JP2020518569A - Foxp3を発現する樹状細胞の癌の診断または治療のための用途 - Google Patents
Foxp3を発現する樹状細胞の癌の診断または治療のための用途 Download PDFInfo
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Abstract
Description
Foxp3(Forkhead box P3)は調節T細胞(regulatory T cells;Treg)の発達と機能に関与すると知られた転写調節因子である(Hori、S.、Nomura、T.& Sakaguchi、S.Control of regulatory T cell development by the transcription factor Foxp3.Science 299、1057−1061、doi:10.1126/science.1079490(2003))。
しかし、樹状細胞のようなT細胞以外の免疫細胞でのFoxp3発現およびその医薬的有用性についてまだ知られていることがない。
一例は、Foxp3を発現する樹状細胞の癌治療ターゲットおよび/または癌診断マーカとしての用途を提供する。
他の例は、Foxp3を発現する樹状細胞の阻害剤を有効性分として含む癌治療用薬学組成物を提供する。前記癌治療用薬学組成物は、腫瘍組織または血液からFoxp3を発現する樹状細胞が検出された癌患者に投与するためのものであり得る。
他の例は、Foxp3を発現する樹状細胞の阻害剤の癌治療に使用するための用途を提供する。前記癌治療に使用するための用途は、腫瘍組織または血液からFoxp3を発現する樹状細胞が検出された癌患者に適用するためのものであり得る。
他の例は、Foxp3を発現する樹状細胞の阻害剤の薬学的有効量を癌患者に投与する段階を含む、癌治療方法を提供する。前記癌患者は、腫瘍組織または血液からFoxp3を発現する樹状細胞が検出された癌患者であり得る。
他の例は、Foxp3を発現する樹状細胞の阻害剤を有効性分として含むCD8を発現する調節T細胞(CD8+ Treg)阻害用薬学組成物を提供する。他の例は、Foxp3を発現する樹状細胞の阻害剤のCD8を発現する調節T細胞阻害に使用するための用途を提供する。他の例は、Foxp3を発現する樹状細胞の阻害剤をCD8を発現する調節T細胞阻害を必要とする患者に投与する段階を含む、CD8を発現する調節T細胞阻害方法を提供する。前記患者は、癌患者、例えば、腫瘍組織または血液からFoxp3を発現する樹状細胞が検出された癌患者であり得る。
他の例は、CD8を発現する調節T細胞(CD8+ Treg)の癌治療ターゲットとしての用途を提供する。
他の例は、CD8を発現する調節T細胞の阻害剤を有効性分として含む癌治療用薬学組成物を提供する。前記癌治療用薬学組成物は、腫瘍組織または血液からCD8を発現する調節T細胞が検出された癌患者に投与するためのものであり得る。
他の例は、CD8を発現する調節T細胞の阻害剤の癌治療に使用するための用途を提供する。前記癌治療に使用するための用途は、腫瘍組織または血液からCD8を発現する調節T細胞が検出された癌患者に適用するためのものであり得る。
他の例は、CD8を発現する調節T細胞の阻害剤の薬学的有効量を癌患者に投与する段階を含む、癌治療方法を提供する。前記癌患者は、腫瘍組織または血液からCD8を発現する調節T細胞が検出された癌患者であり得る。
他の例は、候補化合物をFoxp3を発現する樹状細胞、CD8を発現する調節T細胞、またはこれら全てと接触させた後にFoxp3を発現する樹状細胞および/またはCD8を発現する調節T細胞の水準が減少した場合、前記候補化合物を抗癌剤候補物質と決定する段階を含む、抗癌剤スクリーニング方法を提供する。
他の例は、Foxp3を発現する樹状細胞の検出可能な製剤を含む癌診断または癌予後確認用組成物を提供する。他の例は、患者から分離された生物学的試料からFoxp3を発現する樹状細胞を検出する段階を含む、癌診断または癌予後確認方法または癌診断または癌予後確認に情報を提供する方法を提供する。前記癌診断方法は、前記検出する段階以後に前記生物学的試料からFoxp3を発現する樹状細胞が検出される場合(存在する場合)、前記患者を癌患者と決定する段階、またはFoxp3を発現する樹状細胞水準変化によって癌の進行程度を確認する段階を追加的に含むことができる。
他の例は、Foxp3を発現する樹状細胞とCD8を発現するT細胞と共に培養する段階を含むCD8を発現する調節T細胞(CD8+ Treg)の製造方法を提供する。
他の例は、Foxp3を発現する樹状細胞とCD8を発現するT細胞を共培養して生成されたCD8+ Tregの免疫抑制および/または自己免疫疾患または移植拒絶の予防および/または治療に使用するための用途を提供する。前記CD8+ Tregは、先に説明したCD8+ Tregの製造方法によって製造されたものであり得る。他の例は、前記製造方法によって製造されたCD8+ Tregを有効性分として含む免疫抑制剤または自己免疫疾患または移植拒絶の予防および/または治療用組成物を提供する。他の例は、前記製造方法によって製造されたCD8+ Tregを免疫抑制または自己免疫疾患または移植拒絶の予防および/または治療を必要とする個体に投与する段階を含む免疫抑制方法または自己免疫疾患または移植拒絶の予防および/または治療方法を提供する。
よって、一例は、Foxp3を発現する樹状細胞の癌治療ターゲットとしての用途を提供する。
他の例は、Foxp3を発現する樹状細胞の阻害剤を有効性分として含む癌治療用薬学組成物を提供する。前記Foxp3を発現する樹状細胞は癌患者の腫瘍組織または血液に存在するものであり得、前記癌治療用薬学組成物は腫瘍組織または血液からFoxp3を発現する樹状細胞が検出された癌患者に投与するためのものであり得る。
他の例は、Foxp3を発現する樹状細胞の阻害剤の癌治療に使用するための用途を提供する。前記癌治療に使用するための用途は、腫瘍組織または血液からFoxp3を発現する樹状細胞が検出された癌患者に適用するためのものであり得る。
他の例は、Foxp3を発現する樹状細胞の阻害剤の薬学的有効量を癌患者に投与するか、前記患者(例えば、患者の血液および/または腫瘍組織など)からFoxp3を発現する樹状細胞を除去する段階を含む、癌治療方法を提供する。前記癌患者は、腫瘍組織または血液からFoxp3を発現する樹状細胞が検出された癌患者であり得る。
他の例は、Foxp3を発現する樹状細胞の阻害剤を有効性分として含むCD8を発現する調節T細胞(CD8+ Treg)阻害用薬学組成物を提供する。他の例は、Foxp3を発現する樹状細胞の阻害剤のCD8を発現する調節T細胞阻害に使用するための用途を提供する。他の例は、Foxp3を発現する樹状細胞の阻害剤をCD8を発現する調節T細胞阻害を必要とする患者に投与するか、前記患者(例えば、患者の血液および/または腫瘍組織など)からFoxp3を発現する樹状細胞を除去する段階を含む、CD8+ Treg阻害方法を提供する。前記CD8を発現する調節T細胞は、Foxp3を発現する樹状細胞によって癌患者の血液内で誘導されるものであり得る。前記患者は、癌患者、例えば、腫瘍組織または血液からFoxp3を発現する樹状細胞が検出された癌患者または腫瘍組織または血液からFoxp3を発現する樹状細胞によってCD8を発現する調節T細胞が誘導された患者であり得る。
