KR20190130593A - 결장직장암의 진단 및 모니터링에 사용하기 위한 방법 및 장치 - Google Patents

Abstract

본 발명은 환자 혈액의 시료화를 통해 결장직장암을 조기에 검출하고 모니터링하는 방법 및 장치에 관한 것이다.

Description

결장직장암의 진단 및 모니터링에 사용하기 위한 방법 및 장치

본 발명은 환자 혈액의 시료화를 통해 결장직장암을 조기 검출하고 모니터링하는 방법 및 장치에 관한 것이다.

창자암(bowel cancer)은 영국에서 3번째로 가장 흔한 암이고, 암 사망의 두번째로 가장 흔한 원인이며, 매년 약 38,000개의 새로운 사례가 존재하고, 16,200명이 사망한다. 환자는 계속해서 진전된 병기(stage)(55% III/IV 기)에 존재하고, 종종 연관된 더 열악한 생존율과 함께 응급(24%)으로서 존재한다. 최상의 환자 성과는 질병이 조기에 검출되고 증상이 발생하기 전에 달성된다. 창자암 스크리닝 프로그램이 존재함에도 불구하고, 현재의 시험 시술의 대중 수용성(public acceptance)은 불량하였다. 이는, 잠혈에 대한 실험실 시험을 위해 환자가 배설물 시료를 발송해야 하는 현재의 시험 방법에 기인할 수 있다. 환자는 이를 불편하게 느끼고, 활용(uptake)은 최근의 모니터링을 통해 55%에서 예상된 것보다 낮은 것으로 확인되었다. 대안적인 최근에 소규모실험된(piloted) S상결장경검사 스크리닝 프로그램은 훨씬 더 낮은 활용을 확인하였다.

추가의 문제점은, 배설물에서 혈액이 검출되더라도, 환자가 결장암을 갖고 있다는 것이 불확실하다는 점이다. 따라서, 결장경검사라고 하는 추가의 침습적 시험이 필요하다. 결장경검사 조사는 장천공의 합병증과 같은 위험 없이는 존재하지 않는다. 전형적으로, 이러한 결장경검사 시험은, 제2 시험을 가진 10명의 모든 환자 중 약 1명이 실제로 암을 갖고 있으며, 나머지(90%)는 이들이 비용이 많이 드는 시술(위험을 가지며, 대기 시간의 스트레스를 포함하여 상당한 시간을 소모하고, 수술 전문 기술을 필요로 함)을 받아 암을 갖고 있지 않음을 확인했다는 것을 보여준다. 따라서, 현재의 스크리닝 방법은 침습적이며, 처음에 암에 대해 낮은 특이성을 갖고, 광범위한 환자 수용성 또는 활용을 갖지 않는다. 이들 인자는 진전된 기 및 응급 사례 진료협력의 수를 늘리고 있다.

이와 같이, 창자암에 대한 대안적인 비-침습적인 허용 가능한 스크리닝 방법을 개발하는 것이 절실이 요망되고 있다. 본원에 상술된 발명은, 초기 환자 분류를 돕고 지속적인 치료 경로를 결정할 것이며, 그러는 한편 더 조기의 검출을 또한 허용하는, 신속한 진단 시험을 생성하기 위한 주된 경로이다. 내시경 시술 필요성에서 가능한 감소, 및 따라서 2차 치유 진료협력에 대한 필요성 없이 진단까지 보다 신속한 접근으로 인해 보건 당국 및/또는 환자에게 상당한 비용 절감이 존재한다. 본 발명은 또한, 치료 후 창자암의 조기 재발을 검출하여 화학요법에 대한 보다 조기의 접근을 허용하는 수단을 나타낼 수 있다. 혈액 시험은 또한, 직장암에 대한 업프론트(upfront) 병용 화학/방사선요법에 대해 '완전한 반응'을 경험한 환자를 정의할 수 있고, 이러한 환자는 근치 수술(radical surgery)을 모면할 수 있을 것이다. 이는 이러한 방식으로 치료받은 5명의 환자 중 1명일 수 있다.

본 발명의 제1 양태에 따르면, 대상체에서 결장직장암의 존재의 지표(indication)를 결정하는 방법이 존재하며, 상기 방법은:

- 대상체로부터 수득된 혈액 또는 혈액 유도체 시료 상에서 레이저 분광법을 수행하여, 적어도 하나의 출력 스펙트럼(output spectrum)을 수득하는 단계;

- 상기 출력 스펙트럼을, 복수의 공지된 출력 스펙트럼을 포함하는 대조군 데이터세트와 비교하는 단계로서, 여기서, 복수의 공지된 출력 스펙트럼은 결장직장암을 갖는 복수의 제1 대상체 및 결장직장암을 갖지 않는 복수의 제2 대상체의 혈액 또는 혈액 유도체 시료로부터 유래된 것인, 단계; 및

- 상기 비교로부터, 상기 대상체가 결장직장암의 존재의 지표를 갖고 있는지의 여부를 결정하는 단계

를 포함한다.

대상체가 결장직장암을 갖고 있는지의 결정은 예를 들어, 출력 스펙트럼과 대조군 데이터세트에서의 차이일 수 있거나, 출력 스펙트럼과 대조군 데이터세트 사이에서의 매치(match)일 수 있다. 상기 방법은 결장직장암의 존재 또는 부재의 지표를 출력한다. 상기 출력은 또한, 의료진에 의한 추가의 조사가 필요한지의 여부도 가리킬 수 있다.

분광법은 시료의 화학적 지문을 생성하고, 따라서 산란된 방사선 강도를 파수(산란된 광의 에너지에서 시프트를 보여주는 데 사용되는 에너지 규모)의 함수로서 측정함으로써 다른 것들과 비교한 경우 혈청 시료에서의 독특한 특징을 식별할 수 있다.

본 발명은 결장직장암을 나타내는 환자로 인해 존재하는 기여도(contribution)를 대상체의 혈액 내에서 식별할 수 있게 한다. 이는, 혈액에 대한 배설물의 실험실 시험, 그 후에 존재한다면 뒤이어 결장경검사를 수행하여, 혈액의 존재가 결장직장암을 가리키는지의 여부를 결정하는 데 대한 기존의 요건이, 많은 대상체에게 더 이상 필요하지 않거나 사실상 진단에 대한 최상의 경로일 수 있음을 의미한다. 결장직장암의 검출 또는 진행은 비교적 단순한 시험을 통해 결정될 수 있다. 이러한 시험은 환자의 혈액 시료로부터 혈청을 시험하는 것을 기초로 하며, 따라서, 신속하고 상대적으로 비-침습적이다. 훨씬 더 조기에서의 검출이 잠재적으로 이루어질 수 있고, 민감성/특이성에서의 향상을 통해, 추적 치료(follow up treatment)(예를 들어 결장절개술 및 화학요법까지 진행되는 결장경검사)는 보다 효과적으로 표적화될 것이며, 따라서, 기대 수명을 증가시키고 비용 부담을 상당히 감소시킬 것이다. 이에, 결장직장암 진단력(diagnostic capability)은 높은 민감성 및 특이성으로 개발되어 왔다. 더욱이, 암의 진행 및 치료의 잠재적인 효과는 원래의 암-지시 스펙트럼 또는 대상체로부터 취한 스펙트럼에 대한 대상체의 지속적인 비교를 통해 모니터링될 수 있다.

레이저 분광법 기술은 바람직하게는 라만 분광법인데, 이 분광법이 비-파괴적이기 때문이고, 물이 성공적인 분석까지 최소의 간섭을 이루기 때문에 대체로 액체 시료에 적용될 수 있다.

