KR20190140999A - Foxp3를 발현하는 수지상 세포의 암의 진단 또는 치료를 위한 용도 - Google Patents

Foxp3를 발현하는 수지상 세포의 암의 진단 또는 치료를 위한 용도 Download PDF

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KR20190140999A
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정이들
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성균관대학교산학협력단
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Abstract

Foxp3(Forkhead box P3)를 발현하는 수지상 세포 및 CD8(cluster of differentiation 8)을 발현하는 조절 T 세포로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 암치료 표적으로서의 용도 및/또는 암진단 마커로서의 용도가 제공된다.

Description

Foxp3를 발현하는 수지상 세포의 암의 진단 또는 치료를 위한 용도
Foxp3(Forkhead box P3)를 발현하는 수지상 세포 및 CD8(cluster of differentiation 8)을 발현하는 조절 T 세포로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 암치료 표적으로서의 용도 및/또는 암진단 마커로서의 용도가 제공된다.
수지상 세포 (Dendritic Cell, DC)는 포유 동물의 면역계에서 선천적 면역과 적응 면역 사이에 중요한 연결고리를 제공하는 항원제시세포(APC)이다.
Foxp3 (Forkhead box P3)은 조절 T세포 (regulatory T cells; Treg)의 발달과 기능에 관여하는 것으로 알려진 전사조절인자이다 (Hori, S., Nomura, T. & Sakaguchi, S. Control of regulatory T cell development by the transcription factor Foxp3. Science 299, 1057-1061, doi:10.1126/science.1079490 (2003)).
그러나, 수지상 세포와 같은 T 세포 이외의 면역 세포에서의 Foxp3 발현 및 이의 의약적 유용성에 대하여 아직 알려진 바가 없다.
본 명세서에서는 암환자의 생체 내(in vivo; 예컨대, 혈액, 종양 조직 등)에서 Foxp3를 발현하는 수지상 세포를 확인하고, 이의 암의 진단 및/또는 치료 및/또는 항암치료 후 예후 모니터링을 위한 용도를 제공한다
일 예는 Foxp3를 발현하는 수지상 세포의 암 치료 타겟 및/또는 암 진단 마커로서의 용도를 제공한다.
다른 예는 Foxp3를 발현하는 수지상 세포의 저해제를 유효성분으로 포함하는 암 치료용 약학 조성물을 제공한다. 상기 암 치료용 약학 조성물은 종양 조직 또는 혈액에서 Foxp3를 발현하는 수지상 세포가 검출된 암 환자에게 투여하기 위한 것이 수 있다.
다른 예는 Foxp3를 발현하는 수지상 세포의 저해제의 암 치료에 사용하기 위한 용도를 제공한다. 상기 암 치료에 사용하기 위한 용도는 종양 조직 또는 혈액에서 Foxp3를 발현하는 수지상 세포가 검출된 암 환자에게 적용하기 위한 것일 수 있다.
다른 예는 Foxp3를 발현하는 수지상 세포의 저해제의 약학적 유효량을 암 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 암 치료 방법을 제공한다. 상기 암 환자는 종양 조직 또는 혈액에서 Foxp3를 발현하는 수지상 세포가 검출된 암 환자일 수 있다.
다른 예는 Foxp3를 발현하는 수지상 세포의 저해제를 유효성분으로 포함하는 CD8을 발현하는 조절 T 세포 (CD8+ Treg) 저해용 약학 조성물을 제공한다. 다른 예는 Foxp3를 발현하는 수지상 세포의 저해제의 CD8을 발현하는 조절 T 세포 저해에 사용하기 위한 용도를 제공한다. 다른 예는 Foxp3를 발현하는 수지상 세포의 저해제를 CD8을 발현하는 조절 T 세포 저해를 필요로 하는 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, CD8을 발현하는 조절 T 세포 저해 방법을 제공한다. 상기 환자는 암환자, 예컨대, 종양 조직 또는 혈액에서 Foxp3를 발현하는 수지상 세포가 검출된 암 환자일 수 있다.
다른 예는 CD8을 발현하는 조절 T 세포 (CD8+ Treg)의 암 치료 타겟으로서의 용도를 제공한다.
다른 예는 CD8을 발현하는 조절 T 세포의 저해제를 유효성분으로 포함하는 암 치료용 약학 조성물을 제공한다. 상기 암 치료용 약학 조성물은 종양 조직 또는 혈액에서 CD8을 발현하는 조절 T 세포가 검출된 암 환자에게 투여하기 위한 것이 수 있다.
다른 예는 CD8을 발현하는 조절 T 세포의 저해제의 암 치료에 사용하기 위한 용도를 제공한다. 상기 암 치료에 사용하기 위한 용도는 종양 조직 또는 혈액에서 CD8을 발현하는 조절 T 세포가 검출된 암 환자에게 적용하기 위한 것일 수 있다.
다른 예는 CD8을 발현하는 조절 T 세포의 저해제의 약학적 유효량을 암 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 암 치료 방법을 제공한다. 상기 암 환자는 종양 조직 또는 혈액에서 CD8을 발현하는 조절 T 세포가 검출된 암 환자일 수 있다.
다른 예는 후보 화합물을 Foxp3를 발현하는 수지상 세포, CD8을 발현하는 조절 T 세, 또는 이들 모두와 접촉시킨 후 Foxp3를 발현하는 수지상 세포 및/또는 CD8을 발현하는 조절 T 세포의 수준이 감소한 경우, 상기 후보 화합물을 항암제 후보 물질로 결정하는 단계를 포함하는, 항암제 스크리닝 방법을 제공한다.
다른 예는 Foxp3를 발현하는 수지상 세포의 검출가능한 제제를 포함하는 암 진단 또는 암 예후 확인용 조성물을 제공한다. 다른 예는 환자로부터 분리된 생물학적 시료에서 Foxp3를 발현하는 수지상 세포를 검출하는 단계를 포함하는, 암 진단 또는 암 예후 확인 방법 또는 암 진단 또는 암 예후 확인에 정보를 제공하는 방법을 제공한다. 상기 암 진단 방법은, 상기 검출하는 단계 이후에 상기 생물학적 시료에서 Foxp3를 발현하는 수지상 세포가 검출되는 경우 (존재하는 경우), 상기 환자를 암 환자로 결정하는 단계, 또는 Foxp3를 발현하는 수지상 세포 수준 변화에 따라서 암의 진행 정도를 확인하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
다른 예는 Foxp3를 발현하는 수지상 세포와 CD8을 발현하는 T 세포를 함께 배양하는 단계를 포함하는 CD8를 발현하는 조절 T 세포 (CD8+ Treg)의 제조 방법을 제공한다.
다른 예는 Foxp3를 발현하는 수지상 세포와 CD8을 발현하는 T 세포를 공배양하여 생성된 CD8+ Treg의 면역 억제 및/또는 자가면역질환 또는 이식거부의 예방 및/또는 치료에 사용하기 위한 용도를 제공한다. 상기CD8+ Treg는 앞서 설명한 CD8+ Treg의 제조 방법에 의하여 제조된 것일 수 있다. 다른 예는 상기 제조 방법에 의하여 제조된 CD8+ Treg를 유효성분으로 포함하는 면역 억제제 또는 자가면역질환 또는 이식거부의 예방 및/또는 치료용 조성물을 제공한다. 다른 예는 상기 제조 방법에 의하여 제조된 CD8+ Treg를 면역 억제 또는 자가면역질환 또는 이식거부의 예방 및/또는 치료를 필요로 하는 개체에 투여하는 단계를 포함하는 면역 억제 방법 또는 자가면역질환 또는 이식거부의 예방 및/또는 치료 방법을 제공한다.
본 명세서는 종양 및 종양 환경에서 Foxp3를 발현하는 수지상 세포가 유도되고, 이로 인하여 종양 내 CD8+ Treg가 유도되며, 이들 세포의 유도에 의하여 종양을 제거하기 위해 몰려드는 CTL의 활성이 억제되어 종양이 지속적으로 성장하게 되고, Foxp3를 발현하는 수지상 세포를 제거할 경우 CTL 활성을 억제하는 CTLA4 발현이 감소하여 종양특이적 CTL 활성이 억제되지 않아서 효과적인 항암면역을 유도하고 종양성장을 현저하게 저해할 수 있음을 확인하여, Foxp3를 발현하는 수지상 세포의 암 진단 및/또는 치료에 있어서의 용도와 Foxp3를 발현하는 수지상 세포를 제거함으로써 암을 치료하는 기술을 제안한다.
이에, 일 예는 Foxp3를 발현하는 수지상 세포의 암 치료 타겟으로서의 용도를 제공한다.
다른 예는 Foxp3를 발현하는 수지상 세포의 저해제를 유효성분으로 포함하는 암 치료용 약학 조성물을 제공한다. 상기 Foxp3를 발현하는 수지상 세포는 암 환자의 종양 조직 또는 혈액에 존재하는 것일 수 있으며, 상기 암 치료용 약학 조성물은 종양 조직 또는 혈액에서 Foxp3를 발현하는 수지상 세포가 검출된 암 환자에게 투여하기 위한 것이 수 있다.
다른 예는 Foxp3를 발현하는 수지상 세포의 저해제의 암 치료에 사용하기 위한 용도를 제공한다. 상기 암 치료에 사용하기 위한 용도는 종양 조직 또는 혈액에서 Foxp3를 발현하는 수지상 세포가 검출된 암 환자에게 적용하기 위한 것일 수 있다.
다른 예는 Foxp3를 발현하는 수지상 세포의 저해제의 약학적 유효량을 암 환자에게 투여하거나, 상기 환자(예컨대, 환자의 혈액 및/또는 종양조직 등)로부터 Foxp3를 발현하는 수지상 세포를 제거하는 단계를 포함하는, 암 치료 방법을 제공한다. 상기 암 환자는 종양 조직 또는 혈액에서 Foxp3를 발현하는 수지상 세포가 검출된 암 환자일 수 있다.
