KR20190140904A - HCV NS5B 폴리머레이즈(polymerase) 억제제의 전구약물 및 이의 생산 방법과 응용 - Google Patents
HCV NS5B 폴리머레이즈(polymerase) 억제제의 전구약물 및 이의 생산 방법과 응용 Download PDFInfo
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- C07H19/02—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof sharing nitrogen
- C07H19/04—Heterocyclic radicals containing only nitrogen atoms as ring hetero atom
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- C07H19/10—Pyrimidine radicals with the saccharide radical esterified by phosphoric or polyphosphoric acids
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Abstract
본 발명은 전구약물 및 이를 환자에서 C형 바이러스성 간염을 치료하는데 응용하는 것에 관한 것 이다.
상기 전구약물은 일반 화학 구조식 1의 전구약물, 이의 입체이성질체, 동위원소 농축 유사체, 또는 결정체 또는 다형성(polymorphic form) 형태의 화합물이다.
상기 전구약물은 일반 화학 구조식 1의 전구약물, 이의 입체이성질체, 동위원소 농축 유사체, 또는 결정체 또는 다형성(polymorphic form) 형태의 화합물이다.
Description
본 발명은 화학요법제제들 및 이들의 바이러스 질병 및 암의 치료를 위한 응용에 관한 것이다. 이들 화합물들은 HCV NS5B 폴리머레이즈 (polymerase) 억제제의 전구약물들이며 포유류에서 C 형 간염(hepatitis C)을 치료 하려는 의도이다.
HCV에 의한 C 형 간염(hepatitis C) 은 세계적으로 가장 널리 퍼지는 간 질환들 중에 하나이다. 세계 보건 기구 (World Health Organization) (WHO)의 년간 보고에 따르면, 130-150 mln 이상의 사람이 HCV로 감염되며 700,000 이상의 개인이 HVC로 인해 죽는다 [WHO. Hepatitis C. WHO fact sheet ¹ 164. Updated July 2016, http://www.who.int/mediacentre /factsheets/fs164/en/]. HCV는 유전적으로 고도의 다양성을 보이며 및 HCV 유전자형 (genotype)의 지역적인 변들이(gT) 특징이다. 유전자형 1 (gT1)은 세계에서 가장 흔하다 (83.4 mln 사람, 또는 모든 HCV-감염자의 46.2 %; 이들의 약 삼분의 일(1/3)은 동 아시아). 유전자형 3 (gT3)은 두 번째로 가장 흔한 유전자형이다. 전 세계적으로, 54.3 mln 사람 (30.1 %)이 gT3 로 감염된다. 유전자형 2, 4, 및 6 는 모든 HCV-감염자의 22.8 %의 원인이며, 반면에 유전자형 5(gT5) 는 <1% 의 원인이다. 유전자형 1 및 3이 이들의 경제적 상황과 관계없이 대부분의 나라에서 흔하며, 유전자형 4 및 5가 가장 많이 나타나는 곳은 저-소득 상태에서 이다[Messina, J. P. at al. Global Distribution and Prevalence of Hepatitis C Virus Genotypes. Hepatology 2015, 61(1), 77-87.]
최근 몇 년에 달성 된 C 형 간염의 치료에 상당한 진전이 있는 것은 주로 소포스부비아(Sofosbuvir (Sovaldi®, PSI-7977, GS-7977))의 발견과 관련 되며, 이는 HCV NS5B 억제제의 뉴클레오사이드 전구약물(nucleoside prodrug)이며 전구약물 PSI-785의 Sp 이성질체이다. [Sofia, M. J. et al. Discovery of a β-D-20-Deoxy-20-rfluoro-2 0-β-C-methyluridine Sovaldi Nucleotide Prodrug (PSI-7977) for the Treatment of Hepatitis C Virus. J. Med. Chem. 2010, 53, 7202-7218. Sofia, M. J. et al. Nucleoside phosphoramidate prodrugs. Patent US 7964580 (2011), Patent US 8334270 (2012). Patent RU 2478104 (2013)],
소발디(Sovaldi®)는 현재 HCV NS5A 억제제들과 함께 포함되어 C형 간염 복합 치료에 널리 적용 되고 있다. 소발디(Sovaldi®)는 여러 가지 HCV 유전자형 (gT)에 의해 감염된 C형 간염 환자들의 복합 치료제로 FDA 및 EC 규제 기관에서 허가 된 첫 번째 뉴클레오타이드가 되었다. 임상 연구들에서, 이는 6 개의 HCV 유전자형들 (gT1-gT6)에 대해 높은 역가를 보여 주었다 [I.M. Jacobson et al. Sofosbuvir for hepatitis C genotype 2 or 3 in patients without treatment options. Engl. J. Med. 2013, 368, 1867-1877. E. Lewirz et al. Sofosbuvir for previously untreated chronic hepatitis C infection. Engl. J. Med. 2013, 368, 1878-1887].
PSI-7851 및 이의 입체이성질체 PSI-7976 및 PSI-7977은 트리포스페이트 (triphosphate) PSI7409로 대사되며, 이는 실제로 HCV NS5B 폴리머레이즈 억제제이다 [E. Murakami et al. Mechanism of activation of PSI-7851 and its diastereoisomer PSI-7977. J. Biol. Chem. 2010, 285(45), 34337-34347],
화학구조식 A1의 싸이클로헥실 (S)-2-{[(2R,3R,4R,5R)-5-(2,4-디옥소-3,4-디하이드로-2H-피리미딘-1-일)-4-풀루오로-3-하이드록시-4-메틸-테트라하이드로푸란-2-일메톡시]-펜옥시-포스포릴아미노}-프로피오네이트 ((cyclohexyl (S)-2-{[(2R,3R,4R,5R)-5-(2,4-dioxo-3,4-dihydro-2Н-pyrimidin-1-yl)-4-fluoro-3-hydroxy-4-methyl-tetrahydrofuran-2-ylmethoxy]-phenoxy-phosphorylamino}-propionate))를 포함하는 다른 알려진 소발디(Sovaldi®) 유사체들이 있으며 [Patent US 8334270 (2012). M. J. Sofia et al. Discovery of a β-D-20-Deoxy-20-r-fluoro-20-β-C-methyluridine Nucleotide Prodrug (PSI-7977) for the Treatment of Hepatitis C Virus. J. Med. Chem. 2010, 53, 7202-7218.], PSI-7851 및 이의 인 (phosphor) 입체이성질체들 PSI-7976 및 PSI-7977 (Sovaldi®) 와 같이, 트리포스페이트 (triphosphate) PSI-7409로 대사된다.
그러나 C형 간염 치료의 최근 진전에도 불구하고, 향상된 성질을 갖는 HCV NS5B 억제제의 새로운 전구약물에 대한 요구는 아직도 주된 도전으로 남아 있다.
본 발명가들은 일반 화학구조식 1 및 이의 인 함유한(phosphorous) 입체이성질체인 화학구조식 1.1 (Sp 입체이성질체) 및 1.2 (Rp 입체이성질체)를 가진 이전에 알려지지 않은 화합물이 HCV NS5B 폴리머레이즈 억제제의 강력한 전구약물이고 전망이 좋은 항 바이러스제, 그 중 에서도, C 형 간염의 치료에 전망이 좋을 것 임을 놀랍게도 발견했다.
아래에 이 발명을 서술하기 위해 사용된 여러 가지 용어들의 정의가 목록화 되어 있다. 개별적으로 또는 더 큰 그룹의 한 파트로서, 달리 특별한 경우에 제한되지 않는 한, 이 정의들은 이 상세 설명서 및 청구항에 전체적으로 사용 될 때 그 용어에 적용된다.
"결정체 형태(crystalline form)" 라는 용어는 분자들이 결정 격자(lattice)를 형성하도록 정렬 되어 있는 물질의 구조를 의미한다.
"다결정체 형태(polycrystalline form)" 라는 용어는 다수의 작은 단결정들 또는 어떤 결정 형태의 미세결정들로 구성된 다결정체 물질 구조를 의미한다.
"활성 성분(active component) (약물 물질) (drug substance)"은 합성 또는 다른 기원으로(생명공학기술, 식물, 동물, 박테리아, 및 그 외 등으로) 얻어진 생리적으로 활성이 있는 화합물을 의미하며, 이들은 약리학적인 활성을 보이며 약학적 조성물의 활성 성분들이다.
"의학적 약물(medical drug)"이란 용어는 사람이나 동물에서 생리적 기능을 회복시키거나, 향상 또는 수정시키기 위해, 및 질병들의 치료 및 예방을 위해, 진단제, 마취제, 피임제, 화장품제, 등을 위한 의도로 타블렛, 주사제, 연고 형태, 또는 다른 완성된 용법 형태의 화합물을 (또는 약학적 조성물을 구성하는 화합물들의 혼합) 의미한다.
"치료적인 칵테일(therapeutic cocktail)" 이란 용어는 서로 다른 약리학적인 활성을 보이며 질병의 발병에 관여는 여러 생물학적 타겟을 겨냥한 두 개 또는 그 이상의 의학적 약물들의 조합을 동시에 투여함을 의미한다.
“약학적 조성물 (pharmaceutical composition)”이란 용어는 화학구조식 1의 화합물과 약학적으로 허용할 만한 및 약리학적으로 호환이 될 만한 충전제(fillers), 용매(solvents), 희석제(diluents), 캐리어(carriers), 보조제(auxiliary), 분배 및 수용제 (distributing, and receptive agents), 첨가제(excipients), 및 방부제(preservatives), 안정제(stabilizers), 충전제(fillers), 붕해제(disintegrators), 보습제(moisteners), 유화제(emulsifiers), 현탁제(suspending agents), 점도증가제(thickeners), 감미료(sweeteners), 향미제(flavoring agents), 방향제(aromatizing agents), 항박테리아제(antibacterial agents), 진균제(fungicides), 윤활제(lubricants), 및 지속성 전달 조절제( prolonged delivery controllers)와 같은 전달제(delivery agents) 로 구성된 그룹으로부터 선택된 적어도 하나의 성분을 포함하는 조성물을 의미하며, 이들의 선택 및 비율은 투여 성격 및 경로 및 용법에 의존 한다. 적절한 현탁제 (suspending agents)의 예시들에는 에톡실화된 이소스테아릴 알코올(ethoxylated isostearyl alcohol), 폴리옥시에틸렌(polyoxyethylene), 소르비톨 및 소르비톨 에테르(sorbitol and sorbitol ether), 마이크로크리스탈린 셀루로오즈(microcrystalline cellulose), 알루미늄 메타하이드록사이드(aluminum metahydroxide), 벤토나이트(bentonite), 아가-아가(agar-agar) 및 트라가칸트 (tragacant), 및 이들의 혼합물들이 있다. 미생물들로부터의 보호는 파라벤(parabens), 클로로부탄올(chlorobutanol), 소르빅 에시드(sorbic acid) 및 이와 비슷한 것과 같은, 다양한 항박테리아제 및 항곰팡이제를 사용하여 제공 될 수 있다. 상기 조성물은 또한 설탕 (sugar), 소듐 클로라이드(sodium chloride), 및 이와 유사한 것과 같은 등장제(isotonic agents)를 포함 할 수 있다. 조성물의 지속적인 활성은 활성 성분의 흡수를 감속시키는 제제, 예를 들어, 알루미늄 모노스테아레이트(aluminum monostearate) 및 젤라틴(gelatin)을, 사용하여 달성 시킬 수 있다. 적절한 캐리어(carriers), 용매, 희석제 및 전달제들의 예시들에는 물, 에탄올, 폴리알코올 (polyalchols) 및 이들의 혼합물, 천연 오일(올리브와 같은), 및 주사제를 위한 유기 에스터 (organic ester)((에틸 올레에이트 (ethyl oleate)와 같은))가 포함 된다. 충전제들의 예시들에는 락토즈(lactose), 밀크 슈가(milk sugar), 소듐 시트레이트(sodium citrate), 칼슘 카보네이트(calcium carbonate), 칼슘 포스페이트(calcium phosphate), 및 이와 비슷한 것들이 있다. 분해제(disintegrators) 및 분배제(distributor)의 예시들에는 전분(starch), 알기닉 에시드(alginic acid) 및 이의 염들, 및 실리케이트(silicates)가 있다. 윤활제의 예시들에는 마그네슘 스테아레이트 (magnesium stearate), 소듐 라우릴 설페이트(sodium lauryl sulfate), 탈크(talc), 및 고분자량의 폴리에틸렌 글라이콜 (polyethylene glycol)이 있다. 활성 성분의, 단독으로 또는 다른 활성 화합물과 함께, 경구, 설하, 경피(transdermal), 근육내, 정맥내, 피하 및 국부 또는 직장내 투여를 위한 약학적 조성물은 전통적인 약학적 캐리어들과의 혼합물로서 표준 투여 형태로 동물들 및 사람들에게 투여 될 수 있다. 적절한 표준 투여 형태들에는 타블렛, 젤란틴 캡슐(gelatin capsule), 알약, 분말, 과립, 츄잉껌, 및 경구 용액 또는 현탁액과 같은 경구 형태; 설하 및 구강을 통한(tra nsbuccal) 투여 형태; 에어러졸(aerosols); 임플렌트(implant); 국소(local), 경피(transdermal), 피하(subcutaneous), 근육내(intramuscular), 정맥내(intravenous), 비강내(intranasal), 또는 안내의(intraocular)형태들; 및 직장 (rectal) 투여 형태가 포함된다.
"불활성 충전체(inert filler)" 란 용어는 여기서 사용된 대로 조성물을 형성하는데 사용되고 및 보통, 안전하고, 비독성이며, 및 생물학적으로 또는 달리 바람직하지 않지 않은 화합물을 의미하며, 및 수의학적 및 사람에게 약학적 용도를 위해 허용될 만한 첨가제들을 포함한다. 이 발명의 화합물들은 개별적으로 투여 될 수도 있으나 그러나 생각하고 있는 약물의 투여 경로 및 표준 약학적 실례에 따라 하나 또는 그 이상의 약학적으로 허용될 만한 첨가제, 희석제 또는 담체들과 혼합물로서 일반적으로 투여 된다.
