KR20190122163A - Taz의 pdx1 활성 조절을 통한 혈당 조절 용도 - Google Patents

Taz의 pdx1 활성 조절을 통한 혈당 조절 용도 Download PDF

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Abstract

TAZ를 이용하여 췌장조직에서의 인슐린 생성 조절을 통한 혈당 조절용 조성물에 관한 것이다. 일 양상에 따르면, TAZ 유전자 또는 단백질의 발현 또는 활성을 조절함으로써 인슐린 생성 조절을 통해 혈당을 조절할 수 있는 효과가 있으므로, 대사성 질환, 특히 췌장 기능 장애에 기인하는 대사성 질환의 예방, 개선, 또는 치료에 사용할 수 있다.

Description

TAZ의 PDX1 활성 조절을 통한 혈당 조절 용도{Use of TAZ to control blood sugar by controlling PDX1 activity}
TAZ를 이용한 췌장조직에서의 인슐린 생성 조절을 통한 혈당 조절용 조성물에 관한 것이다.
TAZ (Transcriptional coactivator with PDZ-binding motif)는 14-3-3과 상호작용하는 세포 단백질로 동정된 바 있으며, TAZ는 또한 퍼옥시좀 증식자-활성화된 수용체-γ (PPARγ), 지방세포-특이적인 전사 인자와 상호작용을 수행하여, PPARγ 유도된 지방세포 분화의 저해를 야기한다. 또한, 중간엽 줄기세포에서 TAZ의 발현 수준은 조골세포 또는 지방세포로 세포 운명 결정에 대하여 중요한 역할을 하므로, TAZ는 중간엽 줄기세포 분화의 전사 조절자로 작용하는 것으로 인식되고 있다. 이 뿐만 아니라, TAZ는 갑상선 (thyroid) 전사 인자-1 (TTF-1/Nkx2.1), T-박스 전사 인자 (Tbx5), 페어드 박스 유전자 3 (Pax3), Gli-Similar 3 (Glis3) 및 Smad2/3-4 복합체를 포함하는 몇몇의 다른 전사인자와 상호작용을 하고, 그들의 전사 활성 및 세포 기능을 조절한다.
따라서, TAZ는 신장 및 폐 형성 (Park, K. S., 등(2004) J Biol Chem 279, 17384-17390;Kang, H. S., 등(2009) Mol Cell Biol 29, 2556-2569; Makita, R., 등 (2008) Am J Physiol Renal Physiol 294, F542-5535, 8, 12), 심장 및 팔다리 발생 (Murakami, M., Nakagawa, M., Olson, E. N., and Nakagawa, O. (2005) Proc Natl Acad Sci U S A 102, 18034-18039), 갑상선 분화 (Di Palma, T., 등 (2009) Exp Cell Res 315, 162-175), 배아 줄기세포 자가-재생 (Varelas, X., 등 (2008) Nat Cell Biol 10, 837-848), 및 내피-중간엽 전이 및 암세포의 침습 (Chan, S. W., 등 (2008) Cancer Res 68, 2592-2598;Lei, Q. Y., 등 (2008) Mol Cell Biol 28, 2426-2436)과 같은 생물학적 기능에 관여하는 것으로 알려져 있으나, 혈당 조절과의 연관성에 대해서는 아직 보고된 바가 없는 실정이다.
일 양상은 췌장에서 TAZ 유전자 또는 단백질의 발현 또는 활성을 조절하여 췌장에서의 인슐린 생성 및 분비를 조절하는 제제를 포함하는 혈당 조절용 조성물을 제공하는 것이다.
다른 양상은 상기 제제를 포함하는 췌장 기능 장애로부터 기인하는 대사성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
또 다른 양상은 상기 제제를 포함하는 췌장 기능 장애로부터 기인하는 대사성 질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공하는 것이다.
일 양상은 TAZ 유전자 또는 단백질의 발현 또는 활성을 조절하는 제제를 포함하는 혈당 조절용 조성물을 제공한다. 구체적으로, 상기 조성물은 췌장에서 TAZ 유전자 또는 단백질의 발현 또는 활성을 조절하여 췌장에서의 인슐린 생성 및 분비를 조절하는 제제를 포함하는 혈당 조절용 조성물을 의미할 수 있다.
본 명세서에서 용어, "TAZ(Transcriptional coactivator with PDZ-binding motif)"는 14-3-3 단백질과 상호작용하는 세포 단백질로 동정된 바 있으며, WWTR1으로도 명명될 수 있다. TAZ는 또한 퍼옥시좀 증식자-활성화된 수용체-γ(PPARγ), 지방세포-특이적인 전사 인자와 상호작용을 수행하여, PPARγ-유도된 지방세포 분화의 저해를 야기하는 것으로 알려져 있다. 상기 TAZ는 단백질을 코딩하는 유전자의 서열은, 사람의 경우 GeneBank Accession No. NM_000116.5, NM_001303465.1, NM_181311.3, NM_181312.3, 또는 NM_181313.3, 마우스의 경우, NM_001173547.2, NM_001242615.2, NM_001242616.2, NM_001290738.1, 또는 NM_181516.6로부터 수득되는 서열일 수 있다. 상기 TAZ 단백질의 아미노산 서열은 GeneBank Accession No. NP_000107.1, NP_001290394.1, NP_851828.1, NP_851829.1, 또는 NP_851830.1로부터 수득되는 아미노산 서열일 수 있다. 상기 핵산 서열 또는 아미노산 서열과 일부 핵산 서열 또는 아미노산 서열이 일치하지 않더라도, 생물학적으로 동등한 활성을 갖는 핵산 서열 또는 아미노산 서열은 TAZ의 mRNA 또는 단백질로 간주될 수 있다.
상기 TAZ 유전자 또는 단백질은 TAZ의 C-말단 도메인의 유전자 또는 단백질인 것일 수 있다. 상기 TAZ의 C-말단 도메인은 TAZ 단백질의 아미노산 서열의 N-말단으로부터 예를 들어, 80번째, 예를 들어, 90번째, 예를 들어, 100번째, 예를 들어, 110번째, 예를 들어, 120번째, 예를 들어, 130번째, 예를 들어, 140번째, 예를 들어, 150번째, 예를 들어, 160번째, 예를 들어, 170번째, 예를 들어, 180번째, 예를 들어, 190번째, 예를 들어, 200번째 아미노산부터 C-말단까지의 영역일 수 있으나, 다른 단백질과 상호작용할 수 있는 TAZ 단백질의 도메인이라면 이에 제한되지 않는다. 구체적으로, 사람의 경우 상기 TAZ의 C-말단 도메인은 N-말단으로부터 124번째부터 C-말단까지의 영역일 수 있다. 또한, 마우스의 경우 상기 TAZ C-말단 도메인은 N-말단으로부터 164번째부터 C-말단까지의 영역일 수 있다.
상기 조성물은 췌장의 α-세포 및 β-세포의 활성 또는 세포량(cell mass)을 조절하는 것일 수 있다. 또한, 상기 조성물은 췌장세포에서 생성 및 분비되는 인슐린 및 글루카곤의 양을 조절하는 것일 수 있다.
상기 조성물은 글루코스 내성(glucose tolerance) 또는 인슐린 감수성(insulin resistance)을 조절하는 것일 수 있다. 상기 용어 "글루코스 내성"은 생체 내 글루코스 처리능력을 의미하는 것으로, 글루코스가 대사되는 속도를 측정하는 것으로, 많은 양의 글루코스를 복용한 후 시간 간격으로 혈당치를 측정하여 계산될 수 있으며, 용어 "당내성"또는 "내당능"과 혼용될 수 있다. 상기 용어 "인슐린 감수성"은 외래성 인슐린에 대한 생체의 감수성을 의미하는 것으로, 일정량의 인슐린을 투여하였을 때의 혈당 저하도로 계산될 수 있으며, 용어 "인슐린 저항성"또는 "인슐린 내성"과 혼용될 수 있다.
