KR20200000969A

KR20200000969A - 췌장암 진단 또는 치료용 조성물

Info

Publication number: KR20200000969A
Application number: KR1020180073341A
Authority: KR
Inventors: 홍순선; 정경희; 엄홍화
Original assignee: 인하대학교 산학협력단
Priority date: 2018-06-26
Filing date: 2018-06-26
Publication date: 2020-01-06

Abstract

본 발명은 췌장암 진단 또는 치료용 조성물에 관한 것으로, 본 발명에서는 췌장암에서 ANGPTL4 발현이 증가되어 있는 것을 확인하였으며, 상기 ANGPTL4를 넉다운 시, 췌장암 세포의 성장, 이동, 침윤 및 혈관 형성이 억제되는 것을 확인한 바, 상기 ANGPTL4는 췌장암 진단, 췌장암 전이 예후 예측, 췌장암 예방 또는 치료 등에 유용하게 활용될 수 있다.

Description

췌장암 진단 또는 치료용 조성물{Composition for diagnosing or treating pancreatic cancer}

본 발명은 ANGPTL4(angiopoietin like 4)를 유효성분으로 포함하는 췌장암 진단 또는 췌장암 전이 예후 예측용 바이오마커 조성물에 관한 것이다.

췌장암은 5년 생존율이 1-4%, 중앙생존기간이 5개월에 이르는 치명적인 암으로 인체의 암 중에서 가장 불량한 예후를 보이며, 보건복지부 암 등록 본부에서 공개한 자료에 의하면 1년 이내 사망률이 약 80%로 생존율이 매우 낮은 것으로 알려져 있다. 췌장암은 조기 진단이 어렵고 쉽게 전이되는 특성을 가지고 있어 환자의 80-90%는 완치를 기대하는 근치적 절제가 불가능한 상태에서 발견되기 때문에 수술할 수 있는 시점을 지나치는 경우가 많다. 또한, 방사선 치료 및 화학 요법을 이용한 치료에 의존하고 있으나 치료 효과가 낮아 조기 진단법의 개발이 절실히 요구되고 있는 실정이다.

췌장암 치료에 가장 많이 사용되는 항암제는 젬시타빈(gemcitabine)으로 피리미딘 항 대사물질이며, 제 2상 연구에서 6-11%의 관해율을 나타내었으나 췌장암 환자에서 초기 다른 약물에 비하여 부작용이 낮아 다른 약물과의 복합제로 사용되고 있다. 그러나, 췌장암 치료 및 생존율 향상에 있어서 만족할 만한 결과는 나타나지 않고 있다. 젬시타빈 이외 표피 성장인자 수용체(epidermal growth factor receptor; EGFR), 혈관 내피 성장인자 수용체(vascular endothelial growth factor receptor; VEGFR) 등의 키나아제를 표적으로 하는 다양한 약물 개발 연구가 진행되고 있으며, 현재 췌장암 치료제로 FDA 승인을 받은 키나아제 저해제인 소라페닙(sorafenib), 엘로티닙(erlotinib) 및 제피티닙(gefitinib)은 실제로 췌장암 환자에게 치료제로 사용되었으나, 임상 1상 및 2상에서 효과가 거의 없는 것으로 나타나 새로운 표적 치료제의 개발이 절실히 필요하다.

ANGPTL(angiopoietin like) 패밀리 대부분은 대사 및 혈관 형성에 관여하며, ANGPTL4는 종양 촉진 효과를 나타내고, 세포사멸 음성 조절자로서 암세포 사멸을 억제하여 암세포의 성장을 증진시키는 것으로 보고된 바 있다. 또한, ANGPTL4는 대장암에서 세포사의 다른 형태인 아노이키스(anoikis)에 저항성을 일으켜 종양의 침윤 및 세포 이동을 가속화시키는 세포외 기질(extracellular matrix; ECM)과도 상호 작용하는 것으로 보고되었다. 특이하게도, ANGPTL4는 세포 배양 상층액이나 체순환에서 주로 발견되며, 적어도 ANGPTL4는 내분비기관 방식으로 이루어지는 것으로 추측되고 있다. 이는 혈액 중 측정 인자로서의 응용 가능성을 보여주는 결과라고 사료되며, 특히 ANGPTL4가 지방조직, 간 및 소화기관에서 지질 및 에너지 대사에 주로 관여하는 인자라는 점을 감안할 때, 이들과 함께 대사를 진행하는 췌장에서도 다양한 질환을 일으키는 요인 인자로서 작용할 수 있을 것으로 사료된다.

