KR20190135342A

KR20190135342A - 유산균 유래 단백질의 활성 단편 펩타이드 및 이의 용도

Info

Publication number: KR20190135342A
Application number: KR1020180060702A
Authority: KR
Inventors: 정명준
Original assignee: 주식회사 쎌바이오텍
Priority date: 2018-05-28
Filing date: 2018-05-28
Publication date: 2019-12-06

Abstract

본 발명은 유산균 유래 단백질의 활성 단편 펩타이드에 관한 것이다. 본 발명의 활성 단편 펩타이드는 이 펩타이드가 유래된 단백질의 본래 대장 질환 치료 활성을 보유하면서, 그 크기가 감소된 펩타이드 형태이다. 본 발명의 활성 단편 펩타이드는 대장 질환의 치료 용도로 유용하게 사용될 수 있다.

Description

유산균 유래 단백질의 활성 단편 펩타이드 및 이의 용도{Active Fragment Peptide of Protein Derived from Lactic Acid Bacteria and Use of the Same}

본 발명은 유산균 유래 단백질의 활성 단편 펩타이드 및 이의 용도에 관한 것이다.

대장 질환이란 대장암, 대장염, 과민성대장증후군, 크론병 등을 포함하는 것으로, 대장에 발생하는 여러가지 질병을 총칭한다. 현대에는 잦은 스트레스와 서구화된 식습관, 음주 등의 영향으로 대장질환 환자 수가 큰 폭으로 증가하고 있다. 국민건강보험공단 2012년 대장암 진료비 보고서에 따르면, 대장암 환자 수는 2007년 7만 7,193명에서 2011년 11만 3,504명으로 증가하였고, 대장암 진료비는 2007년 3,360억원에서 2011년 5,148억원으로 증가하였다. 대장암 치료를 위하여 합성화합물로서의 5-플루오로유라실(5-FU, fluorouracil), UFT(tegafur-uracil), 카페시타빈(capecitabine) 등의 플루오로피리미딘(flouropyrimidine)계열 약물들과 이리노테칸(irinotecan), 옥살리플라틴(oxaliplatin) 등이 개발되어 사용되고 있고, 표적치료제인 베바시주맙(bevacizumab, 상품명 아바스틴) 및 세툭시맙 (cetuximab, 상품명 얼비툭스) 등이 개발되고 있다. 그러나 고농도 투여 및 장기적 사용에 따른 부작용 위험이 높아 천연물 치료제의 개발이 시급히 요구되고 있다.

한편, 프로바이오틱스란 섭취되어 장에 도달하였을 때에 장내 환경에 유익한 작용을 하는 균주를 말한다. 현재까지 알려진 대부분의 프로바이오틱스는 유산균들이며, 유산균이란 당류를 발효하여 에너지를 획득하고 다량의 젖산을 생성 하는 세균의 총칭이다. 대장암 및 대장염을 포함하는 대장질환 환자들에게 유산균을 투여하여 치료 효과를 기대할 수 있다는 것이 공지되어, “장내 유해효소의 활성을 억제하는 새로운 한국형 유산균 및 그의 용도(KR 10-0232639 B1)” 및 “장내 환경개선효과를 갖는 나노형 김치 유산균 조성물(KR 10-2016-0084822 A)” 등 유산균을 대장질환 치료제로 사용하고자 하는 기술들이 개발되고 있으나, 유산균 내에 서 유효성분으로서의 단백질을 확인하고 이용하는 것에 대한 기술은 개발이 미비한 실정이다.

본 명세서에서 언급된 특허문헌 및 참고문헌은 각각의 문헌이 참조에 의해 개별적이고 명확하게 특정된 것과 동일한 정도로 본 명세서에 참조로 삽입된다.

대한민국 등록특허 제10-0232639호 대한민국 공개특허 제10-2016-0084822호

본 발명자들은 유산균 유래 신규 단백질을 분리하여 이의 대장 질환 치료 활성을 확인하였고, 이 단백질의 활성을 유지하면서 크기가 감소된 활성 펩타이드를 개발하고자 예의 연구 노력하였다. 그 결과, 2차 및 3차 구조 분석을 통해 상기 단백질의 활성을 유지하면서 크기가 감소된 활성 단편 펩타이드들을 개발하였고, 이들의 대장 질환 치료 활성을 실험적으로 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 단백질의 활성을 갖는 단편 펩타이드를 제공하는 데에 있다.

본 발명의 다른 목적은 상기 활성 단편 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 대장질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 데에 있다.

본 발명의 다른 목적 및 기술적 특징은 이하의 발명의 상세한 설명, 청구의 범위 및 도면에 의해 보다 구체적으로 제시된다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 단백질의 활성을 갖는 단편 펩타이드를 제공한다.