상기 조성물은 PDX1(pancreatic and duodenal homeobox 1)의 DNA 결합 또는 전사 활성을 조절하는 것일 수 있다. 일 실시예에 따르면, TAZ 과발현에 의해 PDX1의 DNA-결합 활성이 유의적으로 증가됨을 확인하였다.
일 구체예에 있어서, 상기 조성물은 TAZ 유전자 또는 단백질의 발현 또는 활성을 증가시켜 췌장에서의 인슐린 생성 분비를 촉진함으로써 혈당을 감소시키는 것일 수 있다. 구체적으로, 상기 조성물은 TAZ 유전자 또는 단백질의 발현 또는 활성을 증가시켜 혈당을 정상 수치 범위로 조절할 수 있다. 상기 혈당 정상 수치는 8시간 동안 금식한 후 채혈하여 혈당을 측정하는 경우를 기준으로, 예를 들어, 130 mg/dL 이하, 예를 들어, 125 mg/dL 이하, 예를 들어, 120 mg/dL 이하, 예를 들어, 115 mg/dL 이하, 예를 들어, 110 mg/dL 이하, 예를 들어, 105 mg/dL 이하, 예를 들어, 100 mg/dL 이하일 수 있고, 예를 들어, 70 mg/dL 이상, 예를 들어, 75 mg/dL 이상, 예를 들어, 80 mg/dL 이상, 예를 들어, 85 mg/dL, 예를 들어, 90 mg/dL 이상, 예를 들어, 95 mg/dL 이상일 수 있고, 이들을 조합한 범위일 수 있다.
상기 TAZ 유전자 또는 단백질의 발현 또는 활성을 증가시키는 방법으로는 유전자 카피 수의 증가, 고유 프로모터보다 강력한 프로모터로의 교체 및 돌연변이에 의한 TAZ 발현의 증가에 의한 것이 포함된다. 상기 유전자 카피 수의 증가는 외래 유전자의 도입에 의한 카피 수의 증가뿐만 아니라, 내재적 유전자의 증폭에 의한 것도 포함될 수 있다. 상기 유전자 프로모터의 교체는 하류에 연결된 유전자를 증가 발현시키는 특성을 가진 외래 프로모터의 도입은 물론 내재 프로모터로의 교체에 의한 것도 포함될 수 있다. 이러한 내재적 유전자 또는 단백질의 증폭은 당업계에 알려진 방법에 의하여 용이하게 이루어질 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 조성물은 TAZ 유전자 또는 단백질의 발현 또는 활성을 억제하여 혈당을 정상적인 수준 보다 높은 수준으로 증가시킬 수 있다. 상기 TAZ 유전자 또는 단백질의 발현 또는 활성을 억제하는 방법으로는 상기 TAZ 단백질의 발현 또는 활성 억제제는 TAZ 단백질의 기능을 저해 또는 방해하는 것일 수 있다. 이와 같은 저해 또는 방해는 TAZ 유전자의 전사를 방해하거나, 또는 TAZ 유전자의 mRNA의 번역을 저해함으로써 이루어질 수 있다. 또는, TAZ 단백질의 활성 부위에 특이적으로 결합하거나 단백질 구조 변형을 일으킴으로써, TAZ 단백질의 활성을 감소 또는 불활성화시킬 수 있다. 예를 들어, "녹아웃"은 유전자의 결손이 유발된 DNA를 외부에서 도입하여 정상 유전자에 완전 불활성화를 유도하는 것을 의미하며, "녹다운"은 RNAi 등을 이용해서 발현하는 mRNA를 퇴화(degradation)시켜서 유전자 발현량을 줄이는 것을 의미한다.
상기 TAZ 유전자의 발현 또는 활성을 조절하는 제제는 TAZ 인핸서(enhancer)에 결합하는 전사활성화인자(activator), TAZ 사일렌서(siliencer)에 결합하는 억제자(repressor), TAZ mRNA에 상보적으로 결합하는 안티센스 뉴클레오티드, 작은 간섭 RNA(small interfering RNA, siRNA), 짧은 헤어핀 RNA(short hairpin RNA, shRNA) 및 이의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있다.
상기 뉴클레오티드는 올리고뉴클레오티드 및 폴리뉴클레오티드의 빌딩 블록일 수 있고, 본 발명의 목적을 위하여 천연 발생 및 비-천연 발생 뉴클레오티드를 모두 포함할 수 있다. 천연적으로, 뉴클레오티드, 예컨대 DNA 및 RNA 뉴클레오티드는 리보스 당 모이어티, 핵염기 모이어티 및 하나 이상의 포스페이트 기(뉴클레오시드에는 부재함)를 포함할 수 있다. 뉴클레오시드 및 뉴클레오티드는 또한 "단위" 또는 "단량체"와 상호교환적으로 지칭될 수 있다.
상기 "상보적으로 결합"하는 것의 의미는 뉴클레오시드/뉴클레오티드의 왓슨-크릭(Watson-Crick)의 염기 쌍과 관련이 있다. 왓슨-크릭 염기 쌍은 구아닌(G)-시토신(C) 및 아데닌(A)-티민(T)/우라실(U)이다. 올리고뉴클레오티드는 변형된 핵염기를 갖는 뉴클레오시드를 포함할 수 있다. 예를 들어 5-메틸 시토신이 종종 시토신 대신에 사용될 수 있다. 상기 용어 "상보적으로 결합"은 비-변형된 핵염기와 변형된 핵염기 사이의 왓슨-크릭 염기-결합을 포함할 수 있다.
상기 안티센스 뉴클레오티드는 표적 핵산, 특히 표적 핵산 상의 인접 서열에 혼성화함으로써 표적 유전자의 발현을 조절할 수 있는 올리고뉴클레오티드로 정의될 수 있다. 안티센스 올리고뉴클레오티드는 본질적으로 이중가닥이 아니고, 이에 따라 siRNA 또는 shRNA가 아니다.
상기 용어, "작은 간섭 RNA"는 유전자의 활성을 억제하는 RNAi(RNA interference)를 유발시킬 수 있는 RNA를 의미할 수 있다. 상기 작은 간섭 RNA는 TAZ 유전자의 발현을 억제할 수 있는 miRNA, siRNA 등이 될 수 있는데, 상기 작은 간섭 RNA는 TAZ 유전자의 발현 또는 활성을 억제시키기만 하면 어떠한 형태의 것도 가능할 수 있다. 예를 들면, 화학합성 또는 생화학적 합성 또는 생체 내 합성에 의해 수득되는 siRNA, 혹은 약 60 내지 40개 염기 이상의 이중가닥 RNA가 체내에서 분해된 10 내지 30개 염기 이상의 이중가닥 RNA 등을 사용할 수 있다.
상기 TAZ 단백질의 발현 또는 활성을 조절하는 제제는 TAZ 단백질에 특이적으로 결합하는 화합물, 펩티드, 펩티드 미메틱스, 앱타머, 항원-결합 단편, 항체, 천연물, 및 이의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있다.
상기 "앱타머"는 소정의 표적 분자에 대한 결합 활성을 갖는 핵산 분자를 의미할 수 있다. 상기 앱타머는 RNA, DNA, 수식(modified) 핵산 또는 이들의 혼합물일 수 있으며, 직쇄상 또는 환상의 형태일 수 있는데, 대체로, 상기 앱타머를 구성하는 뉴클레오티드의 서열이 짧을수록 화학합성 및 대량 생산이 보다 용이하고, 비용면에서의 장점이 우수하며, 화학수식이 용이하고, 생체 내 안정성이 우수하며, 독성이 낮다고 알려져 있다.