대한민국 등록특허 제10-1794145호 (2017.10.31. 등록)

본 발명의 목적은 ANGPTL4을 유효성분으로 포함하는 췌장암 진단용 또는 췌장암 전이 예후 예측용 바이오마커 조성물, ANGPTL4의 발현 수준을 측정할 수 있는 제제를 유효성분으로 포함하는 췌장암 진단용 또는 췌장암 전이 예후 예측용 조성물, 이를 이용한 췌장암 진단 방법 및 췌장암 전이 예후 예측방법을 제공하는 데에 있다.

본 발명의 다른 목적은 ANGPTL4 단백질 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 포함하는 췌장암 예방 또는 치료용 약학 조성물, 또는 췌장암 전이 억제용 약학 조성물을 제공하는 데에 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 ANGPTL4 단백질의 발현 수준 측정을 통한 췌장암 치료제 또는 췌장암 전이 억제제 스크리닝 방법을 제공하는 데에 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 ANGPTL4 또는 이를 코딩하는 유전자를 유효성분으로 포함하는 췌장암 진단용 바이오마커 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 ANGPTL4 또는 이를 코딩하는 유전자를 유효성분으로 포함하는 췌장암 전이 예후 예측용 바이오마커 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 ANGPTL4의 발현 수준을 측정할 수 있는 제제를 유효성분으로 포함하는 췌장암 진단용 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 ANGPTL4의 발현 수준을 측정할 수 있는 제제를 유효성분으로 포함하는 췌장암 전이 예후 예측용 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 ANGPTL4의 발현 수준을 측정하여 췌장암 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 ANGPTL4의 발현 수준을 측정하여 췌장암 전이 예후 예측에 필요한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 ANGPTL4 단백질 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 포함하는 췌장암 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 ANGPTL4 단백질 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 포함하는 췌장암 전이 억제용 약 학조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 ANGPTL4 단백질의 발현 수준 측정을 통한 췌장암 치료제 스크리닝 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 ANGPTL4 단백질의 발현 수준 측정을 통한 췌장암 전이 억제제 스크리닝 방법을 제공한다.

본 발명에서는 췌장암에서 ANGPTL4 발현이 증가되어 있는 것을 확인하였으며, 상기 ANGPTL4를 넉다운 시, 췌장암 세포의 성장, 이동, 침윤 및 혈관 형성이 억제되는 것을 확인한 바, 상기 ANGPTL4는 췌장암 진단, 췌장암 전이 예후 예측, 췌장암 예방 또는 치료 등에 유용하게 활용될 수 있다.

도 1은 췌장암에서 ANGPTL4의 발현량을 확인한 것이다.
도 2는 ANGPTL4에 의한 세포 이동성 증가, 혈관 세포의 성장 촉진, 혈관 형성 촉진 효과를 확인한 것이다.
도 3은 ANGPTL4를 넉다운 시킨 MIA PaCa-2 췌장암 세포주의 세포 성장 억제 효과를 확인한 것이다.
도 4는 ANGPTL4를 넉다운 시킨 MIA PaCa-2 췌장암 세포의 세포 전이 및 침윤 억제 효과를 확인한 것이다.
도 5는 ANGPTL4를 넉다운 시킨 MIA PaCa-2 췌장암 세포주를 이용한 이종이식 및 동소이식 암 마우스 모델에서 종양 성장 억제 효과를 확인한 것이다.
도 6은 상기 이종이식 및 동소이식 암 마우스 모델에서 ANGPTL4, 세포 성장 마커, 세포 사멸 마커, 혈관 마커의 발현을 확인한 것이다.

본 발명의 발명자들은 췌장암 환자의 종양 조직에서 ANGPTL4의 발현이 증가되어 있고, 상기 ANGPTL4를 넉다운 시켰을 때, 췌장암 세포의 성장, 이동, 침윤 및 혈관 형성이 억제되는 것을 확인한 바, 상기 ANGPTL4를 췌장암 진단 또는 치료에 활용이 가능함을 확인하며 본 발명을 완성하였다.

이에, 본 발명은 ANGPTL4(angiopoietin like 4) 또는 이를 코딩하는 유전자를 유효성분으로 포함하는 췌장암 진단용 바이오마커 조성물 또는 췌장암 전이 예후 예측용 바이오마커 조성물을 제공한다.

