KR20200000551A - 브루셀라 어보투스 균주 유래의 InpB, Dps, AspC 및 Ndk 단백질을 유효성분으로 포함하는 브루셀라 감염증 예방 또는 치료용 백신 조성물 - Google Patents

Abstract

브루셀라 어보투스 균주 유래의 InpB, Dps, AspC 및 Ndk 단백질을 유효성분으로 포함하는 브루셀라 감염증 예방 또는 치료용 백신 조성물에 관한 것으로, 본 발명의 백신 조성물은 브루셀라 감염증의 예방 또는 치료에 널리 활용될 수 있을 것이다.

Description

브루셀라 어보투스 균주 유래의 InpB, Dps, AspC 및 Ndk 단백질을 유효성분으로 포함하는 브루셀라 감염증 예방 또는 치료용 백신 조성물{Vaccine composition for prevention or treatment of brucellosis comprising InpB, Dps, AspC and Ndk protein derived from Brucella abortus as effective component}

본 발명은 브루셀라 어보투스 균주 유래의 InpB(invasion protein B), Dps(DNA starvation/stationary phase protection protein), AspC(aspartate aminotransferase) 및 Ndk(nucleoside diphosphate kinase) 단백질을 유효성분으로 포함하는 브루셀라 감염증 예방 또는 치료용 백신 조성물에 관한 것이다.

브루셀라 감염증은 대표적인 인수공통 전염병(인체; 4군 법정전염병, 가축; 2종 법정전염병)의 하나이며 국내는 물론 전 세계적으로 공중보건학적 및 경제학적 심각한 문제를 야기한다고 알려져 있다. 최근 국내에서 본 브루셀라 감염증이 인체와 가축에서도 폭발적인 증가를 보이고 있어 국민적 관심사는 물론 이에 대한 대책이 시급한 실정이다.

브루셀라 감염증을 유발하는 브루셀라균은 Brucella abortus(소), B. melitensis(양, 염소), B. canis(개), B. ovis(양), B. suis(돼지) 등이 알려져 있는데, 이들은 모두 인체에 감염하여 심각한 질병을 초래할 수 있고, 국내에서는 브루셀라 어보투스(Brucella abortus)가 높은 비율을 차지하는 것으로 알려져 있다. 브루셀라 감염증이 발병되면, 인체에 감염될 경우 10% 미만의 치사율을 보이고, 지속적 발열, 두통, 식욕부진, 원기쇠약을 보이다가 심내막염, 뇌척수염, 관절염 등 중증 질병으로 진행하게 되며, 감염된 동물에서 보이는 증상은 특별한 외부 증상이 없이 암컷에서의 태반염, 자궁 내막염 등으로 인한 유산과 수컷에서 고환염, 기형정자 등으로 인한 불임을 유발한다고 알려져 있다. 브루셀라균은 세포 내에서 증식하며 발병을 일으키기 때문에 인체감염의 경우 짧게는 수주에서 길게는 수년간의 항생제 치료가 필요하며, 다량의 항생제 복용으로 인한 후유증 등으로 인하여 치료 방법에 대한 개선이 시급한 실정이며, 완치로 판단되었어도 수년 이내에 재발되는 경우가 많아 지속적 관찰이 요구되고 있다.

브루셀라균은 숙주의 저항성이 획득된 세포매개성 면역(cell-mediated immunity, CMI)에 주로 의존하는 세포 내 병원균이기 때문에, 강력한 세포매개성 면역을 자극할 수 있는 살아있는 약독화 백신이 브루셀라 감염증에 대해 주로 사용되고 있다. 비록 백신화가 가장 경제적인 감염 통제 수단이나, 최근 브루셀라 아보투스 S19(smooth) 또는 RB51(rough) 균주와 같은 이용할 수 있는 살아있는 약독화 백신이 특정 숙주 종(species)에서 브루셀라 감염증의 제거에 충분하지 않음이 확인되었다. 더욱이, 살아있는 약독화 백신은 낙태와 젖으로 백신 균주의 배출과 같은 여러 단점을 가지고 있다. 따라서, 효율적이고, 안전하며 효과적인 백신의 개발을 위해 다른 접근방법이 필요되고 있으며, 재조합 단백질을 이용한 면역법이 유망한 후보로 관심받고 있다.

지금까지, 병원성의 브루셀라균 감염에 대항하여 L7/L12 리보솜 단백질, Cu-Zn SOD(superoxide dismutase) 단백질, 22.9-kDa 단백질, lumazine synthase, 외막 단백질인 Omp31, Omp16 또는 Omp19, 및 이인산 뉴클레오사이드 인산화효소(nucleoside diphosphate kinase, NDPK) 등을 포함하는 다양한 종류의 재조합 브루셀라 단백질의 보호 효과에 관한 많은 연구가 보고되었다. 그러나, 단일 항원의 투여는 브루셀라균의 감염으로부터 효과적으로 생쥐의 면역반응을 유도하지 못하여, 다른 종류의 항원 단백질의 조합이 단일 항원보다 높은 보호 효과를 보여줄 것으로 기대되고 있다.

한편, 한국등록특허 제1840360호에는 브루셀라 아보투스 유래 BLS, Omp19, PrpA 및 SOD 항원의 분비를 증가시키도록 개발된 벡터로 LPS의 O-항원이 결실된 약독화 살모넬라균을 유효성분으로 포함하는 '브루셀라 균 주요 공통 항원을 발현하는 LPS의 O-항원 결실 비병원성 살모넬라 균주를 포함하는 브루셀라증 예방 또는 치료용 백신 조성물'이 개시되어 있고, 한국등록특허 제1775369호에는 '브루셀라 어보투스 균주 유래의 Ohr 재조합 단백질을 유효성분으로 포함하는 브루셀라 감염증 예방 또는 치료용 백신 조성물'이 개시되어 있으나, 본 발명의 브루셀라 어보투스 균주 유래의 InpB, Dps, AspC 및 Ndk 단백질을 유효성분으로 포함하는 브루셀라 감염증 예방 또는 치료용 백신 조성물에 대해서는 기재된 바가 없다.

본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명자들은 면역원성 및 감염방어 효과면에서는 생백신에 미치지 못하는 것으로 알려진 서브유닛 백신의 단점을 보완하기 위해, 브루셀라 어보투스(Brucella abortus) 균주 유래의 고면역원성 단백질인 InpB, Dps, AspC 및 Ndk의 재조합 단백질을 제조하고, 상기 4개의 재조합 단백질을 모두 포함하는 서브유닛 백신과 각각의 재조합 단백질을 포함하는 서브유닛 백신을 이용하여 감염방어 효과를 확인한 결과, 4개의 재조합 단백질을 모두 포함하는 서브유닛 백신으로 면역화된 그룹에서 병원성 브루셀라 균을 도전감염하였을 때, 개별 재조합 단백질만을 포함하는 서브유닛 백신으로 면역화된 그룹보다 비장 내 병원성 브루셀라 균의 수가 현저히 감소된 것을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.