혈액 시료는 임의의 보편적으로 공지된 혈액 추출 방법에 의해 환자로부터 수득될 수 있다. 혈액은 레이저 분광법을 받을 수 있거나, 대안적으로 혈액은 분리될 수 있다. 따라서, 분광법은 혈청 또는 혈장과 같은 혈액 유도체 상에서 수행될 수 있다. 이들 혈액 유도체 또는 구성성분은 공지된 기술에 의해 혈액으로부터 분리될 수 있다. 혈청은 증가된 민감성에 의해 바람직하다.

출력 스펙트럼은 바람직하게는, 하나 이상의 파수 또는 하나 이상의 파수 범위에 걸쳐 기록된다. 동일한 파수에서 피크 강도의 증가나 감소 또는 파수 사이에서 피크 강도의 위치의 시프트 및/또는 혈액 또는 혈액 유도체 시료와 대조군 데이터세트 사이에서 수득된 피크 곡선-형상(line-shape)에서의 변이(variation)는 결장직장암을 앓고 있는 대상체를 가리킬 수 있다. 주된 변화는 암 및 비-암 대조군으로부터 취해진 스펙트럼과 비교된다. 피크 곡선-형상은 플롯화된 스펙트럼의 형상을 의미하고, 예를 들어 피크 전 또는 후의 곡선의 기울기, 또는 변화하는 조성으로 인한 부가적인 피크 구성성분의 출현과 관련이 있을 수 있다.

라만 분광법에서, 스펙트럼의 재현성은 또한, 이용되는 시료화 프로토콜 및 분석 유형을 받는다. 본원에서 상술되는 분석의 독특한 조합, 대조군의 사용 및 시료화 방법은 높은 민감성 및 특이성을 갖는 결장직장암 진단력을 드러내었다. 상술된 본 발명은 건조 시료화 공정과 액체 시료화 공정 둘 모두, 및 또한 고 처리량 분석에 대한 잠재성을 기재하고 있다.

대조군 데이터세트는 결장직장암을 갖는 제1 대상체 및 결장직장암을 갖지 않는 제2 대상체로부터의 스펙트럼을 포함한다. 비교는 바람직하게는, 결장직장암을 갖는 제1 대상체 및 결장직장암을 갖지 않는 제2 대상체의 라이브러리에 대해 이루어진다.

복수의 대상체 스펙트럼은 바람직하게는, 비교에 사용하기 위해 레이저 분광법에 의해 수득된다. 적합한 수는 예를 들어 5개 스펙트럼일 수 있다.

대상체로부터 수득된 혈액 또는 혈액 유도체 시료는 바람직하게는 액체 형태이다. 이는 부가적인 건조 과정을 최소화한다. 혈액 또는 혈액 유도체 시료는 바람직하게는 신선하다.

액체 형태 방법은 제1 액체 시료 상에서 분광법을 수행하는 단계를 수반하고, 여기서, 대상체로부터의 혈액 또는 혈액 유도체 시료는 시료 홀더 내의 웰에서 제공된다. 상기 웰은 금속벽에 의해 한정(define)될 수 있으며, 여기서, 상기 금속은 스테인리스강 또는 알루미늄일 수 있다. 유리하게는, 시료를 담기 위한 금속 웰의 사용은 시료의 스펙트럼 판독을 취할 때 임의의 간섭을 최소화하며, 이로써 민감성 및 재현성을 향상시키고, 라만 분석을 위한 실행 가능한(viable) 시료 홀더를 제공한다는 것이 확인되었다. 상기 웰은 바람직하게는 원형이다. 웰 깊이는 4 mm 내지 8 mm, 보다 더 바람직하게는 5 mm 내지 7 mm, 보다 더 바람직하게는 실질적으로 6 mm일 수 있다. 웰 직경은 바람직하게는 5 mm 내지 9 mm, 보다 더 바람직하게는 6 mm 내지 8 mm, 보다 더 바람직하게는 실질적으로 7 mm이다. 이들 웰 치수를 사용할 때, 시료로부터 스펙트럼 판독의 최소의 마스킹(masking)이 존재하며, 이들 매개변수를 벗어난 치수는 더 큰 교차-시료 변이 및 따라서 감소된 재현성을 보여주는 것으로 확인되었다. 본 발명의 목적은 시료에서 암과 비-암 사이를 정확하게 판별하는 것이고, 따라서 재현성 및 신뢰성이 가장 중요하다.

고 처리량 시료화를 위해, 웰은 바람직하게는 시료 홀더에서 한정되고, 여기서, 상기 시료 홀더에서 한정되는 복수의 웰이 존재한다. 이러한 배열에서, 시료 홀더(및 따라서 함유된 제1 시료)를 냉각시키고 둘 모두의 고정된 온도를 최적으로 유지시키기 위한, 바람직하게는 냉각 플레이트를 포함하는 냉각 배열(cooling arrangement)이 존재할 수 있다.

분광계의 광원은 바람직하게는, 웰의 바닥으로부터 1.1 내지 1.3 mm 위에서, 보다 더 바람직하게는 웰의 바닥으로부터 대략 1.2 mm 위에서 초점이 맞춰진다. 웰의 바닥은, 혈액 또는 혈액 유도체가 웰 내에서 위치할 수 있는 최저점이다. 스펙트럼 판독은 시료 상에서 레이저 초점에 의해 영향을 받으며, 이때 비-최적화된 초점은 백그라운드 시그니처의 마스킹을 초래하고, 이러한 마스킹은 스펙트럼 출력의 신뢰성을 감소시키는 것으로 확인되었다. 유리하게는, 정의된 바와 같은 초점 깊이는, 분석에서 관심 스펙트럼 영역을 고려할 때, 감소된 백그라운드 가변성 및 향상된 판별과 함께 최적 초점을 나타내는 것으로 확인되었다.

시료는 또한, 일단 건조되면 분석될 수 있다. 이러한 방법은 시료를 건조하는 단계를 포함할 수 있다. 건조 단계는 제1 시료를 실온에서, 또는 보조 건조(예를 들어 진공 건조)를 통해 건조하는 단계를 수반할 수 있다. 시료가 시료 홀더 상에서 건조될 수 있는 것이 유리하다. 시료 홀더는 금속성일 수 있고, 바람직하게는 알루미늄으로 형성된다. 시료 홀더는 유리하게는 재사용이 불가능하다.

추가의 바람직한 실시형태에서, 분석되는 시료를 냉각시킨다. 이를 수행함으로써, 스펙트럼 판독에서 더 적은 가변성, 및 따라서 더 양호한 판별이 존재하는 것으로 확인되었다. 보다 추가의 바람직한 실시형태에서, 시료를 4℃ 내지 25℃의 범위 내에서 이들 사이의 모든 0.1℃를 포함한 온도까지 냉각시킨다. 보다 바람직하게는, 상기 시료를 10℃ 내지 20℃의 범위 내에서 이들 사이의 모든 0.1℃를 포함한 온도까지 냉각시킨다. 보다 더 바람직하게는 여전히 상기 시료를 15℃ 내지 20℃의 범위 내의 온도까지 냉각시킨다.