他の例は、CD8を発現する調節T細胞(CD8+ Treg)の癌治療ターゲットとしての用途を提供する。
他の例は、CD8を発現する調節T細胞の阻害剤を有効性分として含む癌治療用薬学組成物を提供する。前記癌治療用薬学組成物は、腫瘍組織または血液からCD8を発現する調節T細胞が検出された癌患者に投与するためのものであり得る。
他の例は、CD8を発現する調節T細胞の阻害剤の癌治療に使用するための用途を提供する。前記癌治療に使用するための用途は、腫瘍組織または血液からCD8を発現する調節T細胞が検出された癌患者に適用するためのものであり得る。
他の例は、CD8を発現する調節T細胞の阻害剤の薬学的有効量を癌患者に投与するか前記患者(例えば、患者の血液および/または腫瘍組織など)からCD8を発現する調節T細胞を除去する段階を含む、癌治療方法を提供する。前記癌患者は、腫瘍組織または血液からCD8を発現する調節T細胞が検出された癌患者であり得る。
前記癌の予後確認方法において、生物学的試料は、癌の予後(進行状態)を確認(モニタリング)しようとする癌患者から分離された血液、血球、腫瘍組織などからなる群より選択された1種以上であってもよい。前記癌の予後確認方法で、癌患者から分離された生物学的試料でのFoxp3を発現する樹状細胞水準を互いに異なる2以上の時点で測定して、ある一時点で測定したFoxp3を発現する樹状細胞水準が以前時点で測定された水準より高い場合、前記癌患者で癌が悪化するか癌進行が速くなっていると確認することができ、ある一時点で測定したFoxp3を発現する樹状細胞水準が以前時点で測定された水準より低い場合、前記癌患者で癌が緩和されるか癌進行が遅くなっていると確認することができる。前記癌予後確認方法は、(1)癌患者から分離された生物学的試料でのFoxp3を発現する樹状細胞水準を互いに異なる2以上の時点で測定する段階、および(2)ある一時点で測定したFoxp3を発現する樹状細胞水準が以前時点で測定された水準より高い場合、前記癌患者で癌が悪化するか癌進行が速くなっていると確認するか、ある一時点で測定したFoxp3を発現する樹状細胞水準が以前時点で測定された水準より低い場合、前記癌患者で癌が緩和されるか癌進行が遅くなっていると確認する段階を含むものであり得る。
他の例は、前記Foxp3を発現する樹状細胞とCD8を発現するT細胞を共培養して生成されたCD8を発現する調節T細胞を提供する。前記CD8を発現する調節T細胞は、先に説明したCD8を発現する調節T細胞の製造方法によって製造されたものであってもよい。
他の例は、Foxp3を発現する樹状細胞とCD8を発現するT細胞を共培養して生成されたCD8を発現する調節T細胞の免疫抑制および/または自己免疫疾患または移植拒絶の予防および/または治療に使用するための用途を提供する。前記CD8を発現する調節T細胞は、先に説明したCD8を発現する調節T細胞の製造方法によって製造されたものであってもよい。他の例は、前記製造方法によって製造されたCD8を発現する調節T細胞を有効性分として含む免疫抑制剤または自己免疫疾患または移植拒絶の予防および/または治療用組成物を提供する。他の例は、前記製造方法によって製造されたCD8を発現する調節T細胞を免疫抑制または自己免疫疾患または移植拒否の予防および/または治療を必要とする個体に投与する段階を含む免疫抑制方法または自己免疫疾患または移植拒絶の予防および/または治療方法を提供する。前記自己免疫疾患は、リウマチ、ループス病、自己免疫性肝炎、自己免疫性溶血性疾患などから選択されたものであり得る。
Foxp3(Forkhead box P3、scurfinとも呼ばれる)は、免疫系反応に関与する蛋白質であって、調節T細胞の発達および機能の調節経路の主要調節因子としての機能を果たす。Foxp3は、人間、猿などの霊長類、ラット、マウスなどのげっ歯類を含む哺乳動物に由来するものであってもよく、例えば、人間Foxp3(例えば、GenBank Accession No.NP_001107849.1(遺伝子(mRNA):NM_001114377.1)、NP_054728.2(遺伝子(mRNA):NM_014009.3)など)、マウスFoxp3(例えば、GenBank Accession No.NP_001186276.1(遺伝子(mRNA):NM_001199347.1)、NP_001186277.1(遺伝子(mRNA):NM_001199348.1)、NP_473380.1(遺伝子(mRNA):NM_054039.2)など)であってもよい。一例で、Foxp3は、配列番号1のアミノ酸配列(MPNPRPAKPMAPSLALGPSPGVLPSWKTAPKGSELLGTRGSGGPFQGRDLRSGAHTSSSLNPLPPSQLQLPTVPLVMVAPSGARLGPSPHLQALLQDRPHFMHQLSTVDAHAQTPVLQVRPLDNPAMISLPPPSAATGVFSLKARPGLPPGINVASLEWVSREPALLCTFPRSGTPRKDSNLLAAPQGSYPLLANGVCKWPGCEKVFEEPEEFLKHCQADHLLDEKGKAQCLLQREVVQSLEQQLELEKEKLGAMQAHLAGKMALAKAPSVASMDKSSCCIVATSTQGSVLPAWSAPREAPDGGLFAVRRHLWGSHGNSSFPEFFHNMDYFKYHNMRPPFTYATLIRWAILEAPERQRTLNEIYHWFTRMFAYFRNHPATWKNAIRHNLSLHKCFVRVESEKGAVWTVDEFEFRKKRSQRPNKCSNPCP)を含むものであってもよいが、これに制限されるのではない。
Foxp3を発現する樹状細胞の阻害剤は、投与対象(患者の体内(例えば、癌患者生体内血液および/または腫瘍組織)、患者から分離された生物学的試料(例えば、分離された血液および/または腫瘍組織))でFoxp3を発現する樹状細胞の水準を低めるか、死滅させるか、除去することができる全ての製剤の中から選択でき、例えば、Foxp3を発現する樹状細胞に特異的な抗体、細胞毒性薬物(cytotoxic drugs)、抗体−細胞毒性薬物接合体、抗体−磁性粒子複合体などからなる群より選択された1種以上の阻害剤、または前記阻害剤を含むナノ伝達体(nano delivery system)などからなる群より選択された1種以上であってもよいが、これに制限されるのではない。前記ナノ伝達体は、前記阻害剤を封入または伝達することができるナノサイズ(例えば、1−1000nm)の粒子を意味するものであって、その材質は蛋白質、脂質、およびその他の生体適合性または生分解性高分子からなる群より選択された1種以上であってもよく、形態には制限がない。