본 발명에서, 상기 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 단백질은 본 발명자들에 의해 대장 질환 치료 활성을 갖는 것으로 규명된 유산균 유래 단백질이다.

본 발명의 활성 단편 펩타이드는 상기 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 단백질의 대장 질환 치료 활성을 가지면서, 상기 단백질의 일부 도메인을 포함하는 단편 펩타이드를 의미한다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 활성 단편 펩타이드는 서열번호 2 내지 서열번호 10으로 이루어지는 그룹에서 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열을 갖는 펩타이드이다.

서열번호 10의 아미노산 서열을 갖는 펩타이드는 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 펩타이드와 서열번호 7의 아미노산 서열을 갖는 펩타이드가 융합된 융합 펩타이드이다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 상기 활성 단편 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 대장질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 약학적 조성물에서 상기 대장 질환은 대장암, 대장용종, 대장염, 허혈성 장질환, 이질, 장내 혈관 이형성, 게실증, 과민성대장증후군, 및 크론병으로 구성되는 그룹으로부터 선택된 어느 하나 이상이다.

본 발명의 약학적 조성물에서 유효성분인 활성 단편 펩타이드는 “약학적 유효량”으로 포함된다. 상기 용어 “약학적 유효량”은 상술한 본 발명 펩타이드의 효능 또는 활성을 달성하는 데 충분한 양을 의미한다.

본 발명의 약학적 조성물은 경구적 또는 비경구적으로 투여할 수 있으며, 바람직하게는 비경구적으로 투여할 수 있다.

본 명세서에서, “비경구적 투여” 는 피하 주사, 정맥 내, 근육 내, 흉골 내 주사 또는 주입 기술을 포함한다.

본 발명의 약학적 조성물을 주사제로 제제화 시, 당해 기술분야에 공지되어 있는 통상의 주사제 제조방법에 따라 제조될 수 있다. 본 발명에 따른 주사제는 환자에게 투여 시 그대로 이용될 수 있도록 멸균 매질에 분산된 형태일 수도 있으며, 투여 시 주사용 증류수를 가해 적절한 농도로 분산시킨 다음 투여하는 형태일 수도 있다.

본 발명의 약학적 조성물을 경구투여제로 제제화 시, 담체로서 희석제, 활택제, 결합제, 붕해제, 감미제, 안정제, 및 방부제 중에서 1 종 이상을 선택하여 사용할 수 있으며, 첨가제로는 향료, 비타민류, 및 항산화제 중에서 1 종 이상을 선택하여 사용할 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물의 제제화에 필요한 기술 및 약제학적으로 적절한 담체, 첨가제 등에 관해서는 당해 제제학 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 널리 알려져 있으며, 이와 관련하여 문헌들 예컨대 the Handbook of Pharmaceutical Excipients, 4thedition, Rowe et al., Eds., American Pharmaceuticals Association (2003); Remington: the Science and Practice of Pharmacy, 20 th edition, Gennaro, Ed., Lippincott Williams & Wilkins (2000); Remington's Pharmaceutical Sciences (19 th ed., 1995) 등을 참조할 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물의 투여량은 성인 기준으로 0.0001-1000 ㎍/kg (체중)이다.

본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:

(ⅰ) 본 발명은 유산균 유래 단백질의 활성 단편 펩타이드에 관한 것이다.

(ⅱ) 본 발명의 활성 단편 펩타이드는 이 펩타이드가 유래된 단백질의 본래 대장 질환 치료 활성을 보유하면서, 그 크기가 감소된 펩타이드 형태이다.

(ⅲ) 본 발명의 활성 단편 펩타이드는 대장 질환의 치료 용도로 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 P8 단백질의 각 활성 단편 펩타이드들의 위치와 서열을 P8 단백질과 대비하여 나타낸다. P8 단백질의 각 활성 단편 펩타이드는 각각 P8-1 펩타이드(서열번호 2), P8-2 펩타이드(서열번호 3), P8-3 펩타이드(서열번호 4), P8-4 펩타이드(서열번호 4), P8-5 펩타이드(서열번호 6), P8-6 펩타이드(서열번호 7), P8-7 펩타이드(서열번호 8), P8-8 펩타이드(서열번호 9), P8-9 펩타이드(서열번호 10)이다.
도 2는 P8 단백질의 각 활성 단편 펩타이드들의 항암활성을 측정한 결과이다.
도 3은 P8-1 펩타이드를 4 종류의 대장암 세포(HCT-116, DLD-1, SW-480, HT-29)에 대해 항암 활성을 평가한 결과이다.
도 4은 P8-6 펩타이드를 4 종류의 대장암 세포(HCT-116, DLD-1, SW-480, HT-29)에 대해 항암 활성을 평가한 결과이다.
도 5은 P8-9 펩타이드를 4 종류의 대장암 세포(HCT-116, DLD-1, SW-480, HT-29)에 대해 항암 활성을 평가한 결과이다.
도 6은 P8-1, P8-6, P8-9 펩타이드가 대장암 세포(DLD-1)에서 세포 자멸사(cell apoptosis)를 유발시키는 지 여부를 분석한 결과이다.
도 7은 P8 활성 단편 펩타이드들의 P8 항체에 대한 특이적 결합력을 측정한 결과이다.
도 8는 P8 활성 단편 펩타이드 P8-1, P8-6, P8-9들을 SBA(sheep bood agar plate)에 처리하여 시간에 따른 용혈 반응을 평가한 결과이다.