광원은 바람직하게는, 레이저 광원이다. 레이저 분광법은 바람직하게는, 시료를 제1 및 제2의 상이한 파장의 광을 받게 하여, 제1 및 제2 스펙트럼을 수득하고, 여기서, 비교 단계는 비교에서 제1 및 제2 스펙트럼을 사용한다. 이는 결장직장암의 존재의 결정에 대한 교차 검증(cross validation)을 제공한다. 예를 들어, 대상체가 약물을 복용하고 있거나, 관련없는 병을 앓고 있거나 과거에 암을 앓았다면, 이는 수득된 스펙트럼에 대해 의도치 않은 영향을 가질 수 있다. 제1 및 제2 스펙트럼을 수득하기 위해 제1 및 제2의 상이한 파장의 광을 사용하는 것은, 시료로부터 상이한 반응을 촉진하며, 수득된 스펙트럼의 검증을 가능하게 한다. 제1 및 제2 파장의 광은 바람직하게는, 시료에 순차적으로 투여된다.

제1 파장은 가시광의 파장 대역에 있을 수 있고, 제2 파장은 적외선광의 파장 대역에 있을 수 있으며, 여기서, 각각의 파장은 각각 약 532 nm 및 약 785 nm일 수 있다.

출력 스펙트럼은 바람직하게는 610 cm^-1 내지 1718 cm^-1 사이에서 기록된다. 이러한 범위는 재현 가능한 판별을 허용하는 최대한의(fullest) 스펙트럼 출력을 포괄하는 것으로 결정되었다.

해당 또는 각각의 스펙트럼은 바람직하게는, 하나 이상의 스펙트럼과 연관된 노이즈를 감소시키기 위해 비교 단계 전에 가공 단계를 받아, 해당 또는 각각의 가공된 스펙트럼을 제공한다. 가공 단계는 원(raw) 스펙트럼의 처리를 포함하며, 이는 후속적인 비교 단계의 능력을 향상시킨다. 가공 단계는 정규화(normalisation) 및/또는 백그라운드 차감(subtraction) 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 바람직하게는, 다수의 출력 스펙트럼이 수득되고, 각각의 스펙트럼은 바람직하게는 파수 교정된다(corrected).

해당 또는 각각의 가공된 스펙트럼은 바람직하게는 추가로 가공되어, 하나 이상의 차원적으로 감소된 스펙트럼을 제공한다. 그 후에, 해당 또는 각각의 차원적으로 감소된 스펙트럼은 대조군 데이터세트 내의 공지된 출력 스펙트럼/스펙트럼과 비교된다.

제2 혈액 또는 혈액 유도체 시료로부터의 공지된 출력 스펙트럼/스펙트럼은 바람직하게는, 결장직장암을 가리키는 시료와 결장직장암을 가리키지 않는 시료 둘 모두를 포함하는 대조군 스펙트럼의 라이브러리를 포함한다.

이러한 방법은 유리하게는, 대상체에서 결장직장임의 결정 또는 미정(not)의 지표를 출력하는 단계를 추가로 포함한다. 출력은 예를 들어, 대상체에 결장직장암 마커가 존재하며, 결장직장암의 존재의 지표 마커가 존재하지 않고, 선택적으로 진단이 결론적이지 않고, 추가의 조사가 필요하다는 것일 수 있다. 이는 임상적 요구 및 진료협력을 결정하는 것을 돕기 위해 분류 툴을 사용하는 것을 단순하고 용이하게 할 수 있다. 이는 또한, 결장직장암과 관련된 진행/퇴행 및/또는 치료 효능을 보여주기 위해, 대상체로부터의 이전의 스펙트럼 입력(input)을 혼입할 수 있다.

따라서, 본 발명은, 스펙트럼 획득과 분석 둘 모두의 선명하게 적응된 방법을 이용한 환자 혈액의 시료화를 통해 결장직장암의 병기를 진단하는 것과 연관된 정의된 스펙트럼 범위에서 주된 라만 스펙트럼 시그니처의 식별을 가능하게 한다.

본 발명의 제2 양태에 따르면, 대상체에서 결장직장암의 존재의 지표를 결정하는 장치가 존재하며, 상기 장치는 대상체로부터 수득된 혈액 또는 혈액 유도체 시료 상에서 출력 스펙트럼을 생성하기 위한 분광계, 및 상기 출력 스펙트럼을, 결장직장암을 갖는 제1의 복수의 대상체 및 결장직장암을 갖지 않는 제2의 복수의 대상체의 혈액 또는 혈액 유도체 시료로부터 유래된 복수의 공지된 출력 스펙트럼을 포함하는 대조군 데이터세트와 비교하도록 배치된 프로세서를 포함하고, 상기 장치는 대상체가 결장직장암을 갖고 있는지의 여부의 지표를 출력하도록 배열된다.

상기 장치는 바람직하게는, 출력 스펙트럼 및 대조군 데이터세트를 저장하기 위한 데이터 저장 장치를 추가로 포함한다.

분광계는 바람직하게는 라만 분광계이다.

출력 스펙트럼은 바람직하게는, 하나 이상의 파수 또는 하나 이상의 파수 범위에서 취해진다.

바람직하게는 혈액 또는 혈액 유도체 시료를 담기 위한 용기가 추가로 포함되고, 여기서, 용기는 웰을 포함한다. 상기 웰은 금속에 의해 한정될 수 있고, 여기서, 금속은 바람직하게는 스테인리스강이다. 웰 깊이는 4 mm 내지 8 mm, 보다 더 바람직하게는 5 mm 내지 7 mm, 보다 더 바람직하게는 실질적으로 6 mm일 수 있다. 웰 직경은 바람직하게는 5 mm 내지 9 mm, 보다 더 바람직하게는 6 mm 내지 8 mm, 보다 더 바람직하게는 실질적으로 7 mm이다.

웰은 바람직하게는, 시료 홀더 내에서 한정되고, 여기서, 시료 홀더에서 한정된 복수의 웰이 존재한다. 냉각 배열은 바람직하게는, 시료 홀더를 냉각시키기 위해 제공된다. 유리하게는, 냉각은 모델에서 안정한 스펙트럼 판독, 더 적은 가변성, 및 따라서 더 양호한 판별을 제공하는 것으로 확인되었다. 냉각 배열은 바람직하게는, 냉각 플레이트를 포함한다.

분광계는 바람직하게는 적어도 하나의 레이저 광원 및 이상적으로 복수의 레이저 광원을 포함한다. 레이저 광원(들)은 가시광 파장 대역 및/또는 적외선 파장 대역에서 광을 방출하도록 배열될 수 있고, 따라서 전형적으로 상이한 레이저 광원이 상이한 파장에서 방출된다. 이에, 광원은 제1 및 제2 광 이미터(light emitter)를 포함할 수 있다. 레이저 광원은 785 nm 및/또는 532 nm 레이저 광원(들)을 포함할 수 있다.

보다 추가의 바람직한 실시형태에서, 분광계의 광원은 바람직하게는 웰의 바닥으로부터 1.1 내지 1.3 mm 위에서, 보다 더 바람직하게는 웰의 바닥으로부터 대략 1.2 mm 위에서 초점이 맞춰진다. 웰의 바닥은, 혈액 또는 혈액 유도체가 웰 내에서 위치할 수 있는 최저점이다.

본 명세서의 상세한 설명 및 청구항 전체에서, 단어 "포함하다" 및 "함유하다" 및 단어의 변이형, 예를 들어 "포함하는" 및 "포함한다"는, "포함하지만, 이들로 한정되지 않음"을 의미하고, 다른 모이어티, 첨가제, 구성성분, 정수 또는 단계를 배제하지 않는다. 본 명세서의 상세한 설명 및 청구항 전체에서, 단수형은 문맥상 다르게 필요로 하지 않는 한, 복수형을 포괄한다. 특히, 부정 관사가 사용되는 경우, 명세서는 문맥상 다르게 필요로 하지 않는 한, 복수형뿐만 아니라 단수형을 고려하는 것으로 이해된다.