CD8(cluster of differentiation 8)は、T細胞受容体(T cell receptor;TCR)に対してco−receptor役割を果たす膜貫通糖蛋白質であって、MHC(major histocompatibility complex)分子に結合し、class I MHC蛋白質に特異的である。CD8は、人間、猿などの霊長類、ラット、マウスなどのげっ歯類を含む哺乳動物に由来するものであってもよく、例えば、人間CD8(例えば、GenBank Accession No.NP_001139345.1(遺伝子(mRNA):NM_001145873.1)、NP_001759.3(遺伝子(mRNA):NM_001768.6)、NP_741969.1(遺伝子(mRNA):NM_171827.3)、NP_001171571.1(遺伝子(mRNA):NM_001178100.1)、NP_004922.1(遺伝子(mRNA):NM_004931.4)、NP_742099.1(遺伝子(mRNA):NM_172101.3)、NP_742100.1(遺伝子(mRNA):NM_172102.3)、NP_757362.1(遺伝子(mRNA):NM_172213.3)など)であってもよい。
CD8を発現する調節T細胞の阻害剤は、投与対象(患者の体内(例えば、癌患者生体内血液および/または腫瘍組織)、患者から分離された生物学的試料(例えば、分離された血液および/または腫瘍組織))でCD8を発現する調節T細胞の水準を低めるか除去することができる全ての製剤の中から選択でき、例えば、CD8を発現する調節T細胞に特異的な抗体、細胞毒性薬物、抗体−細胞毒性薬物接合体、抗体−磁性粒子複合体などからなる群より選択された1種以上が阻害剤、または前記阻害剤を含むナノ伝達体などからなる群より選択された1種以上であってもよいが、これに制限されるのではない。前記ナノ伝達体は、前記阻害剤を封入または伝達することができるナノサイズ(例えば、1−1000nm)の粒子を意味するものであって、その材質は蛋白質、脂質、およびその他の生体適合性または生分解性高分子からなる群より選択された1種以上であってもよく、形態には制限がない。
本明細書に使用されたものとして、患者は、人間、猿などの霊長類、マウス、ラットなどのげっ歯類などを含む哺乳動物、または前記哺乳動物から分離された細胞または組織(例えば、血液、血球、腫瘍組織)であり得る。一例で、前記患者は、癌患者または癌患者から分離された細胞または組織(例えば、血液、血球、腫瘍組織)であり得る。例えば、前記患者は、腫瘍組織または血液からFoxp3を発現する樹状細胞、CD8を発現する調節T細胞、またはこれら全てが検出された癌患者であり得る。
また、癌診断に使用される生物試料は、患者(人間、猿などの霊長類、マウス、ラットなどのげっ歯類などを含む哺乳動物の中から選択)から分離された細胞、組織、体液(例えば、血液、血球、腫瘍組織など)などであり得る。
本明細書での癌治療は、癌細胞の成長を抑制または癌細胞を消滅(除去)させる効果だけでなく、癌細胞の移動(migration)、浸湿(invasion)、転移(metastasis)などを抑制してこれによる癌の悪化を抑制する効果も含む。
前記Foxp3を発現する樹状細胞の検出可能な製剤は、Foxp3を発現する樹状細胞と特異的に結合可能な全ての化合物(例えば、小分子化合物、抗体など)の中から選択でき、例えば、樹状細胞内でFoxp3に特異的に結合する小分子化合物、抗体の中から選択された1種以上およびFoxp3を発現する樹状細胞の表面蛋白質に特異的に結合する小分子化合物、抗体、またはこれら(抗体および/または小分子化合物)を含むナノ伝達体の中からり選択された1種以上の組み合わせであってもよい。
前記CD8を発現する調節T細胞の検出可能な製剤は、CD8を発現する調節T細胞と特異的に結合可能な全ての化合物(例えば、小分子化合物、抗体、ナノ伝達体など)の中から選択でき、例えば、CD8調節T細胞の表面蛋白質に特異的に結合する小分子化合物、抗体の中から選択された1種以上の組み合わせであってもよい。
前記Foxp3を発現する樹状細胞の検出可能な製剤および/またはCD8を発現する調節T細胞の検出可能な製剤は、通常の方法(例えば、酵素反応、蛍光、発光および/または放射線検出など)で探知可能な通常の標識物質で標識されたものであってもよい。例えば、前記標識物質は、蛍光物質(例えば、蛍光化学染料、蛍光蛋白質など)、発光物質、放射性同位元素などからなる群より選択された1種以上であり得るが、これに制限されるのではない。一例で、Foxp3を発現する樹状細胞の検出および/またはCD8を発現する調節T細胞の検出は、フローサイトメトリー(Flow cytometry)、FACS(fluorescence−activated cell sorting)、免疫クロマトグラフィー(Immunochromatography)、免疫組織化学染色、酵素結合免疫吸着分析(enzyme linked immunosorbent assay:ELISA)、放射線免疫測定法(radioimmunoassay:RIA)、酵素免疫分析(enzyme immunoassay:EIA)、蛍光免疫分析(Floresence immunoassay:FIA)、発光免疫分析(luminescence immunoassay:LIA)、ウエスタンブロッティング(Western blotting)などから選択された方法を使用して行うことができるが、これに制限されるのではない。
前記抗癌剤スクリーニング方法において、候補化合物は、各種化合物、例えば、小分子化合物(chemicals)、蛋白質、ポリペプチド、オリゴペプチド、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、植物または動物の抽出物などからなる群より選択されたものであり得る。
1.マウス準備
7−10週齢の野生型C57BL6およびBALB/cマウス、および遺伝子変形されたC57BL6−OT−1、C57BL6−Foxp3GFP[Foxp3+細胞でFoxp3−緑色蛍光蛋白質(GFP)融合蛋白質を発現するFoxp3−GFPレポーターマウス]、C57BL6−Foxp3DTR[Foxp3プロモーターの調節下でFoxp3−暗号化エクソンに代わってジフテリア毒素受容体(diphtheria toxin receptor;DTR)を発現するFoxp3−DTR形質転換(Tg)マウス]、C57BL6−Foxp3DTR−GFP(C57BL6−Foxp3DTRマウスをC57BL6−Foxp3GFPマウスと3世代の間に逆交配して製作する)、C57BL6−Foxp3−floxed(Foxp3fl/fl)、CD11c−Foxp3cKO(CD11c−creマウスとFoxp3fl/flマウスを交配して製作されたC57BL6−Foxp3cKOマウス)、C57BL6−Rag1tm1Mom(RAG1−/−)、およびCD11c−creマウスを下記試験に使用した。