상기 ANGPTL4(angiopoietin like 4)는 NCBI accession no. NG_012169일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아님을 명시한다.

본 명세서에서 용어 “진단”은 특정 질병 또는 질환에 대한 한 객체의 감수성(susceptibility)을 판정하는 것, 한 객체가 특정 질병 또는 질환을 현재 가지고 있는지 여부를 판정하는 것, 특정 질병 또는 질환에 걸린 한 객체의 예후(prognosis)를 판정하는 것, 또는 테라메트릭스(therametrics)(예컨대, 치료 효능에 대한 정보를 제공하기 위하여 객체의 상태를 모니터링하는 것)을 포함한다.

본 명세서 용어 “예후(prognosis)”는 질병을 진단하여 판단된 장래의 증세 또는 경과에 대한 전망을 말한다. 암 환자에 있어서 예후는 통상적으로 암 발병 또는 외과적 시술 후 일정기간 내의 전이 여부 또는 생존기간을 뜻한다. 예후의 예측은 특히 췌장암 환자의 화학치료 여부를 비롯하여 향후 췌장암 치료의 방향에 대한 단서를 제시하므로 매우 중요한 임상적 과제이다.

본 명세서에서 용어 “전이(metastasis)”는 어떤 종양이 그 원발 부위에서 여러 경로를 따라 다른 신체의 부위에 이식되어 그곳에 정착 및 증식하는 상태를 말한다. 암의 전이여부는 해당 암의 고유의 특성에 의하여 결정될 뿐만 아니라 암의 예후 결정에 있어서 가장 중요한 단서가 되는 사건이므로, 암 환자의 생존과 관련된 가장 중요한 임상정보로 다루어진다.

또한, 본 발명은 ANGPTL4의 발현 수준을 측정할 수 있는 제제를 유효성분으로 포함하는 췌장암 진단용 조성물 또는 췌장암 전이 예후 예측용 조성물을 제공한다.

상기 제제는 ANGPTL4 단백질에 특이적으로 결합하는 항체, 펩타이드, 앱타머 또는 화합물이며, 상기 ANGPTL4 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아님을 명시한다.

또한, 본 발명은 상기 조성물을 포함하는 췌장암 진단용 키트 또는 췌장암 예후 예측용 키트를 제공한다.

본 명세서에서 용어 "프라이머"는 짧은 자유 3-말단 수산화기(free 3' hydroxyl group)를 가지는 핵산 서열로 상보적인 템플레이트(template)와 염기쌍을 형성할 수 있고 템플레이트 가닥 복사를 위한 시작 지점으로서 작용하는 짧은 핵산 서열을 말한다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응을 위한 시약(즉, DNA 폴리머라제 또는 역전사효소) 및 상이한 4가지의 뉴클레오사이드 트리포스페이트의 존재 하에서 DNA 합성을 개시할 수 있다. PCR 조건, 센스 및 안티센스 프라이머의 길이는 당업계에 공지된 기술에 따라 적절히 선택될 수 있다.

본 명세서에서 용어 "프로브"는 mRNA 외 특이적으로 결합을 이룰 수 있는 짧게는 수 염기 내지 길게는 수백 염기에 해당하는 RNA 또는 DNA 등의 핵산 단편을 의미하며 라벨링되어 있어서 특정 mRNA의 존재 유무, 발현량을 확인할 수 있다. 프로브는 올리고뉴클레오타이드(oligonucleotide) 프로브, 단쇄 DNA(single strand DNA) 프로브, 이중쇄 DNA(double strand DNA)프로브, RNA 프로브 등의 형태로 제작될 수 있다. 적절한 프로브의 선택 및 혼성화 조건은 당해 기술 분야에 공지된 기술에 따라 적절히 선택할 수 있다.

본 명세서에서 용어 "항체"는 당해 기술분야에 공지된 용어로서 항원성 부위에 대하여 지시되는 특이적인 면역글로불린을 의미한다. 본 발명에서의 항체는 본 발명의 ANGPTL4에 대해 특이적으로 결합하는 항체를 의미하며, 당해 기술분야의 통상적인 방법에 따라 항체를 제조할 수 있다. 상기 항체의 형태는 폴리클로날 항체 또는 모노클로날 항체를 포함하며, 모든 면역글로불린 항체가 포함된다. 상기 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 갖는 완전한 형태를 의미한다. 또한, 상기 항체는 인간화 항체 등의 특수 항체도 포함된다.

