAMP PDE 서열의 단편은 N 말단 단편일 수 있다. 즉, 단편의 N 말단 잔기는 전장 cAMP PDE 서열의 N 말단 잔기에 상응할 수 있다. 예를 들어, N 말단 단편은 전장 cAMP PDE 서열의 N 말단으로부터 적어도 40개, 적어도 50개, 적어도 60개, 적어도 75개 또는 적어도 100개의 인접한 아미노산을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 적합한 N 말단 단편은 서열번호 4의 아미노산 1 내지 57을 포함할 수 있다. 다른 구현예에서, 적합한 N 말단 단편은 서열번호 4를 포함할 수 있다.
T 세포에서 발현되는 재조합 cAMP PDE 또는 이의 단편은 C 말단에 또는 더 바람직하게는 N 말단에 이종 태그를 포함할 수 있다. 태그는 cAMP PDE와 자연적으로 결합되지 않으며, 특정 결합 쌍의 하나의 구성원을 형성하는 펩티드 서열이다. 재조합 cAMP PDE를 발현하는 T 세포는 특정 결합 쌍의 다른 하나의 구성원을 태그에 결합시킴으로써 확인 및/또는 정제될 수 있다. 예를 들어, 태그는 항-태그 항체에 의해 결합된 에피토프(epitope)를 형성할 수 있다. 이는 치료 동안 변형된 T 세포를 확인하는데 유용할 수 있다.
적합한 태그는 예를 들어, MRGS(H)6 , DYKDDDDK(FLAGTM), T7-, S-(KETAAAKFERQHMDS), 폴리-Arg(R5-6), 폴리-His(H2-10), 폴리-Cys(C4), 폴리-Phe(F11), 폴리-Asp(D5-16), SUMO 태그(Invitrogen Champion pET SUMO 발현 시스템), Strept-태그 II(WSHPQFEK), c-myc(EQKLISEEDL), 인플루엔자-HA 태그(Murray, P. J. et al.(1995) Anal Biochem 229, 170-9), Glu-Glu-Phe 태그(Stammers, D. K. et al.(1991) FEBS Lett 283, 298-302), 태그.100(Qiagen; 포유류 MAP 키나아제 2로부터 유래된 12 aa tag), Cruz 태그 09™(MKAEFRRQESDR, Santa Cruz Biotechnology Inc.) 및 Cruz 태그 22™(MRDALDRLDRLA, Santa Cruz Biotechnology Inc.)를 포함할 수 있다. 알려진 태그 서열은 Terpe(2003) Appl. Microbiol. Biotechnol. 60 523-533에서 검토된다. 바람직한 구현예에서, YPYDVPDYA와 같은 혈구응집소(haemagglutinin, HA) 태그가 사용될 수 있다.
변형된 T 세포에서 발현되는 cAMP PDE 또는 이의 단편은 이종 핵산에 의해 암호화되는 재조합 단백질이다. 즉, cAMP PDE는 재조합 기법에 의해 T 세포의 게놈 내로 통합된 핵산을 암호화하는 것으로부터 발현된다. 변형된 T 세포에서의 cAMP 신호전달은 비변형된 T 세포에서의 cAMP 신호전달에 비하여 감소될 수 있다. 일부 구현예에서, 변형된 T 세포에서의 cAMP PDE 활성은 비변형된 T 세포에서의 cAMP PDE 활성보다 적어도 5배, 적어도 10배 또는 적어도 100배 높을 수 있다.
cAMP PDE 또는 이의 단편을 발현하도록 T 세포를 변형시키는 것은 cAMP PDE 또는 이의 단편을 암호화하는 이종 핵산을 T 세포 내로 도입하는 것을 포함할 수 있다. 이종 핵산을 T 세포 내로 도입 및 발현시키기 위한 적합한 방법은 해당 기술 분야에서 잘 알려져 있으며, 하기에서 좀 더 자세히 설명된다.
도입 후, 본원에 기재된 바와 같은 변형된 T 세포는 cAMP PDE 또는 이의 단편을 암호화하는 이종 핵산의 하나 이상의 카피를 포함할 수 있다.
본원에 기재된 바와 같은 변형된 T 세포는 또한 암세포에 특이적으로 결합하는 항원 수용체를 발현한다.
항원 수용체는 T 세포 수용체(TCR)일 수 있다. TCR은 전형적으로 불변 CD3 사슬 분자를 갖는 복합체로서 발현되는 높은 가변 알파(α) 및 베타(β) 사슬을 포함하는, 이황화-결합 막 고정 이형 이량체 단백질이다. 이러한 유형의 TCR을 발현하는 T 세포는 α:β(또는 αβ) T 세포로 지칭된다. 소수의 T 세포는 가변 감마(γ) 및 델타(δ) 사슬을 포함하는 대안적인 TCR을 발현하며, γδ T 세포로 지칭된다.
적합한 TCR은 종양 항원의 펩티드 단편을 표출하는 암세포의 표면상의 주조직 적합성 복합체(MHC)에 특이적으로 결합한다. MHC는 획득 면역계(acquired immune system)가 “외인성(foreign)” 분자를 인식할 수 있게 하는 일련의 세포-표면 단백질이다. 단백질은 세포 내에서 분해되어 MHC에 의해 세포의 표면에 나타난다. 바이러스성 또는 암 관련 펩티드와 같은 “외인성” 펩티드를 표출하는 MHC는 세포 파괴 경로를 촉진하는 적절한 TCR을 갖는 T 세포에 의해 인식된다. 암세포의 표면상의 MHC는 종양 항원, 즉 상응하는 비-암세포가 아닌 암세포 상에 존재하는 항원의 펩티드 단편을 표출할 수 있다. 이들 펩티드 단편을 인식하는 T 세포는 암세포에 세포독성 효과를 발휘할 수 있다.
일부 구현예에서, 암세포에 특이적으로 결합하는 TCR은 T 세포(즉, 내생적 TCR)에 의해 자연적으로 발현될 수 있다. 예를 들어, T 세포는 종양 침윤 림프구(Tumour Infiltrating Lymphocyte, TIL)일 수 있다. TIL은 표준 기법을 이용하여 암 질환에 걸린 개체로부터 수득될 수 있다.
더 바람직하게는, TCR은 T 세포에 의해 자연적으로 발현되지는 않는다(즉, TCR은 외생적(exogenous) 또는 이종성이다). 이종 TCR은 αβTCR 이형 이량체를 포함할 수 있다. 적합한 이종 TCR은 종양 항원을 발현하는 암세포에 특이적으로 결합할 수 있다. 예를 들어, T 세포는 특정 암 환자의 암세포에 의해 발현되는 종양 항원의 펩티드 단편을 표출하는 MHC에 특이적으로 결합하는 이종 TCR을 발현하도록 변형될 수 있다. 암 환자의 암세포에 의해 발현되는 종양 항원은 표준 기법을 이용하여 확인될 수 있다.
이종 TCR은 합성 또는 인공 TCR, 즉 자연에 존재하지 않는 TCR일 수 있다. 예를 들어, 이종 TCR은 종양 항원에 대한 이의 친화력 또는 결합력(avidity)을 증가시키도록 조작(즉, 친화력이 증가된 TCR)될 수 있다. 친화력이 증가된 TCR은 자연 발생적인 TCR에 비하여 하나 이상의 돌연변이, 예를 들어 TCR α 및 β 사슬의 가변 영역의 초가변 상보성 결정 영역(complementarity determining region, CDR) 내에 하나 이상의 돌연변이를 포함할 수 있다. 이들 돌연변이는 암세포에 의해 발현되는 종양 항원의 펩티드 단편을 표출하는 MHC에 대한 TCR의 친화력을 증가시킨다. 친화력이 증가된 TCR을 생성하는 적합한 방법은 파지 또는 효모 표출(display)을 이용한 TCR 돌연변이체의 스크리닝 라이브러리(screening library)를 포함하며, 해당 기술 분야에 잘 알려져 있다(예를 들어, Robbins et al. J Immunol(2008) 180(9):6116; San Miguel et al.(2015) Cancer Cell 28(3) 281-283; Schmitt et al.(2013) Blood 122 348-256; Jiang et al.(2015) Cancer Discovery 5 901을 참조).
바람직한 친화력이 증가된 TCR은 종양 항원 NY-ESO1, PRAME, 알파-태아단백질(alpha-fetoprotein, AFP), MAGE A4, MAGE A1, MAGE A10 및 MAGE B2 중 하나 이상을 발현하는 암세포에 결합할 수 있다.
대안적으로, 항원 수용체는 키메라 항원 수용체(chimeric antigen receptor, CAR)일 수 있다. CAR은 단일-사슬 가변 단편(single-chain variable fragment, scFv)과 같은 면역글로불린 항원 결합 도메인을 함유하도록 조작되는 인공 수용체이다. CAR은 예를 들어, TCR CD3 막관통 영역 및 엔도도메인(endodomain)에 융합된 scFv를 포함할 수 있다. scFv는 약 10개 내지 25개의 아미노산의 짧은 링커 펩티드와 연결될 수 있는 면역글로불린의 중쇄(VH) 및 경쇄(VL) 가변 영역을 가진 융합 단백질이다(Huston J.S. et al. Proc Natl Acad Sci USA 1988; 85(16):5879-5883). 링커는 유연성(flexibility)을 위해 글리신이 풍부할 수 있고, 가용성을 위해 세린 또는 트레오닌이 풍부할 수 있으며, VH의 N-말단을 VL의 C-말단에 또는 그 반대로 연결할 수 있다. scFv는 소포체 및 이어서 T 세포 표면으로 단백질을 유도하기(directed) 위해 신호 펩티드에 의해 선행될 수 있다. CAR에서, scFv는 TCR 막관통 및 엔도도메인에 융합될 수 있다. 유연한 스페이서(spacer)가 scFv 및 TCR 막관통 도메인 사이에 포함되어 가변 배향(variable orientation) 및 항원 결합을 할 수 있게 한다. 엔도도메인은 수용체의 기능적인 신호-전송 도메인이다. CAR의 엔도도메인은 예를 들어, CD3 ζ-사슬로부터의 또는 CD28, 41BB 또는 ICOS와 같은 수용체로부터의 세포 내 신호전달 도메인을 포함할 수 있다. CAR은, 예를 들어 CD3z-CD28-41BB 또는 CD3z-CD28-OX40일 수 있지만 이에 한정되지 않는, 다중 신호전달 도메인을 포함할 수 있다.
CAR은 암세포에 의해 발현되는 종양-특이적 항원에 특이적으로 결합할 수 있다. 예를 들어, T 세포는 특정 암 환자의 암세포에 의해 발현되는 종양 항원에 특이적으로 결합하는 CAR을 발현하도록 변형될 수 있다. 암 환자의 암세포에 의해 발현되는 종양 항원은 표준 기법을 이용하여 확인될 수 있다.
이종 TCR 또는 CAR과 같은 이종 항원 수용체의 발현은 T 세포가 암에 걸린 개체의 암세포의 표면상에 존재하는 하나 이상의 종양 항원을 인식하거나 개선된 인식을 나타낼 수 있도록, T 세포의 면역원성 특이성을 변경시킬 수 있다.
일부 구현예에서, T 세포는 이종 항원 수용체의 부재 시 암세포에 대하여 감소된 결합을 나타내거나 결합을 나타내지 않을 수 있다. 예를 들어, 이종 항원 수용체의 발현은 비변형된 T 세포에 비하여 변형된 T 세포의 암세포 결합의 친화력 및/또는 특이성을 증가시킬 수 있다.
용어 “이종”은 숙주 세포와 같은 특정 생물학적 시스템에 대해 외인성이고, 해당 시스템에 자연적으로 존재하지 않는 폴리펩티드 또는 핵산을 지칭한다. 이종 폴리펩티드 또는 핵산은 인공적인 수단에 의해, 예를 들어 재조합 기법을 이용하여 생물학적 시스템에 도입될 수 있다. 예를 들어, 폴리펩티드를 암호화하는 이종 핵산은 이어서 숙주 세포를 형질전환시켜 폴리펩티드를 형성하는 적합한 발현 구조물 내로 삽입될 수 있다. 이종 폴리펩티드 또는 핵산은 합성 또는 인공적일 수 있거나, 또는 상이한 종 또는 세포 유형과 같은 상이한 생물학적 시스템 내에 존재할 수 있다. 내생적 폴리펩티드 또는 핵산은 숙주 세포와 같은 특정 생물학적 시스템에 고유하며, 해당 시스템에 자연적으로 존재한다. 재조합 폴리펩티드는 인공적인 수단에 의해, 예를 들어 재조합 기법을 이용하여 세포 내로 도입된 이종 핵산으로부터 발현된다. 재조합 폴리펩티드는 세포 내에 자연적으로 존재하는 폴리펩티드와 동일할 수 있거나, 또는 해당 세포 내에 자연적으로 존재하는 폴리펩티드와 상이할 수 있다.
T 세포는 암 환자의 암세포에 특이적으로 결합하는 이종 항원 수용체를 발현하도록 변형될 수 있다. 이후에 암 환자는 변형된 T 세포로 치료될 수 있다. 변형된 T 세포로 치료하기에 적합한 암 환자는
암에 걸린 개체로부터 암세포의 샘플을 수득하는 단계; 및
암세포가 변형된 T 세포에 의해 발현되는 항원 수용체에 결합하는 것으로 확인하는 단계
를 포함하는 방법에 의해 확인될 수 있다.
암세포는 암세포에 의해 발현되는 하나 이상의 종양 항원을 확인함으로써 항원 수용체에 결합하는 것으로 확인될 수 있다. 암에 걸린 개체로부터 수득된 암세포의 표면상의 항원을 확인하는 방법은 해당 기술 분야에 잘 알려져 있다.
일부 구현예에서, 특정 암 환자를 치료하기에 적합한 이종 항원 수용체는
암에 걸린 개체로부터 암세포의 샘플을 수득하고;
암세포에 특이적으로 결합하는 항원 수용체를 확인함으로써 확인될 수 있다.
암세포에 특이적으로 결합하는 항원 수용체는 예를 들어, 암세포에 의해 발현되는 하나 이상의 종양 항원을 확인함으로써 확인될 수 있다. 암에 걸린 개체로부터 수득된 암세포의 표면상의 항원을 확인하는 방법은 해당 기술 분야에 잘 알려져 있다. 하나 이상의 종양 항원에 결합하거나 하나 이상의 항원의 MHC-표출 펩티드 단편에 결합하는 항원 수용체는 예를 들어, 공지된 특이성의 항원 수용체로부터 또는 다양한 특이성을 갖는 항원 수용체의 패널 또는 라이브러리를 스크리닝함으로써 확인될 수 있다. 하나 이상의 정의된 종양 항원을 갖는 암세포에 특이적으로 결합하는 항원 수용체는 통상적인 기법을 이용하여 생성될 수 있다.
