KR102136954B1 - HBD2(human beta-defensin 2) 또는 상기 유전자와 융합된 메르스 코로나 바이러스의 에피토프 단백질을 포함하는 메르스 코로나바이러스의 예방 또는 치료용 조성물 - Google Patents

HBD2(human beta-defensin 2) 또는 상기 유전자와 융합된 메르스 코로나 바이러스의 에피토프 단백질을 포함하는 메르스 코로나바이러스의 예방 또는 치료용 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 HBD2(human beta-defensin 2) 또는 상기 유전자와 융합된 메르스 바이러스의 에피토프 단백질을 포함하는 메르스 코로나바이러스의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.

Description

HBD2(human beta-defensin 2) 또는 상기 유전자와 융합된 메르스 코로나 바이러스의 에피토프 단백질을 포함하는 메르스 코로나바이러스의 예방 또는 치료용 조성물 {A composition for preventing or treating MERS-CoV virus comprising HBD2 (human beta-defensin 2) or an fusion protein comprising epitope protein of MERS-CoV virus and the HBD2)}
본 발명은 HBD2(human beta-defensin 2) 또는 상기 유전자와 융합된 메르스 바이러스의 에피토프 단백질을 포함하는 메르스 코로나바이러스의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.
백신은 자연 감염을 모방하여 특이적인 후천성 면역반응을 유도할 수 있어야하는데, 일반적으로 약독화 생백신 또는 사백신의 경우에는 pathogen-cell wall product 등 병원체 유래 물질들이 병원체-연관 분자패턴(pathogen-associated molecular pattern, PAMP)으로 작용하여 병원체 침입에 대하여 1 차적으로 반응하는 선천면역을 유도하며, 아울러 후천성 면역반응을 유도할 수 있는 내인성 보조제를 포함하고 있다. 그러나 재조합 단백질을 기반으로 하는 항원백신의 경우에는 이러한 선천면역 유도체가 내제되어 있지 않은 상태로, 효과적으로 항원특이적인 면역반응을 유도하기 위하여 선천 면역을 활성화 시켜 숙주의 방어면역을 활성화 시켜 숙주의 방어면역을 유도하는데 도움을 줄 수 있는 백신 보조제로서 면역 중강제가 필요하다.
HBD2(human beta-defensin 2)는 사람의 점액성 표피세포와 대식세포에서 주로 발현되는 항균 펩타이드 중 하나로, 이들 펩타이드 항균물질은 자연 분해가 잘 되어 인체에서나 자연계에 잔류성의 위험이 없는 환경 친화적인 항생물질로 기존 항생제를 대체할 새로운 후보물질로 활발하게 연구가 진행되고 있다. 지금까지 곤충, 갑각류, 양서류, 포유동물 식물 및 세균 등으로부터 약 500여종의 발견되었고, 디펜신은 사람 및 포유동물 유래의 항균 펩타이드 중 대표적인 물질로 병원균의 침입을 막아주는 선천성 면역시스템의 일부로 알려졌다.
메르스(MERS, 중동호흡기증후군)는 잠복기가 1주일가량이며 발열을 동반한 기침, 호흡곤란, 숨 가쁨, 가래 등 호흡기 증상을 주로 보이며 그 이외에도 두통, 오한, 콧물, 근육통뿐만 아니라 식욕부진, 메스꺼움, 구토, 복통, 설사 등 소화기 증상도 나타날 수 있다. 다만 사스와는 달리 급성 신부전증을 동반한다. 사스보다 치사율 이 6배가량 높다는 조사 결과가 나오기도 하는 등 더 치명적인 양상을 보이고 있다. 연령대에 따라 치사율은 50%가 넘는다. 현재까지 중동호흡기증후군 바이러스 치료를 위한 항바이러스 제는 개발되지 않았고 증상에 대한 치료를 위주로 하게 되며 중증의 경우 인공호흡기나 인공혈액투석 등을 받아야 되는 경우도 있다. 명확한 감염원과 감염경로는 확인되지 않았으나, 중동 지역의 낙타와의 접촉을 통해 감염될 가능성이 높고 사람 간 밀접접촉에 의한 전파가 가능하다고 보고되었다. MERS-CoV는 코로나바이러스 중에서 베타코로나바이러스의 일종으로, 유전자 길이는 다양하지만 약 30 kb에 해당 하며, 11개의 ORF(open reading frame)를 지닌다. MERS-CoV의 구조 단백질은 S(spike), E(envelope), M(matrix) 및 NP(nucleocapsid) 단백질이 존재한다.
이러한 배경 하에서, 본 발명자들은 HBD2(human beta-defensin 2)의 항바이러스 활성, 선천면역의 증진 및 면역 증가제 효과를 연구 노력한 결과, HBD2(human beta-defensin 2)이 IFN-β, IFN-γ, TNF-α, CXCL-10, IL-1β, IL-6, MCP-1, MIP-1α, PANTES 등 특이적인 면역반응 유도에 필요한 선천면역반응을 유도됨을 확인하였고, 염증성 사이토카인의 발현을 유도하고 host defense에 중요한 viral pattern recognition receptor로 생각되고 있는 NOd2와 RNA viruses의 증식 억제에 관여한다고 알려진 MxA, PKR, RNase L도 증가하는 되는 것을 확인하였다. 나아가, HBD2(human beta-defensin 2)를 메르스 코로나바이러스의 숙주세포 수용체에 결합하는 부위인 S-RBD에 융합하여 처리한 결과, S-RBD 단독 사용 시와 비교하여 HBD2에 의한 항원 특이적인 항체 증가 및 anti-body mediated inbition assay를 통하여 유도된 항체의 메르스 바이러스 방어능을 확인하였다. 상기의 결과들을 통해, HBD2(human beta-defensin 2)가 항바이러스 활성, 선천면역의 증진 및 면역증가제 효과를 확인함으로서, 본 발명을 완성하였다.
본 발명은 상기와 같은 문제점을 해결하기 위하여 안출된 것으로, 본 발명자들은 HBD2(human beta-defensin 2)를 이용하여 항바이러스 활성, 선천면역의 증진 및 면역 증가제 효과를 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
상기와 같은 본 발명의 과제를 달성하기 위해서, 본 발명은 서열번호 2의 아미노산 서열로 구성되는 메르스 코로나 바이러스 에피토프 단백질을 제공한다.
본 발명은 다른 목적을 달성하기 위해, 상기 서술한 에피토프를 포함하는 메르스 코로나 바이러스의 항원을 제공한다.
본 발명은 다른 목적을 달성하기 위해, 상기 서술한 에피토프 단백질을 암호화하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.
본 발명은 다른 목적을 달성하기 위해, 상기 서술한 재조합 벡터로 형질 전환된 형질전화체를 제공한다.
본 발명은 다른 목적을 달성하기 위해, 상기 서술한 형질 전환체의 단백질 추출물 또는 상기 형질전화체로 부터 분리된 재조합 메르스 코로나 바이러스 에피토프 단백질을 포함하는 메르스 코로나 바이러스 감염에 대한 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명은 다른 목적을 달성하기 위해, 상기 서술한 형질 전환체의 단백질 추출물 또는 상기 형질전화체로 부터 분리된 재조합 메르스 코로나 바이러스 에피토프 단백질을 포함하는 메르스 코로나 바이러스 감염에 대한 예방 또는 개선용 건강기능식품조성물을 제공한다.
본 발명의 HBD2(human beta-defensin 2)이 IFN-β, IFN-γ, TNF-α, CXCL-10, IL-1β, IL-6, MCP-1, MIP-1α, PANTES 등 특이적인 면역반응 유도에 필요한 선천면역반응을 유도하고, 염증성 사이토카인의 발현을 유도하고 host defense에 중요한 viral pattern recognition receptor로 생각되고 있는 NOd2와 RNA viruses의 증식 억제에 관여한다고 알려진 MxA, PKR, RNase L도 증가시키며, HBD2(human beta-defensin 2)를 메르스 코로나바이러스의 숙주세포 수용체에 결합하는 부위인 S-RBD에 융합하여 처리한 결과, S-RBD 단독 사용 시와 비교하여 HBD2에 의한 항원 특이적인 항체 증가 및 anti-body mediated inbition assay를 통하여 유도된 항체의 메르스 바이러스 방어하는 효과를 가진다. 즉 HBD2(human beta-defensin 2)는 항바이러스 활성, 선천면역의 증진 및 면역 증가제 효과가 있다.
도 1은 본 발명의 항원 단백질(MERS-CoV S-RBD)에 HBD2가 융합된 유전자 염기서열 및 구조이다.
도 2는 본 발명의 HBD2에 의한 항원(MERS-CoV S-RBD) 특이적인 면역반응의 결과이다.
도 3은 본 발명의 HBD2에 의하여 유도된 중화항체 반응 및 바이러스 반어능을 확인한 결과이다.
도 4는 본 발명의 HBD2에 의하여 항바이러스 면역반응과 연계된 선천면역 증가효과를 확인 결과이다.