C57BL6−OT−1、Foxp3GFP、Foxp3DTR、Rag1−/−、およびCD11c−creマウスはJackson Laboratory(Bar Harbor、Sacramento、CA)で購入した。Foxp3−floxed(C57BL6−Foxp3fl/fl)マウスは、“A.Rudensky、Memorial Sloan Kettering Cancer Center、NY”から提供を受けた。全てのマウスは、“Institute/University Animal Care and Use guidelines”によってSPF(specific pathogen−free)動物保護施設(成均館大学校)で維持管理され、本実験のために別途のanimal care chamberに移して同一条件でco−housingして使用した。DTRマウスには、従来に報告された方法でジフテリア毒素(diphtheria toxin;DT)を処理した(参照文献:“Kim、J.et al.Cutting edge:depletion of Foxp3+ cells leads to induction of autoimmunity by specific ablation of regulatory T cells in genetically targeted mice. J Immunol 183、7631−7634、doi:10.4049/jimmunol.0804308(2009)”および“Penaloza−MacMaster、P.et al.Interplay between regulatory T cells and PD−1 in modulating T cell exhaustion and viral control during chronic LCMV infection.The Journal of experimental medicine 211、1905−1918、doi:10.1084/jem.20132577(2014)”)。簡略に説明すれば、DTをPBSに溶かした後、血液採取前連続3日間(day−3、day−2およびday−1)Foxp3DTRまたはFoxp3DTR−GFPマウスに適切な容量(50μg/kg)200μlをi.p.注射した後、前記DT処理マウスの血液または腫瘍からCD11c+MHC+樹状細胞(DC)を分離し、下記試験に使用した。
EL4(C57BL/6 mouse−derived lymphoma)、EG7(OVA−expressing EL4)、B16/F10(C57BL/6 mouse−derived skin melanoma)、266−6(C57BL/6 mouse−derived pancreatic acinar cell tumor)、CT26(BALB/c mouse−derived colon carcinoma)、4T−1(BALB/c mouse−derived mammary carcinoma)、およびRENCA(BALB/c mouse−derived renal adenocarcinoma)細胞は、ATCC(American Type Culture Collection)から入手した。三星医療院IRB(#SMC 2016−04−057)の承認を受けたプロトコルによって悪性腫瘍患者(膠芽腫(GBM、stages 3および4)、結腸癌(colon cancer;CC、stage 2(CC2)、3(CC3)および4(CC4))および胃癌(GC、stage 2(GC2)、3(GC3)および4(GC4))と健康な寄贈者からヒト末梢血単核細胞(Human peripheral blood mononuclear cells;hPBMCs)を採取した。
野生型(wt)マウス(C57BL6、BALB/c)および遺伝的変形マウス[C57BL6−Foxp3GFP、C57BL6−Foxp3DTR、C57BL6−Foxp3cKO(Foxp3fl/flxCD11c−cre)]の右側横腹部位にEL4/EG7、B16/F10、LLC、266−6、CT−26、4T−1およびRENCA細胞を5×105cellsの量で注入して、マウス腫瘍モデルを準備した。
Ficoll(GE Healthcare、Little Chalfont、UK)およびPercoll(Sigma Aldrich、Chemie GmbH、Taufkirchen、Germany)密度勾配遠心分離によって、TBマウスの血液および腫瘍組織からマウスPBMCsおよび腫瘍浸潤白血球(tumor infiltrated leukocytes;TILs)を分離した。lineage+(CD3+/CD14+/CD19+)細胞の枯渇(depletion)後、CD11c−microbeads(Miltenyi Biotech)を使用してFoxp3GFPマウスのTILsまたはPBMCsから樹状細胞を分離した。Foxp3cKOマウスの腫瘍大きさが小さくて、正常化(normalization)後に単一試験用として5〜10匹のTB Foxp3cKOマウスから分離したTILsをプーリング(pooling)した(p5/Eまたはp10/Eと表示)。MDSCs(myeloid derived suppressor cells)subsetsをMDSC Isolation Kit(Miltenyi Biotec)を使用してTB Foxp3GFPマウスまたは対照群Foxp3GFPマウスの血液から分離した。Foxp3+ fxDCs、cDCs、CD4+ Treg、CD8+ Tregs、CTLA4+/CTLA4−T−細胞およびCCR2+/CCR2−細胞はBD FACSAriaTMIIを使用してFoxp3GFPマウスの血液または腫瘍組織から分離した。全てのin vitro試験およびadoptive transfer(AT)試験は分離された細胞の正常化(normalization)後に行った。
表現型分析のために、免疫蛍光染色法を行った。細胞を4℃で20分間FACS bufferで適切な抗体で染色した。FITC−標識された抗−マウス抗体[Ly6g(1A8)、CD11c(N418)、I−A/I−E(M5/114.15.2)、CD3(17A2)およびB220(RA3−6B2)]はThermo Fisher−eBioscience(Waltham、MA、USA)から入手し、抗−マウスCD14(Sa14−2)抗体はBiolegend(San Diego、CA、USA)から入手した。PE(Phycoerythrin)−標識された抗−マウスFoxp3抗体(150D、Biolegend)、抗−マウスzbtb46抗体(U4−1374、BD biosciences、San Jose、CA、USA)、およびPE−標識された抗−マウス抗体[Ly6c(HK1.4)、CD11c(N418)、CD317(BST2、927)、ki−67(SolA15)およびCD25(PC61.5)]をThermo Fisher−eBioscienceから入手した。