다른 예는 Foxp3를 발현하는 수지상 세포의 저해제를 유효성분으로 포함하는 CD8을 발현하는 조절 T 세포 (CD8+ Treg) 저해용 약학 조성물을 제공한다. 다른 예는 Foxp3를 발현하는 수지상 세포의 저해제의 CD8을 발현하는 조절 T 세포 저해에 사용하기 위한 용도를 제공한다. 다른 예는 Foxp3를 발현하는 수지상 세포의 저해제를 CD8을 발현하는 조절 T 세포 저해를 필요로 하는 환자에게 투여하거나, 상기 환자(예컨대, 환자의 혈액 및/또는 종양조직 등)로부터 Foxp3를 발현하는 수지상 세포를 제거하는 단계를 포함하는, CD8+ Treg 저해 방법을 제공한다. 상기 CD8을 발현하는 조절 T 세포는 Foxp3를 발현하는 수지상 세포에 의하여 암 환자의 혈액내에서 유도되는 것일 수 있다. 상기 환자는 암환자, 예컨대, 종양 조직 또는 혈액에서 Foxp3를 발현하는 수지상 세포가 검출된 암 환자 또는 종양 조직 또는 혈액에서 Foxp3를 발현하는 수지상 세포에 의하여 CD8을 발현하는 조절 T 세포가 유도된 환자일 수 있다.
다른 예는 CD8을 발현하는 조절 T 세포 (CD8+ Treg)의 암 치료 타겟으로서의 용도를 제공한다.
다른 예는 CD8을 발현하는 조절 T 세포의 저해제를 유효성분으로 포함하는 암 치료용 약학 조성물을 제공한다. 상기 암 치료용 약학 조성물은 종양 조직 또는 혈액에서 CD8을 발현하는 조절 T 세포가 검출된 암 환자에게 투여하기 위한 것일 수 있다.
다른 예는 CD8을 발현하는 조절 T 세포의 저해제의 암 치료에 사용하기 위한 용도를 제공한다. 상기 암 치료에 사용하기 위한 용도는 종양 조직 또는 혈액에서 CD8을 발현하는 조절 T 세포가 검출된 암 환자에게 적용하기 위한 것일 수 있다.
다른 예는 CD8을 발현하는 조절 T 세포의 저해제의 약학적 유효량을 암 환자에게 투여하거나 상기 환자(예컨대, 환자의 혈액 및/또는 종양조직 등)로부터 CD8을 발현하는 조절 T 세포를 제거하는 단계를 포함하는, 암 치료 방법을 제공한다. 상기 암 환자는 종양 조직 또는 혈액에서 CD8을 발현하는 조절 T 세포가 검출된 암 환자일 수 있다.
다른 예는 후보 화합물을 Foxp3를 발현하는 수지상 세포, CD8+ CD8을 발현하는 조절 T 세포, 또는 이들 모두와 접촉시킨 후 Foxp3를 발현하는 수지상 세포 및/또는 CD8을 발현하는 조절 T 세포의 수준이 감소한 경우, 상기 후보 화합물을 항암제 후보 물질로 결정하는 단계를 포함하는, 항암제 스크리닝 방법을 제공한다. 구제적으로, 상기 스크리닝 방법은, (1) 후보 화합물을 Foxp3를 발현하는 수지상 세포, CD8을 발현하는 조절 T 세포, 이들 모두, 또는 이들을 포함하는 생물학적 시료 (예컨대, 혈액, 혈구, 종양 조직 등)와 접촉시키는 단계; 및 (2) Foxp3를 발현하는 수지상 세포 및/또는 CD8을 발현하는 조절 T 세포의 수준을 측정하는 단계를 포함할 수 있다. 상기 항암제 스크리닝 방법은, 상기 단계 (2) 이후에, 단계 (2)에서 측정된 Foxp3를 발현하는 수지상 세포 및/또는 CD8을 발현하는 조절 T 세포의 수준을 후보 화합물 처리 전의 Foxp3를 발현하는 수지상 세포 및/또는 CD8을 발현하는 조절 T 세포의 수준과 비교하는 단계 (단계 (3))를 추가로 포함할 수 있다. 또한 상기 항암제 스크리닝 방법은, 상기 단계 (2) 또는 단계 (3) 이후에, 단계 (2)에서 측정된 Foxp3를 발현하는 수지상 세포 및/또는 CD8을 발현하는 조절 T 세포의 수준이 후보 화합물 처리 전의 Foxp3를 발현하는 수지상 세포 및/또는 CD8을 발현하는 조절 T 세포의 수준보다 감소한 경우, 상기 후보 화합물을 항암제 후보 물질로 결정하는 단계 (단계 (4))를 추가로 포함할 수 있다. 상기 스크리닝 방법의 각 단계는 생체 외 (in vitro)에서 진행되는 것일 수 있다. 또한, 상기 Foxp3를 발현하는 수지상 세포 및/또는 CD8를 발현하는 조절 T 세포는 생체로부터 분리된 세포일 수 있다.
다른 예는 Foxp3를 발현하는 수지상 세포의 검출가능한 제제를 포함하는 암 진단용 조성물을 제공한다. 다른 예는 환자로부터 분리된 생물학적 시료에서 Foxp3를 발현하는 수지상 세포를 검출하는 단계를 포함하는, 암의 진단 또는 예후 확인 방법 또는 암의 진단 또는 예후 확인에 정보를 제공하는 방법을 제공한다. 상기 암의 진단 또는 예후 확인 방법은, 상기 검출하는 단계 이후에 상기 생물학적 시료에서 Foxp3를 발현하는 수지상 세포가 검출되는 경우 (존재하는 경우), 상기 환자를 암 환자로 결정하는 단계, 또는 Foxp3를 발현하는 수지상 세포 수준 변화에 따라서 암의 진행 정도를 확인 하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 상기 암 진단 방법에 있어서, 생물학적 시료는 암의 발생 후 예후를 추정의 추정 확인을 필요로 하는 인간 등의 포유 동물로부터 분리된 혈액, 혈구 등을 포함하는 것일 수 있다. 일 예에서, 상기 암 진단 방법은, 상기 암 환자로 결정하는 단계 이후에, 상기 암환자로 결정된 환자에게 Foxp3를 발현하는 수지상 세포 저해제 및 CD8을 발현하는 조절 T 세포 저해제로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 약학적 유효량을 투여하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
상기 암의 예후 확인 방법에 있어서, 생물학적 시료는 암의 예후 (진행 상태)를 확인 (모니터링)하고자 하는 암 환자로부터 분리된 혈액, 혈구, 종양 조직 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다. 상기 암의 예후 확인 방법에서, 암 환자에서 분리된 생물학적 시료에서의 Foxp3를 발현하는 수지상 세포 수준을 서로 다른 2 이상의 시점에서 측정하여, 어느 한 시점에서 측정한 Foxp3를 발현하는 수지상 세포 수준이 이전 시점에서 측정된 수준보다 높은 경우, 상기 암 환자에서 암이 악화되거나 암 진행이 빨라지고 있는 것으로 확인할 수 있으며, 어느 한 시점에서 측정한 Foxp3를 발현하는 수지상 세포 수준이 이전 시점에서 측정된 수준보다 낮은 경우, 상기 암 환자에서 암이 완화되거나 암 진행이 느려지고 있는 것으로 확인할 수 있다. 상기 암 예후 확인 방법은, (1) 암 환자에서 분리된 생물학적 시료에서의 Foxp3를 발현하는 수지상 세포 수준을 서로 다른 2 이상의 시점에서 측정하는 단계, 및 (2) 어느 한 시점에서 측정한 Foxp3를 발현하는 수지상 세포 수준이 이전 시점에서 측정된 수준보다 높은 경우, 상기 암 환자에서 암이 악화되거나 암 진행이 빨라지고 있는 것으로 확인하거나, 어느 한 시점에서 측정한 Foxp3를 발현하는 수지상 세포 수준이 이전 시점에서 측정된 수준보다 낮은 경우, 상기 암 환자에서 암이 완화되거나 암 진행이 느려지고 있는 것으로 확인하는 단계를 포함하는 것일 수 있다.
상기 암 예후의 확인 방법은 항암 치료 (예컨대, 항암제 투여) 중인 암 환자에서의 항암 치료 효능 모니터링(항암치료 후 예후 모니터링)에 적용될 수 있다. 이에, 본 발명의 다른 예는 Foxp3를 발현하는 수지상 세포의 검출 가능한 제제를 포함하는 항암 치료 효능 확인(모니터링)용 조성물을 제공한다. 다른 예는 환자로부터 분리된 생물학적 시료에서 Foxp3를 발현하는 수지상 세포를 검출하는 단계를 포함하는, 항암 치료 효능 확인(모니터링) 방법 또는 항암 치료 효능 확인(모니터링)에 정보를 제공하는 방법을 제공한다. 상기 항암 치료 효능 확인(모니터링) 방법에 있어서, 상기 환자는 항암 치료를 받은 환자일 수 있고, 상기 항암 치료는 항암제 투여와 같은 화학적 요법, 유전자 치료 생물학적 요법, 방사선 치료 등의 물리학적 요법, 외과적 수술 등으로 이루어진 모든 통상적인 항암 치료 중에서 선택된 하나 또는 두 가지 이상의 복합 요법일 수 있으며, 생물학적 시료는 항암 치료 효능을 확인하고자 하는 암 환자로부터 분리된 혈액, 혈구, 종양 조직 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다. 상기 항암 치료 효능 확인 방법에서, 항암 치료받은 암 환자에서 분리된 생물학적 시료에서의 Foxp3를 발현하는 수지상 세포 수준을 측정하여, 상기 항암 치료를 받기 전보다 증가한 경우, 상기 항암 치료가 상기 암 환자에서 항암 효과가 없는 것으로 확인할 수 있으며, 상기 항암 치료를 받기 전보다 감소한 경우, 상기 항암 치료가 상기 암 환자에서 항암 효과가 있는 것으로 확인할 수 있다. 상기 항암 치료 효능 확인 방법은, (1) 암 환자에서 분리된 생물학적 시료에서의 Foxp3를 발현하는 수지상 세포 수준을 상기 암 환자에 항암 치료를 하기 전과 후에 측정하는 단계, 및 (2) 항암 치료 후에 측정한 Foxp3를 발현하는 수지상 세포 수준이 항암 치료 전에 측정된 수준보다 높은 경우, 상기 항암 치료가 상기 암 환자에서 효과가 없는 것으로 확인하거나, 항암 치료 후에 측정한 Foxp3를 발현하는 수지상 세포 수준이 항암 치료 전에 측정된 수준보다 낮은 경우, 상기 항암 치료가 상기 암 환자에서 효과가 있는 것으로 확인하는 단계를 포함하는 것일 수 있다. 상기 Foxp3를 발현하는 수지상 세포 수준을 측정하는 시기로서의 "항암 치료 후"는 항암 치료 직후부터 2개월까지의 기간 (예컨대, 항암치료 직후 내지 8주일, 항암치료 직후 내지 7주일, 항암치료 직후 내지 6주일, 항암치료 직후 내지 5주일, 항암치료 직후 내지 4주일, 항암치료 직후 내지 3주일, 항암치료 직후 내지 2주일, 또는 항암치료 직후 내지 1주일) 중에서 하나 이상 선택된 임의의 시점일 수 있다. 상기 항암 치료 효능 확인 방법은, 상기 단계 (3) 이후에, (4) 항암 치료 후에 측정한 Foxp3를 발현하는 수지상 세포 수준이 항암 치료 전에 측정된 수준보다 높은 경우 (상기 항암 치료가 상기 암 환자에서 효과가 없는 것으로 확인되는 경우), 상기 암 환자에 항암 치료를 중단하거나 다른 항암 치료를 적용하거나, 항암 치료 후에 측정한 Foxp3를 발현하는 수지상 세포 수준이 항암 치료 전에 측정된 수준보다 낮은 경우 (상기 항암 치료가 상기 암 환자에서 효과가 있는 것으로 확인되는 경우), 상기 항암 치료를 유지하거나 강화하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 상기 항암 효과는 암 세포 사멸 또는 증식 억제, 암 조직 소멸 또는 크기 감소, 암 전이 억제 등의 암의 증상을 제거 또는 완화(호전)시키는 모든 event일 수 있다.