상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 브루셀라 어보투스(Brucella abortus) 균주로부터 유래된 InpB(invasion protein B), Dps(DNA starvation/stationary phase protection protein), AspC(aspartate aminotransferase) 및 Ndk(nucleoside diphosphate kinase) 단백질을 유효성분으로 함유하는 브루셀라 감염증의 예방 또는 치료용 서브유닛 백신(subunit vaccine) 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 서브유닛 백신 조성물을 브루셀라 감염증의 발병이 예상되거나, 브루셀라 감염증이 발병된 가축에게 투여하는 단계를 포함하는 브루셀라 감염증의 예방 또는 치료 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 브루셀라 어보투스 균주로부터 유래된 InpB, Dps, AspC 및 Ndk 단백질을 유효성분으로 포함하는 브루셀라 감염증의 예방 또는 개선용 사료 조성물을 제공한다.

본 발명의 백신은 생백신보다 안정성이 우수한 서브유닛 백신으로, 본 발명의 서브유닛 백신은 브루셀라 어보투스 유래의 4개의 고항원성 단백질을 포함하고 있어 면역원성 및 감염방어 효과가 우수하여, 브루셀라 감염증의 예방 또는 치료에 유용하게 활용될 수 있을 것이다.

도 1은 브루셀라 어보투스 유래 재조합 단백질의 면역반응성을 확인한 결과로, (A)는 정제된 단백질을 SDS-PAGE로 전개한 후 쿠마시에 브릴리안트 블루로 겔을 염색한 결과이고, (B)와 (C)는 각각 브루셀라 양성 또는 음성의 마우스 혈청으로 웨스턴 블롯을 수행한 결과이다. 레인 1; MBP, 레인 2; 마커, 레인 3; rDps, 레인 4; rInpB, 레인 5; rYaeC, 레인 6; rAspC.
도 2는 각각의 재조합 단백질로 생쥐를 면역화한 후 유발된 체액성 면역 반응을 확인한 결과이다.
도 3은 CSV(InpB, Dps, AspC 및 Ndk의 조합 서브유닛 백신)로 생쥐를 면역화한 후 유발된 체액성 면역 반응을 확인한 결과이다.
도 4는 CSV로 면역화된 생쥐의 혈액에서 CD4⁺ 및 CD8⁺ T 세포 집단을 분석한 결과이다.

본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 브루셀라 어보투스(Brucella abortus) 균주로부터 유래된 InpB(invasion protein B), Dps(DNA starvation/stationary phase protection protein), AspC(aspartate aminotransferase) 및 Ndk(nucleoside diphosphate kinase) 단백질을 유효성분으로 함유하는 브루셀라 감염증의 예방 또는 치료용 서브유닛 백신(subunit vaccine) 조성물을 제공한다.

본 발명에서 용어 "서브유닛 백신"이란, 미생물에서 분리한 감염방어항원물질을 포함하는 백신을 의미하는 것으로, 통상적으로 단백질 정제 또는 유전자 재조합 기술로 미생물의 일부 단백질만을 사용하는 단백질 서브유닛 백신을 의미한다.

본 발명에 따른 InpB 단백질, Dps 단백질, AspC 단백질 및 Ndk 단백질의 범위는 각각 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3 및 서열번호 4로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 단백질 및 상기 단백질의 기능적 동등물을 포함한다. "기능적 동등물"이란 아미노산의 부가, 치환, 또는 결실의 결과, 상기 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3 또는 서열번호 4로 표시된 아미노산 서열과 적어도 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 더 더욱 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것으로, 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3 또는 서열번호 4로 표시되는 단백질과 실질적으로 동질의 생리활성을 나타내는 단백질을 말한다.

본 발명에서 용어, "예방"이란, 본 발명의 백신 조성물의 투여로 브루셀라 감염증의 발병을 억제 또는 지연시키는 모든 행위를 의미한다.

본 발명에서 용어, "치료"란, 본 발명의 백신 조성물의 투여로 인해 이미 유발된 브루셀라 감염증의 증세가 호전되거나 이롭게 되는 모든 행위를 의미한다.

본 발명의 백신 조성물은 추가로 약제학적으로 허용가능한 담체 또는 희석제를 포함한다. 백신에 적합한 담체는 당해 기술분야의 기술자에게 공지되어 있으며, 단백질, 당 등을 포함하지만, 이로 한정되는 것은 아니다. 상기의 담체는 수용액 또는 비-수용액, 현탁액, 및 에멀전일 수 있다. 비-수용액 담체의 예는 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 식용유 예컨대 올리브 오일, 및 주사가능한 유기 에스테르 예컨대 에틸 올리에이트를 들 수 있다. 수용액 담체는 식염수 및 완충배지를 포함하는, 물, 알콜/수용액, 에멀전 또는 현탁액을 포함한다. 비경구 담체는 염화 나트륨 용액, 링거 덱스트로오스, 덱스트로오스 및 염화나트륨, 유산처리 링거 또는 고정 오일을 포함한다. 정맥주사용 담체는 예컨대 링거 덱스트로오스를 기본으로 하는 것과 같은 전해질 보충제, 액체 및 영양 보충제 등을 포함한다. 방부제 및 기타 첨가제 예컨대 항미생물제제, 항산화제, 킬레이트제, 불활성가스 등과 같은 것이 추가로 존재할 수 있다. 바람직한 방부제는 포르말린, 티메로살, 네오마이신, 폴리믹신 B 및 암포테리신 B를 포함한다.

또한, 본 발명의 백신 조성물은 어주번트(adjuvant, 면역조성제, 면역증강제)를 추가로 포함할 수 있다. 상기 어주번트는 면역반응의 향상 및/또는 접종 후 흡수 속도를 촉진하는 화합물 또는 혼합물을 칭하는 것으로 임의의 흡수-촉진제를 포함한다. 허용 가능한 어주번트로는 프로인트 완전 어주번트(freund's complete adjuvant), 프로인트 불완전 어주번트, 사포닌, 미네랄 젤 예컨대 수산화 알루미늄, 계면활성제 예컨대 리소레시틴, 플루론 폴리올, 다중음이온, 펩타이드, 오일 또는 탄화수소 에멀전, 키홀림펫 헤모시아닌(keyhole limpet hemocyanin), 디니트로페놀 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 백신 조성물은 경구, 경피, 근육내, 복막내, 정맥내, 피하내 또는 비강 중에서 선택된 어느 하나의 투여경로를 통해 투여될 수 있으며, 볼루스(bolus)로 투여하거나 서서히 주입할 수 있으나, 바람직하게는 주사로 투여되는 것이 바람직하다.