"치료적으로 효과적인 양(therapeutically effective amount)"이란 용어는, 여기서 사용된 대로, 한 대상에서 질병의 증상들을 완화시키기 위해 필요한 물질, 전구약물 또는 약물의 양을 의미한다. 물질, 전구약물 또는 약물의 용량은 각 특별한 케이스에서 각 개인의 요구에 맞을 것이다. 상기 용량은 치료될 질병의 심각성 정도, 환자의 나이 및 일반적인 컨디션, 환자의 치료를 위해 사용되는 다른 치료약들, 투여 방법 및 경로, 및 담당의사의 경험 등과 같은 수많은 요소들에 따라 광범위하게 변할 수 있다. 경구 투여를 위해, 일일 용량은, 그들 사이의 모든 값을 포함하여, 단독치료 및/또는 복합치료에서 모두 대략적으로 0.01-10 g 이다. 바람직한 일일 용량은 0.1-7g 정도 이다. 일반적으로, 바이러스를 완화시키거나 또는 제거하기 위하여, 치료 시작 할 때에는 좀 더 높은 부하용량(loading dose)이 주어지고 이어서 감염이 터지는 것(infection burst)을 예방하기에 충분한 수준의 용량으로 감소 시킨다.
"대상(subject)"은, 이것에만 국한 하지 않으나, 소, 돼지, 양, 닭, 칠면조, 버펄로(buffalos), 라마(lamas), 타조(ostriches), 개, 고양이, 및 사람을 포함하는 포유류를 의미하며; 사람 대상이 가장 바람직하다. 대상의 치료에는 일반 화학구조식 1의 전구약물, 이의 입체이성질체, 동위원소 농축 유사체 (isotopically enriched analog), 약학적으로 허용될 만한 염, 수화물(hydrate), 용매화합물, 및 결정체 및 다형성(polymorphic) 형태, 또는 HCV NS5A 억제제를 포함하는 다른 화합물과의 조합의 사용이 관여 될 수 있다는 것으로 추정 한다.
본 발명의 주제는 일반 화학구조식 1의 싸이클로부틸 (S)-2-{[(2R,3R,4R,5R)-5-(2,4-디옥소-3,4-디하이드로-2H-피리미딘-1-일)-4-풀루오로-3-하이드록시-4-메틸-테트라하이드로푸란-2-일메톡시]-펜옥시-포스포릴아미노}-프로피오네이트 (cyclobutyl (S)-2-{[(2R,3R,4R,5R)-5-(2,4-dioxo-3,4-dihydro-2
-pyrimidin-1-yl)-4-fluoro-3-hydroxy-4-methyl-tetrahydrofuran-2-ylmethoxy]-phenoxy-phosphorylamino}-propanoate), 이의 인 (phosphorus) 입체이성질체들 (화학구조식 1.1의 Sp 입체이성질체 또는 화학구조식 1.2의 Rp 입체이성질체), 이들의 동위원소 농축 유사체(isotopically enriched analog), 또는 결정체(crystalline) 또는 다결정체 형태이다.
본 발명의 주제는 이들을 필요로 하는 사람 또는 온혈동물에서 C형 간염의 치료를 위한 의학적 약물로서의 일반 화학구조식 1, 이의 인 입체이성질체들 (화학구조식 1.1의 Sp 입체이성질체 또는 화학구조식 1.2의 Rp 입체이성질체), 이들의 동위원소 농축 유사체(isotopically enriched analog), 또는 결정체(crystalline) 또는 다결정체 형태의 HCV NS5B 폴리머레이즈 억제제의 전구약물 (prodrug)이다.
바람직한 전구약물들은 싸이클로부틸 (S)-2-{(S)[(2R,3R,4R,5R)-5-(3,4-디하이드로-2,4-디옥소-2H-피리미딘-1-일)-3-하이드록시-4-메틸-4-풀루오로-테트라하이드로푸란-2-일메톡시]-펜옥시-포스포릴아미노}-프로피오네이트 ((cyclobutyl (S)-2-{(S)[(2R,3R,4R,5R)-5-(3,4-dihydro-2,4-dioxo-2H-pyrimidin-1-yl)-3-hydroxy-4-methyl-4-fluoro-tetrahydrofuran-2-ylmethoxy]-phenoxy-phosphorylamino}-propanoate)) (1.1), 이의 동위원소 농축 유사체(isotopically enriched analog), 또는 결정체(crystalline) 또는 다결정체 형태이다.
놀랍게도, 일반 화학구조식 1, 이의 동위원소 농축 유사체(isotopically enriched analog), 또는 결정체(crystalline) 또는 다결정체 형태의 새로운 전구약물은 알려진 HCV NS5B 억제제의 전구약물보다 더 효과적인 HCV NS5B 억제제의 전구약물인 것으로 나타났으며 및, 특히, 소발디 (Sovaldi®) 및 화학구조식 A1의 싸이클로헥실 에스터 (cyclohexyl ester)보다 더 강력하다.
실제, 소발디 (Sovaldi®)는 HCV 유전자형 1b(gT1b) 에 대해 
Ρ50 = 0.045-0.170 μM [http://www.hcvdruginfo.ca/downloads/HCV_Sofosbuvir.pdf] 및 
Ρ90 = 0.59 μM를 갖는 반면에, 새로운 전구약물 화학구조식 1.1은 
Ρ50 = 15.0-27.0 nM 및 
Ρ90 = 128.0 nM (표 1
)를 가지며, 이는 새로운 전구약물 화학구조식 1.1이, 소발디 (Sovaldi®) 보다 3배 이상 더 활성이 있음을 의미한다. 전구약물 화학구조식 1.1의 사람 간 마이크로좀 S9 분획(liver microsomal S9 fraction)에서의 반감기는 T1/2 hS9 = 0.05 시간이고, 반면에 소발디 (Sovaldi®)는 T1/2 hS9 = 0.54 시간 (표 3)이며, 이는 새로운 전구약물 화학구조식 1.1의 사람 간 마이크로좀 S9 분획(liver microsomal S9 fraction)에서의 대사 속도는 소발디 (Sovaldi®)보다 11 배 빠름을 의미한다. 추가로, 전구약물 화학구조식 1.1의 대사 과정으로부터 생긴 쥐 간에서의 PSI-7409 트리포스페이트(triphosphate)의 농도 및 AUC24h 는 각각 Ρmax = 3 224.0 ng/g 및 AUC24h = 30 487.0 ng·h/g이며, 반면에 소발디 (Sovaldi®)의 비슷한 대사는 Ρmax = 1 934.0 ng/g 및 AUC24h = 16 796.0 ng·h/g (표 4)이다. 이는 새로운 전구약물 화학구조식 1.1이 간에서 필요로 하는 PSI-7409 트리포스페이트(triphosphate)(약물)로 거의 두 배 더 효과적으로 대사 된다는 사실을 입증하고 있다.
새로운 전구약물 화학구조식 1.1은 알려진 화학구조식 A1의 싸이클로헥실 에스터와 비교하여도 더 좋은 효과를 가졌다, 왜냐하면 상기 전구약물은 다음의 계수들을 가진 것으로 알려 졌기 때문이다[M. J. Sofia et al. J. Med. Chem. 2010, 53, 7202-7218]: ЕС90 = 250.0 nM, T1/2 hS9 = 1.4 h, Сmax = 557 ng/g 및 AUC24h = 6 484.0 ng·h/g.
얻은 결과들은 놀랍다, 왜냐하면, 싸이클로부틸 에스터인, 전구약물 화학구조식 1 은 화학구조식 A1의 싸이클로헥실 에스터인, 이의 유사체보다 좀더 효과적인 것일 뿐만 아니라, 본 발명들의 상기 놀라운 효과를 좀 더 보여주기 위해 특별히 제조한 또 다른 이의 유사체인, 화학구조식 A2의 싸이클로프로필 에스터 (
Ρ90 = 73.0 nM, 
Ρ90 = 410.0 nM, 표 2 참조), 보다 더 활성적이기 때문이다.
놀라운 것은, 싸이클로알킬 에스터(cycloalkyl esters) 시리즈에서, 가장 효과적인 것은 중간-크기의 싸이클로알킬을 가진 화학구조식 1.1의 싸이클로부틸 에스터(cyclobutyl esters)인 것으로 나타났으며, 반면에 좀 더 큰 싸이클로알킬 (알려진 화학구조식 A1의 싸이클로헥실 에스터) 및 작은 크기의 싸이클로알킬(본 발명가들에 의해 특별히 제조된 화학구조식 A.2의 싸이클로프로필 에스터)은 덜 효과적인 것으로 나타났다.
상기 데이터는 본 발명의 신규성 및 수준(효과성)에 대한 확실한 증명이다.
본 발명의 주제는 HCV NS5B 폴리머레이즈 억제제의 성질을 소유한 의학적 약물 이며, 상기 의학적 약물은 일반적인 화학구조식 1, 이의 입체이성질체들, 이들의 동위원소 농축 유사체(isotopically enriched analog), 또는 결정체(crystalline) 또는 다결정체 형태 화합물로서 이들을 필요로 하는 사람 또는 온혈동물에서 C형 간염의 치료를 목적으로 한 치료적으로 효과적인 양이다.
본 발명의 주제는 치료적으로 효과적인 양의 약학적 조성물이며 포유류에서 간염 C형 바이러스의 치료를 위하여 일반적인 화학구조식 1의 전구약물, 이의 입체이성질체들, 이들의 동위원소 농축 유사체(isotopically enriched analog), 또는 결정체(crystalline) 또는 다결정체 형태, 선택적으로 약학적으로 허용할 만한 충전제, 담체, 첨가물, 또는 희석제와의 조합을 포함한다.
상기 일반적인 화학구조식 1의 전구약물, 이의 입체이성질체들, 이들의 동위원소 농축 유사체(isotopically enriched analog), 또는 결정체(crystalline) 또는 다결정체 형태는 다양한 경구 용법의 형태 및 담체로 제조 될 수 있으며; 경구 투여는 타블렛, 필름-코팅된 타블렛, 경질 및 연질 캡슐, 용액, 에멀젼(emulsion), 시럽, 또는 현탁액의 형태로 효과적일 수 있다. 본 발명의 화합물들은 좌약 형태로 투여 될 때 효과적이다. 일반적으로, 가장 편리한 투여 경로는 보통 질병의 심각성 정도 및 환자의 항바이러스 또는 항암제 반응성에 따라 조절될 수 있는 일일 용량 요법을 사용한 경구이다.
일반적인 화학구조식 1의 전구약물, 이의 입체이성질체들, 이들의 동위원소 농축 유사체(isotopically enriched analog), 또는 결정체(crystalline) 또는 다결정체 형태는 하나 또는 그 이상의 보통의 첨가제, 담체, 또는 희석제와 조합하여 약학적 조성물의 형태 및 이의 단위 용법 형태로 있을 수 있다. 약학적 조성물 및 표준 용법 형태는 추가적인 활성 화합물들과 일상적인 비율로 또는 이들 없이 일반적인 성분들 및 용법 형태로 구성 될 수 있다. 약학적 조성물은 처방되는 일일 용량에 따라 어느 적절한 효과적인 양의 활성 성분을 포함할 수 있다. 약학적 조성물은 타블렛 또는 채워진 캡슐 (filled capsule)과 같은 고체 물질의 형태로 사용 될 수 있으며; 반고체 분말, 지속성 방출제 또는 현탁액, 에멀젼, 또는 경구 투여를 위한 채워진 캡슐과 같은 액체의 형태; 또는 직장 또는 질내 투여를 위한 좌약의 형태로 사용될 수 있다. 전형적인 약물은 대략 5wt% 에서 95wt%의 활성 화합물 또는 한 화합물을 포함할 것이다. “약물(medication)” 또는 “용법 형태(dosage form)”는 활성 성분의 고체 및 액체 조성물 둘 다 포함 함을 의미하며, 그러므로 당업계 통상 전문가에게는 활성 성분이 필요로 하는 용량 및 약동학적인 계수에 따라 다른 약물 형태로 존재 할 수 있음이 명확 할 것이다.
고체 용량 형태는 분말, 타블렛, 환, 캡슐, 좌약 및 분산 가능한 과립이 포함된다. 고체 담체는 희석제(diluents), 향미제(flavors), 용해제(solubilizers), 윤활제 (lubricants), 현탁제(suspending agents), 결합제(binding agents,), 방부제(preservatives), 붕해제(disintegrants), 또는 캡슐화 재료(encapsulating material)로서 작용할 수 있는, 하나 또는 그 이상의 물질을 의미한다. 분말 담체는 일반적으로 세립 (fine-grained) 활성 성분과 섞인 세립 고체(fine-grained solid) 이다. 타블렛에서, 활성 성분은 보통, 적절한 비율로, 필요한 결합능력을 가진 담체와 섞여 원하는 모양과 크기로 압축된다. 적절한 담체에는, 이것에만 국한하지 않으나, 마그네슘 카보네이트(magnesium carbonate), 마그네슘 스테아레이트(magnesium stearate), 탈크(talc), 설탕(sugar), 락토즈(lactose), 펙틴(pectin), 덱스트린(dextrin), 전분(starch), 젤라틴(gelatin), 트라가칸트(tragacant), 메틸셀루로오즈(methylcellulose), 소듐 카복시메틸셀루로우즈 (sodium carboxymethylcellulose), 저융점 왁스(low-melting wax), 코코아 버터(cocoa butter), 및 이와 비슷한 것들이 포함된다. 고체 제제들은, 활성 성분 이외에, 염료, 향미제, 안정제, 버퍼, 인공 및 천연 감미료, 분산제, 점도증강제(thickener), 용해제 및 이와 비슷한 것들을 포함 할 수 있다.
액체 조성물들도 또한 경구 투여로 적절하다. 액체 용법 형태들에는 에멜젼(emulsions), 시럽(syrups), 엘릭서(elixirs), 및 수용성 현탁액 (aqueous suspensions) 이 포함된다. 이들은 사용 바로 직전에 액체 약물로 전환되는 고체 약의 형태를 포함한다. 에멀젼은 용액, 예를 들어, 폴리에틸렌 글라이콜 (propylene glycol)의 수용성 용액으로 제조 될 수 있으며, 또는 이들은 레시틴(lecithin), 소르비톨 모노올레에이트(sorbitol monooleate), 또는 검 아라빅 (gum Arabic) 과 같은 유화제를 포함할 수 있다. 수용성 현탁액은 천연 또는 합성 검(gum), 메틸셀루로오즈(methylcellulose), 소듐 카복시메틸셀루로우즈 (sodium carboxymethylcellulose) 및 다른 잘 알려진 현탁제들과 같은 연성(ductile)의 재료들과 함께 세립된 활성 성분을 물에서 분산시켜 제조 될 수 있다.