다른 예는 Foxp3를 발현하는 수지상 세포와 CD8을 발현하는 T 세포를 함께 배양하는 단계를 포함하는 CD8을 발현하는 조절 T 세포 (CD8+ Treg)의 제조 방법을 제공한다. 상기 배양하는 단계는 Foxp3를 발현하는 수지상 세포와 CD8을 발현하는 T 세포를, 세포 수 기준으로, 1:0.1 내지 10, 1:0.1 내지 8, 1:0.1 내지 6, 1:0.1 내지 4, 1:0.1 내지 2, 1:0.1 내지 1, 1:0.3 내지 10, 1:0.3 내지 8, 1:0.3 내지 6, 1:0.3 내지 4, 1:0.3 내지 2, 1:0.3 내지 1, 1:0.5 내지 10, 1:0.5 내지 8, 1:0.5 내지 6, 1:0.5 내지 4, 1:0.5 내지 2, 1:0.5 내지 1, 1:0.8 내지 10, 1:0.8 내지 8, 1:0.8 내지 6, 1:0.8 내지 4, 1:0.8 내지 2, 1:0.8 내지 1, 1:1 내지 10, 1:1 내지 8, 1:1 내지 6, 1:1 내지 4, 또는 1:1 내지 2(Foxp3를 발현하는 수지상 세포의 수:CD8을 발현하는 T 세포의 수)의 비율로 함께 배양하여 수행될 수 있다.
다른 예는 상기 Foxp3를 발현하는 수지상 세포와 CD8을 발현하는 T 세포를 공배양하여 생성된 CD8을 발현하는 조절 T 세포를 제공한다. 상기 CD8을 발현하는 조절 T 세포는 앞서 설명한 CD8을 발현하는 조절T 세포의 제조 방법에 의하여 제조된 것일 수 있다.
다른 예는 Foxp3를 발현하는 수지상 세포와 CD8을 발현하는 T 세포를 공배양하여 생성된 CD8을 발현하는 조절 T 세포의 면역 억제 및/또는 자가면역질환 또는 이식거부의 예방 및/또는 치료에 사용하기 위한 용도를 제공한다. 상기 CD8을 발현하는 조절 T 세포는 앞서 설명한 CD8을 발현하는 조절 T 세포의 제조 방법에 의하여 제조된 것일 수 있다. 다른 예는 상기 제조 방법에 의하여 제조된 CD8을 발현하는 조절 T 세포를 유효성분으로 포함하는 면역 억제제 또는 자가면역질환 또는 이식거부의 예방 및/또는 치료용 조성물을 제공한다. 다른 예는 상기 제조 방법에 의하여 제조된 CD8을 발현하는 조절 T 세포를 면역 억제 또는 자가면역질환 또는 이식거부의 예방 및/또는 치료를 필요로 하는 개체에 투여하는 단계를 포함하는 면역 억제 방법 또는 자가면역질환 또는 이식거부의 예방 및/또는 치료 방법을 제공한다. 상기 자가면역질환은 류마티즘, 루프스병, 자가면역성 간염, 자가면역성 용혈성 질환 등에서 선택된 것일 수 있다.
이하, 본 발명을 보다 상세히 설명한다.
Foxp3 (Forkhead box P3, scurfin라고도 불림)은 면역계 반응에 관여하는 단백질로서, 조절 T 세포의 발달 및 기능의 조절 경로의 주요 조절 인자로서 기능을 한다. Foxp3는 인간, 원숭이 등의 영장류, 래트, 마우스 등의 설치류를 포함하는 포유 동물에서 유래하는 것일 수 있으며, 예컨대, 인간 Foxp3 (예컨대, GenBank Accession No. NP_001107849.1 (유전자 (mRNA): NM_001114377.1), NP_054728.2 (유전자 (mRNA): NM_014009.3) 등), 마우스 Foxp3 (예컨대, GenBank Accession No. NP_001186276.1 (유전자 (mRNA): NM_001199347.1), NP_001186277.1 (유전자 (mRNA): NM_001199348.1), NP_473380.1 (유전자 (mRNA): NM_054039.2) 등)일 수 있다. 일 예에서, Foxp3는 서열번호 1의 아미노산 서열(MPNPRPAKPMAPSLALGPSPGVLPSWKTAPKGSELLGTRGSGGPFQGRDLRSGAHTSSSLNPLPPSQLQLPTVPLVMVAPSGARLGPSPHLQALLQDRPHFMHQLSTVDAHAQTPVLQVRPLDNPAMISLPPPSAATGVFSLKARPGLPPGINVASLEWVSREPALLCTFPRSGTPRKDSNLLAAPQGSYPLLANGVCKWPGCEKVFEEPEEFLKHCQADHLLDEKGKAQCLLQREVVQSLEQQLELEKEKLGAMQAHLAGKMALAKAPSVASMDKSSCCIVATSTQGSVLPAWSAPREAPDGGLFAVRRHLWGSHGNSSFPEFFHNMDYFKYHNMRPPFTYATLIRWAILEAPERQRTLNEIYHWFTRMFAYFRNHPATWKNAIRHNLSLHKCFVRVESEKGAVWTVDEFEFRKKRSQRPNKCSNPCP)을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
수지상 세포 (dendritic cell; DC)는 포유류의 면역계를 구성하는 면역 세포로, 항원전달세포로서 기능한다. 본 명세서에서, 수지상 세포는 인간, 원숭이 등의 영장류, 래트, 마우스 등의 설치류를 포함하는 포유 동물에서 유래하는 것일 수 있으며, 일 예에서, 포유 동물, 예컨대, 인간 (예컨대, 암 환자)의 혈액(또는 혈구)에서 유래(분리)된 것일 수 있다.
Foxp3를 발현하는 수지상 세포의 저해제는 투여 대상 (환자의 체내 (예컨대, 암 환자 생체 내 혈액 및/또는 종양 조직), 환자로부터 분리된 생물학적 시료 (예컨대, 분리된 혈액 및/또는 종양 조직))에서 Foxp3를 발현하는 수지상 세포의 수준을 낮추거나, 사멸시키거나, 제거할 수 있는 모든 제제들 중에서 선택될 수 있으며, 예컨대, Foxp3를 발현하는 수지상 세포에 특이적인 항체, 세포독성 약물(cytotoxic drugs), 항체-세포독성 약물 접합체, 항체-자성입자 복합체 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상이 저해제, 또는 상기 저해제를 포함하는 나노전달체 (nano delivery system)등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 나노전달체는 상기 저해제를 봉입 또는 전달할 수 있는 나노 크기 (예컨대, 1-1000nm)의 입자를 의미하는 것으로, 그 재질은 단백질, 지질, 및 그 외의 생체적합성 또는 생분해성 고분자로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있고, 모양에는 제한이 없다.
CD8 (cluster of differentiation 8)은 T 세포 수용체 (T cell receptor; TCR)에 대하여 co-receptor 역할을 하는 막통과 당단백질로서, MHC (major histocompatibility complex) 분자에 결합하고, class I MHC 단백질에 특이적이다. CD8은 인간, 원숭이 등의 영장류, 래트, 마우스 등의 설치류를 포함하는 포유 동물에서 유래하는 것일 수 있으며, 예컨대, 인간 CD8 (예컨대, GenBank Accession No. NP_001139345.1 (유전자 (mRNA): NM_001145873.1), NP_001759.3 (유전자 (mRNA): NM_001768.6), NP_741969.1 (유전자 (mRNA): NM_171827.3), NP_001171571.1 (유전자 (mRNA): NM_001178100.1), NP_004922.1 (유전자 (mRNA): NM_004931.4), NP_742099.1 (유전자 (mRNA): NM_172101.3), NP_742100.1 (유전자 (mRNA): NM_172102.3), NP_757362.1 (유전자 (mRNA): NM_172213.3) 등)일 수 있다.
T 세포는 항원특이적인 적응 면역을 주관하는 림프구의 일종이다. 조절 T 세포(regulatory T cell; Treg)는 면역계를 조절하는 T 세포들 중 한 집단으로, 자가항원에 대한 관용을 유지하고 자가면역 질병을 억제하는 것으로 알려져 있다. 본 명세서에서, CD8+ T 세포와 CD8+ 조절 T 세포는 인간, 원숭이 등의 영장류, 래트, 마우스 등의 설치류를 포함하는 포유 동물에서 유래하는 것일 수 있으며, 일 예에서, 포유 동물, 예컨대, 인간(예컨대, 암 환자)의 혈액에서 유래(분리)된 것일 수 있다.
CD8을 발현하는 조절 T 세포의 저해제는 투여 대상 (환자의 체내 (예컨대, 암 환자 생체 내 혈액 및/또는 종양 조직), 환자로부터 분리된 생물학적 시료 (예컨대, 분리된 혈액 및/또는 종양 조직))에서 CD8을 발현하는 조절 T 세포의 수준을 낮추거나 제거할 수 있는 모든 제제들 중에서 선택될 수 있으며, 예컨대, CD8을 발현하는 조절 T 세포에 특이적인 항체, 세포독성 약물, 항체-세포독성 약물 접합체, 항체-자성입자 복합체 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상이 저해제, 또는 상기 저해제를 포함하는 나노전달체 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 나노전달체는 상기 저해제를 봉입 또는 전달할 수 있는 나노 크기 (예컨대, 1-1000nm)의 입자를 의미하는 것으로, 그 재질은 단백질, 지질, 및 그 외의 생체적합성 또는 생분해성 고분자로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있고, 모양에는 제한이 없다.