본 발명의 백신 조성물은 약제학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명의 용어 "약제학적으로 유효한 양"이란, 백신효과를 나타낼 수 있을 정도의 충분한 양으로, 부작용 또는 심각하거나 과도한 면역반응을 일으키지 않을 정도의 양을 의미하며, 유효 용량의 수준은 치료하려는 장애, 장애의 중증도, 특정 화합물의 활성, 투여 경로, 재조합 단백질(rInpB, rDps, rAspC 및 rNdk)의 제거 속도, 치료 지속 기간, 재조합 단백질과 조합되거나 동시에 사용되는 약물, 대상체의 연령, 체중, 성별, 식습관, 일반적인 건강 상태 및 의학 분야에 공지된 인자를 비롯한 다양한 인자들에 따라 달라질 수 있다. "치료상 유효량"의 결정시, 고려되는 다양한 일반적인 사항들은 당업자에게 공지되어 있다.

본 발명의 일 구현 예에 따른 방법에서, InpB, Dps, AspC 및 Ndk 단백질을 제조할 수 있는 방법으로, 서열번호 5(InpB), 서열번호 6(Dps), 서열번호 7(AspC) 또는 서열번호 8(Ndk)의 유전자를 포함하는 발현 벡터를 숙주세포에 형질전환시켜 InpB, Dps, AspC 또는 Ndk 유전자를 대량 발현하여 정제한 것이 바람직하나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 유전자는 InpB, Dps, AspC 또는 Ndk 단백질을 암호화하는 게놈 DNA와 cDNA를 모두 포함한다. 바람직하게는, 본 발명의 유전자는 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 7 또는 서열번호 8로 표시되는 염기서열을 포함할 수 있다. 또한, 상기 염기 서열의 상동체가 본 발명의 범위 내에 포함된다. 구체적으로, 상기 유전자는 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 7 또는 서열번호 8의 염기 서열과 각각 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 더 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기 서열을 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오티드에 대한 "서열 상동성의 %"는 두 개의 최적으로 배열된 서열과 비교 영역을 비교함으로써 확인되며, 비교 영역에서의 폴리뉴클레오티드 서열의 일부는 두 서열의 최적 배열에 대한 참고 서열(추가 또는 삭제를 포함하지 않음)에 비해 추가 또는 삭제(즉, 갭)를 포함할 수 있다.

용어 "벡터"는 세포 내로 전달하는 DNA 단편(들), 핵산 분자를 지칭할 때 사용된다. 벡터는 DNA를 복제시키고, 숙주세포에서 독립적으로 재생산될 수 있다. 용어 "발현 벡터"는 흔히 "재조합 벡터"와 호환하여 사용된다. 용어 "재조합 벡터"는 목적한 코딩 서열과, 특정 숙주 생물에서 작동가능하게 연결 코딩 서열을 발현하는데 필수적인 적정 핵산 서열을 포함하는 재조합 DNA 분자를 의미한다. 진핵세포에서 이용 가능한 프로모터, 인핸서,종결신호 및 폴리아데닐레이션 신호는 공지되어 있다.

본 발명에서 용어, "재조합"은 세포가 이종의 핵산을 복제하거나, 상기 핵산을 발현하거나 또는 펩티드, 이종의 펩티드 또는 이종의 핵산에 의해 코딩된 단백질을 발현하는 세포를 지칭하는 것이다. 재조합 세포는 상기 세포의 천연 형태에서는 발견되지 않는 유전자 또는 유전자 절편을, 센스 또는 안티센스 형태 중 하나로 발현할 수 있다. 또한 재조합 세포는 천연 상태의 세포에서 발견되는 유전자를 발현할 수 있으며, 그러나 상기 유전자는 변형된 것으로서 인위적인 수단에 의해 세포 내 재도입된 것이다.

본 발명은 또한, 상기 서브유닛 백신 조성물을 브루셀라 감염증의 발병이 예상되거나, 브루셀라 감염증이 발병된 가축에게 투여하는 단계를 포함하는 브루셀라 감염증의 예방 또는 치료 방법을 제공한다.

본 발명의 용어 "가축"이란, 브루셀라 감염증이 발병될 수 있는 동물로, 바람직하게는 소, 돼지, 양, 염소, 개 등의 가축이 될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 서브유닛 백신 조성물을 상기 가축에게 투여하면, 브루셀라 감염증을 유발시키는 균주에 대하여 개체의 면역성을 증진시켜서, 브루셀라 감염증을 예방 또는 치료하는 효과를 나타낼 수 있다.

본 발명은 또한, 브루셀라 어보투스(Brucella abortus) 균주로부터 유래된 InpB(invasion protein B), Dps(DNA starvation/stationary phase protection protein), AspC(aspartate aminotransferase) 및 Ndk(nucleoside diphosphate kinase) 단백질을 유효성분으로 함유하는 브루셀라 감염증의 예방 또는 개선용 사료 조성물을 제공한다.

본 발명에 따른 상기 InpB 단백질, Dps 단백질, AspC 단백질 및 Ndk 단백질은 각각 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3 및 서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있고, 그 범위는 전술한 것과 같다.

본 발명은 당해 기술분야에 공지된 일반적인 사료 성분을 포함할 수 있다. 예컨대, 본 발명의 사료 조성물은 곡물 가루, 당질, 비타민, 아미노산, 단백질, 지질, 광물질 등을 포함할 수 있다.

본 발명의 사료 조성물에는 곡물 및 곡물 부산물이 사용될 수 있는데, 예컨대 평지씨, 면실, 대두, 밀기울，미강，탈지강，맥강, 옥수수겨，맥아근，대두피，감자 전분，고구마 전분，옥수수 전분，커피박，잠사，잠분，해조분，타피오카，대두박，면실박，임자박，채종박，아마박，호마박，옥수수글루텐，밀글루텐, 낙화생박，야자박，해바라기씨박，주정박，옥수수배아박, 고추씨박，장유박，맥주박 중에서 선택된 하나 또는 2종 이상이 혼합될 수 있다.

본 발명의 사료 조성물은 수용성 및 불용성 모노사카라이드, 디사카라이드 및 폴리사카라이드와 같은 당 및 복합 탄수화물을 포함할 수 있다. 사용될 수 있는 당질로서 보다 상세하게는, 포도당, 만노오스, 프룩토오스, 백당, 맥아당, 셀로비오스, 젖당, 트레할로오스, 멜리비오스, 라피노오스, 에스크린, 살리신, 아미그달린, 만니톨, 솔비톨, 소르보스, 멘티토오스 등을 들 수 있으며, 당밀, 자당 뿐만 아니라 올리고당도 병용하여 이용할 수 있다.

본 발명의 사료 조성물에 포함될 수 있는 임의의 아미노산 성분에는 아르기닌, 히스티딘, 이소루신, 루신, 리신, 메티오닌, 페닐알라닌, 트레오닌, 트립토판, 발린, 티로신, 알라닌, 아스파르트산, 글루탐산나트륨, 글리신, 프롤린, 세린, 시스테인, 및 이들의 동족체, 및 이들의 염이 있다.

또한, 본 발명의 사료 조성물에 임의로 첨가할 수 있는 티아민(비타민 B1)· HCl, 리보플라빈(비타민 B2), 피리독신(비타민 B6)·HCl, 니아신(비타민 B3), 니아신아미드(수용성비타민과 비타민 B의 복합체), 이노시톨(비타민 B8), 염화콜린(비타민 B4), 판토텐산칼슘(비타민 B5), 바이오틴(비타민 B7), 폴산(비타민 B9) 등의 비타민 B군 및 비타민 A, C, K, D 및 E 등이 있다. 이 중, 특히 비타민 A, 비타민 B군 및 비타민 E는 항산화 물질로도 사용될 수 있다.