일반적인 화학구조식 1의 전구약물, 이의 입체이성질체들, 이들의 동위원소 농축 유사체(isotopically enriched analog), 또는 결정체(crystalline) 또는 다결정체 형태는 좌약 형태로 투여하기 위하여 제조 될 수 있다. 지방산의 글리세라이드(glycerides)의 혼합 또는 코코아 버터와 같은 저융점 왁스를 먼저 녹이고 그리고 그 후 활성 성분을, 예를 들어, 교반하여, 균질하게 분산시킨다. 녹은 균질한 혼합물을 적절한 크기의 틀(mould)에 부어 넣고 냉각 되게 하고 및 고체화 시킨다.
일반적인 화학구조식 1의 전구약물, 이의 입체이성질체들, 이들의 동위원소 농축 유사체(isotopically enriched analog), 또는 결정체(crystalline) 또는 다결정체 형태는 질 내 투여를 위하여 제조 될 수 있다. 활성 성분 이외에, 당업계에서 잘 알려진 담체를 포함하는 좌약(suppositories), 탬폰(tampons), 크림(creams), 젤 (gels), 페이스트(pastes), 폼(foams), 또는 스프레이(sprays)에 적용하는 것이 적절할 것이다.
본 발명의 주제는 일반적인 화학구조식 1의 전구약물, 이의 입체이성질체들, 이들의 동위원소 농축 유사체(isotopically enriched analog), 또는 결정체(crystalline) 또는 다결정체 형태를 C형 간염 바이러스를 치료하기 위한 약물의 생산에 적용하는 것이다. 여기서 서술된 어느 바이러스 질환의 치료를 위한 상기 약물을 제조하는 데 사용되는 일반적인 화학구조식 1의 전구약물, 이의 입체이성질체들, 이들의 동위원소 농축 유사체(isotopically enriched analog), 또는 결정체(crystalline) 또는 다결정체 형태는, 싸이클로부틸 (S)-2-{[(2R,3R,4R,5R)-5-(3,4-디하이드로-2,4-디옥소-2H-피리미딘-1-일)-3-하이드록시-4-메틸-4-풀루오로-테트라하이드로푸란-2-일메톡시]-펜옥시-포스포릴아미노}-프로피오네이트((cyclobutyl (S)-2-{[(2R,3R,4R,5R)-5-(3,4-dihydro-2,4-dioxo-2H-pyrimidin-1-yl)-3-hydroxy-4-methyl-4-fluoro-tetrahydrofuran-2-ylmethoxy]-phenoxy-phosphorylamino}-propanoate)) (1),
싸이클로부틸 (S)-2-{(S)[(2R,3R,4R,5R)-5-(3,4-디하이드로-2,4-디옥소-2H-피리미딘-1-일)-3-하이드록시-4-메틸-4-풀루오로-테트라하이드로푸란-2-일메톡시]-펜옥시-포스포릴아미노}-프로피오네이트 ((cyclobutyl (S)-2-{(S)-[(2R,3R,4R,5R)-5-(3,4-dihydro-2,4-dioxo-2H-pyrimidin-1-yl)-3-hydroxy-4-methyl-4-fluoro-tetrahydrofuran-2-ylmethoxy]-phenoxy-phosphorylamino}-propanoate)) (1.1),
및 싸이클로부틸 (S)-2-{(R)[(2R,3R,4R,5R)-5-(3,4-디하이드로-2,4-디옥소-2H-피리미딘-1-일)-3-하이드록시-4-메틸-4-풀루오로-테트라하이드로푸란-2-일메톡시]-펜옥시-포스포릴아미노}-프로피오네이트 ((cyclobutyl (S)-2-{(R)-[(2R,3R,4R,5R)-5-(3,4-dihydro-2,4-dioxo-2H-pyrimidin-1-yl)-3-hydroxy-4-methyl-4-fluoro-tetrahydrofuran-2-ylmethoxy]-phenoxy-phosphorylamino}-propanoate)) (1.2),
이들의 동위원소 농축 유사체(isotopically enriched analog), 또는 결정체(crystalline) 또는 다결정체 형태 각각 또는 본 발명의 다른 화합물과 조합으로부터, 선택된 일반적인 화학구조식 1의 어는 화합물일 수 있다고 가정 한다.
본 발명의 주제는 이를 필요로 하는 대상에서 바이러스 질병 및 암의 복합치료 및/또는 예방을 위한 방법이며, 상기 방법은 그 대상에게 치료적으로 효과적인 양의 일반적인 화학구조식 1의 전구약물, 이의 입체이성질체들, 이들의 동위원소 농축 유사체(isotopically enriched analog), 또는 결정체(crystalline) 또는 다결정체 형태 및 치료적으로 효과적인 양의 다른 항바이러스제 또는 항암제를 투여하는 것이 관여 되며, 상기 제제들은 동시에 투여되거나 또는 번갈아 투여된다. 제제들의 연속적인 투여 사이에는, 1 내지 24 시간 범위로 어느 기간이 있을 수 있다는 것이 이해 된다.
“다른 항바이러스제제(other antiviral agents)” 의 예시들에는, 이것에만 국한 하지 않으나, HCV NS3 프로테아제 (protease) 억제제 [US 20140296136, US 8,987,195, US 7973040, US 2012214783], HCV NS4 억제제[EP1497282], HCV NS3/NS4 억제제[EP 2364984], 및 HCV NS5A 억제제 [C. Wang et al. Hepatitis C virus RNA elimination and development of resistance in replicon cells treated with BMS-790052. Antimicrob. Agents Chemother. 2012, 56, 13501358. https://en.wikipedia.org/wiki/Daclatasvir; A.V. Ivachtchenko et al. Discovery of Novel Highly Potent Hepatitis C Virus NS5A Inhibitor (AV4025). J. Med. Chem. 2014, 57, 77167730; Pat. Appl. US 14/845,333); 톨-유사 수용체 아고니스트(Toll-like receptor agonists) (WO 2015023958, WO 2012097012); 및 다른 억제제들 (other inhibitors) (WO 2014106019, WO 2014033176, WO 2014033170, WO 2014033167, WO 2013006394, US 20090163545] 가 포함된다.
좀 더 바람직한 것은 새로운 일반적인 화학구조식 1의 전구약물, 또는 이의 입체이성질체 화학구조식 1.1, 이들의 동위원소 농축 유사체(isotopically enriched analog), 결정체(crystalline) 또는 다결정체 형태와 함께, 추가로 항바이러스성 또는 항암 약물을 치료적으로 효과적인 양으로 포함 하는, 항바이러스성 약학적 조성물이다.
좀 더 바람직한 것은 새로운 일반적인 화학구조식 1의 전구약물, 또는 이의 입체이성질체 화학구조식 1.1, 이들의 동위원소 농축 유사체(isotopically enriched analog), 결정체(crystalline) 또는 다결정체 형태와 함께, 추가로 하기를 포함하는 그룹으로부터 선택된 HCV NS5A 억제제의 치료적으로 효과 있는 양을 포함하는 항바이러스성 약학적 조성물이다:
댁라타스비어 (Daclatasvir) (Daklinza, BMS790052) [Belema, M. et al. Discovery and Development of Hepatitis C Virus NS5A Replication Complex Inhibitors. J. Med. Chem. 2014, 57, 1643-1672. Bachand, C. et al. 간염 C형 바이러스 억제제 (Hepatitis C virus inhibitors). 특허 (Patent )WO 2008/021927, 2008. Bachand, C. et al. 간염 C형 바이러스 억제제 (Hepatitis C virus inhibitors). 특허 (Patent) WO 2008/021928, 2008. Bachand, C. et al. 간염 C형 바이러스 억제제 (Hepatitis C virus inhibitors). 특허 (Patent) WO 2008/021936, 2008.http://www.ema.europa.eu/docs/en_GB/document_library/EPAR_Public_assessment report/human/003768/WC500172849.pdf.]
헤파비비어(Hepavivir)(AV-4025) [Ivachtchenko, A. V. et al. Discovery of Novel Highly Potent Hepatitis C Virus NS5A Inhibitor (AV4025). J. Med. Chem. 2014, 57, 77167730. 특허(Patent) WO 2012/074437, 2012. 특허(Patent) US 9428491, 2016.]
AV-4056 및 AV-4058 [US 9428491.]
AV-4067 및 AV-4084 [Pat. Appl. US 14/845,333.]
옴비타스비어 (Ombitasvir)(ABT-267) [Gardelli, C. et al. Phosphoramidate Prodrugs of 20-C-Methylcytidine for Therapy of Hepatitis C Virus Infection. J. Med. Chem. 2014, 57, 2047-2057. Patent WO 2010/144646, 2010.]
엘바스비어(Elbasvir) (MK-8742), [Coburn, C. A. et al. ChemMedChem. 2013, 8, 1930-1940. Patent WO 2012/040923, 2012. Patent WO 2012/041014, 2012]
벨파타스비어(Velpatasvir) (VEL, GS-5816), [Patent WO 2015/110048, 2015. http://www.accessdata.fda.gov/ drugsatfdadocs/ nda/2016/208341O rig1s000PharmR.pdf]. http://www.gilead.com/~/media/files/pdfs/ medicines/liver-disease/epclusa/epclusa_pi.pdf]
나랩프레비어(Narlaprevir) (SCH 900518), HCV 비-구조 단백질 3 (non-structural protein 3) (NS3) 억제제[Arasappan A. et al. Discovery of Narlaprevir (SCH 900518): A Potent, Second Generation HCV NS3 Serine Protease Inhibitor. ACS Med. Chem. Lett., 2010, 1 (2), 64-69]
및 시멥프레비어(Simeprevir) (Olysio), HCV 비-구조단백질(non-structural protein) NS3/NS4 억제제 [https://www.tga.gov.au/sites/default/files/auspar-simeprevir-141027-pi.docx]
본 발명의 주제는 필요로 하는 대상에서 바이러스 및 암 질병의 복합 치료를 위한 방법이며, 상기 방법은 치료적으로 효과 있는 양의 일반적인 화학구조식 1의 전구약물, 또는 이의 입체이성질체, 동위원소 농축 유사체(isotopically enriched analog), 결정체(crystalline) 또는 다결정체 형태, 또는 어떤 다른 항바이러스 또는 항암제를 연속적으로 또는 동시에 투여 하는 것이 관여 된다. 제제의 연속적인 투여 사이에 어느 기간(time span)이 있을 수 있음이 이해 된다.
다른 항바이러스제는, 이것에만 국한 하지는 않으나, 인터페론 알파(interferon alpha), 인터페론 베타(interferon beta), 페길레이티드 인터페론 알파 (pegylated interferon alpha), 리바비린(ribavirin), 레보비린(levovirin), 비라미딘(viramidine), 다른 뉴클레오사이드 HCV 폴리머레이즈 억제제(another nucleoside HCV polymerase inhibitor), 비-뉴클레오사이드 HCV 폴리머레이즈 억제제 (non-nucleoside HCV polymerase inhibitor), HCV 프로테아제 억제제 (HCV protease inhibitor), HCV 헬리케이즈 억제제 (HCV helicase inhibitor) 또는 HCV 융합 억제제(HCV fusion inhibitor), HBV DNA 폴리머레이즈 억제제(HBV DNA polymerase inhibitor), 및 HIV 1 역전사효소(HIV 1 reverse transcriptase) (RT) 억제제인 것으로 가정 한다. 전구약물 또는 이들의 유도체 또는 염이 다른 항바이러스제 또는 항암제와 조합하여 투여 될 때는, 그 활성은 전구약물의 초기 활성에 대항하여 증가 될 수 있다. 복합 치료에서, 제제의 투여는 일반 화학구조식 1 의 전구약물에 대하여 동시에 또는 연속적 일수 있다. 여기서 사용한대로 "동시 투여(simultaneous administration)" 라는 개념은 그러므로 제제를 같은 시간에 또는 다른 시간에 투여함을 의미한다. 두 개 또는 그 이상의 제제를 같은 시간에 투여하는 것은 두 개 또는 그 이상의 활성성분을 포함하는 하나의 제제 형태를 사용하거나, 또는 본질적으로, 하나의 활성성분 가진 두 개 또는 그 이상의 용법 형태를 동시에 투여하여 수행 할 수도 있다. 여기서 사용된 대로 치료에 대한 언급은 예방도 또한 포함한다는 것이 이해 되어야 한다. 그 외에, 바이러스 감염의 "치료(theraphy)" 라는 용어는, 여기서 사용된 대로, 바이러스 감염 중계와 연관되는 질병 또는 컨디션 또는 이의 임상적 증상들의 치료 또는 예방을 포함한다.
본 발명은 일반 화학구조식 1의 전구약물 및 입체이성질체, 동위원소 농축 유사체(isotopically enriched analog), 및 이들의 결정체(crystalline) 또는 다결정체 형태의 생산을 위한 방법과 관련 되며, 상기 방법은 전에 알려지지 않은 화학구조식 2의 싸이클로부틸 (S)-2-(펜타풀루오로페닐옥시-펜옥시-포스포릴아미노)-프로피오네이트 ((cyclobutyl (S)-2-(pentafluorophenyloxy-phenoxy-phosphorylamino)-propionate)), 또는 이의 입체이성체들 화학구조식 2.1의 싸이클로부틸(S)-2-((S)-펜타풀루오로페닐옥시-펜옥시-포스포릴아미노)-프로피오네이트 ((cyclobutyl (S)-2-((S)-pentafluorophenyloxy-phenoxy-phosphorylamino)-propionate)), 및 화학구조식 2.2의 싸이클로부틸(S)-2-((R)-펜타풀루오로페닐옥시-펜옥시-포스포릴아미노)-프로피오네이트 ((cyclobutyl (S)-2-((R)-pentafluorophenyloxy-phenoxy-phosphorylamino)-propionate)) ,
의 사용이 관여 되며, 이들은 또한 본 발명의 주제이다.
본 발명가들은 놀랍게도 일반 화학구조식 1의 새로운 전구물질 및 이의 인 입체이성질체들 ((화학구조식 1.1의 Sp-입체이성질체 및 화학구조식 1.2의 Rp-입체이성질체)이, 예를 들어, 알려진 소발디 (Sovaldi®) 및 화학구조식 A1의 싸이클로헥실 에스터 (cyclohexyl ester)는 물론 이전에 알려지지 않은 화학구조식 A2의 싸이클로프로필 에스터(비교대상) 보다 더 효과적인 HCV NS5B 억제제의 전구약물인 것을 발견했다.