T 세포는 본원에 기재된 바와 같이 확인된 항원 수용체를 발현하도록 변형될 수 있다.
본원에 기재된 바와 같은 치료에 적합한 개체의 암세포는 항원을 발현할 수 있고, 항원 수용체에 결합하기에 정확한 HLA 유형일 수 있다.
암세포는 하나 이상의 항원(즉, 종양 항원)의 발현에 의해 개체의 정상 체세포와 구별될 수 있다. 개체의 정상 체세포는 하나 이상의 항원을 발현하지 않거나, 또는 상이한 조직에서 및/또는 상이한 발단 단계에서 상이한 방식으로, 예를 들어 더 낮은 수준으로 항원을 발현할 수 있다. 종양 항원은 개체의 면역 반응을 유발할 수 있다. 특히, 종양 항원은 종양 항원을 발현하는 개체의 암세포에 대해 T 세포-매개성 면역 반응을 유발할 수 있다. 환자의 암세포에 의해 발현되는 하나 이상의 종양 항원은 변형된 T 세포 상의 이종 수용체에 대하여 표적 항원으로서 선택될 수 있다.
암세포에 의해 발현되는 종양 항원은 예를 들어, 암-생식세포 계열(cancer-germ line) 유전자, 예컨대 MAGE-A1, MAGE-A2, MAGE- A3, MAGE-A4, MAGE-A5, MAGE-A6, MAGE-A7, MAGE-A8, MAGE-A9, MAGE-A10, MAGE-A11, MAGE-A12, GAGE-I, GAGE-2, GAGE-3, GAGE-4, GAGE-5, GAGE-6, GAGE-7, GAGE-8, BAGE-I, RAGE-1, LB33/MUM-1, PRAME, NAG, MAGE-Xp2(MAGE-B2), MAGE-Xp3(MAGE-B3), MAGE-Xp4(MAGE-B4), MAGE-C1/CT7, MAGE-C2, NY-ESO-I, LAGE-I, SSX-I, SSX-2(HOM-MEL-40), SSX-3, SSX-4, SSX-5, SCP-I 및 XAGE 그리고 이의 면역원성 단편에 의해 암호화되는 암-고환(CT) 항원을 포함할 수 있다(Simpson et al. Nature Rev(2005) 5, 615-625, Gure et al., Clin Cancer Res(2005) 11, 8055-8062; Velazquez et al., Cancer Immun(2007) 7, 1 1 ; Andrade et al., Cancer Immun(2008) 8, 2; Tinguely et al., Cancer Science(2008); Napoletano et al., Am J of Obstet Gyn(2008) 198, 99 e91-97).
다른 종양 항원은 예를 들어, 과발현, 상향조절 또는 돌연변이된 단백질 및 분화 항원(differentiation antigen), 구체적으로 멜라닌세포 분화 항원, 예컨대 p53, 라스(ras), CEA, MUC1, PMSA, PSA, 티로시나아제(tyrosinase), 멜란(Melan)-A, MART-1, gp100, gp75, 알파-액티닌-4, Bcr-Abl 융합 단백질, Casp-8, 베타-카테닌, cdc27, cdk4, cdkn2a, coa-1, dek-can 융합 단백질, EF2, ETV6-AML1 융합 단백질, LDLR-푸코실전달효소AS 융합 단백질, HLA-A2, HLA-A11, hsp70-2, KIAAO205, Mart2, Mum-2 및 3, 네오(neo)-PAP, 미오신 클라스 I, OS-9, pml-RAR.알파. 융합 단백질, PTPRK, K-라스, N-라스, 3탄당인산 이성질체화효소, GnTV, Herv-K-mel, NA-88, SP17, 및 TRP2-Int2, (MART-I), E2A-PRL, H4-RET, IGH-IGK, MYL-RAR, 엡스타인-바(Epstein Barr) 바이러스 항원, EBNA, 인유두종 바이러스(human papillomavirus, HPV) 항원 E6 및 E7, TSP-180, MAGE-4, MAGE-5, MAGE-6, p185erbB2, p180erbB-3, c-met, nm-23H1, PSA, TAG-72-4, CA 19-9, CA 72-4, CAM 17.1, NuMa, K-라스, 알파.-태아단백질, 13HCG, BCA225, BTAA, CA 125, CA 15-3(CA 27.29＼BCAA), CA 195, CA 242, CA-50, CAM43, CD68＼KP1, CO-029, FGF-5, G250, Ga733(EpCAM), HTgp-175, M344, MA-50, MG7-Ag, MOV18, NB＼170K, NY-CO-1, RCAS1, SDCCAG16, TA-90(Mac-2 결합 단백질\시클로필린 C-관련 단백질), TAAL6, TAG72, TLP, TPS, 및 TRP-1, TRP-2와 같은 티로시나아제 관련 단백질을 포함한다.
다른 종양 항원은 “스트레스를 받은(stressed)” 암세포에 의해 사용되는 비-AUG 번역 개시 매커니즘에 의해 생성되는 프레임 외(out-of-frame) 펩티드-MHC 복합체를 포함한다(Malarkannan et al. Immunity 1999 Jun; 10(6):681-90).
다른 종양 항원은 해당 기술 분야에 잘 알려져 있다(예를 들어, WO00/20581; Cancer Vaccines and Immunotherapy(2000) Eds Stern, Beverley and Carroll, Cambridge University Press, Cambridge를 참조). 이러한 종양 항원의 서열은 공용 데이터베이스에서 쉽게 입수 가능하지만, 또한 WO 1992/020356 A1, WO 1994/005304 A1, WO 1994/023031 A1, WO 1995/020974 A1, WO 1995/023874 A1 및 WO 1996/026214 A1에서도 찾을 수 있다.
바람직한 종양 항원은 NY-ESO1, PRAME, 알파-태아단백질(AFP), MAGE A4, MAGE A1, MAGE A10 및 MAGE B2, 가장 바람직하게는 NY-ESO-1 및 MAGE-A10을 포함한다.
NY-ESO-1은 암/고환(CT) 패밀리의 인간 종양 항원이며, 흑색종, 전립선, 이행(transitional) 세포 방광, 유방, 폐, 갑상선, 위, 두경부 및 자궁경부 암종을 포함하는 다양한 암에서 흔히 발현된다(van Rhee F. et al. Blood 2005; 105(10): 3939-3944). 또한, NY-ESO-1의 발현은 주로 생식 세포에 국한되며, 체세포에서는 발현되지 않는다(Scanlan M.J. et al. Cancer Immun. 2004; 4(1)). NY-ESO-1을 발현하는 암세포에 결합하는 적합한 친화력이 증가된 TCR은 NY-ESO-1c259를 포함한다.
NY-ESO-1c259는 친화력이 증가된 TCR이며, 야생형 TCR에 비하여 알파 사슬 95:96LY의 위치 95 및 96에서 돌연변이된다. NY-ESO-1c259는 비변형 야생형 TCR에 비하여 증가된 친화력을 가지고, HLA-A2+ 클라스 1 대립 형질 유전자(allele)의 맥락에서 인간 암 고환 Ag NY-ESO-1(SLLMWITQC)의 아미노산 잔기 157-165에 상응하는 펩티드에 결합한다(Robbins et al. J Immunol(2008) 180(9):6116).
MAGE-A10은 CT 항원의 MAGE-A 패밀리의 높은 면역원성 구성원이며, 생식 세포에서 발현되지만 건강한 조직에서는 발현되지 않는다. MAGE-A10은 다수의 종양으로부터 높은 비율의 암세포 내에서 발현된다(Schultz-Thater E. et al. Int J Cancer. 2011; 129(5):1137-1148).
T 세포의 변형 및 그 이후의 증식은 시험관 내(in vitro) 및/또는 생체 외(ex vivo)에서 수행될 수 있다.
T 세포는 이종 암호화 핵산을 T 세포 내로 도입함으로써 cAMP PDE 또는 cAMP PDE의 단편, 및 선택적으로 항원 수용체를 발현하도록 변형될 수 있다.
일부 구현예에서, cAMP PDE 또는 cAMP PDE의 단편 및 항원 수용체를 암호화하는 이종 핵산은 동일한 발현 벡터에서 T 세포 내로 도입된다. 이는 형질도입 후에 두 유전자를 발현하는 T 세포의 비율을 증가시키는데 도움이 될 수 있다. 다른 구현예에서, cAMP PDE 및 항원 수용체를 암호화하는 이종 핵산은 상이한 발현 벡터에서 T 세포 내로 도입될 수 있다.
cAMP PDE 또는 이의 단편 및 항원 수용체는 융합 단백질과 동일한 전사체에서 발현되고, 이후에는 예를 들어 부위-특이적 단백질 분해 효소를 이용하여 분리될 수 있다. 대안적으로, cAMP PDE 또는 이의 단편 및 항원 수용체는 상이한 전사체에서 발현될 수 있다.
예를 들어, 절단된 cAMP PDE 및 NY-ESO TCR을 포함하는 융합 단백질이 발현될 수 있다. 융합 단백질은 서열번호 6의 아미노산 서열 또는 이의 변이체를 포함할 수 있고, 서열번호 5의 뉴클레오티드 서열 또는 이의 변이체를 갖는 핵산에 의해 암호화될 수 있다. 대안적으로, 절단된 cAMP PDE 및 MAGE-A4 TCR을 포함하는 융합 단백질이 발현될 수 있다. 융합 단백질은 서열번호 8의 아미노산 서열 또는 이의 변이체를 포함할 수 있고, 서열번호 7의 뉴클레오티드 서열 또는 이의 변이체를 갖는 핵산에 의해 암호화될 수 있다.
항원 수용체를 암호화하는 핵산은 수용체의 모든 서브유닛를 암호화할 수 있다. 예를 들어, TCR을 암호화하는 핵산은 TCR α 사슬을 암호화하는 뉴클레오티드 서열 및 TCR β 사슬을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다.
핵산은 임의의 편리한 방법에 의해 T 세포 내로 도입될 수 있다. 이종 핵산을 T 세포 내로 도입하거나 통합시킬 때는, 해당 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자들에게 잘 알려진 특정한 고려 사항을 참작해야 한다. 삽입될 핵산은 T 세포에서 전사를 추진할 효과적인 조절 요소를 함유하는 구조물 또는 벡터 내로 조립되어야 한다. 생성자(constructor) 벡터를 T 세포 내로 수송하는 데 적합한 기법은 해당 기술 분야에서 잘 알려져 있으며, 인산칼슘 형질감염, DEAE-덱스트란, 전기 천공법, 리포솜-매개성 형질감염 및 레트로바이러스 또는 백시니아나 렌티바이러스와 같은 기타 바이러스를 이용한 형질도입을 포함한다. 예를 들어, 고체상 형질도입은 레트로넥틴-코팅 레트로바이러스 벡터가 미리 로딩된 조직 배양 플레이트 상에서의 배양에 의해 선택 없이 수행될 수 있다.
바람직하게는, cAMP PDE 또는 이의 단편, 및 선택적으로 항원 수용체를 암호화하는 핵산은 바이러스 벡터, 가장 바람직하게는 감마 레트로바이러스 벡터 또는 VSVg-위형(pseudotype) 렌티바이러스 벡터와 같은 렌티바이러스 벡터 내에 함유될 수 있다. T 세포는 핵산을 포함하는 바이러스 입자와의 접촉에 의해 형질 도입될 수 있다. 형질도입을 위한 바이러스 입자는 알려진 방법에 따라 생성될 수 있다. 예를 들어, HEK293T 세포는 코딩 핵산을 포함하는 렌티바이러스 벡터뿐만 아니라 바이러스 패키징 및 외피(envelope) 요소들을 암호화하는 플라스미드로 형질 감염될 수 있다. VSVg-위형 바이러스 벡터는 위형의 바이러스 입자를 생성하기 위해 수포성 구내염 바이러스(vesicular stomatitis virus, VSVg)의 바이러스 외피 당단백질 G와 결합하여 생성될 수 있다.
예를 들어, 핵산 구조물의 제조, DNA의 세포 내로의 도입 및 유전자 발현에서 핵산의 조작 및 변형을 위해 알려진 많은 기술 및 프로토콜은 문헌[Protocols in Molecular Biology, Second Edition, Ausubel et al. eds. John Wiley & Sons, 1992]에 상세히 기술된다.
핵산의 T 세포에 도입된 후에, 변형된 T 세포의 초기 집단은 변형된 T 세포가 증식하여 집단을 확장시키도록 시험관 내(in vitro)에서 배양될 수 있다.
변형된 T 세포 집단은 예를 들어, 항-CD3 및 항-CD28로 코팅된 자성 비드를 이용하여 증식될 수 있다. 변형된 T 세포는 증식된 집단을 생성하기 위해 임의의 편리한 기법을 이용하여 배양될 수 있다. 적합한 배양 시스템은 교반 탱크 발효기, 공기부양식 발효기, 회전 보틀, 배양 자루 또는 접시 및 기타 생물 반응기, 특히 중공사(hollow fibre) 생물반응기를 포함한다. 이러한 시스템의 이용은 해당 기술 분야에 잘 알려져 있다.
생체 외(ex vivo) T 세포의 증식에 사용하기에 적합한 수많은 배양 배지, 특히 AIM-V, 이스코브(Iscoves) 배지 및 RPMI-1640(Invitrogen-GIBCO)과 같은 완전한 배지가 이용 가능하다. 배지는 혈청, 혈청 단백질 및 선택적 제제와 같은 기타 인자들이 보충될 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 2 mM 글루타민, 10% FBS, 25 mM HEPES, pH 7.2, 1% 페니실린-스트렙토마이신 및 55 μM β-머캅토에탄올을 함유하고, 선택적으로 20 ng/ml 재조합 IL-2가 보충된 RPMI-1640 배지가 사용될 수 있다. 배양 배지는 통상적인 실험에 의해 통상의 지식을 가진 자가 쉽게 결정할 수 있는 표준 농도에서 상술된 작용 인자 또는 길항 인자들로 보충될 수 있다.
편리하게는, 세포는 적합한 배양 배지 내에 5% CO2 를 함유하는 가습 환경하에 37℃에서 배양된다.