이하, 본 발명을 보다 상세히 설명한다.
본 발명의 목적은 상기와 같은 본 발명의 과제를 달성하기 위해서, 본 발명은 HBD2 (human beta-defensin 2)를 포함하는 선천면역 증진, 또는 바이러스 감염에 대한 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성되는 HBD2는 개체의 선천면역을 증가시켜 바이러스의 감염 및 증식을 억제하는 효과가 있을 뿐만 아니라, 세포 독성이나 부작용을 거의 나타내지 않으므로 장기간 복용 시에도 안심하고 사용할 수 있는 것을 특징으로 한다. 병원체의 감염 시 선천 면역의 방어 기작의 하나로 면역 인자가 분비되는데, 이들 면역 인자들(TNF-α, IL-6 및 IFN-β)의 분비가 병원체를 방어하므로, 적정한 수준의 사이토카인의 반응 유도는 다양한 전염병 병원체에 대한 예방 및 치료 방법이 될 수 있다. 특히 바이러스에 대한 면역력을 증강시킬 수 있는 것이다.
본 발명의 선천면역 증진 및 약학 조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체, 부형제 또는 희석제를 더 포함할 수 있다. 본 발명에 이용될 수 있는 약학적으로 허용 가능한 담체, 부형제 또는 희석제는 본 발명의 효과를 해하지 않는 한 특별히 제한되지 않으며, 예를 들어 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제, 윤활제, 감미제, 방향제, 보존제 등을 포함할 수 있다. 약학적으로 허용 가능한 담체, 부형제 또는 희석제의 대표적인 예로는, 락토즈, 덱스트로스, 슈크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 말티톨, 전분, 젤라틴, 글리세린, 아카시아 고무, 알지네이트, 칼슘포스페이트, 칼슘카보네이트, 칼슘실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로즈, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트, 광물유, 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜, 식물성 오일, 주사 가능한 에스테르, 위텝솔, 마크로골, 트윈 61, 카카오지, 라우리지 등을 들 수 있다. 본 발명의 선천면역 증진 및 항바이러스용 약학 조성물은 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽제, 에어로졸, 외용제, 좌제 및 주사제로 이루어진 군으로부터 선택되는 형태일 수 있다. 약학 조성물의 제제화 방법은 기술 분야에 공지된 통상의 방법에 따라 수행될 수 있으며, 특별히 제한되지 않는다.
본 발명의 선천면역 증진 및 약학 조성물은 경구 또는 비경구 투여될 수 있으며, 투여량은 투여 대상의 연령, 성별, 체중, 상태, 질병의 정도, 약물의 형태, 투여 경로 및 기간에 따라 적절히 선택될 수 있으나, 일반적으로 약 5~500㎎/㎏, 바람직하게는 약 100~250㎎/㎏을 1일 1~3회 투여할 수 있다.
본 발명의 선천면역 증진 및 약학 조성물의 제제화 방법, 투여량, 투여 경로, 구성성분 등은 기술분야에 공지된 통상의 기술로부터 적절히 선택될 수 있음이 통상의 기술자에게 명백하다.
본 발명의 선천면역 증진 및 약학 조성물은 박테리아 감염성 질병 또는 바이러스 감염성 질병의 예방 및 치료에 이용될 수 있다. 본 발명의 선천면역 증진 및 항바이러스용 약학 조성물은 유효 성분으로 구맥 추출물 외에 다른 약학적 활성 성분을 함께 포함하거나, 또는 다른 유효 성분을 포함하는 약학 조성물과 혼합되어 이용될 수 있다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면 상기 바이러스는 메르스 코로나 바이러스(MERS-CoV virus)일 수 있다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면 상기 HBD2는 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명은 다른 목적을 달성하기 위해, HBD2 (human beta-defensin 2)를 포함하는 선천면역 증진, 또는 바이러스 감염에 대한 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물을 제공한다.
발명의 바람직한 일실시예에 따르면 상기 바이러스는 메르스 코로나 바이러스(MERS-CoV virus)일 수 있다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면 상기 HBD2는 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 선천면역 증진 및 건강기능식품은 식품학적으로 허용가능한 식품 보조 첨가제를 더 포함할 수 있다. 본 발명에 이용될 수 있는 식품학적으로 허용가능한 식품 보조 첨가제는 포도당, 과당, 말토오스, 슈크로스, 덱스트린, 시클로덱스트린과 같은 당 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당 알코올과 같은 천연 탄수화물, 타우마틴, 스테비아 추출물 등의 천연 향미제, 사카린, 아스파르탐산 등의 합성 향미제, 착색제, 펙트산 또는 그의 염, 알긴산 또는 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산화제 등을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 선천면역 증진 및 항바이러스용 건강기능식품은 분말, 과립, 정제, 캡슐, 캔디, 츄잉검, 젤리 및 음료로 이루어진 군으로부터 선택되는 형태일 수 있다. 선천면역 증진 및 항바이러스용 건강기능식품 중의 구맥 추출물의 함량은 식품의 형태, 풍미, 맛 등을 고려하여 적절하게 선택될 수 있으며, 예를 들어 건강기능식품 전체 중량에 대하여 0.01~30 중량%의 범위일 수 있다. 본 발명의 선천면역 증진 및 항바이러스용 건강기능식품의 형태, 조성 및 제조방법 등은 기술분야에 공지된 통상의 기술로부터 적절히 선택될 수 있음이 통상의 기술자에게 명백하다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면 상기 바이러스는 메르스 코로나 바이러스(MERS-CoV virus)일 수 있다.
본 발명은 다른 목적을 달성하기 위해, 서열번호 2의 아미노산 서열로 구성되는 메르스 코로나 바이러스 에피토프 단백질을 제공한다.
본 발명에서 용어, 메르스 코로나 바이러스(MERS-CoV)는 베타코로나바이러스의 하나로서, MERS-CoV 게놈은 계통 발생적으로 clade A, clade B, 두 clades로 분류되는데, 초기 MERS 사례들은 clade A 였고(EMC/2012 and Jordan-N3/2012), 새로 보고된 사례들은 유전적으로 별개인 clade B이다. 유전자 길이는 다양하지만 약 30 kb에 해당 하며, 11개의 ORF(open reading frame)를 지닌다. MERS-CoV의 구조 단백질은 S(spike), E(envelope), M(matrix) 및 NP(nucleocapsid) 단백질이 존재한다. 이 바이러스는 베로 세포(Vero cell)와 히말라야원숭이 신장세포 프로키네티신 2 수용체(LLC-MK 2 cells)에서 쉽게 성장한다.
본 발명에서 용어, "에피토프"는 특정 항체에 의해 인식되는 항원결합부위의 아미노산 잔기 세트, 또는 T 세포에서는 T 세포 수용체 단백질 및/또는 주요 조직적합성 복합체 (Major Histocompatibility Complex, MHC)수용체에 의해 인식되는 잔기이다. 에피토프는 항체, T 세포 수용체 또는 HLA에 의해 인식되는 부위를 형성하는 분자로, 일차, 이차 및 삼차 펩티드 구조, 또는 전하를 의미한다.
본 발명은 다른 목적을 달성하기 위해, 상기 서술한 에피토프를 포함하는 메르스 코로나 바이러스의 항원을 제공한다.
본 발명은 다른 목적을 달성하기 위해, 상기 서술한 에피토프 단백질을 암호화하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.
본 발명에서 용어, "재조합"은 세포가 이종의 핵산을 복제하거나, 상기 핵산을 발현하거나 또는 펩티드, 이종의 펩티드 또는 이종의 핵산에 의해 암호화된 단백질을 발현하는 세포를 지칭하는 것이다. 재조합 세포는 상기 세포의 천연 형태에서는 발견되지 않는 유전자 또는 유전자 절편을, 센스 또는 안티센스 형태 중 하나로 발현할 수 있다. 또한 재조합 세포는 천연 상태의 세포에서 발견되는 유전자를 발현할 수 있으며, 상기 유전자는 변형된 것으로써 인위적인 수단에 의해 세포 내 재도입된 것이다.
본 발명에서 용어, "벡터"는 숙주 세포로 염기의 클로닝 및/또는 전이를 위한 임의의 매개물을 말한다. 벡터는 다른 DNA 단편이 결합하여 결합된 단편의 복제를 가져올 수 있는 복제단위 (replicon)일 수 있다. "복제단위"란 생체 내에서 DNA 복제의 자가 유닛으로서 기능하는, 즉, 스스로의 조절에 의해 복제가능한, 임의의 유전적 단위 (예를 들면, 플라스미드, 파지, 코스미드, 염색체, 바이러스)를 말한다. 용어 "벡터"는 시험관 내, 생체 외 또는 생체 내에서 숙주 세포로 염기를 도입하기 위한 바이러스 및 비 바이러스 매개물을 포함한다.
본 발명은 다른 목적을 달성하기 위해, 상기 서술한 재조합 벡터로 형질전화된 형질전화체를 제공한다.