본 명세서에 사용된 바로서, 환자는 인간, 원숭이 등의 영장류, 마우스, 래트 등의 설치류 등을 포함하는 포유 동물, 또는 상기 포유 동물로부터 분리된 세포 또는 조직 (예컨대, 혈액, 혈구, 종양 조직)일 수 있다. 일 예에서, 상기 환자는 암 환자 또는 암 환자로부터 분리된 세포 또는 조직 (예컨대, 혈액, 혈구, 종양 조직)일 수 있다. 예컨대, 상기 환자는 종양 조직 또는 혈액에서 Foxp3를 발현하는 수지상 세포, CD8을 발현하는 조절 T 세포, 또는 이들 모두가 검출된 암 환자일 수 있다.
또한, 암 진단에 사용되는 생물 시료는 환자(인간, 원숭이 등의 영장류, 마우스, 래트 등의 설치류 등을 포함하는 포유 동물 중에서 선택)로부터 분리된 세포, 조직, 체액 (예컨대, 혈액, 혈구, 종양 조직 등) 등일 수 있다.
본 발명의 치료 및/또는 진단의 적용이 가능한 암은 모든 고형암 및 혈액암 중에서 선택될 수 있다. 예컨대, 상기 암은 편평상피세포암, 폐암 (예컨대, 소세포폐암, 비소세포폐암, 폐선암, 폐의 편평상피암 등), 복막암, 피부암, 직장암, 항문부근암, 식도암, 소장암, 내분비선암, 부갑상선암, 부신암, 연조직 육종, 요도암, 만성 또는 급성 백혈병, 림프종, 간암, 위암, 췌장암, 경부암, 난소암, 방광암, 유방암, 결장암, 대장암, 자궁내막암, 자궁암, 침샘암, 전립선암, 음문암, 갑상선암, 두경부암, 뇌암, 골육종, 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 일 예에서, 상기 암은 대장암, 위암, 폐암, 췌장암, 유방암 등의 고형암, 및/또는 림프종, 백혈병 등의 혈액암일 수 있다. 상기 암은 원발성 암 또는 전이성 암일 수 있다.
본 명세서에의 암 치료는 암세포의 성장을 억제 또는 암세포를 소멸(제거)시키는 효과뿐 아니라, 암세포의 이동(migration), 침습(invasion), 전이(metastasis) 등을 억제하여 이로 인한 암의 악화를 억제하는 효과도 포함한다.
상기 Foxp3를 발현하는 수지상 세포의 검출 가능한 제제는 Foxp3를 발현하는 수지상 세포와 특이적으로 결합 가능한 모든 화합물 (예컨대, 소분자 화합물, 항체 등) 중에서 선택될 될 수 있으며, 예컨대, 수지상세포 내에서 Foxp3에 특이적으로 결합하는 소분자 화합물, 항체 중에서 선택된 1종 이상 및Foxp3를 발현하는 수지상 세포의 표면 단백질에 특이적으로 결합하는 소분자 화합물, 항체, 또는 이들(항체 및/또는 소분자 화합물)을 포함하는 나노전달체 중에서 선택된 1종 이상의 조합일 수 있다..
상기 CD8을 발현하는 조절 T 세포의 검출 가능한 제제는 CD8을 발현하는 조절 T 세포와 특이적으로 결합 가능한 모든 화합물 (예컨대, 소분자 화합물, 항체, 나노전달체 등) 중에서 선택될 될 수 있으며, 예컨대, CD8 조절 T 세포의 표면 단백질에 특이적으로 결합하는 소분자 화합물, 항체 중에서 선택된 1종 이상의 조합일 수 있다..
상기 Foxp3를 발현하는 수지상 세포의 검출 가능한 제제 및/또는 CD8을 발현하는 조절 T 세포의 검출 가능한 제제는 통상적인 방법(예컨대, 효소 반응, 형광, 발광 및/또는 방사선 검출 등)으로 탐지 가능한 통상적인 표지 물질로 표지된 것일 수 있다. 예컨대, 상기 표지 물질은 형광 물질(예컨대, 형광 화학 염료, 형광 단백질 등), 발광물질, 방사성동위원소 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 일 예에서, Foxp3를 발현하는 수지상 세포의 검출 및/또는 CD8을 발현하는 조절 T 세포의 검출은 유세포 분석법(Flow cytometry), FACS(fluorescence-activated cell sorting), 면역크로마토그래피(Immunochromatography), 면역조직화학염색, 효소결합 면역흡착분석(enzyme linked immunosorbent assay: ELISA), 방사선 면역측정법(radioimmunoassay: RIA), 효소 면역분석(enzyme immunoassay: EIA), 형광면역분석(Floresence immunoassay: FIA), 발광면역분석(luminescence immunoassay: LIA), 웨스턴블라팅(Western blotting) 등에서 선택된 방법을 사용하여 수행될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 항암제 스크리닝 방법에 있어서, 후보 화합물은 각종 화합물, 예컨대, 소분바 화합물 (chemicals), 단백질, 폴리펩타이드, 올리고펩타이드, 폴리뉴클레오타이드, 올리고뉴클레오타이드, 식물 또는 동물의 추출물 등으로 이루어진 군에서 선택된 것일 수 있다.
종양 또는 종양 환경 (예컨대 암 환자의 혈액) 내의 Foxp3를 발현하는 수지상 세포 및/또는 이에 의하여 유도된 CD8+ Treg의 암 진단 마커 및/또는 암치료 타겟으로서의 용도가 제공되며, 이는 암의 진단, 치료 및 항암제 연구, 항암치료 후 예후 모니터링 등의 다양한 분야에 유용하게 적용될 수 있다.
도 1은 종양성장 중의 종양 마우스 모델의 혈액 내 Foxp3 발현 수지상 세포 (fxDC)의 비율 (% of fxDC/CD11c+DC)을 보여주는 그래프이다 (Paired one-way ANOVA without multiple comparison correction).
도2a는 정상인과 암환자의 혈액에서 fxDC 분포(% of fxDC/b-DC)를 보여주는 그래프이다 (n=30 human samples, unpaired one-way ANOVA without multiple-comparisons correction).
도 2b는 여러 마우스 종양모델 혈액에서 fxDC의 분포를 보여주는 그래프이다 (EL4; lymphoma, B16; melanoma, LLC; Lewis lung carcinoma, 266-6; pancreatic cancer, CT-26; colon cancer, 4T-1; breast cancer, RENCA; renal cancer). n= 5 to 7 mice per tumor model, unpaired one-way ANOVA without multiple-comparisons correction).
도 3은 수지상 세포 특이적 Foxp3 제거 마우스(CD11c-Cre x Foxp3fl/fl: 이하 Foxp3cKO 마우스) 및 floxed littermates (Foxp3fl/fl)의 혈액 내의 FxDCs 분포를 보여주는 결과이다.
도 4는 WT 마우스(Foxp3fl/fl)와 Foxp3cKO마우스에서 종양 부피 변화를 보여주는 그래프(좌) 및 종양무게를 보여주는 그래프(우)이다 (n=5 mice each, unpaired one-tailed t-test.)
도 5는 WT 마우스와 Foxp3cKO 마우스 종양조직 내 fxDC 확인결과를 보여준다 (E=5, unpaired one-tailed t-test. ***p<0.001).
도 6은 WT 마우스와 Foxp3cKO 마우스에서의 다양한 고형암의 종양 부피 변화를 보여주는 그래프이다.
도 7은 Foxp3cKO마우스의 종양조직 내 cytotoxic CD8+ T-세포의 비율을 나타낸 그래프이다 (n=3, unpaired one-tailed t-test).
도 8은 Foxp3cKO마우스의 종양조직 내 CD8+ T-cell의 종양세포에 대한 세포독성을 CTL(Cytotoxic T Lymphocytes)의 활성으로 확인한 결과를 보여주는 그래프이다(n=3, unpaired one-tailed t-test).
도 9는 WT 마우스와 Foxp3cKO 마우스의 종양조직 내 CD8+ T세포에서 CTLA4(cytotoxic T-lymphocyte-associated protein 4) 발현 수준을 보여주는 결과이다.
도 10은 야생형 마우스와 Foxp3cKO 마우스의 종양 조직에서의 CD8+ T 세포 중의 CTLA4 발현 CD8+ T 세포 (CTLA4+ CD8+ T 세포)의 비율을 보여주는 그래프이다(unpaired one-tailed t-test, **p<0.01 and ***p<0.001).
도 11은 EL4 종양으로부터 분리된 CTLA4+ CD8+ T 세포와 CTLA4- CD8+ T 세포의 종양세포(EL4)를 표적으로 하는 CTL 활성을 나타낸 그래프이다(unpaired one-tailed t-test).
도 12는 fxDC와 CD8+T세포의 공배양 후의 Foxp3+ CD8+ Treg 분포를 보여주는 결과이다(unpaired one-tailed t-test).
도 13은 fxDC와 foxp3가 제거된 DC의 CD4/8 Treg 유도능 확인 a. Pre-activated T cells of Foxp3GFP mice were co-cultured with splenic DCs (spDC), blood DCs (bDC) and fxDC-depleted (DT-treated) bDCs (bDC/DT) of TB Foxp3DTR mice (p3/E, for b-DCs), and examined the population of Foxp3+ CD4+ and CD8+ T cells. E=3, unpaired two-way ANOVA with multiple comparisons.
도 14는 TB 마우스의 혈액 내의 fxDC 및 CD8+ Tregs 세포 비율을 나타낸 그래프이다 (n=27).
도 15는 야생형 마우스와 Foxp3cKO 마우스 종양조직 내 CD4+/CD8+Treg 분포를 보여주는 결과이다(unpaired two-way ANOVA with multiple comparisons).
도 16은 T 세포와 CD8+/CD4+ Treg 세포의 공배양 후의 T 세포 증식 정도를 보여준다.