실시예

실시예 1 : 유산균 유래 단백질의 활성 단편 펩타이드들의 항암 활성의 측정

본 발명자들이 분리하여 그 활성을 규명한 P8 단백질(서열번호 1)의 2차 구조 및 3차 구조를 분석하고, 활성을 유지할 것으로 예측되는 도메인을 선정한 후, 이들 도메인에 해당되는 펩타이드들을 화학적 합성 방법을 이용하여 제조하였다[애니젠(Anygen)(주), 광주, 대한민국].

도 1에 P8-1 펩타이드(서열번호 2), P8-2 펩타이드(서열번호 3), P8-3 펩타이드(서열번호 4), P8-4 펩타이드(서열번호 4), P8-5 펩타이드(서열번호 6), P8-6 펩타이드(서열번호 7), P8-7 펩타이드(서열번호 8), P8-8 펩타이드(서열번호 9), P8-9 펩타이드(서열번호 10)들의 위치와 서열을 P8 단백질과 대비하여 나타내었다. 상기 P8-9 펩타이드는 P8-1 및 P8-6을 연결시킨 융합 펩타이드이다.

상기 합성하여 제조한 펩타이드들 각각의 항암 활성을 측정하였다. 구체적으로, 제조한 P8 펩타이드들(P8-1, P8-2, P8-3, P8-4, P8-5, P8-6, P8-7, P8-8, P8-9)을 각각 0, 5, 10, 20, 50, 또는 100 μg/ml의 농도로 대장암 세포(DLD-1)에 처리한 후 MTT assay를 행하여 항암 활성을 평가하였다. 도 2에 상기 P8 펩타이드들의 항암활성을 측정한 결과를 나타내었다.

이어서, 항암 활성이 우수한 것으로 확인된 P8-1 펩타이드를 4 종류의 대장암 세포(HCT-116, DLD-1, SW-480, HT-29)에 대해 0, 5, 10, 20, 50, 또는 100 μg/ml의 농도로 처리하고, 항암 활성을 평가하였다(도 3).

또한, 항암 활성이 우수한 것으로 확인된 P8-6 펩타이드를 4 종류의 대장암 세포(HCT-116, DLD-1, SW-480, HT-29)에 대해 0, 5, 10, 20, 50, 또는 100 μg/ml의 농도로 처리하고, 항암 활성을 평가하였다(도 4).

또한, 항암 활성이 우수한 것으로 확인된 P8-9 펩타이드를 4 종류의 대장암 세포(HCT-116, DLD-1, SW-480, HT-29)에 대해 0, 5, 10, 20, 50, 또는 100 μg/ml의 농도로 처리하고, 항암 활성을 평가하였다(도 5).

이어서, P8-1, P8-6, P8-9 펩타이드 각각을 48시간 처리한 DLD-1 대장암 세포에서 Annexin V Stainning 분석을 통해 세포자멸사(cell apoptosis) 유발 여부를 분석하였다(도 6). 도 6의 결과에 의하면, P8-1, P8-6, P8-9 펩타이드가 대장암 세포에서 세포자멸사를 일으키는 것을 확인할 수 있었다.

실시예 2: P8 펩타이드들의 P8 단백질에 대한 항체의 결합력 확인

Rabbit anti-P8 항체를 사용한 닷 블랏(Dot blot) 방법을 통해 P8 펩타이드들의 P8 단백질에 대한 항체의 결합력을 확인하였다(도 7). 도 7의 결과를 통해, P8-1, P8-4, P8-6, P8-8 펩타이드들은 P8 단백질 항체에 특이적 결합력이 매우 약하거나 결합력이 없다는 것을 확인할 수 있었다.

실시예 3: P8 펩타이드들의 주사제 사용 안전성 확인

P8-1, P8-6, P8-9 펩타이드를 SBA(sheep bood agar plate)에 처리하여 시간에 따른 적혈구 용혈 반응을 평가하였고, 그 결과는 도 8에 나타내었다. 도 8의 결과에서 나타나는 바와 같이, P8-1, P8-6, P8-9 펩타이드는 주사제로서 사용될 경우 용혈 안전성이 높은 것으로 확인하였다.