본 발명의 사료 조성물에 포함될 수 있는 지방산은, 예를 들어, 대두유, 평지씨유, 옥수수유, 홍화유, 해바라기유, 라이스유, 비프스테이크 식물유, 달맞이꽃유, 유리지치유, 아마인유 등의 식물유, 및 가다랭이, 고등어, 정어리 등의 어유 및 각종 미생물 유래의 트리글리세라이드 등의 유지를 가수분해 처리함으로써 획 득할 수 있고, 상기에서 얻어지는 지방산의 금속염으로서 지방산의 칼슘염 및 마그네슘염 또한 포함될 수 있다. 본 발명의 사료 조성물에는 사장석, 벤토나이트, 맥반석 등 공지의 바이오세라믹 물질이 소량 첨가되어 항균 기능 등을 배가시킬 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

재료 및 방법

1. 박테리아 균주 및 성장 조건

Smooth형, 병원성의 브루셀라 어보투스(Brucella abortus) 544 생태형(biovar) 1 균주는 농림수산검역검사본부(Animal, Plant and Fisheries Quarantine and Inspection Agency)로부터 분양받아 사용하였으며, 대장균 DH5α 균주는 Invitrogen(미국)에서 구매하여 사용하였다. 브루셀라 어보투스 균의 배양은 브루셀라 배양액(BD Biosciences, 미국)을 사용하여 37℃에서 정지상까지 배양하였으며, 대장균 균주는 100㎍/㎖의 암피실린(Sigma, 미국)을 포함하는 LB 액체 또는 고체배지를 사용하여 37℃에서 배양시켰다.

2. 플라스미드의 준비 및 재조합 단백질의 정제

브루셀라 어보투스의 InpB, Dps, AspC 및 Ndk 유전자의 클로닝 및 단백질 정제는 이전 연구의 방법을 따라 수행하였다(Hop HT. et al., FEMS Microbiol Lett. 2015, 362(4)). 간략하게, 상기 각각의 브루셀라 어보투스 유전자의 전장을 pMAL 벡터로 클로닝하기 위해 유전자 특이적인 프라이머 세트를 이용하였다(표 1). 각각의 유전자를 포함하는 벡터로 형질전환된 대장균 세포를 배양하여 재조합 단백질을 생산하였으며, 배양 시 단백질 발현 유도를 위한 IPTG(Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside)의 사용량은 하기 표 1에 제시하였다.

프라이머 세트 및 단백질 발현 유도를 위한 IPTG 사용양

유전자	정방향 (5'→3') (서열번호)	역방향 (5'→3') (서열번호)	IPTG (mM)
InpB	AGCGGATCCATGAAAAATTATCG3 (9)	ATCCTGCAGTTACTTGGTCAATGC (10)	0.4
Dps	AGCGGATCCATGCCGAAGAAGTC (11)	ATCCTGCAGTTAATTGCTTTCCTG (12)	0.1
AspC	AGCGGATCCATGGCATTTCTCGCC (13)	ATCCTGCAGTCAGCGCAGGCTGGC (14)	2.0
Ndk	CGCGGATCCATGGCAATTGAACG (15)	GGCCTGCAGTCAGCCAACGATTTC (16)	0.2
YaeC	AGCGGATCCATGTCGTCAGTCCTT (17)	ATCCTGCAGTTAATTCCAGGCCGG (18)	1.0

(밑줄 : BamHI 및 PstI 제한효소 자리)

재조합 단백질의 정제는 배양한 세포를 3,000xg의 속도로 10분간 원심분리하여 세포 펠렛을 수거하고, 20㎖의 컬럼 완충액으로 재현탁시킨 후 -70℃/4℃의 동결융해(freeze-thaw) 과정을 3회 반복한 후, 얼음통 안에 넣고 10,000Hz 조건으로 초음파 파쇄하였다. 그 후, 5,000xg의 속도로 20분간 원심분리하여 상층액을 회수하고, 10mM 말토즈를 함유하는 컬럼 완충액을 용출액으로 이용하여 말토즈 레진 컬럼(Bio-Rad)으로 재조합 단백질을 정제하였다.

3. SDS-PAGE 및 웨스턴 블롯

단백질의 발현이 유도된 세포의 용출물과 정제된 재조합 단백질은 SDS-PAGE 및 웨스턴 블롯을 이용하여 분석하였다. 브루셀라 어보투스-음성 또는 양성의 생쥐 혈청을 1차 항체로 사용하였다.

4. 생쥐 면역화 및 세균 도전감염

각각의 개별 항원의 보호 효과를 검정하기 위해서, 6주령의 암컷 BALB/c 생쥐(Japan SLC, 일본) 35마리를 7개의 그룹으로 나누었다. 각각의 생쥐는 100㎕의 프로인트 불완전 어주번트(incomplete Freund's adjuvant, Sigma)에 10㎍의 단백질(MBP, InpB, Dps, AspC 또는 Ndk) 또는 PBS를 혼합하여, 0, 2, 4 및 6주차에 복강내로 투여하여 면역화시켰다.

혼합 서브유닛 백신(InpB, Dps, AspC 및 Ndk의 combined subunit vaccine, 이하 CSV)의 보호 효과를 확인하기 위해, 20마리의 생쥐를 무작위로 4개의 그룹으로 나눈 후, 100㎕의 프로인트 불완전 어주번트에 20㎍의 혼합단백질(InpB, Dps, AspC 및 Ndk이 1:1:1:1의 비율로 혼합) 또는 PBS를 혼합하여, 0, 2, 4 및 6주차에 복강내 투여하여 면역화를 유도하였다. 양성 대조군으로 5 × 10⁶ CFU RB51(/100㎕ PBS)을 0일차에 복강내 투여하여 사용하였다. 개별 항원 및 혼합 서브유닛 백신 면역화 그룹은 모두 8주차에 각 생쥐의 꼬리 정맥으로부터 채혈하여 혈청 시료를 확보하고, 각각의 생쥐는 5 × 10⁵ CFU 브루셀라 어보투스(/100㎕ PBS)를 복강내로 투여하여 도전감염시켰다.

5. 말초 혈액 내의 CD4 ⁺ 및 CD8 ⁺ T 세포의 정량

생쥐로부터 채혈한 말초 혈액 내의 세포 집단은 이전의 방법에 따라 수행하였다(Yang Z. et al., Vaccine 2007, 25:161-9). 각각의 생쥐로부터 채혈한 100㎕의 혈액에 FITC-결합 래트 항-마우스 CD4 및 PE-결합 래트 항 마우스 CD8 단클론항체(SantaCruz Biotechnology, 미국)를 75㎕ 첨가하고, 암 조건, 상온에서 30분간 반응시켰다. 그 후, 적혈구 융해 버퍼 1㎖을 첨가하고 37℃에서 30분간 반응시켰다. 상기 반응은 2㎖의 PBS를 첨가하여 종료시키고, 4℃, 380xg, 5분간 원심분리하여 상층액을 버리고 세포 펠렛은 PBS로 2회 세척하고, 0.5㎖의 PBS로 재현탁시킨 후 FACS Calibur 유세포분석기(BD Biosciences)로 분석하였다.