도 17은 T 세포와 CD8+/CD4+ Treg 세포의 공배양 후의 IFN-gamma+ T 세포 수준을 보여주는 결과이다 (unpaired one-way ANOVA with multiple-comparisons correction. *p<0.05, **p<0.01).
도 18은 CD8+ Treg와 CD8+ T 세포의 공배양 후의 CTLA4 발현 T 세포 수준을 보여주는 결과이다(unpaired one-tailed t-test, *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001).
도 19는 야생형 CD8+ T 세포를 DT-처리 tu-CD8+ T-세포 또는 PBS-처리 tu-CD8+ T-세포와 공배양한 후의 CTLA4+ CD8+ T 세포 수준을 측정한 결과를 보여준다(n=3, unpaired one-tailed t-test).
이하에서는 실시예를 들어 본 발명을 더욱 구체적으로 설명하고자 하나, 이는 예시적인 것에 불과할 뿐 본 발명의 범위를 제한하고자 함이 아니다. 아래 기재된 실시예들은 발명의 본질적인 요지를 벗어나지 않는 범위에서 변형될 수 있음은 당 업자들에게 있어 자명하다.
참고예
1. 마우스 준비
7-10 주령의 야생형 C57BL6 및 BALB/c 마우스, 및 유전자 변형된 C57BL6-OT-1, C57BL6-Foxp3GFP [Foxp3+ 세포에서 Foxp3-녹색형광 단백질(GFP) 융합단백질을 발현하는 Foxp3-GFP 리포터 마우스], C57BL6-Foxp3DTR [Foxp3 프로모터의 조절 하에서 Foxp3-암호화 엑손을 대신하여 디프테리아 독소 수용체(dephtheria toxin receptor; DTR)를 발현하는 Foxp3-DTR 형질전환(Tg) 마우스], C57BL6-Foxp3DTR-GFP(C57BL6-Foxp3DTR 마우스를 C57BL6-Foxp3GFP 마우스와 3세대 동안 역교배하여 제작함), C57BL6-Foxp3-floxed (Foxp3fl/fl), CD11c-Foxp3cKO (CD11c-cre 마우스와 Foxp3fl/fl 마우스를 교배하여 제작된 C57BL6-Foxp3cKO 마우스),
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(RAG1·/·), 및 CD11c-cre 마우스를 하기 시험에 사용하였다. C57BL6-OT-1, Foxp3GFP, Foxp3DTR, Rag1-/-, 및 CD11c-cre 마우스는 Jackson Laboratory (Bar Harbor, Sacramento, CA)에서 구입 하였다. Foxp3-floxed (C57BL6-Foxp3fl/fl) 마우스는 "A. Rudensky, Memorial Sloan Kettering Cancer Center, NY"에서 제공받았다. 모든 마우스는 "Institute/University Animal Care and Use guidelines"에 따라서 SPF (specific pathogen-free) 동물보호시설 (성균관대학교)에서 유지 관리되었고 본 실험을 위해 별도의 animal care chamber에 옮겨 동일 조건에서 co-housing 하여 사용하였다. DTR 마우스에는 기존에 보고된 방법으로 디프테리아 독소 (diphtheria toxin; DT)를 처리하였다 (참조문헌: "Kim, J. et al. Cutting edge: depletion of Foxp3+ cells leads to induction of autoimmunity by specific ablation of regulatory T cells in genetically targeted mice. J Immunol 183, 7631-7634, doi:10.4049/jimmunol.0804308 (2009)" 및 "Penaloza-MacMaster, P. et al. Interplay between regulatory T cells and PD-1 in modulating T cell exhaustion and viral control during chronic LCMV infection. The Journal of experimental medicine 211, 1905-1918, doi:10.1084/jem.20132577 (2014)"). 간략히 설명하면, DT를 PBS에 녹인 다음, 혈액 채취 전 연속 3일간 (day-3, day-2 및 day-1) Foxp3DTR 또는 Foxp3DTR-GFP 마우스에 적절한 용량 (50㎍/kg) 200㎕을 i.p. 주사한 후, 상기 DT 처리 마우스의 혈액 또는 종양으로부터 CD11c+MHC+ 수지상 세포 (DC)를 분리하고, 하기 시험에 사용하였다.
2. 마우스 세포주 및 인간 primary cells의 준비
EL4 (C57BL/6 mouse-derived lymphoma), EG7 (OVA-expressing EL4), B16/F10 (C57BL/6 mouse-derived skin melanoma), 266-6 (C57BL/6 mouse-derived pancreatic acinar cell tumor), CT26 (BALB/c mouse-derived colon carcinoma), 4T-1 (BALB/c mouse-derived mammary carcinoma), 및 RENCA (BALB/c mouse-derived renal adenocarcinoma) 세포들은 ATCC (American Type Culture Collection)로부터 입수하였다. 삼성 의료원 IRB(#SMC 2016-04-057)의 승인을 받은 프로토콜에 따라서 악성종양환자(교모세포종 (GBM, stages 3 및 4), 결장암(colon cancer; CC, stage 2(CC2), 3(CC3) 및 4(CC4)) 및 위암 (GC, stage 2(GC2), 3(GC3) 및 4(GC4))와 건강한 기증자로부터 사람 말초 혈액 단핵 세포 (Human peripheral blood mononuclear cells; hPBMCs)를 채취하였다.
3. 마우스 종양 모델의 준비
야생형 (wt) 마우스 (C57BL6, BALB/c) 및 유전적 변형 마우스[C57BL6-Foxp3GFP, C57BL6-Foxp3DTR, C57BL6-Foxp3cKO (Foxp3fl/flxCD11c-cre)]의 오른쪽 옆구리 부위에 EL4/EG7, B16/F10, LLC, 266-6, CT-26, 4T-1 및 RENCA 세포를 5x105 cells의 양으로 주입하여, 마우스 종양 모델을 준비하였다.
3. 일차 면역세포 (primary immune cells)의 분리
Ficoll (GE Healthcare, Little Chalfont, UK) 및 Percoll (Sigma Aldrich, Chemie GmbH, Taufkirchen, Germany) 밀도구배 원심분리에 의하여, TB 마우스의 혈액 및 종양 조직으로부터 마우스 PBMCs 및 종양 침윤 백혈구(tumor infiltrated leukocytes; TILs)를 분리하였다. lineage+(CD3+/CD14+/CD19+) 세포의 고갈(depletion) 후, CD11c-microbeads(Miltenyi Biotech)를 사용하여 Foxp3GFP 마우스의 TILs 또는 PBMCs로부터 수지상 세포를 분리하였다. Foxp3cKO 마우스의 종양 크기가 작아서, 정상화(normalization) 후 단일 시험용으로 5 내지 10 마리의 TB Foxp3cKO 마우스로부터 분리한 TILs를 풀링(pooling)하였다 (p5/E 또는 p10/E로 표시). MDSCs(myeloid derived suppressor cells) subsets을 MDSC Isolation Kit (Miltenyi Biotec)를 사용하여 TB Foxp3GFP 마우스 또는 대조군 Foxp3GFP 마우스의 혈액으로부터 분리하였다. Foxp3+ fxDCs, cDCs, CD4+ Treg, CD8+ Tregs, CTLA4+/CTLA4- T-세포 및 CCR2+/CCR2- 세포는 BD FACSAria™II를 사용하여 Foxp3GFP 마우스의 혈액 또는 종양 조직으로부터 분리하였다. 모든 in vitro 시험 및 adoptive transfer (AT) 시험은 분리된 세포의 normalization 후 수행하였다.
4. 유세포 분석법(Flow cytometry)
표현형 분석을 위하여, 면역형광 염색법을 수행하였다. 세포들을 4℃에서 20분 동안 FACS buffer에서 적절한 항체로 염색하였다. FITC-표지된 항-마우스 항체 [Ly6g (1A8), CD11c (N418), I-A/I-E (M5/114.15.2), CD3 (17A2) 및 B220 (RA3-6B2)]는 Thermo Fisher-eBioscience (Waltham, MA, USA)로부터 입수하고, 항-마우스 CD14 (Sa14-2) 항체는 Biolegend (San Diego, CA, USA)로부터 입수하였다. PE(Phycoerythrin)-표지된 항-마우스 Foxp3 항체 (150D, Biolegend), 항-마우스 zbtb46 항체 (U4-1374, BD biosciences, San Jose, CA, USA), 및 PE-표지된 항-마우스 항체 [Ly6c (HK1.4), CD11c (N418), CD317 (BST2, 927), ki-67 (SolA15) 및 CD25 (PC61.5)]를 Thermo Fisher-eBioscience로부터 입수하였다. PerCP-Cy5.5-표지된 항-마우스 항체 [CD11b, Gr-1 (RB6-8C5), CD44 (IM7), Foxp3 (FJK-16s), I-A/I-E, CD11c 및 CD25 (PC61.5)], PE-Cy7-표지된 항-마우스 항체 [CD4 (GK1.5), CD8a (53-6.7), F4/80 (BM8), CD16/CD32 (93), Foxp3 (FJK-16s) 및 CD11c (N418)], APC-표지된 항-마우스 항체 [CD3 (17A2), CD14 (SA14-2), CD19 (1D3/CD19), Foxp3 (FJK-16s), CCR2 (475301), CTLA4 (UC10-4B9) and CD44 (IM7)] 및 Pacific blue-표지된 항-마우스 항체 [CD4 (GK1.5), CD8a (53-6.7), CD3 (17A2) 및 CD62L (MEL-14)]를 Thermo Fisher-eBioscience로부터 입수하였다. 모든 시료는 또한 이소형 대조 항체로 염색하였다. 세척 후, 세포들을 FACSCanto II (BD Biosciences, San Jose, CA, USA) 및 FACS DIVA software로 분석하였다. Foxp3, IFN-gamma(XMG1.2), perforin 및 Granzyme B에 대한 항체들은 Thermo Fisher-eBioscience에서 입수하였으며, 제조자 프로토콜에 따라서 세포 내 염색을 수행하였다.
