KR20190143246A - 신규한 링커 화합물 및 이를 포함하는 위치 특이적인 항체-약물 결합체 화합물 - Google Patents

신규한 링커 화합물 및 이를 포함하는 위치 특이적인 항체-약물 결합체 화합물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 신규한 링커 화합물에 관한 것으로서, 이를 포함한 위치 특이적인 항체-약물 결합체(Antibody-Drug Conjugate, 이하 ADC) 화합물, 이의 제조방법 및 이를 유효성분으로 포함하는 항암제 조성물에 관한 것이다. 상기 링커 화합물은 ADC 화합물 제조 시 우수한 위치 특이성으로 균일한 ADC 화합물을 생성하며, 이를 포함하는 ADC 화합물은 우수한 항암 효과를 나타낸다.

Description

신규한 링커 화합물 및 이를 포함하는 위치 특이적인 항체-약물 결합체 화합물 {Novel linker compound and Site-Specific compounds of Antibody-Drug Conjugate Comprising the Same}
본 발명은 항체의 시스테인 잔기에 직접 결합할 수 있는 링커에 관한 것으로서, 이를 포함한 위치 특이적인 항체-약물 결합체 화합물(Site-Specific Antibody-Drug Conjugate Compound, 이의 제조방법 및 이를 유효성분으로 포함하는 항암제 조성물에 관한 것이다.
항체-약물 결합체(Antibody-Drug Conjugate, 이하 ADC) 화합물은 항체 요법 또는 전통적인 화학요법에 대한 임상적인 효능 및 내성을 개선하고 상당한 잠재력을 갖는 유망한 표적화된 치료제이다. 임상적으로 유용한 ADC 화합물은 매우 강력한 세포독성 약물을 종양 세포에 항원-특이적으로 전달할 수 있다. ADC 화합물의 단클론성 항체 성분은 건강한 세포보다 종양 세포의 세포 표면 항원을 특이적으로 인지할 수 있다. 따라서 결합된 약물의 비-종양 세포에 대한 비특이적 전달이 감소되고 종양 세포에 대한 특이적인 전달이 증가한다.
ADC 화합물 제품으로는 미국 식품의약국 FDA(Food and Drug Administration)에서 승인된 브렌툭시맙 베도틴(항-CD30 ADC 화합물) 및 아도-트라스트주맙 엠탄신(항-HER2 ADC 화합물) 및 일본 후생성에서 승인된 겜투주맙 오조가미신(항-CD33 ADC 화합물)과 같이 총 세 개의 ADC 화합물 제품만이 시판 중이다.
약물을 항체에 부착하는 방법 즉, 결합은 ADC 화합물 개발에 있어 매우 중요한 과정으로 상기 세 개의 시판 중인 ADC 화합물 제품은 모두 통상적인 비-특이적 결합 방법을 이용한다. 그러나 비-특이적 결합 방법은 불균일한 ADC 화합물의 혼합물을 생성하여 ADC 화합물의 약물로서 치료 효능이 떨어지고, 약동학 분석에 있어 수십 종의 상이한 ADC 화합물 분자를 고려해야 하는 문제가 발생한다[Wang et al., Protein Sci. 2005, 14, 2436-2446].
상기 비-특이적 결합 방법의 문제를 해결하기 위해서 시스테인-기반 위치 특이적 ADC 화합물의 항체 반응 부위에 위치 특이성을 부여하는 방법을 통해 균일한 ADC 화합물을 제조하는 방법이 최근에 개발되었다. 그러나 상기와 같이 위치 특이성을 부여하는 방법은 유전자 조작을 통하여 결합 항체에 추가적인 시스테인 잔기를 부여하거나 항체 구조 결정에 중요한 이황화결합을 형성하는 시스테인 잔기에 결합하여 항체의 구조 및 기능을 변경시키는 문제점이 있다[Jagath et al., Nature Biotechnology, 2008, 26(8):925-32].
이에 본 발명자들은 상기와 같이 유전자 조작을 통하여 항체의 구조 및 기능을 변경시키지 않으면서 종래의 비-특이적인 ADC 화합물의 문제점을 해결하고자 연구하였고, 그 결과 항체에 존재하는 이황화결합에 결합하는 신규한 위치 특이적인 ADC 화합물 및 이의 제조에 사용되는 화합물을 개발하여 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서, 본 발명의 해결하려는 과제는 위치 특이적인 ADC 화합물의 제조에 사용되는 화학식 A의 화합물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 해결하려는 과제는 위치 특이적인 ADC 화합물의 제조에 사용되는 상기 화학식 A를 포함하는 화학식 B의 화합물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 해결하려는 과제는 위치 특이적인 ADC 화합물인 화학식 C의 화합물을 제공하는 것이다.
본 발명은 하기 화학식 A의 화합물을 제공한다.
[화학식 A]
Figure pat00001
상기 식에서,
XA 및 XB는 각각 독립적으로 산소 및 황에서 선택되며,
YA 및 YB는 각각 독립적으로 수소, 할로겐 및 이탈기(leaving group)에서 선택되며,
R1는 카르보닐기, 카르복실기, 알킬기, 아릴기, 헤테로아릴기 및 아민기에서 선택되고 이들 그룹은 치환되거나 비치환된 것일 수 있으며,
n는 1 내지 4이다.
본 명세서에서 “할로겐”은 염소, 브롬 또는 요오드를 의미한다.
본 명세서에서 "이탈기"(leaving group)는 반응시 기질로부터 분리되는 기질의 부분을 말한다. 이탈기의 예는 2-머캅토 피리딘, 티오페놀, 1,3-디티오페놀, 1,4-디티오페놀, 머캅토아닐린, 머캅토페닐아마이드, 머캅토페닐아미노 옥소프로필 포스핀 등이며, 이에 한정되지 않는다.
본 명세서에서 “카르보닐기”는 -C(=O)- 로 표시되는 2가의 작용기를 의미하며, 알데하이드, 케톤, 카복실산과 그 유도체인 에스터와 아마이드, 그리고 케텐 등을 포함하며, 이에 한정되지 않는다.
본 명세서에서 “카르복실기”는 -C(=O)-O-, 간단히 -COO-로 표시되는 1가 또는 2가의 작용기를 의미하며, 카르복실산 뿐만 아니라, 에스터 및 카바메이트 등을 포함하며, 이에 한정되지 않는다.
본 명세서에서 “알킬기”는 다른 언급이 없는 한, 전부 포화되거나 하나 또는 여러 개가 불포화될 수 있으며, 여러 개의 탄소 원자, 예를 들어 탄소수 1 내지 12개를 가지는 다가 라디칼을 포함할 수 있는 직쇄 또는 측쇄, 또는 고리 탄화수소 라디칼 또는 그의 조합물을 포함한다.
상기 포화 알킬기의 예로는 메틸, 에틸, n-프로필, 이소프로필, n-부틸, t-부틸, 이소부틸, 이차-부틸, 시클로헥실, 시클로헥실메틸, 시클로프로필메틸, 그의 동형체 및 이성질체, 예를 들면, n-펜틸, n-헥실, n-헵틸, n-옥틸 및 이의 유사 형태를 포함하며, 이에 한정되지 않는다.
상기 불포화 알킬기의 예로는 하나 또는 그 이상의 이중 결합 또는 삼중 결합을 갖는 것이 있다. 불포화 알킬 기의 예로는 비닐, 2-프로페닐, 크로틸, 2-이소펜테닐, 2-(부타디에닐), 2,4-펜타디에닐, 3-(l,4-펜타디에닐), 에티닐, 1- 및 3-프로피닐, 3-부티닐, 및 고급 동형체 및 이성질체를 포함하며, 이에 한정되지 않는다.
본 명세서에서 “아릴기”는 5 내지 15각형으로 이루어진 단순 또는 융합 고리형 구조를 의미하며, 아릴기의 예로는 페닐, 나프틸 등이 있으나, 이에 한정되지 않는다.
본 명세서에서 “헤테로아릴기”는 산소, 황 또는 질소를 하나 이상 포함하는 아릴기를 의미하며, 헤테로아릴기의 예로는 피리디닐, 푸라닐, 티오페닐, 인돌릴, 퀴놀리닐, 이미다졸리닐, 트리아졸릴, 옥사졸릴, 테트라히드로나프틸 등을 포함하며, 이에 한정되지 않는다.
본 명세서에서 “아민기”는 질소 원자에 수소가 결합된 형태로 -NH- 표시되는 다가 작용기를 의미하며, 수소의 치환 및 배위 결합에 따른 암모늄 이온 생성을 통하여 1가 내지 4가 작용기로 사용될 수 있다. 아민기는 1 내지 3차 알킬아민 뿐만 아니라 그 유도체인 아마이드 등을 포함하며, 이에 한정되지 않는다.
상기 화학식 A의 화합물은 하기 화학식 I의 화합물을 포함한다.
[화학식 I]
Figure pat00002
상기 식에서,
YA 및 YB는 각각 독립적으로 할로겐이며,
R2는 수소, 히드록시, 할로겐, 이탈기 및 보호기(Protecting group)에서 선택되며,
n는 1 내지 4이다.
본 명세서에서 "보호기"는 유기 합성 반응에서 화합물에 작용기(functional group)가 다수 존재할 경우 특정 작용기와 결합하여 추가적인 반응을 하지 못하도록 차단시킬 수 있는 분자 또는 화합물을 말한다. 추가적인 반응 및 활성화를 위해서 "보호기"는 탈보호화 반응을 통해 화합물에서 분리될 수 있다. 일반적으로 보호기를 도입하는 작용기는 카르복실기 및 아미노기가 있다.
상기 카르복실기 보호기로는 메틸, 에틸, t-부틸, 2,2,2-트리클로로에틸, N-히드록시 숙신이미드 또는 카르보닐디이미다졸 등을 사용할 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다. 또한 카르복실산 보호기의 탈보호화 반응은 수산화 리튬 또는 트리플루오르아세트산을 사용하여 수행할 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 하기 화학식 B의 화합물을 제공한다.
[화학식 B]
Figure pat00003
상기 식에서
XA 및 XB는 각각 독립적으로 산소 및 황에서 선택되며,
YA 및 YB는 각각 독립적으로 수소, 할로겐 및 이탈기(leaving group)에서 선택되며,
FG(functional group)는 기능기로
Figure pat00004
이며,
D는 약물이며,
CV는 절단 부위 화합물이며,
SP는 스페이서 화합물이며,
p, q 및 r은 각각 독립적으로 0 내지 8이고 p, q 및 r 중 적어도 하나는 0이 아니며,
n는 1 내지 4이다.
본 명세서에서 "약물"은 치료학적으로 효과적인 양으로 존재할 때 포유 동물에 원하는 치료 효과를 내는 화합물을 의미한다. 특히 암 치료에 있어서 표적 세포에 들어갈 수 있는 화합물을 의미한다.
상기 "약물"은 돌라스타틴, 파클리탁셀, 두오카르마이신, 크립토파이신, 안트라시클린, 미토마이신C, 올리고마이신, 에포타일론, 헤미아스테린, 카리케아마이신, 독소루비신, 파이롤벤젠디아지핀, 마이탄시노이드 및 이들의 유도체를 포함하며, 이에 한정되지 않는다.
본 명세서에서 "절단 부위 화합물"은 생체 내에서 불안정한 성분으로 특정 생물학적 환경 예를 들면, 특정 효소 작용 환경 또는 특정 pH 등에 의해 생체 내에서 절단되는 화합물을 의미한다. 상기 절단을 통해 ADC 화합물에서 약물이 분리되어 약물의 활성이 나타나게 한다.
상기 "절단 부위 화합물"은 생체 내의 원하는 작용 위치에서 약물의 활성이 나타날 수 있도록 선택되며 작용 위치는 치료가 필요한 활성 작용 위치에 해당하는 표적 세포 예를 들면, 악성 종양 세포, 조직 내 또는 그 근처가 될 수 있다.
상기 "절단 부위 화합물"은 효소적으로 절단 가능한 부위를 포함하는 화합물일 수 있으며, 예로 천연 아미노산 또는 천연 아미노산으로 끝나고 그의 카르복실 말단에서 링커에 부착되어 있는 펩티드 서열 예를 들면, 발린-시트롤린(Val-Cit) 및 이의 유도체 등 또는 당 유도체 예를 들면, 클루쿠로나이드 유도체 등이 포함된다.
상기 "절단 부위 화합물"은 비-효소적으로 절단 가능한 부위를 포함하는 화합물일 수 있으며, 예로 이황화결합(disulfide, -S-S-)를 포함하는 화합물 및 이의 유도체, 옥심 및 이의 유도체, 이민 및 이의 유도체 등이 포함된다.
본 명세서에서 "스페이서 화합물"은 약물, 절단 부위 화합물, 항체의 특정 위치와 결합하는 화합물과 반응할 수 있는 ADC 화합물의 일 구성 요소를 의미한다. 또한 스페이서 화합물에 부가된 작용기에 의해서 ADC 화합물의 용해성 및 반감기가 조절될 수 있다.
상기 스페이서 화합물의 예로 탄소수 1 내지 50개의 알킬기, 탄소수 1 내지 50개의 알케닐기 또는 탄소수 1 내지 50개의 알키닐린기로서 그 골격 탄소의 하나 이상의 -CH2-가 -O-, -S-, -S-S-, -C(=O)-, -COO-, -NH-, -N(탄소수 1 내지 6개 알킬)-, 치환되거나 비치환된 아릴기 및 치환되거나 비치환된 헤테로 아릴기에서 선택된 작용기로 치환된 것이며, 이에 한정되지 않는다.
상기 "스페이서 화합물"은 PEG(폴리에틸렌글리콜), 피페라진, 6-아미노헥사놀, 6-메르캅토헥사놀, 10-히드록시데칸산, 글리신 및 다른 아미노산, 1,6-헥산디올, β-알라닌, 2-아미노에탄올, 시스테아민 (2-아미노에탄티올), 5-아미노펜탄산, 6-아미노헥산, 3-말레이미도벤조산, 프탈리드, α-치환 프탈리드, 카르보닐기, 아민성 에스테르, 핵산, 펩티드 및 이의 유도체를 포함하며, 이에 한정되지 않는다.
상기 스페이서 화합물은
Figure pat00005
,
Figure pat00006
,
Figure pat00007
,
Figure pat00008
,
Figure pat00009
및
Figure pat00010
에서 선택되는 것인 화합물을 포함하며, 이에 한정되지 않는다:
상기 식에서
n1 및 n2는 각각 독립적으로 0 내지 3이고 n1 및 n2 중 적어도 하나는 0이 아니며,
p', q', r'은 각각 독립적으로 0 내지 4이고 p', q' 및 r' 중 적어도 하나는 0이 아니다.
상기 화학식 II의 화합물은 하기 화학식의 화합물을 포함하며, 이에 한정되지 않는다.
Figure pat00011
,
Figure pat00012
,
Figure pat00013
,
Figure pat00014
,
Figure pat00015
,
Figure pat00016
.
상기 화학식 B의 화합물은 하기 화학식 VIII-1 내지 VIII-6의 화합물을 포함하며, 이에 한정되지 않는다.
[화학식 VIII-1]
Figure pat00017
[화학식 VIII-2]
Figure pat00018
[화학식 VIII-3]
Figure pat00019
[화학식 VIII-4]
Figure pat00020
[화학식 VIII-5]
Figure pat00021
[화학식 VIII-6]
Figure pat00022
또한, 본 발명은 하기 화학식 C의 화합물을 제공한다.
[화학식 C]
Figure pat00023
상기 식에서,
XA 및 XB는 각각 독립적으로 산소 및 황에서 선택되며,
Ab는 항체이며,
SA 및 SB는 항체 내의 이황화결합으로부터 유래된 2개의 시스테인 잔기의 황 원자이며,
FG는 기능기(functional group)로,
Figure pat00024
이며,
D는 약물이며,
CV는 절단 부위 화합물이며,
SP는 스페이서 화합물이며,
p, q 및 r은 각각 독립적으로 0 내지 8이고 p, q 및 r 중 적어도 하나는 0이 아니며,
n는 1 내지 4이다.
상기 D, CV 및 SP 는 상기 화학식 B에서 정의한 바와 같다.
본 명세서에서 "항체"는 최대한 넓은 의미로 사용되며, 구체적으로 무 손상(intact) 단일클론 항체, 다클론 항체, 2종 이상의 무손상 항체로부터 형성된 다중특이성 항체(예를 들어, 이중특이성 항체), 및 목적하는 생물학적 활성을 나타내는 항체 단편을 포함한다. 항체는 특이적인 항원을 인식하고 결합할 수 있는 면역계에 의하여 생성되는 단백질이다. 그 구조적인 면에서, 항체는 통상적으로 4개의 아미노산 쇄(2개의 중쇄 및 2개의 경쇄)로 이루어진 Y-형상의 단백질을 가진다. 각각의 항체는 주로 가변 영역 및 불변 영역의 2개의 영역을 가진다. Y의 팔의 말단 부분에 위치한 가변 영역은 표적 항원에 결합하고 상호작용한다. 상기 가변 영역은 특정 항원 상의 특이적 결합 부위를 인식하고 결합하는 상보성 결정 영역 (CDR)을 포함한다. Y의 꼬리 부분에 위치한 불변 영역은 면역계에 의하여 인식되고 상호작용한다. 표적 항원은 일반적으로 다수의 항체 상의 CDR에 의하여 인식되는, 에피토프라고 하는 다수의 결합 부위를 가지고 있다. 상이한 에피토프에 특이적으로 결합하는 각각의 항체는 상이한 구조를 가진다. 그러므로 한 항원은 하나 이상의 상응하는 항체를 가질 수 있다.