또한, 본 발명의 키트는 마커 성분에 특이적으로 결합하는 항체, 기질과의 반응에 의해서 발색하는 표지체가 접합된 2차 항체 접합체(conjugate), 상기 표지체와 발색 반응할 발색 기질 용액, 세척액 및 효소반응 정지용액 등을 포함할 수 있으며, 사용되는 시약 성분을 포함하는 다수의 별도 패키징 또는 컴파트먼트로 제작될 수 있다.

본 명세서에서 용어 "펩타이드"는 표적 물질에 대한 결합력 높은 장점이 있으며, 열/화학 처리시에도 변성이 일어나지 않는다. 또한 분자 크기가 작기 때문에 다른 단백질에 붙여서 융합 단백질로의 이용이 가능하다. 구체적으로 고분자 단백질 체인에 붙여서 이용이 가능하므로 진단 키트 및 약물전달 물질로 이용될 수 있다.

본 명세서에서 용어 "앱타머(aptamer)"란, 그 자체로 안정된 삼차 구조를 가지면서 표적 분자에 높은 친화성과 특이성으로 결합할 수 있는 특징을 가진 특별한 종류의 단일가닥 핵산(DNA, RNA 또는 변형핵산)으로 구성된 폴리뉴클레오티드의 일종을 의미한다. 상술한 바와 같이, 앱타머는 항체와 동일하게 항원성 물질에 특이적으로 결합할 수 있으면서도, 단백질보다 안정성이 높고, 구조가 간단하며, 합성이 용이한 폴리뉴클레오티드로 구성되어 있으므로, 항체를 대체하여 사용될 수 있다.

또한, 본 발명은 (1) 환자에서 분리된 시료로부터 ANGPTL4 유전자의 mRNA 발현 수준 또는 ANGPTL4 단백질의 발현 수준을 측정하는 단계; (2) 상기 ANGPTL4 유전자의 mRNA 발현 수준 또는 ANGPTL4 단백질의 발현 수준을 대조군 시료와 비교하는 단계; 및 (3) 상기 ANGPTL4 유전자의 mRNA 발현 수준 또는 ANGPTL4 단백질의 발현 수준이 대조군 시료보다 높을 경우 췌장암이라고 판단하는 단계를 포함하는 췌장암 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 (1) 췌장암 환자에서 분리된 시료로부터 ANGPTL4 유전자의 mRNA 발현 수준 또는 ANGPTL4 단백질의 발현 수준을 측정하는 단계; (2) 상기 ANGPTL4 유전자의 mRNA 발현 수준 또는 ANGPTL4 단백질의 발현 수준을 대조군 시료와 비교하는 단계; 및 (3) 상기 ANGPTL4 유전자의 mRNA 발현 수준 또는 ANGPTL4 단백질의 발현 수준이 대조군 시료보다 높을 경우 췌장암의 전이 위험성이 높다고 판단하는 단계를 포함하는 췌장암 전이 예후 예측에 필요한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.

상세하게는, 상기 mRNA 발현 수준을 측정하는 방법은 RT-PCR, 경쟁적 RT-PCR(Competitive RT-PCR), 실시간 RT-PCR(Real-time RT-PCR), RNase 보호 분석법(RPA; RNase protection assay), 노던 블랏팅 (Northern blotting) 및 DNA 칩을 이용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아님을 명시한다.

상세하게는, 상기 단백질 발현 수준을 측정하는 방법은 웨스턴 블랏, ELISA(enzyme linked immunosorbent asay), 방사선면역분석(Radioimmunoassay; RIA), 방사면역확산법(radioimmunodiffusion), 오우크테로니(Ouchterlony) 면역 확산법, 로케이트(rocket) 면역전기영동, 조직면역염색, 면역침전 분석법(Immunoprecipitation assay), 보체고정분석법 (Complement Fixation Assay), FACS 및 단백질 칩을 이용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아님을 명시한다.

본 명세서에서 용어 "환자에서 분리된 시료"란 바이오 마커인 상기 ANGPTL4 유전자 또는 ANGPTL4 단백질의 발현 수준에 있어서 대조군과 차이가 나는 조직, 세포, 전혈, 혈청, 혈장, 타액, 객담, 뇌척수액, 또는 뇨와 같은 시료일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아님을 명시한다.

또한, 본 발명은 ANGPTL4 단백질 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 포함하는 췌장암 예방 또는 치료용 약학 조성물 또는 췌장암 전이 억제용 약학 조성물을 제공한다.