5. Foxp3 발현 수지상 세포 (fxDCs)에 대한 FACS gating strategy
TB 마우스의 종양 및 혈액으로부터 마우스 PBMCs 및 TIL (tumor infiltrated leukocytes)을 분리하였다. 분리된 세포들은 적절한 항체를 사용하여 세포 염색 버퍼 내에서 염색하였다. 유세포 분석(flow cytometry)의 검출 채널에 따라서 각각의 gating strategy에 맞게 항체 패널을 최적화하여 설계하고 구축하였다. single-stained UltraComp eBeads (Affymetrix) 또는 세포를 사용하여 보정(Compensation)을 수행하였다. 모든 채널에 대하여, 양성 세포 및 음성 세포들을 Fluorescence Minus One controls (FMOs) 및 Isotype controls 기준으로 게이팅하고, Foxp3+는 Foxp3GFP 마우스의 경우 GFP littermate control를 사용하여 게이팅하고, wt TB 마우스의 경우 Foxp3+ 세포의 세포내 염색을 수행하였다. FxDC 게이팅은 다음과 같이 수행하였다; FVD+(Live cells), CD45+, Lineage (CD3/CD19/CD14; T-cells, B-cells and Monocytes)-negative, CD11c+, MHC II+ 및 Foxp3+, fxDCs의 모든 표현형 패널은 상기한 바와 같은 the gating strategy를 통하여 수행되었다. FVD: Fixable Viability Dye.
6. DC/T-세포의 공배양(co-culture)
TB Fopx3GFP 마우스의 비장으로부터 T 세포를 분리하고 정제하였다. TB Fopx3GFP 마우스 마우스의 비장을 RPMI 배지에서 균질화시키고, 70㎛ nylon cell strainer (BD Falcon)를 통과시킨 다음 ACK 용해 버퍼(Lonza)로 처리하여 T세포를 분리하였다. 상기 분리된 T 세포를 마우스 CD4 and CD8 T-cell Isolation Kit II (Miltenyi Biotech)를 사용하여 정제한 후, 37℃에서 1mM의 5, 6-carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE, Molecular Probes)(at 1 mM for 10 min), Cell Trace Violet (CTV, Invitrogen)(at 10 uM for 15 min), 또는 4-chlorobenzenesulfonate salt (DiD, Thermo fisher) (at 5uM for 15min)로 표지하였다. CFSE/CTV-표지된 T 세포를 항 CD3/CD28 항체 (알파-CD3 10㎍/ml, 알파-CD28 4㎍/ml)와 1일간 인큐베이팅한 다음, 5x105개의 T 세포를 fxDCs 또는 다른 DC subsets과 함께 1:5 (DC:T)의 비율로 3일 간 공배양하였다. 세포 증식은 유세포 분석법 (참고예 4 참조)로 측정하였다. OT-1(ovalbumin-specific, CD8+ T cells) T 세포와 함께 공배양한 경우, 비장 OT-1 T 세포는 OT-1 마우스로부터 준비하고, 상기한 바와 같이 표지하였다. 추가 자극 없이, CFSE-표지된 5x105 naive OT-1 T-세포를 Foxp3DTR 종양마우스로부터 분리하여 DT-처리한 (fxDC-고갈) bDCs, 또는 PBS-처리 (fxDC-함유) bDC, 또는 sp-DCs와 함께 1:5 (DC:T) 비율로 공배양하였다.
7. CTL (Cytotoxic T Lymphocytes) 분석
종양 이식 후 21일째에 Foxp3fl/fl 또는 Foxp8cKO TB 마우스의 종양 조직으로부터 분리한 CD8+ T-세포를 CTV-표지된 표적 세포 (1 x 105 EL4 cells)와 함께 상이한 비율로 24시간 동안 공배양하였다. PI 염색 후, 상기 참고예 4을 참조하여 유세포 분석법을 수행하여 CTL 활성을 분석하였다. 21일째에 Foxpfl/fl 또는 Foxp3cKO TB 마우스의 종양에서 분리된 tu-DCs을 splenic CD8+ T-세포와 1:5 (DC:T) 비율로 3일 동안 공배양하여 CTLs을 생성시킨 후, CTL 활성을 측정하였다. FACSAria™II를 사용하여 TB Foxp3GFP 마우스의 종양으로부터 CTLA4+ 또는 CTLA4- CD8+ T-세포를 분리하고 이들의 CTL 활성을 조사하였다.
8. Adoptive transfer (AT) 시험
MDSC Isolation Kit (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany)를 사용하여 TB Foxp3GFP 마우스의 비장 또는 혈액으로부터 분리한 M-MDSCs (1x106 cells)를 대조군 (종양을 이식받지 않은 tumor-free 마우스) 또는 TB 마우스에 꼬리 정맥을 통하여 전달하였다 (Adoptive transfer; AT). AT 3일 후, 상기 AT 받은 마우스 (recipient)에서 fxDC를 분석하였다.
CD8+ T 세포의 AT를 수행하기 위하여, CD8+ T-cell isolation kit(Miltenyi Biotec)를 사용하여 tumor-free 마우스 또는 OT-1 마우스의 비장, 또는 TB Foxp3fl/fl 및 Foxp3cko 마우스의 혈액 또는 종양 조직으로부터 세포를 분리한 후, 상기 분리된 세포를 CTV (10uM) 또는 DiD (10uM)로 37℃에서 15 분간 표지하고, 표지된 세포 (1x106)를 앞서 설명한 방법으로 마우스에 전달(AT)하였다.
통계분석
통계 분석은 GraphPad 5.0 software를 사용하여 수행하였으며, P < 0.05 (*P < 0.05, **P < 0.01, ***P <0.001)인 경우 유의성이 있는 것으로 결정하였다. 모든 시험 결과는 적어도 3개 이상의 시료에 대하여 적어도 3번 이상의 독립적인 시험(3E)으로부터 얻었다. 통계 데이터는 mean ± s.e.m으로 나타내었다.
실시예 1. 종양 환자 혈액 내의 fxDC 측정
EL4 lymphoma를 마우스에 주입하여 준비된 마우스 종양 모델(참고예 2 참조)에서, 종양 세포 주입 후 7일차부터 3일 간격으로 안와채혈(안구정맥채혈)하여 혈액 내 Foxp3를 발현하는 수지상 세포 (fxDC 또는 Foxp3+ DC로 표시)를 측정하여 (참고예 4 및 5 참조), 그 결과를 도 1에 나타내었다. 도 1은 종양 성장 동안의 Foxp3GFP 마우스의 혈액 내의 fxDC 개체군(populations) 모니터링 결과를 보여주는 것으로, fxDC는 각 그룹의 마우스 (n=30 마리의 마우스; 3 그룹, 그룹당 10 마리의 마우스)의 안구정맥으로부터 채혈된 혈액에 대하여 각 시점에서 평가하였다. 도 1에 나타난 바와 같이, 종양 마우스 모델의 혈액 내의 fxDC가 종양 성장에 비례하여 그 비율이 증가함을 알 수 있다.
또한, 건강한 공여자 (healthy donors; HD) 및 암환자 (교모세포종(GBM, stages 3 및 4), 대장암(Colorecta cancer; CC, stage 2(CC2), 3(CCS) 및 4(CC4)) 및 위암 (GC, stage 2(GC2), 3(GC3) 및 4(GC4))(참고예 2 참조)의 혈액 내의 DC (b(blood)-DC) 중 fxDC를 측정하여(참고예 4 및 5 참조), 그 결과를 도2a에 나타내었다. 도 2a에 나타난 바와 같이, 마우스 종양 모델에서와 동일하게, 인간 암 환자의 혈액에서도 암 진행 정도에 따라 fxDC 분포가 비례하여 증가함을 확인하였다.
또한 앞서 설명한 방법으로 다양한 종양(EL4; 임파종양, LLC; 루이스폐암, 266-6; 췌장암, CT-26; 대장암, 4T-1; 유방암)이 이식된 5-7마리의 종양마우스를 만들고, 혈액 내의 fxDC 분포를 조사하여, 그 결과를 도 2b에 나타내었다. 도 2b에 나타난 바와 같이, 종양 마우스 혈액에서 fxDC가 다량 발견되었다.
실시예 2. fxDC 저해에 의한 종양성장 저해 시험
fxDC가 종양성장에 주는 영향을 시험하기 위하여, 우선, 수지상 세포 특이적으로 Foxp3 발현을 제거한 마우스(CD11c-Cre x Foxp3fl/fl: 이하 Foxp3cKO 마우스)를 제작하여(참고예 1 참조), 여기에 종양세포를 투여하여 종양 마우스를 만든 다음 혈액 내의 fxDC를 측정하였다(참고예 4 및 5 참조). 상기 얻어진 결과를 도 3에 나타내었다. 도 3에서와 같이, Foxp3cKO 마우스의 혈액에서 fxDC이 제거됨을 확인할 수 있다.
야생형 마우스(Foxp3fl/fl; Foxp3가 knock-out되지 않은 TB 마우스)와 Foxp3cKO 마우스에 EL4 lymphoma tumor cell(5x105 cells)을 주입하고, 7일 후부터 3일 간격으로 종양성장을 모니터링한 결과를 도 4에 나타내었다. 도 4의 왼쪽은 종양 부피 변화를 보여주는 그래프이고, 오른쪽은 종양이식 후 23일째의 종양 무게를 보여주는 그래프이다. 도 4에 나타난 바와 같이, 야생형 마우스(Foxp3fl/fl)에서는 종양 크기가 지속적으로 증가하는 반면, fxDC가 제거된 Foxp3cKO 마우스 (fxDC 제거는 도 3의 결과 참조)에서 17일까지 종양이 소폭 성장하다가 30일 이후로는 완전히 사라지는 것을 확인할 수 있다. 이러한 결과는 수지상 세포 특이적으로 Foxp3를 제거하거나 fxDC를 제거함으로써, 종양 치료 효과를 나타낼 수 있음을 보여준다.
상기 도 4에서 종양성장이 억제된 것으로 확인된 Foxp3cKO 마우스의 종양 주입 후 17일째의 종양조직 내 fxDC 분포를 측정하여 (참고예 4 및 5 참조), 도 5에 나타내었다. 도 5에 나타난 바와 같이, 실제 종양성장이 억제된 Foxp3cKO 마우스에서 fxDC가 대부분 사라지는 것을 확인할 수 있다.
또한, EL4 lymphoma 뿐만 아니라, 다양한 고형암 (266-6: pancreatic cancer, LLC: Lewis lung carcinoma, EG7: OVA expressing EL4 lymphoma)에 대하여 동일한 시험을 수행하여 종양 부피를 측정하여 도 6에 나타내었다. 도 6에 나타난 바와 같이, EL4 lymphoma 뿐만 아니라, 다양한 고형암에서도, EL4 lymphoma의 경우와 유사하게, fxDC가 제거된 마우스에서의 종양 억제 효과가 야생형 마우스보다 현저하게 우수한 것으로 나타났다.