상기 항체는 암세포 항원에 면역특이적으로 결합하는 항체일 수 있다. 암세포 항원에 면역특이적인 항체는 상업적으로 입수하거나, 재조합 발현 기술과 같이 당업계에 공지된 방법에 의해 제조될 수 있다. 암세포 항원에 면역특이적인 항체를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 예를 들어 진뱅크 데이터베이스 또는 문헌으로부터 얻거나, 통상의 클로닝 및 시퀀싱에 의해 얻을 수 있다.
상기 항체는 EGFR, HER2, HER3 및 HER4로부터 선택된 ErbB 수용체 및 기타 암 항원에 대한 결합능 및 특이성을 가지며, 예를 들어 본 발명에 따른 모항체는 트라스투주맙(trastuzumab, 상품명: 허셉틴), 리툭시맙(rituximab, 상품명: 리툭산), 베바시주맙(bevacizumab, 상품명: 아바스틴) 세툭시맙(cetuximab, 상품명: 얼비툭스), cBR96, cAClO, 항-CD20 항체, 항-EphB2 항체, 항-IL-8, E-셀렉틴 항체, 항-MUC16 항체, 항 FR-β 항체 및 항-CD30 항체로부터 선택되는 하나 이상의 것을 포함하나, 이에 한정되지는 않는다.
상기 화학식 C의 화합물은 항체 및 약물을 포함하는 ADC 화합물일 수 이으나, 이에 한정되지 않는다.
상기 화학식 C의 화합물은 하기 화학식 X-1 내지 X-9의 ADC 화합물을 포함하며, 이에 한정되지 않는다.
[화학식 X-1]
Figure pat00025
[화학식 X-2]
Figure pat00026
[화학식 X-3]
Figure pat00027
[화학식 X-4]
Figure pat00028
[화학식 X-5]
Figure pat00029
[화학식 X-6]
Figure pat00030
[화학식 X-7]
Figure pat00031
[화학식 X-8]
Figure pat00032
[화학식 X-9]
Figure pat00033
또한, 본 발명은 화학식 C의 화합물의 제조방법을 제공한다.
상기 본 발명의 화학식 C의 제조방법은
하기 화학식 B의 화합물과 항체를 반응시키는 단계를 포함한다.
[화학식 B]
Figure pat00034
[화학식 C]
Figure pat00035
상기 식에서,
XA 및 XB는 각각 독립적으로 산소 및 황에서 선택되며,
YA 및 YB는 각각 독립적으로 수소, 할로겐 및 이탈기(leaving group)에서 선택되며,
Ab는 항체이며,
SA 및 SB는 항체 내에 이황화결합으로부터 유래된 2개의 시스테인 잔기의 황 원자이며,
FG는 기능기(functional group)로,
Figure pat00036
이며,
D는 약물이며,
CV는 절단 부위 화합물이며,
SP는 스페이서 화합물이며,
p, q 및 r은 각각 독립적으로 0 내지 8이고, p, q 및 r 중 적어도 하나는 0이 아니며,
n는 1 내지 4이다.
상기 D, CV 및 SP 는 상기 화학식 B에서 정의한 바와 같다.
본 발명은 상기 화학식 C의 제조방법에 있어 추가적으로
하기 화학식 A의 화합물과 기능기(FG)를 반응시켜 하기 화학식 B의 화합물을 수득하는 단계를 포함한다.
[화학식 A]
Figure pat00037
[화학식 B]
Figure pat00038
상기 식에서,
XA 및 XB는 각각 독립적으로 산소 및 황에서 선택되며,
YA 및 YB는 각각 독립적으로 수소, 할로겐 및 이탈기(leaving group)에서 선택되며,
R1은 카르보닐기, 카르복실기, 알킬기, 아릴기, 헤테로아릴기 및 아민기에서 선택되고 이들 그룹은 치환되거나 비치환된 것일 수 있으며,
FG는 기능기(functional group)로,
Figure pat00039
이며,
D는 약물이며,
CV는 절단 부위 화합물이며,
SP는 스페이서 화합물이며,
p, q 및 r은 각각 독립적으로 0 내지 8이고, p, q 및 r 중 적어도 하나는 0이 아니며,
n는 1 내지 4이다.
상기 D, CV 및 SP 는 상기 화학식 B에서 정의한 바와 같다.
상기, 화학식 C의 화합물의 제조방법을 ADC 화합물인 X-2의 제조방법인 반응식을 참조로 상세히 설명한다. 하기 반응식에 기재된 방법은 대표적으로 사용된 방법을 예시한 것일 뿐 단위 조작의 순서, 반응 시약, 반응 조건 등은 경우에 따라 얼마든지 변경될 수 있다.
상기, 화학식 C의 화합물의 제조방법을 ADC 화합물인 X-2의 제조방법인 반응식을 참조로 상세히 설명한다. 하기 반응식에 기재된 방법은 대표적으로 사용된 방법을 예시한 것일 뿐 단위 조작의 순서, 반응 시약, 반응 조건 등은 경우에 따라 얼마든지 변경될 수 있다.
[반응식]
Figure pat00040
Figure pat00041
Figure pat00042
Figure pat00043
Figure pat00044
Figure pat00045
상기 단계 (i)에서는 화학식 III의 화합물과 화학식 IV의 돌라스타틴 10 유도체를 축합 반응시켜 화학식 V의 화합물을 수득한다. 상기 축합 반응은 축합제의 존재 하에 수행될 수 있으며, 축합제로는 디시클로헥실카르보디이미드(DCC), (3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드(EDC), I-[비스(디메틸아미노)메틸렌]-1H-1,2,3-트리아졸[4,4-b]피리딘늄3-옥사이드 헥사플루오르포스페이트(HATU), N,N'-디이소프로필카르보디이이미드(DIC), 벤조트리아졸-I-일-옥시트리피롤리딘노포스포늄 헥사플루오르포스페이트(PyBOP),벤조트리아졸-I-일-옥시트리디메틸아미노 포스포늄 헥사플루오르포스페이트(BOP), (I-시아노-2-에톡시-2-옥소에틸리덴아미노옥시)디메틸아미노-몰포린노-카벤늄 헥사플루오르포스페이트(COMU) 히드록시벤조트리아졸(HOBt), 히드록시아자벤조트리아졸(HOAt) 등을 사용할 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다. 축합 반응시 필요하다면, 피리딘, 디이소프로필에틸아민과 같은 유기 염기를 축합제와 함께 사용할 수 있다. 반응 용매로는 디메틸포름아미드(DMF), 디메틸아세트아미드(DMA), 디메틸술폭시드(DMSO), N-메틸-2-피롤리돈(NMP) 등을 사용할 수 있으며, 반응 온도는 20 내지 25 ℃가 바람직하다.
상기 단계 (ii)에서는 화학식 V의 화합물을 염기성 물질과 반응시켜 화학식 VI의 화합물을 수득한다. 반응 용매로는 디메틸술폭시드(DMSO), 아세토니트릴(MeCN), 디메틸포름아미드(DMF) 등을 사용할 수 있으며, 반응 온도는 20 내지 25 ℃가 바람직하다.
상기 염기성 물질로는 피리딘, N,N-디이소프로필에틸아민 등을 사용할 수 있으며, 이에 한정되지 않는다.
상기 단계 (iii)에서는 화학식 VI의 화합물과 화학식 II-2를 축합 반응시켜 화학식 VII-2의 화합물을 제조한다.
상기 축합 반응은 축합제의 존재 하에 수행될 수 있으며, 축합제로는 축합제로는 디시클로헥실카르보디이미드(DCC), (3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드(EDC), I-[비스(디메틸아미노)메틸렌]-1H-1,2,3-트리아졸[4,4-b]피리딘늄3-옥사이드 헥사플루오르포스페이트(HATU), N,N'-디이소프로필카르보디이이미드(DIC), 벤조트리아졸-I-일-옥시트리피롤리딘노포스포늄 헥사플루오르포스페이트(PyBOP),벤조트리아졸-I-일-옥시트리디메틸아미노 포스포늄 헥사플루오르포스페이트(BOP), (I-시아노-2-에톡시-2-옥소에틸리덴아미노옥시)디메틸아미노-몰포린노-카벤늄 헥사플루오르포스페이트(COMU) 히드록시벤조트리아졸(HOBt), 히드록시아자벤조트리아졸(HOAt) 등을 사용할 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다. 반응 용매로는 디메틸포름아미드(DMF),디메틸아세트이미드 (DMAC), 디클로로메탄(DCM), 아세토니트릴(MeCN) 등을 사용할 수 있으며, 반응 온도는 20 내지 25 ℃가 바람직하다.
상기 단계 (iv)에서는 화학식 VII-2의 화합물을 염기성 물질과 반응시켜 화학식 VIII-2의 화합물을 수득한다. 반응 용매로는 디메틸술폭시드(DMSO), 아세토니트릴(MeCN), 디메틸포름이미드(DMF) 등을 사용할 수 있으며, 반응 온도는 20 내지 25 ℃가 바람직하다.
상기 염기성 물질로는 피리딘, N,N-디이소프로필에틸아민 등을 사용할 수 있으며, 이에 한정되지 않는다.
상기 단계 (v)에서는 화학식 VIII-2의 화합물과 화학식 I-2를 축합 반응시켜 화학식 IX-2의 화합물의 카르복실기를 제조한다. 반응 용매로는 디메틸술폭시드(DMSO), 아세토니트릴(MeCN), 테트라히드로퓨란 (THF), 디클로로메탄(DCM), 디메틸아세트이미드(DMAC), 디메틸포름이미드(DMF) 등을 사용할 수 있으며, 반응 온도는 20 내지 25 ℃가 바람직하다.
상기 단계 (vi)에서는 화학식 IX-2의 화합물과 항체를 반응시켜 최종 생성물인 화학식 X-2의 화합물을 수득한다. 반응 용매로는 pH 6.0 내지 8.0의 포스페이트 버퍼를 사용할 수 있으며, 필요에 따라 디메틸포름아미드(DMF), 디메틸술폭시드(DMSO, 아세토니트릴(MeCN), 디메틸아세트이미드 (DMAC), 등의 유기용매를 혼합하여 사용할 수 있다. 이때 혼합용매 중 유기용매의 비율은 10% ~25% 이하인 것이 바람직하다.
상기 화학식 IX-2의 화합물은 항체를 기준으로 5 내지 8 당량 사용하는 것이 바람직하다. 이때 제조된 ADC 화합물에서 1 분자의 항체에 결합된 약물의 수인 약물-항체 비(Drug Antibody Ratio: DAR)가 수치 4인 결합체는 약 60% 내지 85%가 된다.
본 발명은 신규한 링커 화합물을 이용하여, 위치 특이적인 항체-약물 결합체를 제조할 수 있다.
도 1은 유방암 세포주 BT-474 세포에 대한 본 발명에 따른 ADC 화합물 X-2의 시험관 내 종양의 성장억제 효과를 나타낸 그래프이다.
도 2는 내성세포주 JIMT-1 세포에 대한 본 발명에 ADC 화합물 X-2의 시험관 내 종양의 성장억제 효과를 나타낸 그래프이다.
이하, 실시예에 의해 본 발명을 보다 구체적으로 설명한다. 그러나 실시예는 오직 본 발명의 이해를 돕기 위한 것으로, 어떤 의미로든 본 발명의 범위가 실시예에 의하여 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 화학식 Ⅰ-1 내지 Ⅰ-3 화합물의 제조
실시예 Ⅰ-1: 화학식 Ⅰ-1 화합물의 제조
1단계: 화합물 Ⅰ-1b 의 제조
Figure pat00046
테트라하이드로퓨란 (100 mL)에 소듐(metallic sodium) (3.8 g, 163 mmol)을 현탁시킨 후 0 ℃ 내지 상온(Room Temperature, 이하 r.t)에서 디에틸말로네이트(1a) (20 g, 125 mmol)를 천천히 적가하고 상온에서 1시간 교반시킨 다음 0 ℃에서 아릴브로마이드(13 mL, 150 mmo)를 첨가하고 상온에서 19시간 동안 교반하였다. 반응 완결 후 반응 용매를 감압 농축하여 디이에틸에터 (200 mL X 2)과 증류수 (200 mL)로 추출한 후 유기층을 무수황산나트륨으로 건조시키고 감압 농축하여 잔사를 실리카겔 컬럼크로마토그래피로 정제하여 표제화합물 I-1b (11.5 g, 46%)를 얻었다.
ES-MS m/z: 201.1 [M+H]+
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 5.81 - 5.74 (m, 1 H), 5.06 - 4.99 (m, 1 H), 4.21 (q, 4H), 3.37 (t, 1 H), 3.37 (t, 1 H), 2.03 (q, 2H), 1.21 (t, 6 H)
2단계: 화합물 I-1c 의 제조
Figure pat00047
화합물 I-1b (11.5 g, 57 mmol)를 테트라하이드로퓨란 (100 mL)에 용해 한 후 0 ℃ 내지 상온에서 소듐하이드라이드 (3.17 g, 132 mmol), 디터트부틸아조디카복시레이트 (13.2 g, 57 mmol)를 첨가한 후 반응 혼합물을 상온에서 15분간 교반하고 증류수 (2.1 mL, 114 mmol)를 천천히 적가하고 상온에서 3시간 동안 교반하였다. 반응이 완결 후 반응 용매를 감압 농축하여 증류수 (400 mL)과 에틸아세테이트 (400 mL X 2)로 추출한 다음 유기층을 무수황산마그네슘으로 건조시키고 감압 농축하였다. 농축 잔사를 실리카겔 컬럼크로마토그래피로 정제하여 표제화합물 I-1c (8.3 g, 41%)를 얻었다.
ES-MS m/z: 359.3 [M+H]+
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 6.43 (S, 1 H), 5.97 - 5.95 (m, 1 H), 5.17 (d, 1 H), 5.09 (d, 1H), 4.86 (S, 1H), 4.20 (q, 2H), 1.47 (d, 18 H), 1.30 (t, 3 H)
3단계: 화합물 I-1d 의 제조
Figure pat00048
화합물 I-1c (8.3 g, 23 mmol)를 테트라하이드로퓨란 (100 mL)에 녹인 후 0 ℃ 내지 상온에서 디메틸설파이드보란 (2.0 M in THF, 23.2 mL, 46 mmol)을 첨가한 후 상온에서 2시간 교반한 후 0 ℃에서 소듐아세테이트 (11.3 g, 138 mmol) (증류수 20 mL)과 하이드로젠퍼옥사이드 (30 %, 10.7 mL)를 천천히 적가하고 상온에서 1시간 교반하였다. 반응 완결 후 반응 용매를 감압 농축하여 증류수 250 ml과 에틸아세테이트 (250 mL X 2)로 추출한 다음 유기층을 무수황산마그네슘으로 건조시키고 감압 농축하였다. 농축 잔사를 실리카겔 컬럼크로마토그래피로 정제하여 표제화합물 I-1d (4.8 g, 55 %)를 얻었다.
ES-MS m/z: 375.2 [M-H]-
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 6.56 (S, 1 H), 4.84 (bs, 1 H), 4.21 (q, 2H), 3.72 (d, 2 H), 2.01 - 1.90 (m, 3H), 1.77 (bs, 1H), 1.49 (d, 18 H), 1.31 (t, 3 H)
4단계: 화합물 I-1e 의 제조
Figure pat00049
화합물 I-1d (4.80 g, 13 mmol)를 디클로로메탄 (50 mL)에 녹인 후 0 ℃에서 4-디메틸아미노피리딘 (0.15 g, 1 mmol), 트리에틸아민 (5.4 mL, 38 mmol), 메탄설포닐클로라이드 (1.48 mL, 19 mmol)를 첨가한 후 0 ℃에서 3시간 교반하였다. 반응 완결 후 포화염화암모늄 (10 mL)으로 ?칭(quenching)한 다음, 반응 용매를 감압 농축하여 증류수 (200 mL)과 에틸아세테이트 (200 mL X 2)로 추출한 다음, 유기층을 무수황산마그네슘으로 건조시키고 감압 농축하여 표제화합물 I-1e (crude 5.5 g)를 얻었다.
ES-MS m/z: 455.3 [M+H]+
5단계: 화합물 I-1f 의 제조
Figure pat00050
화합물 I-1e (5.5 g, 12 mmol)를 테트라하이드로퓨란 (240 mL)에 녹인 후 테트라부틸암모늄플루오라이드 용액(1.0 M 테트라하이드로퓨란, 36.0 mL, 36 mmol)을 첨가한 후 상온에서 2시간 교반하였다. 반응 완결 후 포화 염화암모늄 12 ml로 ?칭(quenching)한 다음, 반응 용매를 감압 농축하여 증류수 (200 mL)과 에틸아세테이트 (200 mL X 2)로 추출한 다음, 유기층을 무수황산마그네슘으로 건조시키고 감압 농축하였다. 농축 잔사를 실리카겔 컬럼크로마토그래피로 정제하여 표제화합물 I-1f (3.86 g, 90 %)를 얻었다.
ES-MS m/z: 359.3 [M+H]+