상기 "항체"는 단백질 또는 펩티드 분자의 항원성 부위에 특이적으로 결합할 수 있는 단백질성 분자를 의미할 수 있고, 이러한 항체는, 각 유전자를 통상적인 방법에 따라 발현벡터에 클로닝하여 상기 마커 유전자에 의해 코딩되는 단백질을 얻고, 얻어진 단백질로부터 통상적인 방법을 거쳐 제조될 수 있다. 상기 항체의 형태는 특별히 제한되지 않으며 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체 또는 항원 결합성을 갖는 것이면 그것의 일부도 본 발명의 항체에 포함되고 모든 면역 글로불린 항체가 포함될 수 있을 뿐만 아니라, 인간화 항체 등의 특수 항체를 포함할 수도 있다. 아울러, 상기 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 완전한 형태뿐만 아니라 항체 분자의 기능적인 단편을 포함할 수 있다. 항체 분자의 기능적인 단편이란 적어도 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 의미하며 Fab, F(ab'), F(ab')2 또는 Fv 등이 될 수 있다.
다른 양상은 TAZ 유전자 또는 단백질의 발현 또는 활성을 조절하는 제제를 포함하는 대사성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
상기 TAZ, TAZ 유전자 또는 단백질의 발현 또는 활성을 조절하는 제제 등에 대해서는 상기한 바와 같다.
본 명세서에서 용어, "대사성 질환(metabolic disease)"은 생체 내 물질대사 장애에 의해 발생하는 질환을 말한다. 구체적으로, 상기 대사성 질환은 췌장 기능 장애로부터 기인한 것일 수 있다. 예를 들어, 상기 대사성 질환은 당뇨병, 고혈당증(hyperglycemia), 비만, 비알코올성 지방간, 공복혈당장애(impaired　fasting　glucose), 내당능장애(impaired　glucose　tolerance), 고지혈증(hyperlipidemia), 단백뇨, 고혈압, 고콜레스테롤혈증, 협심증, 심근경색, 뇌졸중, 심부전, 고인슐린혈증(hyperinsulinemia), 지연성 저혈당(prolonged hypoglycemia), 반응성 저혈당(reactive hypoglycemia), 사병성 저혈당(factitious hypoglycemia), 외인성 저혈당(exogenous hypoglycemia), 저혈당 뇌병증(hypoglycemic encephalopathy), 저혈당 혼수(hypoglycemic coma) 및 저혈당 무감지증으로 이루어진 군으로부터 선택된 것일 수 있다. 상기 당뇨병은 췌장에서 인슐린 분비 기능 장애로부터 발병된 제1형 당뇨병일 수 있다.
본 명세서에서 용어, "예방"은 일 양상에 따른 약학적 조성물을 개체에 투여하여 대사성 질환을 억제시키거나 지연시키는 모든 행위를 포함한다. 본 명세서에서 용어, "치료"는 일 양상에 따른 약학적 조성물을 개체에 투여하여 대사성 질환의 증세가 호전되도록 하거나 이롭게 되도록 하는 모든 행위를 의미한다.
상기 약학적 조성물은 혈당 조절 활성, 인슐린 생성 조절, 글루카곤 생성 조절, 또는 대사성 질환의 예방 또는 치료 활성을 갖는 공지의 유효 성분을 더 포함할 수 있다. 상기 유효 성분은 공지의 천연 추출물, 천연물 기반 화합물, 합성 화합물 또는 이들의 조합일 수 있다.
상기 약학적 조성물은 담체, 부형제 또는 희석제를 더 포함할 수 있다. 담체, 부형제, 또는 희석제는 예를 들어, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알기네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로스, 메틸 셀룰로스, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트, 또는 광물유를 포함할 수 있다.
상기 약학적 조성물은 경구 또는 비경구 투여 제형을 갖는 것일 수 있다. 약학적 조성물은 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 또는 멸균 주사용액의 형태로 제형화될 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다.
상기 약학적 조성물에 있어서, 경구 투여를 위한 고형 제제는 정제, 환제, 산제, 과립제, 또는 캡슐제일 수 있다. 상기 고형 제제는 부형제 또는 윤활제를 더 포함할 수 있다. 부형제는 예를 들면, 전분, 칼슘 카르보네이트(calcium carbonate), 수크로스, 락토스, 또는 젤라틴일 수 있다. 또한, 상기 윤활제는 마그네슘 스테아레이트, 또는 탈크일 수 있다. 상기 약학적 조성물에 있어서, 경구를 위한 액상 제제는 현탁제, 내용액제, 유제, 또는 시럽제일 수 있다. 상기 액상 제제는 물, 또는 리퀴드 파라핀을 포함할 수 있다. 상기 액상 제제는 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 또는 보존제를 포함할 수 있다. 상기 약학적 조성물에 있어서, 비경구 투여를 위한 제제는 크림, 로션, 연고, 액제, 패취, 향낭(sachet), 주사제, 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 또는 및 좌제일 수 있다.
상기 약학적 조성물은 상기 TAZ 유전자 또는 단백질의 발현 또는 활성을 조절하는 제제를 유효한 양으로 포함할 수 있다. 상기 유효한 양은 질환의 중증도, 환자의 연령, 체중, 건강, 성별, 환자의 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료 기간, 상기 약학적 조성물과 배합 또는 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 상기 유효한 양은 상기 약학적 조성물 당 약 10 mg 내지 약 10 g, 약 100 mg 내지 약 8 g, 약 250 mg 내지 약 6 g, 약 약 500 mg 내지 약 4 g, 약 500 mg 내지 약 2 g, 또는 약 500 mg 내지 약 1 g일 수 있다. 상기 약학적 조성물은 경구, 경피, 피하, 직장, 정맥내, 동맥내, 복강내, 근육내, 흉골내, 국소, 또는 피내 경로를 통해 통상적인 방식으로 투여될 수 있다. 상기 약학적 조성물의 투여량은 예를 들어, 성인 기준으로 약 0.001 ㎎/kg 내지 약 100 ㎎/kg, 약 0.01 ㎎/kg 내지 약 10 ㎎/kg, 또는 약 0.1 ㎎/kg 내지 약 1 ㎎/kg의 범위 내이고, 1일 1회 내지 6회, 2 일 내지 3일에 1회, 또는 수일 1회 투여될 수 있다.
다른 양상은 TAZ 유전자 또는 단백질의 발현 또는 활성을 조절하는 제제를 포함하는 대사성 질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공한다.
상기 TAZ, TAZ 유전자 또는 단백질의 발현 또는 활성을 조절하는 제제, 대사성 질환 등에 대해서는 상기한 바와 같다.
본 명세서에서, 용어 "개선"은 상기 식품 조성물을 개체에 투여하여 대사성 질환의 증세가 호전되도록 하거나 이롭게 되도록 하는 모든 행위를 포함한다.
상기 식품 조성물은 TAZ 유전자 또는 단백질의 발현 또는 활성을 조절하는 제제를 캡슐화, 분말화, 또는 현탁액 등으로 제제화하여 기능성 식품으로 이용하거나 각종 식품에 첨가할 수 있다. 상기 식품은 예를 들어, 육류, 소시지, 빵, 초콜릿, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알코올음료, 비타민 복합제, 기능성 식품 및 건강 식품이다.
또 다른 양상은 췌장에서 TAZ(Transcriptional coactivator with PDZ-binding motif) 유전자 또는 단백질의 발현 또는 활성을 조절하는 단계를 포함하는 혈당 조절 방법을 제공한다.
상기 TAZ, TAZ 유전자 또는 단백질의 발현 또는 활성을 조절하는 제제 등에 대해서는 상기한 바와 같다.
또 다른 양상은 TAZ 유전자 또는 단백질의 발현 또는 활성을 조절하는 제제 또는 이를 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물을 투여하는 단계를 포함하는 대사성 질환을 예방 또는 치료하는 방법; 및 대사성 질환의 치료제를 제조하기 위한, 상기 TAZ 유전자 또는 단백질의 발현 또는 활성을 조절하는 제제 또는 이를 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물의 의약적 용도를 제공한다.
일 양상에 따르면, 췌장에서 TAZ 유전자 또는 단백질의 발현 또는 활성을 조절함으로써 췌장으로부터 인슐린 및 글루카곤의 생산 및 분비를 조절할 수 있는 효과가 있으므로, 혈당 조절과 관련된 대사성 질환, 특히 췌장 기능 장애로부터 기인한 대사성 질환의 예방, 개선, 또는 치료에 사용할 수 있다.