본 발명에서 용어, “형질전환”은 외부로부터 주어진 DNA에 의하여 생물의 유전적인 성질이 변하는 것으로, 즉 생물의 어떤 계통의 세포에서 추출된 핵산의 일종인 DNA를 다른 계통의 살아있는 세포의 주었을 때 DNA가 그 세포에 들어가서 유전형질이 변화하는 현상으로 형질변환 형전환 또는 형변환 등이라고도 한다. 본 발명에서 용어, “형질전환체”는 형질전환으로 인해 생성된 형질전환식물 또는 형질전환동물을 의미하며, 유전자 재조합 기술을 이용하여 특정 유전자의 변형 또는 변이가 유발되어 생성된 유전자재조합체를 포함한다.
본 발명은 다른 목적을 달성하기 위해, 상기 서술한 형질 전환체의 단백질 추출물 또는 상기 형질전화체로 부터 분리된 재조합 메르스 코로나 바이러스 에피토프 단백질을 포함하는 메르스 코로나 바이러스 감염에 대한 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 용어, "감염의 예방 또는 치료용 조성물"은 생체에 면역을 주는 항원을 함유한 생물학적인 제제로서, 감염증의 예방을 위하여 사람이나 동물에 주사하거나 경구 투여함으로써 생체에 면역이 생기게 하는 면역원 또는 항원성 물질인 백신 조성물 또는 약학적 조성물이 포함 될 수 있다.
본 발명에서 용어, “예방”은 본 발명의 메르스 코로나 바이러스의 에피토프 단백질을 발현하는 형질전환체 또는 상기 형질 전환체를 유효성분으로 하는 조성물의 투여로 상기 메르스 코로나 바이러스 감염을 억제 또는 지연시키는 모든 행위를 말한다.
본 발명에서 용어, “치료”는 본 발명의 메르스 코로나바이러스 에피토프 단백질을 발현하는 형질전환체 또는 상기 형질전환체를 유효성분으로 하는 조성물의 투여로 상기 메르스 코로나바이러스의 감염 증상이 호전되거나 이롭게 되는 모든 행위를 말한다.
“면역원”또는 “항원성 물질”은 펩티드, 폴리펩티드, 상기 폴리펩티드를 발현하는 유산균, 단백질, 상기 단백질을 발현하는 유산균, 올리고뉴클레오티드, 폴리뉴클레오티드, 재조합 박테리아 및 재조합 바이러스로 구성된 군에서 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 할 수 있다. 구체적인 예를 들면, 상기 항원 물질은 불활성화된 전체 또는 부분 세포 제제 형태, 또는 통상적인 단백질 정제, 유전 공학 기법 또는 화학 합성에 의해 수득되는 항원 분자 형태일 수 있다.
본 발명의 서술한 형질 전환체의 단백질 추출물 또는 상기 형질전화체로 부터 분리된 재조합 메르스 코로나 바이러스 에피토프 단백질을 포함하는 메르스 코로나 바이러스 감염에 대한 예방 또는 치료용 약학적 조성물은 각각의 사용 목적에 맞게 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁제, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구 제형, 멸균 주사용액의 주사제 등 다양한 형태로 제형화하여 사용할 수 있으며, 경구 투여하거나 정맥 내, 복강 내, 피하, 직장, 국소 투여 등을 포함한 다양한 경로를 통해 투여될 수 있다.
이러한 약학적 조성물에는 추가적으로 담체, 부형제 또는 희석제 등이 더 포함될 수 있으며, 포함될 수 있는 적합한 담체, 부형제 또는 희석제의 예로는 락토오스, 덱스트로오스, 수크로오스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리쓰리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로스, 메틸 셀룰로스, 비정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유 등을 들 수 있다. 또한, 본 발명의 약학적 조성물은 충전제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제, 방부제 등을 추가로 더 포함할 수도 있다.
본 발명의 유효 성분은 약제학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명에서, "약제학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 환자의 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료 기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고, 종래의 치료제와 순차적으로 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기한 요소들을 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물에서 유효성분의 유효량은 환자의 나이, 성별, 체중에 따라 달라질 수 있으며, 일반적으로는 체중 ㎏ 당 1 내지 5,000mg, 바람직하게는 100 내지 3,000mg을 매일 또는 격일 투여하거나 1일 1 내지 3회로 나누어 투여할 수 있다. 그러나, 투여 경로, 질병의 중증도, 성별, 체중, 연령 등에 따라서 증감될 수 있으므로 상기 투여량이 어떠한 방법으로도 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
본 발명의 약학적 조성물은 다양한 경로를 통하여 대상에 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁내 경막 또는 뇌혈관 내(intracerebroventricular) 주사에 의해 투여될 수 있다.
본 발명에서 "투여"는 임의의 적절한 방법으로 환자에게 소정의 물질을 제공하는 것을 의미하며, 본 발명의 약학적 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 일반적인 모든 경로를 통하여 경구 또는 비경구 투여될 수 있다. 또한, 본 발명의 조성물은 유효성분을 표적 세포로 전달할 수 있는 임의의 장치를 이용해 투여될 수도 있다.
본 발명에서 "대상"은, 특별히 한정되는 것은 아니지만, 예를 들어, 인간, 원숭이, 소, 말, 양, 돼지, 닭, 칠면조, 메추라기, 고양이, 개, 마우스, 쥐, 토끼 또는 기니아 피그를 포함하고, 바람직하게는 포유류, 보다 바람직하게는 인간을 의미한다.
본 발명은 다른 목적을 달성하기 위해, 상기 서술한 형질전환체의 단백질 추출물 또는 상기 형질전화체로 부터 분리된 재조합 메르스 코로나 바이러스 에피토프 단백질을 포함하는 메르스 코로나 바이러스 감염에 대한 예방 또는 개선용 건강기능식품조성물을 제공한다.
본 발명의 유효성분을 포함하는 식품으로는, 예를 들어, 각종 식품류, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 건강보조, 식품류 등이 있고, 분말, 과립, 정제, 캡슐 또는 음료인 형태로 사용할 수 있다.
본 발명의 유효성분은 일반적으로 전체 식품 중량의 0.01 내지 15중량%로 가할 수 있으며, 건강 음료 조성물은 100ml를 기준으로 0.02 내지 10g, 바람직하게는 0.3 내지 1g의 비율로 가할 수 있다.
본 발명의 건강 기능 식품은 지시된 비율로 필수 성분으로서 상기 유효성분을 함유하는 것 외에 식품학적으로 허용 가능한 식품보조 첨가제, 예컨대, 천연 탄수화물 및 다양한 향미제 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다.
상기 천연 탄수화물의 예로는 포도당, 과당 등의 단당류, 말토오스, 수크로오스 등의 이당류 및 덱스트린, 시클로덱스트린 등의 다당류와 같은 통상적인 당 및 자일리톨, 소르비톨, 에리쓰리톨 등의 당알코올이 있다.
상기 향미제로는 타우마틴, 레바우디오시드 A 또는 글리시르히진과 같은 스테비아 등의 천연 향미제 및 사카린, 아스파르탐 등의 합성 향미제를 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 건강 기능 식품 100ml 당 일반적으로 약 1 내지 20g, 바람직하게는 약 5 내지 12g을 사용한다. 상기 외에 본 발명의 건강 기능 식품은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물, 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그 밖에 본 발명의 건강 기능 식품은 천연 과일 주스 및 과일 주스 음료 및 야채 음료 등의 제조를 위한 과육을 함유할 수도 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 본 발명의 유효성분 100중량부 당 0.01 내지 약 20중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.
본 발명은 다른 목적을 달성하기 위해, 상기 서술한 형질전환체의 단백질 추출물 또는 상기 형질전화체로 부터 분리된 재조합 메르스 코로나 바이러스 에피토프 단백질을 포함하는 메르스 코로나 바이러스 감염에 대한 예방 또는 개선용 화장료 조성물을 제공한다.
본 발명에 따른 화장료 조성물은 첨가제를 추가로 포함할 수 있다. 첨가제의 종류는 특별히 제한되는 것은 아니나, 예를 들면, 유분, 물, 계면활성제, 보습제, 저급알코올, 살균제, 산화방지제, 증점제, 킬레이트제, 색소, 방부제 및 향료 중 어느 하나 이상일 수 있다. 이러한 첨가제들은 필요에 따라 적절한 함량으로 배합하여 사용할 수 있다.
본 발명은 다른 목적을 달성하기 위해, 상기 서술한 형질전환체의 단백질 추출물 또는 상기 형질전화체로 부터 분리된 재조합 메르스 코로나 바이러스 에피토프 단백질을 포함하는 메르스 코로나 감염에 대한 예방 또는 치료용 의약외품 조성물 제공한다.
이하에서는 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다. 하기 실시예는 본 발명의 바람직한 일 구체예일 뿐이며, 본 발명의 권리범위가 하기 실시예의 범위로 한정되는 것은 아니다.