상세하게는, 상기 ANGPTL4 단백질 발현 억제제는 ANGPTL4 유전자의 mRNA에 상보적으로 결합하는 안티센스 뉴클레오타이드, 작은 간섭 RNA(small interfering RNA; siRNA) 또는 짧은 헤어핀 RNA(short hairpin RNA; shRNA)일 수 있고, 상기 ANGPTL4 단백질 활성 억제제는 ANGPTL4 단백질에 특이적으로 결합하는 화합물, 펩티드, 펩티드 미메틱스, 앱타머, 항체 또는 천연물일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아님을 명시한다.

본 발명의 조성물이 약학 조성물인 경우, 투여를 위하여, 상기 기재한 유효성분 이외에 약학적으로 허용 가능한 담체, 부형제 또는 희석제를 포함할 수 있다. 상기 담체, 부형제 및 희석제로는 락토오스, 덱스트로오스, 수크로오스, 소르비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로오스, 메틸 셀룰로오스, 미정질 셀룰로오스, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다.

본 발명의 약학 조성물은 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 또는 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용할 수 있다. 상세하게는 제형화할 경우 통상 사용하는 충진제, 중량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다. 경구투여를 위한 고형 제제로는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다. 이러한 고형 제제는 상기 유효성분 외에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 칼슘 카보네이트, 수크로오스, 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용될 수 있다. 경구를 위한 액상물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등을 첨가하여 조제될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제는 멸균된 수용액, 비수성 용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제 및 과제를 포함한다. 비수성 용제 및 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 오일, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔, 마크로솔, 트윈 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 약학 조성물의 적합한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 시간에 따라 다르지만, 당 업자에 의해 적절하게 선택될 수 있는 바, 상기 조성물의 일일 투여량은 바람직하게는 0.001 mg/kg 내지 50 mg/kg이며, 필요에 따라 일일 1회 내지 수회로 나누어 투여할 수 있다.

또한, 본 발명은 (1) 췌장암 세포에 시험물질을 접촉시키는 단계; (2) 상기 시험물질을 접촉한 췌장암 세포에서 ANGPTL4 단백질의 발현 또는 활성 정도를 측정하는 단계; 및 (3) 대조구 시료와 비교하여 상기 ANGPTL4 단백질의 발현 또는 활성 정도가 감소한 시험물질을 선별하는 단계를 포함하는 췌장암 치료제 스크리닝 방법 또는 췌장암 전이 억제제 스크리닝 방법을 제공한다.

본 발명의 스크리닝 방법을 언급하면서 사용되는 용어 "시험물질"은 유전자의 발현량에 영향을 미치거나, 단백질의 발현 또는 활성에 영향을 미치는지 여부를 검사하기 위하여 스크리닝에서 이용되는 미지의 후보 물질을 의미한다. 상기 시료는 화학물질, 뉴클레오타이드, 안티센스-RNA, siRNA(small interference RNA) 및 천연물 추출물을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아님을 명시한다.

본 명세서에서 "암" 또는 "암세포"는 췌장암이 가장 바람직하지만, ANGPTL4 유전자 또는 ANGPTL4 단백질의 발현 수준에 있어서 대조군과 차이가 나는 암 또는 암세포라면 적용 가능하다. "암" 또는 "암세포"는 유방암, 자궁경부암, 신경교종, 뇌암, 흑색종, 폐암, 방광암, 전립선암, 백혈병, 신장암, 간암, 대장암, 위암, 담낭암, 난소암, 임파종, 골육종, 자궁암, 구강암, 기관지암, 비인두암, 후두암, 피부암, 혈액암, 갑상선암, 부갑상선암 또는 요관암이거나, 이의 암세포일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아님을 명시한다.

이하에서는 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예 1: 췌장암 조직 및 췌장암 세포주에서의 ANGPTL4의 발현량 분석

환자의 정상 췌장 조직 및 췌장암 조직(human pancreatic cancer tissue array-US Biomax, PA2072)을 이용하여 ANGPTL4의 발현량을 확인하였고, ATCC에서 구입한 췌장암 세포주 HUVEC, HPNE, PANC-1, BxPC-3 및 MIA PaCa-2에서 ANGPTL4의 발현량을 확인하였다.

또한, 면역조직화학(immunohistochemistry; IHC) 및 웨스턴 블랏을 수행하여 췌장암 환자의 조직 및 정상대조군의 조직에서 ANGPTL4의 단백질 발현량을 분석하였다.