도 1은 TAZ 결핍이 유발하는 췌장 조직 내 이자섬의 기능 및 구조적 이상을 확인한 결과이다. 도 1A는 췌장에서 TAZ 발현에 대한 면역블롯 분석 결과를 나타낸 것이다(그룹당 n=4). 도 1B는 췌장 조직 내 이자섬에서 TAZ의 면역조직화학 결과를 나타낸 것이다(그룹당 n=4, 막대눈금: 50 ㎛). 도 1C는 WT 및 TAZ KO 마우스의 췌장 조직의 HE 염색 결과를 나타낸 것이다(그룹당 n=6, 막대눈금: 200 및 50 ㎛). 도 1D는 WT 및 TAZ KO 마우스 췌장 조직 내 이자섬에서 생성되는 인슐린 및 글루카곤의 면역조직화학 결과를 나타낸 것이다(막대눈금: 50 ㎛). 도 1E는 WT 및 TAZ KO 마우스의 혈액 샘플에서 인슐린 및 글루카곤의 ELISA 결과를 나타낸 것이다(그룹당 n=6, *P<0.05; **P<0.005, 양측 스튜던트 t-검정(two tailed Student's t-test)). 모든 실험은 적어도 3회 반복하였고, 대표 도면을 나타낸 것이다.
도 2는 TAZ KO 마우스 췌장의 조직학적 분석 결과를 나타낸 것이다. 도 2A는 WT 및 TAZ KO 마우스의 연령대별 인슐린 생성에 대한 면역조직화학 결과를 나타낸 것이다. 도 2B는 WT 및 TAZ KO 마우스 췌장에서 PDX1 및 p65 발현을 확인하는 면역조직화학 결과를 나타낸 것이다. 도 2C는 WT 및 TAZ KO 마우스 췌장의 콜라겐 축적(트리크롬 염색), 췌장 조직의 외분비선 부위의 HE 염색, 및 E-카데린 발현을 확인하는 면역조직화학 결과를 나타낸 것이다. (그룹당 n=6, 막대눈금: 10, 20, 50 및 100 ㎛)
도 3은 췌장 특이적 TAZ KO(TAZ P-KO) 마우스의 췌장의 구조 및 기능의 손상을 나타낸 것이다. 도 3A는 WT 및 TAZ P-KO 마우스 췌장에서 HE 염색 및 인슐린 및 글루카곤의 면역조직화학 결과를 나타낸 것이다(막대눈금: 200 및 50 ㎛). 도 3B는 WT 및 TAZ P-KO 마우스 췌장에서 preproinsulin, insulin, pdx1, mafA, 및 glucagon의 상대적 전사 수준을 나타낸 것이다. 도 3C는 GLUT2 및 PDX1 단백질 발현의 면역조직화학 결과를 나타낸 것이다. 도 3D는 WT 및 TAZ P-KO 마우스 췌장으로부터 분리된 이자섬 세포에서 preproinsulin, glut2, mafA, glucagon, 및 foxA2의 상대적 전사 수준을 나타낸 것이다. (그룹당 n=6, **P<0.005; ***P<0.0005, 양측 스튜던트 t-검정)
도 4는 마우스 췌장 및 분리된 이자섬의 조직학적 분석 결과를 나타낸 것이다. 도 4A는 WT 및 TAZ P-KO 마우스 췌장 외분비선 부위의 HE 염색 및 E-카데린 단백질의 면역조직화학 결과를 나타낸 것이다(막대눈금: 50 및 20 ㎛). 도 4B는 글루카곤 및 p65의 면역조직화학 결과를 나타낸 것이다(막대눈금: 50 ㎛). 도 4C는 가스트린 및 소마토스타틴의 상대적 전사 수준을 나타낸 것이다(데이터는 평균±표준측정오차(SEM: Standard Error of Measurment), n= 5로 나타냄, *P<0.05; **P<0.005, 양측 스튜던트 t-검정). 도 4D는 이자섬의 분리 및 1차 배양 후 세포 모양을 나타낸 것이다.
도 5는 TAZ P-KO 마우스에서 관찰되는 당뇨-유사 표현형을 나타낸 것이다. 도 5A는 WT 및 TAZ P-KO 마우스 혈청의 인슐린 및 글루카곤에 대한 ELISA 결과를 나타낸 것이다. 도 5B는 WT 및 TAZ P-KO 마우스의 글루코스 내성 분석 결과를 나타낸 것이다. 도 5C는 WT 및 TAZ P-KO 마우스의 인슐린 감수성 분석 결과를 나타낸 것이다. 도 5D는 연령에 따른 체중 변화를 나타낸 것이다. (그룹당 n=6, *P<0.05; **P<0.005, ***P<0.0005, 양측 스튜던트 t-검정)
도 6은 TAZ의 과발현 및 넉다운에 의한 β-세포 마커 발현의 상호 조절 결과를 나타낸 것이다. 도 6A는 안정적 TAZ/NIT-1 세포에서 TAZ 발현의 면역블롯 분석 결과를 나타낸 것이다. 도 6B는 안정적 TAZ/NIT-1 세포에서 β-세포 마커의 상대적 전사 수준을 나타낸 것이다(그룹당 n=5). 도 6C는 TAZ 넉다운된 TAZi/NIT-1 세포에서 β-세포 마커의 상대적 전사 수준을 나타낸 것이다(그룹당 n=4). (**P<0.005; ***P<0.0005, 양측 스튜던트 t-검정)
도 7은 TAZ에 의한 PDX1의 활성 증가 결과를 나타낸 것이다. 도 7A는 HEK293T 세포에서 PDX1 및 TAZ 발현에 대한 면역블롯 분석 결과 및 PDX 및/또는 TAZ의 존재 하에 인슐린 프로모터 활성의 리포터 분석(reporter assay) 결과를 나타낸 것이다(데이터는 평균±SEM(n= 5)로 나타냄, ***P<0.0005). 도 7B는 인슐린 프로모터 DNA에 바이오틴이 붙여 결합된 단백질 PDX1의 존재를 확인한 결과를 나타낸 것이다. 도 7C는 다양한 TAZ 절단(truncation) 단백질의 존재에 따른 PDX1의 DNA 결합력을 측정한 결과를 나타낸 것이다. 도 7D는 다양한 TAZ 절단 단백질의 존재 하에 PDX1의 인슐린 활성 촉진 분석결과를 나타낸 것이다(데이터는 평균±SEM(n= 5)로 나타냄, ***P<0.0005, 양측 스튜던트 t-검정). 도 7E는 면역침전법 및 면역블롯 분석에 의한 PDX1-TAZ 상호결합 결과를 나타낸 것이다.
도 8은 비-β-세포에서 PDX1 및 TAZ에 의한 β-세포 마커의 전사가 증가된 결과를 나타낸 것이다. 도 8A는 NIT-1 세포에서 내인성 또는 외인성 PDX1 존재 하에 TAZ에 의해 인슐린 프로모터 활성이 증가된 결과를 나타낸 것이다. 글루카곤 프로코터 활성은 PDX1과 TAZ 단백질에 의해 영향을 받지 않는다. 도 8B는 NIT-1 세포에서 다양한 PDX 절단 단백질과 TAZ의 발현에 의해 인슐린 프로모터 활성 분석 결과를 나타낸 것이다. 도 8C는 PDX1 및 TAZ의 형질도입에 의해 C3H10T1/2 세포가 β-유사 세포로 분화하는데 있어, TAZ 및 PDX1의 상대적 전사 수준을 나타낸 것이다.