PerCP−Cy5.5−標識された抗−マウス抗体[CD11b、Gr−1(RB6−8C5)、CD44(IM7)、Foxp3(FJK−16s)、I−A/I−E、CD11cおよびCD25(PC61.5)]、PE−Cy7−標識された抗−マウス抗体[CD4(GK1.5)、CD8a(53−6.7)、F4/80(BM8)、CD16/CD32(93)、Foxp3(FJK−16s)およびCD11c(N418)]、APC−標識された抗−マウス抗体[CD3(17A2)、CD14(SA14−2)、CD19(1D3/CD19)、Foxp3(FJK−16s)、CCR2(475301)、CTLA4(UC10−4B9) and CD44(IM7)]およびPacific blue−標識された抗−マウス抗体[CD4(GK1.5)、CD8a(53−6.7)、CD3(17A2)およびCD62L(MEL−14)]をThermo Fisher−eBioscienceから入手した。全ての試料はまた、イソ型対照抗体で染色した。洗浄後、細胞をFACSCantoII(BD Biosciences、San Jose、CA、USA)およびFACS DIVA softwareで分析した。Foxp3、IFN−gamma(XMG1.2)、perforinおよびGranzyme Bに対する抗体はThermo Fisher−eBioscienceから入手し、製造者プロトコルによって細胞内染色を行った。
TBマウスの腫瘍および血液からマウスPBMCsおよびTIL(tumor infiltrated leukocytes)を分離した。分離された細胞は、適切な抗体を使用して細胞染色バッファー内で染色した。フローサイトメトリー(flow cytometry)の検出チャンネルによってそれぞれのgating strategyに合うように抗体パネルを最適化して設計し構築した。single−stained UltraComp eBeads(Affymetrix)または細胞を使用して補正(Compensation)を行った。全てのチャンネルに対して、陽性細胞および陰性細胞をFluorescence Minus Onecontrols(FMOs)およびIsotype controls基準でゲーティングし、Foxp3+はFoxp3GFPマウスの場合、GFP littermate controlを使用してゲーティングし、wt TBマウスの場合、Foxp3+細胞の細胞内染色を行った。FxDCゲーティングは、次のように行った;FVD+(Live cells)、CD45+、Lineage(CD3/CD19/CD14;T−cells、B−cells and Monocytes)−negative、CD11c+、MHC II+およびFoxp3+.fxDCsの全ての表現型パネルは前記のようなthe gating strategyを通じて行われた。FVD:Fixable Viability Dye。
TB Fopx3GFPマウスの脾臓からT細胞を分離して精製した。TB Fopx3GFPマウスの脾臓をRPMI培地で均質化させ、70μmのnylon cell strainer(BD Falcon)を通過させた後、ACK溶解バッファー(Lonza)で処理してT細胞を分離した。前記分離されたT細胞をマウス CD4 and CD8 T−cell Isolation Kit II(Miltenyi Biotech)を使用して精製した後、37℃で1mMの5,6−carboxyfluorescein succinimidyl ester(CFSE、Molecular Probes)(at 1mM for 10min)、Cell Trace Violet(CTV、Invitrogen)(at 10uM for 15min)、または4−chlorobenzenesulfonate salt(DiD、Thermo fisher)(at 5uM for 15min)で標識した。CFSE/CTV−標識されたT細胞を抗CD3/CD28抗体(アルファ−CD3 10μg/ml、アルファ−CD28 4μg/ml)と1日間インキュベーティングした後、5×105個のT細胞をfxDCsまたは他のDC subsetsと共に1:5(DC:T)の比率で3日間共培養した。細胞増殖は、フローサイトメトリー(参考例4参照)で測定した。OT−1(ovalbumin−specific、CD8+ T cells)T細胞と共に共培養した場合、脾臓OT−1 T細胞はOT−1マウスから準備し、前記のように標識した。追加刺激無く、CFSE−標識された5×105naive OT−1 T−細胞をFoxp3DTR腫瘍マウスから分離してDT−処理した(fxDC−枯渇)bDCs、またはPBS−処理(fxDC−含有)bDC、またはsp−DCsと共に1:5(DC:T)比率で共培養した。
腫瘍移植後21日目にFoxp3fl/flまたはFoxp3cKOTBマウスの腫瘍組織から分離したCD8+ T−細胞をCTV−標識された標的細胞(1×105 EL4 cells)と共に相異なる比率で24時間共培養した。PI染色後、前記参考例4を参照してフローサイトメトリーを行ってCTL活性を分析した。21日目にFoxpfl/flまたはFoxp3cKOTBマウスの腫瘍から分離されたtu−DCsをsplenic CD8+ T−細胞と1:5(DC:T)比率で3日間共培養してCTLsを生成させた後、CTL活性を測定した。FACSAriaTMIIを使用してTB Foxp3GFPマウスの腫瘍からCTLA4+またはCTLA4− CD8+ T−細胞を分離し、これらのCTL活性を調査した。
MDSC Isolation Kit(Miltenyi Biotec、Bergisch Gladbach、Germany)を使用してTB Foxp3GFPマウスの脾臓または血液から分離したM−MDSCs(1×106 cells)を対照群(腫瘍の移植を受けないtumor−freeマウス)またはTBマウスに尾静脈を通じて伝達した(Adoptive transfer;AT)。AT3日後、前記AT受けたマウス(recipient)でfxDCを分析した。
CD8+ T細胞のATを行うために、CD8+ T−cell isolation kit(Miltenyi Biotec)を使用してtumor−freeマウスまたはOT−1マウスの脾臓、またはTB Foxp3fl/flおよびFoxp3ckoマウスの血液または腫瘍組織から細胞を分離した後、前記分離された細胞をCTV(10uM)またはDiD(10uM)で37℃で15分間標識し、標識された細胞(1×106)を先に説明した方法でマウスに伝達(AT)した。
統計分析
統計分析は、GraphPad 5.0 softwareを使用して行い、P<0.05(*P<0.05、**P<0.01、***P<0.001)の場合に有意性があると決定した。全ての試験結果は、少なくとも3つ以上の試料に対して少なくとも3回以上の独立的な試験(3E)から得た。統計データは、mean±s.e.mで示した。