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 4.95 (bs, 1 H), 4.20 (q, 2H), 4.18 - 4.11 (m, 2 H), 2.07 - 2.04 (m, 1 H), 1.88 - 1.71 (m, 3 H), 1.46 (d, 18 H), 1.28 (t, 3 H)
6단계: 화합물 I-1g 의 제조
Figure pat00051
화합물 I-1f (3.86 g, 0.011 mmol)를 디클로로메탄(50 mL)에 녹이고 0 ℃에서 내지 상온에서 트리플루오르아세트산(20 mL)을 가한 후 상온에서 5시간 동안 교반하였다. 반응 완결 후 반응 용매를 감압 농축한 후 정제 없이 표제화합물 I-1g (4.2 g, Quant)를 얻었다.
ES-MS m/z: 159.1 [M+H]+
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 4.28 (q, 2H), 3.96 (t, 1 H), 3.37 (t, 1 H), 2.21 - 2.18 (m, 1 H), 1.99 - 1.93 (m, 3H), 1.77 (bs, 1H), 1.32 (t, 3 H)
7단계: 화합물 I-1h 의 제조
Figure pat00052
화합물 I-1g (500 mg, 1.201 mmol)를 디클로로메탄 (5 mL) 에 녹인 후 0 ℃내지 상온에서 메틸-3,4-디브로모-2,5-디옥소-2H-피롤-1(5H)-카르복실레이트 (338 mg, 1.079 mmol, 1.0 eq), 디이소프로필에틸아민 (70 ㎕, 0.40 mmol)을 가한 후 밤새 동안 환류 교반하였다. 반응 완결 후 증류수 (50 mL)과 디클로로메탄 (50 mL X 2)로 추출한 다음 유기층을 무수황산마그네슘으로 건조시키고 감압 농축하였다. 농축 잔사를 실리카겔 컬럼크로마토그래피로 정제하여 표제화합물 I-1h (400 mg, 78 %)를 얻었다.
ES-MS m/z: 396.9 [M+H]+
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 5.56 - 5.54 (m, 1 H), 4.81 - 4.75 (m, 1H), 4.23 (q, 2 H), 3.37 (t, 1 H), 3.31 - 3.23 (m, 1 H), 2.57 - 2.53 (m, 1 H), 2.11 - 2.04 (m, 1 H), 2.03 - 1.92 (m, 1 H), 1.78 - 1.71 (m, 1H), 1.26 (t, 3 H)
8단계: 화합물 I-1 의 제조
Figure pat00053
화합물 I-1h (400 mg, 1.010 mmol)를 테트라하이드로퓨란/증류수 (4 mL/2 mL)에 녹이고 리튬하이드록사이드 모노하이드레이트(85 mg, 2.02 mmol)을 가한 후 상온에서 밤새 동안 교반하였다. 반응 완결 후 2N 염산을 이용하여 산성화한 후 에틸아세이트 (20 mL X 3)로 추출한 다음 유기층을 무수 황산마그네슘으로 건조시키고 감압 농축하여 표제화합물 I-1 (330 mg, 89 %)을 얻었다.
ES-MS m/z: 368.3 [M-H]-
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 5.51 - 5.49 (m, 1 H), 4.85 - 4.63 (m, 1 H), 3.38 - 3,34 (m, 1 H), 2.50 - 2.44 (m, 1 H), 2.17 - 2.10 (m, 1 H), 1.92 - 1.84 (m, 1 H), 1.78 - 1.69 (m, 1 H)
실시예 I-2: 화합물 I-2의 제조
1단계: 화합물 I-2b 의 제조
Figure pat00054
테트라하이드로퓨란 (150 mL)에 소듐(metallic sodium) (3.7 g, 140 mmol)을 현탁시킨 후 0 ℃ 내지 상온에서 디에틸말로네이트(1a)(15 g, 93 mmol)를 천천히 적가하고 상온에서 1시간 교반시킨 다음 0 ℃ 내지 상온 에서 4-브로모-1-뷰테인 (15.3 mL, 140 mmol)을 첨가한 후 상온에서 밤새 동안 교반하였다. 이후 화합물 I-1b와 동일한 방법으로 표제화합물 I-2b (8.07 g, 40 %)를 얻었다.
ES-MS m/z: 215.1 [M+H]+
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 5.81 - 5.74 (m, 1 H), 5.06 - 4.99 (m, 1 H), 4.21 (q, 4H), 3.37 (t, 1 H), 2.12 (q ,1 H), 2.03 (q, 2H), 1.21 (t, 6 H)
2단계: 화합물 I-2c 의 제조
Figure pat00055
화합물 I-2b (8.0 g, 37 mmol)를 테트라하이드로퓨란 (100 mL)에 녹인 후 0 ℃ 내지 상온에서 소듐하이드라이드 (2.1 g, 0.086 mol, 2.3 eq), 디터트부틸아조디카복시레이트 (8.6 g, 37 mmol)를 첨가한 후 반응 혼합물을 상온에서 15분간 교반하고. 증류수 (2.1 ml, 114 mmol)을 천천히 적가하고 상온에서 3시간 동안 교반하였다. 이후 화합물 I-1c와 동일한 방법으로 표제화합물 I-2c (3.38 g, 25 %)를 얻었다.
ES-MS m/z: 371.0 [M-H]-
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 6.45 (S, 1 H), 5.87 - 5.77 (m, 1 H), 5.10 (d, 1 H), 5.02 (bs, 1 H), 4.21 (q, 2 H), 2.42 - 2.18 (m, 2 H), 1.95 - 1.82 (m, 2 H), 1.47 (d, 18 H), 1.31 (t, 3 H)
3단계: 화합물 I-2d 의 제조
Figure pat00056
화합물 I-2c (3.38 g, 9 mmol)을 테트라하이드로퓨란 (50 mL)에 녹인 후 0 ℃에서 디메틸설파이드보란 (2.0 M in THF, 9.1 ml, 18 mmol)을 첨가한 후 상온에서 2시간 교반한 후 0 ℃ 내지 상온에서 소듐아세테이트(4.5 g, 54 mmol), 증류수 (20 mL)과 하이드로젠퍼옥사이드(30 %, 5.0 mL)를 천천히 적가하고 상온에서 1시간 동안 교반하였다. 이후 화합물 I-1d와 동일한 방법으로 표제화합물 I-2d (2.44 g, 69 %)를 얻었다.
ES-MS m/z: 389.0 [M-H]-
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 6.53 (S, 1 H), 4.81 (bs, 1 H), 4.21 (q, 2H), 3.64 (bs, 2 H), 2.32 (bs, 1H), 1.91 - 1.64 (m, 4H), 1.47 (d, 18 H), 1.30 (t, 3 H)
4단계: 화합물 I-2e 의 제조
Figure pat00057
화합물 I-2d (2.44 g, 6 mmol)를 디클로로메탄 (25 mL)에 녹인 후 0 ℃에서 4-디메틸아미노피리딘 (77 mg, 0.63 mmol), 트리에틸아민(2.6 mL, 18 mmol), 메탄설포닐클로라이드 (0.73 mL, 9 mmol)를 첨가한 후 0 ℃에서 3시간 동안 교반하였다. 이후 화합물 I-1e와 동일한 방법으로 표제화합물 I-2e (crude 3.2 g)를 얻었다.
ES-MS m/z: 469.1 [M+H]+
5단계: 화합물 I-2f 의 제조
Figure pat00058
화합물 I-2e (3.2 g, 7 mmol)를 테트라하이드로퓨란 (100 mL)에 녹인 후 테트라부틸암모늄플루오라이드 용액(1.0 M 테트라하이드로퓨란), 20.5 mL, 20 mmol)를 첨가한 후 상온에서 2시간 동안 교반하였다. 이후 화합물 I-1f와 동일한 방법으로 표제화합물 I-2f(1.8 g, 71 %)를 얻었다.
ES-MS m/z: 373.1 [M+H]+
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 4.64 - 4.58 (m, 1 H), 4.36 - 4.33 (m, 1 H), 4.24 (q, 2H), 3.16 - 3.11 (m, 1 H), 2.16 - 2.06 (m, 1 H), 1.78 - 1.61 (m, 5 H), 1.46 (d, 18 H), 1.28 (t, 3 H)
6단계: 화합물 I-2g 의 제조
Figure pat00059
화합물 I-2f (900 mg, 2.42 mmol)를 테트라하이드로퓨란 /증류수 (8 mL/4 mL)에 녹이고 리튬하이드록사이드 모노하이드레이트(202 mg, 4.83 mmol)을 가한 후 60 ℃ 내지 60 ℃에서 밤새 교반하였다. 이후 화합물 I-1과와 동일한 방법으로 표제화합물 I-2g (810 mg, 97 %)를 얻었다.
ES-MS m/z: 343.0 [M-H]-
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 4.58 - 4.52 (m, 1 H), 4.33 - 4.30 (m, 1 H), 3.14 - 3.08 (m, 1 H), 2.14 - 2.07 (m, 1 H), 1.75 - 1.60 (m, 5 H), 1.46 (d, 18 H)
7단계: 화합물 I-2h 의 제조
Figure pat00060
화합물 I-2g (810 mg, 2.35 mmol)를 디클로로메탄(10 mL)에 녹이고 0 ℃ 내지 상온에서 트리플루오르아세트산(3 mL)을 가한 후 상온에서 4시간 동안 교반하였다. 이후 화합물 I-1g와동일한 방법으로 표제화합물 I-2h (960 mg, Quant)를 얻었다.
ES-MS m/z: 144.9 [M+H]+
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 3.88 - 3.85 (m, 1 H), 3.34 - 3.30 (m, 1 H), 3.19 - 3.13 (m, 1 H), 2.38 - 2.31 (m, 1 H), 1.98 - 1.76 (m, 5 H)
8단계: 화합물 I-2 의 제조
Figure pat00061
화합물 I-2h (960 mg, 2.58 mmol)를 아세트산 (10 mL) 에 녹인 후 0 ℃ 내지 상온에서 메틸3,4-디브로모-2,5-디옥소-2H-피롤-1(5H)-카르복실레이트 (800 mg, 2.58 mmol)를 가한 후 60 ℃에서 밤새 동안 교반하였다. 이후 화합물 I-1h와 동일한 방법으로 표제화합물 I-2 (390 mg, 40 %)를 얻었다.
ES-MS m/z: 380.9 [M-H]-
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 5.81 (bs, 1 H), 4.82 (bs, 1 H), 3.52 - 3.49 (m, 1 H), 2.63 (bs, 1 H), 2.04 - 1.90 (m, 3 H), 1.73 - 1.62 (m, 2 H)
실시예 I-3: 화합물 I-3의 제조
1단계: 화합물 Ⅰ-3b 의 제조
Figure pat00062
테트라하이드로퓨란 (150 mL)에 소듐(metallic sodium) (2.2 g, 140 mmol)를 현탁시킨 후 0 ℃ 내지 상온에서 디에틸말로네이트(1a)(10 g, 93 mmol)를 천천히 적가하고 상온에서 1시간 교반 시킨 후 0 ℃ 내지 상온에서 5-브로모-1-펜테인 (11.1 mL, 94 mmol)를 첨가하고 상온에서 밤새 동안 교반하였다. 이후 화합물 I-1b 와 동일한 방법으로 표제화합물 I-3b (8.86 g, 63 %)를 얻었다.
ES-MS m/z: 229.0 [M+H]+
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 5.82 - 5.75 (m, 1 H), 5.04 - 4.95 (m, 2 H), 4.23 (q, 4H), 3.34 (t, 1 H), 3.37 (t, 2 H), 2.10 (q, 2 H), 1.47 (q, 2H), 1.29 (t, 6 H)
2단계: 화합물 I-3c 의 제조
Figure pat00063
화합물 I-3b (8.86 g, 39 mmol)를 테트라하이드로퓨란 (100 mL)에 녹인 후 0 ℃ 내지 상온에서 소듐하이드라이드 (2.2 g, 89 mmol), 디터트부틸아조디카복시레이트 (9.0 g, 39 mmol)를 첨가한 후 반응 혼합물을 상온에서 15분간 교반하고. 증류수 (1.4 mL, 78 mmol)을 천천히 적가한 후 상온에서 밤새 동안 교반하였다. 이후 화합물 I-1c와 동일한 방법으로 표제화합물 I-3c (3.8 g, 25 %)를 얻었다.
ES-MS m/z: 385.0 [M-H]-
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 6.45 (S, 1 H), 5.83 - 5.76 (m, 1 H), 5.03 - 4.95 (m, 2 H), 4.78 (bs, 1 H), 4.20 (q, 2H), 2.11 - 2.09 (m, 2H), 1.89 - 1.71 (m, 3 H), 1.47 (d, 18 H), 1.29 (t, 3 H)
3단계: 화합물 I-3d 의 제조
Figure pat00064
화합물 I-3c (3.80 g, 10 mmol)를 테트라하이드로퓨란 (50 mL)에 녹인 후 0 ℃ 내지 상온에서 디메틸설파이드보란 (2.0 M in THF, 10 mL, 20 mmol)를 첨가한 후 상온에서 2시간 교반한 후 0 ℃ 내지 상온에서 소듐아세테이트(4.84 g, 59 mmol), 증류수 (8.6 mL)과 하이드로젠퍼옥사이드(30 %, 5.7 mL)를 천천히 적가한 후 상온에서 1시간 교반하였다. 이후 화합물 I-1d와 동일한 방법으로 표제화합물 I-3d (2.70 g, 68 %)를 얻었다.
ES-MS m/z: 403.3 [M-H]-
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 6.50 (S, 1 H), 4.81 (bs, 1 H), 4.20 (q, 2H), 3.67 - 3.61 (m, 2 H), 1.95 - 1.83 (m, 2H), 1.78 - 1.66 (m, 3 H), 1.63 - 1.56 (m, 2 H), 1.47 (d, 18 H), 1.31 (t, 3 H)
4단계: 화합물 I-3e 의 제조
Figure pat00065
화합물 I-3d (2.70 g, 7 mmol)를 디클로로메탄 (30 mL)에 녹인 후 0 ℃에서 4-디메틸아미노피리딘 (82 mg, 0.67 mmol), 트리에틸아민(2.8 mL, 20 mmol), 메탄설포닐클로라이드 (0.73 mL, 10 mmol)를 첨가한 후 0 ℃에서 2시간 동안 교반하였다. 이후 화합물 I-1e와 동일한 방법으로 표제화합물 I-3e (crude 3.4 g)을 얻었다.
ES-MS m/z: 483.1 [M+H]+
5단계: 화합물 I-3f 의 제조
Figure pat00066
화합물 I-3e (3.40 g, 7 mmol)를 테트라하이드로퓨란 (100 mL)에 녹인 후 테트라부틸암모늄플루오라이드 용액(1.0 M 테트라하이드로퓨란, 21.2 mL, 21 mmol)를 첨가한 후 상온에서 19시간 동안 교반하였다. 이후 화합물 I-1f와 동일한 방법으로 표제화합물 I-3f (0.94 g, 35 %)를 얻었다.
ES-MS m/z: 387.1 [M+H]+
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 4.67 - 4.51 (m, 1 H), 4.39 - 4.35 (m, 1 H), 4.21 (q, 2H), 3.17 - 3.12 (m, 2 H), 1.96 - 1.84 (m, 2 H), 1.74 - 1.65 (m, 3 H), 1.61 - 1.56 (m, 2 H), 1.47 (d, 18 H), 1.31 (t, 3 H)
6단계: 화합물 I-3g 의 제조
Figure pat00067
화합물 I-3f (940 mg, 2.43 mmol)를 테트라하이드로퓨란 /증류수 (8 mL/4 mL)에 녹인 후 리튬하이드록사이드모노하이드레이트(205 mg, 4.86 mmol)을 가한 후 밤새 동안 환류하였다. 이후 화합물 I-1과 동일한 방법으로 표제화합물 I-3g (820 mg, 94 %)를 얻었다.