도 9는 고지방 식이가 TAZ P-KO 마우스의 글루코스 및 인슐린 저항성을 악화시킴을 나타낸 것이다. 도 9A는 고지방 식이가 공급된 이후의 체중 변화를 나타낸 것이다. 도 9B는 8주 동안 고지방 식이가 공급된 WT 및 TAZ P-KO 마우스에서 글루코스 내성 분석 결과를 나타낸 것이다. 도 9C는 고지방 식이가 공급된 WT 및 TAZ P-KO 마우스에서 인슐린 감수성 분석 결과를 나타낸 것이다. 도 9D는 고지방 식이 후 WT 및 TAZ P-KO 마우스의 췌장에서 인슐린 및 글루카곤의 HE 염색 및 면역조직화학 결과를 나타낸 것이다(지방 조직은 HE 염색, 및 간 조직은 보디피(bodipy) 염색, 막대눈금: 20, 50 및 100 ㎛). 도 9E는 WT 및 TAZ P-KO 마우스 혈청의 인슐린 및 글루카곤에 대한 ELISA 결과를 나타낸 것이다. 도 9F는 췌장에서 분리된 이자섬 세포들에서 발현되는 mafA, nkx6.1, glut2, 및 pdx1의 상대적 전사 수준을 나타낸 것이다.
이하 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. TAZ 넉아웃(TAZ KO) 마우스를 이용한 TAZ 역할 확인
1.1 TAZ 넉아웃(TAZ KO) 마우스 제작
수컷 야생형(WT) C57BL/6 마우스는 Jackson 실험실(Minneapolis, 미국)에서 구입하였다. TAZ 유전자 녹아웃 카세트를 배아줄기세포에 형질도입시키고, 상기 배아줄기세포를 배반포의 포배강에 주입하여 키메라 마우스를 얻은 후, 상기 키메라 마우스로부터 TAZ+/- 유전형질을 갖는 이형접합체 마우스을 얻었다. 이어서 상기 이형접합체 마우스를 상호교배시켜 TAZ-/- 유전형질을 갖는 동형접합체 마우스를 수득하여 TAZ 넉아웃(KO) 마우스를 제작하였다. 모든 동물은 무균 조건에서 사육되었고, 이화여자대학교의 동물실험윤리위원회(IACUC)에 의해 승인(2010-13-3, 2015-01-020, 및 17-013)을 받아 IACUC 지침에 따라 실시되었다.
1.2 췌장에서의 TAZ 발현 여부 확인
췌장에서의 TAZ 발현 여부를 확인하기 위해, TAZ 넉아웃(KO) 마우스의 췌장 조직과 야생형(WT) 마우스 조직을 염색하여 비교하였다. 구체적으로, 췌장 조직을 WT, TAZ KO 마우스로부터 분리하고, 10% 중화된 포르말린으로 고정시켰다. 4 ㎛ 두께의 조직 절편을 헤마톡실린 및 에오신(HE; Sigma-Aldrich)으로 염색하고, Nikon Eclipse E200 현미경(Nikon, 일본)으로 관찰하였다.
그 결과, 도 1A에 나타낸 바와 같이, 야생형 마우스에서는 TAZ 발현이 관찰되었으나, TAZ KO 마우스에서는 TAZ 발현이 관찰되지 않았다.
TAZ가 단백질의 췌장조직에서의 발현됨을 확인하기 위해, 췌장 조직에서의 면역조직화학을 수행하였다. 구체적으로, 면역조직화학은 조직 절편을 특이적 1차 항체 및 형광물질이 접합된 2차 항체(Molecular Probes, Eugene, OR, USA)와 함께 반응시킨 다음, 4',6'-디아미노-2-페닐인돌(4,6-DAPI: 　4',6'-diamidino-2-phenylindol)으로 대비염색하였다. 공초점 현미경 및 NIS-Elements AR 소프트웨어를 이용하여 측정하였다.
그 결과, 도 1B에 나타낸 바와 같이, 1차 항체로서 항-TAZ 항체(BD Biosciences, Sandiego, CA, USA)를 이용한 경우, WT 마우스의 췌장 조직에서 TAZ 발현을 관찰할 수 있었으나, TAZ KO 마우스의 췌장 조직에서는 관찰되지 않았다. 또한, 1차 항체로서 항-TAZ/YAP 항체(Cell Signaling Technology Inc., Danvers, MA, USA)를 이용한 경우, YAP의 발현은 WT 및 TAZ KO 마우스의 췌장 조직 모두에서 관찰되었으나, TAZ 발현은 WT 마우스의 췌장 조직에서만 관찰되었다. 상기 결과로부터, TAZ는 주로 이자섬에서 발현됨을 확인할 수 있다.
1.3 췌장의 구조 및 기능과 관련된 TAZ의 효과 확인
이자섬의 구조와 관련된 TAZ 역할을 확인하기 위해, TAZ 넉아웃(KO) 마우스 및 야생형(WT) 마우스의 췌장 조직을 염색하여 비교 관찰하였다. 조직 염색은 상기 실시예 1.2과 동일한 방법으로 수행하였다. 그 결과, 도 1C에 나타낸 바와 같이, WT 마우스의 이자섬은 고밀도의 구형 형태를 유지하였으나, TAZ-결핍된 이자섬은 불규칙적인 경계를 가진 늘어진 형태로 관찰되었다. 상기 결과로부터 TAZ가 이자섬의 구조를 유지하는데 중요한 역할을 수행함을 확인할 수 있다.
이자섬의 기능, 특히 인슐린 및 글루카곤 생산 기능과 관련된 TAZ 역할을 확인하기 위해, 실시예 1.2와 동일한 방법으로 면역조직화학을 수행하였다. 그 결과, 도 1D에 나타낸 바와 같이, 항-인슐린 항체(Santa Cruz Biotechnology, SantaCruz, CA, USA) 및 항-글루카곤 항체(R&D systems, Minneapolis, MN, USA)를 이용하여 조직을 염색한 경우, 대조군 WT 마우스와 비교하여, TAZ-결핍된 이자섬 조직에서 인슐린 생산이 감소한 반면, 글루카곤 생산이 증가됨을 확인하였다.
추가적으로, TAZ KO 마우스의 혈청 내 인슐린 및 글루카곤 농도를 분석한 결과, 도 1E에 나타낸 바와 같이, 6시간 단식 및 하룻밤 동안의 단식 조건 모두에서, 대조군 WT 마우스와 비교하여, TAZ KO 마우스에서 인슐린 생산이 상당히 많이 감소되고, 글루카곤 생산은 유의적으로 증가됨을 확인하였다.
또한, 도 2A에 나타낸 바와 같이, 마우스의 연령별 인슐린에 대한 면역조직화학을 수행한 결과, WT 마우스는 연령에 따라 인슐린 생산량의 변화가 거의 없었으나, TAZ KO 마우스는 노화될수록 인슐린 생산의 감소가 유의적으로 나타남을 확인하였다.
도 2B에 나타낸 바와 같이, 이자섬 β-세포 마커인 PDX1와 대조군으로서 p65에 대한 면역조직화학을 수행한 결과, 대조군 WT 마우스와 비교하여, TAZ KO 마우스에서 p65 발현의 변화는 거의 없으나, PDX1의 발현은 유의적으로 감소됨을 확인하였다.
도 2C에 나타낸 바와 같이, 췌장 조직을 트리크롬(trichrome) 및 HE로 염색하여 관찰하고, E-카데린(E-cadherin)에 대하여 면역조직화학을 수행한 결과, 대조군 WT 마우스와 비교하여 TAZ KO 마우스에서 췌장의 외분비선(exocrine gland)이 손상되며, 생체 조직 내의 상호 접착을 유지하는 E-카데린의 발현이 감소됨을 확인하였다.
상기 결과로부터, TAZ는 이자섬의 구조 및 기능, 특히 인슐린 및 글루카곤 생산을 조절하는 기능과 관련하여 중요한 역할을 수행함을 확인할 수 있다.