T 세포 및 기타 포유류 세포의 배양을 위한 방법 및 기법은 해당 기술 분야에서 잘 알려져 있다(예를 들어, Basic Cell Culture Protocols, C. Helgason, Humana Press Inc. U.S.(15 Oct 2004) ISBN: 1588295451; Human Cell Culture Protocols(Methods in Molecular Medicine S.) Humana Press Inc., U.S.(9 Dec 2004) ISBN: 1588292223; Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique, R. Freshney, John Wiley & Sons Inc(2 Aug 2005) ISBN: 0471453293, Ho WY et al J Immunol Methods.(2006) 310:40-52를 참조).
일부 구현예에서, 변형된 T 세포를 집단으로부터 분리 및/또는 정제하는 것이 편리할 수 있다. FACS 및 항체 코팅된 자성 입자를 포함하는 임의의 편리한 기법이 사용될 수 있다.
선택적으로, 본원에 기재된 바와 같이 생성된 변형된 T 세포 집단은 사용 전에, 예를 들어 동결건조(lyophilisation) 및/또는 냉동보존(cryopreservation)에 의해 저장될 수 있다.
변형된 T 세포 집단은 완충제, 담체, 희석제, 보존제 및/또는 약학적으로 허용 가능한 부형제와 같은 기타 시약들과 혼합될 수 있다. 적합한 시약은 하기에서 더욱 상세히 설명된다. 본원에 기재된 방법은 변형된 T 세포 집단을 약학적으로 허용 가능한 부형제와 혼합하는 단계를 포함할 수 있다.
투여(예를 들어, 주입에 의한)에 적합한 약학적 조성물은 항산화제, 완충제, 보존제, 안정화제, 세균 발육 저지제(bacteriostat) 및 대상(intended) 수용자의 혈액과 등장성인 제형을 부여하는 용질을 함유할 수 있는, 수성 및 비수성 등장성 용액, 무-발열원(pyrogen-free) 용액, 멸균 주사 용액; 및 현탁제 및 증점제를 포함할 수 있는 수성 및 비수성 멸균 현탁액을 포함한다. 이러한 제형에 사용하기 적합한 등장성 비히클의 예는 염화나트륨 주사액, 링거액 또는 링거 젖산 주사액을 포함한다. 적합한 비히클은 표준 약학 문서, 예를 들어 문헌[Remington’s Pharmaceutical Sciences, 18th edition, Mack Publishing Company, Easton, Pa., 1990]에서 찾을 수 있다.
일부 바람직한 실시예에서, 변형된 T 세포는 개체 내로 정맥 주입하기에 적합한 약학 조성물로 제형화될 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 “약학적으로 허용 가능한”은 올바른 의학적 판단의 범위 내에서 과도한 독성, 자극, 알레르기 반응 또는 기타 문제나 합병증 없이 대상체(예를 들어, 인간)의 조직과 접촉하여 사용하기에 적합하고, 합리적인 이익/위험 비율에 비례하는 화합물, 물질, 조성물 및/또는 제형과 관련된다. 각각의 담체, 부형제 등은 또한 제형의 다른 성분과 상용성(compatible)을 갖는 의미에서 “허용 가능”해야 한다.
본 발명의 양태는 재조합 cAMP PDE 또는 이의 단편, 및 암세포에 특이적으로 결합하는 항원 수용체를 발현하는 변형된 T 세포 집단을 제공한다. 적합한 집단은 상술된 방법에 의해 생성될 수 있다.
변형된 T 세포 집단은 약제로서 사용하기 위한 것일 수 있다. 예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 변형된 T 세포 집단은 암 면역요법, 예를 들어 입양 T 세포 요법에서 사용될 수 있다.
본 발명의 다른 양태는 암 치료용 약제의 제조를 위한 본원에 기재된 바와 같은 변형된 T 세포 집단, 암 치료를 위한 본원에 기재된 바와 같은 변형된 T 세포 집단의 용도를 제공하며, 암을 치료하는 방법은 이를 필요로 하는 개체에 본원에 기재된 바와 같은 변형된 T 세포 집단을 투여하는 단계를 포함할 수 있다.
변형된 T 세포 집단은 자가 유래(autologous)일 수 있으며, 즉 변형된 T 세포는 이후에 변형된 T 세포가 투여되는 개체와 원래 동일한 개체로부터 수득된다(즉, 공여 개체 및 수용 개체가 동일함). 개체로의 투여에 적합한 변형된 T 세포 집단은 개체로부터 수득된 최초 T 세포 집단을 제공하는 단계; cAMP PDE 또는 이의 단편 및 개체 내 암세포에 특이적으로 결합하는 항원 수용체를 발현하도록 T 세포를 변형시키는 단계; 및 변형된 T 세포를 배양하는 단계를 포함하는 방법에 의해 생성될 수 있다.
변형된 T 세포 집단은 동종 이계(allogeneic)일 수 있으며, 즉 변형된 T 세포는 이후에 변형된 T 세포가 투여되는 개체와 원래 상이한 개체로부터 수득된다(즉, 공여 개체 및 수용 개체가 상이함). 공여 개체 및 수용 개체는 GVHD 및 기타 바람직하지 않은 면역 효과를 피하기 위해 HLA가 일치할 수 있다. 수용 개체로의 투여에 적합한 변형된 T 세포 집단은 공여 개체로부터 수득된 최초 T 세포 집단을 제공하는 단계; cAMP PDE 또는 이의 단편 및 수용 개체 내 암세포에 특이적으로 결합하는 항원 수용체를 발현하도록 T 세포를 변형시키는 단계; 및 변형된 T 세포를 배양하는 단계를 포함하는 방법에 의해 생성될 수 있다.
변형된 T 세포의 투여 후에, 수용 개체는 수용 개체 내 암세포에 대해 T 세포-매개성 면역 반응을 보일 수 있다. 이는 개체 내 암 질환에 유익한 효과를 가질 수 있다.
암 질환은 악성 암세포의 비정상적 증식을 특징으로 할 수 있으며, AML, CML, ALL 및 CLL과 같은 백혈병; 호지킨 림프종, 비-호지킨 림프종 및 다발성 골수종과 같은 림프종; 및 육종, 피부암, 흑색종, 방광암, 뇌암, 유방암, 자궁암, 난소암, 전립선암, 폐암, 결장암, 자궁경부암, 간암, 두경부암, 식도암, 췌장암, 신장암, 부신암, 위암, 고환암, 담낭암/담도암, 갑상선암, 흉선암, 뼈암 및 대뇌암과 같은 고형암뿐만 아니라 원발부위 불명암(cancer of unknown primary, CUP)을 포함할 수 있다.
개체 내 암세포는 개체 내에서 정상 체세포와 면역학적으로 구별 될 수 있다(즉, 암 종양은 면역원성일 수 있음). 예를 들어, 암세포는 암세포에 의해 발현되는 하나 이상의 항원에 대해 개체에서 전신 면역 반응을 유발하는 능력이 있을 수 있다. 면역 반응을 유발하는 종양 항원은 암세포에 특이적일 수 있거나, 개체 내 하나 이상의 정상 세포에 의해 공유될 수 있다.
상술된 바와 같은 치료에 적합한 개체는 설치류(예를 들어, 기니피그, 햄스터, 쥐, 마우스), 쥣과(예를 들어, 마우스), 갯과(예를 들어, 개), 고양잇과(예를 들어, 고양이), 말과(예를 들어, 말), 영장류, 원숭잇과(예를 들어, 원숭이 또는 유인원), 원숭이(예를 들어, 마모셋, 개코원숭이), 유인원(예를 들어, 고릴라, 침팬치, 오랑우탄, 긴팔원숭이) 또는 인간과 같은 포유류일 수 있다.
바람직한 구현예에서, 개체는 인간이다. 다른 바람직한 구현예에서, 비-인간 포유류, 특히 인간에서의 치료 효능을 입증하기 위한 모델로서 기존에 이용되는 포유류(예를 들어, 쥣과, 영장류, 돼지과, 갯과 또는 토끼 동물)가 사용될 수 있다.
일부 구현예에서, 개체는 최초 암 치료 후에 미세 잔존 질환(minimal residual disease, MRD)을 가질 수 있다.
암에 걸린 개체는 해당 기술 분야에서 알려진 임상 표준에 따라 암을 진단하기에 충분한 적어도 하나의 인식 가능한 징후, 증상 또는 실험실 발견을 보일 수 있다. 이러한 임상 표준의 예는 Harrison’s Principles of Internal Medicine, 15th Ed., Fauci AS et al., eds., McGraw-Hill, New York, 2001과 같은 의학 문서에서 찾을 수 있다. 일부 경우에서, 개체 내 암의 진단은 개체로부터 수득된 체액 또는 조직의 샘플에서 특정한 세포 유형(예를 들어, 암세포)의 확인을 포함할 수 있다.
치료는 인간이든 동물(예를 들어, 수의학적 적용)이든 상관없이 일부 바람직한 치료 효과, 예를 들어 질환 진행의 억제 또는 지연이 달성되고, 진행 속도의 감소, 진행 속도의 중단, 질환의 개선, 질환의 치유(cure) 또는 관해(remission)(부분 또는 전체), 질환에 대한 하나 이상의 증상 및/또는 징후의 예방, 지연, 완화 또는 저지, 또는 치료의 부재 시 예측되는 바를 넘어서는 대상체 또는 환자의 생존 연장을 포함하는 임의의 치료 및 치료요법일 수 있다.
치료는 또한 예방적일 수 있다(즉, 예방). 예를 들어, 암의 발병 또는 재발에 취약하거나 위험이 있는 개체는 본원에 기재된 바와 같이 치료될 수 있다. 이러한 치료는 개체의 암의 발병 또는 재발을 예방하거나 지연시킬 수 있다.
특히, 치료는 암 성장을 억제하고, 완전한 암의 관해를 포함하고/하거나 암 전이를 억제하는 것을 포함할 수 있다. 암 성장은 일반적으로 암 내에서 더 진행된 형태로의 변화를 나타내는 많은 지표 중 어느 하나를 지칭한다. 따라서, 암 성장의 억제를 측정하기 위한 지표는 암세포 생존의 감소, (예를 들어, 컴퓨터 단층 촬영(computed tomographic, CT), 초음파 검사 또는 다른 이미지 촬영 방법을 이용하여 판단된 바와 같은) 종양 부피 또는 형태의 감소, 종양 성장의 지연, 종양 맥관 구조의 파괴, 지연성 과민증 피부 검사의 개선된 성능, T 세포의 활성 증가 및 종양-특이적 항원의 수준 감소를 포함한다. 본원에 기술된 바와 같은 변형된 T 세포의 투여는 암 성장, 특히 대상체에 이미 존재하는 암의 성장에 저항하고/하거나 개체의 암 성장의 경향을 감소시키기 위한 개체의 능력을 개선시킬 수 있다.
변형된 T 세포 또는 변형된 T 세포를 포함하는 약학적 조성물은 전신적/말초적이든지 바람직한 작용 부위의 여부에 관계없이, 비경구, 예를 들어 주입에 의한 것을 포함하지만 이에 국한되지는 않는 임의의 편리한 투여 경로에 의해 대상체에게 투여될 수 있다. 주입은 바늘 또는 카테터를 통해 적합한 조성물로 T 세포를 투여하는 것을 포함한다. 전형적으로, T 세포는 근육 내 주사 및 경막 외 경로와 같은 기타 비-경구 경로를 통해 주입될 수 있지만, T 세포는 정맥 내 또는 피하로 주입된다. 적합한 주입 기법은 해당 기술 분야에서 잘 알려져 있으며, 치료에서 일반적으로 사용된다(예를 들어, Rosenberg et al., New Eng. J. of Med., 319:1676, 1988를 참조).
전형적으로, 투여되는 세포의 수는 체중 1kg당 약 105 내지 약 1010개이며, 전형적으로 개체 당 2x108 내지 2x1010개의 세포이며, 전형적으로 30분의 과정 동안 필요에 따라, 예를 들어 수일 내지 수주의 간격을 두고 치료를 반복한다. 변형된 T 세포 및 변형된 T 세포를 포함하는 조성물의 적절한 투여량은 환자마다 다를 수 있음은 이해될 것이다. 최적의 투여량을 결정하는 것은 일반적으로 본 발명의 치료의 임의의 위험 또는 해로운 부작용에 대한 치료적 이익 수준의 균형을 맞추는 것을 포함할 것이다. 선택되는 투여량의 수준은 특정 세포의 활성, 투여의 경로, 투여 시간, 세포의 손실 또는 비활성화의 비율, 치료의 지속기간, 기타 약물, 화합물, 및/또는 병용되는 물질, 그리고 환자의 연령, 성별, 체중, 상태, 일반적인 건강 및 이전 병력을 포함하지만 이에 국한되지는 않는 다양한 요인에 따라 좌우될 것이다. 일반적으로 투여량은 실질적으로 해롭거나 해로운 부작용을 초래하지 않으면서 원하는 효과를 달성하는 작용 부위에서 국소 농도를 달성할 것이지만, 세포의 양 및 투여 경로는 궁극적으로 의사의 재량에 따를 것이다.
변형된 T 세포는 단독으로 투여될 수 있는 반면, 일부의 경우에서 변형된 T 세포는 변형된 T 세포 집단의 생체 내(in vivo) 증식을 촉진하기 위해 표적 항원, 표적 항원을 표출하는 APC 및/또는 IL-2와 함께 투여되는 세포일 수 있다. 변형된 T 세포 집단은 하나 이상의 다른 치료요법, 예컨대 IL-2와 같은 사이토카인, 세포독성 화학요법, 방사능 그리고 항-B7-H3, 항-B7-H4, 항-TIM3, 항-KIR, 항-LAG3, 항-PD-1, 항-PD-L1 및 항-CTLA4 항체와 같은 체크포인트 억제제(checkpoint inhibitor)를 포함하는 면역 항암제와 병용하여 투여될 수 있다.
하나 이상의 다른 치료요법이 임의의 편리한 수단에 의해, 바람직하게는 변형된 T 세포의 투여 부위와는 별개인 부위에서 투여될 수 있다.
변형된 T 세포의 투여는 연속적이거나 간헐적으로(예를 들어, 적절한 간격의 분할된 양으로) 치료의 과정에 걸쳐 한 번의 용량으로 효과를 가져올 수도 있다. 가장 효과적인 투여 수단 및 투여량을 결정하는 방법은 해당 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 잘 알려져 있으며, 치료에 사용된 제형, 치료의 목적, 치료될 표적 세포 및 치료될 대상체에 따라 다를 수 있을 것이다. 담당 의사가 용량 수준 및 패턴을 선택하여 함에 따라 단일 또는 다중 투여를 수행할 수 있다. 바람직하게는, 변형된 T 세포는 적어도 1 x 109개의 T 세포의 단독 수혈(transfusion)로 투여된다.