실험예 1: HBD2에 의한 항원(MERS-CoV S-RBD) 특이적인 면역반응 증가
재조합 항원 단백질을 확보하기 위하여 메르스 바이러스의 spike protein(GenBank: AKL59401.1)의 RBD(residues 291-725) 부위의 c-terminal에 HBD2(서열번호 1 :　N- GIGDPVTCLK SGAICHPVFC PRRYKQIGTC GLPGTKCCKK P -C）가 융합된 gene construct （서열번호 2 :　N- KYYSIIPHSI RSIQSDRKAW AAFYVYKLQP LTFLLDFSVD GYIRRAIDCG FNDLSQLHCS YESFDVESGV YSVSSFEAKP SGSVVEQAEG VECDFSPLLS GTPPQVYNFK RLVFTNCNYN LTKLLSLFSV NDFTCSQISP AAIASNCYSS LILDYFSYPL SMKSDLSVSS AGPISQFNYK QSFSNPTCLI LATVPHNLTT ITKPLKYSYI NKCSRLLSDD RTEVPQLVNA NQYSPCVSIL PSTVWEDGDY YRKQLSPLEG GGWLVASGST VAMTEQLQMG FGITVQYGTD TNSVCPKLEF ANDTKIASQL GNCVEYSLYG VSGRGVFQNC TAVGVRQQRF VYDAYQNLVG YYSDDGNYYC LRACVSVPVS VIYDKETKTH ATLFGSVACE HISSTMSQYS RSTRSMLKRR DSTYGPLQTP VGCVLGLVNS SLFVEGIGDPVTCLK SGAICHPVFC PRRYKQIGTC GLPGTKCCKK P　-C）을 제작하여 pCold II bactrial expression system에서 발현시킨 다음, N-terminal의 His tag을 기반으로 Ni-NTA Superflow (Qiagen, Valencia, CA)를 사용하여 재조합 항원 단백질을 확보하였다 (도 1). HBD2에 의한 항원(MERS-CoV S-RBD) 특이적인 면역반응 증가를 확인하기 위하여 Freund's complete adjuvant와 함께 각 항원 단백질 10ug씩을 6주-8주령의 암컷 C57BL/6 마우스의 꼬리와 뒷다리에 피하와 근육 주사 10일 후, Freund's incomplete adjuvant와 섞은 각 항원 단백질로 boost한 다음 3일 후 각 마우스로부터 serum sample을 확보하여 항원 특이적인 면역반응과 neutralizing 항체 반응을 확인하였다 (도 2). ELISA를 기반으로 antigen-specific antibody binding assay를 수행하여 MERS-CoV S-RBD-specific antibody responses를 확인하였다. 96-well ELISA plate를 S-RBD 단백질(2 μg/ml)로 4 °에서 overnight으로 coating한 다음, 5% non-fat milk로 37°에서 2시간 동안 blocking한 후 각 serum을 희석하여 37°에서 1시간 동안 처리하고 PBST로 세척하고 AP-conjugated anti-mouse IgG(1:7,000, Sigma-Aldrich)를 37 °에서 1시간 동안 처리 후 pNPP substrate를 처리하여 405nm (A405)에서 absorbance를 측정하였다. 그 결과 S-RBD(단독 항원)만 접종했을 때 보다 HBD-2 conjugated S-RBD(항원 단백질(S-RBD)의 C-terminal에 HDB2가 융합된 제조합 단백질)의 경우 항원 특이적 면역 반응 유도능이 높은 것을 확인 하였다 (도 2).
실험예 2 : HBD2에 의하여 유도된 중화항체 반응 및 메르스 바이러스 방어능 확인
HBD2에 의하여 유도된 면역반응의 메르스 바이러스에 대한 방어능을 확인하기 위하여 MERS-CoV(KCDC,1-001-MER-IS-2015001)의 propagation에 사용된 Vero E6 세포와 메르스 바이러스의 host cell receptor인 hDPP4를 발현하는 Huh-7, (KCLB No. 60104)을 기반으로 in vitro에서 neutralization assay를 수행하였다. receptor binding-inhibition assay를 위하여 각 serum을 1:50으로 희석하여 1 μg의 S-RBD protein과 pre-incubation한 후 4% paraformaldehyde로 고정한 Huh-7 cells에 처리한 다음 Penta-His antibody-Alexa Fluor 488(1:100, Qiagen)을 사용하여 기관내 CURF의 CLSM(LSM 510, Carl Zeiss, Thornwood, NY, USA)로 receptor에 binding한 항원 단백질을 비교 분석 수행하였다. 그 결과 HBD-2 conjugated S-RBD의 접종 후 확보한 serum을 처리한 세료에서 MERS-CoV의 S-RBD protein의 DPP4 특이적인 결합이 현저하게 억제되는 것을 확인하였다 (도 3A). 각각 serum의 중화능을 확인하기 위하여 Vero E6 세포에 메르스 바이러스를 감염 시킨 후 세포에 감염된 viral RNA의 양을 upstream E gene을 target으로 하여 qRT-PCR을 통하여 분석하였다. 먼저 각 serum을 1:100으로 희석하여 103 PFU의 메르스 바이러스와 pre-incubation한 후 Vero E6 cells(1*106cells)에 처리한 다음, 24시간 후 Tri REAGENT (Sigma, Saint Quentin Fallavier, France)을 사용하여 total RNA를 추출하였다. 각 1 μg의 total RNA를 기반으로 M-MLV Reverse Transcriptase(Promega, Charbonnieres, France)를 사용하여 cDNA를 합성하고, power SYBR Green PCR mastermix(Applied Biosystems, Woolston, Warrington, UK)과 ABI 7500 real-time PCR system을 사용하여 qRT-PCR을 수행하였다. Target인 upstream E gene과 함께 endogenous control로 Vero E6 β-actin gene을 사용하였다. 본 실험에 사용한 upstream E gene의 primer 염기서열은 F: 5'-GCCTCTACACGGGACCCATA-3'과 R: 5'-GCAACGCGCGATTCAGTT-3'이고 Vero E6 β-actin gene의 primer 염기서열은 F: 5'-ATCGTGCGTGACATTAAGGAG-3'과 R: 5'-AGGAAGGAAGGCTGGAAGAG-3'이다. Amplification condition은 95 ℃에서 10 min activation 후 95 ℃에서 15s, 55 ℃에서 30s, 72 ℃에서 30s씩 40 amplification cycles 수행 후 7500 software(v2.3)을 사용하여 Real-time data 분석하였다. HBD-2 conjugated S-RBD에 의하여 유도된 항원 특이적인 항체에 의하여 MERS-CoV의 infection이 저해되는 것을 확인하였다 (도 3B).
실험예 3 : 항바이러스 면역반응과 연계된 선천면역반응에 미치는 HBD2의 효과
HBD2에 의하여 조절되는 선천면역반응을 확인하기 위하여 PMA-differentiated THP-1 세포(1*106 cells)에 HBD2 포함 각 재조합 단백질을 1μg/mL씩 처리 후 6시간과 24시간에 Tri REAGENT (Sigma, Saint Quentin Fallavier, France)을 사용하여 total RNA를 추출하였다. 각 1 μg의 total RNA를 기반으로 M-MLV Reverse Transcriptase(Promega, Charbonnieres, France)를 사용하여 cDNA를 합성하고, power SYBR Green PCR mastermix (Applied Biosystems, Woolston, Warrington, UK)과 ABI 7500 real-time PCR system을 사용하여 qRT-PCR을 수행하여 항바이러스 활성을 지닌 주요 선천면역 molecule들을 확인하였다. Beta-actin gene(hACTB)을 Endogenous control로 사용하였고 본 실험에 사용한 primer들의 염기서열은 하기 표 1과 같다. Amplification condition은 95 ℃에서 10 min activation 후 95 ℃에서 15s, 55 ℃에서 30s, 72 ℃에서 30s씩 40 amplification cycles 수행 후 7500 software(v2.3)을 사용하여 Real-time data 분석하였다. 먼저 바이러스 감염 예방 및 치료에 주요한 IFN들과 이의 조절 인자로 알려진 MxA, 그리고 적응 면역에 필요한 pro-inflammatory cytokine의 발현을 유도하고 Host defense에 중요한 viral PRR(pattern recognition receptor)로 생각되고 있는 Nod2를 확인한 결과, HBD-2 conjugated S-RBD 처리시 현저하게 증가되는 것을 확인하였다 (도 4). 아울러 IFN은 antiviral activity를 지닌 다양한 유전자들의 발현을 유도하는데, MxA와 함께 대표적인 antiviral molecule로 바이러스 증식 억제에 관여한다고 알려진 PKR과 RNase L 모두 HBD-2 conjugated S-RBD 처리 시간에 비례하여 발현이 증가되는 것을 확인하였다. IL-1β, TNF-α 및 PAMP(pathogen-associated moleuclar pattern)에 특이적으로 반응하는 IL-6 모두 HBD-2 conjugated S-RBD 처리시 증가되는 것을 확인하였고, IFN-γ에 의하여 유도되는 CXCL-10을 포함하여 CXCL-1, RANTES, MCP-1 및 세균 감염시 대식세포에서 발현되는 대표적인 물질인 MIP-1α 같은 chemokine들 또한 HBD-2 conjugated S-RBD 처리시 유의하미하게 발현이 증가되는 것을 확인 하였다 (도 4).이하, 본 발명을 보다 상세히 설명한다.