실시예 2. 췌장 특이적 TAZ 넉아웃(TAZ P-KO) 마우스를 이용한 TAZ 역할 확인
2.1 췌장 특이적 TAZ 넉아웃(TAZ P-KO) 마우스 제작
췌장 특이적 TAZ KO 마우스 제작을 위해 loxp가 삽입된 TAZ 유전자 녹아웃 카세트를 배아줄기세포에 형질도입시켜 동형접합체 TAZ floxed 마우스를 수득한 다음, PDX1-cre transgenic 마우스 (Jackson 실험실(Minneapolis, 미국)에서 구입)와 교배하여 PDX1-cre 유전자를 발현하는 TAZ KO 동형접합체 마우스를 제작하였다. 유전형질 분석을 위한 프라이머 세트는 하기 표 1에 나타낸다. 모든 동물은 무균 조건에서 사육되었고, 이화여자대학교의 동물실험윤리위원회(IACUC)에 의해 승인(2010-13-3, 2015-01-020, 및 17-013)을 받아 IACUC 지침에 따라 실시되었다.
프라이머명 핵산 서열(5'→3') 서열번호
pdx1 tg 정방향 CTGGACTACATCTTGAGTTGC 1
pdx1 tg 역방향e TGGGCATACAGGAGGCAGGAA 2
TAZ-GP2 ATGGGACAGTCCGGGAG 3
TAZ-GP3 GTGCAAGTCAGAGGAGG 4
TAZ-ks-Neo R GGAGAACCTGCGTGCAATCCA 5
2.2 이자섬의 기능을 조절하는 TAZ의 효과 확인
이자섬의 기능과 관련된 TAZ의 주요 역할을 확인하기 위해, 상기 실시예 1과 동일한 방법을 이용하여, 췌장 조직 염색 및 면역조직화학을 수행하였다. 그 결과, 도 3A 및 4A에 나타낸 바와 같이, TAZ T-KO 마우스는 상기 실시예 1에서 확인한 TAZ KO 마우스와 동일한 결과를 나타내었다. 구체적으로, 대조군 WT 마우스와 비교하여, TAZ T-KO 마우스는 이자섬 및 외분비 시스템이 손상되고, 인슐린 생산이 감소되나, 글루카곤을 분비하는 α-세포들은 증가됨을 확인하였다.
WT 및 TAZ P-KO 마우스로부터 분리된 이자섬에서 preproinsulin, insulin, glut2, mafA, 및 glucagon의 상대적 전사 수준을 확인하였다. 그 결과, 도 3B 및 4B에 나타낸 바와 같이, 대조군 WT 마우스와 비교하여, TAZ T-KO 마우스에서 preproinsulin, insulin, glut2, 및 mafA의 상대적 전사 수준은 유의적으로 감소된 반면에, glucagon의 상대적 전사 수준은 유의적으로 증가됨을 확인하였다. 또한, 도 3C에 나타낸 바와 같이, 대조군과 비교하여 TAZ T-KO 마우스에서 인슐린 생산이 감소됨에 따라, GLUT2 및 PDX1의 단백질 발현 수준이 감소됨을 확인하였다.
WT 및 TAZ P-KO 마우스에서, 위의 G세포가 분비하는 가스트린(gastrin) 및 이자섬의 D세포가 분비하는 소마토스타틴(somatostatin)의 상대적 전사 수준을 확인하였다. 그 결과, 도 4C에 나타낸 바와 같이, 대조군 WT 마우스와 비교하여 TAZ T-KO 마우스에서 가스트린 및 소마토스타틴의 생산이 증가됨을 확인하였다.
WT 및 TAZ T-KO 마우스로부터 분리된 이자섬의 유전자 발현의 정량적 분석을 수행한 결과, 도 3D 및 도 4D에 나타낸 바와 같이, WT 대조군과 비교하여 TAZ T-KO 마우스에서 α-세포 관련 마커인 insulin, glut2, 및 mafA의 발현은 감소되었으나, β-세포 관련 마커인 glucagon 및 FoxA2의 발현은 증가됨을 확인하였다.
상기 결과로부터, 췌장에서 TAZ 유전자가 결여 또는 억제되는 경우, 인슐린 생산에 관여하는 α-세포의 활성을 감소시키고, 글루카곤 생산에 관여하는 β-세포의 활성을 증가됨을 확인하였다.
2.3 혈당 및 대사 상태를 조절하는 TAZ의 효과 확인
TAZ P-KO 마우스의 혈청 내 인슐린 및 글루카곤 농도를 확인하였다. 그 결과, 도 5A에 나타낸 바와 같이, 혈청 내 인슐린 농도가 감소되는 반면, 글루카곤 농도가 증가됨을 확인하였다.
TAZ P-KO 마우스의 글루코스 내성 (glucose tolerance) 및 인슐린 감수성(insulin　sensitivity) 시험을 수행하였다. 인슐린 감수성은 단식 6시간 후 측정하였다. 그 결과, 도 5B에 나타낸 바와 같이, 대조군 WT 마우스는 글루코스 주입 즉시 혈당이 증가하고, 기저 수준으로 다시 낮아지는 반면, TAZ P-KO 마우스는 대조군 WT 마우스에 비해 높은 혈당 수준을 유지하므로, 글루코스 불내성(glucose intolerance)임을 확인하였다. 또한, 도 5C에 나타낸 바와 같이, 대조군 WT 마우스와 비교하여, TAZ P-KO 마우스의 혈당 기저 수준은 훨씬 더 높고, 인슐린 주입 후 시간이 경과함에 따라 더 오랜 기간 동안 고혈당으로 유지하므로, 인슐린 감수성이 낮음을 확인하였다.
TAZ P-KO 마우스의 연령별 체중 변화를 확인하였다. 그 결과, 도 5D에 나타낸 바와 같이, 대조군 WT 마우스는 연령이 높아짐에 따라, 체중이 점진적으로 증가되는 반면, TAZ P-KO 마우스는 4월령 이후 연령에서 체중이 급격히 증가됨을 확인하였다.
상기 결과로부터, TAZ는 이자섬 기능을 조절함으로써, 혈당 및 대사 상태를 조절하는 데 중요한 역할이 있음을 확인하였다.
실시예 3. TAZ에 의한 이자섬 세포 마커의 발현 조절 확인
3.1 TAZ에 의한 α- 및 β-세포 마커의 직접적인 전사 조절 확인
이자섬 세포 마커의 발현에 대한 TAZ의 직접적인 효과를 확인하기 위해, 이자 β-세포주인 NIT-1세포로부터 TAZ를 안정적으로 과발현하는 TAZ/NIT-1 세포를 제작하였다. TAZ/NIT-1 세포에 대한 면역 블롯 분석을 수행한 결과, 도 6A에 나타낸 바와 같이, TAZ의 발현 수준이 증가됨을 확인하였다.
상기 제작된 TAZ/NIT-1 세포를 이용하여 TAZ의 과발현 및 넉다운에 따른 β-세포 마커 발현의 상반되는 조절 효과를 확인하였다. 구체적으로, TRIzol 시약을 이용하여 NIT-1 이자 세포주로부터 총 RNA를 분리하고, cDNA 합성 키트(Thermo Fisher Scientific)를 이용하여 역전사시켰다. 실시간 PCR은 StepOnePlus (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)을 이용하여 수행하였다. 상대적 발현 수준은 β-엑틴의 수준에 대하여 정규화하여 계산하였다. 사용된 프라이머 세트는 하기 표 2에 나타낸다.
프라이머명 핵산 서열(5'→3') 서열번호
β-actin 정방향 agagggaaatcgtgcgtgac 6
β-actin 역방향 caatagtgatgacctggccgt 7
TAZ 정방향 gtcaccaacagtagctcagatc 8
TAZ 역방향 agtgattacagccaggttagaaag 9
insulin 정방향 tcagagaccatcagcaagcag 10
insulin 역방향 gtctgaaggtccccggggct 11
pdx1 정방향 agagcccaaccgcgtccagc 12
pdx1 역방향 aacatcactgccagctccacc 13
glut2 정방향 ggctaatttcaggactggtt 14
glut2 역방향 tttctttgccctgacttcct 15
MafA 정방향 ttggaggagcgcttctcc 16
MafA 역방향 tctccagaatgtgccgctg 17
그 결과, 도 6B에 나타낸 바와 같이, TAZ를 안정적으로 과발현하는 TAZ/NIT-1 세포에서는 TAZ, insulin, pdx1, glut2, 및 mafA의 상대적 전사 수준이 유의적으로 증가됨을 확인하였다. 이와 반대로, 도 6C에 나타낸 바와 같이, TAZ가 넉다운된 TAZi/NIT-1 세포에서는 TAZ 및 상기 β-세포 마커의 발현이 감소됨을 확인하였다.