본 발명의 다른 양태는 본원에 기재된 바와 같은 변형된 T 세포의 생성을 위한 핵산 및 다른 시약을 제공한다.
분리된 핵산은 암세포에 특이적으로 결합하는 항원 수용체를 암호화하는 뉴클레오티드 서열, 및 cAMP PDE 또는 cAMP PDE의 단편을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다.
코딩 서열은 동일하거나 상이한 촉진자 또는 다른 조절 요소들에 작동적으로 연결될 수 있다. 적합한 촉진자는 해당 기술 분야에서 잘 알려져 있으며, 인간 연장인자-1 알파(Human elongation factor-1 alpha, EF1α)와 같은 포유류 촉진자를 포함한다. 일부 구현예에서, 코딩 서열은 절단 인식 서열에 의해 분리될 수 있다. 이는 cAMP PDE 또는 이의 단편 및 항원 수용체로 하여금 퓨린과 같은 부위 특이적 단백질 분해효소에 의한 세포 내 절단을 거쳐 단일 융합체로서 발현되게 하여 두 개의 분리된 단백질을 생성하게 한다. 적합한 절단 인식 서열은 2A-퓨린 서열을 포함한다. 단일 융합의 예는 퓨린 절단 부위에 의해 분리된 MAGE-A4 TCR 및 N 말단 PDE7A 단편을 포함하는 서열번호 6; 및 퓨린 절단 부위에 의해 분리된 NY-ESO TCR 및 N 말단 PDE7A 단편을 포함하는 서열번호 8을 포함한다.
적합한 분리된 핵산의 예는 퓨린 절단 서열에 의해 분리된 MAGE-A4 TCR 및 N 말단 PDE7A 단편을 포함하는 융합을 암호화하는 서열번호 5; 및 퓨린 절단 부위에 의해 분리된 NY-ESO TCR 및 N 말단 PDE7A 단편을 포함한 융합을 암호화하는 서열번호 7을 포함한다.
항원 수용체 및 cAMP PDE 또는 이의 단편을 암호화하는 뉴클레오티드 서열은 동일한 발현 벡터에 위치할 수 있다. 예를 들어, 적합한 발현 벡터는 상술된 바와 같은 핵산을 포함할 수 있다. 한편, 코딩 서열은 분리된 발현 벡터에 위치할 수 있다.
적합한 벡터가 해당 기술 분야에서 잘 알려져 있으며, 상기에 더욱 상세히 설명된다.
촉진자 서열, 종결자 단편, 아데닐산중합반응 서열, 증폭자 서열, 표지 유전자 및 기타 적절한 서열을 포함하는 적절한 조절 서열을 함유하는 적합한 벡터가 선택되거나 구성될 수 있다. 바람직하게는, 벡터는 포유류 세포 내 핵산의 발현을 추진하기 위해 적절한 조절 서열을 함유한다. 벡터는 또한 대장균과 같은 박테리아 숙주 내에서 이의 선택, 발현 및 복제를 가능하게 하는 복제 원점(origins of replication), 촉진자 영역 및 선택 가능한 표지와 같은 서열을 포함할 수 있다. 바람직한 벡터는 VSVg-위형 자기-불활성화(self-inactivating) 벡터를 비롯하여, 렌티바이러스 벡터와 같은 레트로바이러스 벡터를 포함한다.
렌티바이러스와 같은 바이러스 벡터는 하나 이상의 바이러스 단백질에 의해 캡슐화된(encapsulated) 핵산 벡터를 포함하는 바이러스 입자 내에 함유될 수 있다. 바이러스 입자는 포유류 세포를 본원에 기재된 바와 같은 바이러스 벡터 및 하나 이상의 바이러스 패키징 및 엔벨로프(envelope) 벡터로 형질 도입하는 단계; 및 세포가 배지 내로 방출되는 렌티바이러스 입자를 생성하도록, 배양 배지에서 형질 도입된 세포를 배양하는 단계를 포함하는 방법에 의해 생성될 수 있다.
바이러스 입자의 방출 이후에, 바이러스 입자를 포함하는 배양 배지는 회수될 수 있으며, 선택적으로 바이러스 입자는 농축될 수 있다.
생성 및 선택적 농축 이후에, 바이러스 입자는 예를 들어, T 세포를 형질 도입하는데 사용할 준비가 되도록 -80℃로 동결시킴으로써 저장될 수 있다.
본 발명의 다른 양태 및 구현예는 용어 “포함하는(comprising)”이 용어 “이루어지는(consisting of)”으로 대체되는 상술된 양태 및 구현예, 그리고 용어 “포함하는”이 용어 “필수적으로 이루어지는(consisting essentially of)”으로 대체되는 상술된 양태 및 구현예를 제공한다.
본 출원은, 문맥상 달리 요구하지 않는 한, 임의의 상술된 양태 및 구현예의 모든 조합을 서로 개시하는 것으로 이해되어야 한다. 마찬가지로, 본 출원은, 문맥상 달리 요구하지 않는 한, 바람직한 및/또는 선택적인 특징의 모든 조합을 단독으로 또는 임의의 다른 양태와 함께 개시한다.
위의 구현예의 변형, 추가 구현예 및 이의 변형은 본 개시를 읽는 통상의 지식을 가진 자에게 분명할 것이며, 따라서 해당 변형은 본 발명의 범위 내에 있다.
본 명세서 내에서 언급된 모든 문서 및 서열 데이터베이스 항목은 어떤 용도로든 그 전체가 참조로서 본원에 포함된다.
본원에 사용된 “및/또는”은 두 개의 명시된 특징 또는 구성요소 각각을 단독으로 또는 함께 구체적으로 개시하는 것으로 이해되어야 한다. 예를 들어, “A 및/또는 B”는, 각각이 본원에서 개별적으로 제시되는 것처럼, (i) A, (ii) B, 및 (iii) A 및 B의 각각의 구체적인 개시로 간주되어야 한다.
본 발명의 특정한 양태 및 실시예는 예시로서 그리고 상술된 도면을 참조하여 앞으로 설명할 것이다.
실시예
1. 재료 및 방법
1.1 렌티바이러스 벡터 및 바이러스 입자 생성
렌티바이러스계는 EF1α 촉진자로부터의 NY-ESO1c259 TCR α- 및 β-사슬과 함께 N-말단 인간 인플루엔자 혈구응집소 태그를 함유하는 포스포디에스테라아제(phosphodiesterase, PDE) 4C 또는 PDE7A, 또는 PDE7A 또는 PDE7A의 단편을 모두 발현시키는데 사용되는 제3세대 VSVg-위형 자기-불활성화 벡터였다. 각각의 이식 유전자를 2A-퓨린 서열로 분리하였다.
플라스미드 pELNS-ADB1076은 TCR 상류에 PDE4C(도 1a) 또는 PDE7A(도 1b)를 포함한다. EF-1a 촉진자 및 하류 PDE 및 TCR 이식 유전자 외에도, 렌티바이러스 및 박테리아 플라스미드의 특징들을 나타내는 다양한 요소가 나타나 있다. 맵은 CLC 메인 워크벤치(Main Workbench) 소프트웨어 버전 7.6.1을 이용하여 생성하였다.
HEK 293T 세포를 터보펙트(Turbofect) 형질감염 시약(ThermoScientific)을 이용하여 렌티벡터 플라스미드뿐만 아니라 패키징 및 엔벨로프 요소를 암호화하는 3 플라스미드 시스템으로 형질감염시킴으로써 렌티바이러스 입자를 생성하였다. 형질감염 후 48~72시간이 지나서 상층액을 수집하고, 원심 분리하고 여과한 후, 10,000 x g로 밤새 농축하였다. 배지를 제거하여 렌티바이러스 입자가 비농축된 상층액과 비교하여 5~10배 농축되도록 하였다. 그런 다음, 렌티바이러스 제조물을 드라이아이스 상에서 빠르게 동결시키고, 다음 사용 시까지 -80℃에 저장하였다.
1.2 PBMC 분리 및 T 세포 증식
건강한 인간 지원자의 정맥혈로부터 분리된 PBMC를 CD14+ 세포 고갈 하에 놓이게 하고, IL-2의 존재하에 10% 소태아 혈청(foetal bovine serum, FBS), 1% 페니실린 및 스트렙토마이신 및 1% L-글루타민이 보충된 IMDM 배지(Gibco) 내에서 CD3/CD28 항체 코팅된 비드와 함께 밤새 배양한 후, HA-PDE7A, HA-PDE4C, PDE7A 또는 PDE7A의 단편과 함께 발현된 친화력이 증가된 NY-ESO1c259 TCR 또는 NY-ESO1c259 TCR을 발현하도록 렌티바이러스 형질도입을 하였다. 그런 다음, T 세포를 14일간 배양물에서 증식시키고, TCR 형질도입 수준을 Vβ13.1에 대한 염색에 의해 유세포 분석기로 평가하였다(TRBV 6-9).
렌티바이러스 형질도입은 Dull, T., et al(1998). J. Virol. 72, 8463-8471에 기재된 4 벡터계를 이용하여 수행하였다.
1.3 암세포
ATCC(CRL-1619)로부터 구매한 NY-ESO1-양성 A375 흑색종 세포를 10% FBS, 1% 페니실린 및 스트렙토마이신 및 1% L-글루타민(R10)이 보충된 RPMI 1640(Gibco)에서 배양하였다. A375 흑색종 세포를 트립신(Trypsin)/0.25% EDTA를 이용하여 수확하고 세척한 후, T 세포 활성화 분석시험에서 표적으로 사용하였다.
1.4 시약
아데노신, 프로스타글란딘 E2(PGE2) 및 포스콜린을 시그마-알드리치(Sigma Aldrich)로부터 구입하였다. 아데노신 분말을 PBS에 희석된 0.13 M NH4OH 중에 25 mM의 최종 농도로 희석하였다. 포스콜린을 100 mM로 디메틸-술폭시드(dimethyl-sulfoxide, DMSO) 중에 희석하였다. 프로스타글란딘 E2를 285 μM로 10% 에탄올을 함유하는 PBS 중에 희석하였다. 각각의 시약은 섹션 2에 지시된 최종 농도로 사용하였다.
1.5 IFN -γ ELISA 분석 및 사이토카인 측정
A375 흑색종 표적 세포를 수확하고 재현탁시킨 후, 96-웰 플랫 바텀(flat bottom) 플레이트에 웰당 50,000개의 표적 세포를 플레이팅하였다. T 세포를 증식 또는 저온보존하고, 해동 및 세척하여 신선하게 사용하였다. T 세포를 37℃의 R10 배지 에 약 2시간 동안 방치한 후, 웰당 120,000~200,000개 T 세포의 농도로 플레이팅하였다.
아데노신, PGE2 또는 포스콜린을 지시된 최종 농도로 첨가하여 최종 부피가 200 ㎕/웰이 되도록 하였다. 각각의 분석 조건을 3회씩 수행하였다. 세포를 37℃에서 48시간 동안 배양하고, 상층액을 채취한 후 -20℃에서 동결 및 저장하였다. 임의의 분석시험에 앞서, 플레이트를 해동 후 원심분리하였다. 그런 다음, 상층액을 이후 분석시험 시 사용하기 위해 새로운 96-웰 플레이트로 옮겼다.
96-웰 하프 에어리어(half area) 플레이트를 이용하는 제조사의 사용 설명서에 따라 인간 듀오세트(DuoSet) ELISA 키트(R&D Systems)를 이용하여 IFN-γ 농도를 결정하였다. 분석시험을 시판되는 TMB 기질 용액을 이용하여 진행하였고, 1M H2SO4로 반응을 중지하였다. 분석시험을 540 nm로 파장 보정이 설정된 스펙트로스타 오메가(Spectrostar Omega)를 이용하여 450 nm에서 판독하였다. 데이터를 스펙트로스타 데이터 분석 소프트웨어를 이용하여 분석하였다.
1.6 시간-분해(time-resolved) 세포독성 분석
인큐사이트(IncuCyte)™ FLR 기술(Essen Bioscience)은 37℃에서 실시간으로 현미경 관찰에 의해 카스파아제(caspase)-3/7 의존성 아포토시스의 직접적인 시각화를 가능하게 한다. 아포토시스의 동역학적(kinetic) 측정을 활성화된 카스파제-3/7 인식 모티프(DEVD)를 DNA 삽입 염료인 Nuncview™ 488에 결합시키는 셀플레이어™ 96-웰 키네틱 카스파제-3/7(CellPlayer™ 96-Well Kinetic Caspase-3/7) 시약(Essen Biosciences)을 이용하여 수행하였다. 조직 배양 배지에 첨가할 때, 이 불활성 및 비-형광성 기질은 활성화된 카스파제-3/7에 의해 절단된 세포막을 가로질러 DNA 염료의 방출 및 핵 DNA의 녹색 형광 염색으로 이어진다. 카스파제-3/7의 동역학적 활성화는 생세포 이미지 촬영을 이용하여 형태상으로 모니터링하고, mm2당 형광 객체(object)의 수로서 인큐사이트 객체 계수 알고리즘을 이용하여 정량화할 수 있다. 아포토시스성 T 세포는 100 ㎛2로 필터 임계치를 설정한 크기 배제에 의한 분석을 통해 게이트 아웃(gate out)된다.
인큐사이트 분석시험을 다음과 같이 수행하였다. 간단하게는, 분석시험을 설정하기 24시간 전, A375 흑색종 표적 세포를 50 ㎕ R10 내에 웰당 15,000~20,000개씩 플레이팅하였다. 분석시험 당일에 효과기 세포(effector cells)를 첨가하기에 앞서, 포스콜린 또는 PGE2의 존재 또는 부재하에 10 μM 셀플레이어™ 96-웰 키네틱 카스파제-3/7 시약을 함유하는 분석시험 배지를 웰당 50 ㎕씩 이용하였다. 비-형질도입 및 형질도입된 효과기 세포를 삼중 웰(triplicate well)에서 50 ㎕의 분석시험 배지 중에 웰당 60,000개씩 플레이팅하여 150 ㎕의 최종 부피로 만들었다. 37℃/5% CO2에서 96시간(4일)에 걸쳐 3~4시간마다 10배의 배율을 이용하여 각 웰의 이미지를 촬영하도록 인큐사이트를 설정하였다.