실시예 3. fxDC 저해에 의한 CD8+ T 세포 증가 및 종양 세포에 대한 세포 독성 증가 시험
CD8+ T (Tc1) 세포는 실제 Anti-cancer immunity에 중요한 역할을 하는 세포로, 직접적으로 종양세포의 사멸을 유도한다(cytotoxic CD8+T-cell). fxDC가 제거된 Foxp3cKO 마우스에서 종양 내의 CD8+ T 세포의 비율이 약 35.6%로 야생형 마우스(Foxp3fl/fl)에서의 CD8+ T 세포의 비율(약 16.3%)보다 크게 증가된 것을 확인하였다. fxDC가 제거된 Foxp3cKO 마우스 종양 조직에서의 CD8+ T 세포 중에서 IFN-gamma를 발현하는 CD8+ T 세포(FN-gamma+ CD8+ T 세포; cytotoxic CD8+ T-세포)의 비율을 측정하여 도 7에 나타내었다. 도 7에 나타난 바와 같이, 야생형 마우스(Foxp3fl/fl)와 비교하여, fxDC가 제거된 Foxp3cKO 마우스에서 cytotoxic CD8+T-세포의 비율이 약 2.5배 증가되어 있음을 확인하였다. 이러한 결과는 fxDC에 의한 cytotoxic CD8+T-세포의 조절 효과 (fxDC 제거에 의하여 cytotoxic CD8+T-세포가 상향 조절됨)를 제안한다.
종양조직 내 CD8+ T 세포가 직접적으로 종양의 증식 억제 (종양 세포의 사멸)를 유도하는지 확인하기 위하여, 야생형 마우스(Foxp3fl/fl)와 fxDC가 제거된 Foxp3cKO 마우스의 종양조직 내 CD8+ T 세포를 분리한 후, 종양세포와 공배양 하여, 종양세포에 대한 세포독성효과를 측정하였다. 세포 독성은 CTL (Cytotoxic T Lymphocytes)의 활성시험(참고예 7 참조)으로 측정하였다. 상기 얻어진 결과를 도 8에 나타내었다. 도 8에서와 같이, Foxp3cKO 마우스에 분리한 CD8+ T 세포가 야생형 마우스의 CD8+ T 세포보다 종양세포에 대한 세포 독성이 현저히 높은 것으로 나타났으며, 이러한 결과는 Foxp3의 제거(knock-out)에 의하여 CD8+ T 세포 생성이 유도되고, 이를 통하여 종양세포의 사멸률이 증가하여 종양 억제 효과가 나타남을 보여준다.
fxDC 제거 마우스의 CD8+ T-세포에 의한 CTL 활성(세포독성)이향상되는 기전을 확인하기 위하여, 다양한 세포표면 면역활성/억제 분자들의 발현을 조사하였다. 이 중에서, fxDC가 제거된 TB 마우스의 종양 조직의 CD8+ T세포에서의 CTLA4 (cytotoxic T-lymphocyte-associated protein 4) 발현 수준을 야생형 마우스(TB)와 비교하여 도 9에 나타내었다. 도 9에 나타난 바와 같이, fxDC가 제거된 TB 마우스의 종양조직의 CD8+ T세포에서 CTLA4 발현 수준 (약 8.92%)이 야생형 TB 마우스에서의 CTLA4 발현 수준 (약 79.5%)과 비교하여 크게 감소함을 확인하였다.
fxDC가 CD8+ T 세포의 CTLA4 발현을 조절하는 기작을 확인하기 위하여, 정상 마우스(종양이 이식되지 않음)의 CD8+ T 세포(Donor T 세포: DiD stained)를 종양이 이식된 야생형 마우스와 Foxp3cKO 마우스에 각각 꼬리정맥을 통하여 adoptive transfer (AT)(참고예 8 참조)한 후, 3일 후에, 종양조직 내 Donor T 세포(DiD+ CD8+ T 세포) 중에서 CTLA4 발현 CD8+ T 세포(CTLA4+ CD8+ T 세포)를 측정하여, 그 결과를 도 10에 나타내었다. 도 10에 나타난 바와 같이, fxDC가 제거된 마우스에서는 Donor CD8+ T 세포에서 CTLA4 발현이 크게 감소됨을 확인할 수 있다.
CD8+ T 세포에서의 CTLA4 발현이 항암면역의 핵심이 되는 CTL 반응(종양세포에 대한 세포독성)을 조절하는지 확인하기 위하여, EL4 TB 마우스의 EL4 종양으로부터 CTLA4+ CD8+ T 세포와 CTLA4- CD8+ T 세포를 분리한 후, 종양세포(EL4)를 표적 세포로 하여 CTL 활성을 시험하여, 그 결과를 도 11에 나타내었다. 도 11에 나타난 바와 같이, CTLA4를 발현하는 CTLA4+ CD8+ T 세포는 CTLA4를 발현하지 않는 CTLA4- CD8+ T 세포보다 CTL 활성이 현저히 감소함을 확인할 수 있다.
상기 결과들은 종양 및 종양 환경에 의해 유도되는 fxDC가 종양 내 CD8+ Treg을 유도하고(하기 실시예 5 참조), 이 세포가 종양을 제거하기 위해 몰려드는 CTL의 활성을 억제하여 종양의 지속적인 성장에 관여하며, fxDC를 제거할 경우 CTL 활성을 억제하는 CTLA4 발현이 감소하여 종양특이적 CTL 활성이 억제되지 않아서 효과적인 항암면역을 유도함으로써 종양성장을 현저하게 저해할 수 있음을 보여준다. 따라서 종양환자에서 fxDC를 제거하면 효과적인 항암면역을 유도하여 우수한 암 성장 억제 효과 및/또는 암 치료 효과를 얻을 수 있을 것으로 기대된다.
상기 결과는 fxDC에 의해 유도되는 CD8+ Treg가 T 세포 증식을 억제하고 항암 면역을 주관하는 CTL 활성을 감소시킴을 보여주는 것으로, fxDC의 제거에 의하여 T 세포 면역 및/또는 항암 면역이 강화될 수 있음을 제안한다.
실시예 4. fxDC와 CD8 + T 세포와의 공배양에 의한 CD8 + Treg의 제조
야생형 정상 마우스에 EL4 종양세포를 5x105 cell의 양으로 s.c injection하였다. 14일 후, 상기 마우스의 혈액에서 PBMC를 분리한 후, Ficoll-Paque (GE healthcare, Cat. #17-5442-02) 1ml을 15ml conical tube (Hyundai micro, Cat. #H20050)에 채우고, 동량의 혈액 또는 buddy coat를 Ficoll-Paque tube에 섞이지 않게 overlay 시켰다. 다목적 원심분리기(Gyrozen, Cat. #1580MGR)의 가속력을 1, 감속력 (DCC)을 0으로 설정하고 2500rpm로 30분간 농도구배 원심분리를 시행하였다. 원심 분리 후, 제일 위층의 혈장과 중간의 단핵구층을 분리하고, 분리된 단핵구로부터 CD11c-Microbeads를 사용하여 CD11c+ 수지상 세포를 분리하였다.
정상 마우스의 비장(spleen)을 적출한 후, cell strainer를 사용하여 단일세포로 분리하고, RBC lysis buffer를 사용하여 상기 분리된 단일세포로부터 모든 적혈구를 제거한 후, Microbeads를 사용하여 CD8+ T세포를 분리하였다. 분리된 CD8+ T세포를 CD3/CD28로 코팅된 96 Well plate에 2.5 x 105 cell씩 분주하였다.
상기 CD8+ T세포가 포함된 96well plate에 앞서 혈액에서 분리된 수지상 세포를 분주하여 CD8+ T 세포와 3일동안 공배양한 후, CD8+ T 세포를 수거하여 아래의 실시예 5 및 실시예 6분리 및 분석에 이용하였다.
상기와 같이 fxDC와 CD8+ T 세포의 공배양에 의하여 CD8+ Treg가 유도됨을 확인하기 위하여, Foxp3GFP TB 마우스로부터 분리하고 항-CD3/28 항체로 예비 활성화(pre-activation)시킨 CTV-표지 CD8+ T 세포를 Foxp3GFP TB 마우스의 혈액에서 분리한 DC와 공배양하고, Foxp3+ CD8+ Treg 분포를 측정하였다. 상기 결과를 도 12에 나타내었으며, 상기 결과로부터 fxDC와 CD8+ T 세포의 공배양에 의하여 CD8+ Treg가 유도됨을 확인할 수 있다.
실시예 5. fxDC에 의한 CD8 + Treg 유도 시험
fxDC에 의하여 CD8+ Treg (CD8+ regulatory T cell)이 유도되는지 여부를 시험하기 위하여, 비장 DC (spDC) 또는 fxDC가 포함된 혈액 DC (bDC)와 fxDC가 제거된 혈액 DC (Foxp3-DTR 마우스에 Diphtheria Toxin(DT)를 처리하면 표적 세포가 제거됨; fxDC-depleted (DT-treated) bDCs (bDC/DT))와 항-CD3/28 항체로 미리 활성화(pre-activation)시킨 T 세포를 공배양하여, 전체 T 세포에 대한 Foxp3+ CD4+ 및 CD8+ T 세포 비율을 측정하여, 도 13에 나타내었다. 도 13에 나타난 바와 같이, fxDC가 제거된 혈액 DC는 CD8+ Treg를 전혀 유도하지 못함을 확인할 수 있다.
fxDC에 의해 유도되는 CD8+ Treg가 종양성장과 어떠한 연관성이 있는지 시험하기 위하여, EL4 세포를 27마리의 Foxp3GFP 마우스에 동시 접종하여 TB 마우스를 제작한 후, 하루에 한 마리씩 희생하여 분석하였다. 상기 TB 마우스의 혈액 내의 fxDC 및 CD8+ Treg을 측정하여, 혈액 DC 중의 fxDC 비율(%)을 x축으로 하고 혈액 내의 CD8+ Treg의 비율 (% of CD8+ Tregs/CD8+ T-cell)을 y축으로 하여, 도 14에 나타내었다. 도 14에 나타난 바와 같이, TB 마우스의 혈액에서 종양 성장에 따라 증가하는 fxDC와 비례하여 CD8+ Treg가 증가함을 확인하였다.
fxDC가 제거된 마우스에서 종양이 성장하다가 일정 시간 후 사라지는 결과 (도 4 참조)를 기초로, Foxp3cKO TB 마우스와 야생형 TB 마우스의 종양 조직에서의 Foxp3+ CD4+ 및 CD8+ Treg의 분포를 측정하여 도 15에 나타내었다. 도 15에 나타난 바와 같이, fxDC가 제거된 마우스의 종양조직에서 CD8+ Treg가 야생형 마우스에 비해 크게 감소하는 반면, CD4+ Treg 세포는 fxDC 존재 여부에 따른 영향을 받지 않음을 확인하였다.