간략하게, 면역조직화학은 암 조직을 파라핀 조직 절편으로 제작하고, 탈파라핀 과정을 거친 후 항원 복구(antigen retrieval) 과정을 통해 조직 내 항원을 노출시켰다. 내인성 퍼옥시다제(endogenous peroxidase)의 불활성(inactivation) 과정을 통해 조직 내 퍼옥시다제를 블로킹(blocking) 시켰다. 조직 절편은 5% 염소 및 말 혈청/PBS로 실온에서 1시간 동안 반응시켜 비특이적 결합을 차단한 후, 가습 챔버에서 ANGPTL4에 대한 1차 항체로 4℃에서 밤새 반응시켰다. 이후, PBS로 2회 세척한 다음 형광이 접합된 2차 항체로 실온에서 1시간 동안 반응시켰다. 마지막으로 조직 절편을 디아미노벤지딘(diaminobenzidine; DAB)으로 발색시켜 현미경으로 조직을 관찰하였다.

그 결과, 도 1을 참조하여 보면, 정상 대조군과 비교하였을 때, 췌장암 환자의 종양의 발생 과정(ADM, PanIN-1, PanIN-2)과 췌장암(PDAC) 조직에서 ANGPTL4의 발현량이 증가하였고, 췌장암 세포주에서도 ANGPTL4의 발현량이 현저하게 증가한 것을 확인하였다.

실시예 2: ANGPTL4에 의한 혈관 형성 촉진 효과

ANGPTL4가 혈관 형성에 미치는 영향을 확인하기 위해, 인간 탯줄 정맥 내피세포 이동 분석(HUVEC migration assay), 대동맥 성장 분석(aortic sprouting assay) 및 면역형광(immunofluorescence)을 수행하였다.

간략하게, HUVEC 이동 분석을 위해, 60 mm 배양 디쉬(dish)에 HUVEC 세포를 100% 밀도가 되도록 배양한 후, 200 μL의 파이펫 팁(tip)을 이용하여 약 2 mm 두께의 균일한 선형 스크래치를 만들었다. 이후, PBS로 세척하여 떨어진 세포를 제거하고, VEGF 100 ng/mL 또는 ANGPTL4 300 ng/mL을 처리하고 24시간 동안 배양하여 세포를 이동시킨 다음 100% 메탄올로 고정시켰다. 이동된 세포는 현미경을 이용하여 분석하였다.

대동맥 성장 분석은 랫드(lewis)의 대동맥을 고리(1-2 mm) 모양으로 절단하고 마트리겔(matrigel)을 이용하여 고정시킨 후, VEGF 100 ng/mL 또는 ANGPTL4 300 ng/mL(R&D)을 처리하고 7일 동안 배양한 후, 현미경으로 관찰하였다.

혈관 형성에 있어서 ANGPTL4의 발현 양상을 분석하기 위해, 5 X 10⁶의 세포 밀도로 AsPC-1 췌장암 세포주(ATCC)를 마우스의 정상 췌장에 주입하여 췌장암 마우스 모델을 제작하였다. 이후 췌장암 조직에서 혈관 마커인 CD34와 ANGPTL4를 면역형광 방법으로 동시에 염색하였다. Olympus 공초점 레이저 현미경을 이용하여 사진을 획득하고 CD34 및 ANGPTL4의 발현 양상을 분석하였다.

그 결과, 도 2를 참조하여 보면, ANGPTL4는 HUVEC 세포의 이동성을 증가시키고, 대동맥 고리에서 혈관 세포의 성장을 촉진시켰으며, 췌장암 종양 조직의 혈관 주변에서 ANGPTL4의 발현량이 증가하여 혈관 형성을 촉진시키는 것을 확인하였다.

실시예 3: ANGPTL4 넉다운에 의한 췌장암 세포주의 성장 억제 효과

MIA PaCa-2 췌장암 세포주에 렌티바이러스(lentivirus)로 ANGPTL4를 넉다운 시킨 후, 웨스턴 블랏으로 ANGPTL4의 발현량을 분석하였다.

또한, ANGPTL4를 넉다운 시킨 MIA PaCa-2(sh-ANGPTL4: NM_001039667, NM_139314) 세포주를 24 웰 플레이트에 5 X 10⁴의 세포 밀도로 접종한 다음 24시간 동안 배양하고 0.5% 크리스탈 바이올렛(crystal violet)으로 세포를 염색하여 세포 성장을 관찰하였다.