상기 결과로부터, TAZ는 β-세포 마커의 발현을 직접적으로 조절하고, 특히, 전사 수준에서 조절함을 확인하였다.
3.2 TAZ에 의한 β-세포 마커 발현 조절의 메커니즘 확인
TAZ에 의한 β-세포 마커 발현 조절의 분자적 메커니즘, 특히 인슐린 유전자 프로모터에 존재하는 PDX1과의 관계를 확인하고자 하였다. 인슐린 유전자 프로모터는 PDX1-결합 요소를 포함하고 있으므로, HEK293T 세포에서 인슐린 프로모터 리포터 유전자를 이용하여 PDX1을 발현시키고, 단백질-단백질 상호작용 및 DNA 풀다운(pulldown) 분석을 수행하였다. 구체적으로, 인산칼슘 형질주입 방법(calcium phosphate transfection method)을 이용하여 HEK293T 세포에 Flag-PDX1 및/또는 Myc-tagged TAZ 및 이의 끝이 절단된 형태를 형질주입하였다. 총 세포 용해물을 수득하고, Flag-M2 아가로스 비드(Sigma-Aldrich)와 반응하고 침전물을 SDS-PAGE 및 면역블롯 방법으로 분석하였다. DNA 풀다운 분석의 경우, 세포 용해물은 비오틴화된 이중 가닥의 인슐린 프로모터 DNA를 이용하여 반응시킨 다음, 스트렙타비딘-아가로스 비드로 다시 1시간 동안 반응시켰다. 인슐린 프로모터 DNA는 하기 표 3에 기재된 프라이머 세트를 이용한 PCR에 의해 제조하였다. PCR 산물을 정제하여 단백질 용해물과 함께 반응시키고, 스트렙타비딘 아가로스 비드로 1시간 동안 추가 반응시킨 후, SDS-PAGE 및 면역 블록 분석을 수행하였다.
프라이머명 서열(5'→3') 서열번호
인슐린 프로모터-정방향 Biotin-ccaagggacatcaatattagg 18
인슐린 프로모터-역방향 ctggtcactaagggctggggg 19
그 결과, 도 7A에 나타낸 바와 같이, PDX1 단독으로는 발현 수준과 관계 없이 인슐린 프로모터 활성에 영향을 미치지 않았으나, TAZ의 발현이 동반되는 경우, TAZ 용량-의존적인 방식으로 인슐린 프로모터 활성을 증가시킴을 확인하였다. 도 7B에 나타낸 바와 같이, TAZ 과발현에 의해, PDX1의 DNA-결합 활성이 유의적으로 증가됨을 확인하였다.
DNA 풀다운 분석 결과, 도 7C에 나타낸 바와 같이, TAZ 전장(1-395) 또는 이의 C-말단 도메인(164-395)의 존재 여부에 따라 PDX1의 DNA-결합 활성이 증가하므로, TAZ의 C-말단 도메인은 PDX1-DNA 상호작용에 필수적임을 확인하였다. 보다 구체적으로, 도 7D에 나타낸 바와 같이, PDX1 및 전장 TAZ의 존재 하에 인슐린 프로모터 활성이 촉진되고, 특히, PDX1 및 TAZ의 C-말단 도메인(164-395)의 발현에 의해 인슐린 프로모터 활성이 유의적으로 증가할 수 있는 반면, TAZ의 N-말단 도메인(1-163)의 발현에 의해서는 인슐린 프로모터 활성을 증가시킬 수 없음을 확인하였다. 또한, 단백질-단백질 상호작용 분석 결과, 도 7E에 나타낸 바와 같이, TAZ는 PDX1과 물리적으로 연관됨을 확인하였다.
상기 결과로부터, TAZ는 PDX1과 직접적으로 결합하여 PDX1 단백질의 DNA-결합을 촉진하여 PDX1의 전사 활성을 증가시킴으로써, 인슐린 발현에 영향을 미칠 수 있음을 확인하였다.
3.3 PDX1 및 TAZ의 인슐린 발현에 대한 선택적인 조절 효과 확인
β-세포에서 인슐린 유전자 발현에 대한 내인성 PDX1 및 TAZ의 역할을 확인하기 위해, NIT-1 세포에 외인성 TAZ의 존재 또는 부재 하에 인슐린 프로모터 리포터 유전자를 형질주입하였다. 구체적으로, HEK293T 세포 또는 NIT-1 세포에 일시적으로 리포터 유전자(인슐린 프로모터-luc 또는 글루카곤-luc) 및 발현 벡터(PDX1, TAZ 전장, 및 끝이 절단된 형태)를 형질주입하였다. 형질주입 효능의 표준화를 위해 pCMVβ 벡터를 또한 형질주입하였다. 세포 용해물은 루시퍼라제 분석 키트(Promega, Madison, WI, USA) 및 β-갈락토시다아제 분석 키트(Thermo Fisher Scientific)를 이용하여 분석하였다. 상대적 루시퍼라제 활성을 측정하여, 대조군 대비 배수 변화로 표현하였다.
그 결과, 도 8A에 나타낸 바와 같이, 외인성 TAZ 발현만으로 인슐린 프로모터 활성을 상당히 증가시킬 수 있고, PDX1이 함께 발현되는 경우에는 더욱 인슐린 발현을 증가시킬 수 있음을 확인하였다. 반면에, PDX1 및 TAZ는 글루카곤 프로모터 활성에 대해서 영향을 미치지 않음을 확인하였다. 또한, 도 8B에 나타낸 바와 같이, PDX1의 C-말단에 DNA-결합 도메인을 포함하므로, PDX1의 DNA-결합 도메인을 포함하는 단편(140-283)은 TAZ와 협력하여 인슐린 프로모터 활성을 증가시킬 수 있음을 확인하였다.
또한, TAZ가 비-β-세포에서도 β-세포 마커 발현을 충분히 유도할 수 있는지 시험하기 위해, 중간엽 줄기세포 C3H10T1/2 클론에서 TAZ를 안정적으로 발현하는 세포주를 제작하고, PDX1을 추가로 도입하고 분화배지에서 10일간 배양하였다. 그 결과, 도 8C에 나타낸 바와 같이, TAZ 과발현 세포주에서 PDX1 도입 유무에 상관없이 TAZ 전사발현이 동일함을 확인하였고, 대조군에서 PDX1 도입에 따라 PDX1 발현이 50배 증가한 것에 비해, TAZ 세포주에서는 PDX1 유전자 도입에 의해 세포 내 PDX1 전사 발현이 150배 증가함을 확인하였다.
상기 결과로부터, TAZ는 인슐린 발현만을 특이적으로 조절하고, PDX1이 발현되지 않는 비-β-세포에서도 TAZ는 PDX1과의 상호작용을 통해 β-세포 마커 발현을 충분히 유도할 수 있음을 확인하였다.
실시예 4. TAZ P-KO 마우스에서 고지방 식이에 의한 글루코스 내성 악화 및 인슐린 저항성 확인
글루코스 항상성에 있어 TAZ의 중요성을 확인하기 위해, WT 및 TAZ P-KO 마우스에 최대 8주까지 고지방 식이(HFD: high-fat diet)를 공급하였다.