본 발명의 목적은 상기와 같은 본 발명의 과제를 달성하기 위해서, 본 발명은 HBD2 (human beta-defensin 2)를 포함하는 선천면역 증진, 또는 바이러스 감염에 대한 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성되는 HBD2는 개체의 선천면역을 증가시켜 바이러스의 감염 및 증식을 억제하는 효과가 있을 뿐만 아니라, 세포 독성이나 부작용을 거의 나타내지 않으므로 장기간 복용 시에도 안심하고 사용할 수 있는 것을 특징으로 한다. 병원체의 감염 시 선천 면역의 방어 기작의 하나로 면역 인자가 분비되는데, 이들 면역 인자들(TNF-α, IL-6 및 IFN-β)의 분비가 병원체를 방어하므로, 적정한 수준의 사이토카인의 반응 유도는 다양한 전염병 병원체에 대한 예방 및 치료 방법이 될 수 있다. 특히 바이러스에 대한 면역력을 증강시킬 수 있는 것이다.
본 발명의 선천면역 증진 및 약학 조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체, 부형제 또는 희석제를 더 포함할 수 있다. 본 발명에 이용될 수 있는 약학적으로 허용 가능한 담체, 부형제 또는 희석제는 본 발명의 효과를 해하지 않는 한 특별히 제한되지 않으며, 예를 들어 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제, 윤활제, 감미제, 방향제, 보존제 등을 포함할 수 있다. 약학적으로 허용 가능한 담체, 부형제 또는 희석제의 대표적인 예로는, 락토즈, 덱스트로스, 슈크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 말티톨, 전분, 젤라틴, 글리세린, 아카시아 고무, 알지네이트, 칼슘포스페이트, 칼슘카보네이트, 칼슘실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로즈, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트, 광물유, 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜, 식물성 오일, 주사 가능한 에스테르, 위텝솔, 마크로골, 트윈 61, 카카오지, 라우리지 등을 들 수 있다. 본 발명의 선천면역 증진 및 항바이러스용 약학 조성물은 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽제, 에어로졸, 외용제, 좌제 및 주사제로 이루어진 군으로부터 선택되는 형태일 수 있다. 약학 조성물의 제제화 방법은 기술 분야에 공지된 통상의 방법에 따라 수행될 수 있으며, 특별히 제한되지 않는다.
본 발명의 선천면역 증진 및 약학 조성물은 경구 또는 비경구 투여될 수 있으며, 투여량은 투여 대상의 연령, 성별, 체중, 상태, 질병의 정도, 약물의 형태, 투여 경로 및 기간에 따라 적절히 선택될 수 있으나, 일반적으로 약 5~500㎎/㎏, 바람직하게는 약 100~250㎎/㎏을 1일 1~3회 투여할 수 있다.
본 발명의 선천면역 증진 및 약학 조성물의 제제화 방법, 투여량, 투여 경로, 구성성분 등은 기술분야에 공지된 통상의 기술로부터 적절히 선택될 수 있음이 통상의 기술자에게 명백하다.
본 발명의 선천면역 증진 및 약학 조성물은 박테리아 감염성 질병 또는 바이러스 감염성 질병의 예방 및 치료에 이용될 수 있다. 본 발명의 선천면역 증진 및 항바이러스용 약학 조성물은 유효 성분으로 구맥 추출물 외에 다른 약학적 활성 성분을 함께 포함하거나, 또는 다른 유효 성분을 포함하는 약학 조성물과 혼합되어 이용될 수 있다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면 상기 바이러스는 메르스 코로나 바이러스(MERS-CoV virus)일 수 있다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면 상기 HBD2는 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명은 다른 목적을 달성하기 위해, HBD2 (human beta-defensin 2)를 포함하는 선천면역 증진, 또는 바이러스 감염에 대한 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물을 제공한다.
발명의 바람직한 일실시예에 따르면 상기 바이러스는 메르스 코로나 바이러스(MERS-CoV virus)일 수 있다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면 상기 HBD2는 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 선천면역 증진 및 건강기능식품은 식품학적으로 허용가능한 식품 보조 첨가제를 더 포함할 수 있다. 본 발명에 이용될 수 있는 식품학적으로 허용가능한 식품 보조 첨가제는 포도당, 과당, 말토오스, 슈크로스, 덱스트린, 시클로덱스트린과 같은 당 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당 알코올과 같은 천연 탄수화물, 타우마틴, 스테비아 추출물 등의 천연 향미제, 사카린, 아스파르탐산 등의 합성 향미제, 착색제, 펙트산 또는 그의 염, 알긴산 또는 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산화제 등을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 선천면역 증진 및 항바이러스용 건강기능식품은 분말, 과립, 정제, 캡슐, 캔디, 츄잉검, 젤리 및 음료로 이루어진 군으로부터 선택되는 형태일 수 있다. 선천면역 증진 및 항바이러스용 건강기능식품 중의 구맥 추출물의 함량은 식품의 형태, 풍미, 맛 등을 고려하여 적절하게 선택될 수 있으며, 예를 들어 건강기능식품 전체 중량에 대하여 0.01~30 중량%의 범위일 수 있다. 본 발명의 선천면역 증진 및 항바이러스용 건강기능식품의 형태, 조성 및 제조방법 등은 기술분야에 공지된 통상의 기술로부터 적절히 선택될 수 있음이 통상의 기술자에게 명백하다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면 상기 바이러스는 메르스 코로나 바이러스(MERS-CoV virus)일 수 있다.
본 발명은 다른 목적을 달성하기 위해, 서열번호 2의 아미노산 서열로 구성되는 메르스 코로나 바이러스 에피토프 단백질을 제공한다.
본 발명에서 용어, 메르스 코로나 바이러스(MERS-CoV)는 베타코로나바이러스의 하나로서, MERS-CoV 게놈은 계통 발생적으로 clade A, clade B, 두 clades로 분류되는데, 초기 MERS 사례들은 clade A 였고(EMC/2012 and Jordan-N3/2012), 새로 보고된 사례들은 유전적으로 별개인 clade B이다. 유전자 길이는 다양하지만 약 30 kb에 해당 하며, 11개의 ORF(open reading frame)를 지닌다. MERS-CoV의 구조 단백질은 S(spike), E(envelope), M(matrix) 및 NP(nucleocapsid) 단백질이 존재한다. 이 바이러스는 베로 세포(Vero cell)와 히말라야원숭이 신장세포 프로키네티신 2 수용체(LLC-MK 2 cells)에서 쉽게 성장한다.
본 발명에서 용어, "에피토프"는 특정 항체에 의해 인식되는 항원결합부위의 아미노산 잔기 세트, 또는 T 세포에서는 T 세포 수용체 단백질 및/또는 주요 조직적합성 복합체 (Major Histocompatibility Complex, MHC)수용체에 의해 인식되는 잔기이다. 에피토프는 항체, T 세포 수용체 또는 HLA에 의해 인식되는 부위를 형성하는 분자로, 일차, 이차 및 삼차 펩티드 구조, 또는 전하를 의미한다.
본 발명은 다른 목적을 달성하기 위해, 상기 서술한 에피토프를 포함하는 메르스 코로나 바이러스의 항원을 제공한다.
본 발명은 다른 목적을 달성하기 위해, 상기 서술한 에피토프 단백질을 암호화하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.
본 발명에서 용어, "재조합"은 세포가 이종의 핵산을 복제하거나, 상기 핵산을 발현하거나 또는 펩티드, 이종의 펩티드 또는 이종의 핵산에 의해 암호화된 단백질을 발현하는 세포를 지칭하는 것이다. 재조합 세포는 상기 세포의 천연 형태에서는 발견되지 않는 유전자 또는 유전자 절편을, 센스 또는 안티센스 형태 중 하나로 발현할 수 있다. 또한 재조합 세포는 천연 상태의 세포에서 발견되는 유전자를 발현할 수 있으며, 상기 유전자는 변형된 것으로써 인위적인 수단에 의해 세포 내 재도입된 것이다.
본 발명에서 용어, "벡터"는 숙주 세포로 염기의 클로닝 및/또는 전이를 위한 임의의 매개물을 말한다. 벡터는 다른 DNA 단편이 결합하여 결합된 단편의 복제를 가져올 수 있는 복제단위 (replicon)일 수 있다. "복제단위"란 생체 내에서 DNA 복제의 자가 유닛으로서 기능하는, 즉, 스스로의 조절에 의해 복제가능한, 임의의 유전적 단위 (예를 들면, 플라스미드, 파지, 코스미드, 염색체, 바이러스)를 말한다. 용어 "벡터"는 시험관 내, 생체 외 또는 생체 내에서 숙주 세포로 염기를 도입하기 위한 바이러스 및 비 바이러스 매개물을 포함한다.