그 결과, 도 3을 참조하여 보면, ANGPTL4를 넉다운 시켰을 때, MIA PaCa-2 췌장암 세포주의 성장이 현저하게 억제되는 것을 확인하였다.

실시예 4: ANGPTL4 넉다운에 의한 췌장암 세포주의 전이 및 침윤 억제 효과

ANGPTL4를 넉다운 시킨 MIA PaCa-2 췌장암 세포주의 세포 전이 및 침윤 효과를 분석하였다.

간략하게, 세포 전이 분석을 위해, 60 mm 배양 디쉬에 1 X 10⁶의 밀도로 세포를 접종한 다음 100% 밀도가 되도록 세포를 배양하였다. 이후, 200 μL의 파이펫 팁(tip)을 이용하여 약 2 mm 두께의 균일한 선형 스크래치를 만든 다음 48시간 동안 배양하여 세포를 이동시킨 다음 100% 메탄올로 고정시켰다. 이동된 세포는 현미경을 이용하여 분석하였다.

또한, 세포 침윤 분석을 위해, 10% 마트리겔을 무 혈청 배지와 혼합하고, 8.0 μm의 기공 크기(pore size)를 가지는 24 트랜스 웰 플레이트(transwell plate) boyden 챔버에 50 μL씩 넣어 코팅하였다. ANGPTL4를 넉다운 시킨 MIA PaCa-2 췌장암 세포주를 상부 챔버에 2 X 10⁴의 밀도로 접종하고, 하부 챔버에 배양 배지를 첨가하여 48시간 동안 배양하였다. 이후, 4% 파라포름알데하이드로 세포를 고정시킨 다음 크리스탈 바이올렛으로 염색하여 침윤된 세포를 계수하였다.

그 결과, 도 4를 참조하여 보면, ANGPTL4를 넉다운 시켰을 때, MIA PaCa-2 췌장암 세포의 전이 및 침윤이 억제되는 것을 확인하였다.

실시예 5: 암 유발 마우스에서 ANGPTL4 넉다운(sh-ANGPTL4)에 의한 종양 성장 억제 효과

이종이식(xenograft) 및 동소이식(orthotopic) 암 마우스 모델을 제작하기 위해, balb/c 누드 마우스의 등 또는 정상 췌장에 MIA PaCa-2 con 또는 MIA PaCa-2 sh-ANGPTL4 세포를 5 X 10⁶의 밀도로 주입하였다. 이종이식 모델은 1-2주 후에 종양이 생성되면 3일 간격으로 종양의 부피(공식: 장축×단축×단축÷2)를 측정하였고, 동소이식 암 마우스 모델은 췌장암 종양의 크기를 손으로 만져 확인하였다.

이종이식 및 동소이식 암 마우스 모델의 몸무게를 측정하여 마우스의 건강 상태를 확인하였으며, 3-4주 후 마우스를 마취하여 종양을 제거한 후, 종양의 크기 및 무게를 측정하였다.

그 결과, 도 5를 참조하여 보면, 이종이식 및 동소이식 암 마우스 모델에서 ANGPTL4 넉다운에 의해 종양 크기 및 무게가 뚜렷하게 감소되는 것을 확인하였고, 몸무게의 변화는 관찰되지 않았다. 따라서, ANGPTL4가 종양유전자(oncogene)로 작용함을 확인할 수 있었다.

실시예 6: 암 유발 마우스에서 ANGPTL4 넉다운(sh-ANGPTL4)에 의한 암세포 증식 억제, 혈관 형성 억제, 암세포 사멸 증가 효과

상기 이종이식 및 동소이식 암 마우스 모델의 종양 조직에서 세포 증식, 세포 사멸 및 혈관 형성 효과를 분석하기 위해, 헤마톡실린 & 에오신 염색 및 면역조직화학을 수행하였다. 본 실험은 ANGPTL4, 혈관 마커인 CD34, 콜라겐 IV, 세포 성장 마커인 증식성 세포 핵 항원(proliferating cell nuclear antigen; PCNA) 및 세포 사멸 마커인 절단된 카스파제-3(cleaved caspase-3)에 특이적으로 결합하는 1차 항체를 반응시키고, HRP(horseradish peroxidase)가 접합된 2차 항체로 반응시켜 DAB으로 해당 단백질의 발현량을 확인하였다.