2. 결과
2.1 NY- ESO1 c259 및 PDE7A를 발현하는 T 세포의 표적 세포 살상 동역학
HA-PDE7A와 함께 NY-ESO1c259 TCR 또는 NY-ESO1c259 TCR을 발현하는 T 세포가 A375 표적 세포의 아포토시스를 유도하는 능력을 시간-분해 세포독성 분석시험으로 측정하였다. 상이한 형질도입 상태(비-형질도입된(NTD), c259 TCR(ADB869), c259 TCR + PDE7A(ADB1077))를 갖는 60,000개의 T 세포를 각 분석시험 웰에 첨가하고, 분석시험 24시간 전에 웰당 15,000개의 세포로 씨딩된 HLA-A2+/NYESO+ A375 흑색종 표적 세포와 함께 공동-배양하였다. 셀플레이어™ 96-웰 키네틱 카스파제-3/7 시약을 3.3 μM의 최종 농도로 모든 웰에 첨가하였다. 96시간의 지속기간 동안 4시간의 간격으로 이미지를 촬영하였다. 아포토시스를 겪는 표적 세포의 척도인 ㎟당 객체의 수를 이미지별로 측정하고, 시간에 대해 플롯팅하였다.
HA-PDE7A와 함께 NY-ESO1c259 TCR로 형질도입된 T 세포는 A375 표적 세포 내 아포토시스을 유도하는 기초 능력이 개선된 것으로 나타났다(도 2a 및 도 2b). 데이터 포인트는 평균값 및 삼중 웰의 평균에 대한 표준오차를 나타낸다. 도 2a 및 도 2b는 2명의 건강한 공여자로부터 분리된 T 세포를 이용하여 수행된 실험을 나타낸다. 제시된 데이터는 5번의 상이한 실험을 나타낸다.
2.2 PGE2의 존재 시 NY- ESO1 c259 및 PDE7A를 발현하는 T 세포의 표적 세포 살상 동역학
HA-PDE7A와 함께 NY-ESO1c259 TCR 또는 NY-ESO1c259 TCR을 발현하는 T 세포가 A375 표적 세포의 아포토시스를 유도하는 능력을 프로스타글란딘 E2의 존재 및 부재하에 시간-분해 세포독성 분석시험으로 측정하였다.
상이한 형질도입 상태를 갖는 60,000개의 T 세포를 각 분석시험 웰에 첨가하고, 분석시험 24시간 전에 웰당 15,000개씩 씨딩된 HLA-A2+/NYESO+ A375 흑색종 표적 세포와 함께 공동-배양하였다. 프로스타글란딘 E2를 각 웰에 1 μM의 최종 농도로 첨가하였다. 셀플레이어™ 96-웰 키네틱 카스파제-3/7 시약을 3.3 μM의 최종 농도로 모든 웰에 첨가하였다. 96시간의 지속기간 동안 4시간의 간격으로 이미지를 촬영하였다. 아포토시스를 겪는 표적 세포의 척도인 ㎟당 객체의 수를 이미지별로 측정하고, 시간에 대해 플롯팅하였다.
표적 A375 세포 단독, 비-형질도입 세포(NTD), NY-ESO1c259 TCR(ADB869)을 발현하는 T 세포 및 NY-ESO1c259 TCR 및 PDE7A(ADB1077)를 모두 발현하는 T 세포를 PGE2의 부재(닫힌 기호) 또는 존재(열린 기호)하에 표적 세포의 아포토시스를 유도하는 능력에 대하여 조사하였다. NY-ESO 특이적 T 세포에서 PDE7A의 과발현은 PGE2의 억제 효과에 대한 내성을 부여한다(도 3a 및 도 3b). PDE7A로 형질도입된 T 세포는 PGE2의 부재 시 PDE7A/NY-ESO1c259 TCR T 세포가 보인 것과 유사한 살상 동역학을 PGE2의 존재 시에 보였다.
데이터 포인트는 평균값 및 삼중 웰의 평균에 대한 표준오차를 나타낸다. 도 3a 및 도 3b는 2명의 건강한 공여자로부터 분리된 T 세포를 이용하여 수행된 실험을 나타낸다. 제시된 데이터는 6번의 실험을 나타낸다.
2.3 포스콜린의 존재하에 NY- ESO1 c259 및 PDE7A를 발현하는 T 세포의 표적 세포 살상 동역학
HA-PDE7A와 함께 NY-ESO1c259 TCR 또는 NY-ESO1c259 TCR을 발현하는 T 세포가 A375 표적 세포의 아포토시스를 유도하는 능력을 포스콜린의 존재 및 부재하에 시간-분해 세포독성 분석시험으로 측정하였다.
설명에서 제시된 바와 같이 상이한 형질도입 상태를 갖는 60,000개의 T 세포를 각 분석시험 웰에 첨가하고 분석시험 24시간 전에 웰당 15,000개씩 씨딩된 HLA-A2+/NYESO+ A375 흑색종 표적 세포와 함께 공동-배양하였다. 포스콜린을 각 웰에 30 μM의 최종 농도로 첨가하였다. 셀플레이어™ 96-웰 키네틱 카스파제-3/7 시약을 3.3 μM의 최종 농도로 모든 웰에 첨가하였다. 이미지를 96시간의 지속 기간에 걸쳐 4시간의 간격으로 촬영하였다. 아포토시스를 겪는 표적 세포의 척도인 mm2당 객체 수를 이미지별로 측정하고, 시간에 대해 플롯팅하였다.
비-형질도입(NTD) 세포, NY-ESO1c259 TCR(ADB869)을 발현하는 T 세포, NY-ESO1c259 TCR 및 PDE7A(ADB1077)를 모두 발현하는 T 세포를 포스콜린의 부재(닫힌 기호) 또는 존재(열린 기호)하에 표적 세포의 아포토시스를 유도하는 능력에 대하여 조사하였다. NY-ESO 특이적 T 세포에서 PDE7A의 과발현은 포스콜린이 표적 세포 살상 능력에 미치는 억제 효과에 대한 부분적인 내성을 부여한다(도 4a 및 도 4b). 데이터 포인트는 평균값 및 삼중 웰의 평균에 대한 표준오차를 나타낸다. 도 4a 및 도 4b는 2명의 건강한 공여자로부터 분리된 T 세포로 수행된 실험을 나타낸다. 제시된 데이터는 6번의 상이한 실험을 나타낸다.
2.4 NY- ESO1 c259 및 PDE7A를 발현하는 T 세포의 IFN -γ 분비
포스콜린, 아데노신 및 PGE2는 세포 내 cAMP 수준을 증가시킬 수 있다. 이들 매개체가 T 세포로부터의 IFN-γ 분비에 미치는 효과를 조사하기 위해, NY-ESO1c259 TCR를 발현하는 T 세포 그리고 NY-ESO1c259 TCR 및 PDE7A을 모두 발현하는 T 세포에 대하여 샌드위치 ELISA로 사이토카인 분석을 수행하였다.
NY-ESO1-특이적 TCR c259를 단독으로 또는 포스포디에스테라아제 7A(PDE7A)와 함께 발현하는 렌티벡터로 형질도입된 건강한 공여자로부터 분리된 200,000개의 T 세포를 각각의 분석 웰로 첨가하고, 웰당 50,000개씩 씨딩한 HLA-A2+/NYESO+ A375 흑색종 표적 세포와 함께 공동-배양하였다. 포스콜린을 30 μM의 최종 농도로, 아데노신을 250 μM, 및 프로스타글란딘 E2를 1 또는 0.3 μM의 최종 농도로 첨가하였다. T 세포 및 표적 세포를 48시간 동안 공동-배양하고, 상층액을 사이토카인 분석을 위해 수집하였다.
PDE7A를 발현하는 T 세포는 포스콜린(도 5a), 아데노신(도 5b) 및 PGE2(도 5c)에 의한 IFN-γ 방출의 억제에 대하여 부분적으로 내성이 있다. 제시된 데이터는 6번의 실험을 나타낸다.
2.5 NY- ESO1 c259 및 PDE4C를 발현하는 T 세포의 IFN -γ 분비
포스콜린 및 PGE2가 NY-ESO1c259 TCR을 발현하는 T 세포, 및 NY-ESO1c259 TCR 및 PDE4C를 모두 발현하는 T 세포로부터의 IFN-γ 분비에 미치는 효과를 조사하기 위해 샌드위치 ELISA를 이용하였다.
NY-ESO1-특이적 TCR c259를 단독으로 또는 포스포디에스테라아제 4C(PDE4C)와 함께 발현하는 렌티벡터로 형질도입된 건강한 공여자로부터 분리된 200,000개의 T 세포를 각각의 분석시험 웰에 첨가하고, 웰당 50,000개씩 씨딩된 HLA-A2+/NYESO+ A375 흑색종 표적 세포와 함께 공동-배양하였다. 포스콜린을 30 μM의 최종 농도로, 프로스타글란딘 E2를 1 μM의 최종 농도로 첨가하였다. T 세포 및 표적 세포를 48시간 동안 공동-배양하고, 상층액을 사이토카인 분석을 위해 수집하였다.
PDE4C를 발현하는 T 세포는 PGE2 및 포스콜린이 IFN-γ 방출에 미치는 억제 효과에 대한 부분적인 내성을 보인다(도 6a 및 도6b). 도 6a 및 도 6b는 2명의 건강한 공여자로부터 분리된 T 세포로 수행된 실험을 나타낸다.
2.6 NY- ESO1 c259 TCR 및 전장 또는 절단된 형태의 PDE7A를 함유하는 렌티바이러스 구조물의 생물학적 역가 ( titre )
다양한 렌티바이러스 제제물을 PBL 상에 적정하여 효과적인 생물학적 역가를 결정하였다. T 세포 형질도입 수준을 TCR의 Vβ 사슬(Vβ13.1)에 대한 염색에 의해 결정하였다.
동일한 농도의 렌티바이러스를 이용할 때, 형질도입은 NY-ESO1c259 TCR+ 절단된 PDE7A로 형질 도입된 세포에 대하여 중간 수준이었던 반면, T 세포 형질도입은 NY-ESO1c259 TCR 단독으로 형질도입된 세포와 비교하여 NY-ESO1c259 TCR+ 전장 PDE7A로 형질도입된 세포에 대하여 항상 훨씬 낮은 수준이었다(도 7). 형질도입 효율의 차이는 아마도 구조물의 상이한 크기에 의해 설명될 수 있다.
2.7 NY- ESO1 c259 및 전장 또는 절단된 형태의 PDE7A를 발현하는 T 세포의 형질도입 효율 및 TCR 발현 수준
T 세포 형질도입 수준을 TCR의 Vβ 사슬(Vβ13.1)에 대한 염색에 의해 결정하였다. 형질도입에 이용된 바이러스의 양은 모든 구조물에 대하여 매우 유사한 형질도입 효율로 이어지는 렌티바이러스 적정 후에 정규화하였다(도 8a). Vβ13.1의 형광 강도 중간값(median fluorescence intensity, MFI)에 의해 측정된 바와 같은 TCR 발현 수준은 NY-ESO1c259 TCR 단독으로 형질도입된 T 세포와 비교하여 NY-ESO1c259 TCR+ 전장 PDE7A로 형질도입된 T 세포에 대하여 상당히 더 낮았다(도 8b). NY-ESO1c259 TCR+ 절단된 PDE7A로 형질도입된 T 세포는 중간의 TCR 발현 수준을 보였다.zzz
2.8 PGE2의 존재 시 NY- ESO1 c259 및 전장 또는 절단된 형태의 PDE7A를 발현하는 T 세포의 표적 세포 살상 동역학
(i) NY-ESO1c259 TCR, (ii) NY-ESO1c259 TCR 및 전장 PDE7A, 또는 (iii) NY-ESO1c259 TCR 및 절단된 PDE7A을 발현하는 T 세포가 A375 표적 세포의 아포토시스를 유도하는 능력을 프로스타글란딘 E2의 존재 및 부재하에 시간-분해 세포독성 분석시험으로 측정하였다.
상이한 형질도입 상태를 갖는 60,000개의 T 세포를 각 분석시험 웰에 첨가하고, 분석시험 24시간 전에 웰당 20,000개씩 씨딩된 HLA-A2+/NYESO+ A375 흑색종 표적 세포와 함께 공동-배양하였다. 프로스타글란딘 E2는 각 웰에 1 μM의 최종 농도로 첨가하였다. 셀플레이어™ 96-웰 키네틱 카스파제-3/7 시약을 3.3 μM의 최종 농도로 모든 웰에 첨가하였다. 이미지를 96시간의 지속 기간에 걸쳐 3시간의 간격으로 촬영하였다. 아포토시스를 겪는 표적 세포의 척도인 mm2당 객체의 수를 이미지별로 측정하고, 시간에 대해 플롯팅하였다.
비-형질도입(NTD) T 세포, NY-ESO1c259 TCR을 발현하는 T 세포, NY-ESO1c259 TCR 및 전장 PDE7A를 모두 발현하는 T 세포 및 NY-ESO1c259 TCR 및 절단된 PDE7A를 모두 발현하는 T 세포를 PGE2의 부재(닫힌 기호) 또는 존재(열린 기호)하에 표적 세포의 아포토시스를 유도하는 능력에 대하여 조사하였다(도 9a). NY-ESO 특이적 T 세포에서 전장 및 절단된 PDE7A 모두의 과발현은 절단된 PDE7A에 대하여 효과가 약간 감소되었음에도 불구하고 PGE2의 억제 효과에 대한 내성을 부여한다(도 9c). 두 형태의 PDE7A로 형질도입된 T 세포는 PGE2의 부재 시 상응하는 세포가 보여주는 것과 유사한 살상 동역학을 PGE2의 존재 시에 보였다(도 9b).
데이터 포인트는 평균값 및 삼중 웰의 평균에 대한 표준오차를 나타낸다. 도 9는 1명의 건강한 공여자로부터 분리된 T 세포로 수행된 실험을 나타낸다. 제시된 데이터는 4번의 실험을 나타낸다.
2.9 NY- ESO1 c259 및 전장 또는 절단된 형태의 PDE7A를 발현하는 T 세포의 IFN-γ 분비
포스콜린 및 PGE2가 NY-ESO1c259 TCR을 발현하는 T 세포, NY-ESO1c259 TCR 및 전장 PDE7A를 모두 발현하는 T 세포, 및 NY-ESO1c259 TCR 및 절단된 PDE7A를 모두 발현하는 T 세포로부터의 IFN-γ 분비에 미치는 효과를 조사하기 위해 샌드위치 ELISA를 이용하였다.