ES-MS m/z: 357.1 [M-H]-
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 4.33 - 4.28 (m, 1 H), 4.04 - 3.97 (m, 1 H), 3.34 - 3.22 (m, 2 H), 1.96 - 1.84 (m, 2 H), 1.74 - 1.65 (m, 3 H), 1.56 - 1.51 (m, 2 H), 1.47 (d, 18 H)
7단계: 화합물 I-3h 의 제조
Figure pat00068
화합물 I-3g (820 mg, 2.29 mmol)를 디클로로메탄(6 mL)에 용해한 후 0 ℃ 내지 상온에서 트리플루오르아세트산(6 mL)을 가한 후 상온에서 3시간 동안 교반하였다. 이후 화합물 I-1g와 동일한 방법으로 표제화합물 I-3h (720 mg, Quant)을 얻었다.
ES-MS m/z: 158.9 [M+H]+
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 3.88 - 3.82 (m, 1 H), 3.32 - 3.30 (m, 1 H), 3.18 - 3.13 (m, 2 H), 2.18 - 2.11 (m, 2 H), 1.84 - 1.75 (m, 3 H), 1.68 - 1.62 (m, 2 H)
8단계 화합물 I-3 의 제조
Figure pat00069
화합물 I-3h (400 mg, 1.04 mmol)를 아세트산 (10 mL)에 녹인 후 0 ℃ 내지 상온에서 메틸3,4-디브로모-2,5-디옥소-2H-피롤-1(5H)-카르복실레이트 (360 mg, 1.14 mmol)를 가한 후 60 ℃에서 밤새 동안 교반하였다. 이후 화합물 I-1h와 동일한 방법으로 표제화합물 I-3 (244 mg, 60 %)을 얻었다.
ES-MS m/z: 394.9 [M-H]-
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 5.80 (bs, 1 H), 4.82 (bs, 1 H), 3.51 - 3.49 (m, 2 H), 2.64 (bs, 1 H), 1.96 - 1.84 (m, 4 H), 1.64 - 1.60 (m, 2 H),
실시예 2: Ⅱ-1 내지 Ⅱ-6 화합물의 제조
실시예 2-1: Ⅱ-1 화합물의 제조
1단계: 화합물 Ⅱ-1c 의 제조
Figure pat00070
화합물 Ⅱ-1a (2.00 g 5.18 mmol)와 화합물 Ⅱ-1b (1.70 g, 7.77 mmol)를 디클로로메탄 (50 mL)에 녹인 후, 0 ℃ 내지 상온에서 I-(3-다이메틸아미노프로필)-3-에틸카보다이이미드 하이드로클로라이드 (1.97 g, 10.38 mmol), 히드록시벤조트리아졸 (1.40 g, 10.38 mmol) 그리고 디이소프로필아민(2.64 mL, 15.57 mmol)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 상온에서 밤새 교반하였다. 반응 완결 후 증류수와 소금물로 추출한 다음, 유기층을 무수황산나트륨으로 건조시키고 감압 농축하였다. 농축 잔사를 실리카겔 컬럼크로마토그래피(디클로로메탄:메탄올 = 20:1 부피비)로 정제하여 표제화합물 Ⅱ-1c (2.01 g, 66 %)를 얻었다.
ES-MS m/z: 587.38[M-H]+
2단계: 화합물 Ⅱ-1d 의 제조
Figure pat00071
화합물 Ⅱ-1c (2.01 g, 3.42 mmol)를 디메틸포름아미드 (30 mL)에 녹인 후 디에틸아민(1.80 mL, 17.15 mmol)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 상온에서 밤새 동안 교반하였다. 반응 완결 후 반응 용매를 고 진공 하에 감압 농축하여 얻어진 잔사를 실리카겔 컬럼크로마토그래피로 정제하여(디클로로메탄:메탄올 = 3:1 부피비 (혼합물의 총 부피 대비 10% TEA 포함))로 정제하여 표제화합물 Ⅱ-1d (730 mg, 58 %)를 투명한 오일로 얻었다.
ES-MS m/z: 365.32 [M-H]+
3단계: 화합물 Ⅱ-1e 의 제조
Figure pat00072
화합물 Ⅱ-1 d (305 mg, 830 umol)와 화합물 Ⅱ-1a 8-(플루오르에닐메톡시카르보닐-아미노)-3,6-디옥사오타노익애씨드 (478 mg, 1.24 mmol)를 디클로로메탄 (20 mL)에 녹인 후, 0 ℃ 내지 상온에서 I-(3-다이메틸아미노프로필)-3-에틸카보다이이미드 하이드로클로라이드 (318 mg, 1.66 mmol), 히드록시벤조트리아졸 (224mg, 1.66 mmol) 그리고 디이소프로필아민 (423 ㎕, 2.49 mmol)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 상온에서 6시간 동안 교반하였다. 반응 완결 후 증류수와 소금물로 추출한 다음, 유기층을 무수황산나트륨으로 건조시키고 감압 농축하였다. 농축 잔사를 실리카겔 컬럼크로마토그래피(디클로로메탄:메탄올 = 10:1 부피비)로 정제하여 표제화합물 Ⅱ-1e (570 mg, 92 %)를 노란색 오일로 얻었다.
ES-MS m/z: 732.48[M-H]+
4단계: 화합물 Ⅱ-1 의 제조
Figure pat00073
화합물 Ⅱ-1e (440 mg, 601 umol)를 디클로로메탄 (20 mL)에 용해 한 후 트리클로로아세트산 (10 mL)를 첨가한 후 반응 혼합물을 상온에서 밤새 동안 교반하였다. 반응 완결 후 반응 용매를 고 진공 하에 감압 농축하여 잔사에 톨루엔을 첨가한 후 다시 한번 감압 농축 하여 표제화합물 Ⅱ-1 (406 mg, Quant)를 얻었다.
ES-MS m/z: 676 [M-H]+
실시예 2-2: Ⅱ-2 화합물의 제조
1단계: 화합물 Ⅱ-2c 의 제조
Figure pat00074
화합물 Ⅱ-2a (4.50 g, 11.68 mmol)와 화합물 Ⅱ-2b (3.27 g, 14.01 mmol)를 디클로로메탄 (250 mL)에 녹인 후, 0 ℃ 내지 상온에서 I-(3-다이메틸아미노프로필)-3-에틸카보다이이미드 하이드로클로라이드 (4.47 g, 23.35 mmol), 히드록시벤조트리아졸 (3.15 g, 23.35 mmol) 그리고 디이소프로필아민(5.96 mL, 35.03 mmol)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 상온에서 밤새 교반하였다. 반응 완결 후 증류수와 소금물로 추출한 다음, 유기층을 무수황산나트륨으로 건조시키고 감압 농축하였다. 농축 잔사를 실리카겔 컬럼크로마토그래피(디클로로메탄:메탄올 = 30:1 부피비)로 정제하여 표제화합물 Ⅱ-2c (6.55 g, 93 %)를 얻었다.
ES-MS m/z: 601 [M-H]+
2단계: 화합물 Ⅱ-2d 의 제조
Figure pat00075
화합물 Ⅱ-2c (6.53 g, 10.87 mmol)를 디메틸포름아미드 (60 mL)에 녹인 후 디에틸아민(5.67 mL, 54.35 mmol)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 상온에서 6시간 동안 교반하였다. 반응 완결 후 반응 용매를 고 진공 하에 감압 농축하여 얻어진 잔사를 실리카겔 컬럼크로마토그래피로 정제하여(디클로로메탄:메탄올 = 10:1->5:1->3:1 부피비 농도 구배 용출)로 정제하여 표제화합물 Ⅱ-2d (2.04 g, 58 %)를 투명한 오일로 얻었다.
ES-MS m/z: 379 [M-H]+
3단계: 화합물 Ⅱ-2d 의 제조
Figure pat00076
화합물 Ⅱ-2 d (2.04 g, 5.39 mmol)와 화합물 Ⅱ-2a 8-(플루오르에닐메톡시카르보닐-아미노)-3,6-디옥사오타노익애씨드 (2.07 g, 5.39 mmol)를 디클로로메탄 (150 mL)에 녹인 후, 0 ℃ 내지 상온에서 I-(3-다이메틸아미노프로필)-3-에틸카보다이이미드 하이드로클로라이드 (2.06 g, 10.78 mmol), 히드록시벤조트리아졸 (1.46 g, 10.78 mmol) 그리고 디이소프로필아민 (2.75 mL, 16.17 mmol)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 상온에서 6시간 동안 교반하였다. 반응 완결 후 증류수와 소금물로 추출한 다음, 유기층을 무수황산나트륨으로 건조시키고 감압 농축하였다. 농축 잔사를 실리카겔 컬럼크로마토그래피(디클로로메탄:메탄올 = 30:1 부피비)로 정제하여 표제화합물 Ⅱ-2e (2.16 g, 54%)를 노란색 오일로 얻었다.
ES-MS m/z: 746.32 [M-H]+
4단계: 화합물 Ⅱ-2 의 제조
Figure pat00077
화합물 Ⅱ-2e (2.16 g, 2.89 mmol)를 디클로로메탄(50 mL)에 용해 한 후 트리클로로아세트산(10 mL)를 첨가한 후 반응 혼합물을 상온에서 밤새 동안 교반하였다. 반응 완결 후 반응 용매를 고 진공 하에 감압 농축하여 잔사에 톨루엔을 첨가한 후 다시 한번 감압 농축 하여 표제화합물 Ⅱ-2 (2.32 g, Quant)를 얻었다.
ES-MS m/z: 690.16 [M-H]+
실시예 2-3: Ⅱ-3 화합물의 제조
1단계: 화합물 Ⅱ-3b 의 제조
Figure pat00078
화합물 Ⅱ-3a (4.55 g, 20.75 mmol)를 테트라하이드로퓨란 (20 mL)에 용해시킨 후, 9-플루오르에닐메톡시카르보닐클로라이드 (5.90 g, 22.80 mmol)와 디이소프로필에틸아민 (4.46 mL, 24.89 mmol)를 첨가한 후 상온에서 16시간 동안 교반하였다. 반응 용매를 감압 농축하여 디클로로메탄과 증류수 그리고 소금물 순차적으로 세척한 다음 유기층을 무수황산나트륨으로 건조시키고 감압 농축하여 잔사를 실리카겔 컬럼크로마토그래피(에틸아세테이트:노르말-헥산 = 1:1 부피비)로 정제하여 표제화합물 Ⅱ-3b (7.60 g, 83%)를 얻었다.
ES-MS m/z: 456.2 [M+H]-
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.78 (d, 2 H, J = 7.6), 7.62 (d, 2 H, J = 7.6), 7.33-7.29 (m, 4 H), 4.40-4.38 (m, 2 H), 3.74-3.71 (m, 2 H), 3.43-3.39 (m, 2 H), 2.53-2.50 (m, 2 H), 1.44 (s, 9 H)
2단계: 화합물 Ⅱ-3c 의 제조
Figure pat00079
화합물 Ⅱ-3b (3.45 g, 7.81 mmol)를 디클로로메탄 (14 mL)에 용해시킨 후, 트리플루오르아세트산 (6 mL)를 첨가한 후 2시간 동안 교반하였다. 반응 완결 후 반응 용매를 고 진공 하에 감압 농축하였다. 농축된 잔사에다 톨루엔을 첨가한 후 다시 한번 감압 농축 하여 표제화합물 Ⅱ-3c (3.00 g, Quant)를 얻었다.
ES-MS m/z: 384.3[M+H]+
3단계: 화합물 Ⅱ-3d 의 제조
Figure pat00080
화합물 Ⅱ-3c (3.00 g, 7.81 mmol)와 I-복-피페라진(1.89 g, 10.1 mmol)를 디메틸포름아미드 (20 mL)에 용해시킨 후, 0 ℃에서 디이소프로필아민 (2.09 ml, 11.7 mmol), 1-[비스(디메틸아미노)메틸렌]-1H-1,2,3-트리아졸[4,4-b]피리딘늄3-옥사이드 헥사플루오르포스페이트 (HATU) (4.44 g, 11.7 mmol)를 첨가하여 2시간 동안 교반하였다. 반응 완결 후 반응 용매를 고 진공 하에 감압 농축하여 잔사에 에틸아세테이트와 증류수로 세척한 다음 유기층을 무수황산나트륨으로 건조시키고 감압 농축하였다. 농축된 잔사를 실리카겔 컬럼크로마토그래피(디클로로메탄:메탄올 20:1 부피비)로 정제하여 표제화합물 Ⅱ-3d(2.65 g, 62%)를 얻었다.
ES-MS m/z: 553.7[M+H]+
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.78-7.76 (m, 2 H), 7.63-7.61 (m, 2 H), 7.42-7.38 (m, 2 H), 7.33-7.29 (m, 2 H), 4.40-4.39 (m, 1 H), 4.25-4.22 (m, 2 H), 3.70-3.66 (m, 2 H), 3.58-3.52 (m, 2 H), 3.45-3.42 (m, 8 H), 3.24-3.22 (m, 4 H), 1.47 (s, 9 H)
4단계: 화합물 Ⅱ-3e 의 제조
Figure pat00081
화합물 Ⅱ-3d (2.65 g, 4.79 mmol)를 디클로로메탄 (10 mL)에 용해시킨 후, 트리플루오르아세트산(3 mL)를 첨가한 후 1시간 동안 교반하였다. 반응 완결 후 반응 용매를 고 진공 하에 감압 농축하였다. 농축된 잔사에다 톨루엔을 첨가한 후 다시 한번 감압 농축 하여 표제화합물 Ⅱ-3e (2.17 g, Quant)를 얻었다.
ES-MS m/z: 451.5 [M+H]-
5단계: 화합물 Ⅱ-3 의 제조
Figure pat00082
3,6,9-트리옥사언데카노익산 (2.04 g, 11.90 mmol)과 화합물 Ⅱ-3e (2.17 g, 4.78 mmol)를 디클로로메탄 (30 mL)에 용해시킨 후, 0 ℃에서 디이소프로필아민 (3.43 ml, 19.10 mmol), 1-[비스(디메틸아미노)메틸렌]-1H-1,2,3-트리아졸[4,4-b]피리딘늄3-옥사이드 헥사플루오르포스페이트 (HATU) (5.45 g, 14.30 mmol), 첨가한 후 상온에서 2시간 동안 교반하였다. 반응 완결 후 반응 용매를 감압 농축하고 부탄온과 증류수로 세척한 다음 유기층을 무수황산나트륨으로 건조시키고 감압 농축하였다. 농축 잔사를 실리카겔 컬럼크로마토그래피로(디클로로메탄:메탄올 = 5:1 부피비)정제하여 표제화합물 Ⅱ-3 (0.99 g, 3 1%)을 얻었다.
ES-MS m/z: 657.7[M+H]+
실시예 2-4: Ⅱ-4 화합물의 제조
1단계: 화합물 Ⅱ-4b 의 제조
Figure pat00083
I-복-피페라진(Ⅱ-4a) (3.85 g, 20.6 mmol)을 아세토니트릴 (200 mL)에 용해 시킨 후 포타슘카보네이트 (8.54 g, 61.8 mmol)와 소듐아이오다이드(9.26 g, 61.8 mmol)그리고 2-[2-(2-클로로에톡시)에톡시]에탄올 (5.56 g, 32.9 mmol)를 가한 후 3시간 동안 환류하였다. 반응 완결 후 포타슘카보네이트를 여과하고 여과된 용액을 감압 농축하여 잔사를 실리카겔 컬럼크로마토그래피로(디클로로메탄:메탄올 = 메탄올 부피비 5%->10% 혼합물 농도 구배 용출)정제하여 표제화합물 Ⅱ-4b (3.35 g, 50 %)를 얻었다.
ES-MS m/z: 318.3[M+H]+
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.703(s, 1H), 4.623-4.597(t, J=5.6Hz, 1H), 3.73-3.65(m, 2H), 3.60(s, 0.5H), 3.57-3.46(m, 6.5H), 3.43-3.40(m, 2H), 3.36(s, 6H), 3.07(m, 2H), 2.51-2.50(m, 2H), 1.41(d, J=4.8Hz, 9H)
2단계: 화합물 Ⅱ-4c 의 제조
Figure pat00084
0 ℃ 내지 상온에서 화합물 Ⅱ-4b (2.50 g, 7.85 mmol)를 디클로로메탄 (10 mL)에 용해시킨 후 4-디메틸아미노피리딘 (88 mg, 0.78 mmol), 트리에틸아민 (3.28 mL, 23.55 mmol)와 메탄설포닐 클로라이드 (1.35 g, 11.77 mmol)첨가한 후 상온에서 1시간 동안 교반하였다. 반응이 완료 후 디클로로메탄과 증류수, 소금물 순차적으로 세척한 다음 유기층을 무수 황산마그네슘으로 건조시키고 감압 농축하였다. 잔사를 실리카겔 컬럼크로마토그래피로 정제하여(디클로로메탄:메탄올 = 메탄올 부피비 1%->2% 혼합물 농도 구배 용출) 표제화합물 Ⅱ-4c (2.79 g, 90 %)를 얻었다.
ES-MS m/z: 397.2[M+H]+