6. ELISA 및 사이토카인 정량

재조합 단백질에 특이적인 혈청 내 IgG1 및 IgG2a의 역가는 Luo 등(Infect Immun. 20016, 74:2734-41)의 방법을 참고하여 ELISA 분석을 통해 수행하였다. 컷오프 값은 1:100으로 희석한 비-면역화 생쥐 혈청을 기준으로 OD 값의 평균과 표준편차를 더하여 계산하였다. 혈청 내 IL-10, IL-12p70 및 INF-γ의 수준은 cytometric bead array(BD CBA Mouse Inflammation Kit)를 사용하여 분석하였다.

7. 감염보호 실험

감염보호 연구는 Luo 등의 방법을 일부 변형하여 수행하였다. 세균 감염 4주 후, 생쥐를 희생시켜 비장을 적출하고, 무게를 단 후, PBS 조건에서 균질화하였다. 균질화된 용액을 PBS를 사용하여 10배씩 계열 희석한 후, 브루셀라 고체배지에 올려 37℃에서 3일 동안 배양시켰다. 각 시료에서 log₁₀ CFU를 계산하고, 보호효과는 PBS 그룹의 log₁₀ CFU에서 각 실험군의 log₁₀ CFU 값을 빼서 계산하였다. 모든 동물 실험은 경상대학교 동물 윤리 위원회의 지침에 따라 수행되었다(승인 번호 GNU-170331-M0017).

실험의 모든 결과는 평균±표준편차로 표현하였으며, 일원분산분석(one-way ANOVA)로 검정하였다.

실시예 1. 재조합 단백질의 정제 및 면역원성 분석

정제한 각각의 재조합 단백질을 10% SDS-PAGE 겔에 전개하여 각 단백질의 크기와 면역원성을 확인한 결과, 재조합 단백질 rDps, rInpB, rYaeC 및 rAspC는 각각 61.92, 63, 74 및 87.9kDa의 분자량을 보여주었으며(도 1A), 동시에 브루셀라 어보투스-양성 혈청에는 강한 반응성을 보였으나, 브루셀라 어보투스-음성 혈청에는 면역반응이 일어나지 않는 것으로 확인되었다(도 1B 및 1C).

실시예 2. 단일 항원 투여에 따른 면역반응 분석

이전의 연구에서 재조합 단백질을 이용한 세 번의 독립적인 면역화 후에 면역반응이 최고점에 달하는 것을 확인하였다. 본 발명에서도 세 번의 독립적인 항원 단백질(서브유닛 백신) 접종 후에 생쥐의 혈청 시료를 확보하여 면역반응을 분석하였다. 그 결과, rDps, rInpB, rYaeC 및 rAspC로 면역화시킨 혈청 시료에서는 PBS 또는 MBP(maltose binding protein)로 면역화시킨 혈청 시료에서보다 높은 체액성 면역반응이 유도된 것을 알 수 있었다(도 2). 또한, IgG2a의 역가가 IgG1 보다 높은 것으로 확인되어, 본 발명의 rDps, rInpB 및 rAspC 단백질은 Th1 반응이 우세한 면역반응을 유도함을 유추할 수 있었다. 그러나, rYaeC 단백질은 IgG1의 역가가 IgG2a 보다 높은 것으로 관찰되어, rYaeC 단백질은 Th2 반응이 우세한 면역반응을 유도함을 유추할 수 있었다.

세포-매개 면역 반응을 확인하기 위해서, 혈청 내 사이토카인의 수준을 분석한 결과, 하기 표 2에서 확인되는 것과 같이 MBP로 면역화한 생쥐에서는 IL-10, IL-12p70 및 INF-γ의 생산이 유도되지 않은 반면, rDps, rInpB 및 rAspC로 면역화한 생쥐에서는 IL-10 및 INF-γ의 생산이 유도되었고, IL-12p70은 rDps 및 rAspC로 면역화시킨 생쥐의 혈청에서만 확인되었다. rYaeC 단백질은 다른 단백질들에 비해 사이토카인의 생성 유도가 약한 것으로 확인되었다.

단일 서브유닛 백신으로 면역화시킨 생쥐 혈청의 사이토카인 수준 분석

백신 항원	사이토카인 농도(pg/㎖)
	INF-γ	IL-10	IL-12p70
PBS	not detectable	not detectable	0.16 ± 0.03
MBP	0.28 ± 0.08	not detectable	0.21 ± 0.06
rDps	6.47 ± 0.44	1.42 ± 0.05	3.31 ± 0.29
rInpB	5.13 ± 0.73	2.42 ± 0.04	0.26 ± 0.12
rYaeC	1.77 ± 0.41	0.92 ± 0.50	0.10 ± 0.14
rAspC	8.62 ± 0.30	2.66 ± 0.22	5.47 ± 0.64

실시예 3. 단일 서브유닛 백신화 생쥐에서 브루셀라균 도전감염에 대한 보호 효과 분석

상기 단일 재조합 단백질(항원)의 백신 효과를 확인하기 위해, 면역화 반응 2주 후 브루셀라 어보투스 균을 도전감염시키고, 세균 감염 4주 후 생쥐를 희생시켜 비장 내 도전감염 균의 수를 확인하였다. 그 결과, 표 3에 나타난 것과 같이, rDps, rInpB 및 rAspC 서브유닛 백신화 그룹에서는 PBS 처리군에 비해 유의성 수준에서 도전감염 균의 수가 감소된 것을 알 수 있었고, PBS 처리군 대비 log 보호 효과가 각각 1.35, 1.13 및 1.48배 높은 것을 알 수 있었다. MBP와 rYaeC 단백질로 백신화한 그룹은 실시예 1의 면역반응 분석 결과와 유사하게 PBS 처리군과 비교하여 도전감염 균주에 대항한 보호 효과가 없음을 알 수 있었다.

단일 서브유닛 백신으로 면역화한 생쥐의 도전감염 결과

백신 항원	비장 내 브루셀라 균 수 (log10, 평균 ± 표준편차)	log 보호 효과	유의성
PBS	5.79 ± 0.36
MBP	5.65 ± 0.17	0.14	p > 0.05
rDps	4.44 ± 0.12a	1.35	p < 0.01
rInpB	4.66 ± 0.10a	1.13	p < 0.01
rYaeC	5.34 ± 0.19	0.45	p > 0.05
rAspC	4.31 ± 0.25a	1.48	p < 0.01

실시예 4. 혼합 서브유닛 백신 면역화 생쥐의 체액성 면역반응 분석

상기 결과를 통해, InpB, Dps 및 AspC 단백질이 고면역성 항원임을 확인할 수 있었고, 본 발명자들의 이전 연구(Hop HT. et al., FEMS Microbiol Lett. 2015, 362(4))를 통해 확인된 Ndk 단백질을 조합하여 브루셀라 감염증에 대한 백신을 제조하였다.