그러므로, 소발디 (Sovaldi®)는 HCV 유전자형 1b(gT1b)에 대하여 ЕС50 = 0.045-0.170 μM 및 ЕС90 = 590 nM 가지며, 화학구조식 A1의 싸이클로헥실 에스터(cyclohexyl ester of formula А1) 는 ЕС90 = 250.0 nM, 반면에 화학구조식 A2의 싸이클로프로필 에스터 (cyclopropyl ester of formula А2)는 EC50= 73.0 nM 및 ЕС90 = 410.0 nM를 가진다 (표 2). 화학구조식 1.1의 새로운 전구약물은 ЕС50 = 15.0―27.0 nM 및 ЕС90 = 128.0 nM (표 1а)을 가지며, 이는 화학구조식 1.1의 새로운 전구약물이 소발디 (Sovaldi®) 보다 3 배 이상 활성이 있고, 화학구조식 A.1 화합물의 2배 활성이 있고, 및 화학구조식 A.2 화합물보다 3배 이상 더 활성이 있음을 의미한다.
화학구조식 1.1의 전구약물의 사람 간의 마이크로조말 S9 분획 (human liver microsomal S9 fraction) 에서 반감기는 T1/2 hS9 = 0.05 시간, 반면에 소발디 (Sovaldi®)는 T1/2 hS9 = 0.54 시간 이며, 및 화학구조식 A.1의 싸이클로헥실 에스터는 T1/2 hS9 = 1.4 시간 (표 3) 이다, 이는 화학구조식 1.1의 새로운 전구약물의 사람 간의 마이크로조말 S9 분획에서의 대사속도는 소발디 (Sovaldi®) 보다 11 배 빠르며 및 화학구조식 A.1의 싸이클로헥실 에스터의 대사 속도보다 28 배 빠름을 의미한다. 그 외에, 쥐 간에서 화학구조식 1.1 전구약물의 대사 과정 결과로부터 나오는 PSI-7409 트리포스페이트의 농도 및 AUC24h 는 각각 Сmax = 3 224.0 ng/g 및 AUC24h = 30 487.0 ng·h/g 이며, 반면에 소발디 (Sovaldi®)의 비슷한 대사는 Сmax = 1 934.0 ng/g 및 AUC24h = 16 796.0 ng·h/g (표 4)의 결과를 나타낸다. 이는 화학구조식 1.1의 새로운 전구약물이 간에서 요구되는 PSI-7409의 트리포스페이트로 (약물) 소발디 (Sovaldi®)보다 거의 2 배 및 화학구조식 A.1의 싸이클로헥실 에스터보다 4.7 배 더 효과적으로 대사 된다는 사실을 입증한다.
얻어진 결과들(효과)은 놀랍다, 왜냐하면 싸이클로부틸 에스터인, 화학구조식 1.1의 전구약물이 이의 유사체인- 화학구조식 A.1의 싸이클로헥실 에스터보다 단지 좀더 효과적인 것이 아니고, 상기 이 놀라운 효과를 좀더 분명히 보여주기 위하여 본 발명자들이 특별히 제조한 다른 유사체-화학구조식 A.2의 싸이클로프로필 에스터(EC50 = 73.0 nM, ЕС90 = 410.0 nM, 표 2 참조) 보다도 더 효과적이다.
본 발명은 의학 및 수의학에서 사용될 수 있다.
가장 좋은 실시 양태 (Best embodiment)
본 발명은 어떤 실시양태의 측면에서 서술될 것이며 이들은 그 범위를 제한하려는 의도는 아니다. 반대로, 본 발명은 모든 다른 대안, 수정, 및 청구항의 범위 내에 포함 될 수 있는 것과 동등한 것을 다 포함한다. 그러므로, 특별한 실시양태들을 포함하는 다음의 실시예들은 제한 없이 본 발명을 분명히 보여줄 것이다.
실시예 1. 일반 화학구조식 1 의 싸이클로부틸 (S)-2-{[(2R,3R,4R,5R)-5-(3,4-디하이드로-2,4-디옥소-2H-피리미딘-1-일)-3-하이드록시-4-메틸-4-풀루오로-테트라하이드로푸란-2-일메톡시]-펜옥시-포스포릴아미노}-프로피오네이트의 전구 약물 및 이의 입체이성질체 1.1 및 1.2 의 합성 프로토콜 (도식 1) ((Synthetic protocol for the prodrug of cyclobutyl (S)-2-{[(2R,3R,4R,5R)-5-(3,4-dihydro-2,4-dioxo-2H-pyrimidin-1-yl)-3-hydroxy-4-methyl-4-fluoro-tetrahydrofuran-2-ylmethoxy]-phenoxy-phosphorylamino}-propanoate of general formula 1 and stereoisomers 01.1 and 1.2 thereof (Scheme 1)).
도식 1 (Scheme 1)
N-Boc-L-알라닌 (N-Boc-L-alanine) (4: 15.5 g, 81.9 mmol) 의 디클로롤메탄(dichloromethane )(300 ml), DCC (16.9 g, 81.9 mmol) 용액에 0°C 에서 및 5 분 후에, 싸이클로부탄올 (cyclobutanol) (3: 5.6 g, 78.0 mmol) 및 DMAP (2.0 g, 16.4 mmol)를 첨가시켰다. 혼합물은 상온에서 하룻밤 동안 교반 되도록 놓아두고, 진공에서 증발시키고, 및 그 잔유물은 에틸 아세테이트 (ethyl acetate) (300ml)로 처치 하였다. 잔유물은 여과시키고 에틸 아세테이트로 세척 시켰다. 여과액은 5% 구연산 (citric acid) 용액 (2 x 100 ml), 포화 NaHCO3 용액 (2 x 100 ml), 및 브라인 (brine)으로 세척 시키고, Na2SO4 에서 건조 시키고, 및 진공에서 증발시켜 19.6 g (98 %) 의 (S)-싸이클로부틸 2-(tert-부톡시카보닐아미노)프로피오네이트 ((S)-cyclobutyl 2-(tert-butoxycarbonylamino)propanoate)) (5) 를 흰색 분말로 얻었다. 1H NMR (400 MHz, DMSO -d 6) δ 7.22 (d, J = 7.2 Hz, 0.85H), 6.87 (m, 0.15H), 4.89 (p, J = 7.2 Hz, 1H), 3.94 (m, 1H), 2.26 (m, 2H), 1.98 (m, 2H), 1.74 (m, 1H), 1.59 (m, 1H), 1.38 (s, 7.5H), 1.34 (brs, 1.5H), 1.22 (d, J = 7.2Hz, 3H).
화합물 5 (19.6 g, 80.6 mmol)의 디옥산(dioxane)(50 ml) 용액에 HCl (230 ml, 3M) 디옥산 (dioxane)용액을 첨가 시켰으며, 이 혼합물을 하룻밤 동안 교반 되도록 놓아 두고 및 진공에서 증발 시켰다. 잔유물은 에테르 (ether) (400ml)로 처치하고 하룻밤 동안 교반 시켰다. 잔유물은 여과 시키고, 에테르로 세척 시키고, 및 진공에서 증발 시켜 14.1 g (97 %) 의 (S)-싸이클로부틸 2-아미노-프로피오네이트 하이드로클로라이드 ((S)-cyclobutyl 2-amino-propanoate hydrochloride)) (6)을 흰색 분말로 얻었다. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6) δ 8.56 (brs, 3H), 5.00 (p, J = 7.6 Hz, 1H), 4.02 (q, J = 7.2 Hz, 1H), 2.31 (m, 2H), 2.07 (m, 2H), 1.78 (m, 1H), 1.62 (m, 1H), 1.41 (d, J = 7.2 Hz, 3H).
화합물 6 (14.4 g, 80.2 mmol) 의 디클로로메탄(214 ml)용액에 페닐 디클로포스페이트 (phenyl dichlorophosphate) (16.9 g, 80.2 mmol)를 첨가 시켰다. 이 혼합물을 -75―70°로 냉각 시키고, 온도를 -75―70°C로 유지 시키면서 트리에틸아민 (triethylamine) (16.2 g, 160.4 mmol) 의 디클로로메탄(dichloromethane) (16 ml) 용액을 한 방울씩 첨가시켰다. 이 혼합물을 -70°C에서 30 분 동안 교반 시키고 및 그 후 -20°C로 가열 시켰다. 펜타풀루오로페놀(pentafluorophenol) (14.6 g, 79.4 mmol)의 디클로로메탄 (dichloromethane) (105 ml) 용액을 -20―10°C에서 첨가 시키고, 그 후 트리에틸아민 (triethylamine) (8.1 g, 80.2 mmol)의 디클로로메탄 (dichloromethane) (8 ml)용액을 한 방울씩 첨가시키고, 및 이 혼합물을 실온에서 하룻밤 동안 교반 되도록 놓아 두었다. 이 혼합물은 진공에서 증발시키고, 에틸 아세테이트 (ethyl acetate)(500 ml) 및 물 (500 ml)을 첨가 시키고, 유기층은 분리 시켰으며, 5% NaHCO3 용액, 브라인 (brine)으로 세척 시키고, Na2SO4에서 건조 시키고, 및 진공에서 증발시켰다. 이 잔유물에 헥산 및 에틸 아세테이트 (hexane and ethyl acetate)(200 ml, 6:1) 의 혼합물을 첨가시키고, 및 이 혼합물을 하룻밤 동안 교반 되도록 놓아 두었다. 결과로 얻어진 잔유물을 여과 시키고, 6:1 헥산/에틸 아세테이트 혼합물(hexane/ethyl acetate mixture)(50 ml) 로 세척 시키고, 및 공기-건조하여 16.7 g 의 싸이클로부틸 (S)-2- ((퍼풀루오로펜옥시)(펜옥시)포스포릴아미노)프로피오네이트 ((cyclobutyl (S)-2-((perfluorophenoxy)(phenoxy)phosphorylamino)propanoate)) (2)을 얻었다.
결과적인 산물 (2)은 헥산/ 에틸 아세테이트(4:1) 혼합물로부터 재결정 시켜 13.8 g (37%) 의 싸이클로부틸 (S)-2-((S) (퍼풀루오로펜옥시)-(펜옥시)-포스포릴아미노)프로피오네이트 ((cyclobutyl (S)-2-((S)-(perfluorophenoxy)-(phenoxy)-phosphorylamino)propanoate)) (2.1)을 백색의 흐트러진 분말로 얻었다. 1H NMR (300 MHz, DMSO-d 6) δ 7.42 (m, 2H), 7.24 (m, 3H), 6.87 (dd, J 1 = 14.1 Hz, J 2 = 10.2 Hz, 1H), 4.87 (p, J = 7.5 Hz, 1H), 3.94 (m, 1H), 2.23 (m, 2H), 1.94 (m, 2H), 1.71 (m, 1H), 1.58 (m, 1H), 1.27 (d, J = 7.2 Hz, 3H). 화학구조식 2.1 화합물의 재결정 시키는 동안에 헥산/에틸 아세테이트(6:1) 혼합물로 세척 시킨 후 남은 일반적인 용액은 진공에서 증발시키고 및 헥산으로부터 3 번 재결정 시켜 싸이클로부틸 (S)-2-((R) (퍼풀루오로펜옥시)-(펜옥시)-포스포릴아미노)프로피오네이트 ((cyclobutyl (S)-2-((R)-(perfluorophenoxy)-(phenoxy)-phosphorylamino)propanoate)) (2.2) 를 백색의 흐트러진 분말로 얻었다. 1H NMR (300 MHz, DMSO-d 6) δ 7.42 (m, 2H), 7.26 (m, 3H), 6.85 (dd, J 1 = 13.8 Hz, J 2 = 10.2 Hz, 1H), 4.88 (p, J = 7.5 Hz, 1H), 3.95 (m, 1H), 2.24 (m, 2H), 1.93 (m, 2H), 1.72 (m, 1H), 1.59 (m, 1H), 1.28 (d, J = 6.9 Hz, 3H).
tert-부틸(2R,3R,4R,5R)-5-(2,4-디옥소-3,4-디하이드로피리미딘-1(2H)-일)-2-(하이드록시메틸)-4-메틸-4-풀루오로-테트라하이드로푸란-3-일 카보네이트 ((tert-butyl (2R,3R,4R,5R)-5-(2,4-dioxo-3,4-dihydropyrimidin-1(2H)-yl)-2-(hydroxymethyl)-4-methyl-4-fluoro-tetrahydrofuran-3-yl carbonate)) (7: 5 g, 13.9 mmol) 의 THF (165 ml)용액에, 1M tret-부틸마그네지움 클로라이드 (tert-butylmagnezium chlorid)의 THF(31.3 ml, 31.3 mmol) 용액을 아르곤 (argon) 하에서 0°C에서 첨가 시켰으며, 이 혼합물은 실온에서 30 분 동안 교반 시켰다. 주사기를 사용하여 화학구조식 2.1 화합물 (7.8 g, 16/7 mmol)의 THF(30ml)용액을 0―5°C에서 첨가 시켰으며, 및 이 혼합물을 아르곤(argon) 하에서 24시간 동안 교반 시켰다. 메탄올 (10ml)을 첨가 시킨 후, 이 혼합물은 진공에서 증발 시켰다. 잔유물을 500 ml의 에틸 아세테이트 (ethyl acetate)에 녹이고, 5% 구연산 (citric acid) 용액, 5% NaHCO3용액으로 세척 시키고, Na2SO4 에서 건조 시키고, 및 진공에서 증발시켰다. 잔유물은 헥산/에틸 아세테이트 (hexane/ethyl acetate) (1:2) 를 용리액 (eluent)으로 사용하여 실리카 겔 (silica gel)에서 크로마토그래피하여 5.89 g (66 %)의 무색의 고체 폼(foam)처럼 보이는 싸이클로부틸 (S)-2-((S) (2R,3R,4R,5R)-3-(tert-부톡시카보닐옥시)5-(2,4-디옥소-3,4-디하이드로피리미딘-1(2H)-일)-4-메틸-4-풀루오로-테트라하이드로푸란-2-일)-메톡시)(펜옥시)포스포릴아미노)프로피오네이트 ((cyclobutyl (S)-2-((S)-(((2R,3R,4R,5R)-3-(tert-butoxycarbonyloxy)-5-(2,4-dioxo-3,4-dihydropyrimidin-1(2H)-yl)-4-methyl-4-fluoro-tetrahydrofuran-2-yl)methoxy)(phenoxy)phosphorylamino)propanoate)) (8.1)을 얻었다. LC-MS (ESI) 642 (M+H)+.