본 명세서에서 인용된 임의의 특허 또는 특허 출원을 포함하는 모든 참조문헌은 원용에 의해 본 명세서에 포함된다. 임의의 참조 문헌이 선행 기술을 이룬다는 것을 인정하는 것은 아니다. 나아가, 임의의 선행 기술은 당업계에서 보편적인 일반 지식의 일부를 이루는 것을 인정하는 것이 아니다.

본 발명의 각각의 양태의 바람직한 특징은 임의의 다른 양태와 연관되어 기재될 수 있다.

본 발명의 다른 특징은 하기 실시예로부터 명백해질 것이다. 일반적으로 말해서, 본 발명은 본 명세서(첨부된 청구항 및 도면을 포함함)에서 개시된 특징 중 임의의 신규 하나 또는 임의의 신규 조합까지 확장된다. 따라서, 본 발명의 특정 양태, 실시형태 또는 실시예와 함께 기재된 특징, 정수, 특색, 화합물 또는 화학적 모이어티는 본원에 기재된 임의의 다른 양태, 실시형태 또는 실시예와 비상용적이지 않는 한, 이에 적용 가능한 것으로 이해된다. 더욱이, 다르게 언급되지 않는 한, 본원에 개시된 임의의 특징은 동일한 또는 유사한 목적의 역할을 하는 대안적인 특징에 의해 대체될 수 있다.

이제, 본 발명의 양태는 첨부된 도면을 참조로 예로만 기재될 것이며, 도면에서:
도 1은 혈액 유도체 혈청의 분석으로부터의 전형적인 출력 스펙트럼의 예시적인 그래프 표현이고, 원 데이터와 예비-가공된 데이터(이러한 경우, 롤링 서클(rolling circle)은 후속적으로 기재될 바와 같이 여과되고 정규화됨) 둘 모두를 보여준다. 데이터 재현성은 제시된 시료화 방법 및 시료 홀더 구축에 의존한다.
도 2는 결장직장암을 앓고 있지 않는 대상체의 정상적인 대조군과 결장직장암을 앓고 있는 대상체 사이의 비교의 그래프 표현이고, 또한 둘 모두에 대한 표준 편차를 보여준다.
도 3은 환자로부터 스펙트럼을 수득할 때 수행되는 가공 단계의 도식적인 순서도 및 그래프 표현이다.
도 4는 본 발명의 예시적인 실시형태와 함께 사용하기 위한 단일 웰의 도식적인 투시도이다.
도 5는 본 발명의 예시적인 실시형태에 사용하기 위한 복수의 웰을 포함하는 시료 홀더의 도식도이다.
도 6은 본 발명의 예시적인 실시형태와 함께 사용하기 위한 시료 홀더 및 냉각 배열의 도식적인 측면도이다.
도 7은 본 발명의 대안적인 예시적인 실시형태에 따른 시료 홀더의 도식적인 평면도이다.
도 8은 스펙트럼 판독에 미치는 웰 물질의 효과를 예시하기 위해 플라스틱 물질 웰 플레이트를 사용할 때의 라만 스펙트럼을 보여준다.
도 9는 혈청 시료의 스펙트럼 반응에 미치는 웰 디자인의 효과를 보여주며, 즉, 웰의 치수는 스펙트럼 반응을 달성하기 위해 맞춰져야 한다.
도 10은 웰 치수의 영향의 주성분 분석(PCA) 그래프를 보여주고, 각각의 웰 디자인 및 시료에 대해 취해진 5개 스펙트럼을 가리킨다.
도 11은 상이한 초점 깊이를 사용한 스펙트럼 판독의 비교를 보여준다.
도 12는 스펙트럼에 미치는 초점 깊이의 영향의 주성분 분석(PCA) 그래프를 보여준다.
도 13은 부가적인 손상(insult), 예컨대 과거 암 진단 또는 다른 병을 나타낸 환자 시료에서 판별을 향상시키기 위해 532 nm 및 785 nm에서 이중 스펙트럼 판독을 이용하는 것을 보여준다.
도 14는 최적 판독을 제공하는 스펙트럼 파수 범위의 효과를 보여준다.
도 15는 스펙트럼의 재현성에 미치는 온도의 효과를 보여준다.
도 16은 드라이 스팟(dry spot) 시료로부터 스펙트럼을 취할 때의 공간적 변량(spatial variance)을 보여준다.

도 1은 동일한 액체 시료로부터 취해진 일련의 스펙트럼 획득의 제시이다. 참조 숫자 2로 식별된 획득의 상위(upper) 세트는 원 데이터와 연관된 다양한 반응을 가리키고(좌측-강도 축), 참조 숫자 4로 표시된 획득의 하위(lower) 세트는 예비-가공 및 정규화 후 스펙트럼을 가리킨다(우측-강도 축).

도 2는 결장직장암을 앓고 있지 않은 대상체의 정상적인 대조군 및 결장직장암을 앓고 있는 대상체로부터의 부분적인 스펙트럼 출력의 그래프 표현이다. 이는 피크 형상, 피크 강도 및 피크 위치의 복잡성, 및 따라서 부분 최소 자승법 판별 분석(PLS-DA; Partial least squares Discriminant Analysis)의 적절한 적용을 사용하여 스펙트럼 및 연관된 코호트의 판별을 혼입하기 위해 모델을 구축하는 적용을 위한 요건을 보여준다. 특히, 이러한 도면은 암 환자와 연관된 스펙트럼과 비교하여 대조군 데이터세트와 연관된 스펙트럼을 나타내는 2개의 실선을 보여준다. 대부분의 파수에서, 선들이 강도 면에서 더 적은 변이와 중첩된다는 것이 명백하다. 그러나, 1500 cm^-1 내지 1720 cm^-1 와 같은 소정의 파수 범위에서, 결장직장암을 가리키는 스펙트럼 출력에서 차이가 존재한다. 그러나, 강도가 매치하는 파수가 또한 결장직장암의 지표의 결정에 사용될 수 있으므로, 610 cm^-1 내지 1720 cm^-1 범위에서 파수의 분석이 유리함을 주지한다.

도 3은 환자가 결장직장암을 갖고 있거나 결장직장암의 진행 또는 퇴행을 보여주는지의 여부를 결정하기 위한 단계의 도식적인 흐름도이다. 흐름도에 따라, 각각의 단계의 그래프 표현이 존재한다.

단계 1은 환자 시료로부터 라만 스펙트럼을 수득하는 단계를 나타낸다. 일례로, 5개의 반복 스펙트럼을 각각의 시료로부터 취한다. 이를 단계 1 하에 플롯화하여, 일련의 스펙트럼 획득을 보여준다. 단계 2에서, 가공 단계를 명세서에서 제목 '데이터 예비-가공' 하에 이후에 보다 상세히 기재된 바와 같이 다수의 스펙트럼 상에서 수행하며, 이러한 예비-가공은 스펙트럼을 비교할 만하게 만들고, 각각의 환자에 대한 5개의 스펙트럼이 유지되지만, 예를 들어 시료화의 효과, 예컨대 변동하는 레이저 파워가 제공됨을 의미한다.

후속적으로, 모든 스펙트럼을 단계 3에서 제시된 바와 같은 진단 모델 내로 공급하고, 여기서, 각각의 스펙트럼은 치수 감소를 가진다. 예시적인 진단 모델에서, 각각의 스펙트럼은 도트(dot)가 된다. 이 단계에서, "트레이닝 세트"는 모델을 형성하는 스펙트럼이고, "시험 세트"는 미공지된 시료이고, 비교는 "시험 세트"와 "트레이닝 세트" 사이에서 수행되고, 여기서, 모델은 미공지된 시료가 어떤 진단 그룹과 가장 유사한지 결정한다. 그래프 표현에서 컨투어 라인(contoured line)은 각각의 진단 그룹을 나타낸다.