먼저, 혼합 서브유닛 백신(InpB, Dps, AspC 및 Ndk의 조합 서브유닛 백신, 이하 CSV)으로 면역화시킨 생쥐의 면역반응을 분석하였다. CSV의 면역반응은 1회 백신 투여 후의 혈청과, 3회 백신 투여 후 혈청을 사용하여 분석하였다. 그 결과, CSV로 면역화한 그룹은 MBP로 면역화한 그룹에 비해 1회 면역화 후에도 활발한 IgG 반응을 보였으며, 백신 접종 횟수가 증가할수록 IgG의 역가가 증가하는 것을 알 수 있었다(도 3). 비록, 생균 백신(RB51)으로 면역화한 그룹이 CSV로 면역화한 그룹보다 체액성 반응이 높은 것으로 확인되었으나, 생균 백신 그룹은 IgG2a/IgG1의 비율이 1 보다 작게 확인된 반면, CSV로 면역화한 그룹은 IgG2a/IgG1의 비율이 1.2로 높게 확인되어, Th1 반응이 우세한 면역반응임을 유추할 수 있었다. PBS만 주사한 그룹에서는 체액성 면역이 유도되지 않았다(결과 미첨부).

또한, 각 그룹의 사이토카인 수준을 분석한 결과, 하기 표 4와 같이 PBS만 주사한 그룹에서는 사이토카인의 생성을 유도하지 못하였으나, RB51 또는 CSV로 면역화한 그룹은 1회 백신 접종 후에도 IL-10, IL-12p70 및 INF-γ의 생산이 유도되는 것을 알 수 있었다. 또한, MBP로 면역화한 그룹은 1회 백신 접종 후에는 사이토카인의 생성을 유도하지 못함을 알 수 있었다. 특히, CSV로 면역화한 그룹은 IL-10, IL-12p70 및 INF-γ의 수준이 3회 접종 시까지 점차 증가하는 것을 알 수 있었고, 특히 INF-γ의 수준이 현저히 증가한 반면, RB51로 면역화한 그룹은 2주차에 분석된 사이토카인의 수준이 8주차에는 경미하게 감소되는 것을 알 수 있었다.

혼합 서브유닛 백신으로 면역화시킨 생쥐 혈청의 사이토카인 수준 분석

	사이토카인 농도(pg/㎖)
	INF-γ		IL-10		IL-12p70
weeks	2	8	2	8	2	8
PBS	ND	ND	ND	ND	ND	ND
MBP	ND	0.14±0.16	ND	ND	ND	0.15±0.13
RB51	14.2±1.03	6.72±0.89	4.18±0.29	3.24±0.36	2.51±0.34	1.67±0.18
CSV	2.17±0.42	17.32±1.27	0.94±0.11	3.08±1.04	0.84±0.20	4.63±1.21

(ND : not detectable)

실시예 5. 혼합 서브유닛 백신에 의한 말초 혈액 내 CD4 ⁺ 및 CD8 ⁺ T 세포 서브세트 분석

CD4⁺ 및 CD8⁺ T 세포는 세포성 면역에 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있으며, 브루셀라 저항성에 중요한 기여를 하는 것으로 알려져 있다. 본 발명에서는 백신 접종에 의한 말초 혈액 내 T 세포의 서브세트를 유세포분석기를 사용하여 분석하였다.

그 결과, PBS 및 MBP 처리구는 CD4⁺ 및 CD8⁺ T 세포의 집단 수준에 변화가 없는 것으로 확인되었으나, RB51 또는 CSV로 면역화한 그룹은 CD4⁺ 및 CD8⁺ T 세포의 분화가 유도된 것을 알 수 있었다(도 4). 또한, CSV로 면역화한 그룹은 2주차 및 8주차까지 높은 수준의 CD4⁺ 및 CD8⁺ T 세포 집단이 확인되었으나, RB51로 면역화한 그룹은 2주차에 높게 확인되었던 CD4⁺ 및 CD8⁺ T 세포 집단이 8주차에는 PBS 처리구와 유사한 수준으로 감소된 것을 관찰할 수 있었다.

실시예 6. 혼합 서브유닛 백신화 생쥐에서 브루셀라균 도전감염에 대한 보호 효과 분석

상기 실시예 3과 동일한 방법으로 CSV의 백신 효과를 분석한 결과, 본 발명의 CSV가 브루셀라균에 대한 우수한 보호 효과를 나타내는 것을 알 수 있었다(표 5).

혼합 서브유닛 백신으로 면역화한 생쥐의 도전감염 결과

백신 항원	비장 내 브루셀라 균 수 (log10, 평균 ± 표준편차)	log 보호 효과	유의성
PBS	5.23 ± 0.48
MBP	5.17 ± 0.26	0.06	p > 0.05
RB51	2.92 ± 0.15a	2.31	p < 0.01
CSV	3.04 ± 0.13a	2.19	p < 0.01