NY-ESO1-특이적 TCR c259를 단독으로 또는 전장의 포스포디에스테라아제 7A 또는 절단된 포스포디에스테라아제 7A 와 함께 발현하는 렌티벡터로 형질도입된 건강한 공여자로부터 분리된 120,000개의 T 세포를 각각의 분석 웰에 첨가하고, 웰당 50,000개씩 접종된 HLA-A2+/NYESO+ A375 흑색종 세포와 함께 공동-배양하였다. 포스콜린을 50 μM의 최종 농도로, 프로스타글란딘 E2를 0.3 μM 및 1 μM의 최종 농도로 첨가하였다. T 세포 및 표적 세포를 48시간 동안 공동-배양하고, 상층액을 사이토카인 분석을 위해 수입하였다.
두 형태의 PDE7A를 발현하는 T 세포는 PGE2 및 포스콜린이 IFN-γ 방출에 미치는 억제 효과에 대한 내성을 보여주었다(도 10). 도 10은 2명의 건강한 공여자로부터 분리된 T 세포로 수행된 실험을 나타낸다. 제시된 데이터는 4번의 실험을 나타낸다.
서열
MEVCYQLPVLPLDRPVPQHVLSRRGAISFSSSSALFGCPNPRQLSQRRGAISYDSSDQTALYIRMLGDVRVRSRAGFESERRGSHPYIDFRIFHSQSEIEVSVSARNIRRLLSFQRYLRSSRFFRGTAVSNSLNILDDDYNGQAKCMLEKVGNWNFDIFLFDRLTNGNSLVSLTFHLFSLHGLIEYFHLDMMKLRRFLVMIQEDYHSQNPYHNAVHAADVTQAMHCYLKEPKLANSVTPWDILLSLIAAATHDLDHPGVNQPFLIKTNHYLATLYKNTSVLENHHWRSAVGLLRESGLFSHLPLESRQQMETQIGALILATDISRQNEYLSLFRSHLDRGDLCLEDTRHRHLVLQMALKCADICNPCRTWELSKQWSEKVTEEFFHQGDIEKKYHLGVSPLCDRHTESIANIQIGFMTYLVEPLFTEWARFSNTRLSQTMLGHVGLNKAS
WKGLQREQSSSEDTDAAFELNSQLLPQENRLS
서열번호 1: (PDE7A) NP_001229247.1
MEPPTVPSERSLSLSLPGPREGQATLKPPPQHLWRQPRTPIRIQQRGYSDSAERAERERQPHRPIERADAMDTSDRPGLRTTRMSWPSSFHGTGTGSGGAGGGSSRRFEAENGPTPSPGRSPLDSQASPGLVLHAGAATSQRRESFLYRSDSDYDMSPKTMSRNSSVTSEAHAEDLIVTPFAQVLASLRSVRSNFSLLTNVPVPSNKRSPLGGPTPVCKATLSEETCQQLARETLEELDWCLEQLETMQTYRSVSEMASHKFKRMLNRELTHLSEMSRSGNQVSEYISTTFLDKQNEVEIPSPTMKEREKQQAPRPRPSQPPPPPVPHLQPMSQITGLKKLMHSNSLNNSNIPRFGVKTDQEELLAQELENLNKWGLNIFCVSDYAGGRSLTCIMYMIFQERDLLKKFRIPVDTMVTYMLTLEDHYHADVAYHNSLHAADVLQSTHVLLATPALDAVFTDLEILAALFAAAIHDVDHPGVSNQFLINTNSELALMYNDESVLENHHLAVGFKLLQEDNCDIFQNLSKRQRQSLRKMVIDMVLATDMSKHMTLLADLKTMVETKKVTSSGVLLLDNYSDRIQVLRNMVHCADLSNPTKPLELYRQWTDRIMAEFFQQGDRERERGMEISPMCDKHTASVEKSQVGFIDYIVHPLWETWADLVHPDAQEILDTLEDNRDWYYSAIRQSPSPPPEEESRGPGHPPLPDKFQFELTLEEEEEEEISMAQIPCTAQEALTAQGLSGVEEALDATIAWEASPAQESLEVMAQEASLEAELEAVYLTQQAQSTGSAPVAPDEFSSREEFVVAVSHSSPSALALQSPLLPAWRTLSVSEHAPGLPGLPSTAAEVEAQREHQAAKRACSACAGTFGEDTSALPAPGGGGSGGDPT
서열번호 2: (PDE4A) NP_001104777.1
MENLGVGEGAEACSRLSRSRGRHSMTRAPKHLWRQPRRPIRIQQRFYSDPDKSAGCRERDLSPRPELRKSRLSWPVSSCRRFDLENGLSCGRRALDPQSSPGLGRIMQAPVPHSQRRESFLYRSDSDYELSPKAMSRNSSVASDLHGEDMIVTPFAQVLASLRTVRSNVAALARQQCLGAAKQGPVGNPSSSNQLPPAEDTGQKLALETLDELDWCLDQLETLQTRHSVGEMASNKFKRILNRELTHLSETSRSGNQVSEYISRTFLDQQTEVELPKVTAEEAPQPMSRISGLHGLCHSASLSSATVPRFGVQTDQEEQLAKELEDTNKWGLDVFKVAELSGNRPLTAIIFSIFQERDLLKTFQIPADTLATYLLMLEGHYHANVAYHNSLHAADVAQSTHVLLATPALEAVFTDLEILAALFASAIHDVDHPGVSNQFLINTNSELALMYNDASVLENHHLAVGFKLLQAENCDIFQNLSAKQRLSLRRMVIDMVLATDMSKHMNLLADLKTMVETKKVTSLGVLLLDNYSDRIQVLQNLVHCADLSNPTKPLPLYRQWTDRIMAEFFQQGDRERESGLDISPMCDKHTASVEKSQVGFIDYIAHPLWETWADLVHPDAQDLLDTLEDNREWYQSKIPRSPSDLTNPERDGPDRFQFELTLEEAEEEDEEEEEEGEETALAKEALELPDTELLSPEAGPDPGDLPLDNQRT
서열번호 3 (PDE4C) NP_000914.2
MEVCYQLPVLPLDRPVPQHVLS RRGAIS FSSSSALFGCPNPRQLSQ RRGAIS YDSSDQTALYIRMLGDVRVRSRAGFESERRGSHPYIDFRIFHSQSEIEVSVSARNIRRLLSFQRYLRSSRFFRGTAVSNSLNILDDDYNGQAK
서열번호 4: PDE7A의 비-촉매 N 말단 단편(반복 서열은 밑줄로, PKA 가기질 부위는 굵은 체로 표시함)
ATGGAAGTGTGCTACCAGCTGCCCGTGCTGCCCCTGGATAGACCTGTGCCTCAGCATGTGCTGAGCAGAAGAGGCGCCATCAGCTTCAGCAGCAGCTCCGCCCTGTTCGGCTGCCCCAATCCTAGACAGCTGAGCCAGAGAAGGGGAGCCATCTCCTACGACAGCAGCGACCAGACCGCCCTGTACATCAGAATGCTGGGCGACGTGCGCGTGCGGAGCAGAGCCGGATTTGAGAGCGAGAGAAGAGGCTCCCACCCCTACATCGACTTCCGGATCTTCCACAGCCAGAGCGAGATCGAGGTGTCCGTGTCCGCCCGGAACATCAGACGGCTGCTGAGCTTCCAGAGATACCTGAGAAGCAGCCGGTTCTTCCGGGGCACCGCCGTGTCCAACAGCCTGAACATCCTGGACGACGACTACAACGGCCAGGCCAAGCGGGCCAAGAGATCTGGATCTGGCGCGCCCGTGAAGCAGACCCTGAACTTTGACCTGCTGAAACTGGCCGGCGACGTGGAAAGCAACCCTGGCCCCATGAAGAAGCACCTGACCACCTTTCTCGTGATCCTGTGGCTGTACTTCTACCGGGGCAACGGCAAGAACCAGGTGGAACAGAGCCCCCAGAGCCTGATCATCCTGGAAGGCAAGAACTGCACTCTGCAGTGCAACTACACCGTGTCCCCCTTCAGCAACCTGCGCTGGTACAAGCAGGATACCGGCAGAGGCCCTGTGTCCCTGACCATCCTGACCTTCAGCGAGAACACCAAGAGCAACGGCCGGTACACCGCCACCCTGGACGCCGATACAAAGCAGAGCAGCCTGCACATCACCGCCTCCCAGCTGAGCGATAGCGCCAGCTACATCTGCGTGGTGTCCGGCGGCACAGACAGCTGGGGCAAGCTGCAGTTTGGCGCCGGAACACAGGTGGTCGTGACCCCCGACATCCAGAACCCTGACCCTGCCGTGTACCAGCTGCGGGACAGCAAGAGCAGCGACAAGAGCGTGTGCCTGTTCACCGACTTCGACTCCCAGACCAACGTGTCCCAGAGCAAGGACAGCGACGTGTACATCACCGACAAGACCGTGCTGGATATGCGGAGCATGGACTTCAAGAGCAATAGCGCCGTGGCCTGGTCTAACAAGAGCGACTTCGCCTGCGCCAACGCCTTCAACAACAGCATTATCCCCGAGGACACATTCTTCCCAAGCCCCGAGAGCAGCTGCGACGTGAAACTGGTGGAAAAGAGCTTCGAGACAGACACCAACCTGAATTTCCAGAACCTGAGCGTGATCGGCTTCCGGATCCTGCTGCTGAAGGTGGCCGGATTCAACCTGCTGATGACCCTGCGGCTGTGGTCCTCTGGCTCTCGGGCCAAGAGAAGCGGCAGCGGCGCCACCAATTTCAGCCTGCTGAAGCAGGCAGGGGATGTGGAAGAGAATCCCGGCCCTAGAATGGCCTCCCTGCTGTTTTTCTGCGGCGCCTTCTACCTGCTGGGGACCGGCAGCATGGACGCTGACGTGACCCAGACCCCCCGGAACAGAATCACCAAGACCGGCAAGCGGATCATGCTGGAATGCAGCCAGACAAAGGGCCACGACCGGATGTACTGGTACAGACAGGATCCAGGACTGGGCCTGAGGCTGATCTACTACAGCTTCGATGTGAAGGACATCAACAAGGGCGAGATCAGCGACGGCTACAGCGTGTCCAGACAGGCCCAGGCCAAGTTCTCCCTGAGCCTGGAAAGCGCCATCCCCAACCAGACCGCCCTGTACTTTTGTGCCACAAGCGGCCAGGGCGCCTACGAGGAACAGTTCTTTGGCCCTGGCACCCGGCTGACAGTGCTGGAAGATCTGAAGAACGTGTTCCCCCCAGAGGTGGCAGTGTTCGAGCCTAGCGAGGCCGAGATCTCCCACACCCAGAAAGCCACACTCGTGTGTCTGGCCACCGGATTCTACCCCGACCATGTGGAACTGTCTTGGTGGGTCAACGGCAAAGAGGTGCACAGCGGCGTGTCCACCGATCCCCAGCCTCTGAAAGAACAGCCCGCCCTGAACGACAGCCGGTACTGCCTGAGCAGCAGACTGAGAGTGTCCGCCACCTTCTGGCAGAACCCCAGAAATCACTTCAGATGCCAGGTGCAGTTTTACGGCCTGAGCGAGAACGACGAGTGGACCCAGGATAGGGCCAAGCCCGTGACTCAGATCGTGTCTGCCGAAGCCTGGGGCAGAGCCGATTGCGGCTTTACCAGCGAGAGCTACCAGCAGGGCGTGCTGAGCGCCACCATCCTGTACGAGATCCTGCTGGGCAAGGCCACACTGTACGCCGTGCTGGTGTCTGCCCTGGTGCTGATGGCCATGGTCAAGCGGAAGGACAGCCGGGGCTGA
서열번호 5: MAGE-A4 TCR을 갖는 절단된 PDE7A에 대한 코딩 서열
MEVCYQLPVLPLDRPVPQHVLSRRGAISFSSSSALFGCPNPRQLSQRRGAISYDSSDQTALYIRMLGDVRVRSRAGFESERRGSHPYIDFRIFHSQSEIEVSVSARNIRRLLSFQRYLRSSRFFRGTAVSNSLNILDDDYNGQAKRAKRSGSGAPVKQTLNFDLLKLAGDVESNPGPMKKHLTTFLVILWLYFYRGNGKNQVEQSPQSLIILEGKNCTLQCNYTVSPFSNLRWYKQDTGRGPVSLTILTFSENTKSNGRYTATLDADTKQSSLHITASQLSDSASYICVVSGGTDSWGKLQFGAGTQVVVTPDIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQSKDSDVYITDKTVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDTFFPSPESSCDVKLVEKSFETDTNLNFQNLSVIGFRILLLKVAGFNLLMTLRLWSSGSRAKRSGSGATNFSLLKQAGDVEENPGPRMASLLFFCGAFYLLGTGSMDADVTQTPRNRITKTGKRIMLECSQTKGHDRMYWYRQDPGLGLRLIYYSFDVKDINKGEISDGYSVSRQAQAKFSLSLESAIPNQTALYFCATSGQGAYEEQFFGPGTRLTVLEDLKNVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFYPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQPLKEQPALNDSRYCLSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRADCGFTSESYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSALVLMAMVKRKDSRG*
서열번호 6: MAGE-A4 TCR을 갖는 절단된 PDE7A(밑줄로 표시)에 대한 아미노산 서열
ATGGAAGTGTGCTACCAGCTGCCCGTGCTGCCCCTGGATAGACCTGTGCCTCAGCATGTGCTGAGCAGAAGAGGCGCCATCAGCTTCAGCAGCAGCTCCGCCCTGTTCGGCTGCCCCAATCCTAGACAGCTGAGCCAGAGAAGGGGAGCCATCTCCTACGACAGCAGCGACCAGACCGCCCTGTACATCAGAATGCTGGGCGACGTGCGCGTGCGGAGCAGAGCCGGATTTGAGAGCGAGAGAAGAGGCTCCCACCCCTACATCGACTTCCGGATCTTCCACAGCCAGAGCGAGATCGAGGTGTCCGTGTCCGCCCGGAACATCAGACGGCTGCTGAGCTTCCAGAGATACCTGAGAAGCAGCCGGTTCTTCCGGGGCACCGCCGTGTCCAACAGCCTGAACATCCTGGACGACGACTACAACGGCCAGGCCAAGCGGGCCAAGAGATCTGGAAGCGGAGCCCCTGTGAAGCAGACCCTGAACTTCGATCTGCTGAAACTGGCCGGCGACGTGGAAAGCAACCCTGGCCCCATGGAAACACTGCTGGGACTGCTGATCCTGTGGCTGCAGCTGCAGTGGGTGTCCAGCAAGCAGGAGGTGACCCAGATCCCTGCCGCCCTGAGCGTGCCCGAGGGCGAGAACCTGGTGCTGAACTGCAGCTTCACCGACTCCGCCATCTACAACCTGCAGTGGTTCCGGCAGGACCCCGGCAAGGGCCTGACCAGCCTGCTGCTGATCCAGAGCAGCCAGCGGGAGCAGACCAGCGGACGGCTGAACGCCAGCCTGGACAAGAGCAGCGGCCGGAGCACCCTGTACATCGCCGCCAGCCAGCCCGGCGACAGCGCCACCTACCTGTGCGCTGTGCGGCCTCTGTACGGCGGCAGCTACATCCCCACCTTCGGCAGAGGCACCAGCCTGATCGTGCACCCCTACATCCAGAACCCCGACCCCGCCGTGTACCAGCTGCGGGACAGCAAGAGCAGCGACAAGTCTGTGTGCCTGTTCACCGACTTCGACAGCCAGACCAATGTGAGCCAGAGCAAGGACAGCGACGTGTACATCACCGACAAGACCGTGCTGGACATGCGGAGCATGGACTTCAAGAGCAACAGCGCCGTGGCCTGGAGCAACAAGAGCGACTTCGCCTGCGCCAACGCCTTCAACAACAGCATTATCCCCGAGGACACCTTCTTCCCCAGCCCCGAGAGCAGCTGCGACGTGAAACTGGTGGAGAAGAGCTTCGAGACCGACACCAACCTGAACTTCCAGAACCTGAGCGTGATCGGCTTCAGAATCCTGCTGCTGAAGGTGGCCGGATTCAACCTGCTGATGACCCTGCGGCTGTGGAGCAGCGGCTCCCGGGCCAAGAGAAGCGGATCCGGCGCCACCAACTTCAGCCTGCTGAAGCAGGCCGGAGACGTGGAAGAAAACCCTGGCCCTAGGATGAGCATCGGCCTGCTGTGCTGCGCCGCCCTGAGCCTGCTGTGGGCAGGACCCGTGAACGCCGGAGTGACCCAGACCCCCAAGTTCCAGGTGCTGAAAACCGGCCAGAGCATGACCCTGCAGTGCGCCCAGGACATGAACCACGAGTACATGAGCTGGTATCGGCAGGACCCCGGCATGGGCCTGCGGCTGATCCACTACTCTGTGGGAGCCGGAATCACCGACCAGGGCGAGGTGCCCAACGGCTACAATGTGAGCCGGAGCACCACCGAGGACTTCCCCCTGCGGCTGCTGAGCGCTGCCCCCAGCCAGACCAGCGTGTACTTCTGCGCCAGCAGCTATGTGGGCAACACCGGCGAGCTGTTCTTCGGCGAGGGCTCCAGGCTGACCGTGCTGGAGGACCTGAAGAACGTGTTCCCCCCCGAGGTGGCCGTGTTCGAGCCCAGCGAGGCCGAGATCAGCCACACCCAGAAGGCCACACTGGTGTGTCTGGCCACCGGCTTCTACCCCGACCACGTGGAGCTGTCCTGGTGGGTGAACGGCAAGGAGGTGCACAGCGGCGTGTCTACCGACCCCCAGCCCCTGAAGGAGCAGCCCGCCCTGAACGACAGCCGGTACTGCCTGTCCTCCAGACTGAGAGTGAGCGCCACCTTCTGGCAGAACCCCCGGAACCACTTCCGGTGCCAGGTGCAGTTCTACGGCCTGAGCGAGAACGACGAGTGGACCCAGGACCGGGCCAAGCCCGTGACCCAGATTGTGAGCGCCGAGGCCTGGGGCAGGGCCGACTGCGGCTTCACCAGCGAGAGCTACCAGCAGGGCGTGCTGAGCGCCACCATCCTGTACGAGATCCTGCTGGGCAAGGCCACCCTGTACGCCGTGCTGGTGTCTGCCCTGGTGCTGATGGCTATGGTGAAGCGGAAGGACAGCCGGGGCTAA