단계 4에서, 모델은 출력을 제시하며, 여기서, 진단 결정은 결장직장암을 갖는 시료의 가능성 또는 그렇지 않을 가능성을 가리키는 형태의 출력이다. 예를 들어, '1'의 결과는 암을 가리키고, '2'의 출력은 암이 아님을 가리킬 것이다. 민감성 및 특이성의 값으로부터 제시되어, 모델이 이러한 분석을 얼마나 정확하게 완료하는지 식별한다.

도 4를 참조로, 알루미늄 또는 스테인리스강과 같은 금속을 포함하는 실질적으로 원형 형태의 웰(10)의 예시적인 표현이 존재한다. 웰(10)은 지지체 구조(12) 내로 수용되어, 함께 시료 홀더(14)를 형성할 수 있다. 지지체 구조(12)는 웰(10)의 물질과 상이한 물질을 포함할 수 있고, 예를 들어 플라스틱일 수 있다. 웰 직경은 바람직하게는 대략 7 mm이고, 실질적으로 6 mm의 깊이를 가진다.

도 5를 참조로, 시료 홀더(14)는 그 안에 웰(10) 어레이를 갖는 것으로 제시된다. 웰(10)은 지지체 구조(12)와 함께 통합적으로 형성될 수 있거나, 대안적으로 지지체 구조(12) 내에 장착(mounted)될 수 있다.

도 6을 참조로, 시료 홀더(14)는 유리하게는, 냉각 구조(16)에 인접하게 제공되며, 이러한 냉각 구조(16)는 시료 홀더(14)에 인접하고 히트 싱크(heat sink)(20)와 소통하는 Peltier 플레이트(18)를 포함한다. 그 후에, 히트 싱크(20)는 베이스 플레이트(22)에 의해 지지된다.

이제 도 7을 참조로, 특히 건조 혈액 또는 혈액 유도체 시료의 분석과 함께 사용하기 위한 시료 홀더(14)의 예시적인 실시형태의 평명도 및 측면도가 각각 존재한다. 시료 홀더(14)는 바람직하게는 금속성이고, 예시적인 실시형태에서 3개의 영역(24)을 포함하며, 여기에 혈액 또는 혈액 유도체 시료가 침착되고, 건조되며, 후속적으로 분석된다.

도 8을 참조로, 웰 제조에 사용되는 물질은 스펙트럼 판독에 대폭 영향을 미치는 것으로 제시되었다. 금속 웰과 대조적으로, 다른 도면의 스펙트럼에 제시된 바와 같이, 판독에 플라스틱 물질 웰을 사용한 경우, 어떠한 혈청 시료 스펙트럼도 관찰되지 않으며, 내재적인 변칙(inherent anomaly)에 의해 지배되는 신호는 웰의 플라스틱으로 인한 것이다(시료의 부재 시 관찰된 바와 같음). 이는, 금속 웰의 사용이 라만 분석에 필수적임을 실증한다.

도 9를 참조로, 시료의 스펙트럼 반응에 미치는 웰 디자인의 효과에 신중한 고려를 해야 하며, 즉, 웰의 디자인은, 백그라운드를 능가하여 혈청 스펙트럼 기록을 최대화하는 스펙트럼 기록을 달성하도록 맞춰줘야 하는 것으로 제시된다. 스펙트럼(백그라운드가 차감되고 정규화됨)은, 상이한 웰이 사용될 때 백그라운드 시그니처의 변이를 실증한다. 그 결과는 상이한 크기의 웰을 함유하였을 때, 비-암 대조군(2개의 대조군: Ctrl 1 &2) 대 결장직장암(CRC) 시료에 대한 것이다. D는 웰 직경을 의미하고, H는 웰 높이(즉, 깊이)를 의미한다. 웰 치수를, 6 mm의 깊이 및 7 mm의 직경을 갖는 표준 웰과 비교하였다. 동일한 혈청 시료에 대해 스펙트럼에서 제시된 변이는 상이한 웰 치수의 결과이다. 1200 내지 1400 cm^-1에서의 스펙트럼 기록은, 웰 치수가 청구된 양을 초과할 때, 혈청의 스펙트럼 시그니처의 마스킹을 포함하는 대부분의 변이를 보여준다. 재현성 문제를 고려하여, 스펙트럼은 또한, 각각의 웰에서 반복되었다. 이는 도 10에 제시된 바와 같이 PCA 분석에 의해 확인된다(회색 영역은 상이한 용기에서 측정된 경우 CRC 혈청의 발생, 및 따라서 주성분 분석(PCT) 그래프에 걸쳐 큰 분산을 보여줌을 주지함). 원형은 웰에서 반복적인 측정의 변이 범위를 실증하고, 가장 큰 범위가 5 mm 내지 9 mm 범위의 웰 직경 및 4 mm 내지 8 mm 범위의 웰 깊이를 벗어난 웰 치수였음을, 즉, 이들 치수보다 더 작거나 더 큰 웰이 가장 큰 스펙트럼 변이를 생성함을 가리킨다. 라만 분석의 목적은 암시료와 비-암 사이를 정확하게 판별하는 것이고, 부적절한 웰 디자인은 재현 불가능한 스펙트럼 결과때문에 실행 가능한 진단을 달성하기 어렵게 만든다. CRC 및 Ctrl(1&2)의 표준 웰 반응은 PC2 축 상에서 판별을 제공하고, 이는 임계적으로 정의된 매개변수를 벗어난 다른 웰 치수를 사용한 경우 관찰되지 않았다.

도 11 및 12를 참조로, 표준 웰 크기가 비-최적화된 초점과 함께 사용된 경우, 백그라운드 시그니처가 문제가 된다. 특히, 액체의 표면 상 및 또한 웰의 기부(최저 깊이)에 초점을 맞춘 경우, 시그니처가 가장 영향을 많이 받게 된다. 기부(600, 1200)로부터 멀어진 초점 단계는 1.1 내지 1.3 cm의 최적 초점으로 번역된다. 웰 초점 깊이에 대한 PCA 플롯(도 11)은 동일한 조건 하에 반복된 측정의 가변성을 실증한다. CRC 시료에 대한 600/1200 원형의 중첩은, 초점이 이 영역에서 최적화되고 가변성이 감소됨을 가리키고, 대조군 시료에 대한 최적 조건이 CRC로부터의 판별 및 또한 낮은 가변성을 보여준다. PCA에서 2000 및 3000 단계에 대한 증가된 산란(scatter)은 이들이 실행 가능한 초점 설정이 아님을 보여준다. 웰의 바닥은 큰 가변성을 보여주지 않긴 하지만, 이전이 스펙트럼 플롯 상에서 제시된 바와 같이 백그라운드 구성성분을 받는다.

도 13을 참조로, 원 스펙트럼은, 2-파장 접근법(가시광 및 적외선광)이 상이한 지문 반응을 생성함을 보여준다. 원 데이터의 조사에 의해, 785 nm 시료는 매우 유사한 것으로 보이지만, 532 nm 스펙트럼은 매우 상이한 백그라운드 시그니처를 가지고, 여기서 병의 효과는 명백하고, 따라서, 모델 내로 혼입되어 판별을 향상시킨다. (a) 785 nm 및 (b) 532 nm 레이저를 이용한, 다른 건강 문제가 없는 대조군 환자의 스펙트럼; 과거 암을 가졌으며 (c) 785 nm 및 (d) 532 nm 레이저를 이용한 화학요법(CRT)을 받은 대조군 환자의 스펙트럼; 및 (e) 785 nm 및 (f) 532 nm 레이저를 이용한, 당뇨병을 가진 대조군 환자의 스펙트럼이다.