<110> INDUSTRY-ACADEMIC COOPERATION FOUNDATION GYEONGSANG NATIONAL UNIVERSITY <120> Vaccine composition for prevention or treatment of brucellosis comprising InpB, Dps, AspC and Ndk protein derived from Brucella abortus as effective component <130> PN18144 <160> 18 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 173 <212> PRT <213> Brucella abortus <400> 1 Met Lys Asn Tyr Arg Ala Ile Gly Leu Ala Phe Thr Phe Thr Ala Leu 1 5 10 15 Ser Ser Leu Ser Ala Phe Ala Ala Ser Leu Pro Gly Gly Ala Ser Thr 20 25 30 Leu Gln Glu Thr Tyr Gln Asp Trp Thr Val Ser Cys Gln Ser Gln Lys 35 40 45 Asp Thr Thr Ala Cys Val Met Arg Gln Glu Gln Ser Ser Ala Gln Thr 50 55 60 Gly Gln Arg Val Leu Thr Ala Glu Leu Arg Asn Val Ala Gly Gly Lys 65 70 75 80 Val Asp Gly Val Leu Leu Met Pro Phe Gly Leu Asp Leu Ala Lys Gly 85 90 95 Ala Ser Leu Lys Ile Asp Asp Thr Ala Gly Pro Asn Leu Thr Phe Ser 100 105 110 Thr Cys Leu Pro Gln Gly Cys Leu Ala Pro Val Ser Phe Asp Ala Lys 115 120 125 Gln Val Ala Ala Leu Lys Ser Gly Thr Asn Ile Asn Val Thr Thr Thr 130 135 140 Ala Leu Ser Pro Ser Gln Pro Val Ala Phe Lys Ile Ser Leu Lys Gly 145 150 155 160 Phe Gly Ala Ala Leu Asp Arg Ile Gln Ala Leu Thr Lys 165 170 <210> 2 <211> 165 <212> PRT <213> Brucella abortus <400> 2 Met Pro Lys Lys Ser Met His Ala Thr Arg Asn Asp Leu Pro Ser Asn 1 5 10 15 Thr Lys Thr Thr Met Ile Ala Leu Leu Asn Glu Asn Leu Ala Ala Thr 20 25 30 Ile Asp Leu Ala Leu Ile Thr Lys Gln Ala His Trp Asn Leu Lys Gly 35 40 45 Pro Gln Phe Ile Ala Val His Glu Met Leu Asp Gly Phe Arg Ala Glu 50 55 60 Leu Asp Asp His Val Asp Thr Ile Ala Glu Arg Ala Val Gln Ile Gly 65 70 75 80 Gly Thr Ala Tyr Gly Thr Thr Gln Val Val Val Lys Glu Ser Arg Leu 85 90 95 Lys Pro Tyr Pro Thr Asp Ile Tyr Ala Val His Asp His Leu Val Ala 100 105 110 Leu Ile Glu Arg Tyr Gly Asp Val Ala Asn Leu Val Arg Lys Ser Ile 115 120 125 Lys Asp Ala Asp Asp Ala Gly Asp Asp Asp Thr Ala Asp Ile Phe Thr 130 135 140 Ala Ala Ser Arg Ser Leu Asp Lys Ala Leu Trp Phe Leu Glu Ala His 145 150 155 160 Val Gln Glu Ser Asn 165 <210> 3 <211> 400 <212> PRT <213> Brucella abortus <400> 3 Met Ala Phe Leu Ala Asp Ala Leu Ser Arg Val Lys Pro Ser Ala Thr 1 5 10 15 Ile Ala Val Ser Gln Lys Ala Arg Glu Leu Lys Ala Lys Gly Lys Asp 20 25 30 Val Ile Val Leu Gly Ala Gly Glu Pro Asp Phe Asp Thr Pro Glu Asn 35 40 45 Ile Lys Gln Ala Ala Ile Ala Ala Ile Asn Arg Gly Glu Thr Lys Tyr 50 55 60 Thr Pro Val Ser Gly Ile Pro Gln Leu Arg Gln Ala Ile Val Ser Lys 65 70 75 80 Phe Lys Arg Glu Asn Gly Leu Asp Tyr Lys Pro Glu Gln Thr Ile Val 85 90 95 Gly Thr Gly Gly Lys Gln Ile Leu Phe Asn Ala Phe Met Ala Thr Leu 100 105 110 Asn Pro Gly Asp Glu Val Ile Ile Pro Ala Pro Tyr Trp Val Ser Tyr 115 120 125 Pro Glu Met Val Ala Ile Asn Gly Gly Thr Pro Val Phe Val Asp Thr 130 135 140 Lys Ile Glu Asp Asn Phe Lys Leu Thr Ala Ala Asp Leu Glu Lys Ala 145 150 155 160 Ile Thr Pro Lys Thr Lys Trp Leu Ile Phe Asn Ser Pro Ser Asn Pro 165 170 175 Thr Gly Ala Ala Tyr Thr Gln Ala Glu Leu Lys Ser Leu Thr Asp Val 180 185 190 Leu Val Arg His Pro His Val Trp Ile Leu Thr Asp Asp Met Tyr Glu 195 200 205 His Leu Val Tyr Gly Asp Phe Val Phe Thr Thr Pro Ala Gln Val Glu 210 215 220 Pro Ser Leu Tyr Asp Arg Thr Leu Thr Met Asn Gly Val Ser Lys Ala 225 230 235 240 Tyr Ala Met Thr Gly Trp Arg Ile Gly Tyr Ala Ala Gly Pro Ile Glu 245 250 255 Leu Ile Lys Ala Met Asp Met Ile Gln Gly Gln Gln Thr Ser Gly Ala 260 265 270 Cys Ser Ile Ala Gln Trp Ala Ala Val Glu Ala Leu Asn Gly Thr Gln 275 280 285 Asp Phe Ile Pro Ala Asn Lys Lys Ile Phe Gln Ala Arg Arg Asp Leu 290 295 300 Val Val Ser Met Leu Asn Gln Ala Thr Gly Leu Gln Cys Pro Thr Pro 305 310 315 320 Glu Gly Ala Phe Tyr Val Tyr Pro Ser Cys Ala Gly Leu Ile Gly Lys 325 330 335 Lys Thr Glu Ala Gly Lys Val Ile Glu Thr Asp Lys Asp Phe Val Thr 340 345 350 Glu Leu Leu Glu Thr Glu Gly Val Ala Val Val His Gly Ser Ala Phe 355 360 365 Gly Leu Gly Pro Asn Phe Arg Ile Ser Tyr Ala Thr Ser Asp Glu Leu 370 375 380 Leu Glu Lys Ala Cys Ile Arg Ile Gln Arg Phe Cys Ala Ser Leu Arg 385 390 395 400 <210> 4 <211> 140 <212> PRT <213> Brucella abortus <400> 4 Met Ala Ile Glu Arg Thr Phe Ser Met Ile Lys Pro Asp Ala Thr Arg 1 5 10 15 Arg Asn Leu Thr Gly Ala Ile Ile Ala Lys Leu Glu Glu Ala Gly Leu 20 25 30 Arg Val Val Ala Ser Lys Arg Val Trp Met Ser Arg Arg Glu Ala Glu 35 40 45 Gly Phe Tyr Ala Val His Lys Asp Arg Pro Phe Phe Gly Glu Leu Val 50 55 60 Glu Phe Met Ser Ser Gly Pro Thr Val Val Gln Val Leu Glu Gly Glu 65 70 75 80 Asn Ala Ile Ala Lys Asn Arg Glu Val Met Gly Ala Thr Asn Pro Ala 85 90 95 Asn Ala Asp Glu Gly Thr Ile Arg Lys Thr Phe Ala Leu Ser Ile Gly 100 105 110 Glu Asn Ser Val His Gly Ser Asp Ala Pro Glu Thr Ala Ala Glu Glu 115 120 125 Ile Ala Tyr Trp Phe Ser Gly Thr Glu Ile Val Gly 130 135 140 <210> 5 <211> 522 <212> DNA <213> Brucella abortus <400> 5 atgaaaaatt atcgtgcaat cggtcttgca ttcacgttca ctgccctttc cagtctttcg 60 gcctttgcag cctccctgcc cggcggagca agcaccttgc aggaaaccta tcaggactgg 120 accgtgtctt gccagtcgca gaaggataca acagcctgcg tgatgcgtca ggagcaaagc 180 agcgcccaga ccggccagcg cgttctgact gccgagctgc gcaacgtcgc cggcggcaaa 240 gttgacggtg tgttgctgat gccgttcggt cttgatcttg ccaagggcgc ctcgctcaag 300 attgatgaca ccgctgggcc aaacctcacc ttctccacct gcctgccgca gggctgcctc 360 gcgccagtga gcttcgatgc caagcaggtt gctgcgctga aatccggcac caacatcaat 420 gtcaccacga cggcgctcag cccgagccag ccggttgcct tcaagatttc cctgaaaggc 480 ttcggtgccg cgctcgaccg cattcaggca ttgaccaagt aa 522 <210> 6 <211> 498 <212> DNA <213> Brucella abortus <400> 6 atgccgaaga agtcgatgca tgcaacccgc aacgatcttc cctccaatac caagacgacg 60 atgatcgcgc tgctcaacga gaatcttgcc gcaacaatcg atcttgccct catcaccaag 120 caggcgcact ggaacctcaa gggaccgcaa ttcatcgccg tgcatgaaat gctcgatggt 180 ttccgcgcag aactcgacga ccatgtggac acgattgccg aacgtgccgt gcagatcggc 240 ggaacggcct atggtacaac ccaggtcgtg gtgaaggaat ccagactgaa gccttacccg 300 accgacattt atgccgtcca cgaccatctg gtggcactga tcgaacgcta tggtgatgtt 360 gccaatctgg tgcgcaaatc gatcaaggat gcagacgacg cgggtgacga cgacacggca 420 gatattttca ccgccgcatc gcgcagcctc gacaaggcac tctggttcct cgaagcgcat 480 gtgcaggaaa gcaattaa 498 <210> 7 <211> 1203 <212> DNA <213> Brucella abortus <400> 7 atggcatttc tcgccgacgc cctttcccgt gtaaagccat ctgcgaccat cgctgtcagc 60 cagaaagcac gtgaactgaa agcaaaaggc aaggacgtga tcgtcctggg cgcaggtgag 120 ccggatttcg acacgcctga aaatatcaag caggcggcca ttgccgcgat caatcgcggt 180 gaaacaaagt acacgcccgt atccggcatc ccgcaactgc gccaggccat cgtctccaag 240 ttcaagcgtg aaaacggcct cgactacaag ccggaacaga ccatcgtcgg caccggcggc 300 aagcagattt tgttcaacgc cttcatggcc acgctgaacc ccggcgacga agtcatcatt 360 cccgccccct attgggtcag ctacccggaa atggtggcca tcaacggcgg caccccggtt 420 ttcgtcgaca cgaagattga agacaatttc aagctgaccg ctgccgatct cgaaaaggcg 480 atcacaccga agaccaagtg gctcatcttc aactcgccct ccaacccgac cggcgcggcc 540 tatacgcaag ccgaactgaa gtcgctgacc gacgttctcg tgcgccatcc gcatgtctgg 600 atcttgaccg acgacatgta tgagcatctg gtctatggcg atttcgtctt cacgacgcct 660 gctcaggtgg aaccctcgct ctatgaccgt acgctcacca tgaacggcgt ttccaaggcc 720 tatgccatga ccggctggcg catcggctat gccgccggtc caatcgagct catcaaggcc 780 atggacatga ttcaggggca gcagacctcc ggtgcctgct cgattgctca gtgggcagcg 840 gtcgaagcac tgaacggcac gcaggatttc atccccgcga acaagaaaat cttccaggcc 900 cgccgcgatc tggtcgtttc catgctcaac caggcaaccg gcctccagtg cccgacgccg 960 gaaggcgcgt tctatgtcta tccgtcctgc gcagggctga tcggcaagaa gaccgaagcg 1020 ggcaaagtca tcgaaaccga caaagatttt gtgacggaac ttctggaaac cgaaggcgtg 1080 gcggttgttc atggttcggc attcggcctc ggcccgaact tccgcatttc ctatgcaacc 1140 tcggatgagc tgctggaaaa agcctgcata cgcatccagc gtttctgcgc cagcctgcgc 1200 tga 1203 <210> 8 <211> 423 <212> DNA <213> Brucella abortus <400> 8 atggcaattg aacgtacttt ctccatgatc aagcccgatg cgacccgccg caacctgact 60 ggcgcgatca tcgccaagct tgaagaagcg ggcctgcgcg ttgtcgcatc gaagcgcgtc 120 tggatgagcc gccgtgaagc tgaaggcttc tacgccgttc acaaggaccg tccgttcttt 180 ggcgaactgg ttgaattcat gtcctccggc ccgacggtcg ttcaggttct cgaaggcgaa 240 aacgcaattg ccaagaaccg tgaagtcatg ggcgccacca acccggccaa tgccgacgaa 300 ggcaccatcc gcaagacctt cgccctgtcc atcggtgaaa attcggttca cggttcggat 360 gctcccgaaa ccgctgccga agaaatcgcc tactggtttt cgggcaccga aatcgttggc 420 tga 423 <210> 9 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 9 agcggatcca tgaaaaatta tcg 23 <210> 10 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 10 atcctgcagt tacttggtca atgc 24 <210> 11 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 11 agcggatcca tgccgaagaa gtc 23 <210> 12 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 12 atcctgcagt taattgcttt cctg 24 <210> 13 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 13 agcggatcca tggcatttct cgcc 24 <210> 14 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 14 atcctgcagt cagcgcaggc tggc 24 <210> 15 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 15 cgcggatcca tggcaattga acg 23 <210> 16 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 16 ggcctgcagt cagccaacga tttc 24 <210> 17 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 17 agcggatcca tgtcgtcagt cctt 24 <210> 18 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 18 atcctgcagt taattccagg ccgg 24