비슷하게, 중간 물질 7 및 2 로부터 시작하여 싸이클로부틸 (S)-2-((((2R,3R,4R,5R)-3-(tert-부톡시카보닐옥시)5-(2,4-디옥소-3,4-디하이드로피리미딘-1(2H)-일)-4-메틸-4-풀루오로-테트라하이드로푸란-2-일)-메톡시)(펜옥시)포스포릴아미노)프로피오네이트 ((cyclobutyl (S)-2-((((2R,3R,4R,5R)-3-(tert-butoxycarbonyloxy)-5-(2,4-dioxo-3,4-dihydropyrimidin-1(2H)-yl)-4-methyl-4-fluoro-tetrahydrofuran-2-yl)methoxy)(phenoxy)phosphorylamino))propanoate)) (8)이 제조 되었으며 (수율: 52%, LC-MS (ESI) 642 (M+H)+) 및 중간 물질 7 및 2.2 로부터 시작하여 싸이클로부틸 (S)-2-((R)-(((2R,3R,4R,5R)-3-(tert-부톡시카보닐옥시)5-(2,4-디옥소-3,4-디하이드로피리미딘-1(2H)-일)-4-메틸-4-풀루오로-테트라하이드로푸란-2-일)-메톡시)(펜옥시)포스포릴아미노)프로피오네이트 ((cyclobutyl (S)-2-((R)-(((2R,3R,4R,5R)-3-(tert-butoxycarbonyloxy)-5-(2,4-dioxo-3,4-dihydropyrimidin-1(2H)-yl)-4-methyl-4-fluoro-tetrahydrofuran-2-yl)methoxy)(phenoxy)phosphorylamino)propanoate)) (8.2), (수율: 59%, LC-MS (ESI) 642 (M+H)+) 이 제조 되었다.
화학구조식 8.1 화합물 (4.45 g, 6.9 mmol)의 디클로로메탄 (60ml)용액에 트리풀루오로아세텍 에시드(trifluoroacetic acid) (60 ml)를 0°C 에서 첨가 시켰다. 이 혼합물은 실온에서 15 시간 동안 교반 시키고, 진공에서 증발시키고, 250ml의 DCM에 용해 시키고, 300ml 의 NaHCO3로 세척 시키고, Na2SO4 에서 건조 시키고, 진공에서 증발 시키고 및 에틸 아세테이트 (ethyl acetate) 및 메틸-tert-부틸-에테르( methyl-tert-butyl ether) (1:1) 의 혼합물로부터 재결정 시켜2.7 g (71 %)의 싸이클로부틸 (S)-2-(S)-(((2R,3R,4R,5R)-5-(2,4-디옥소-3,4-디하이드로피리미딘-1(2H)-일)-3-하이드록시-4-메틸-4-풀루오로-테트라하이드로푸란-2-일메톡시)-(펜옥시)-포스포릴아미노)-프로피오네이트 ((cyclobutyl (S)-2-((S)-(((2R,3R,4R,5R)-5-(2,4-dioxo-3,4-dihydropyrimidin-1(2H)-yl)-3-hydroxy-4-methyl-4-fluoro-tetrahydrofuran-2-yl)methoxy)-(phenoxy)-phosphorylamino)propanoate)) (1.1)를 백색의 결정 물질로 얻었다. LC-MS (ESI) 542 (M+H)+. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6 ) δ 11.51 (brs, 1H), 7.56 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 7.38 (m, 2H), 7.23 (m, 2H), 7.19 (m, 1H), 6.03 (m, 2H), 5.84 (d, J = 6.8 Hz, 1H), 5.55 (dd, J 1 = 8.0 Hz, J 2 = 1.2 Hz, 1H), 4.85 (p, J = 7.2 Hz, 1H), 4.37 (m, 1H), 4.27 (m, 1H), 4.01 (m, 1H), 3.83 (m, 2H), 2.23 (m, 2H), 1.95 (m, 2H), 1.71 (m, 1H), 1.56 (m, 1H), 1.25 (d, J = 22.8 Hz, 3H), 1.23 (d, J = 6.8 Hz, 3H).
화학구조식 1.1 전구약물의 여러 용매로부터의 재결정화는 다결정체라인 및 결정체 형태를 얻게 한다. 그러므로, 에틸 아세테이트 (ethyl acetate) 와 메틸-tert-부틸 에테르 (methyl-tert-butyl ether) (1:1)혼합물, 에탄올, 에틸 아세테이트, 및 아세틱 에시드의 물과의 혼합물로부터의 재결정은 전구약물 1.1을 전적으로 단위 셀 계수 (unit cell parameters) a = 28.1056(8)А, b = 16.8998(4)А, 및 c = 5.25380(12)А 인 사방정상 (orthorhombic phase) 및 단위 셀 계수 a = 16.2770(6)А, b = 16.9117(8)А, c = 5.20429(15)А, 및 β = 117.822(2)° 를 가진 단사정계상(monoclinic phase)으로 구성된 다결정체 형태로 얻게 한다.
화학구조식 1.1 전구약물의 디메틸 설폭사이드 (dimethyl sulfoxide)와 물로부터의 재결정화는 단위 셀 계수 (unit cell parameters) a = 28.1056(8)А, b = 16.8998(4)А, 및 c = 5.25380(12)А인 사방정상 (orthorhombic phase)으로 구성된 흰색 결정체 물질을 얻게 한다.
여러가지 용매로부터 재 결정화 후 결정체 및 다결정체 형태들은 pH2 및 pH7에서 0.18 로부터 0.25 mg/ml의 비슷한 용해도 값을 가진다. 예외는 디메틸 설폭사이드로부터 재결정화로 얻어진 다결정체 샘플이며, 이의 용해도는 조금 높으며 0.63에서 0.67mg/ml (표 1)로 다양하다
표 1. 260 nm의 파장에서 화학구조식 1.1 전구약물의 다결정체 및 결정체 형태의 용해도 키네틱스 (Kinetic solubility of polycrystalline and crystalline forms of the prodrug of formula 1.1 for a wavelength of 260 nm)
|
전구약물 1.1의 재결정화가 얻어진 용매
(Prodrug 1.1 recrystallized from) |
전구약물 1.1의 형태
(Form of prodrug 1.1) |
용해도, mg/ml
Solubility, mg/ml |
|||
| рН 2 에서 | рН 7에서 | ||||
| 값value | SD |
값
value |
SD | ||
| 에틸 아세테이트 및 메틸-tert-부틸 에테르의 혼합물 (a mixture of ethyl acetate and methyl-tert-butyl ether) | 다결정체 polycrystal |
0.25 | 0.00 | 0.24 | 0.001 |
| 에탄올 (Ethanol) | 다결정체 polycrystal |
0.20 | 0.00 | 0.20 | 0.003 |
| 에틸 아세테이트 (Ethyl acetate) | 다결정체 polycrystal |
0.22 | 0.00 | 0.22 | 0.002 |
| 아세틱 에시드(Acetic acid) | 다결정체 polycrystal |
0.63 | 0.009 | 0.67 | 0.041 |
| 디메틸 설폭사이드 (Dimethyl sulfoxide) | 크리스탈 crystal |
0.18 | 0.00 | 0.18 | 0.003 |
비슷하게, 싸이클로부틸 (S)-2-((((2R,3R,4R,5R)-5-(2,4-디옥소-3,4-디하이드로피리미딘-1(2H-일)-3-하이드록시-4-메틸-4-풀루오로-테트라하이드로푸란-2-일메톡시)-(펜옥시)-포스포릴아미노)프로피오네이트 ((cyclobutyl (S)-2-((((2R,3R,4R,5R)-5-(2,4-dioxo-3,4-dihydropyrimidin-1(2H)-yl)-3-hydroxy-4-methyl-4-fluoro-tetrahydrofuran-2-yl)methoxy)-(phenoxy)-phosphorylamino)propanoate)) (1) (수율: 58%; LC-MS (ESI) 542 (M+H)+ 및 싸이클로부틸 (S)-2-((R)-(((2R,3R,4R,5R)-5-(2,4-디옥소-3,4-디하이드로피리미딘-1(2H-일)-3-하이드록시-4-메틸-4-풀루오로-테트라하이드로푸란-2-일메톡시)-(펜옥시)-포스포릴아미노)프로피오네이트 ((cyclobutyl (S)-2-((R)-(((2R,3R,4R,5R)-5-(2,4-dioxo-3,4-dihydropyrimidin-1(2H)-yl)-3-hydroxy-4-methyl-4-fluoro-tetrahydrofuran-2-yl)methoxy)-(phenoxy)-phosphorylamino)propanoate)) (1.2) (수율: 64%; LC-MS (ESI) 542 (M+H)+. )+. 1H ЯМР (300 МГц, ДМСО-d 6 ) δ 11.53 (brs, 1H), 7.56 (d, J = 8.1 Hz, 1H), 7.38 (m, 2H), 7.19 (m, 3H), 6.08 (m, 2H), 5.91 (d, J = 6.3 Hz, 1H), 5.57 (d, J = 8.1 Hz, 1H), 4.85 (p, J = 7.5 Hz, 1H), 4.41 (m, 1H), 4.27 (m, 1H), 4.05 (m, 1H), 3.79 (m, 2H), 2.23 (m, 2H), 1.94 (m, 2H), 1.70 (m, 1H), 1.56 (m, 1H), 1.24 (d, J = 23.4 Hz, 3H), 1.21 (d, J = 6.0 Hz, 3H) 가 제조 되었다.
실시예 2. 화학구조식 A2 의 싸이클로프로필 (S)-2-((S)-(((2R,3R,4R,5R)-5-(2,4-디옥-3,4-디하이드로피리미딘-1(2H)-일)-3-하이드록시-4-메틸-4-풀루오로-테트라하이드로푸란-2-일)메톡시)-(펜옥시)-포스포릴아미노)프로피오네이트의 전구 약물의 합성 프로토콜 (도식 2) ((Synthetic protocol for the prodrug of cyclopropyl (S)-2-((S)-(((2R,3R,4R,5R)-5-(2,4-dioxo-3,4-dihydropyrimidin-1(2H)-yl)-3-hydroxy-4-methyl-4-fluoro-tetrahydrofuran-2-yl)methoxy)-(phenoxy)-phosphorylamino)propanoate of formula 
2 (scheme 2))
도식 (Scheme 2)
싸이클로프로필아민(Cyclopropylamine) (9: 4.06 ml, 58.8 mmol) 및 Boc-L-알라닌(Boc-L-alanine) (22.2 g, 58.8 mmol)을 250ml 의 클로로포름에 녹이고, 및 이소아밀 나이트리트 (isoamyl nitrite) (7.9 ml, 58.8 mmol)를 얼음으로 냉각 하에서 첨가시켰다. 이 혼합물을 냉각시키면서 16 시간 동안 교반 시키고, 건조 될 때까지 증발시키고, 및 실리카 겔로 크로마토그라피하여 ((에틸 아세테이트:헥산 (ethyl acetate :hexane) 1:8으로 용리(eluting)) 7.68 g (57%)의 화학구조식 10의 싸이클로프로필 에스터 (cyclopropyl ester) 및 화학구조식 11의 알릴 에테르(allyl ether)의 1:4 비율(1H NMR 데이터에 근거)의 혼합물을 얻었다. 결과로 얻어진 10의 에스터 및 11의 에테르를 120 ml의 아세토니트릴(acetonitril)에 용해시키고, 여기에 트리페닐포스핀 (triphenylphosphine) (446 mg, 1.7 mmol) 및 Pd(PPh3)4 (984 mg, 0.85 mmol)을 아르곤(argon) 하에서 첨가 시켰다. 이 용액을 얼음으로 냉각 시키고 피롤리딘(pyrrolidine) (2.49 g, 35 mmol) 의 아세토니티릴 (acetonitrile) (30 ml) 용액으로 희석시켰다. 이 혼합물을 아르곤 하에서 0―4°C에서 16 시간 동안 교반 시키고, 실리카 겔에서 크로마토그래피 하여((에틸 아세테이트:헥산 (ethyl acetate : hexane) 1:8으로 용리)) 1.38 g 의 (S)-싸이클로프로필 2-(tert-부톡시카보닐아미노)프로피오네이트((S)-cyclopropyl 2-(tert-butoxycarbonylamino)propanoate)) (15) 를 얻었다. 1H NMR (CDCl3, 400 MHz) δ 5.04 (br.s., 1H), 4.26 (m, 1H), 4.19 (m, 1H), 1.46 (с, 9H), 1.37 (d, J = 7.2 Hz, 3H), 0.74 (m, 4H).
화학구조식 12 화합물(3.5 g, 15.3 mmol) 의 10 ml 디옥산 (dioxane)용액에 20ml의 3M HCl의 디옥산 용액을 첨가 시켰다. 이 혼합물을 2 시간 동안 실온에서 교반 시키고 및 건조 될 때까지 증발시켜 2.53 g 의 (S)-싸이클로프로필 2-아미노-프로피오네이트 하이드로클로라이드((S)-cyclopropyl 2-amino-propanoate hydrochloride)) (13)을 얻었다. 1H NMR (DMSO-d 6, 300 MHz) δ 8,65 (br.s., 3H), 4,19 (m, 1H), 3,99 (к, J = 6.9 Hz, 1H), 1.39 (d, J = 6.9 Hz, 3H), 0.73 (m, 4H).
-70°C로 냉각시킨 화학구조식 13 화합물 ((2.53 g, 15.3 mmol) 및 페닐디클로로포스페이트 (phenyldichlorophosphate) (3.23 g, 15.3 mmol)의 50 ml 디클로로메탄(dichloromethane) 용액에 트리에틸아민 (triethylamine) (4.26 ml, 30.6 mmol) 의 10 ml 디클로로메탄 (dichloromethane)용액을 한 방울씩 첨가시켰다. 반응 혼합물의 온도를 그 후 -10 °C로 오르게 하고 및 미리 제조 해 둔 펜타풀루오로페놀 (pentafluorophenol) (2.82 g, 15.3 mmol) 및 트리에틸아민 (triethylamine) (2.13 ml, 15.3 mmol) 의 15 ml 디클로로메탄(dichloromethane) 혼합물 용액을 한 방울씩 첨가 시켰다. 첨가가 완료 된 후에, 반응 혼합물은 실온에서 12 시간 동안 교반 시키고, 그 후 증발 시켰으며, 및 잔유물은 50ml 벤젠으로 처치하였다. 잔유물은 여과 시키고 및 15ml의 벤젠으로 세척 시켰다. 여과액은 포화 소듐 하이드로카보네이트 용액으로 세척 시키고, 소듐 설페이트에서 건조 시키고 및 증발 시켰다. 에틸 아세테이트:헥산 (ethyl acetate : hexane) 1:4의 혼합물을 1g 물질 당 8ml의 속도로 잔유물에 첨가 시키고, 및 결과로 얻어진 혼합물을 16 시간 동안 맹렬하게 교반 시켰다. 잔유물은 여과 시켰으며 및 에틸 아세테이트: 헥산 (ethyl acetate : hexane) 1:4로부터 재결정 시켜 1.02 g (14%) 의 (S)-싸이클로프로필 2-((S)-(퍼풀루오로펜옥시)-포스포릴아미노)프로피오네이트 ((S)-cyclopropyl 2-((S)-(perfluorophenoxy)-phosphorylamino)propanoate)) (14)를 얻었다. LC-MS (ESI) 452 (M+H)+. 1H NMR (CDCl3, 300 MHz) δ 7.38 (m, 2H), 7.26 (m, 3H), 4.7 (m, 1H), 3.96 (m, 1H), 1.46 (d, J = 7.2 Hz, 3H), 0.74 (m, 4H).