서열번호 7: NY-ESO TCR을 갖는 절단된 PDE7A에 대한 코딩 서열
MEVCYQLPVLPLDRPVPQHVLSRRGAISFSSSSALFGCPNPRQLSQRRGAISYDSSDQTALYIRMLGDVRVRSRAGFESERRGSHPYIDFRIFHSQSEIEVSVSARNIRRLLSFQRYLRSSRFFRGTAVSNSLNILDDDYNGQAKRAKRSGSGAPVKQTLNFDLLKLAGDVESNPGPMETLLGLLILWLQLQWVSSKQEVTQIPAALSVPEGENLVLNCSFTDSAIYNLQWFRQDPGKGLTSLLLIQSSQREQTSGRLNASLDKSSGRSTLYIAASQPGDSATYLCAVRPLYGGSYIPTFGRGTSLIVHPYIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQSKDSDVYITDKTVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDTFFPSPESSCDVKLVEKSFETDTNLNFQNLSVIGFRILLLKVAGFNLLMTLRLWSSGSRAKRSGSGATNFSLLKQAGDVEENPGPRMSIGLLCCAALSLLWAGPVNAGVTQTPKFQVLKTGQSMTLQCAQDMNHEYMSWYRQDPGMGLRLIHYSVGAGITDQGEVPNGYNVSRSTTEDFPLRLLSAAPSQTSVYFCASSYVGNTGELFFGEGSRLTVLEDLKNVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFYPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQPLKEQPALNDSRYCLSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRADCGFTSESYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSALVLMAMVKRKDSRG*
서열번호 8 NY-ESO TCR을 갖는 절단된 PDE7A(밑줄로 표시)에 대한 아미노산 서열
SEQUENCE LISTING <110> Adaptimmune Limited <120> T Cells with Increased Immunosuppression Resistance <130> P19-024-INP-MEL <140> PCT/EP2017/074139 <141> 2017-09-22 <150> GB1616238.0 <151> 2016-09-23 <160> 40 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 482 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> (PDE7A) NP_001229247.1 <400> 1 Met Glu Val Cys Tyr Gln Leu Pro Val Leu Pro Leu Asp Arg Pro Val 1 5 10 15 Pro Gln His Val Leu Ser Arg Arg Gly Ala Ile Ser Phe Ser Ser Ser 20 25 30 Ser Ala Leu Phe Gly Cys Pro Asn Pro Arg Gln Leu Ser Gln Arg Arg 35 40 45 Gly Ala Ile Ser Tyr Asp Ser Ser Asp Gln Thr Ala Leu Tyr Ile Arg 50 55 60 Met Leu Gly Asp Val Arg Val Arg Ser Arg Ala Gly Phe Glu Ser Glu 65 70 75 80 Arg Arg Gly Ser His Pro Tyr Ile Asp Phe Arg Ile Phe His Ser Gln 85 90 95 Ser Glu Ile Glu Val Ser Val Ser Ala Arg Asn Ile Arg Arg Leu Leu 100 105 110 Ser Phe Gln Arg Tyr Leu Arg Ser Ser Arg Phe Phe Arg Gly Thr Ala 115 120 125 Val Ser Asn Ser Leu Asn Ile Leu Asp Asp Asp Tyr Asn Gly Gln Ala 130 135 140 Lys Cys Met Leu Glu Lys Val Gly Asn Trp Asn Phe Asp Ile Phe Leu 145 150 155 160 Phe Asp Arg Leu Thr Asn Gly Asn Ser Leu Val Ser Leu Thr Phe His 165 170 175 Leu Phe Ser Leu His Gly Leu Ile Glu Tyr Phe His Leu Asp Met Met 180 185 190 Lys Leu Arg Arg Phe Leu Val Met Ile Gln Glu Asp Tyr His Ser Gln 195 200 205 Asn Pro Tyr His Asn Ala Val His Ala Ala Asp Val Thr Gln Ala Met 210 215 220 His Cys Tyr Leu Lys Glu Pro Lys Leu Ala Asn Ser Val Thr Pro Trp 225 230 235 240 Asp Ile Leu Leu Ser Leu Ile Ala Ala Ala Thr His Asp Leu Asp His 245 250 255 Pro Gly Val Asn Gln Pro Phe Leu Ile Lys Thr Asn His Tyr Leu Ala 260 265 270 Thr Leu Tyr Lys Asn Thr Ser Val Leu Glu Asn His His Trp Arg Ser 275 280 285 Ala Val Gly Leu Leu Arg Glu Ser Gly Leu Phe Ser His Leu Pro Leu 290 295 300 Glu Ser Arg Gln Gln Met Glu Thr Gln Ile Gly Ala Leu Ile Leu Ala 305 310 315 320 Thr Asp Ile Ser Arg Gln Asn Glu Tyr Leu Ser Leu Phe Arg Ser His 325 330 335 Leu Asp Arg Gly Asp Leu Cys Leu Glu Asp Thr Arg His Arg His Leu 340 345 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gagggcgaga acctggtgct gaactgcagc 660 ttcaccgact ccgccatcta caacctgcag tggttccggc aggaccccgg caagggcctg 720 accagcctgc tgctgatcca gagcagccag cgggagcaga ccagcggacg gctgaacgcc 780 agcctggaca agagcagcgg ccggagcacc ctgtacatcg ccgccagcca gcccggcgac 840 agcgccacct acctgtgcgc tgtgcggcct ctgtacggcg gcagctacat ccccaccttc 900 ggcagaggca ccagcctgat cgtgcacccc tacatccaga accccgaccc cgccgtgtac 960 cagctgcggg acagcaagag cagcgacaag tctgtgtgcc tgttcaccga cttcgacagc 1020 cagaccaatg tgagccagag caaggacagc gacgtgtaca tcaccgacaa gaccgtgctg 1080 gacatgcgga gcatggactt caagagcaac agcgccgtgg cctggagcaa caagagcgac 1140 ttcgcctgcg ccaacgcctt caacaacagc attatccccg aggacacctt cttccccagc 1200 cccgagagca gctgcgacgt gaaactggtg gagaagagct tcgagaccga caccaacctg 1260 aacttccaga acctgagcgt gatcggcttc agaatcctgc tgctgaaggt ggccggattc 1320 aacctgctga tgaccctgcg gctgtggagc agcggctccc gggccaagag aagcggatcc 1380 ggcgccacca acttcagcct gctgaagcag gccggagacg tggaagaaaa ccctggccct 1440 aggatgagca tcggcctgct gtgctgcgcc gccctgagcc tgctgtgggc aggacccgtg 1500 aacgccggag tgacccagac ccccaagttc caggtgctga aaaccggcca gagcatgacc 1560 ctgcagtgcg cccaggacat gaaccacgag tacatgagct ggtatcggca ggaccccggc 1620 atgggcctgc ggctgatcca ctactctgtg ggagccggaa tcaccgacca gggcgaggtg 1680 cccaacggct acaatgtgag ccggagcacc accgaggact tccccctgcg gctgctgagc 1740 gctgccccca gccagaccag cgtgtacttc tgcgccagca gctatgtggg caacaccggc 1800 gagctgttct tcggcgaggg ctccaggctg accgtgctgg aggacctgaa gaacgtgttc 1860 ccccccgagg tggccgtgtt cgagcccagc gaggccgaga tcagccacac ccagaaggcc 1920 acactggtgt gtctggccac cggcttctac cccgaccacg tggagctgtc ctggtgggtg 1980 aacggcaagg aggtgcacag cggcgtgtct accgaccccc agcccctgaa ggagcagccc 2040 gccctgaacg acagccggta ctgcctgtcc tccagactga gagtgagcgc caccttctgg 2100 cagaaccccc ggaaccactt ccggtgccag gtgcagttct acggcctgag cgagaacgac 2160 gagtggaccc aggaccgggc caagcccgtg acccagattg tgagcgccga ggcctggggc 2220 agggccgact gcggcttcac cagcgagagc taccagcagg gcgtgctgag cgccaccatc 2280 ctgtacgaga tcctgctggg caaggccacc ctgtacgccg tgctggtgtc tgccctggtg 2340 ctgatggcta tggtgaagcg gaaggacagc cggggctaa 2379 <210> 8 <211> 792 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 8 amino acid sequence for truncated PDE7A (underlined) with NY-ESO TCR <400> 8 Met Glu Val Cys Tyr Gln Leu Pro Val Leu Pro Leu Asp Arg Pro Val 1 5 10 15 Pro Gln His Val Leu Ser Arg Arg Gly Ala Ile Ser Phe Ser Ser Ser 20 25 30 Ser Ala Leu Phe Gly Cys Pro Asn Pro Arg Gln Leu Ser Gln Arg Arg 35 40 45 Gly Ala Ile Ser Tyr Asp Ser Ser Asp Gln Thr Ala Leu Tyr Ile Arg 50 55 60 Met Leu Gly Asp Val Arg Val Arg Ser Arg Ala Gly Phe Glu Ser Glu 65 70 75 80 Arg Arg Gly Ser His Pro Tyr Ile Asp Phe Arg Ile Phe His Ser Gln 85 90 95 Ser Glu Ile Glu Val Ser Val Ser Ala Arg Asn Ile Arg Arg Leu Leu 100 105 110 Ser Phe Gln Arg Tyr Leu Arg Ser Ser Arg Phe Phe Arg Gly Thr Ala 115 120 125 Val Ser Asn Ser Leu Asn Ile Leu Asp Asp Asp Tyr Asn Gly Gln Ala 130 135 140 Lys Arg Ala Lys Arg Ser Gly Ser Gly Ala Pro Val Lys Gln Thr Leu 145 150 155 160 Asn Phe Asp Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp Val Glu Ser Asn Pro Gly 165 170 175 Pro Met Glu Thr Leu Leu Gly Leu Leu Ile Leu Trp Leu Gln Leu Gln 180 185 190 Trp Val Ser Ser Lys Gln Glu Val Thr Gln Ile Pro Ala Ala Leu Ser 195 200 205 Val Pro Glu Gly Glu Asn Leu Val Leu Asn Cys Ser Phe Thr Asp Ser 210 215 220 Ala Ile Tyr Asn Leu Gln Trp Phe Arg Gln Asp Pro Gly Lys Gly Leu 225 230 235 240 Thr Ser Leu Leu Leu Ile Gln Ser Ser Gln Arg Glu Gln Thr Ser Gly 245 250 255 Arg Leu Asn Ala Ser Leu Asp Lys Ser Ser Gly Arg Ser Thr Leu Tyr 260 265 270 Ile Ala Ala Ser Gln Pro Gly Asp Ser Ala Thr Tyr Leu Cys Ala Val 275 280 285 Arg Pro Leu Tyr Gly Gly Ser Tyr Ile Pro Thr Phe Gly Arg Gly Thr 290 295 300 Ser Leu Ile Val His Pro Tyr Ile Gln Asn Pro Asp Pro Ala Val Tyr 305 310 315 320 Gln Leu Arg Asp Ser Lys Ser Ser Asp Lys Ser Val Cys Leu Phe Thr 325 330 335 Asp Phe Asp Ser Gln Thr Asn Val Ser Gln Ser Lys Asp Ser Asp Val 340 345 350 Tyr Ile Thr Asp Lys Thr Val Leu Asp Met Arg Ser Met Asp Phe Lys 355 360 365 Ser Asn Ser Ala Val Ala Trp Ser Asn Lys Ser Asp Phe Ala Cys Ala 370 375 380 Asn Ala Phe Asn Asn Ser Ile Ile Pro Glu Asp Thr Phe Phe Pro Ser 385 390 395 400 Pro Glu Ser Ser Cys Asp Val Lys Leu Val Glu Lys Ser Phe Glu Thr 405 410 415 Asp Thr Asn Leu Asn Phe Gln Asn Leu Ser Val Ile Gly Phe Arg Ile 420 425 430 Leu Leu Leu Lys Val Ala Gly Phe Asn Leu Leu Met Thr Leu Arg Leu 435 440 445 Trp Ser Ser Gly Ser Arg Ala Lys Arg Ser Gly Ser Gly Ala Thr Asn 450 455 460 Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro 465 470 475 480 Arg Met Ser Ile Gly Leu Leu Cys Cys Ala Ala Leu Ser Leu Leu Trp 485 490 495 Ala Gly Pro Val Asn Ala Gly Val Thr Gln Thr Pro Lys Phe Gln Val 500 505 510 Leu Lys Thr Gly Gln Ser Met Thr Leu Gln Cys Ala Gln Asp Met Asn 515 520 525 His Glu Tyr Met Ser Trp Tyr Arg Gln Asp Pro Gly Met Gly Leu Arg 530 535 540 