Claims (6)

1. 브루셀라 어보투스(Brucella abortus) 균주로부터 유래된 InpB(invasion protein B), Dps(DNA starvation/stationary phase protection protein), AspC(aspartate aminotransferase) 및 Ndk(nucleoside diphosphate kinase) 단백질을 유효성분으로 함유하는 브루셀라 감염증의 예방 또는 치료용 서브유닛 백신(subunit vaccine) 조성물.
2. 제1항에 있어서, 상기 InpB, Dps, AspC 및 Ndk 단백질은 각각 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3 및 서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 서브유닛 백신 조성물.
3. 제1항에 있어서, 상기 조성물은 약제학적으로 허용가능한 담체, 희석제 및 어주번트로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 서브유닛 백신 조성물.
4. 제1항에 있어서, 상기 조성물은 경구, 경피, 근육내, 복막내, 정맥내, 피하내 및 비강 중에서 선택된 어느 하나의 투여경로를 통해 투여되는 것을 특징으로 하는 서브유닛 백신 조성물.
5. 제1항의 서브유닛 백신(subunit vaccine) 조성물을 브루셀라 감염증의 발병이 예상되거나, 브루셀라 감염증이 발병된 가축에게 투여하는 단계를 포함하는 브루셀라 감염증의 예방 또는 치료 방법.
6. 브루셀라 어보투스(Brucella abortus) 균주로부터 유래된 InpB(invasion protein B), Dps(DNA starvation/stationary phase protection protein), AspC(aspartate aminotransferase) 및 Ndk(nucleoside diphosphate kinase) 단백질을 유효성분으로 포함하는 브루셀라 감염증의 예방 또는 개선용 사료 조성물.

Images