EL4 lymphomaをマウスに注入して準備されたマウス腫瘍モデル(参考例2参照)で、腫瘍細胞注入後、7日目から3日間隔で眼窩採血(眼球静脈採血)して血液内Foxp3を発現する樹状細胞(fxDCまたはFoxp3+ DCと表示)を測定して(参考例4および5参照)、その結果を図1に示した。図1は腫瘍成長の間のFoxp3GFPマウスの血液内のfxDC個体群(populations)モニタリング結果を示すものであって、fxDCは各グループのマウス(n=30匹のマウス;3グループ、グループ当り10匹のマウス)の眼球静脈から採血された血液に対して各時点で評価した。図1に示されているように、腫瘍マウスモデルの血液内のfxDCが腫瘍成長に比例してその比率が増加することが分かる。
また、健康な供与者(healthy donors;HD)および癌患者(膠芽腫(GBM、stages 3および4)、大腸癌(Colorecta cancer;CC、stage2(CC2)、3(CC3)および4(CC4))および胃癌(GC、stage2(GC2)、3(GC3)および4(GC4))(参考例2参照)の血液内のDC(b(blood)−DC)中のfxDCを測定して(参考例4および5参照)、その結果を図2aに示した。図2aに示されているように、マウス腫瘍モデルと同様に、人間癌患者の血液でも癌進行程度によってfxDC分布が比例して増加することを確認した。
また先に説明した方法で多様な腫瘍(EL4;リンパ腫瘍、LLC;ルイス肺癌、266−6;すい臓癌、CT−26;大腸癌、4T−1;乳癌)が移植された5−7匹の腫瘍マウスを作り、血液内のfxDC分布を調査して、その結果を図2bに示した。図2bに示されているように、腫瘍マウス血液でfxDCが多量発見された。
fxDCが腫瘍成長に与える影響を試験するために、まず、樹状細胞特異的にFoxp3発現を除去したマウス(CD11c−Cre x Foxp3fl/fl:以下、Foxp3cKOマウス)を製作して(参考例1参照)、ここに腫瘍細胞を投与して腫瘍マウスを作った後、血液内のfxDCを測定した(参考例4および5参照)。前記得られた結果を図3に示した。図3のように、Foxp3cKOマウスの血液からfxDCが除去されるのを確認することができる。
野生型マウス(Foxp3fl/fl;Foxp3が除去(knock−out)されないTBマウス)とFoxp3cKOマウスにEL4 lymphoma tumor cell(5×105 cells)を注入し、7日後から3日間隔で腫瘍成長をモニタリングした結果を図4に示した。図4の左側は腫瘍体積変化を示すグラフであり、右側は腫瘍移植後23日目の腫瘍重量を示すグラフである。図4に示されているように、野生型マウス(Foxp3fl/fl)では腫瘍大きさが持続的に増加する反面、fxDCが除去されたFoxp3cKOマウス(fxDC除去は図3の結果参照)では17日まで腫瘍が小幅成長し30日以後は完全に無くなるのを確認することができる。このような結果は、樹状細胞特異的にFoxp3を除去するかfxDCを除去することによって、腫瘍治療効果を得ることができるのを示す。
前記図4で腫瘍成長が抑制されたと確認されたFoxp3cKOマウスの腫瘍注入後、17日目の腫瘍組織内fxDC分布を測定して(参考例4および5参照)、図5に示した。図5に示されているように、実際に腫瘍成長が抑制されたFoxp3cKOマウスでfxDCが大部分無くなるのを確認することができる。
また、EL4 lymphomaだけでなく、多様な固形癌(266−6:pancreatic cancer、LLC:Lewis lung carcinoma、EG7:OVA expressing EL4 lymphoma)に対して同一な試験を行って腫瘍体積を測定して図6に示した。図6に示されているように、EL4 lymphomaだけでなく、多様な固形癌でも、EL4 lymphomaの場合と同様に、fxDCが除去されたマウスでの腫瘍抑制効果が野生型マウスより顕著に優れていることが分かった。
CD8+ T(Tc1)細胞は実際Anti−cancer immunityに重要な役割を果たす細胞であって、直接的に腫瘍細胞の死滅を誘導する(cytotoxic CD8+T−cell)。fxDCが除去されたFoxp3cKOマウスで腫瘍内のCD8+ T細胞の比率が約35.6%であって、野生型マウス(Foxp3fl/fl)でのCD8+ T細胞の比率(約16.3%)より大きく増加したことを確認した。fxDCが除去されたFoxp3cKOマウス腫瘍組織でのCD8+ T細胞中でIFN−gammaを発現するCD8+ T細胞(FN−gamma+ CD8+ T細胞;cytotoxic CD8+ T−細胞)の比率を測定して図7に示した。図7に示されているように、野生型マウス(Foxp3fl/fl)と比較して、fxDCが除去されたFoxp3cKOマウスでcytotoxic CD8+T−細胞の比率が約2.5倍増加されていることを確認した。このような結果は、fxDCによるcytotoxic CD8+T−細胞の調節効果(fxDC除去によってcytotoxic CD8+T−細胞が上向調節される)を提案する。
腫瘍組織内CD8+ T細胞が直接的に腫瘍の増殖抑制(腫瘍細胞の死滅)を誘導するか確認するために、野生型マウス(Foxp3fl/fl)とfxDCが除去されたFoxp3cKOマウスの腫瘍組織内CD8+ T細胞を分離した後、腫瘍細胞と共培養して、腫瘍細胞に対する細胞毒性効果を測定した。細胞毒性は、CTL(Cytotoxic T Lymphocytes)の活性試験(参考例7参照)で測定した。前記得られた結果を図8に示した。図8のように、Foxp3cKOマウスから分離したCD8+ T細胞が野生型マウスのCD8+ T細胞より腫瘍細胞に対する細胞毒性が顕著に高いことが分かり、このような結果は、Foxp3の除去(knock−out)によってCD8+ T細胞生成が誘導され、これを通じて腫瘍細胞の死滅率が増加して腫瘍抑制効果が得られるのを示す。
fxDC除去マウスのCD8+ T−細胞によるCTL活性(細胞毒性)が向上される機序を確認するために、多様な細胞表面免疫活性/抑制分子の発現を調査した。この中で、fxDCが除去されたTBマウスの腫瘍組織のCD8+ T細胞でのCTLA4(cytotoxic T−lymphocyte−associated protein4)発現水準を野生型マウス(TB)と比較して図9に示した。図9に示されているように、fxDCが除去されたTBマウスの腫瘍組織のCD8+ T細胞でCTLA4発現水準(約8.92%)が野生型TBマウスでのCTLA4発現水準(約79.5%)と比較して大きく減少することを確認した。
fxDCがCD8+ T細胞のCTLA4発現を調節する機作を確認するために、正常マウス(腫瘍が移植されない)のCD8+ T細胞(Donor T細胞:DiD stained)を腫瘍が移植された野生型マウスとFoxp3cKOマウスにそれぞれ尾静脈を通じてadoptive transfer(AT)(参考例8参照)した後、3日後に、腫瘍組織内Donor T細胞(DiD+ CD8+ T細胞)中でCTLA4発現CD8+ T細胞(CTLA4+ CD8+ T細胞)を測定して、その結果を図10に示した。図10に示されているように、fxDCが除去されたマウスではDonor CD8+ T細胞でCTLA4発現が大きく減少されるのを確認することができる。