그 결과, 도 9A에 나타낸 바와 같이, 고지방 식이에 의해 대조군 WT 마우스의 체중이 증가되었으나, TAZ P-KO 마우스에서는 대조군에 비해 보다 유의적으로 체중이 증가하였다. 또한, 도 9B에 나타낸 바와 같이, WT 마우스와 비교하여, TAZ P-KO 마우스의 단식 혈당 수치(fasting blood glucose level)는 현저히 더 높고, 고지방 식이에 의해 글루코스 내성이 악화됨을 확인하였다. 또한, 도 9C에 나타낸 바와 같이, 인슐린이 주입된 TAZ P-KO 마우스에서 지속적인 고혈당(hyperglycemia)을 나타내므로, TAZ P-KO 마우스에서 인슐린 저항성이 현저하게 증가됨을 확인하였다. 또한, 조직학적 분석 결과에 따르면, 도 9D에 나타낸 바와 같이, 고지방 식이에 의해, TAZ P-KO 마우스의 지방 및 간 조직에 지방의 축적을 증가시키고, 비정상적인 이자섬을 형성함을 확인하였다. 구체적으로, TAZ P-KO 마우스의 이자섬은 불규칙적인 모양의 세포를 나타내며, 주변의 외분비 조직 및 세포 간에 분명한 경계가 없으며, 인슐린 및 글루카곤의 발현의 변화, 즉, β-세포 질량을 감소시키고, α-세포 질량을 증가시킴을 확인하였다. 또한, 도 9E에 나타낸 바와 같이, 고지방 식이가 공급된 TAZ P-KO 마우스는 혈청 내 인슐린 농도는 감소되고, 글루카곤의 농도는 증가됨을 확인하였다. 나아가, 도 9F에 나타낸 바와 같이, mafA , Nkx6 .1, glut2, 및 pdx1를 포함한 β-세포 마커의 상대적인 mRNA 발현 수준은 TAZ 결핍에 따라 유의적으로 감소됨을 확인하였다.
상기 결과로부터, TAZ는 이자섬의 인슐린 및 글루카곤 생산을 조절할 수 있으므로, 인슐린 저항성을 나타내는 상황에서도 혈당의 항상성 조절에 중요한 물질임을 확인하였다.
따라서, TAZ 유전자 또는 단백질의 발현 또는 활성을 조절함으로써, 췌장조직 또는 세포에서의 인슐린 생성, 글루카곤 생성, 혈당 및 지방 축적 등을 조절할 수 있으므로, 대사성 질환, 특히 췌장 기능 장애로부터 기인한 대사성 질환의 예방 또는 치료할 수 있다.
<110> Ewha University - Industry Collaboration Foundation <120> Use of TAZ to control blood sugar by controlling PDX1 activity <130> PN122017 <150> KR 10-2018-0045749 <151> 2018-04-19 <160> 19 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pdx1 tg forward <400> 1 ctggactaca tcttgagttg c 21 <210> 2 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pdx1 tg reverse <400> 2 tgggcataca ggaggcagga a 21 <210> 3 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TAZ-GP2 <400> 3 atgggacagt ccgggag 17 <210> 4 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TAZ-GP3 <400> 4 gtgcaagtca gaggagg 17 <210> 5 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TAZ-ks-Neo R <400> 5 ggagaacctg cgtgcaatcc a 21 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> beta-actin forward <400> 6 agagggaaat cgtgcgtgac 20 <210> 7 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> beta-actin reverse <400> 7 caatagtgat gacctggccg t 21 <210> 8 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TAZ forward <400> 8 gtcaccaaca gtagctcaga tc 22 <210> 9 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TAZ reverse <400> 9 agtgattaca gccaggttag aaag 24 <210> 10 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> insulin forward <400> 10 tcagagacca tcagcaagca g 21 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> insulin reverse <400> 11 gtctgaaggt ccccggggct 20 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pdx1 forward <400> 12 agagcccaac cgcgtccagc 20 <210> 13 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pdx1 reverse <400> 13 aacatcactg ccagctccac c 21 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> glut2 forward <400> 14 ggctaatttc aggactggtt 20 <210> 15 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> glut2 reverse <400> 15 tttctttgcc ctgacttcct 20 <210> 16 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Maf2 forward <400> 16 ttggaggagc gcttctcc 18 <210> 17 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Maf2 reverse <400> 17 tctccagaat gtgccgctg 19 <210> 18 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> insulin promoter forward <400> 18 ccaagggaca tcaatattag g 21 <210> 19 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> insulin promoter reverse <400> 19 ctggtcacta agggctgggg g 21

Claims (13)

  1. TAZ(Transcriptional coactivator with PDZ-binding motif) 유전자 또는 단백질의 발현 또는 활성을 조절하는 제제를 포함하는 혈당 조절용 조성물.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 조성물은 췌장에서 TAZ 유전자 또는 단백질의 발현 또는 활성을 증가시켜 혈당을 감소시키거나, TAZ 유전자 또는 단백질의 발현 또는 활성을 억제하여 혈당을 증가시키는 것인 혈당 조절용 조성물.
  3. 청구항 1에 있어서, 상기 조성물은 췌장의 α-세포 및 β-세포의 활성 또는 세포량(cell mass)을 조절하는 것인 혈당 조절용 조성물.
  4. 청구항 1에 있어서, 상기 조성물은 글루코스 내성(glucose tolerance) 또는 인슐린 감수성(insulin resistance)을 조절하는 것인 혈당 조절용 조성물.
  5. 청구항 1에 있어서, 상기 조성물은 PDX1(pancreatic and duodenal homeobox 1)의 DNA 결합 또는 전사 활성을 조절하는 것인 혈당 조절용 조성물.
  6. 청구항 1에 있어서, 상기 TAZ 유전자 또는 단백질은 TAZ의 C-말단 도메인의 유전자 또는 단백질인 것인 조성물.
  7. 청구항 1에 있어서, 상기 TAZ 단백질의 발현 또는 활성을 조절하는 제제는 TAZ 단백질에 특이적으로 결합하는 화합물, 펩티드, 펩티드 미메틱스, 앱타머, 항원-결합 단편, 항체, 천연물, 및 이의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것인 혈당 조절용 조성물.
  8. TAZ 유전자 또는 단백질의 발현 또는 활성을 조절하는 제제를 포함하는 대사성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  9. 청구항 8에 있어서, 상기 대사성 질환은 췌장 기능 장애로부터 기인하는 것인 약학적 조성물.
  10. 청구항 8에 있어서, 상기 대사성 질환은 고혈당증(hyperglycemia), 당뇨병, 비만, 비알코올성 지방간, 공복혈당장애(impaired　fasting　glucose), 내당능장애(impaired　glucose　tolerance), 고지혈증(hyperlipidemia), 단백뇨, 고혈압, 고콜레스테롤혈증, 협심증, 심근경색, 뇌졸중, 심부전, 고인슐린혈증(hyperinsulinemia), 지연성 저혈당(prolonged hypoglycemia), 반응성 저혈당(reactive hypoglycemia), 사병성 저혈당(factitious hypoglycemia), 외인성 저혈당(exogenous hypoglycemia), 저혈당 뇌병증(hypoglycemic encephalopathy), 저혈당 혼수(hypoglycemic coma) 및 저혈당 무감지증으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 약학적 조성물.
  11. 청구항 8에 있어서, 상기 TAZ 단백질의 발현 또는 활성을 조절하는 제제는 TAZ 단백질에 특이적으로 결합하는 화합물, 펩티드, 펩티드 미메틱스, 앱타머, 항원-결합 단편, 항체, 천연물, 및 이의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것인 약학적 조성물.
  12. TAZ 유전자 또는 단백질의 발현 또는 활성을 조절하는 제제를 포함하는 대사성 질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물.
  13. 췌장에서 TAZ 유전자 또는 단백질의 발현 또는 활성을 조절하는 단계를 포함하는 혈당 조절 방법.
KR1020190045648A 2018-04-19 2019-04-18 Taz의 pdx1 활성 조절을 통한 혈당 조절 용도 KR102240763B1 (ko)

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