그 결과, 도 6을 참조하여 보면, ANGPTL4를 넉다운 시킨 MIA PaCa-2 췌장암 세포주로 제작된 이종이식 및 동소이식 암 마우스 모델에서 ANGPTL4의 발현량이 억제되었을 때, CD34, 콜라겐 IV, PCNA 발현량이 감소하고, 절단된 카스파제-3의 발현이 증가되는 것을 확인한 바, ANGPTL4가 췌장암에서 종양유전자(oncogene) 작용하는 것을 확인할 수 있었다.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술한 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

본 발명의 범위는 후술하는 특허청구범위에 의하여 나타내어지며, 특허청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 균등 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims

ANGPTL4(angiopoietin like 4) 또는 이를 코딩하는 유전자를 유효성분으로 포함하는 췌장암 진단용 바이오마커 조성물.
ANGPTL4 또는 이를 코딩하는 유전자를 유효성분으로 포함하는 췌장암 전이 예후 예측용 바이오마커 조성물.
ANGPTL4의 발현 수준을 측정할 수 있는 제제를 유효성분으로 포함하는 췌장암 진단용 조성물.
제 3항에 있어서, 상기 제제는 ANGPTL4 단백질에 특이적으로 결합하는 항체, 펩타이드, 앱타머 또는 화합물이며, 상기 ANGPTL4 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브인 것을 특징으로 하는 췌장암 진단용 조성물.
ANGPTL4의 발현 수준을 측정할 수 있는 제제를 유효성분으로 포함하는 췌장암 전이 예후 예측용 조성물.
제 5항에 있어서, 상기 제제는 ANGPTL4 단백질에 특이적으로 결합하는 항체, 펩타이드, 앱타머 또는 화합물이며, 상기 ANGPTL4 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브인 것을 특징으로 하는 췌장암 전이 예후 예측용 조성물.
제 3항 또는 제 4항의 조성물을 포함하는 췌장암 진단용 키트.
제 5항 또는 제 6항의 조성물을 포함하는 췌장암 예후 예측용 키트.
(1) 환자에서 분리된 시료로부터 ANGPTL4 유전자의 mRNA 발현 수준 또는 ANGPTL4 단백질의 발현 수준을 측정하는 단계;
(2) 상기 ANGPTL4 유전자의 mRNA 발현 수준 또는 ANGPTL4 단백질의 발현 수준을 대조군 시료와 비교하는 단계; 및
(3) 상기 ANGPTL4 유전자의 mRNA 발현 수준 또는 ANGPTL4 단백질의 발현 수준이 대조군 시료보다 높을 경우 췌장암이라고 판단하는 단계를 포함하는 췌장암 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법.
(1) 췌장암 환자에서 분리된 시료로부터 ANGPTL4 유전자의 mRNA 발현 수준 또는 ANGPTL4 단백질의 발현 수준을 측정하는 단계;
(2) 상기 ANGPTL4 유전자의 mRNA 발현 수준 또는 ANGPTL4 단백질의 발현 수준을 대조군 시료와 비교하는 단계; 및
(3) 상기 ANGPTL4 유전자의 mRNA 발현 수준 또는 ANGPTL4 단백질의 발현 수준이 대조군 시료보다 높을 경우 췌장암의 전이 위험성이 높다고 판단하는 단계를 포함하는 췌장암 전이 예후 예측에 필요한 정보를 제공하는 방법.
ANGPTL4 단백질 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 포함하는 췌장암 예방 또는 치료용 약학 조성물.
ANGPTL4 단백질 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 포함하는 췌장암 전이 억제용 약학 조성물.
(1) 췌장암 세포에 시험물질을 접촉시키는 단계;
(2) 상기 시험물질을 접촉한 췌장암 세포에서 ANGPTL4 단백질의 발현 또는 활성 정도를 측정하는 단계; 및
(3) 대조구 시료와 비교하여 상기 ANGPTL4 단백질의 발현 또는 활성 정도가 감소한 시험물질을 선별하는 단계를 포함하는 췌장암 치료제 스크리닝 방법.
(1) 췌장암 세포에 시험물질을 접촉시키는 단계;
(2) 상기 시험물질을 접촉한 췌장암 세포에서 ANGPTL4 단백질의 발현 또는 활성 정도를 측정하는 단계; 및
(3) 대조구 시료와 비교하여 상기 ANGPTL4 단백질의 발현 또는 활성 정도가 감소한 시험물질을 선별하는 단계를 포함하는 췌장암 전이 억제제 스크리닝 방법.