Leu Ile His Tyr Ser Val Gly Ala Gly Ile Thr Asp Gln Gly Glu Val 545 550 555 560 Pro Asn Gly Tyr Asn Val Ser Arg Ser Thr Thr Glu Asp Phe Pro Leu 565 570 575 Arg Leu Leu Ser Ala Ala Pro Ser Gln Thr Ser Val Tyr Phe Cys Ala 580 585 590 Ser Ser Tyr Val Gly Asn Thr Gly Glu Leu Phe Phe Gly Glu Gly Ser 595 600 605 Arg Leu Thr Val Leu Glu Asp Leu Lys Asn Val Phe Pro Pro Glu Val 610 615 620 Ala Val Phe Glu Pro Ser Glu Ala Glu Ile Ser His Thr Gln Lys Ala 625 630 635 640 Thr Leu Val Cys Leu Ala Thr Gly Phe Tyr Pro Asp His Val Glu Leu 645 650 655 Ser Trp Trp Val Asn Gly Lys Glu Val His Ser Gly Val Ser Thr Asp 660 665 670 Pro Gln Pro Leu Lys Glu Gln Pro Ala Leu Asn Asp Ser Arg Tyr Cys 675 680 685 Leu Ser Ser Arg Leu Arg Val Ser Ala Thr Phe Trp Gln Asn Pro Arg 690 695 700 Asn His Phe Arg Cys Gln Val Gln Phe Tyr Gly Leu Ser Glu Asn Asp 705 710 715 720 Glu Trp Thr Gln Asp Arg Ala Lys Pro Val Thr Gln Ile Val Ser Ala 725 730 735 Glu Ala Trp Gly Arg Ala Asp Cys Gly Phe Thr Ser Glu Ser Tyr Gln 740 745 750 Gln Gly Val Leu Ser Ala Thr Ile Leu Tyr Glu Ile Leu Leu Gly Lys 755 760 765 Ala Thr Leu Tyr Ala Val Leu Val Ser Ala Leu Val Leu Met Ala Met 770 775 780 Val Lys Arg Lys Asp Ser Arg Gly 785 790 <210> 9 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> repeat amino acid sequence <220> <221> VARIANT <222> (2)..(2) <223> Xaa is Val or Asn <220> <221> VARIANT <222> (4)..(4) <223> Xaa is Gln or Arg <220> <221> VARIANT <222> (5)..(5) <223> Xaa is His or Gln <220> <221> VARIANT <222> (6)..(6) <223> Xaa is Val or Leu <220> <221> VARIANT <222> (7)..(7) <223> Xaa is Leu or Ser <220> <221> VARIANT <222> (8)..(8) <223> Xaa is Ser or Gln <220> <221> VARIANT <222> (15)..(15) <223> Xaa is Phe or Tyr <220> <221> VARIANT <222> (16)..(16) <223> Xaa is Ser or Ser <400> 9 Pro Xaa Pro Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Arg Arg Gly Ala Ile Ser Xaa Xaa 1 5 10 15 Ser Ser <210> 10 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid tag <400> 10 Met Arg Gly Ser His His His His His His 1 5 10 <210> 11 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid tag <400> 11 Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys 1 5 <210> 12 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid 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Asp Asp Asp 1 5 <210> 29 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid tag <400> 29 Asp Asp Asp Asp Asp Asp Asp Asp Asp Asp 1 5 10 <210> 30 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid tag <400> 30 Asp Asp Asp Asp Asp Asp Asp Asp Asp Asp Asp 1 5 10 <210> 31 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid tag <400> 31 Asp Asp Asp Asp Asp Asp Asp Asp Asp Asp Asp Asp 1 5 10 <210> 32 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid tag <400> 32 Asp Asp Asp Asp Asp Asp Asp Asp Asp Asp Asp Asp Asp 1 5 10 <210> 33 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid tag <400> 33 Asp Asp Asp Asp Asp Asp Asp Asp Asp Asp Asp Asp Asp Asp 1 5 10 <210> 34 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid tag <400> 34 Asp Asp Asp Asp Asp Asp Asp Asp Asp Asp Asp Asp Asp Asp Asp 1 5 10 15 <210> 35 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid tag <400> 35 Asp Asp Asp Asp Asp Asp Asp Asp Asp Asp Asp Asp Asp Asp Asp Asp 1 5 10 15 <210> 36 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid tag <400> 36 Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu 1 5 10 <210> 37 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid tag <400> 37 Met Lys Ala Glu Phe Arg Arg Gln Glu Ser Asp Arg 1 5 10 <210> 38 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid tag <400> 38 Met Arg Asp Ala Leu Asp Arg Leu Asp Arg Leu Ala 1 5 10 <210> 39 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid tag <400> 39 Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala 1 5 <210> 40 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid tag <400> 40 Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys 1 5

Claims (48)

  1. 공여(donor) 개체로부터 수득된 T 세포 집단을 변형시켜 cAMP 포스포디에스테라아제(phosphodiesterase, PDE) 또는 이의 단편을 발현하도록 하는 단계
    를 포함하는 변형된 T 세포 집단을 생성하는 방법.
  2. 제1항에 있어서,
    cAMP PDE 또는 이의 단편은 cAMP 신호전달을 억제하는 것인 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    cAMP PDE는 PDE4 및 PDE7로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    T 세포는 cAMP PDE의 N 말단 단편을 발현하도록 변형되는 것인 방법.
  5. 제4항에 있어서,
    T 세포는 PDE7A의 N 말단 단편을 발현하도록 변형되는 것인 방법.
  6. 제5항에 있어서,
    N 말단 단편은 서열번호 4의 잔기 1 내지 57을 포함하는 것인 방법.
  7. 제6항에 있어서,
    N 말단 단편은 서열번호 4를 포함하는 것인 방법.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
    T 세포는 cAMP PDE 또는 이의 단편을 암호화하는 핵산을 T 세포 내로 도입함으로써 변형되는 것인 방법.
  9. 제8항에 있어서,
    cAMP PDE 또는 이의 단편을 암호화하는 핵산은 발현 벡터 내에 포함되는 것인 방법.
  10. 제9항에 있어서,
    발현 벡터는 렌티바이러스 벡터인 것인 방법.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서,
    T 세포는 공여 개체로부터의 암세포에 특이적으로 결합하는 항원 수용체를 발현하는 것인 방법
  12. 제11항에 있어서,
    항원 수용체는 T 세포 수용체(T cell receptor, TCR)인 것인 방법.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서,
    방법은 암세포에 특이적으로 결합하는 항원 수용체를 발현하도록 T 세포 집단을 추가로 변형시키는 단계 포함하는 것인 방법.
  14. 제13항에 있어서,
    T 세포는 항원 수용체를 암호화하는 핵산을 T 세포 내로 도입함으로써 추가로 변형되는 것인 방법.
  15. 제14항에 있어서,
    항원 수용체를 암호화하는 핵산은 발현 벡터 내에 포함되는 것인 방법.
  16. 제15항에 있어서,
    발현 벡터는 렌티바이러스 벡터인 것인 방법.
  17. 제13항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서,
    항원 수용체는 이종(heterologous) TCR인 것인 방법.
  18. 제17항에 있어서,
    이종 TCR은 친화력이 증가된 TCR인 것인 방법
  19. 제12항 및 제17항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서,
    TCR은 암세포에 의해 발현되는 종양 항원의 펩티드 단편을 표출하는(displaying) MHC에 특이적으로 결합하는 것인 방법.
  20. 제11항 및 제13항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서,
    항원 수용체는 키메라 항원 수용체(chimeric antigen receptor, CAR)인 것인 방법.
  21. 제20항에 있어서,
    CAR은 암세포에 의해 발현되는 종양 항원에 특이적으로 결합하는 것인 방법.
  22. 제19항 또는 제20항에 있어서,
    종양 항원은 NY-ESO-1 또는 MAGE-A10인 것인 방법.
  23. 제11항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서,
    항원 수용체를 암호화하는 핵산, 및 PDE 또는 이의 단편을 암호화하는 핵산은 동일한 발현 벡터 내에 포함되는 것인 방법.
  24. 제11항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서,
    T 세포는 항원 수용체 및 cAMP PDE 또는 이의 단편을 생성하기 위해 절단되는 융합 단백질을 발현하는 것인 방법.
  25. 제24항에 있어서,
    융합 단백질은 서열번호 6 또는 서열번호 8의 아미노산 서열 또는 이의 변이체를 포함하는 것인 방법.
  26. 제25항에 있어서,
    융합 단백질은 서열번호 5 또는 서열번호 7의 뉴클레오티드 서열 또는 이의 변이체를 포함하는 핵산에 의해 암호화되는 것인 방법.
  27. 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서,
    변형된 T 세포 집단을 증식시키는 단계를 포함하는 방법.
  28. 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서,
    변형된 T 세포 집단을 저장하는 단계를 포함하는 방법.
  29. 제1항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서,
    변형된 T 세포 집단을 약학적으로 허용 가능한 부형제로 제형화하는 단계를 포함하는 방법.
  30. 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서,
    변형된 T 세포 집단을 수용(recipient) 개체에게 투여하는 단계를 포함하는 방법.
  31. 제30항에 있어서,
    수용 개체는 암 질환을 갖는 것인 방법
  32. 제31항에 있어서,
    암 질환은 상기 항원 수용체에 결합하는 하나 이상의 암세포의 존재를 특징으로 하는 것인 방법.
  33. 제30항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서,
    공여 개체 및 수용 개체는 동일한 것인 방법.
  34. 제30항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서,
    공여 개체 및 수용 개체는 상이한 것인 방법
  35. 제30항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서:
    수용 개체로부터 수득된 암세포의 샘플을 제공하는 단계; 및
    수득된 샘플에서 암세포에 결합하는 항원 수용체를 확인하는 단계
    를 포함하며,
    여기에서 T 세포 집단은 확인된 항원 수용체를 발현하도록 변형되는 것인 방법.
  36. 암세포에 특이적으로 결합하는 항원 수용체, 및 cAMP PDE 또는 이의 단편을 발현하는 변형된 T 세포 집단으로서,
    여기에서 상기 세포는 cAMP PDE를 암호화하는 이종 핵산을 포함하는 변형된 T 세포 집단.
  37. 제36항에 있어서,
    제1항 내지 제35항 중 어느 한 항에 따른 방법에 의해 생성되는 것인 변형된 T 세포 집단.
  38. 제36항 또는 제37항에 따른 변형된 T 세포 집단 및 약학적으로 허용 가능한 부형제를 포함하는 것인 약학적 조성물.
  39. 제36항 또는 제37항에 있어서,
    인간 또는 동물의 신체의 치료 방법에서 사용하기 위한 변형된 T 세포 집단.
  40. 제36항 또는 제37항에 있어서,
    개체의 암 치료 방법에서 사용하기 위한 변형된 T 세포 집단.
  41. 개체의 암 치료용 약제의 제조에 있어서의 제36항 또는 제37항에 따른 변형된 T 세포 집단의 용도.
  42. 제36항 또는 제37항에 따른 변형된 T 세포 집단을 암에 걸린 개체에게 투여하는 단계를 포함하는 암을 치료하는 방법.
  43. 제40항, 제41항 및 제42항에 있어서,
    암은 상기 항원 수용체에 결합하는 하나 이상의 암세포의 존재를 특징으로 하는 것인 집단, 용도, 또는 방법.
  44. 암세포에 특이적으로 결합하는 항원 수용체를 암호화하는 뉴클레오티드 서열, 및 cAMP PDE 또는 이의 단편을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 분리된 핵산.
  45. 제44항에 따른 핵산을 포함하는 벡터.
  46. 제45항에 있어서,
    렌티바이러스 벡터인 것인 벡터.
  47. 제45항 또는 제46항에 따른 벡터를 포함하는 바이러스 입자.
  48. 포유류 세포를 제46항에 따른 바이러스 벡터 및 하나 이상의 바이러스 패키징 및 엔벨로프 벡터(envelope vector)로 형질도입하는 단계; 및
    형질도입된 세포가 배지 내로 방출되는 렌티바이러스 입자를 생성하도록, 배양 배지에서 이 세포를 배양하는 단계
    를 포함하는 바이러스 입자를 제조하는 방법.
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