본 발명은 다른 목적을 달성하기 위해, 상기 서술한 재조합 벡터로 형질전화된 형질전화체를 제공한다.
본 발명에서 용어, “형질전환”은 외부로부터 주어진 DNA에 의하여 생물의 유전적인 성질이 변하는 것으로, 즉 생물의 어떤 계통의 세포에서 추출된 핵산의 일종인 DNA를 다른 계통의 살아있는 세포의 주었을 때 DNA가 그 세포에 들어가서 유전형질이 변화하는 현상으로 형질변환 형전환 또는 형변환 등이라고도 한다. 본 발명에서 용어, “형질전환체”는 형질전환으로 인해 생성된 형질전환식물 또는 형질전환동물을 의미하며, 유전자 재조합 기술을 이용하여 특정 유전자의 변형 또는 변이가 유발되어 생성된 유전자재조합체를 포함한다.
본 발명은 다른 목적을 달성하기 위해, 상기 서술한 형질 전환체의 단백질 추출물 또는 상기 형질전화체로 부터 분리된 재조합 메르스 코로나 바이러스 에피토프 단백질을 포함하는 메르스 코로나 바이러스 감염에 대한 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 용어, "감염의 예방 또는 치료용 조성물"은 생체에 면역을 주는 항원을 함유한 생물학적인 제제로서, 감염증의 예방을 위하여 사람이나 동물에 주사하거나 경구 투여함으로써 생체에 면역이 생기게 하는 면역원 또는 항원성 물질인 백신 조성물 또는 약학적 조성물이 포함 될 수 있다.
본 발명에서 용어, “예방”은 본 발명의 메르스 코로나 바이러스의 에피토프 단백질을 발현하는 형질전환체 또는 상기 형질 전환체를 유효성분으로 하는 조성물의 투여로 상기 메르스 코로나 바이러스 감염을 억제 또는 지연시키는 모든 행위를 말한다.
본 발명에서 용어, “치료”는 본 발명의 메르스 코로나바이러스 에피토프 단백질을 발현하는 형질전환체 또는 상기 형질전환체를 유효성분으로 하는 조성물의 투여로 상기 메르스 코로나바이러스의 감염 증상이 호전되거나 이롭게 되는 모든 행위를 말한다.
“면역원”또는 “항원성 물질”은 펩티드, 폴리펩티드, 상기 폴리펩티드를 발현하는 유산균, 단백질, 상기 단백질을 발현하는 유산균, 올리고뉴클레오티드, 폴리뉴클레오티드, 재조합 박테리아 및 재조합 바이러스로 구성된 군에서 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 할 수 있다. 구체적인 예를 들면, 상기 항원 물질은 불활성화된 전체 또는 부분 세포 제제 형태, 또는 통상적인 단백질 정제, 유전 공학 기법 또는 화학 합성에 의해 수득되는 항원 분자 형태일 수 있다.
본 발명의 서술한 형질 전환체의 단백질 추출물 또는 상기 형질전화체로 부터 분리된 재조합 메르스 코로나 바이러스 에피토프 단백질을 포함하는 메르스 코로나 바이러스 감염에 대한 예방 또는 치료용 약학적 조성물은 각각의 사용 목적에 맞게 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁제, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구 제형, 멸균 주사용액의 주사제 등 다양한 형태로 제형화하여 사용할 수 있으며, 경구 투여하거나 정맥 내, 복강 내, 피하, 직장, 국소 투여 등을 포함한 다양한 경로를 통해 투여될 수 있다.
이러한 약학적 조성물에는 추가적으로 담체, 부형제 또는 희석제 등이 더 포함될 수 있으며, 포함될 수 있는 적합한 담체, 부형제 또는 희석제의 예로는 락토오스, 덱스트로오스, 수크로오스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리쓰리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로스, 메틸 셀룰로스, 비정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유 등을 들 수 있다. 또한, 본 발명의 약학적 조성물은 충전제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제, 방부제 등을 추가로 더 포함할 수도 있다.
본 발명의 유효 성분은 약제학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명에서, "약제학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 환자의 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료 기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고, 종래의 치료제와 순차적으로 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기한 요소들을 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물에서 유효성분의 유효량은 환자의 나이, 성별, 체중에 따라 달라질 수 있으며, 일반적으로는 체중 ㎏ 당 1 내지 5,000mg, 바람직하게는 100 내지 3,000mg을 매일 또는 격일 투여하거나 1일 1 내지 3회로 나누어 투여할 수 있다. 그러나, 투여 경로, 질병의 중증도, 성별, 체중, 연령 등에 따라서 증감될 수 있으므로 상기 투여량이 어떠한 방법으로도 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
본 발명의 약학적 조성물은 다양한 경로를 통하여 대상에 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁내 경막 또는 뇌혈관 내(intracerebroventricular) 주사에 의해 투여될 수 있다.
본 발명에서 "투여"는 임의의 적절한 방법으로 환자에게 소정의 물질을 제공하는 것을 의미하며, 본 발명의 약학적 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 일반적인 모든 경로를 통하여 경구 또는 비경구 투여될 수 있다. 또한, 본 발명의 조성물은 유효성분을 표적 세포로 전달할 수 있는 임의의 장치를 이용해 투여될 수도 있다.
본 발명에서 "대상"은, 특별히 한정되는 것은 아니지만, 예를 들어, 인간, 원숭이, 소, 말, 양, 돼지, 닭, 칠면조, 메추라기, 고양이, 개, 마우스, 쥐, 토끼 또는 기니아 피그를 포함하고, 바람직하게는 포유류, 보다 바람직하게는 인간을 의미한다.
본 발명은 다른 목적을 달성하기 위해, 상기 서술한 형질전환체의 단백질 추출물 또는 상기 형질전화체로 부터 분리된 재조합 메르스 코로나 바이러스 에피토프 단백질을 포함하는 메르스 코로나 바이러스 감염에 대한 예방 또는 개선용 건강기능식품조성물을 제공한다.
본 발명의 유효성분을 포함하는 식품으로는, 예를 들어, 각종 식품류, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 건강보조, 식품류 등이 있고, 분말, 과립, 정제, 캡슐 또는 음료인 형태로 사용할 수 있다.
본 발명의 유효성분은 일반적으로 전체 식품 중량의 0.01 내지 15중량%로 가할 수 있으며, 건강 음료 조성물은 100ml를 기준으로 0.02 내지 10g, 바람직하게는 0.3 내지 1g의 비율로 가할 수 있다.
본 발명의 건강 기능 식품은 지시된 비율로 필수 성분으로서 상기 유효성분을 함유하는 것 외에 식품학적으로 허용 가능한 식품보조 첨가제, 예컨대, 천연 탄수화물 및 다양한 향미제 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다.
상기 천연 탄수화물의 예로는 포도당, 과당 등의 단당류, 말토오스, 수크로오스 등의 이당류 및 덱스트린, 시클로덱스트린 등의 다당류와 같은 통상적인 당 및 자일리톨, 소르비톨, 에리쓰리톨 등의 당알코올이 있다.
상기 향미제로는 타우마틴, 레바우디오시드 A 또는 글리시르히진과 같은 스테비아 등의 천연 향미제 및 사카린, 아스파르탐 등의 합성 향미제를 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 건강 기능 식품 100ml 당 일반적으로 약 1 내지 20g, 바람직하게는 약 5 내지 12g을 사용한다. 상기 외에 본 발명의 건강 기능 식품은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물, 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그 밖에 본 발명의 건강 기능 식품은 천연 과일 주스 및 과일 주스 음료 및 야채 음료 등의 제조를 위한 과육을 함유할 수도 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 본 발명의 유효성분 100중량부 당 0.01 내지 약 20중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.
본 발명은 다른 목적을 달성하기 위해, 상기 서술한 형질전환체의 단백질 추출물 또는 상기 형질전화체로 부터 분리된 재조합 메르스 코로나 바이러스 에피토프 단백질을 포함하는 메르스 코로나 바이러스 감염에 대한 예방 또는 개선용 화장료 조성물을 제공한다.
본 발명에 따른 화장료 조성물은 첨가제를 추가로 포함할 수 있다. 첨가제의 종류는 특별히 제한되는 것은 아니나, 예를 들면, 유분, 물, 계면활성제, 보습제, 저급알코올, 살균제, 산화방지제, 증점제, 킬레이트제, 색소, 방부제 및 향료 중 어느 하나 이상일 수 있다. 이러한 첨가제들은 필요에 따라 적절한 함량으로 배합하여 사용할 수 있다.
본 발명은 다른 목적을 달성하기 위해, 상기 서술한 형질전환체의 단백질 추출물 또는 상기 형질전화체로 부터 분리된 재조합 메르스 코로나 바이러스 에피토프 단백질을 포함하는 메르스 코로나 감염에 대한 예방 또는 치료용 의약외품 조성물 제공한다.
이하에서는 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다. 하기 실시예는 본 발명의 바람직한 일 구체예일 뿐이며, 본 발명의 권리범위가 하기 실시예의 범위로 한정되는 것은 아니다.