실시예 6. CD8 + Treg의 T 세포 증식 억제 및 종양 증식 촉진 효과 시험
fxDC에 의해 유도되는 CD8+ Treg의 T 세포 면역 및 항암 면역에 미치는 효과를 시험하기 위하여, 비장 CD8+ T-세포를 항-CD3/28 항체로 자극한 후, Foxp3GFP TB 마우스의 종양으로부터 분리한 종양-CD4+ Treg (tu-CD4+ Treg) 세포 및 종양-CD8+ Treg (tu-CD8+ Treg) 세포와 함께 3일간 공배양한 후, CD8+ T 세포 증식 정도 및 IFN-gamma+ 세포를 측정하였다(참고예 5 및 6 참조).
도 16은 CD4+ Treg (tu-CD4+ Treg) 세포 및 CD8+ Treg (tu-CD8+ Treg) 세포의 증식을 측정한 결과를 보여주는 것으로, 항-CD3/28 항체가 처리된 (pre-activated) T 세포와 CD8+/CD4+ Treg 세포의 공배양 시 CD8+ Treg가 CD4+ Treg 세포보다 높은 수준으로 T 세포 증식을 억제함을 보여준다.
도 17은 항-CD3/28 항체가 처리된 (pre-activated) T 세포와 CD8+/CD4+ Treg 세포의 공배양 시 IFN-gamma+ T 세포 수준을 보여주는 결과로, 항-CD3/28 항체가 처리된 (pre-activated) T 세포와 CD8+/CD4+ Treg 세포의 공배양 시 IFN-gamma를 발현하는 CTL (CD8+ IFN-gamma+ T 세포)의 수준이 크게 감소함을 보여준다.
앞선 실시예에서 확인된 바와 같이, CTLA4+ CD8+ T 세포에서 CTL 활성이 사라진다 (도 10 참조). 이에, CD8+ Treg가 CTLA4+ CD8+ T 세포를 직접적으로 유도하는지 여부를 시험하였다. 이를 위하여, in vitro에서 fxDC에 의해 유도된 CD8+ Treg를 정상 마우스의 CD8+ T세포와 공배양한 후, CTLA4+ CD8+ T 세포 수준을 측정하였다. 보다 구체적으로, 야생형(정상) 마우스에서 분리된 CD8+ T-세포를 항-CD3/28 항체로 자극한 후, Foxp3f/f 및 Foxp3cKO TB 마우스 종양으로부터 분리한 tu-DC와 함께 3일간 공배양한 후, tu-DC 유도 CD8+ T 세포를 정제하고, DiD-표지된 야생형 CD8+ T-세포와 함께 3일간 공배양한 후, CD8+ T-세포 내의 CTLA-4 발현을 측정하였다. 상기 얻어진 결과를 도 18에 나타내었다. 도 18에 나타난 바와 같이, Foxp3cKO TB 마우스에서의 CTLA4+ CD8+ T 세포 수준이 야생형 TB 마우스와 비교하여 현저하게 감소함을 확인할 수 있다. 이러한 결과는 fxDC에 의해 유도된 CD8+ Treg가 직접적으로 CTLA4+ CD8+ T 세포를 유도함을 보여준다.
야생형 CD8+ T 세포를 DiD로 표지하고, 항-CD3/28 항체로 자극한 후, Foxp3DTR TB 마우스의 종양으로부터 분리된 DT-처리 tu-CD8+ T-세포 (CD8 Treg-depleted) 또는 PBS-처리 tu-CD8+ T-세포와 함께 3일간 공배양한 후 CTLA4+ CD8+ T 세포 수준을 측정하여 도 19에 나타내었다. 도 19에 나타난 바와 같이, DT-처리에 의하여 CD8+ Treg를 모두 제거한 경우, CTLA4+ CD8+ T 세포가 전혀 유도되지 않음을 확인하였다.
상기 결과들을 종합하면, fxDC에 의해 유도되는 CD8+ Treg은 암세포를 직접 공격하는 CTL에서의 CTLA4 발현을 유도하여 CTL 활성을 억제함을 확인할 수 있으며, 이러한 결과로부터, CD8+ Treg을 제거함으로써 항암 면역을 강화시켜 보다 효과적인 암 치료가 가능할 수 있음을 시사하고, 항암제 개발에 있어서 CD8+ Treg의 항암 치료 타겟으로서의 유용성을 제공한다.
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Claims (22)

  1. Foxp3를 발현하는 수지상 세포의 저해제를 포함하는, 암 치료용 약학 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 Foxp3를 발현하는 수지상 세포의 저해제는 항체, 세포독성 약물(cytotoxic drugs), 항체-세포독성 약물 접합체, 및 항체-자성입자로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상이 저해제, 또는 상기 저해제를 포함하는 나노전달체로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인, 암 치료용 약학 조성물.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 조성물은 종양 조직 또는 혈액에서 Foxp3를 발현하는 수지상 세포가 검출된 암 환자에게 투여하기 위한 것인, 암 치료용 약학 조성물.
  4. Foxp3를 발현하는 수지상 세포의 저해제를 포함하는, CD8을 발현하는 조절 T 세포 저해용 약학 조성물.
  5. 제4항에 있어서, 상기 Foxp3를 발현하는 수지상 세포의 저해제는 항체, 세포독성 약물(cytotoxic drugs), 항체-세포독성 약물 접합체, 및 항체-자성입자로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상이 저해제, 또는 상기 저해제를 포함하는 나노전달체인, CD8을 발현하는 조절 T 세포 저해용 약학 조성물.
  6. 제4항 또는 제5항에 있어서, 상기 조성물은 종양 조직 또는 혈액에서 Foxp3를 발현하는 수지상 세포가 검출된 암 환자에게 투여하기 위한 것인, CD8을 발현하는 조절 T 세포 저해용 약학 조성물.
  7. CD8을 발현하는 조절 T 세포의 저해제를 유효성분으로 포함하는, 암 치료용 약학 조성물.
  8. 제7항에 있어서, 상기 CD8을 발현하는 조절 T 세포의 저해제는 항체, 세포독성 약물(cytotoxic drugs), 항체-세포독성 약물 접합체, 및 항체-자성입자로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상이 저해제, 또는 상기 저해제를 포함하는 나노전달체인, 암 치료용 약학 조성물.
  9. 제7항 또는 제8항에 있어서, 상기 조성물은 종양 조직 또는 혈액에서 CD8을 발현하는 조절 T 세포가 검출된 암 환자에게 투여하기 위한 것인, 암 치료용 약학 조성물.
  10. Foxp3를 발현하는 수지상 세포의 저해제를 암 치료를 필요로 하는 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 암 치료 방법.
  11. 제10항에 있어서, 상기 Foxp3를 발현하는 수지상 세포의 저해제는 항체, 세포독성 약물(cytotoxic drugs), 항체-세포독성 약물 접합체, 및 항체-자성입자로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상이 저해제, 또는 상기 저해제를 포함하는 나노전달체인, 암 치료 방법.
  12. 제10항에 있어서, 상기 환자는 종양 조직 또는 혈액에서 Foxp3를 발현하는 수지상 세포가 검출된 암 환자인, 암 치료 방법.
  13. Foxp3를 발현하는 수지상 세포의 저해제를 CD8을 발현하는 조절 T 세포의 저해를 필요로 하는 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, CD8을 발현하는 조절 T 세포 저해 방법.
  14. 제13항에 있어서, 상기 Foxp3를 발현하는 수지상 세포의 저해제는 항체, 세포독성 약물(cytotoxic drugs), 항체-세포독성 약물 접합체, 및 항체-자성입자로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상이 저해제, 또는 상기 저해제를 포함하는 나노전달체인, CD8을 발현하는 조절 T 세포 저해 방법.
  15. 제13항에 있어서, 상기 환자는 종양 조직 또는 혈액에서 Foxp3를 발현하는 수지상 세포가 검출된 암 환자인, CD8을 발현하는 조절 T 세포 저해 방법.
  16. CD8을 발현하는 조절 T 세포의 저해제를 암 치료를 필요로 하는 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 암 치료 방법.
  17. 제16항에 있어서, 상기 CD8을 발현하는 조절 T 세포의 저해제는 항체, 세포독성 약물(cytotoxic drugs), 항체-세포독성 약물 접합체, 및 항체-자성입자로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상이 저해제, 또는 상기 저해제를 포함하는 나노전달체인, 암 치료 방법.
  18. 제16항에 있어서, 상기 환자는 종양 조직 또는 혈액에서 CD8을 발현하는 조절 T 세포가 검출된 암 환자에게 투여하기 위한 것인, 암 치료 방법.
  19. 후보 화합물을 Foxp3를 발현하는 수지상 세포, CD8을 발현하는 조절 T 세포, 또는 이들 모두와 접촉시키는 단계;
    Foxp3를 발현하는 수지상 세포, CD8을 발현하는 조절 T 세포, 또는 이들 모두의 수준을 측정하는 단계; 및
    상기 측정된 Foxp3를 발현하는 수지상 세포, CD8을 발현하는 조절 T 세포, 또는 이들 모두의 수준을 상기 후보 화합물 처리 전과 비교하여 감소한 경우, 상기 후보 화합물을 항암제 후보 물질로 결정하는 단계
    를 포함하는, 항암제 스크리닝 방법.
  20. Foxp3를 발현하는 수지상 세포와 CD8을 발현하는 T 세포를 함께 배양하는 단계를 포함하는, CD8+ Treg의 제조 방법.
  21. 환자로부터 분리된 생물학적 시료에서 Foxp3를 발현하는 수지상 세포, CD8을 발현하는 조절 T 세포, 또는 이들 모두를 검출하는 단계를 포함하는, 암 진단 또는 암 예후 확인에 정보를 제공하는 방법.
  22. 항암 치료를 받은 환자로부터 분리된 생물학적 시료에서 Foxp3를 발현하는 수지상 세포를 검출하는 단계를 포함하는, 항암 치료 효능 모니터링에 정보를 제공하는 방법.
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