CD8+ T細胞でのCTLA4発現が抗癌免疫の核心になるCTL反応(腫瘍細胞に対する細胞毒性)を調節するか確認するために、EL4 TBマウスのEL4腫瘍からCTLA4+ CD8+ T細胞とCTLA4− CD8+ T細胞を分離した後、腫瘍細胞(EL4)を標的細胞にしてCTL活性を試験して、その結果を図11に示した。図11に示されているように、CTLA4を発現するCTLA4+ CD8+ T細胞はCTLA4を発現しないCTLA4− CD8+ T細胞よりCTL活性が顕著に減少するのを確認することができる。
前記結果は、腫瘍および腫瘍環境によって誘導されるfxDCが腫瘍内CD8+ Tregを誘導し(下記実施例5参照)、この細胞が腫瘍を除去するために寄り集まるCTLの活性を抑制して腫瘍の持続的な成長に関与し、fxDCを除去する場合、CTL活性を抑制するCTLA4発現が減少し腫瘍特異的CTL活性が抑制されなくて効果的な抗癌免疫を誘導することによって腫瘍成長を顕著に阻害することができるのを示す。したがって、腫瘍患者からfxDCを除去すれば、効果的な抗癌免疫を誘導して優れた癌成長抑制効果および/または癌治療効果を得ることができると期待される。
前記結果は、fxDCによって誘導されるCD8+ TregがT細胞増殖を抑制し抗癌免疫を主管するCTL活性を減少させるのを示すものであって、fxDCの除去によってT細胞免疫および/または抗癌免疫が強化できるのを提案する。
野生型正常マウスにEL4腫瘍細胞を5×105cellの量でs.c injectionした。14日後、前記マウスの血液からPBMCを分離した後、Ficoll−Paque(GE healthcare、Cat.#17−5442−02)1mlを15ml conical tube(Hyundai micro、Cat.#H20050)に満たし、同量の血液またはbuddy coatをFicoll−Paque tubeに混ざらないようにoverlayさせた。多目的遠心分離機(Gyrozen、Cat.#1580MGR)の加速力を1、減速力(DCC)を0と設定し、2500rpmで30分間濃度勾配遠心分離を施行した。遠心分離後、最上層の血漿と中間の単核球層を分離し、分離された単核球からCD11c−Microbeadsを使用してCD11c+樹状細胞を分離した。
正常マウスの脾臓(spleen)を摘出した後、cell strainerを使用して単一細胞に分離し、RBC lysis bufferを使用して前記分離された単一細胞から全ての赤血球を除去した後、Microbeadsを使用してCD8+ T細胞を分離した。分離されたCD8+ T細胞をCD3/CD28でコーティングされた96ウェルプレート(Well plate)に2.5×105 cellずつ分注した。
前記CD8+ T細胞が含まれている96ウェルプレート(well plate)に先に血液から分離された樹状細胞を分注してCD8+ T細胞と3日間共培養した後、CD8+ T細胞を回収して以下の実施例5および実施例6分離および分析に用いた。
前記のようにfxDCとCD8+ T細胞の共培養によってCD8+ Tregが誘導されるのを確認するために、Foxp3GFP TBマウスから分離して抗−CD3/28抗体で予備活性化(pre−activation)させたCTV−標識CD8+ T細胞をFoxp3GFP TBマウスの血液から分離したDCと共培養し、Foxp3+ CD8+ Treg分布を測定した。前記結果を図12に示し、前記結果からfxDCとCD8+ T細胞の共培養によってCD8+ Tregが誘導されるのを確認することができる。
fxDCによってCD8+ Treg(CD8+ regulatory T cell)が誘導されるかどうかを試験するために、脾臓DC(spDC)またはfxDCが含まれている血液DC(bDC)とfxDCが除去された血液DC(Foxp3−DTRマウスにDiphtheria Toxin(DT)を処理すれば、標的細胞が除去される;fxDC−depleted(DT−treated)bDCs(bDC/DT))と抗−CD3/28抗体で予め活性化(pre−activation)させたT細胞を共培養して、全体T細胞に対するFoxp3+ CD4+およびCD8+ T細胞比率を測定して、図13に示した。図13に示されているように、fxDCが除去された血液DCはCD8+ Tregを全く誘導しないのを確認することができる。
fxDCによって誘導されるCD8+ Tregが腫瘍成長といかなる関連性があるか試験するために、EL4細胞を27匹のFoxp3GFPマウスに同時接種してTBマウスを製作した後、一日に一匹ずつ犠牲にして分析した。前記TBマウスの血液内のfxDCおよびCD8+ Tregを測定して、血液DC中のfxDC比率(%)をx軸にし、血液内のCD8+ Tregの比率(% of CD8+ Tregs/CD8+ T−cell)をy軸にして、図14に示した。図14に示されているように、TBマウスの血液で腫瘍成長によって増加するfxDCと比例してCD8+ Tregが増加するのを確認した。
fxDCが除去されたマウスで腫瘍が成長して一定時間後に無くなる結果(図4参照)を基礎にして、Foxp3cKOTBマウスと野生型TBマウスの腫瘍組織でのFoxp3+ CD4+およびCD8+ Tregの分布を測定して図15に示した。図15に示されているように、fxDCが除去されたマウスの腫瘍組織でCD8+ Tregが野生型マウスに比べて大きく減少する反面、CD4+ Treg細胞はfxDC存在有無による影響を受けないのを確認した。
fxDCによって誘導されるCD8+ TregのT細胞免疫および抗癌免疫に及ぼす効果を試験するために、脾臓CD8+ T−細胞を抗−CD3/28抗体で刺激した後、Foxp3GFPTBマウスの腫瘍から分離した腫瘍−CD4+ Treg(tu−CD4+ Treg)細胞および腫瘍−CD8+ Treg(tu−CD8+ Treg)細胞と共に3日間共培養した後、CD8+ T細胞増殖程度およびIFN−gamma+細胞を測定した(参考例5および6参照)。
図16はCD4+ Treg(tu−CD4+ Treg)細胞およびCD8+ Treg(tu−CD8+ Treg)細胞の増殖を測定した結果を示すものであって、抗−CD3/28抗体が処理された(pre−activated)T細胞とCD8+/CD4+ Treg細胞の共培養時、CD8+ TregがCD4+ Treg細胞より高い水準にT細胞増殖を抑制するのを示す。
図17は抗−CD3/28抗体が処理された(pre−activated)T細胞とCD8+/CD4+ Treg細胞の共培養時、IFN−gamma+ T細胞水準を示す結果であって、抗−CD3/28抗体が処理された(pre−activated)T細胞とCD8+/CD4+ Treg細胞の共培養時、IFN−gammaを発現するCTL(CD8+ IFN−gamma+ T細胞)の水準が大きく減少するのを示す。