도 14를 참조로, 출력 스펙트럼은 바람직하게는 610 cm^-1 내지 1718 cm^-1 사이에서 기록된다. 이 범위는 재현 가능한 판별을 허용하는 최대한의 스펙트럼 출력을 포괄하는 것으로 나타났다.

도 15를 참조로, 스펙트럼 가변성(색상 엔벌로프(envelope))이 온도의 함수로서 제시되어 있다. 실온(불안정화됨)은 스펙트럼에서 큰 변이를 생성하고, 이는 모델에 궁극적으로 영향을 미친다. 냉각은 모델에서 안정한 데이터, 더 적은 가변성 및 따라서 더 양호한 판별을 생성한다.

도 16을 참조로, 스펙트럼에서의 변량은 액체 시료에서 명백하지 않은 드라이 스팟 시료의 상이한 영역을 분석할 때 발생할 수 있다. 이미지 내로 구축된 PC 로딩 - 공간적 변량을 나타냄 - 짙은(dark) 영역은 더 낮은 변량의 영역이고, 따라서 재현성에 대해 분석하기에 가장 양호하다. 이미지는 짙은 고리, 즉, 최소 변량 영역, 및 따라서, 재현성을 달성하기 위해 혈청의 드라이 스팟으로부터 시료화할 때 분석을 위해 스펙트럼을 유도하기에 가장 양호한 위치임을 실증한다.

하기 상세한 설명은, 혈청(또는 혈액 또는 다른 혈액 유도체) 시료로부터 데이터를 수득하고, 후속적으로 결장직장암의 존재 또는 진행/퇴행을 결정하는 청구된 방법에 사용될 수 있는 모델의 생성에 대한 결과를 분석하는 예시적인 단계를 기재한다. 진단 출력은 민감성 및 특이성의 측면에서 측정될 것이다. 민감성은 시험에 의해 올바르게 식별된 진양성 결과의 퍼센트이다. 이러한 경우, 암을 갖는 것으로 식별된 암 환자의 수이다. 특이성은 진단 시험에 의해 올바르게 식별된 진음성 사례의 퍼센트이다. 이러한 경우, 대조군 환자로서 올바르게 식별된 대조군 환자의 수이다.

민감성 정의: 진양성의 수와 위음성의 수의 수의 합계로 나눈 진양성의 수이다.

특이성 정의: 진음성의 수와 위양성의 수의 합계로 나눈 진음성의 수이다.

(A) 시료화(데이터 획득)

혈청 수합

시료화 시 환자 특징은 생성된 스펙트럼의 정확도를 정의할 수 있다. 환자는 바람직하게는 시료화-전 4시간 동안 단식하며, 비-흡연자이고, 간 질병을 갖지 않는다. 환자 약물의 상세한 사항을 또한 기록한다. 혈액 시료를 정상적인 표준 작업 시술을 통해 숙련된 사혈 전문 의사에 의해 채혈한다. Vacutainer™ 혈청 분리기 혈액 수합 튜브를 사용하여, 혈액을 수합하였다. 그 후에, 수합 튜브를 제조업체의 최상의 실행 프로토콜에 따라 취급하여, 액체 혈청을 생성하였다. 그 후에, 혈청 시료를 30분 동안 놔두어서, 응고되게 하였다.

이제, 3개의 상이한 스펙트럼 분석 방법이 기재될 것이다.

건조 시료의 라만 분광법(785 nm 레이저)

785 nm 및 532 nm 레이저 광원이 장착된 Renishaw InVia 라만 분광계를 사용하였다. 시료를 알루미늄 호일 기초 시료 홀더 상으로 스팟(spot)하고, 스펙트럼 획득 전에 실온에서 건조하였다. 시료 상으로 785 nm(다이오드) 레이저 빔을 초점화하는 50 x 대물렌즈(Leica)를 사용하여 데이터점을 수합하였다. 그 후에, 시료 스팟(sample spot)을 610 cm^-1 내지 1718 cm^-1의 스펙트럼 영역에서 1초의 노출 시간과 함께 165 내지 175 mW(100%) 파워를 이용하여 조사하였다. 그 후에, 이러한 과정을 시료 점적물에 걸쳐 반복하였으며, 시료 병기 상에서 다른 침착된 점적물까지 확장될 수 있다. 1개 시료 당 10개의 복제물이 바람직하다. 바람직하게는, 이미지 인지를 또한 이용하여, 건조된 시료의 특이적인 영역을 시료화하고 재현성을 증가시킬 수 있다. 레이저를 스팟 모드로 사용하고, 스팟에 걸쳐 10개의 무작위 위치를 선택한다. 본 발명자들은 3개의 스팟을 파이펫팅하고, 이들 중 2 내지 3개를 사용하고, 각각의 스팟에 대해 5개 이하의 스캔을 수행한다.

액체 시료의 라만 분광법(785 nm 레이저)

액체 시료를 다수의 웰을 갖는 스테인리스강 시료 홀더 형태의 용기에 파이펫팅하였다. 그 후에, 상기 용기를 분광계 내로 스테인리스강 냉각 플레이트 상에 놓았다. 10 x 건조 대물 렌즈(Leica)를 사용하여, 785 nm 레이저 광을 웰의 기부로부터 1.2 mm 위로 액체 시료 내로 초점을 맞추었다. 그 후에, 데이터점을 610 cm^-1 내지 1718 cm^-1의 스펙트럼 영역에서 5초의 노출 시간 동안 165 내지 175m W 레이저 파워를 사용하여 취하였다. 그 후에, 이를 30개의 획득에 걸쳐 평균을 내어, 1개의 스펙트럼을 생성하였다. 그 후에, 이러한 과정을 반복하여, 1개 시료 당 5개의 복제물(replicate)을 생성하고, 진단 모델에 사용하여, '시료화' 재현성과 연관된 변량의 정도(degree of variance)를 체크하였다.

액체 시료의 라만 분광법(532 nm 레이저)

액체 시료를, 다수의 웰을 가진 스테인리스강 시료 홀더 형태의 용기 내에 파이펫팅하였다. 그 후에, 상기 용기를 스테인리스강 냉각 플레이트 상으로 분광계 내에 넣었다. 10x 건조 대물 렌즈(Leica)를 사용하여, 532 nm 레이저 광을 웰의 기부로부터 1.2 mm 위로 액체 시료 내로 초점을 맞추었다. 그 후에, 데이터점을 610 cm^-1 내지 1718 cm^-1의 스펙트럼 영역에서 0.6초의 노출 시간 동안 45 내지 55m W 레이저 파워를 사용하여 취하였다. 그 후에, 이를 120개의 스캔에 걸쳐 평균을 내어, 1개의 스펙트럼을 생성하였다. 그 후에, 이러한 과정을 반복하여, 1개 시료 당 5개의 복제물을 생성하고, 진단 모델에 사용하여, '시료화' 재현성과 연관된 변량의 정도를 체크하였다.