본 명세서에서 설명된 구체적인 실시예는 본 발명의 바람직한 구현예 또는 예시를 대표하는 의미이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 한정되지는 않는다. 본 발명의 변형과 다른 용도가 본 명세서 특허청구범위에 기재된 발명의 범위로부터 벗어나지 않는다는 것은 당업자에게 명백하다.

<110> Cell Biotech <120> Active Fragment Peptide of Protein Derived from Lactic Acid Bacteria and Use of the Same <130> DPB182550 <160> 10 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 73 <212> PRT <213> Lactobacillus rhamnosus <400> 1 Met Ala Thr Val Asp Pro Glu Lys Thr Leu Phe Leu Asp Glu Pro Met 1 5 10 15 Asn Lys Val Phe Asp Trp Ser Asn Ser Glu Ala Pro Val Arg Asp Ala 20 25 30 Leu Trp Asp Tyr Tyr Met Glu Lys Asn Ser Arg Asp Thr Ile Lys Thr 35 40 45 Glu Glu Glu Met Lys Pro Val Leu Asp Met Ser Asp Asp Glu Val Lys 50 55 60 Ala Leu Ala Glu Lys Val Leu Lys Lys 65 70 <210> 2 <211> 25 <212> PRT <213> Lactobacillus rhamnosus <400> 2 Ala Thr Val Asp Pro Glu Lys Thr Leu Phe Leu Asp Glu Pro Met Asn 1 5 10 15 Lys Val Phe Asp Trp Ser Asn Ser Glu 20 25 <210> 3 <211> 33 <212> PRT <213> Lactobacillus rhamnosus <400> 3 Met Asn Lys Val Phe Asp Trp Ser Asn Ser Glu Ala Pro Val Arg Asp 1 5 10 15 Ala Leu Trp Asp Tyr Tyr Met Glu Lys Asn Ser Arg Asp Thr Ile Lys 20 25 30 Thr <210> 4 <211> 49 <212> PRT <213> Lactobacillus rhamnosus <400> 4 Ser Glu Ala Pro Val Arg Asp Ala Leu Trp Asp Tyr Tyr Met Glu Lys 1 5 10 15 Asn Ser Arg Asp Thr Ile Lys Thr Glu Glu Glu Met Lys Pro Val Leu 20 25 30 Asp Met Ser Asp Asp Glu Val Lys Ala Leu Ala Glu Lys Val Leu Lys 35 40 45 Lys <210> 5 <211> 12 <212> PRT <213> Lactobacillus rhamnosus <400> 5 Ser Glu Ala Pro Val Arg Asp Ala Leu Trp Asp Tyr 1 5 10 <210> 6 <211> 33 <212> PRT <213> Lactobacillus rhamnosus <400> 6 Ser Glu Ala Pro Val Arg Asp Ala Leu Trp Asp Tyr Tyr Met Glu Lys 1 5 10 15 Asn Ser Arg Asp Thr Ile Lys Thr Glu Glu Glu Met Lys Pro Val Leu 20 25 30 Asp <210> 7 <211> 15 <212> PRT <213> Lactobacillus rhamnosus <400> 7 Arg Asp Thr Ile Lys Thr Glu Glu Glu Met Lys Pro Val Leu Asp 1 5 10 15 <210> 8 <211> 31 <212> PRT <213> Lactobacillus rhamnosus <400> 8 Arg Asp Thr Ile Lys Thr Glu Glu Glu Met Lys Pro Val Leu Asp Met 1 5 10 15 Ser Asp Asp Glu Val Lys Ala Leu Ala Glu Lys Val Leu Lys Lys 20 25 30 <210> 9 <211> 15 <212> PRT <213> Lactobacillus rhamnosus <400> 9 Ser Asp Asp Glu Val Lys Ala Leu Ala Glu Lys Val Leu Lys Lys 1 5 10 15 <210> 10 <211> 40 <212> PRT <213> Lactobacillus rhamnosus <400> 10 Ala Thr Val Asp Pro Glu Lys Thr Leu Phe Leu Asp Glu Pro Met Asn 1 5 10 15 Lys Val Phe Asp Trp Ser Asn Ser Glu Arg Asp Thr Ile Lys Thr Glu 20 25 30 Glu Glu Met Lys Pro Val Leu Asp 35 40

Claims

서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 단백질의 활성 단편 펩타이드.
제 1 항에 있어서, 상기 활성 단편 펩타이드는 서열번호 2 내지 서열번호 10으로 이루어지는 그룹에서 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 활성 단편 펩타이드.
제 1 항 또는 제 2 항의 활성 단편 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 포함하는 대장질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
제 3 항에 있어서, 상기 대장질환은 대장암, 대장용종, 대장염, 허혈성 장질환, 이질, 장내 혈관 이형성, 게실증, 과민성대장증후군, 및 크론병으로 구성되는 그룹으로부터 선택된 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.