3단계: 화합물 Ⅱ-4d 의 제조
Figure pat00085
화합물 Ⅱ-4c (2.79 g, 7.03 mmol)를 디메틸포름아미드 (10 mL)에 용해 시킨 후 나트륨 아지드(0.68 g, 10.54 mmol)를 첨가하여 반응 혼합물을 60 ℃에서 9시간 동안 교반하였다. 반응을 완료한 후, 에틸아세테이트, 증류수, 소금물 순차적으로 세척한 다음 유기층을 무수황산나트륨으로 건조시키고 감압 농축하고 잔사를 실리카겔 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 표제화합물 Ⅱ-4d (2.2 g, 91 %)를 얻었다.
ES-MS m/z: 344.2[M+H]+
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 3.688-3.659(m, 8H), 3.443(t, J=5.2Hz, 4H), 3.390(t, J=5.2Hz, 2H), 2.609(m, 2H), 2.460(m, 4H), 1.457(s, 9H)
4단계: 화합물 Ⅱ-4e 의 제조
Figure pat00086
화합물 Ⅱ-4d (2.1 g, 6.1 mmol)를 디클로로메탄 (55 mL)에 용해 시킨 후 트리클로로아세트산 (27 mL)를 첨가 하였다. 반응 혼합물을 상온에서 1시간 동안 교반하였다. 반응 완결 후 반응 용매를 고 진공 하에 감압 농축하여 잔사에 톨루엔을 여러 번 첨가한 후 다시 한번 감압 농축 하여 표제화합물 Ⅱ-4e (2.39 g, Quant)를 얻었다.
ES-MS m/z: 244.05[M+H]+
5단계: 화합물 Ⅱ-4f 의 제조
Figure pat00087
화합물 Ⅱ-4e (2.39 g, 7.04 mmol)을 아세토니트릴 (50 mL)에 용해 시킨 후 포타슘카보네이트(2.92 g, 21.1 mmol)와 소듐아이오다이드 (3.16 g, 21.1 mmol)그리고 2-[2-(2-클로로에톡시)에탄올 (1.75 g, 14.0 mmol)를 가한 후 밤새 동안 환류 하였다. 반응 완결 후 포타슘카보네이트를 여과하고 여과된 용액을 감압 농축하여 잔사를 실리카겔 컬럼크로마토그래피로(디클로로메탄:메탄올 = 메탄올 부피비 1%->6% 혼합물 농도 구배 용출)로 정제하여 표제화합물 Ⅱ-4f (2.5 g, Quant)를 얻었다.
ES-MS m/z: 332.26[M+H]+
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 5.281(s, 0.5H) 3.830(s, 2H), 3.765-3.722(m, 4H), 3.677-3.6176.(s, 8H), 3.399(m, 2H), 3.115(s, 7H), 2.910(s, 4H), 1.233(s, 1H)
6단계: 화합물 Ⅱ-4g 의 제조
Figure pat00088
화합물 Ⅱ-4f (1.31 g, 3.95 mmol)을 테트라하이드로퓨란 (50 mL)에 용해 시킨 후 아르곤 대기 하 0 ℃ 내지 상온에서 소듐하이드라이드 (60 % Mineral oil dispersed)[(0.47 g, 11.87 mmol)]와 터트뷰틸브로모아세트산 (1.74 mL, 11.87 mmol)을 첨가한 후 상온에서 밤새 동안 교반하였다. 반응 완결 후 반응 용매를 감압 농축한 후 에틸아세이트와 증류수 및 소금물로 추출한 다음 유기층을 무수황산마그네슘으로 건조시키고 감압 농축하였다. 농축 잔사를 실리카겔 컬럼크로마토그래피로(디클로로메탄:메탄올 = 메탄올 부피비 6%)로 정제하여 표제화합물 Ⅱ-4g (1.00 g, 29%)를 얻었다.
ES-MS m/z: 446.32[M+H]+
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 4.02(s, 2H), 3.71-3.37(m, 14H), 3.39(t, 2H), 2.62(s, 12H), 1.47(s, 9H)
7단계: 화합물 II-4h 의 제조
Figure pat00089
화합물 Ⅱ-4g (0.51 g, 1.15 mmol)를 메틸알코올 (10 mL)에 녹이고 10% 팔라듐 카본 (51.2 mg)을 가한 후 수소 대기 하에서 1시간 동안 교반하였다. 반응이 종결되면 반응 혼합물을 셀라이트로 여과하고 메탄올로 수회 세척한 후, 감압 농축하여 표제화합물 Ⅱ-4h (0.49 g, 99 %)를 얻었다.
ES-MS m/z: 420.36[M+H]+
8단계: 화합물 Ⅱ-4i 의 제조
Figure pat00090
화합물 Ⅱ-4h (58 mg, 0.13 mmol)를 테트라하이드로퓨란 (5 mL)에 용해 시킨 후, 0 ℃ 내지 상온에서 9-플루오르에닐메톡시카르보닐클로라이드 (46.5 mg, 0.18 mmol)와 디이소프로필에틸아민 (35.26 ㎕, 0.20 mmol)를 첨가한 후 상온에서 1시간 동안 교반하였다. 반응 용매를 감압 농축하여 잔사를 실리카겔 컬럼크로마토그래피(디클로로메탄:메탄올 = 메탄올 부피비 10%)로 정제하여 표제화합물 Ⅱ-4i (70 mg, 79 %)를 얻었다.
ES-MS m/z: 642.38[M+H]+
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.77(d, J=7.2Hz, 2H), 7.61(d, J=7.8Hz, 2H), 7.42(m, 2H), 7.29(m, 2H), 5.58(d, J=1.6Hz, 1H), 4.41(d, J=6.4Hz, 2H), 4.24(t, 1H), 4.00(s, 2H), 3.69-3.59(m, 12H), 3.38(m, 2H), 2.61(s, 11H), 1.47(s, 9H)
9단계: 화합물 Ⅱ-4 의 제조
Figure pat00091
화합물 Ⅱ-4i (64 mg, 0.09 mmol)를 디클로로메탄 (5 mL)에 용해시킨 후, 트리플루오르아세트산 (2.5 mL)를 첨가하여 상온에서 1시간 동안 교반하였다. 반응 완결 후 반응 용매를 고 진공 하에 감압 농축하였다. 농축된 잔사에다 톨루엔을 여러 번 첨가한 후 감압 농축 하여 표제화합물 Ⅱ-4 (58 mg, Quant)를 얻었다.
ES-MS m/z: 586.40[M+H]+
실시예 2-5: II-5 화합물의 제조
1단계: 화합물 Ⅱ-5b 의 제조
Figure pat00092
피페라진(Ⅱ-5a) (34.44 g, 399.89 mmol)을 아세토니트릴 (340 mL)에 녹인 후 소듐 카보네이트(42.37 g, 399.89 mmol)와 터트뷰틸브로모아세트산 (26.00 g, 133.29 mmol)를 가한 후 3시간 동안 환류 하였다. 반응 완결 후 소듐카보네이트를 여과하고 여과된 용액을 감압 농축하였다. 농축 잔사를 실리카겔 컬럼크로마토그래피로(디클로로메탄:메탄올 = 10:1 부피비)로 정제하여 표제화합물 Ⅱ-5b (20.28 g, 76 %)를 얻었다.
ES-MS m/z: 201.4[M+H]+
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 3.61 - 3.57 (t, 2 H), 2.59 (s, 4 H), 2.52 - 2.47 (m, 2 H) 1.96 - 1.93 (m, 2 H), 1.49 (s, 9 H)
2단계: 화합물 Ⅱ-5c 의 제조
Figure pat00093
화합물 Ⅱ-5b (20.24 g, 101.06 mmol)를 아세토니트릴 (200 mL)에 녹이고 1-브로모-3-클로로프로판 (39.77 g, 252.65 mmol, 2.5 eq), 포타슘카보네이트 (13.97 g, 110.78 mmol)와 소듐아이오다이드 (15.15 g, 101.06 mmol)를 가한 후 밤새 동안 상온에서 교반하였다. 반응이 완료 후 반응 용매를 감압 농축하고 에틸아세테이트와 증류수, 소금물을 순차적으로 세척한 다음 유기층을 무수황산마그네슘으로 건조시키고 감압 농축하였다. 농축된 잔사를 실리카겔 컬럼크로마토그래피로 정제하여(디클로로메탄:메탄올 = 20:1->15:1 부피비 혼합물 농도 구배 용출) 표제화합물 Ⅱ-5c (22.93 g, 82 %)를 얻었다.
ES-MS m/z: 277.1 [M+H]+
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 3.61 - 3.57 (t, 2 H), 3.10 (s, 2 H), 2.59 (s, 4 H), 2.52 - 2.47 (m, 6 H) 1.96 - 1.93 (m, 2 H), 1.49 (s, 9 H)
3단계: 화합물 Ⅱ-5d 의 제조
Figure pat00094
화합물 Ⅱ-5c (22.90 g, 82.73 mmol )를 아세토니트릴 (350 mL)에 녹이고 피페라진 (21.38 g, 248.19 mmol), 포타슘카보네이트 (68.61 g, 496.39 mmol)와 포타슘아이오다이드 (2.75 g, 16.55 mmol)를 가한 후 60 ℃에서 5시간 동안 교반하였다. 반응이 완료 후 포타슘카보네이트를 여과하고 여과된 용액을 감압 농축하여 잔사를 실리카겔 컬럼크로마토그래피로 정제하여(디클로로메탄:메탄올 = 10:1->5:1->3:1 부피비 혼합물 농도 구배 용출) 표제화합물 Ⅱ-5d (9.99 g, 37 %)를 얻었다.
ES-MS m/z: 327.2 [M+H]+
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 3.88 - 3.86 (t, 2 H), 2.84 (s, 2 H), 2.59 (s, 4 H), 2.47 (s, 6 H), 2.41 - 2.36 (m, 6 H), 1.76 - 1.68 (m, 4 H), 1.47 (s, 9 H)
4단계: 화합물 Ⅱ-5e 의 제조
Figure pat00095
화합물 Ⅱ-5d (9.99 g, 30.60 mmol)를 아세토니트릴 (20 mL)에 녹인 후 포타슘 카보네이트 (10.57 g, 76.49 mmol), N-(3-브로모프로필)프탈리이미드 (1 g, 45.90 mmol)를 가한 후 밤새 동안 환류하였다. 반응 완결 후 포타슘카보네이트를 여과하고 여과된 용액을 감압 농축하였다. 농축된 잔사를 실리카겔 컬럼크로마토그래피로 정제하여(디클로로메탄:메탄올 = 20:1->10:1 부피비 혼합물 농도 구배 용출) 표제화합물 Ⅱ-5e (7.70 g, 49 %)를 얻었다.
ES-MS m/z: 514.42 [M+H]+
5단계: 화합물 Ⅱ-5f 의 제조
Figure pat00096
화합물 Ⅱ-5e (7.70 g, 14.99 mmol)를 에탄올 (200 mL)에 녹인 후 상온에서 메틸아민 40 % 용액(3.89 mL, 44.97 mmol)를 가하고 반응물을 밤새 동안 환류하였다. 반응 완결 후 반응 용매를 감압 농축하였다. 다시 한번 더 에탄올에 녹이고 고 진공 하에 감압 농축하여 표제화합물 Ⅱ-5f (5.76 g, Quant)를 얻었다.
ES-MS m/z: 384.39 [M+H]+
6단계: 화합물 Ⅱ-5g 의 제조
Figure pat00097
화합물 Ⅱ-5f (5.71 g, 14.85 mmol)를 디클로로메탄 (150 mL)에 용해시킨 후 0 ℃에서 디이소프로필아민(5.20 mL, 29.84 mmol), 9-플루오르에닐메톡시카르보닐클로라이드 (7.72 g, 29.84 mmol)를 가한 후 상온에서 1시간 동안 교반하였다. 반응 완결 후 디클로로메탄을 첨가하여 희석시키고 증류수와 소금물 순차적으로 세척한 다음 유기층을 무수황산마그네슘으로 건조시키고 감압 농축하였다. 농축된 잔사를 실리카겔 컬럼크로마토그래피로 정제하여(디클로로메탄:메탄올 = 10:1->8:1 부피비 혼합물 농도 구배 용출) 표제화합물 Ⅱ-5g (2.87 g, 32 %)를 얻었다
ES-MS m/z: 606.49 [M+H]+
7단계: 화합물 Ⅱ-5 의 제조
Figure pat00098
화합물 Ⅱ-5g (0.95 g, 1.57 mmol)를 디클로로메탄 (20 mL)에 용해시킨 후 트리플루오르아세트산 (6 mL)를 첨가하여 반응 혼합물을 상온에서 밤새 동안 교반하였다. 반응 완결 후 반응 용매를 고 진공 하에 감압 농축하였다. 농축된 잔사에다 톨루엔을 여러 번 첨가한 후 감압 농축 하여 표제화합물 Ⅱ-5 (1.20 g, Quant)를 얻었다.
ES-MS m/z: 550.38 [M+H]+
실시예 2-6: Ⅱ-6 화합물의 제조
Figure pat00099
상기 실시예 2-3의 II-3의 화합물의 제조 방법에서, 화합물 Ⅱ-3a 대신 화합물 II-6a를 사용하여, 동일한 방법으로 II-6을 제조할 수 있다.
실시예 3: 화합물 Ⅵ의 제조
[반응식 A]
Figure pat00100
Figure pat00101
상기 화합물 Ⅲ은 효소-분해형(enzyme cleavable) 펩타이드 절단 부위로 공지된 물질로, 미국특허 제6,214,345호에 기재된 방법에 따라 용이하게 제조할 수 있다.
또한 상기 화합물 Ⅳ의 돌라스타틴 10 유도체는 세포독성 약물로서, 대한민국 특허 제10-1520302호 또는 미국특허 제5,599,902호에 기재된 방법에 따라 제조할 수 있다. 이에 상기 특허 문헌을 전부 본 명세서에 참조로 포함시킨다.
또한 상기 화합물 Ⅴ 및 Ⅵ은 돌라스타틴 10 유도체 및 펩타이드 절단 부위의 결합체 화합물로서, 국제공개공보 제2014-107024호에 기재된 방법에 따라 제조할 수 있다. 이에 상기 특허 문헌을 전부 본 명세서에 참조로 포함시킨다.
화합물 Ⅴ 의 제조
Figure pat00102
아르곤 대기 하 0 ℃ 에서 화합물 Ⅳ (14.40 g, 19.12 mmol)를 디메틸포름아미드 (50 mL)에 용해시킨 후 Fmoc-Val-Cit-PABC-PNP (Ⅲ)(17.59 g, 22.94 mmol) 및 피리딘(4.62 mL, 57.36 mmol)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 상온에서 1.5시간 동안 교반하였다. 반응 완결 후 고 진공 하에 감압 농축하여 얻어진 잔사를 실리카겔 컬럼 크로마토그래피로 정제하여(디클로로메탄:메탄올 = 메탄올 부피비 1%->8% 혼합물 농도 구배 용출) 표제화합물 Ⅴ (17.60 g, 74 %)를 얻었다.
화합물 Ⅵ 의 제조
Figure pat00103
화합물 Ⅴ (17.6 g, 24.3 mmol)를 디메틸포름아미드 (60 mL)에 녹인 후 디에틸아민(5.67 mL, 54.35 mmol)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 상온에서 3시간 동안 교반하였다. 반응 완결 후 반응 용매를 고 진공 하에 감압 농축하여 얻어진 잔사를 아민 실리카겔 컬럼크로마토그래피로 정제하여(디클로로메탄:메탄올 = 메탄올 부피비 1%->5% 혼합물 농도 구배 용출) 표제화합물 Ⅵ (14.7 g, 100 %)을 얻었다
1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6 ) δ 10.08(s, 1H), 8.11(d, J=6.0Hz, 1H), 7.98(m, 1H), 7.56(d, J=8.8Hz, 2H), 7.44 (t, J=7.6Hz, 1H), 7.27-7.24(m, 3H), 7.02(t, J=7.6Hz, 2H), 5.94-5.91(m, 1H), 5.73(s, 2H), 4.94(d, J=4.4Hz, 2H), 4.7-4.42(m, 3H), 3.92(d, J=8.0Hz, 2H), 3.8-3.66(m, 2H), 4.1-4.0(m, 1H), 3.96(d, J=8.0Hz, 2H), 3.8-3.65(m 2H), 3.23(s, 3H), 3.23-3.13(m, 3H), 3.12(s, 3H), 3.06(s, 1H), 2.98-2.89(m, 5H), 2.73(d, J=8.0Hz, 2H), 2.62-2.58(m, 2H), 2.35(s, 1H), 2.16-2.15(m, 6H), 2.01-2.00(m, 2H), 1.89-1.85(m, 3H), 1.69-1.64(m, 4H), 1.6-1.5(m, 1H), 1.5-1.2(m, 4H), 1.1-0.9(m, 3H), 0.9-0.8(m, 13H), 0.8-0.6(m, 8H)
실시예 4: 화합물 Ⅶ-1 내지 Ⅶ-5의 제조
실시예 4-1: 화합물 Ⅶ-1의 제조