얼음으로 냉각시킨 tert-부틸 (2R,3R,4R,5R)-5-(2,4-디옥소-3,4-디하이드로피리미딘-1-(2H)-일)-2-(하이드록시메틸)-4-메틸-4-풀루오로-테트라하이드로프란-3-일 카보네이트 ((tert-butyl (2R,3R,4R,5R)-5-(2,4-dioxo-3,4-dihydropyrimidin-1(2H)-yl)-2-(hydroxymethyl)-4-methyl-4-fluoro-tetrahydrofuran-3-yl carbonate)) (820 mg, 1.85 mmol) 의 25 ml 건조 THF 용액에 1М t-BuMgCl 의 THF (4 ml, 0.4 mmol) 용액을 한 방울씩 첨가 시켰다. 냉각을 종료 시키고 및 반응 혼합물을 실온에서 0.5 시간 동안 교반 시키고, 그 후 얼음으로 다시 냉각 시키고, 및 화학구조식 14 화합물 (1.02 g, 2.18 mmol) 의 THF 용액을 한 방울씩 첨가 시켰다. 반응 혼합물을 실온에서 12 시간 동안 교반 시키고 및 그 후 포화 암모늄 클로라이드 용액으로 처치 하였다. 유기상(organic phase)을 분리 시키고, 및 수용액 상은 디클로로메탄으로 추출하였다. 합친 추출물들을 소듐 설페이트로 건조 시키고 및 여과 시켜 ~1.16 g의 (S)-싸이클로프로필 2-((S)-(((2R,3R,4R,5R)-3-(tert-부톡시카보닐옥시)-5-(2,4-디옥소-3,4-디하이드로피리미딘-1-(2H)-일)-4-메틸-4-풀루오로-테트라하이드로프란-2-일)메톡시)-(펜옥시)-포스포릴아미노)프로피오네이트 ((S)-cyclopropyl 2-((S)-(((2R,3R,4R,5R)-3-(tert-butoxycarbonyloxy)-5-(2,4-dioxo-3,4-dihydropyrimidin-1(2H)-yl)-4-methyl-4-fluoro-tetrahydrofuran-2-yl)methoxy)-(phenoxy)-phosphorylamino)propanoate)) (15) 를 얻었으며, 이는 그대로 다음 단계에 사용 되었다. LC-MS (ESI) 628 (M+H)+.
화학구조식 15 화합물(~1.16 g, 1.85 mmol) 의 20 ml 디클로로메탄( dichloromethane) 용액에, 얼음으로 냉각시키면서 트리풀루오로아세텍 에시드(trifluoroacetic acid) (20 ml)를 첨가 시켰다. 반응 혼합물을 3 시간 동안 교반 시키고 및 그 후 진공에서 농축시켰다. 잔유물은 디클로로메탄( dichloromethane)에 용해 시키고, 물로 희석시키고, 및 소듐 하이드로카보네이트로 중화 시켰다. 유기층을 분리 시키고, 소듐 설페이트로 건조 시키고, 및 건조 될 때까지 증발 시켰다. 잔유물은 실리카 겔에서 크로마토그래피 (클로로포름:메탄올) 하고 및 에틸 아세테이트: MTBE
에틸아세테이트 : MTBE의 혼합물로부터 재 결정하여 505 mg 의 화학구조식 A2 (52%)의 (S)-싸이클로프로필 2-((S)-(((2R,3R,4R,5R)-5-(2,4-디옥소-3,4-디하이드로피리미딘-1-(2H)-일)-3-하이드록시-4-메틸-4-풀루오로-테트라하이드로프란-2-일)메톡시)-(펜옥시)-포스포릴아미노)프로피오네이트 ((S)-cyclopropyl 2-((S)-(((2R,3R,4R,5R)-5-(2,4-dioxo-3,4-dihydropyrimidin-1-(2H)-yl)-3-hydroxy-4-methyl-4-fluoro-tetrahydrofuran-2-yl)methoxy)-(phenoxy)-phosphorylamino)propanoate)) 를 얻었다. LC-MS (ESI) 528 (M+H)+. 1H NMR (DMSO-d 6, 400 MHz) δ 11.24 (br. s., 1H), 7.56 (d, J = 8.1 Hz, 1H), 7.38 (m, 2H), 7.20 (m, 3H), 6.05 (m, 2H), 5.86 (m, 1H), 5.54 (d, J = 8.1 Hz, 1H), 4.36 (m, 1H), 4.23 (m, 1H), 4.02 (m, 2H), 3.82 (m, 2H), 1.25 (d, J = 22.2 Hz, 3H), 1.21 (d, J = 6.6 Hz, 3H), 0.66 (m, 2H), 0.57 (m, 2H).
실시예 3. 타블렛 형태의 약학적 조성물의 제조 (Preparation of a pharmaceutical composition in the form of tablet)
전분 (starch) (500 mg), 갈은 락토즈(ground lactose) (800 mg), 탈크(talc) (200 mg), 및 1500 mg의 화학구조식 1.1의 전구약물을 함께 섞고 막대 모양(bar)으로 압축 시켰다. 결과로 얻어진 바(bar)는 과립으로 세분하고 및 체를 통해 걸러서 14-16 매쉬(mesh)의 과립을 모았다. 그렇게 얻은 과립은 각각의 무게 400 또는 800 mg 으로 적절한 형태의 타블렛 모양으로 만들었다.
실시예 4. 캡슐 형태의 약학적 조성물의 제조 (Preparation of a pharmaceutical composition in the form of capsules).
화학구조식 1.1의 전구약물을 락토즈 분말과 1:1의 비율로 조심스럽게 섞었다. 결과로 얻어진 분말 같은 혼합물을 각 캡슐에 200 또는 400 mg로 적절한 크기의 젤라틴 캡슐에 넣었다.
실시예 5. 근육내, 복강내, 또는 피하 주사를 위한 조성물의 형태의 약학적 조성물의 제조 (Preparation of a pharmaceutical composition in the form of compositions for intramuscular, intraperitoneal, or subcutaneous injections).
화학구조식 1.1의 전구약물 (500 mg)을 클로로부탄올(chlorobutanol) (300 ml), 프로필렌 글라이콜 (propylene glycol) (2 ml), 및 주사 가능한 물과 섞었다. 결과로 얻어진 용액을 여과하고, 5ml 앰플(ample)에 넣고, 봉인 시켰다.
실시예 6. 전구약물 화학구조식 1.1 및 A2 및 소발디 (Sovaldi®)의 항-HCV 활성 및 세포독성 평가 (Evaluation of anti-HCV activity and cytotoxicity for the prodrugs of formulas 1.1 and А2 and Sovaldi®).
전구약물들을 포함하는 테스트되는 조성물들의 항바이러스 활성도는 HCV 레플리콘(replicon)으로 안정적으로 감염시킨 Huh7 인간 간세포 암종 세포주 (Huh7 human hepatocellular carcinoma cell line)를 사용하여 평가 하였다. 완전 배양 배지(DMEM 1X, Cellgro; cat. # 10-013-CV)에 현탁 시킨 세포는 96-웰 플레이트 (96-well plate) (웰당 50 μl)에 웰 당 최종 밀도 7500 세포가 되도록 옮겼다. DMSO에 있는 200-배 농도의 새로운 일반 용액으로부터 11 농도 포인트로 및 20 nM 부터 시작하여 3-배씩 증가 되도록 완전 배지로 연속적인 희석 농도 (serial dilutions) 의 테스트 전구약물들을 제조 하였으며 및 두 개의 복제로 사용 되었다. 세포를 이식 시킨 후 최소 4 시간 후에, 50 μl의 연속적인 전구약물 희석액을 각 웰에 첨가 하였다. 최종 전구약물의 농도는 10 nM 로부터 0.1 pM로 변화 시켰으며 DMSO의 최종 농도는 0.5%였다. 세포가 있는 플레이트를 37°C에서 습기가 있는 5% CO2 하에서 3 일 동안 배양시켰다. 배양을 완료 시킨 후, 배지는 플레이트를 뒤집어 조심스럽게 흔들어 제거 시켰다. 세포들은 100 μl의 1:1 아세톤:메탄올 (acetone:methanol) 용액으로 1 분간 고정시키고, 인산 버퍼 (phosphate buffer) (PBS)로 3 번 세척 시키고, 및 PBS 에 있는 10% 소 태아 혈청 (fetal bovine serum) (FBS) (150 μl/웰)을 사용하여 실온에서 1 시간 동안 차단 시켰다. 세포들은 PBS로 세 번 세척 시키고 및 Affinity BioReagents (cat. # MA1-080)를 사용하여 37°C 에서 2 시간 동안 항- NS5B HCV 항체들((100 μl/웰)로 배양 시켰으며 및 일반 용액 (generic solution)(1 mg/ml)을 1:4000 의 비율로 10% FBS-PBS에서 희석 시켰다. 세포들은 PBS로 세 번 세척 시키고 각 플레이트 당 1 타블렛의 OPD를 시트레이트/인산 버퍼(citrate/phosphate buffer) (12 ml)에 용해시키고, 여기에 5 μl 의 30% H2O2 를 첨가 시키고, 실온에서 30 동안 암실 두어 OPD 용액 (100 μl/웰)으로 발색 (develoed)시켰다. 반응은 2N H2SO4 (100 μl/웰)로 정지 시키고, 및 다기능 리더 Victor3 V 1420 (multifunctional reader Victor3 V 1420) (Perkin Elmer)를 사용하여 OD490를 측정하였다. 테스트되는 전구약물들의 ЕС50 값은 그라프패드 프리즘 소프트웨어 (GraphPad Prizm software)를 사용하여 플럿 된 활성 커브 (activity curve) 로부터 측정 되었다. 화학구조식 1.1의 새로운 전구약물은 1b (gT1b) HCV 유전자형 (genotype) 에 대하여 ЕС50 = 15.0―27.0 nM 및 ЕС90 = 128.0 Nm; 소발디 (Sovaldi®), ЕС50 = 45―170 nM 및 ЕС90 = 590 nM; 화학구조식 A1 의 싸이클로헥실 에스터 (cyclohexyl ester of formula А1), ЕС90 = 250.0 nM; 및 화학구조식 A2 의 싸이클로헥실 에스터 (cyclohexyl ester of formula А2), EC90 = 73.0 nM 및 ЕС90 = 410.0 nM 를 가진다 (표 1а). 결과적으로, 화학구조식 1.1의 새로운 전구약물의 활성은 소발디 (Sovaldi®)의 활성보다 3 배 이상 더, 화학구조식 A1 화합물의 활성의 2 배, 및 화학구조식 A2의 활성의 3 배 이상 보다 더 초과한다.
표 2. gT1b HCV NS5B에 대한 전구약물 화학구조식 1.1, A1, 및 A2 및 소발디 (Sovaldi®)의 억제 활성 (Inhibiting activity of the prodrugs of formulas 1.1, A1, and A2 and against gT1b HCV NS5B)
| 전구약물Prodrug | 10% FBS | ||
| EC50, nM | EC90, nM | СC90, μM | |
| 1.1 | 15.0-27.0 | 128.0 | >100 |
| 소발디*Sovaldi® | 45.0-170.0* | 520.0** | >100** |
| A1 | 250.0** | ||
| A2 | 73.0 | 410.0 | |
| From: *http//www.hcvdruginfo.ca/HCV_Sofosbuvir.pdf; ** M. J. Sofia et al. J. Med. Chem. 2010, 53, 7202-7218. |
|||
전구약물들을 포함하는 테스트되는 조성물들의 세포 독성은 ATPLite 키트(Perkin-Elmer, Boston, USA)를 사용하여 제조사의 설명대로 같은 세포주 Huh7에서 동시에 평가 되었다. 완전 배양 배지 (DMEM 1X, Cellgro; cat. # 10-013-CV)에 현탁시킨 세포들은 검은색 벽 및 투명한 바닥을 가진 96-웰 플레이트에 최종 밀도가 웰 당 7500세포가 되도록 옮겼다(50 μl/웰). 세포들을 이식 한지 18 시간 후에, 연속적인 약물 희석액 (serial drug dilution) (50 μl/웰)을 첨가 시켰다. 세포가 있는 플레이트는 37°C에서 습기가 있는 5% CO2 환경하에서 4 일 간 배양 되었다. 세포는 PBS (200 μl/웰)로 두 번 세척 시키고 및 용해 버퍼 (lytic buffer) (50 μl/웰)를 첨가하여 용해시켰다; 모든 시약들은 ATPLite 키트로부터 사용했다. 쉐이커 (shaker)에서 5 분 동안 교반 시킨 후, 기질이 첨가 되었다(50 μl/웰). 추가로 5 분 더 배양시킨 후, 플레이트는 어두운 곳에서 10 분 동안 유지시키고, 및 웰에서의 발광은 다기능 리더 Victor3 V 1420 (Perkin Elmer)를 사용하여 측정 되었다. 테스트된 전구약물의 CС50 값은 그라프패드 프리즘 소프트웨어 (GraphPad Prizm software)를 사용하여 플럿 된 활성 커브 (activity curve) 로부터 측정 되었다. 특히, 화학구조식 1.1 의 새로운 전구약물의 세포 독성은 СС50 > 100 μM (표 2) 및 치료 영역 (therapeutic window) ((치료지수 (therapeutic index )TI = EC50/CC50)), TI > 6 000.0. 으로 나타났다.