前述の実施例で確認されたように、CTLA4+ CD8+ T細胞でCTL活性が無くなる(図10参照)。よって、CD8+ TregがCTLA4+ CD8+ T細胞を直接的に誘導するかどうかを試験した。このために、in vitroでfxDCによって誘導されたCD8+ Tregを正常マウスのCD8+ T細胞と共培養した後、CTLA4+ CD8+ T細胞水準を測定した。より具体的に、野生型(正常)マウスから分離されたCD8+ T−細胞を抗−CD3/28抗体で刺激した後、Foxp3f/fおよびFoxp3cKOTBマウス腫瘍から分離したtu−DCと共に3日間共培養した後、tu−DC誘導CD8+ T細胞を精製し、DiD−標識された野生型CD8+ T−細胞と共に3日間共培養した後、CD8+ T−細胞内のCTLA−4発現を測定した。前記得られた結果を図18に示した。図18に示されているように、Foxp3cKOTBマウスでのCTLA4+ CD8+ T細胞水準が野生型TBマウスと比較して顕著に減少するのを確認することができる。このような結果は、fxDCによって誘導されたCD8+ Tregが直接的にCTLA4+ CD8+ T細胞を誘導するのを示す。
野生型CD8+ T細胞をDiDで標識し、抗−CD3/28抗体で刺激した後、Foxp3DTR TBマウスの腫瘍から分離されたDT−処理tu−CD8+ T−細胞(CD8 Treg−depleted)またはPBS−処理tu−CD8+ T−細胞と共に3日間共培養した後、CTLA4+ CD8+ T細胞水準を測定して図19に示した。図19に示されているように、DT−処理によってCD8+ Tregを全て除去した場合、CTLA4+ CD8+ T細胞が全く誘導されないのを確認した。
前記結果を総合すれば、fxDCによって誘導されるCD8+ Tregは癌細胞を直接攻撃するCTLでのCTLA4発現を誘導してCTL活性を抑制するのを確認することができ、このような結果から、CD8+ Tregを除去することによって抗癌免疫を強化させてより効果的な癌治療が可能になるのを示唆し、抗癌剤開発においてCD8+ Tregの抗癌治療ターゲットとしての有用性を提供する。
Claims (22)
- Foxp3を発現する樹状細胞の阻害剤を含む、癌治療用薬学組成物。
- 前記Foxp3を発現する樹状細胞の阻害剤は、抗体、細胞毒性薬物(cytotoxic drugs)、抗体−細胞毒性薬物接合体、および抗体−磁性粒子(antibody−magnetic particle composites)からなる群より選択された1種以上の阻害剤、または前記阻害剤を含むナノ伝達体(nano−delivery system)の形態である、請求項1に記載の癌治療用薬学組成物。
- 前記組成物は、その腫瘍組織または血液から、Foxp3を発現する樹状細胞が検出される癌患者に投与するために使用される、請求項1または2に記載の癌治療用薬学組成物。
- Foxp3を発現する樹状細胞の阻害剤を含む、CD8を発現する調節T細胞阻害用薬学組成物。
- 前記Foxp3を発現する樹状細胞の阻害剤は、抗体、細胞毒性薬物(cytotoxic drugs)、抗体−細胞毒性薬物接合体、および抗体−磁性粒子からなる群より選択された1種以上の阻害剤、または前記阻害剤を含むナノ伝達体の形態である、請求項4に記載のCD8を発現する調節T細胞阻害用薬学組成物。
- 前記組成物は、その腫瘍組織または血液から、Foxp3を発現する樹状細胞が検出された癌患者に投与するために使用される、請求項4または5に記載のCD8を発現する調節T細胞阻害用薬学組成物。
- CD8を発現する調節T細胞の阻害剤を、癌治療用の有効性分として含む、薬学組成物。
- 前記CD8を発現する調節T細胞の阻害剤は、抗体、細胞毒性薬物(cytotoxic drugs)、抗体−細胞毒性薬物接合体、および抗体−磁性粒子からなる群より選択された1種以上の阻害剤、または前記阻害剤を含むナノ伝達体の形態である、請求項7に記載の癌治療用薬学組成物。
- 前記組成物は、その腫瘍組織または血液から、CD8を発現する調節T細胞が検出される癌患者に投与するために使用される、請求項7または8に記載の癌治療用薬学組成物。
- Foxp3を発現する樹状細胞の阻害剤を癌治療を必要とする患者に投与する段階を含む、癌治療方法。
- 前記Foxp3を発現する樹状細胞の阻害剤は、抗体、細胞毒性薬物(cytotoxic drugs)、抗体−細胞毒性薬物接合体、および抗体−磁性粒子からなる群より選択された1種以上の阻害剤、または前記阻害剤を含むナノ伝達体である、請求項10に記載の癌治療方法。
- 前記患者は、腫瘍組織または血液からFoxp3を発現する樹状細胞が検出された癌患者である、請求項10に記載の癌治療方法。
- Foxp3を発現する樹状細胞の阻害剤を、必要とする患者に投与する段階を含む、CD8を発現する調節T細胞を阻害する方法。
- 前記Foxp3を発現する樹状細胞の阻害剤は、抗体、細胞毒性薬物(cytotoxic drugs)、抗体−細胞毒性薬物接合体、および抗体−磁性粒子からなる群より選択された1種以上の阻害剤、または前記阻害剤を含むナノ伝達体の形態である、請求項13に記載のCD8を発現する調節T細胞を阻害する方法。
- 前記患者は、その腫瘍組織または血液から、Foxp3を発現する樹状細胞が検出される癌患者である、請求項13に記載のCD8を発現する調節T細胞を阻害する方法。
- CD8を発現する調節T細胞の阻害剤を癌治療を必要とする患者に投与する段階を含む、癌治療方法。
- 前記CD8を発現する調節T細胞の阻害剤は、抗体、細胞毒性薬物(cytotoxic drugs)、抗体−細胞毒性薬物接合体、および抗体−磁性粒子からなる群より選択された1種以上の阻害剤、または前記阻害剤を含むナノ伝達体である、請求項16に記載の癌治療方法。
- 前記患者は、腫瘍組織または血液からCD8を発現する調節T細胞が検出された癌患者である、請求項16に記載の癌治療方法。
- 候補化合物を、Foxp3を発現する樹状細胞、CD8を発現する調節T細胞、またはこれらの両方と接触させる段階;
Foxp3を発現する樹状細胞、CD8を発現する調節T細胞、またはこれらの両方の水準を測定する段階;および
前記測定されたFoxp3を発現する樹状細胞、CD8を発現する調節T細胞、またはこれら両方の水準を、前記候補化合物での処理前に測定された水準と比較して減少した場合に、前記候補化合物を抗癌剤候補物質と決定する段階
を含む、抗癌剤のスクリーニング方法。 - Foxp3を発現する樹状細胞とCD8を発現するT細胞と共に培養する段階を含む、CD8+ Treg細胞の製造方法。
- 患者から分離された生物学的試料から、Foxp3を発現する樹状細胞、CD8を発現する調節T細胞、またはこれらの両方を検出する段階を含む、癌診断または癌予後確認のために情報を提供する方法。
- 患者から分離された生物学的試料から、Foxp3を発現する樹状細胞を検出する段階を含む、抗癌治療の有効性のモニタリングに情報を提供する方法。
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