Figure pat00104
화합물 Ⅵ (150 mg, 120 μmol)와 화합물 Ⅱ-1 (162 mg, 240 μmol)를 디메틸포름아미드 (10 mL)에 녹이고 0 ℃에서 디이소프로필아민 (129 ㎕, 720 μmol), 1-[비스(디메틸아미노)메틸렌]-1H-1,2,3-트리아졸[4,4-b]피리딘늄3-옥사이드 헥사플루오르포스페이트 (HATU) (91 mg, 240 μmol)를 첨가한 후 상온에서 밤새 동안 교반하였다. 반응 완결 후 고 진공 하에 감압 농축 하여 얻어진 잔사를 실리카겔 컬럼크로마토그래피로 정제하여(디클로로메탄:메탄올 = 3:1 부피비) 표제화합물 Ⅶ-1 (200 mg, 91 %)을 흰색 고체로 얻었다.
ES-MS m/z: 1817.96 (908.98) [M+H]+
실시예 4-2: 화합물 Ⅶ-2의 제조
Figure pat00105
화합물 Ⅵ (0.50 g, 0.43 mmol)와 화합물 Ⅱ-2 (0.52 g, 5.39 mmol)를 디메틸포름아미드 (15 mL)에 녹이고 0 ℃에서 디이소프로필아민 (0.44 mL, 2.59 mmol), 1-[비스(디메틸아미노)메틸렌]-1H-1,2,3-트리아졸[4,4-b]피리딘늄3-옥사이드 헥사플루오르포스페이트 (HATU) (0.49 g, 1.29 mmol)를 첨가한 후 상온에서 1시간 동안 교반하였다. 반응 완결 후 고 진공 하에 감압 농축 하여 얻어진 잔사를 실리카겔 컬럼크로마토그래피로 정제하여(디클로로메탄:메탄올 = 10:1->5:1->3:1 부피비 혼합물 농도 구배 용출) 표제화합물 Ⅶ-2 (0.65 g, 83 %)를 연한 노란고체로 얻었다.
ES-MS m/z: 1829.74 (915.16) [M+H]+
실시예 4-3: 화합물 Ⅶ-3의 제조
Figure pat00106
화합물 Ⅵ (0.21 g, 0.18 mmol)와 화합물 Ⅱ-3 (0.10 g, 0.15 mmol)를 디메틸포름아미드 (10 mL)에 용해시킨 후, 0 ℃에서 디이소프로필아민 (0.04 mL, 0.23 mmol), 1-[비스(디메틸아미노)메틸렌]-1H-1,2,3-트리아졸[4,4-b]피리딘늄3-옥사이드 헥사플루오르포스페이트 (HATU)(87 mg, 0.23 mmol)를 첨가하고 상온에서 2시간 동안 교반하였다. 반응 완결 후 반응 용매를 고 진공 하에 감압 농축하여 잔사에 에틸아세테이트와 증류수로 세척한 다음 유기층을 무수황산나트륨으로 건조시키고 감압 농축하였다. 농축된 잔사를 실리카겔 컬럼크로마토그래피(디클로로메탄:메탄올 = 5:1 부피비)로 정제하여 표제화합물 Ⅶ-3 (0.25 g, 90 %)을 얻었다.
ES-MS m/z: 1798.1[M+H]+ (900.2)
실시예 4-4: 화합물 Ⅶ-4의 제조
Figure pat00107
화학물 Ⅵ (0.11 g, 0.09 mmol)와 화합물 Ⅱ-4 (0.06 g, 0.19 mmol)를 디클로로메탄 (3 mL)에 녹이고 0 ℃에서 디이소프로필아민(33.71 ㎕, 2.59 mmol), 1-[비스(디메틸아미노)메틸렌]-1H-1,2,3-트리아졸[4,4-b]피리딘늄3-옥사이드 헥사플루오르포스페이트 (HATU) (0.08 mg, 0.19 mmol)를 첨가한 후 상온에서 1시간 동안 교반하였다. 반응 완결 후 반응 용매를 감압 농축 하여 얻어진 잔사를 실리카겔 컬럼크로마토그래피로 정제하여(디클로로메탄:메탄올 = 메탄올 부피비 20%->25% 혼합물 농도 구배 용출) 표제화합물 Ⅶ-4 (122 mg, 94 %)를 얻었다.
ES-MS m/z: 1726.7[M+H]+ (863.89)
실시예 4-5: 화합물 Ⅶ-5의 제조
1단계: 화합물 Ⅶ-5a 의 제조
Figure pat00108
화학물 Ⅵ (1.00 g, 0.86 mmol)와 화합물Ⅱ-1a (0.50 g, 1.29 mmol)를 디메틸포름아미드 (70 mL)에 용해시킨 후 0 ℃에서 1-(3-다이메틸아미노프로필)-3-에틸카보다이이미드 하이드로클로라이드 (0.25 g, 1.29 mmol), 히드록시벤조트리아졸 (23.32 mg, 0.17 mmol), 그리고 디이소프로필아민 (0.45 mL, 2.58 mmol)를 첨가한 후 반응 혼합물을 상온에서 밤새 동안 교반하였다. 반응 완결 후 반응 용매를 고 진공 하에 감압 농축하고 디클로로메탄/메탄올에 용해 한 후 증류수와 소금물 순차적으로 세척한 다음, 유기층을 무수황산나트륨으로 건조시키고 감압 농축하였다. 농축 잔사를 실리카겔 컬럼크로마토그래피로 정제하여 표제화합물 Ⅶ-5a (1.10 g, 85 %)을 얻었다.
ES-MS m/z: 1525.82 [M+H]+ (half : 763)
2단계: 화합물 VII-5b 의 제조
Figure pat00109
화합물 Ⅶ-5a (1.10 g, 0.34 mmol)를 디메틸포름아미드 (40 mL)에 용해시킨 후, 디에틸아민 (0.38 mL, 3.60 mmol)를 첨가 후 상온에서 5시간 동안 교반하였다. 반응 완결 후 고 진공 하에 감압 농축하여 얻어진 잔사를 실리카겔 컬럼크로마토그래피로 정제하여((메틸렌클로라이드:메탄올 = 10:1->5:1->3:1 부피비 혼합물 농도 구배 용출) 화합물을 얻은 다음 여기에 디클로로메탄/다이에틸에터로 재결정하여 표제화합물 Ⅶ-5b (0.90 g, 97 %)를 연한 노란 고체로 얻었다.
ES-MS m/z: 1303.58 [M+H]+ (half : 651.79)
화합물 VII-5 의 제조
Figure pat00110
화합물 Ⅶ-5b (0.45 g, 0.35 mmol)와 화합물 Ⅱ-5 (0.27 g, 0.41 mmol)를 디메틸포름아미드 (70 mL)에 용해 시킨 후 0 ℃에서 디이소프로필아민 (0.36 mL, 2.07 mmol), 1-[비스(디메틸아미노)메틸렌]-1H-1,2,3-트리아졸[4,4-b]피리딘늄3-옥사이드 헥사플루오르포스페이트 (HATU)(0.39 g, 1.04 mmol) 첨가하여 반응 혼합물을 상온에서 1시간 동안 교반하였다. 반응 완결 후 반응 용매를 고 진공 하에 감압 농축하여 잔사를 실리카겔 컬럼크로마토그래피로(디클로로메탄:메탄올 = 5:1->3:1->3:2 부피비 혼합물 농도 구배 용출) 정제하여 표제화합물 Ⅶ-5 (0.44 g, 70 %)를 얻었다.
ES-MS m/z: 1835.27 [M+H]+, 612.80 (1/3 값), 918.60 (1/2 값)
실시예 4-6: VII-6 화합물의 제조
Figure pat00111
상기 실시예 4-3의 VII-3의 화합물의 제조 방법에서, 화합물 II-3 대신 화합물 II-6을 사용하여, 동일한 방법으로 VII-6을 제조할 수 있다.
실시예 5: 화합물 Ⅷ-1 내지 Ⅷ-6의 제조
실시예 5-1: 화합물 Ⅷ-1의 제조
Figure pat00112
화합물 Ⅶ-1 (200 mg, 110 umol)을 디메틸포름아미드 (10 mL)에 녹인 후, 디에틸아민 (57 ㎕, 550 umol)를 첨가시켜준 후에 밤새 동안 교반하였다. 반응 완결 후 고 진공 하에 감압 농축하여 얻어진 잔사를 실리카겔 컬럼크로마토그래피로 정제하여((디클로로메탄:메탄올 = 1:1 부피비 (혼합물의 총 부피 대비 10% TEA 포함)) 화합물을 얻은 다음 여기에 디클로로메탄/메탄올에 녹인 후 증류수와 소금물로 순차적으로 세척한 다음, 무수황산나트륨으로 건조 후 감압 농축하여 유기용매를 제거하여 표제화합물 Ⅷ-1 (120 mg, 64 %)을 노란 고체로 얻었다.
ES-MS m/z: 1594.2, (797.60) [M+H]+
실시예 5-2: 화합물 Ⅷ-2의 제조
Figure pat00113
화합물 Ⅶ-2 (0.65 g, 0.34 mmol)를 디메틸포름아미드 (8 mL)에 녹인 후, 디에틸아민 (0.19 mL, 1.79 mmol)를 첨가시켜준 후에 밤새 동안 교반하였다. 반응 완결 후 고 진공 하에 감압 농축하여 얻어진 잔사를 실리카겔 컬럼크로마토그래피로 정제하여((메틸클로라이드:메탄올 10:1->5:1->3:1 (혼합물의 총 부피 대비 1% TEA 포함)) 화합물을 얻은 다음 여기에 디클로로메탄/메탄올에 녹인 후 증류수와 소금물로 순차적으로 세척한 다음, 무수황산나트륨으로 건조 후 감압 농축하여 유기용매를 제거하여 표제화합물 Ⅷ-2 (0.48 g, 84 %)를 노란 고체로 얻었다.
ES-MS m/z: 1608.92,(804.96) [M+H]+
실시예 5-3: 화합물 Ⅷ-3의 제조
Figure pat00114
화합물 Ⅶ-3 (0.29 g, 0.16 mmol)을 디메틸포름아미드 (10 mL)에 용해시킨 후 디에틸아민(0.08 mL, 0.79 mmol)를 첨가하고 반응 혼합물을 상온에서 6시간 동안 교반하였다. 반응 완결 후 반응 용매를 고 진공 하에 감압 농축하여 얻어진 잔사를 실리카겔 컬럼크로마토그래피로 정제하여(디클로로메탄:메탄올 = 5:1->3:1 부피비 혼합물 농도 구배 용출)로 정제하여 표제화합물 Ⅷ-3 (0.16 g, 64 %)을 얻었다.
ES-MS m/z: 1575.9[M+H]+ (788.9)
실시예 5-4: 화합물 Ⅷ-4의 제조
Figure pat00115
화합물 Ⅶ-4 (0.12 g, 0.07 mmol)를 디메틸포름아미드 (3 mL)에 용해 시킨 후 디에틸아민(35.7 mL, 0.34 mmol)를 첨가한 후 반응 혼합물을 상온에서 밤새 동안 교반하였다. 반응 완결 후 반응 용매를 고 진공 하에 감압 농축하여 얻어진 잔사를 아민실리카겔 컬럼크로마토그래피로 정제하여(디클로로메탄:메탄올 = 메탄올 부피비 1%->3% 혼합물 농도 구배 용출)로 정제하여 표제화합물 Ⅷ-4 (91 mg, 89 %)를 얻었다.
ES-MS m/z: 1503.9[M+H]+ (752.56)
실시예 5-5: 화합물 Ⅷ-5의 제조
Figure pat00116
화합물 Ⅶ-5 (100 mg, 0.05 mmol)를 디메틸포름아미드 (10 mL)에 녹인 후 디에틸아민(28.47 ㎕, 0.27 mmol)를 첨가하여 반응 혼합물을 상온에서 6시간 동안 교반하였다. 반응 완결 후 반응 용매를 고 진공 하에 감압 농축하여 얻어진 잔사를 실리카겔 컬럼크로마토그래피로 정제하여 (디클로로메탄:메탄올 = 10:1->5:1->3:1 부피비 혼합물 농도 구배 용출(혼합물의 총 부피 대비 1% TEA 포함))로 정제하여 표제화합물 Ⅷ-5 (78.90 mg, 89 %)를 얻었다.
ES-MS m/z: 1614.05[M+H]+ (807.02)
실시예 5-6: VIII-6 화합물의 제조
Figure pat00117
상기 실시예 5-3의 VIII-3의 화합물의 제조 방법에서, 화합물 VII-3 대신 화합물 VII-6을 사용하여, 동일한 방법으로 VIII-6을 제조할 수 있다.
실시예 6: 화합물 Ⅸ-1 내지 Ⅸ-9의 제조
실시예 6-1: 화합물 Ⅸ-1의 제조
Figure pat00118
화합물 I-1 (17.32 mg, 0.05 mmol)과 화합물 Ⅷ-1 (50 mg, 0.03 mmol)를 디클로로메탄 (3 mL)에 녹이고 0 ℃에서 디이소프로필에틸아민 (12.72 ㎕, 0.07 mmol), 1-[비스(디메틸아미노)메틸렌]-1H-1,2,3-트리아졸[4,4-b]피리딘늄3-옥사이드 헥사플루오르포스페이트 (HATU) (27.43 mg, 0.07 mmol)를 첨가한 후 상온에서 1시간 동안 교반하였다. 반응 완결 후 증류수 (10 mL)와 디클로로메탄 (10 mLX 2)로 추출한 다음, 유기층을 무수황산나트륨으로 건조시키고 감압 농축하였다. 농축 잔사를 실리카겔 컬럼크로마토그래피로 정제하여 표제화합물 Ⅸ-1 (28 mg, 46 %)을 흰색 고체로 얻었다.
ES-MS m/z: 1944.85 [M-H]+ (972.43)
실시예 6-2: 화합물 Ⅸ-2의 제조
Figure pat00119
화합물 Ⅰ-2 (22 mg, 0.06 mmol)와 화합물 Ⅷ-2 (60 mg, 0.04 mmol)를 사용하여 화합물 IX-1과 동일한 방법으로 표제화합물 Ⅸ-2 (34 mg, 47 %)를 얻었다.
ES-MS m/z: 1958.92 [M+H]+ 652.4 (1/3 값), 979.5 (1/2 값)
실시예 6-3: 화합물 Ⅸ-3의 제조
Figure pat00120
화합물 Ⅰ-2 (14 mg, 0.37 mmol)와 화합물 Ⅷ-1을 사용하여 화합물 IX-1과 동일한 방법으로 표제화합물 Ⅸ-3 (12.2 mg, 21 %)을 얻었다.
ES-MS m/z: 1958.92 [M+H]+ 652.4 (1/3 값), 979.5 (1/2 값)
실시예 6-4: 화합물 Ⅸ-4의 제조
Figure pat00121
화합물 Ⅰ-1 (14 mg, 0.04 mmol)과 화합물 Ⅷ-2를 사용하여 화합물 IX-1과 동일한 방법으로 표제화합물 Ⅸ-4 (10.6 mg, 22 %)를 얻었다.
ES-MS m/z: 1962.99 [M+H]+ 655.4 (1/3 값), 982.3 (1/2 값)
실시예 6-5: 화합물 Ⅸ-5의 제조
Figure pat00122
화합물 Ⅰ-3 (18 mg, 0.05 mmol)과 화합물 Ⅷ-2를 사용하여 화합물 IX-1과 동일한 방법으로 표제화합물 Ⅸ-5 (21 mg, 33 %)를 얻었다.
ES-MS m/z: 1985.94, (993.9) [M+H]+
실시예 6-6: 화합물 Ⅸ-6의 제조
Figure pat00123
화합물 I-1 (28 mg, 0.08 mmol)과 화합물 Ⅷ-3 (80 mg, 0.05 mmol)을 사용하여 화합물 IX-1과 동일한 방법으로 표제화합물 Ⅸ-6 (16 mg, 72 %)을 얻었다.
ES-MS m/z: 1925.8[M+H]+ (963.8)
실시예 6-7: 화합물 Ⅸ-7의 제조
Figure pat00124
화합물 I-1 (16.81 mg, 0.05 mmol)과 화합물 Ⅷ-4 (45.8 mg, 0.03 mmol)를 사용하여 화합물 IX-1과 동일한 방법으로 표제화합물 Ⅸ-7 (16 mg, 2 9%)을 얻었다.
ES-MS m/z: 1853.7[M+H]+ (927.50)
실시예 6-8: 화합물 Ⅸ-8의 제조
Figure pat00125
화합물 I-1 (20 mg, 0.05 mmol)과 화합물 Ⅷ-5 (88.09 mg, 0.05 mmol)를 사용하여 화합물 IX-1과 동일한 방법으로 표제화합물 Ⅸ-8 (28 mg, 26 %)을 얻었다.
ES-MS m/z: 1962.99[M+H]+ 655.4 (1/3 값), 982.3 (1/2 값)
실시예 6-9: 화합물 Ⅸ-9의 제조
Figure pat00126
화합물 I-2 (20 mg, 0.05 mmol)와 화합물 Ⅷ-6(57 mg, 0.04 mmol)을 사용하여 화합물 IX-1와 동일한 방법으로 표제화합물 Ⅸ-9 (25 mg, 36 %)를 얻었다.
ES-MS m/z: 1954.9[M+H]+ (977.8)
실시예 7: 화합물 Ⅹ-1 내지 Ⅹ-9의 제조
실시예 7-1: 화합물 Ⅹ-1의 제조
Figure pat00127
허셉틴 (100 mg, 0.67 μmol, 20 mg/mL)을 pH 7.3 PBS 15 mL에 가하고 40 ℃로 온도를 맞춘 후 10mM TCEP (1 mL, 10 μmol) 를 넣고 40 ℃에서 2시간 동안 교반하였다. 반응 물질을 원심여과기(Amicon Ultra-15 30K centrifugal filter)로 40분간 돌려 정제를 해준 후 pH 7.3 PBS 12 mL를 넣고, UV로 농도 측정하였다.
상기 방법으로 제조된 환원된 허셉틴 (20 mg, 0.14 μmol, 7.5 mg/mL)을 pH 7.3 PBS 5.34 mL에 넣고 20 ℃로 온도를 맞춘 후 디메틸포름이미드 0.8 mL를 넣었다. 온도를 20 ℃로 유지하고 화합물 IX-1 (1.44 mg, 0.73 μmol)을 디메틸포름이미드 88 ㎕에 녹여 넣어준 후 16시간 동안 교반하였다. 반응이 종결되면 반응혼합물을 0.45 μm PVDF로 여과하고 여액을 원심 여과기(Amicon Ultra-15 30K centrifugal filter)을 사용하여 유기용매와 미 반응 물질이 제거될 때까지 pH 7.3 PBS를 다시 가하여 2회 반복 농축하였다. 농축액을 pH 7.3 PBS 중에 평형화시킨 Sephadex G-25 수지 충진 컬럼 (30 x 300 mm, pH 7.3 PBS)을 사용하여 MPLC (Medium Pressure liquid chromatography) (wavelength 280 nm, UV range 0.08, flow rate 10 mL/min)로 분리 정제하여 화합물 Ⅹ-1을 얻었다. 이때 얻어진 화합물의 Ⅹ-1의 농도는 UV 분광계로 세가지 파장(280 nm, 320 nm, 350 nm) 각각에서의 흡광도를 측정하여 결정하였다.