실시예 7. 화합물들의 키네틱 용해도 평가 (Evaluation of kinetic solubility for compounds).
방법의 원리 (Principle of the method). 테스트되는 화합물은 10-mM농도에 달하도록 DMSO에 용해시키고 및 그 후 수용성 용매 (인산 버퍼, 물, 또는 다른 pH 값을 가진 버퍼)에 쏟아 부어 농도가 200 μM로 낮추어지도록 하였다. 결과로 얻어진 용액을 96-웰 필터 플레이트 (96-well filter plate) (Millipore’s MultiScreen Solubility Filter Plate)에 넣고 1 시간 동안 실온의 진탕기(쉐이커)에서 배양시켰으며, 잔유물은 진공에서 여과 시켰다. 화합물의 흡광 스펙트럼은 240-400nm의 범위에서 10nm씩 증가 시키면서 스펙트로포토미터 (spectrophotometer) 에서 기록하였다. 용해도의 양적인 추정치를 위해, 40% 아세토니트릴 (acetonitrile)을 포함하는 표준용액(0 - 200 μM) 검량 곡선이 사용되었다. 추정농도 범위는 3―200 μM 이었다. 테스트 과정은 두 번 수행 되었다.
검량 표준 의 제조 (Preparation of calibration standards). 검량 표준은 DMSO 에 있는 50-배 스톡 용액(stock solution)으로부터 40% 아세토니트릴을 가진 버퍼에서 희석시켜 제조 하였으며, 검량 샘플에 테스트되는 화합물이 완전히 용해 될 수 있도록 첨가 되었다. 농도 0, 3.125, 12.5, 50, 100, 및 200 μM의 6 개 표준 샘플이 UV 96-웰 플레이트 (UV 96-well plate)의 웰에서 196μl의 40% 아세토니트릴을 포함하는 버퍼에 4 μl의 해당하는 50x 스톡 용액을 첨가하여 제조 되었다. 모든 포인트에서 DMSO 의 농도는 일정 하였고, 및 2%(v/v)에 해당된다.
검량곡선을 플럿 하기 위하여, UV 플레이트 (UV plate)의 광학 스펙트럼은 10nm 증가 폭으로 250-400nm의 범위의 파장에서 기록 되었다. 각 화합물의 스펙트라 데이터에 근거하여, 파장은 다음의 기준에 맞도록 선택되었다:
-최소 화합물 농도를 위하여, OD > 0.1 (AU);
-최대 화합물 농도를 위하여, OD < 2.0.
각 화합물을 위하여 검량 곡선은 선택된 파장에서의 OD를 농도 대비하여 플럿 되었다.
화합물들의 키네틱 용해도 평가 (Evaluation of kinetic solubility for compounds). 용해도는 MultiScreen Solubility (Millipore Corp.) 필터 플레이트 (filter plate) 에서 다음과 같이 평가 되었다:
●
MultiScreen Solubility (Millipore Corp.) 필터 플레이트의 각 웰에, 196 μl의 버퍼 (아세토니트릴 없이) 및 4 μl 의 DMSO에 있는 10-nM 화합물 또는 4 μl 의 DMSO (브랭크 매트릭스를 위해)가 첨가 되었다. 플레이트는 실온의 진탕기(쉐이커)에서 (400rpm) 1 시간 동안 배양시켰다.
●
결과로 얻어진 용액들은 필터 플레이트를 통해 진공(10" Hg) 으로 U-자 모양의 바닥을 가진 폴리프로필렌 플레이트(polypropylene plate) 으로 여과 시켰다.
●
U-자형 바닥 플레이트로부터, 여과액(120 μl/웰)을 새로운 UV 플레이트에 옮기고, 여기에 아세토니트릴(acetonitrile) (80 μl/웰)을 첨가 시켰다.
●
결과로 얻어진 용액의 미리-선택된 파장에서의 광학 밀도(optical density)는 각 화합물마다 측정 되었다.
계산 (calculations). 여과액에서의 화합물의 최종 농도는 다음과 같이 계산 되었다:
C
filtrate
= (OD
λ
Filtrate-OD
λ
Blank)/Slope x 1.67,
여기서
ODλFiltrate 는 선택된 파장에서의 여과액의 광학 밀도;
ODλBlank 는 브랭크 매트릭스 (blank matrix)의 OD;
Slope (기울기) 는 검량 선의 구배 (gradient);
1.67 은 아세토니트릴로 희석된 여과액의 희석 인자
그 결과들은 표 1 에 나타나있다.
실시 예 8. 전구약물 샘플들의 X-선 가루 상 분석 (X-ray powder phase analysis of prodrug samples).
모든 굴절 패턴은 copper-anode X-ray tube 및 Ge(111) monochromator (CuKo^) 및 LynxEye position-sensitive detector, 의 peek-a-boo 세팅으로 장치 되어 있는 Bruker D8 Advance Vario diffractometer에 기록되었다. 짧은 범위 (shot range) 는 샘플 s5를 위해 3-90° 26 이었고 및 다른 샘플들을 위해 5.7-90° 26 이었으며 및 증가폭은 0.01° 26 이었다. 분석은 Bruker Topas5 소프트웨어 ['Bruker TOPAS 5 User Manual. ― Karlsruhe, Germany : Bruker AXS GmbH, 2015.]를 사용하여 수행 되었다.
화학구조식 1.1 화합물의 에틸 아세테이트 및 메틸-tert-부틸 에테르 (ethyl acetate and methyl-tert-butyl ether) (1:1) 혼합물, 에탄올, 에틸 아세테이트, 및 아세틱 에시드와 물의 혼합물로부터 재결정하여 얻은 샘플들은 다결정체 형태를 가진다. 이들 샘플들의 X-선 가루 상 분석 (X-ray powder phase analyses)은 이들의 질적인 상 구조들과 비슷함을 보여주며 이들의 상 관계에서 무의미한 차이를 보여 준다. 샘플들은 다음의 단위 셀 계수들을 가진 사방정상 (orthorhombic phase) 을 가졌다: a = 28.1056(8) A, b = 16.8998(4) A, 및 c = 5.25380(12) A. 체계적인 소멸 분석 (systematic extinction analysis) 에서는 공간 그룹 P212121을 추정하도록 한다. 단위 셀 부피 (unit cell volume) 2495.45(11) А3 는 청구하는 조성물에 해당하며 및 Z’ = 1 이다. 적분 피크 강도 (integral peak intensities)의 비교에 근거한 상 관계 평가는 단사정계상 (monoclinic phase) 의 함량은 30 에서부터 50%로 변함을 제시 한다.
화학구조식 1.1 화합물의 디메틸 설폭사이드 (dimethyl sulfoxide)와 물과의 혼합물로부터 재결정하여 얻은 샘플은 결정체 형태의 흰색 물질이다. X-선 가루 상 분석 (X-ray powder phase analyses) 데이터에 따르면, 상기 형태의 샘플은 단일-상(single-phase)이며 및 다음의 단위 셀 계수를 가진 사방정상 (orthorhombic phase)으로 구성 된다: a = 28.1056(8) A, b = 16.8998(4) A, c = 5.25380(12) A. 체계적인 소멸 분석 (systematic extinction analysis) 에서는 공간 그룹 P212121 을 추정하도록 한다. 단위 셀 부피 (unit cell volume) 2495.45(11) А3 는 청구하는 조성물에 해당하며 및 Z’ = 1.
실시예 9. 화학구조식 1.1의 전구약물을 포함하는 조성물들을 위한 생물학적 매트리스에서의 안정성 평가 (Evaluation of stability in biological matrix for compositions comprising the prodrug of formula 1.1.)
화학구조식 1.1의 전구약물을 포함하는 초기 조성물들을 10 mM의 농도로 DMSO에 제조 하였다. 상기 조성물들로부터, 아세토니트릴: 물이 부피로 1:1 비율의 혼합물로 100-배의 워킹-용액 (working solution)을 100 μM의 농도로 제조 하였다.
a)S9 분획에서의 안전성 (stability in S9 fraction). 반응 혼합물을 0.1M 포타슘 포스페이트 버퍼 (potassium phosphate buffer) (pH7.4 BD Gentest)에 총 최종 부피가 250 μl이 되도록 제조 하였으며, 및 1mM NADPH 테트라소듐 염 (NADPH-tetrasodium salt) (AppliChem), 7 mM 글루코즈-6-포스페이트 소듐 염(glucose-6-phosphate sodium salt) (Sigma), 1.5 U/ml 글루코즈-6-포스페이트 디하이드로지네이즈 (glucose-6-phosphate dehydrogenase) (Sigma), 3.3 mM MgCl2 (Sigma), 5 mM 유리딘-5-디포스페이트-글루크로닉 에시드 트리소듐 염 (uridine-5-diphosphate-glucuronic acid trisodium salt) (UDPGluA, Sigma), 및 1 μM 테스트되는 화합물 (이들은 최종 농도이다)을 포함한다. 대사 반응은 인간 간 S9 분획(BD Gentest) 현탁액을 첨가 하여 시작 되었으며, 및 단백질의 최종 농도는 1 mg/ml 이었다. 반응 혼합물은 37°С 에서 Vortemp56 진탕기(쉐이커)에서 400 rpm으로 교반 시키면서 배양 시켰다. 일정한 간격 후에(0, 0.25, 0.5, 1, 2, 4, 6, 8, 24 시간), 30-μl 샘플들을 취하고; 반응은 내부 표준물을 포함하는 찬 아세토니트릴(180 μl)을 각 취한 샘플에 첨가 하여 멈추게 하였다. 단백질들은 얼음에 15 분 동안 놓아 두었다. 그 후 샘플들은 3000 rpm 에서 10분 동안 원심분리 시키고, 상등액 (150 μl)을 분석을 위하여 샘플로 취했다. 배양은 같은 것 두 개로 수행 되었으며, 각 샘플은 2번 측정 되었다.
b) 인공 위액 및 장액에서의 안정성 (Stability in artificial gastric and intestjuices). 최종 농도 1 μM의 테스트되는 화학구조식 1.1의 전구약물을 포함하는 조성물들을 인공 위액 (0.7% v/v HCl에 있는 0.2% NaCl) 및 인공 장액 (0.05M KH2PO4, pH 6.75)에서 배양시켰다. 배양은 37˚C 에서 Vortemp56 진탕 배양기(shaking incubator)로 300 rev/분의 속도로 교반 시키면서 수행 되었다. 일정한 간격 후에 (0, 0.25, 0.5, 1, 2, 4, 6, 8, 24 시간), 30-μl 샘플들을 취하고; 반응은 내부 표준물을 포함하는 찬 아세토니트릴(180 μl)을 각 취한 샘플에 첨가 하여 멈추게 하였다. 그 후 샘플들은 원심분리 시키고, 및 상등액 (150 μl)을 3000 rev/분 에서 10분 동안 분석을 위하여 샘플로 취했다. 배양은 같은 것 두 개로 수행 되었으며, 각 샘플은 2번 측정 되었다.
c) 혈액 플라즈마에서의 안정성 (Stability in blood plasma). 최종 농도 1 μM의 테스트되는 화합물을 모아진 인간 혈액 플라즈마 (pooled human blood plasma) (Innovative Research)에서 배양시켰다. 배양은 37˚C 에서 Vortemp56 진탕 배양기(shaking incubator)로 300 rev/분의 속도로 교반 시키면서 수행 되었다. 일정한 간격 후에 (0, 0.25, 0.5, 1, 2, 4, 6, 8, 24 시간), 30-μl 샘플들을 취하고; 반응은 내부 표준물을 포함하는 찬 아세토니트릴(180 μl)을 각 취한 샘플에 첨가 하여 멈추게 하였다. 그 후 샘플들은 원심분리 시키고, 및 상등액 (150 μl)을 3000 rev/분 에서 10분 동안 분석을 위하여 샘플로 취했다. 배양은 같은 것 두 개로 수행 되었으며, 각 샘플은 2번 측정 되었다.
샘플 분석 (sample analysis). 샘플들은 각 테스트되는 전구약물을 위해 개발된HPLC-MS/MS 기술을 사용하여 분석되었으며, 여기서 크로마토그래픽 시스템 1290 인피니티II(chromatographic system 1290 Infinity II)(Agilent Technologies)는 텐덤 매스 스펙트로메터 QTRAP5500 (tandem mass spectrometer QTRAP5500) (AB Sciex)와 조합 되었다. 매스-스펙트로메트릭한 검출을 위한 컨디션이 개발 될 때, 아세토니트릴-물(1:1)의 혼합물에 100ng/ml의 농도로 있는 테스트되는 화합물들의 용액들은 양성이온 모드로 수행 되는 전자분무 이온화 (electrospray ionization) 를 가진 주사기 펌프를 사용하여 직접 매스 스펙트로메터에 주사 되었다. 총 이온 커런트 모드 (total ion current mode) (MS1)에서 스캐닝은 각 화합물의 분자 이온을 동정하게 하였으며, 및 염기성 생산물 이온 (basic product ions)들은 MS2 모드로 기록 되었다. 그 후, 최대 민감도를 얻기 위해, MS/MS 기술은 MRM 모드로 최적화 시켰다. 정량적인 크로마토그램 과정에서, 분석물 및 내부 표준을 위해 위해 가장 강도 있는 MRM 전이가 사용 되었다. 분리는 물에 있는 0.1% 포믹 에시드 (formic acid in water) 및 아세토니트릴에 있는 0.1% 포믹에시드 (0.1% formic acid in acetonitrile)로 구성된 이동 상으로 YMC Triart C18 컬럼 (50 x 2 mm, 1.9 μm) 에서 선상 구배 용리 (linear gradient elution) 크로마토그래피에 의해 수행 되었다. 톨부타마이드 (Tolbutamide)(Fluka)가 내부 표준으로 사용되었다.