(B) 분석

라만 스펙트럼 분석의 설명은 3개 범주로 나누어질 수 있다:

1. 데이터 예비-가공

2. 진단 모델 구축

3. 모델 시험

1. 데이터 예비-가공

획득된 스펙트럼으로부터 백그라운드 형광을 차감시키기에 바람직한 방법으로서 2개의 대안적인 방법이 제시된다. 이들 방법은 대안적인 방법(예컨대 다항 함수를 이용한 단순한 백그라운드 적합화(simple background fitting))보다 양호한 것으로 결정된다. 그 후에, '시료화' 영향(예컨대 변동하는 레이저 파워)의 효과를 최소화함으로써 스펙트럼이 비교될 수 있도록 하기 위해, 2개의 추가 절차를 기재한다. 이러한 과정은 정규화로서 공지되어 있다. 기재된 2개의 정규화 방법은 벡터-정규화 및 피크-최대 정규화이다. 백그라운드 차감을 이용하여, 두 방법 모두는 대안적인 방법보다 양호한 것으로 확인된다.

1.1 데이터 예비-가공 - 유도체 스펙트럼

이전에 기재된 방법을 사용하여 스펙트럼 데이터를 획득하였다. 모든 스펙트럼을 개발된 소프트웨어를 사용하여 파수 교정하였다. 분광계로부터의 원 데이터는, 스캔이 진행되는 각각의 시간이 시스템 상에서의 CCD 검출기로 인해 약간 상이한 x-축을 가진다. 파수 교정은 이것이, 시료 비교를 위해 단일 x 축을 생성함으로써 시료 사이에서 직접적인 비교를 허용하는 것을 허용한다. 그 후에, 스펙트럼을 2차 다항 및 9점 사비즈키-골레이 미분 알고리즘(Savitzky-Golay derivative algorithm)을 사용하여 백그라운드를 차감시켰고, 그 후에 벡터 정규화하였다. 벡터 정규화는, 각각의 스펙트럼 아래 면적을 1과 동일하게 함으로써 시료 사이에서 비교를 허용하는 것을 돕는다. 그 후에, 이는 상이한 시료 사이에서 전반적인 스펙트럼 형상의 비교를 허용하여, 스펙트럼 판별을 지배하는 '시료화' 영향의 효과 없이 조성 변화를 결정한다.

1.2 데이터 예비-가공 - 롤링 서클 필터

스펙트럼 데이터를 이전에 기재된 방법을 사용하여 획득하였다. 모든 스펙트럼을 파수 교정하였다. 그 후에, 특이적으로 선택된, 바람직하게는 150의 반경을 갖는 하이 패스 롤링 서클 필터를 사용하여 스펙트럼에서 백그라운드를 차감시켜, 스펙트럼 데이터로부터의 백그라운드 형광을 차감시켰다. 이러한 유형의 백그라운드는 시료 스펙트럼 사이에서 변화할 수 있고, 판별 절차를 지배할 수 있으며, 따라서 암 판별에 필요한 민감성을 마스킹할 수 있다. 부가적으로, 그 후에, 이들 스펙트럼을 일부 경우 페닐알라닌에 기인한 약 1004 cm^-1에서의 피크로 정규화하였고, 다른 경우에는 진단 모델 성능에 따라 벡터 정규화하였다. 모든 정규화 기술은 스펙트럼을 표준화하는 것을 도와, 이들을 판별 비교에 적합하게 한다. 본 발명자들이 특정 피크(1004 cm^-1)에 대한 비(ratio)에서 보려고 하는 경우, 이러한 유형의 정규화를 사용하였다. 이러한 유형의 정규화는 각각의 스펙트럼에서 1004 cm^-1에서의 피크를 1과 동일하게 만든다. 따라서, 1004 cm^-1에서의 피크와 모든 다른 피크 사이에서의 강도 변이를, 유사하게 가공된 대조군에 대해 보다 쉽게 비교할 수 있으며, 즉, 피크 변화(강도, 폭 및 선형상(lineshape))는 외부의 '시료화' 영향, 예컨대 비-임 관련 시료 변화 및 레이저 분광법 조건보다는 시료에서의 조성 변화에 직접적으로 기인할 수 있다.

2. 진단 모델 구축

예비-가공된 데이터를, 9개의 잠재 변수(latent variable)를 갖는 평균-중심 데이터를 사용하여 PLS-DA(부분 최소 자승법 판별 분석) 내로 공급하여, 진단 모델을 생성한다. 그 후에, 이러한 모델을 베네시안(venetian)-블라인드 교차 검증을 사용하여 검증하여, 모델 트레이닝 데이터세트를 생성한다. 잠재 변수는 암을 가리키는 스펙트럼의 단리된 구성성분인 것으로 여겨진다. 이들은 모델 내에서 생성된다. 그 후에, 이러한 모델을 베네시안-블라인드 교차 검증을 사용하여 교차-검증하여, 모델 트레이닝 데이터세트를 생성한다. 교차 검증은 모델에 대한 내부 검증으로서 작용하며, 따라서, 모델은 시험의 민감성 및 특이성의 과다-예측을 제공하지 않는다. 진단 모델을 트레이닝하는 데 사용된 데이터세트를 검증 동안 이븐(even) 그룹으로 분할한다. 그 후에, 모델을 다시-만들어서, 일부 그룹을 누락시킨다. 그 후에, '누락된' 그룹을 '시험' 데이터세트로서 사용하여, 전체 데이터세트 없이 상기 모델이 결과를 얼마나 잘 예측하는지 알아본다. 보고된 민감성 및 특이성은 교차-검증된 모델의 것들이다. 이러한 방법은, 달성할 수 있는 민감성 및 특이성으로 인해 다른 옵션을 능가하여 바람직하다.

3. 결장직장암의 검출을 위한 모델 시험 - 건조 혈청 시료

라만 스펙트럼을 상기 기재된 바와 같이 건조한 3 μl 점적물로부터 취하였다. 결장직장암을 갖는 것으로 확인된 환자(n=30) 및 스펙트럼, 및 명확한 결장경검사를 갖고 암의 다른 징후가 없는 연령 매칭된 대조군(n=30)을 수합하였다. 교차 검증된 진단 모델을 벡터 정규화시킨 유도체 스펙트럼은, 98%의, 암을 검출하는 민감성, 및 92%의 특이성을 생성하였다. 벡터 정규화와 함께 롤링 서클 필터 기초 예비-가공 방법을 사용하여, 92% 및 91%의 민감성 및 특이성을 달성하였다. 롤링 서클 필터 기초 예비-가공 및 1004 cm^-1 정규화를 사용하여, 각각 95% 및 92%의 민감성 및 특이성을 달성하였다.

결장직장암의 검출을 위한 라만 분광법 - 액체 혈청 시료

라만 스펙트럼을 암 환자 및 대조군 환자(n=60)로부터 785 nm 레이저원을 사용하여 수합하였다. 그 후에, 스펙트럼을 롤링 서클 필터 및 피크 정규화를 사용하여 예비-가공하였다. PLS-DA 진단 모델을 구축한 후, 85% 및 81%의 민감성 및 특이성을 달성하였다. 이러한 데이터세트를 532 nm 레이저를 이용하여 반복하였고, 74% 및 78% 민감성 및 특이성 결과를 동일한 분석 루틴을 사용하여 달성하였다. 각각의 시료의 분석을 위해 2개의 레이저를 사용하는 것을 또한 고려하였으며, 이는 보다 강력한(robust) 진단을 가능하게 한다. 상이한 파장의 사용은 시료로부터 상이한 반응을 촉진하고, 예를 들어 대상체가 복용하는 약물의 효과에 의해 영향을 받을 수 있는 반응의 구분을 달성할 수 있다.