실시예 7-2: 화합물 Ⅹ-2의 제조
Figure pat00128
환원된 허셉틴(20 mg, 0.14 μmol, 7.5 mg/mL)을 pH 7.3 PBS 5.34 mL에 넣고 20 ℃로 온도를 맞춘 후 디메틸포름이미드 0.8 mL를 넣었다. 온도를 20 ℃로 유지하고 화합물 IX-2 (1.54 mg, 0.69 μmol)를 디메틸포름이미드 88 ㎕에 녹여 넣어준 후 16시간 동안 교반하였다. 반응이 종결되면 화합물 Ⅹ-1과 동일한 방법으로 정제하여 화합물 Ⅹ-2를 얻었다. 이때 얻어진 화합물 Ⅹ-2의 농도는 UV 분광계로 세가지 파장(280 nm, 320 nm, 350 nm) 각각에서의 흡광도를 측정하여 결정하였다.
실시예 7-3: 화합물 X-3의 제조
Figure pat00129
환원된 허셉틴(20 mg, 0.1333 μmol, 7.5 mg/mL)을 pH 7.3 PBS 5.34 mL에 넣고 20 ℃로 온도를 맞춘 후 디메틸포름이미드 0.8 mL를 넣었다. 온도를 20 ℃로 유지하고 화합물 Ⅸ-3 (1.19 mg, 0.60 μmol)을 디메틸포름이미드 88 ㎕에 녹여 넣어준 후 16시간 동안 교반하였다. 반응이 종결되면 화합물 Ⅹ-1과 동일한 방법으로 정제하여 화합물 Ⅹ-3을 얻었다. 이때 얻어진 화합물 Ⅹ-3의 농도는 UV 분광계로 세가지 파장(280 nm, 320 nm, 350 nm) 각각에서의 흡광도를 측정하여 결정하였다.
실시예 7-4: 화합물 Ⅹ-4의 제조
Figure pat00130
환원된 허셉틴(20 mg, 0.1333 μmol, 7.5 mg/mL)을 pH 7.3 PBS 5.34 mL에 넣고 20 ℃로 온도를 맞춘 후 디메틸포름이미드 0.8 mL를 넣었다. 온도를 20 ℃로 유지하고 화합물 Ⅸ-4 (1.64 mg, 0.82 μmol)를 DMF 88 ㎕에 녹여 넣어준 후 16시간 동안 교반하였다. 반응이 종결되면 화합물 Ⅹ-1과 동일한 방법으로 정제하여 화합물 Ⅹ-4를 얻었다. 이때 얻어진 화합물 Ⅹ-4의 농도는 UV 분광계로 세가지 파장(280 nm, 320 nm, 350 nm) 각각에서의 흡광도를 측정하여 결정하였다.
실시예 7-5: 화합물 Ⅹ-5의 제조
Figure pat00131
환원된 허셉틴(20 mg, 0.1333 μmol, 7.5 mg/mL)을 pH 7.3 PBS 5.34 mL에 넣고 20 ℃로 온도를 맞춘 후 디메틸술폭시드 0.8 mL를 넣었다. 온도를 20 ℃로 유지하고 화합물 Ⅸ-5 (1.4 mg, 0.693 μmol)을 디메틸술폭시드 88 ㎕에 녹여 넣어준 후 16시간 동안 교반하였다. 반응이 종결되면 화합물 Ⅹ-1과 동일한 방법으로 정제하여 화합물 Ⅹ-5를 얻었다. 이때 얻어진 화합물 Ⅹ-5의 농도는 UV 분광계로 세가지 파장(280 nm, 320 nm, 350 nm) 각각에서의 흡광도를 측정하여 결정하였다.
실시예 7-6: 화합물 Ⅹ-6의 제조
Figure pat00132
환원된 허셉틴(20 mg, 0.1333 μmol, 7.5 mg/ml)을 pH 7.3 PBS 5.34 ml에 넣고 20 ℃로 온도를 맞춘 후 디메틸술폭시드 0.32 mL를 넣었다. 온도를 20 ℃로 유지하고 화합물 Ⅸ-6 (1.43 mg, 0.73 μmol)을 디메틸술폭시드 100 ㎕에 녹여 넣어준 후 16시간 동안 교반하였다. 반응이 종결되면 화합물 Ⅹ-1과 동일한 방법으로 정제하여 화합물 Ⅹ-6을 얻었다. 이때 얻어진 화합물 Ⅹ-6의 농도는 UV 분광계로 세가지 파장(280 nm, 320 nm, 350 nm) 각각에서의 흡광도를 측정하여 결정하였다.
실시예 7-7: 화합물 Ⅹ-7의 제조
Figure pat00133
환원된 허셉틴 (20 mg, 0.1333 μmol, 7.5 mg/mL)을 pH 7.3 PBS 5.34 mL에 넣고 20 ℃로 온도를 맞춘 후 디메틸술폭시드 0.32 mL를 넣었다. 온도를 20 ℃로 유지하고 화합물 Ⅸ-7(1.76 mg, 0.93 μmol)을 디메틸술폭시드 100 ㎕에 녹여 넣어준 후 16시간 동안 교반하였다. 반응이 종결되면 화합물 Ⅹ-1과 동일한 방법으로 정제하여 화합물 Ⅹ-7을 얻었다. 이때 얻어진 화합물 Ⅹ-7의 농도는 UV 분광계로 세가지 파장(280 nm, 320 nm, 350 nm) 각각에서의 흡광도를 측정하여 결정하였다.
실시예 7-8: 화합물 Ⅹ-8의 제조
Figure pat00134
환원된 허셉틴(20 mg, 0.1333 μmol, 7.5 mg/mL)을 pH 7.3 PBS 5.34 mL에 넣고 20 ℃로 온도를 맞춘 후 디메틸포름이미드 0.8 mL를 넣었다. 온도를 20 ℃로 유지하고 화합물 Ⅸ-8 (1.59 mg, 0.8 μmol)을 디메틸포름이미드 88 ㎕에 녹여 넣어준 후 16시간 동안 교반하였다. 반응이 종결되면 화합물 Ⅹ-1과 동일한 방법으로 정제하여 화합물 Ⅹ-8을 얻었다. 이때 얻어진 화합물 Ⅹ-8의 농도는 UV 분광계로 세가지 파장(280 nm, 320 nm, 350 nm) 각각에서의 흡광도를 측정하여 결정하였다.
실시예 7-9: 화합물 Ⅹ-9의 제조
Figure pat00135
환원된 허셉틴(20 mg, 0.1333 μmol, 7.5 mg/mL)을 pH 7.3 PBS 5.34 mL에 넣고 20 ℃로 온도를 맞춘 후 디메틸포름아미드 0.8 mL를 넣었다. 온도를 20 ℃로 유지하고 화합물 Ⅸ-9 (1.35 mg, 0.69 μmol)를 디메틸포름아미드 88 ㎕에 녹여 넣어준 후 16시간 동안 교반하였다. 반응이 종결되면 화합물 Ⅹ-1과 동일한 방법으로 정제하여 화합물 Ⅹ-9를 얻었다. 이때 얻어진 화합물 Ⅹ-9의 농도는 UV 분광계로 세가지 파장(280 nm, 320 nm, 350 nm) 각각에서의 흡광도를 측정하여 결정하였다.
실험예
본 발명자들은 상기 제조예를 통해 제조된 ADC 화합물의 위치 특이적인 결합의 효과를 확인하기 위해서 DAR(Drug Antibody Ration) 결정 시험을 수행하였으며, ADC 화합물의 항암 효과를 확인하기 위해서 종양 세포가 이식된 쥐를 대상으로 성장 억제 효과를 평가하였다.
시험예 1: HIC(Hydrophobic Interaction Chromatography) 크로마토그램을 이용한 DAR 결정
실시예 7-2 내지 7-9에서 제조된 ADC 화합물 X-2, X-3, X-4, X-5, X-6, X-7, X-8 및 X-9를 Waters alliance HPLC 를 이용하여 분석하였다. TSKgel Butyl NPR (4.6 mm x 100 mm, 2.5 um) 컬럼과 이동상 A (1.5 M 암모늄설페이트, 25 mM 모노나트륨인산염, pH 7.0) 및 이동상 B(25 mM 모노나트륨인산염, pH 7.0 :아이소프로필 알코올 = 75:25)의 구배 용리 (Gradient elution)를 이용하여 분석하였고, 물질의 소수성(hydrophobicity) 차이로 피크가 용리되므로 크로마토그램 상의 비율을 확인하여 DAR 을 계산하였다. 각 피크의 상대 존재비(relative abundance)는 하기 식을 이용하여 계산하였다. 각 피크의 존재비를 모든 피크의 존재비의 합으로 나누어 각 피크의 % 상대 존재비를 계산하였다.
각 피크의 % 상대 존재비 =
Figure pat00136
ADC 화합물의 DAR은 % 상대 존재비와 하기 식을 이용하여 계산하였다.
DAR =
Figure pat00137
그 결과를 하기 표 1에 나타내었다.
Sample DAR
D0 D1 D2 D3 D4 D5
Ⅹ-2 0.12 0.4 0.96 5.25 82.53 10.84
Ⅹ-3 0.00 0.00 0.00 2.26 84.31 13.43
Ⅹ-4 0.37 0.11 0.36 7.03 79.24 12.9
Ⅹ-5 0.21 1.19 5.34 17.45 62.94 12.86
Ⅹ-6 0.00 0.00 0.51 9.91 76.22 13.37
Ⅹ-7 0.00 0.42 2.30 17.68 66.03 13.58
Ⅹ-8 1.15 5.40 9.97 29.27 54.21 0.00
Ⅹ-9 0.08 0.9 6.72 27.84 57.23 7.23
자연적인 항체의 내부에 존재하는 이황화결합의 수는 4개로 알려져 있으므로, 이론적으로 이 위치 모두에 위치 특이적으로 약물이 결합하였을 때 DAR 값은 4가 나타난다.
상기 표 1에서 나타난 바와 같이, 실시예 7-2 내지 7-9에서 제조된 ADC 화합물 X-2, X-3, X-4, X-5, X-6, X-7, X-8 및 X-9는 모두 50 % 이상의 DAR 4 값이 나타났으며, 이를 통하여 본 발명의 신규 링커 화합물이 우수한 위치 특이성을 가짐을 확인하였다.
시험예 2: 시험관 내 세포독성 시험
ADC 화합물의 항암 효능을 평가하기 위하여 인체 유래의 유방암 세포주 BT-474와 유방암 내성 세포주 JIMT-1에 X-1, X-2 및 X-6을 처리한 후, 세포 생장 저해능(anti-proliferation activity) 실험을 실시하였다.
세포주 배양
인체 유래의 HER-2 과발현 유방암 세포주 BT-474와 유방암 내성 세포주 JIMT-1을 10% 우태아혈청(FBS)과 젠타마이신(gentamicin)을 첨가한 DMEM:F12(Dulbecco's Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12) 배양액에서 계대 배양하였다. 세포 배양은 37 ℃, 5 % CO2 조건에서 배양되었다.
시료 처리
96웰 마이크로 플레이트에 웰 당 1X 104 개의 세포를 준비하고 대조군인 trastuzumab과 실시예 7-1, 7-2 및 7-6에서 제조된 X-1, X-2 및 X-6을 최대 200 ng/ml에서 최저 0.391 ng/ml 사이의 10개의 농도 별로 처리한 후, 5일 배양 후에 살아있는 세포 수를 발색 시약(CCK-8)으로 처리한 후 450 nm에서 흡광도를 측정하였다. 농도-효능 간의 관계식은 4차 곡선 함수로 구하고, EC50(effective concentration of 50 %, 반수영향농도)를 비교하여 상대적인 효능을 평가하였다. 그 결과를 표 2 내지 3으로 나타내었다.
결과
하기 표 2에서 나타난 바와 같이, ADC 화합물 X-1, X-2 및 X-6는 BT-474 세포에서 대조군인 현재 유방암 치료 허가 항체 의약품인 트라스트주맙과 비교하여 약 16.8배, 20.2배, 27.3배의 낮은 EC50값을 보였다.
Sample EC 50 (ng/ml) Relative effect
트라스투주맙 40.67 1
X-1 2.428 16.8
트라스투주맙 75.95 1
X-2 3.758 20.2
트라스투주맙 81.51 1
X-6 2.985 27.3
하기 표 3에서 나타난 바와 같이, 현재 유방암 치료제로 시판 중인 항체 의약품인 케싸일라(성분명: 트라스투주맙엠탄신)의 치료 효과가 나타나지 않는 유방암 내성 세포주에서 X-1과 X-2의 EC50 (ng/ml)은 각각 39.63 및 49.59로 나타났다.
Sample EC 50 (ng/ml) Relative effect
케싸일라 N/A N/A
X-1 39.63 N/A
X-2 47.59 N/A
시험예 3: 동물모델 효능 시험
시험예 3-1: ADC 화합물 X-2의 누드마우스에 이식된 인체 유래의 유방암 세포주 BT-474에 대한 항암시험
인체 유래의 유방암 세포주인 BT-474 세포가 이식된 누드마우스에 실시예 7-2에서 제조된 X-2 를 정맥투여 한 후, 종양의 성장 억제 효과를 평가하고자 실시하였다. 관찰 기간 동안 매일 1 회 일반증상을 관찰하였고, 동물의 체중은 주 1 회, 종양의 부피는 주 2 회 측정하였다. 관찰기간 종료 후 종양을 적출하여 중량을 측정하였다
조제 및 조제물의 분석
<시험물질>
4.53 mg/mL X-2를 취하여 부형제인 D-PBS(Dolecco's Phosphate Buffered Saline)를 가하여 농도 (0.02, 0.1 및 0.5 mg/mL)로 조제하였다.
<양성대조물질>
2.5 mg/mL를 케싸일라(성분명: 트라스투주맙엠탄신)를 취하여 부형제인 D-PBS를 가하여 농도 (0.5 mg/mL)로 조제하였다.
세포주 및 세포주의 준비
아래의 표 4와 같은 조성으로 100 mL 당 우태아혈청(FBS), 페니실린 및 스트렙토마이신 혼합물(10,000 units/mL 페니실린 및 10,000 μg/mL 스트렙토마이신) 및 DMEM -F12 를 혼합하여 사용하였다.
Figure pat00138
시험에 사용할 세포는 해동하여 세포 배양용 플라스크에 넣었고 37 ℃, 5 % CO2 배양기(MCO-20AIC, Sanyo, Japan)에서 배양하였다. 세포주 이식일에 배양된 세포를 원심분리 튜브에 넣은 후 원심분리 (1,000 rpm, 5 분)하여 상층액을 버리고 D-PBS 로 세포 부유액 (2Х107 cells/mL)을 만들었다.
투여
시험물질의 투여는 일회용 주사기를 이용하여 1 회/주, 총 2회 정맥 투여하였다.
군구성
Figure pat00139
군구성은 상기 표 5와 같이, 음성대조군 (G1), 0.2 mg/kg 용량의 시험물질투여군 1 (G2), 1 mg/kg 용량의 시험물질투여군 2 (G3), 5 mg/kg 용량의 시험물질투여군 3 (G4) 및 5 mg/kg 용량의 양성대조군 (G5)으로 군당 6 마리씩 총 5 군으로 설정하였다.
결과
도 1에서 나타난 바와 같이, 음성대조군의 투여 전부터 투여 후 24 일까지의 평균 종양 부피 (Tumor volume)의 변동 범위는 107 ~ 2,938 mm3 로, 시간 추이적으로 증가되는 경향을 나타내었다. 0.2, 1 및 5 mg/kg 용량의 시험물질투여군의 평균 종양 부피는 각각 107 ~ 1,482 mm3, 107~ 1110 mm3 및 107 ~ 648 mm3 의 변동 범위를 나타내었고, 모든 시험물질투여군에서, 투여 24일 후에는 음성대조군과 비교하여 통계학적으로 유의하게 용량의존적으로 종양 부피가 감소되었다.
또한 5 mg/kg 용량의 양성대조군의 평균 종양 부피는 106 ~ 1,390 mm3 의 변동 범위를 나타내었고, 동일 용량의 시험물질투여군이 투여 후 2주(29일) 기준 약 2배 정도 평균 종양 부피가 작음을 확인하였다.
시험예 3-2: 화합물 (Ⅰ-2)의 누드마우스에 이식된 인체 유래의 유방암내성세포주 JIMT-1에 대한 항암시험
인체 유래의 유방암 내성세포주인 JIMT-1 세포가 이식된 누드마우스에
시험물질인 X-2와 양성대조군인 캐싸일라의 종양 성장 억제 효과를 시험예 3-1과 같이 1회/주, 총 2회 정맥 투여한 뒤 평가하였다.
군구성
음성대조군 (G1), 5 mg/kg 용량의 시험물질투여군 1 (G2), 25 mg/kg 용량의 시험물질투여군 2 (G3) 및 양성대조군 (G4)으로 군당 6 마리씩 총 4 군으로 설정하였다.
결과
도 2에서 나타난 바와 같이, 음성대조군의 투여 전부터 투여 후 29 일까지의 평균 종양 부피 (Tumor volume)의 변동 범위는 104 ~ 691 mm3 로, 시간 추이적으로 증가되는 경향을 나타내었다.
5 및 25 mg/kg 용량의 시험물질투여군의 평균 종양 부피는 각각 7 ~ 136 mm3 및 2 ~ 122 mm3 의 변동 범위를 나타내었고, 음성대조군과 비교하여 모든 시험물질투여군에서 투여 29일 후에는 통계학적으로 유의하게 감소되었다.
또한 25 mg/kg 용량의 양성대조군의 평균 종양 부피는 78 - 178 mm3의 변동범위를 나타내었고 동일 용량의 시험물질투여군이 투여 후 2주(29일) 기준 약 1.5배 정도 평균 종양 부피가 작음을 확인하였다.