실험예 1: HBD2에 의한 항원(MERS-CoV S-RBD) 특이적인 면역반응 증가
재조합 항원 단백질을 확보하기 위하여 메르스 바이러스의 spike protein(GenBank: AKL59401.1)의 RBD(residues 291-725) 부위의 c-terminal에 HBD2(서열번호 1 :　N- GIGDPVTCLK SGAICHPVFC PRRYKQIGTC GLPGTKCCKK P -C）가 융합된 gene construct （서열번호 2 :　N- KYYSIIPHSI RSIQSDRKAW AAFYVYKLQP LTFLLDFSVD GYIRRAIDCG FNDLSQLHCS YESFDVESGV YSVSSFEAKP SGSVVEQAEG VECDFSPLLS GTPPQVYNFK RLVFTNCNYN LTKLLSLFSV NDFTCSQISP AAIASNCYSS LILDYFSYPL SMKSDLSVSS AGPISQFNYK QSFSNPTCLI LATVPHNLTT ITKPLKYSYI NKCSRLLSDD RTEVPQLVNA NQYSPCVSIL PSTVWEDGDY YRKQLSPLEG GGWLVASGST VAMTEQLQMG FGITVQYGTD TNSVCPKLEF ANDTKIASQL GNCVEYSLYG VSGRGVFQNC TAVGVRQQRF VYDAYQNLVG YYSDDGNYYC LRACVSVPVS VIYDKETKTH ATLFGSVACE HISSTMSQYS RSTRSMLKRR DSTYGPLQTP VGCVLGLVNS SLFVEGIGDPVTCLK SGAICHPVFC PRRYKQIGTC GLPGTKCCKK P　-C）을 제작하여 pCold II bactrial expression system에서 발현시킨 다음, N-terminal의 His tag을 기반으로 Ni-NTA Superflow (Qiagen, Valencia, CA)를 사용하여 재조합 항원 단백질을 확보하였다 (도 1). HBD2에 의한 항원(MERS-CoV S-RBD) 특이적인 면역반응 증가를 확인하기 위하여 Freund's complete adjuvant와 함께 각 항원 단백질 10ug씩을 6주-8주령의 암컷 C57BL/6 마우스의 꼬리와 뒷다리에 피하와 근육 주사 10일 후, Freund's incomplete adjuvant와 섞은 각 항원 단백질로 boost한 다음 3일 후 각 마우스로부터 serum sample을 확보하여 항원 특이적인 면역반응과 neutralizing 항체 반응을 확인하였다 (도 2). ELISA를 기반으로 antigen-specific antibody binding assay를 수행하여 MERS-CoV S-RBD-specific antibody responses를 확인하였다. 96-well ELISA plate를 S-RBD 단백질(2 μg/ml)로 4 °에서 overnight으로 coating한 다음, 5% non-fat milk로 37°에서 2시간 동안 blocking한 후 각 serum을 희석하여 37°에서 1시간 동안 처리하고 PBST로 세척하고 AP-conjugated anti-mouse IgG(1:7,000, Sigma-Aldrich)를 37 °에서 1시간 동안 처리 후 pNPP substrate를 처리하여 405nm (A405)에서 absorbance를 측정하였다. 그 결과 S-RBD(단독 항원)만 접종했을 때 보다 HBD-2 conjugated S-RBD(항원 단백질(S-RBD)의 C-terminal에 HDB2가 융합된 제조합 단백질)의 경우 항원 특이적 면역 반응 유도능이 높은 것을 확인 하였다 (도 2).
실험예 2: HBD2에 의하여 유도된 중화항체 반응 및 메르스 바이러스 방어능 확인
HBD2에 의하여 유도된 면역반응의 메르스 바이러스에 대한 방어능을 확인하기 위하여 MERS-CoV(KCDC,1-001-MER-IS-2015001)의 propagation에 사용된 Vero E6 세포와 메르스 바이러스의 host cell receptor인 hDPP4를 발현하는 Huh-7, (KCLB No. 60104)을 기반으로 in vitro에서 neutralization assay를 수행하였다. receptor binding-inhibition assay를 위하여 각 serum을 1:50으로 희석하여 1 μg의 S-RBD protein과 pre-incubation한 후 4% paraformaldehyde로 고정한 Huh-7 cells에 처리한 다음 Penta-His antibody-Alexa Fluor 488(1:100, Qiagen)을 사용하여 기관내 CURF의 CLSM(LSM 510, Carl Zeiss, Thornwood, NY, USA)로 receptor에 binding한 항원 단백질을 비교 분석 수행하였다. 그 결과 HBD-2 conjugated S-RBD의 접종 후 확보한 serum을 처리한 세료에서 MERS-CoV의 S-RBD protein의 DPP4 특이적인 결합이 현저하게 억제되는 것을 확인하였다 (도 3A). 각각 serum의 중화능을 확인하기 위하여 Vero E6 세포에 메르스 바이러스를 감염 시킨 후 세포에 감염된 viral RNA의 양을 upstream E gene을 target으로 하여 qRT-PCR을 통하여 분석하였다. 먼저 각 serum을 1:100으로 희석하여 103 PFU의 메르스 바이러스와 pre-incubation한 후 Vero E6 cells(1*106cells)에 처리한 다음, 24시간 후 Tri REAGENT (Sigma, Saint Quentin Fallavier, France)을 사용하여 total RNA를 추출하였다. 각 1 μg의 total RNA를 기반으로 M-MLV Reverse Transcriptase(Promega, Charbonnieres, France)를 사용하여 cDNA를 합성하고, power SYBR Green PCR mastermix(Applied Biosystems, Woolston, Warrington, UK)과 ABI 7500 real-time PCR system을 사용하여 qRT-PCR을 수행하였다. Target인 upstream E gene과 함께 endogenous control로 Vero E6 β-actin gene을 사용하였다. 본 실험에 사용한 upstream E gene의 primer 염기서열은 F: 5'-GCCTCTACACGGGACCCATA-3'과 R: 5'-GCAACGCGCGATTCAGTT-3'이고 Vero E6 β-actin gene의 primer 염기서열은 F: 5'-ATCGTGCGTGACATTAAGGAG-3'과 R: 5'-AGGAAGGAAGGCTGGAAGAG-3'이다. Amplification condition은 95 ℃에서 10 min activation 후 95 ℃에서 15s, 55 ℃에서 30s, 72 ℃에서 30s씩 40 amplification cycles 수행 후 7500 software(v2.3)을 사용하여 Real-time data 분석하였다. HBD-2 conjugated S-RBD에 의하여 유도된 항원 특이적인 항체에 의하여 MERS-CoV의 infection이 저해되는 것을 확인하였다 (도 3B).
실험예 3: 항바이러스 면역반응과 연계된 선천면역반응에 미치는 HBD2의 효과
HBD2에 의하여 조절되는 선천면역반응을 확인하기 위하여 PMA-differentiated THP-1 세포(1*106 cells)에 HBD2 포함 각 재조합 단백질을 1μg/mL씩 처리 후 6시간과 24시간에 Tri REAGENT (Sigma, Saint Quentin Fallavier, France)을 사용하여 total RNA를 추출하였다. 각 1 μg의 total RNA를 기반으로 M-MLV Reverse Transcriptase(Promega, Charbonnieres, France)를 사용하여 cDNA를 합성하고, power SYBR Green PCR mastermix (Applied Biosystems, Woolston, Warrington, UK)과 ABI 7500 real-time PCR system을 사용하여 qRT-PCR을 수행하여 항바이러스 활성을 지닌 주요 선천면역 molecule들을 확인하였다. Beta-actin gene(hACTB)을 Endogenous control로 사용하였고 본 실험에 사용한 primer들의 염기서열은 하기 표 1과 같다. Amplification condition은 95 ℃에서 10 min activation 후 95 ℃에서 15s, 55 ℃에서 30s, 72 ℃에서 30s씩 40 amplification cycles 수행 후 7500 software(v2.3)을 사용하여 Real-time data 분석하였다. 먼저 바이러스 감염 예방 및 치료에 주요한 IFN들과 이의 조절 인자로 알려진 MxA, 그리고 적응 면역에 필요한 pro-inflammatory cytokine의 발현을 유도하고 Host defense에 중요한 viral PRR(pattern recognition receptor)로 생각되고 있는 Nod2를 확인한 결과, HBD-2 conjugated S-RBD 처리시 현저하게 증가되는 것을 확인하였다 (도 4). 아울러 IFN은 antiviral activity를 지닌 다양한 유전자들의 발현을 유도하는데, MxA와 함께 대표적인 antiviral molecule로 바이러스 증식 억제에 관여한다고 알려진 PKR과 RNase L 모두 HBD-2 conjugated S-RBD 처리 시간에 비례하여 발현이 증가되는 것을 확인하였다. IL-1β, TNF-α 및 PAMP(pathogen-associated moleuclar pattern)에 특이적으로 반응하는 IL-6 모두 HBD-2 conjugated S-RBD 처리시 증가되는 것을 확인하였고, IFN-γ에 의하여 유도되는 CXCL-10을 포함하여 CXCL-1, RANTES, MCP-1 및 세균 감염시 대식세포에서 발현되는 대표적인 물질인 MIP-1α 같은 chemokine들 또한 HBD-2 conjugated S-RBD 처리시 유의하미하게 발현이 증가되는 것을 확인 하였다 (도 4).