계산 (computations). 반감기는 생물학적 매트릭스에서 배양시키는 동안 항바이러스 조성물에서 테스트되는 전구약물의 제거 키네틱스로부터 찾았다. 계산은 내부 표준으로 정상화 시킨 테스트 샘플에서의 화합물들의 크로마토그래피 피크 면적의 값에 근거한다. 시간에서 크로마토그래피 피크의 로그 정상화 면적의 선상 의존성으로부터, 제거 속도의 항수가 계산되었다 (k는 선상 부위의 기울기). 그 후, 반감기가 찾아졌다: Т1/2 = 0.693 / k. 특히 (표 3), 화학구조식 1.1의 전구약물, 화학구조식 A1 화합물, 및 소발디 (Sovaldi®)는 인간 위액 (Т1/2 SGF = 12.7― 17 h), 인간 장액 내 (Т1/2 SIF > 20 h), 및 인간 플라즈마 내(Т1/2 HPL > 24 h) 에서 비교될 만한 안정성을 가진 것으로 발견 되었다. 동시에, 화학구조식 1.1의 전구약물은 인간 간 마이크로조말 S9 분획에서 좀더 활성적으로 대사 되며 및 반감기는 Т1/2 HS9 = 0.05시간이고, 반면에 원형 소발디 (prototype Sovaldi®) 는 Т1/2 HS9 = 0.57 시간 및 화학구조식 A1의 싸이클로헥실 에스터 (cyclohexyl ester of formula А1) 는 Т1/2 HS9 = 1.4 시간의 반감기를 가지며 (표 3), 이는 화학구조식 1.1의 전구약물은 인간 간 마이크로조말 S9 분획에서 소발디 (Sovaldi®) 보다 11배 빠르고, 화학구조식 A1의 화합물보다 28 배 빠르게 대사 됨을 의미한다.
표 3. 화학구조식 1.1의 새로운 전구약물 및 소발디 (Sovaldi®)를 포함하는 항바이러스 조성물의 안정성 및 활성 (Stability and activity of antiviral compositions comprising the novel prodrug of formula 1.1 and Sovaldi®).
| ID | T1/2 (h) | |||
| SGF | SIF | 인간 플라즈마human plasma | 인간 S9 human S9 |
|
| 1.1 | 12.7 | >24 | >24 | 0.05 |
| 소발디(Sovaldi®) | 22.0* | >24* | >24* | 0.57* |
| А1 | 17* | >20* | >24* | 1,4* |
| *from M. J. Sofia et al. J. Med. Chem. 2010, 53, 7202-7218. | ||||
실시예 10. 화학구조식 1.1 전구약물 및 소발디 (Sovaldi®)를 포함하는 조성물의 쥐 간에서의 약동학 (pharmacokinetic) (PK) 연구 (Pharmacokinetic (PK) study of compositions comprising the prodrug of formula 1.1 and Sovaldi® in rat liver)
쥐에 투여를 위한 화학구조식 1.1 전구약물 및 소발디 (Sovaldi ® )를 포함하는 조성물의 제조. 테스트되는 조성물은 50 mg/kg의 용량으로 투여 된다. 이 목적으로, 조성물들은 화학구조식 1.1의 전구약물 또는 소발디(Sovaldi®) 를 5.0 mg/ml의 농도로 0.5% 하이드록시프로필 메틸셀루로오즈 (hydroxypropyl methylcellulose) (HPMC) 용액으로 제조하였고, 여기에 5% 에탄올이 다음과 같이 첨가 되었다: 무게를 달은 화학구조식 1.1의 전구약물 또는 소발디(Sovaldi®)에, 적절한 양의 HPMC를 첨가하고, 및 이 혼합물을 약사발(mortal)에서 가루로 빻아 건조시키고, 그 후에 증류수에 있는 5% 에탄올 적절한 양을 일부분씩 천천히 첨가 시키고, 및 이 혼합물을 조심스럽게 교반하여 위내로 투여하기 적절한 현탁액을 얻었다.
화학구조식 1.1 전구약물 및 소발디 (Sovaldi ® )를 포함하는 조성물의 동물에의 투여. 혈액 플라즈마 및 간 샘플 제조. 연구는 스프라구 다우리 (Sprague Dawley) 쥐에서 수행되었다. 쥐는 선택되는 시간 포인트 (1, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 16, 및 24 시간)에 근거하여 한 그룹당 6 마리로 나누었다. 쥐는 무게를 달고, 및 화학구조식 1.1 전구약물 또는 소발디 (Sovaldi®)를 포함하는 일정 부피의 조성물을 영양보급관을 통해 위내(inragastrically)로 투여 하였다. 어떤 그룹의 동물에 투여 하는 사이의 간격에, 간 및 혈액 샘플들을 얻었다. 투여 다음에 적절한 시간 기간 후에, 쥐는 CO2 흡입으로 안락사 시켰다. 안락사 바로 후에, 동물은 빨리 개복시키고, 간의 윗엽(upper lobe)을 자르고 및 즉시 액체 질소에 넣었다. 동결된 간 조각은 그 후 액체 질소로 냉각시킨 라벨 된 실험관으로 옮겼다. 샘플들은 실험 끝날 때까지 액체 질소에 유지 시켰으며 및 그 후 -80°С의 초-저온 냉동고에 넣었다.
샘플제조 (Sample preparation). 약 1 g 무게의 간 샘플은 액체 질소로 냉각시키면서 약사발에서 빻았다. 결과로 얻어진 분말은 3배 부피의 메탄올 및 EDTA가 있는 70 % 메탄올에 쏟아 붓고 및 45 초 동안 두 번 (10초 간격을 두고) 옴니 비드 럽터 24 호모게나이져(Omni Bead Ruptor 24 homogenizer)를 사용하여 6.3 m/s 의 속도로 균질화시켰다. 이렇게 얻은 균질액(homogenate) 360 μl에, 40 μl 의 PSI-7409 및 H027-4261을 포함하는 10-배 표준 용액 (또는 메탄올, 실험 샘플인 경우) 및 100 μl 의 25 ng/ml의 내부 표준 용액 (5-브로모유리딘 트리포스페이트, 5-bromouridine triphosphate)을 첨가 하였다. 교반 및 원심분리 후에, 400 μl의 상등액을 메탄올-물 (1:1) 혼합물에 있는 1% 포믹 에시드 (formic acid)용액 400 μl로 희석시켰다. 그 후, 워터즈 오아시스 왁스 카트리지 (Waters Oasis WAX cartridges)를 사용하여 고체-상 추출 (solid-phase extraction)을 수행 하였다. 결과로 얻어진 산물은 800 μl 의 메탄올에 있는 5% 암모니아 용액으로 용출시키고, 및 이 용출액은 증발시키고 및 200 μl 의 메탄올에 다시 용해 시켰다.
HPLC-MS/MS 분석 조건들 (HPLC-MS/MS analytical conditions). 샘플들은 HPLC-MS/MS 기술을 사용하여 분석 되었으며, 여기서 HPLC 시스템 Agilent 1290 Infinity II는 AB Sciex QTrap 5500 매스 스펙트로메터와 조합 되었다. 분리는 Thermo Hypercarb 컬럼 (50 x 3 mm, 5 μm)에서 수행 되었다. 0.5% 암모늄을 가진 25-mM 암모늄 아세테이트 용액을 이동상 A (MPA)로 사용 했으며; 0.5% 암모늄을 가진 물-이소프로판올-아세토니트릴(water-isopropanol-acetonitrile) (1:1:3)의 혼합물에 있는 25-mM 암모늄 아세테이트 용액을 이동상 B(MPB)로 사용 하였다. 분리는 구배 모드 (gradient mode)로 수행 되었다: 0―0.3 분- 5% MPB; 3―3.4 분 - 50% MPB; 3.6―4.5 분 - 5% MPB. PSI-7409 및 H027-4261는 이온 전이 각각 499/159 및 410/150로 MRM 모드에서 기록 되었다.
약동학 분석 (Pharmacokinetic analysis). “간의 농도 대비 시간” 의 약동학 분석 데이터는 페닉스 윈놀린6.3 (Phoenix™ WinNonlin® 6.3 )(Pharsight Corp.) 및 그래프패드 프리즘 소프트웨어 (GraphPad Prizm software)를 사용하여 비-분획 기술 (non-compartmental technique)로 수행 되었다. 다음의 약동학 계수들이 계산 되었다: 간에서의 최대 농도(Сmax) 및 이의 도달 시간((Tmax), 반감기(T1/2), 및 PK 커브 아래 면적 (AUC0-t, AUC0-inf). 그 결과는 표 4 에서 주어진다. 표 4에서 볼 수 있는 바와 같이, 쥐의 간에서 화학구조식 1.1 전구약물의 대사 결과로부터 나오는 트리포스페이트 (triphosphate) PSI-7409 의 농도 및 AUC24h 는 각각 Сmax =3224.0 ng/g 및 AUC24 h = 30487.0 ng·h/g 이며, 반면에, 비슷한 대사를 보이는 소발디 (Sovaldi®)는 Сmax =1934.0 ng/g 및 AUC24 h = 16796.0 ng·h/g이고, 및 화학구조식 A1 의 싸이클로헥실 에스터는 Сmax = 557 ng/g 및AUC24 h = 6484.0 ng·h/g (표 4)이다. 이는 새로운 전구약물 화학구조식 1.1은 소발디 (Sovaldi®)와 비교 하였을 때 바람직한 트리포스페이트 PSI-7409 (약물)으로 간에서 대사 되는데 거의 2 배 더 효과적이며, 및 화학구조식 A1 의 싸이클로헥실 에스터에 비교하여 4.7배 더 효과적임을 제시 한다.
표 4. 전구약물 화학구조식1.1 및 소발디 (Sovaldi®) 50 mg/kg 용량의 경구 투여 후 쥐 간에서의 트리포스페이트 PSI- PSI-7409 의 약동학 (Pharmacokinetic) (PK) 계수들(Pharmacokinetic (PK) parameters of triphosphate PSI-7409 in rat liver following peroral administration of the prodrug of formula 1.1 and Sovaldi® in a dose of 50 mg/kg)
| PK 계수들 PK parameters |
PK 결과들을 처리하는데 사용된 소프트웨어 Software used for processing PK results |
According to M. J. Sofia et al. J. Med. Chem. 2010, 53, 7202-7218. | ||
| Phoenix™ WinNonlin® 6.3 | GraphPad Prizm | |||
| 전구약물1.1. Prodrug 1.1 |
소발디 Sovaldi® |
전구약물 A1 Prodrug А1 |
||
| T1/2, h | 7.2 | 5.5 | ||
| Tmax, h | 8.0 | 4.0 | 4.0 | 2,0 |
| Cmax, ng/g | 3224.0 | 3102.0 | 1934 | 557.0 |
| C24 h, ng/g | 320.0 | |||
| AUC24 h, ng · h/g | 30 487.0 | 30 444.0 | 16 796.0 | 6487.0 |
| AUC0-inf, ng · h/g | 33 823.0 | 18 080.0 | 8831.0 | |
Claims (8)
- 하기 일반 화학구조식 1의 싸이클로부틸 (S)-2-{[(2R,3R,4R,5R)-5-(2,4-디옥소-3,4-디하이드로-2H-피리미딘-1-일)-4-풀루오로-3-하이드록시-4-메틸-테트라하이드로푸란-2-일메톡시]-펜옥시-포스포릴아미노}-프로피오네이트, 이의 입체이성질체, 동위원소 농축 유사체(isotopically enriched analog), 또는 결정체(crystalline) 또는 다결정체 형태의 화합물:
.
- 제1항에 따른 화합물에 있어서, 하기 화학구조식 1.1의 싸이클로부틸 (S)-2-{(S)[(2R,3R,4R,5R)-5-(3,4-디하이드로-2,4-디옥소-2H-피리미딘-1-일)-3-하이드록시-4-메틸-4-풀루오로-테트라하이드로푸란-2-일메톡시]-펜옥시-포스포릴아미노}-프로피오네이트 ((cyclobutyl (S)-2-{(S)-[(2R,3R,4R,5R)-5-(3,4-dihydro-2,4-dioxo-2H-pyrimidin-1-yl)-3-hydroxy-4-methyl-4-fluoro-tetrahydrofuran-2-ylmethoxy]-phenoxy-phosphorylamino}-propanoate), 또는 화학구조식 1.2의 싸이클로부틸 (S)-2-{(R)[(2R,3R,4R,5R)-5-(3,4-디하이드로-2,4-디옥소-2H-피리미딘-1-일)-3-하이드록시-4-메틸-4-풀루오로-테트라하이드로푸란-2-일메톡시]-펜옥시-포스포릴아미노}-프로피오네이트 ((cyclobutyl (S)-2-{(R)-[(2R,3R,4R,5R)-5-(3,4-dihydro-2,4-dioxo-2H-pyrimidin-1-yl)-3-hydroxy-4-methyl-4-fluoro-tetrahydrofuran-2-ylmethoxy]-phenoxy-phosphorylamino}-propanoate)), 또는 이들의 동위원소 농축 유사체(isotopically enriched analog), 또는 결정체(crystalline) 또는 다결정체 형태의 화합물:
.
- HCV NS5B 폴리머레이즈 억제제 성질을 소유하고 제 1항의 화합물인 의학적 약물이되, 이를 필요로 하는 사람 또는 온혈동물에서 C형 간염을 치료용인, 의학적 약물.
- 제 1항 또는 제2항에 따른 화합물을 제조하는 방법으로서, 화학구조식 2의 싸이클로부틸 (S)-2-(펜타풀루오로페닐옥시-펜옥시-포스포릴아미노)-프로피오네이트 ((cyclobutyl (S)-2-(pentafluorophenyloxy-phenoxy-phosphorylamino)-propionate)), 또는 이의 입체이성체들: 화학구조식 2.1의 싸이클로부틸(S)-2-((S)-펜타풀루오로페닐옥시-펜옥시-포스포릴아미노)-프로피오네이트 ((cyclobutyl (S)-2-((S)-pentafluorophenyloxy-phenoxy-phosphorylamino)-propionate)), 또는 화학구조식 2.2의 싸이클로부틸(S)-2-((R)-펜타풀루오로페닐옥시-펜옥시-포스포릴아미노)-프로피오네이트 ((cyclobutyl (S)-2-((R)-pentafluorophenyloxy-phenoxy-phosphorylamino)-propionate))의 사용을 포함하는, 방법:
.
- 치료적으로 효과적인 양의 제1항의 화합물 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는, 약학적 조성물.
- 제 5 항의 약학적 조성물에 있어서, C 형 간염 바이러스의 치료를 위한 것을 특징으로 하는, 조성물.
- 제5항 또는 제6항의 약학적 조성물, 또는 제 1 항에 따른 화합물 또는 이의 입체이성질체, 이들의 동위원소 농축 유사체, 결정체 또는 다결정체 형태 화합물의 효과적인 양을 대상에게 투여 하는 것을 포함하는 C형 간염 바이러스로 감염된 대상을 치료 하는 방법.
- 제7항 의 방법에 있어서, 이를 필요로 하는 대상에서 C형 간염 바이러스에 의한 감염을 치료하려는 의도를 갖는 것을 특징으로 하는, 방법.
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