Claims (10)

  1. 하기 화학식 A의 화합물:
    [화학식 A]
    Figure pat00140

    상기 식에서,
    XA 및 XB는 각각 독립적으로 산소 및 황에서 선택되며,
    YA 및 YB는 각각 독립적으로 수소, 할로겐 및 이탈기(leaving group)에서 선택되며,
    R1은 카르보닐기, 카르복실기, 알킬기, 아릴기, 헤테로아릴기 및 아민기에서 선택되고 이들 그룹은 치환되거나 비치환된 것일 수 있으며,
    n는 1 내지 4이다.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 화학식 A의 화합물은 하기 화학식 I인 것인, 화합물:
    [화학식 I]
    Figure pat00141

    상기 식에서,
    YA 및 YB는 각각 독립적으로 할로겐이며,
    R2는 수소, 히드록시, 할로겐, 이탈기 및 보호기(Protecting group)에서 선택되며,
    n는 1 내지 4이다.
  3. 하기 화학식 B의 화합물:
    [화학식 B]
    Figure pat00142

    상기 식에서,
    XA 및 XB는 각각 독립적으로 산소 및 황에서 선택되며,
    YA 및 YB는 각각 독립적으로 수소, 할로겐 및 이탈기(leaving group)에서 선택되며,
    FG는 기능기(functional group)로,
    Figure pat00143
    이며,
    D는 약물이며,
    CV는 절단 부위 화합물이며,
    SP는 스페이서 화합물이며,
    p, q 및 r은 각각 독립적으로 0 내지 8이고, p, q 및 r 중 적어도 하나는 0이 아니며,
    n는 1 내지 4이다.
  4. 하기 화학식 C의 화합물:
    [화학식 C]
    Figure pat00144

    상기 식에서,
    XA 및 XB는 각각 독립적으로 산소 및 황에서 선택되며,
    Ab는 항체이며,
    SA 및 SB는 항체 내에 이황화결합으로부터 유래된 2개의 시스테인 잔기의 황 원자이며,
    FG는 기능기(functional group)로,
    Figure pat00145
    이며,
    D는 약물이며,
    CV는 절단 부위 화합물이며,
    SP는 스페이서 화합물이며,
    p, q 및 r은 각각 독립적으로 0 내지 8이고, p, q 및 r 중 적어도 하나는 0이 아니며,
    n는 1 내지 4이다.
  5. 제3항 또는 제4항에 있어서,
    상기 약물은 돌라스타틴, 파클리탁셀, 두오카르마이신, 크립토파이신, 안트라시클린, 미토마이신C, 올리고마이신, 에포타일론, 헤미아스테린, 카리케아마이신, 독소루비신, 파이롤벤젠디아지핀, 마이탄시노이드 및 이들의 유도체에서 선택되는 것인, 화합물.
  6. 제3항 또는 제4항에 있어서,
    상기 절단 부위 화합물은 발린-시트롤린(Val-Cit), 글루쿠로나이드, 이황화 화합물(disulfide boned(S-S-)), 옥심, 이민 및 이들의 유도체에서 선택되는 것인, 화합물.
  7. 제3항 또는 제4항에 있어서,
    상기 스페이서 화합물은
    Figure pat00146
    ,
    Figure pat00147
    ,
    Figure pat00148
    ,
    Figure pat00149
    ,
    Figure pat00150
    및
    Figure pat00151

    에서 선택되는 것인, 화합물:
    상기 식에서
    n1 및 n2는 각각 독립적으로 0 내지 3이고 n1 및 n2 중 적어도 하나는 0이 아니며,
    p', q' 및 r'은 각각 독립적으로 0 내지 4이고 p', q' 및 r' 중 적어도 하나는 0이 아니다.
  8. 제4항에 있어서,
    상기 화학식 C의 화합물은 하기 화합물 중 어느 하나인, 화합물:
    [화학식 X-1]
    Figure pat00152

    [화학식 X-2]
    Figure pat00153

    [화학식 X-3]
    Figure pat00154

    [화학식 X-4]

    [화학식 X-5]
    Figure pat00156

    [화학식 X-6]
    Figure pat00157

    [화학식 X-7]
    Figure pat00158

    [화학식 X-8]
    Figure pat00159

    [화학식 X-9]
    Figure pat00160
  9. 하기 화학식 B의 화합물과 항체를 반응시키는 단계를 포함하는 하기 화학식 C의 화합물의 제조방법:
    [화학식 B]
    Figure pat00161

    [화학식 C]
    Figure pat00162

    상기 식에서,
    XA 및 XB는 각각 독립적으로 산소 및 황에서 선택되며,
    YA 및 YB는 각각 독립적으로 수소, 할로겐 및 이탈기(leaving group)에서 선택되며,
    Ab는 항체이며,
    SA 및 SB는 항체 내에 이황화결합으로부터 유래된 2개의 시스테인 잔기의 황 원자이며,
    FG는 기능기(functional group)로,
    Figure pat00163
    이며,
    D는 약물이며,
    CV는 절단 부위 화합물이며,
    SP는 스페이서 화합물이며,
    p, q 및 r은 각각 독립적으로 0 내지 8이고, p, q 및 r 중 적어도 하나는 0이 아니며,
    n는 1 내지 4이다.
  10. 제10항에 있어서,
    화학식 B의 화합물은 하기 화학식 A의 화합물과 기능기(FG)를 반응시켜 하기 화학식 B의 화합물 제조하는 것인, 제조방법
    [화학식 A]
    Figure pat00164

    [화학식 B]
    Figure pat00165

    상기 식에서,
    XA 및 XB는 각각 독립적으로 산소 및 황에서 선택되며,
    YA 및 YB는 각각 독립적으로 수소, 할로겐 및 이탈기(leaving group)에서 선택되며,
    R1은 카르보닐기, 카르복실기, 알킬기, 아릴기, 헤테로아릴기 및 아민기에서 선택되고 이들 그룹은 치환되거나 비치환된 것일 수 있으며,
    FG는 기능기(functional group)로,
    Figure pat00166
    이며,
    D는 약물이며,
    CV는 절단 부위 화합물이며,
    SP는 스페이서 화합물이며,
    p, q 및 r은 각각 독립적으로 0 내지 8이고, p, q 및 r 중 적어도 하나는 0이 아니며,
    n는 1 내지 4이다.
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