real-time qRT-PCR에 사용되는 프라이머 시퀀스
Gene Primer
Orientation Sequence (5’-3')
hACTB Forward CCA ACC GCG AGA AGA TGA
Reverse TCC ATC ACG ATG CCA GTG
IFN-b Forward TTT CAG TGT CAG AAG CTC CT
Reverse TGG CCT TCA GGT AAT GCA GA
IFN-g Forward CCA ACG CAA AGC AAT ACA TGA
Reverse CCT TTT TCG CTT CCC TGT TTT
MxA Forward CTG TGG CCA TAC TGC CAG GA
Reverse ACT CCT GAC AGT GCC TCC AA
TNF-a Forward GGA GAA GGG TGA CCG ACT CA
Reverse CTG CCC AGA CTC GGC AA
IL-1b Forward CCT GTC CTG CGT GTT GAA AGA
Reverse GGG AAC TGG GCA GAC TCA AA
IL-6 Forward TGG CTG AAA AAG ATG GAT GCT
Reverse TCT GCA CAG CTC TGG CTT GT
CXCL-10 Forward AGT GGA TGT TCT GAC CCT GCT TCA
Reverse TGG GCC CCT TGG GAG GAT GG
CXCL-1 Forward ATT CAC CCC AAG AAC ATC CA
Reverse TGG ATT TGT CAC TGT TCA GCA
MCP-1 Forward ACT GAA GCT CGC ACT CTC
Reverse CTT GGG TTG TGG AGT GAG
MIP-1a Forward CAG CAG ACA GTG GTC AGT CC
Reverse TTC TGA GCA GGT GAC GGA AT
RNATES Forward CCT CAT TGC TAC TGC CCT CT
Reverse GGT GTG GTG TCC GAG GAA TAT
PKR Forward CAG GCA CGA CAA GCA TAG AA
Reverse CTA CTC CCT GCT TCT GAC GG
RNaseL Forward GCA GAA ATG CCT TGA TCC AT
Reverse AGT CTT CAG CAG GAG GGT GA
Nod2 Forward CGG CGT TCC TCA GGA AGT AC
Reverse ACC CCG GGC TCA TGA TG
<110> INDUSTRIAL COOPERATION FOUNDATION CHONBUK NATIONAL UNIVERSITY <120> A composition for preventing or treating MERS-CoV virus comprising HBD2 (human beta-defensin 2) or an fusion protein comprising epitope protein of MERS-CoV virus and the HBD2 <130> 1063238 <160> 2 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 41 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> gene of HDB2 <400> 1 Gly Ile Gly Asp Pro Val Thr Cys Leu Lys Ser Gly Ala Ile Cys His 1 5 10 15 Pro Val Phe Cys Pro Arg Arg Tyr Lys Gln Ile Gly Thr Cys Gly Leu 20 25 30 Pro Gly Thr Lys Cys Cys Lys Lys Pro 35 40 <210> 2 <211> 476 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> MERS-CoV S-RBD <400> 2 Lys Tyr Tyr Ser Ile Ile Pro His Ser Ile Arg Ser Ile Gln Ser Asp 1 5 10 15 Arg Lys Ala Trp Ala Ala Phe Tyr Val Tyr Lys Leu Gln Pro Leu Thr 20 25 30 Phe Leu Leu Asp Phe Ser Val Asp Gly Tyr Ile Arg Arg Ala Ile Asp 35 40 45 Cys Gly Phe Asn Asp Leu Ser Gln Leu His Cys Ser Tyr Glu Ser Phe 50 55 60 Asp Val Glu Ser Gly Val Tyr Ser Val Ser Ser Phe Glu Ala Lys Pro 65 70 75 80 Ser Gly Ser Val Val Glu Gln Ala Glu Gly Val Glu Cys Asp Phe Ser 85 90 95 Pro Leu Leu Ser Gly Thr Pro Pro Gln Val Tyr Asn Phe Lys Arg Leu 100 105 110 Val Phe Thr Asn Cys Asn Tyr Asn Leu Thr Lys Leu Leu Ser Leu Phe 115 120 125 Ser Val Asn Asp Phe Thr Cys Ser Gln Ile Ser Pro Ala Ala Ile Ala 130 135 140 Ser Asn Cys Tyr Ser Ser Leu Ile Leu Asp Tyr Phe Ser Tyr Pro Leu 145 150 155 160 Ser Met Lys Ser Asp Leu Ser Val Ser Ser Ala Gly Pro Ile Ser Gln 165 170 175 Phe Asn Tyr Lys Gln Ser Phe Ser Asn Pro Thr Cys Leu Ile Leu Ala 180 185 190 Thr Val Pro His Asn Leu Thr Thr Ile Thr Lys Pro Leu Lys Tyr Ser 195 200 205 Tyr Ile Asn Lys Cys Ser Arg Leu Leu Ser Asp Asp Arg Thr Glu Val 210 215 220 Pro Gln Leu Val Asn Ala Asn Gln Tyr Ser Pro Cys Val Ser Ile Leu 225 230 235 240 Pro Ser Thr Val Trp Glu Asp Gly Asp Tyr Tyr Arg Lys Gln Leu Ser 245 250 255 Pro Leu Glu Gly Gly Gly Trp Leu Val Ala Ser Gly Ser Thr Val Ala 260 265 270 Met Thr Glu Gln Leu Gln Met Gly Phe Gly Ile Thr Val Gln Tyr Gly 275 280 285 Thr Asp Thr Asn Ser Val Cys Pro Lys Leu Glu Phe Ala Asn Asp Thr 290 295 300 Lys Ile Ala Ser Gln Leu Gly Asn Cys Val Glu Tyr Ser Leu Tyr Gly 305 310 315 320 Val Ser Gly Arg Gly Val Phe Gln Asn Cys Thr Ala Val Gly Val Arg 325 330 335 Gln Gln Arg Phe Val Tyr Asp Ala Tyr Gln Asn Leu Val Gly Tyr Tyr 340 345 350 Ser Asp Asp Gly Asn Tyr Tyr Cys Leu Arg Ala Cys Val Ser Val Pro 355 360 365 Val Ser Val Ile Tyr Asp Lys Glu Thr Lys Thr His Ala Thr Leu Phe 370 375 380 Gly Ser Val Ala Cys Glu His Ile Ser Ser Thr Met Ser Gln Tyr Ser 385 390 395 400 Arg Ser Thr Arg Ser Met Leu Lys Arg Arg Asp Ser Thr Tyr Gly Pro 405 410 415 Leu Gln Thr Pro Val Gly Cys Val Leu Gly Leu Val Asn Ser Ser Leu 420 425 430 Phe Val Glu Gly Ile Gly Asp Pro Val Thr Cys Leu Lys Ser Gly Ala 435 440 445 Ile Cys His Pro Val Phe Cys Pro Arg Arg Tyr Lys Gln Ile Gly Thr 450 455 460 Cys Gly Leu Pro Gly Thr Lys Cys Cys Lys Lys Pro 465 470 475

Claims (6)

  1. 서열번호 2의 아미노산 서열로 구성되는 메르스 코로나 바이러스 에피토프 단백질.
  2. 제 1항의 에피토프를 포함하는 메르스 코로나 바이러스의 항원.
  3. 제 1항의 에피토프 단백질을 암호화하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터.
  4. 제 3항의 재조합 벡터로 형질전환된 형질전환체.
  5. 제 4항의 형질전환체, 상기 형질전환체의 단백질 추출물 또는 상기 형질전환체로부터 분리된 재조합 메르스 코로나 바이러스 에피토프 단백질을 포함하는 메르스 코로나 바이러스 감염에 대한 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  6. 제 4항의 형질전환체, 상기 형질전환체의 단백질 추출물 또는 상기 형질전환체로부터 분리된 재조합 메르스 코로나 바이러스 에피토프 단백질을 포함하는 메르스 코로나 바이러스 감염의 예방 또는 개선용 건강기능식품조성물.
KR1020190154546A 2019-11-27 2019-11-27 HBD2(human beta-defensin 2) 또는 상기 유전자와 융합된 메르스 코로나 바이러스의 에피토프 단백질을 포함하는 메르스 코로나바이러스의 예방 또는 치료용 조성물 KR102136954B1 (ko)

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KR20240086740A (ko) 2022-11-28 2024-06-19 충북대학교 산학협력단 사이클로필린 a 단백질을 유효성분으로 포함하는 코로나 바이러스 감염증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물

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Journal of Virology, 2013, 제87권, 제16호, 페이지 9379-9383*
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