따라서, 제안된 발명은 결장직장암의 발병 또는 진행/퇴행, 및 이것이 어떻게 달성되는지에 대한 최상의 경로를 결정하기 위한 강력한 판별 툴을 제공하는 것으로 제시될 수 있다. 시험 결과는 추가의 해석을 필요로 하지 않는 사용자에게 출력될 수 있고, 환자에서 결장직장암의 존재의 지표 마커, 환자에서 결장직장암 마커의 양성 지표가 없음을 제공할 수 있거나, 비-결론적인 결과를 가리킬 수 있고, 이는 추가의 조사가 필요함을 의미한다(예를 들어 이러한 추가의 조사는, 환자 약물이 시험에 영향을 미치는지, 또는 환자가 적절한 예비-시험 조건을 따랐는지의 여부를 체크하는 단계를 포함할 수 있음).

결장직장암 판별 소프트웨어가 증가하는 수의 임상 시료의 분석 시 업데이트될 수 있으며, 따라서 모델은 자가-습득하게 됨을 알게 될 것이다.

본 발명의 양태는 예로서만 기재되었고, 당업자는 첨부된 청구항에 의해 부여되는 보호 범위로부터 벗어나지 않으면서 변형 및 변이가 이루어질 수 있음을 알게 될 것이다.

Claims (31)

1. 대상체에서 결장직장암의 존재의 지표(indication)를 결정하는 장치로서,
   상기 장치는 대상체로부터 수득된 혈액 또는 혈액 유도체 시료 상에서 출력 스펙트럼(output spectrum)을 생성하기 위한 분광계, 및 상기 출력 스펙트럼을, 결장직장암을 갖는 제1의 복수의 대상체 및 결장직장암을 갖지 않는 제2의 복수의 대상체의 혈액 또는 혈액 유도체 시료로부터 유래된 복수의 공지된 출력 스펙트럼을 포함하는 대조군 데이터세트와 비교하도록 배치된 프로세서를 포함하고, 상기 장치는 대상체가 결장직장암을 갖고 있는지의 여부의 지표를 출력하도록 배열되는, 장치.
2. 제1항에 있어서, 출력 스펙트럼 및 대조군 데이터세트를 저장하기 위한 데이터 저장 장치를 추가로 포함하는, 장치.
3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 분광계가 라만(Raman) 분광계인, 장치.
4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 출력 스펙트럼을 하나 이상의 파수 또는 하나 이상의 파수 범위에서 취하는, 장치.
5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 혈액 또는 혈액 유도체 시료를 담기 위한 용기를 추가로 포함하고, 상기 용기는 웰을 포함하는, 장치.
6. 제5항에 있어서, 웰 깊이가 4 mm 내지 8 mm, 보다 더 바람직하게는 5 mm 내지 7 mm, 보다 더 바람직하게는 실질적으로 6 mm인, 장치.
7. 제5항 또는 제6항에 있어서, 웰이 실질적으로 원형이고, 5 mm 내지 9 mm, 보다 더 바람직하게는 6 mm 내지 8 mm, 보다 더 바람직하게는 실질적으로 7 mm의 웰 직경을 포함하는, 장치.
8. 제5항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 웰이 시료 홀더 내에서 한정되고(defined), 시료 홀더 내에서 한정된 복수의 웰이 존재하는, 장치.
9. 제8항에 있어서, 시료 홀더를 냉각시키도록 제공된 냉각 배열(cooling arrangement)을 포함하는, 장치.
10. 제9항에 있어서, 냉각 배열이 냉각 플레이트를 포함하는, 장치.
11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 분광계가 적어도 하나의 레이저 광원을 포함하는, 장치.
12. 제11항에 있어서, 상기 적어도 하나의 레이저 광원이 제1 및 제2 파장의 광을 방출하도록 배열되고, 제1 파장의 광은 제2 파장의 광과 상이한 것인, 장치.
13. 제12항에 있어서, 상기 적어도 하나의 레이저 광원이 가시광 파장 대역 및 적외선 파장 대역에서 광을 방출하도록 배열된, 장치.
14. 제11항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 분광계가 레이저 광원을 포함하고, 상기 레이저 광원은 785 nm 및/또는 532 nm 레이저 광원을 포함하는, 장치.
15. 제5항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 웰이 금속인, 장치.
16. 대상체에서 결장직장암의 존재의 지표를 결정하는 방법으로서, 상기 방법은:
    - 대상체로부터 수득된 혈액 또는 혈액 유도체 시료 상에서 레이저 분광법을 수행하여, 적어도 하나의 출력 스펙트럼을 수득하는 단계;
    - 상기 출력 스펙트럼을, 복수의 공지된 출력 스펙트럼을 포함하는 대조군 데이터세트와 비교하는 단계로서, 여기서, 복수의 공지된 출력 스펙트럼은 결장직장암을 갖는 복수의 제1 대상체 및 결장직장암을 갖지 않는 복수의 제2 대상체의 혈액 또는 혈액 유도체 시료로부터 유래된 것인, 단계; 및
    - 상기 비교로부터, 상기 대상체가 결장직장암의 존재의 지표를 갖고 있는지의 여부를 결정하는 단계
    를 포함하는, 방법.
17. 제16항에 있어서, 시료가 혈청 형태의 혈액 유도체를 포함하는, 방법.
18. 제16항 또는 제17항에 있어서, 출력 스펙트럼이 하나 이상의 파수, 또는 하나 이상의 파수 범위에 걸쳐 기록되는, 방법.
19. 제16항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 복수의 대상체 스펙트럼을 비교에 사용하기 위해 레이저 분광법에 의해 수득하는, 방법.
20. 제16항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 레이저 분광법을 액체 형태의 혈액 또는 혈액 유도체 시료를 이용하여 수행하는, 방법.
21. 제16항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 시료를 시료화 전 및/또는 후에 냉각시켜, 고정된 온도를 유지시키는, 방법.
22. 제16항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 분광계의 광원을 웰의 바닥으로부터 1.1 내지 1.3 mm 위에서, 보다 더 바람직하게는 웰의 바닥으로부터 대략 1.2 mm 위에서 초점을 맞추는, 방법.
23. 제16항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 출력 스펙트럼이 610 cm^-1 내지 1718 cm^-1에서 기록되는, 방법.
24. 제16항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 해당 또는 각각의 스펙트럼이 하나 이상의 스펙트럼과 연관된 노이즈를 감소시키기 위해 비교 단계 전에 가공 단계를 받아, 하나 이상의 가공된 스펙트럼을 제공하는, 방법.
25. 제24항에 있어서, 가공 단계가 정규화(normalisation) 및/또는 백그라운드 차감(subtraction) 중 하나 이상을 포함하는, 방법.
26. 제16항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 다수의 출력 스펙트럼이 수득되고, 다수의 스펙트럼의 각각의 출력 스펙트럼은 파수 교정되는(corrected), 방법.
27. 제16항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 해당 또는 각각의 가공된 스펙트럼을 추가로 가공하여, 하나 이상의 차원적으로 감소된 스펙트럼을 제공하는, 방법.
28. 제16항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 레이저 분광법이 시료를 제1 및 제2의 상이한 파장의 레이저 광을 받게 하여, 제1 및 제2 스펙트럼을 수득하고, 비교 단계는 비교에서 제1 및 제2 스펙트럼을 사용하는, 방법.
29. 제28항에 있어서, 제1 파장이 가시광의 파장 대역에 존재하고, 제2 파장이 적외선의 파장 대역에 존재하는, 방법.
30. 제28항 또는 제29항에 있어서, 제1 파장이 532 nm이고, 제2 파장이 785 nm인, 방법.
31. 제16항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체에서 결장직장암의 결정 또는 미정(not) 및/또는 진행/퇴행의 지표를 출력하는 단계를 포함하는, 방법.

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