KR20190122159A - Taz에 의한 스테로이드 호르몬의 조절 - Google Patents
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Abstract
TAZ(Transcriptional coactivator with PDZ-binding motif)에 의한 스테로이드 호르몬의 조절을 통한 성기능 장애의 예방, 치료 또는 개선에 관한 것으로서, 성기능 장애 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 성기능 장애 예방 또는 개선용 건강 기능성 식품 조성물을 제공한다.
Description
TAZ(transcriptional coactivator with PDZ-binding motif)에 의한 스테로이드 호르몬의 조절을 통한 성기능 장애의 예방, 치료 또는 개선에 관한 것이다.
TAZ(transcriptional coactivator with PDZ-binding motif)는 14-3-3과 상호작용하는 세포 단백질로 동정된 바 있으며, TAZ는 또한 퍼옥시좀 증식자-활성화된 수용체-γ(PPARγ), 지방세포-특이적인 전사 인자와 상호작용을 수행하여, PPARγ유도된 지방세포 분화의 저해를 야기한다. 또한, 중간엽 줄기세포에서 TAZ의 발현 수준은 조골세포 또는 지방세포로 세포 운명 결정에 대하여 중요한 역할을 하므로, TAZ는 중간엽 줄기세포 분화의 전사 조절자로 작용하는 것으로 인식되고 있다. 이 뿐만 아니라, TAZ는 갑상선(thyroid) 전사 인자-1(TTF-1/Nkx2.1), T-박스 전사 인자(Tbx5), 페어드 박스 유전자 3(Pax3), Gli-Similar 3(Glis3) 및 Smad2/3-4 복합체를 포함하는 몇몇의 다른 전사인자와 상호작용을 하고, 그들의 전사 활성 및 세포 기능을 조절한다.
따라서, TAZ는 신장 및 폐 형성(Park, K. S. et al., J Biol Chem 279, 17384-17390, 2004), 심장 및 팔다리 발생, 갑상선 분화, 배아 줄기세포 자가-재생, 및 내피-중간엽 전이 및 암세포의 침습과 같은 생물학적 기능에 관여하는 것으로 알려져 있으나, 생식세포의 분화와의 연관성에 대해서는 아직 보고된 바가 없는 실정이다.
일 양상은 TAZ(Transcriptional coactivator with PDZ-binding motif) 유전자 또는 단백질의 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 포함하는 성기능 장애 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
다른 양상은 TAZ 유전자 또는 단백질의 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 포함하는, 성기능 장애 예방 또는 개선용 건강 기능성 식품 조성물을 제공하는 것이다.
일 양상은 TAZ 유전자 또는 단백질의 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 포함하는, 성기능 장애 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 명세서에서 사용되는 용어, "예방"은 일 실시예에 따른 약학적 조성물의 투여에 의해 성기능 장애를 억제시키거나 발병을 지연시키는 모든 행위를 의미할 수 있다..
본 명세서에서 사용되는 용어, "치료"는 일 실시예에 따른 약학적 조성물의 투여에 의해 성기능 장애에 대한 증상이 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미할 수 있다.
상기 조성물에 의해 예방 또는 치료 대상 질병인 "성기능 장애"는 생식 세포의 기능 이상로부터 유래된 병리적 상태를 총칭하는 것으로서, 스테로이드 호르몬의 비정상적인 생성 및/또는 분비와 관련되어 있을 수 있으며, 예를 들어, 발기기능장애(erectile dysfunction) 또는 조루증(premature ejaculation)일 수 있다.
상기 조성물은 스테로이드 호르몬 생성을 증가시키는 것일 수 있고, 상기 스테로이드 호르몬은 안드로겐일 수 있으며, 예를 들어, 디히드로에피안드로스테론(dehydroepiandrosterone, DHEA), 안드로스테네디온(androstenedione), 안드로스테네디올(androstenediol), 안드로스테론(androsterone), 디히드로테스토스테론(dihydrotestosterone, DHT) 및 테스토스테론(testosterone)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다
스테로이드 생성(steroidogenesis)은 콜레스테롤이 부신 피질에 의해 분비된 부신 스테로이드 및 난소 및 정소에 의해 생성되는 성 호르몬을 포함하는 스테로이드 호르몬으로 전환되는 일련의 다중 효소 반응이다.
콜레스테롤에서 유래된 스테로이드 호르몬 생합성은 성장 인자 및 칼슘을 포함하는 다중 신호전달경로에 의해 조절되고 레이딕(Leydig) 세포와 같은 스테로이드 생성 세포 내에서 단백질 키나아제 A의 활성화에 의해서 섬세하게 조절된다. 비록 스테로이드 생성 효소의 발현이 핵 수용체 패밀리와 같은 몇몇의 전사 인자에 의해 전사 수준에서 조절되지만, 이러한 전사 인자가 어떻게 스테로이드 생성 유전자 발현을 조절하는지는 알려져 있지 않다.
본 명세서에서 사용되는 용어, "TAZ(Transcriptional coactivator with PDZ-binding motif)"는 14-3-3 단백질과 상호작용하는 세포 단백질로 동정된 바 있으며, WW 도메인-포함 전사 조절인자 1(WW domain-containing transcription regulator 1, WWTR1)로도 알려져 있다. TAZ는 또한 퍼옥시좀 증식자-활성화된 수용체-γ(PPARγ), 지방세포-특이적인 전사 인자와 상호작용을 수행하여, PPARγ 유도된 지방세포 분화의 저해를 야기하는 것으로 알려져 있다. 상기 TAZ 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자의 서열은 미국 국립생물공학정보센터(National Center for Biotechnology Information, NCBI), 미국국립보건원의 GenBank 등 공지의 데이터베이스로부터 수득할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어, "녹아웃"은 유전자의 결손이 유발된 DNA를 외부에서 도입하여 정상 유전자에 완전 불활성화를 유도하는 것을 의미하며, 용어, "녹다운"은 예를 들어, RNAi 등을 이용해서 발현하는 mRNA를 퇴화(degradation)시켜서 유전자의 단백질 발현량을 줄이는 것을 의미한다.
상기 TAZ 단백질의 발현 또는 활성 억제제는 TAZ 단백질의 기능을 저해 또는 방해하는 물질을 의미할 수 있다. 이와 같은 저해 또는 방해는 TAZ 유전자의 전사를 방해하거나, 또는 TAZ 유전자의 mRNA의 번역을 저해함으로써 이루어질 수 있다. 또는 TAZ 단백질의 활성 부위에 특이적으로 결합하거나, 단백질 구조 변형을 일으킴으로써, TAZ 단백질의 활성을 감소 또는 불활성화시킬 수 있다.
상기 TAZ 유전자의 발현 또는 활성 억제제는 TAZ mRNA에 상보적으로 결합하는 안티센스 뉴클레오티드, 작은 간섭 RNA(small interfering RNA, siRNA), 짧은 헤어핀 RNA(short hairpin RNA, shRNA), 및 이의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것일 수 있다.
상기 TAZ 단백질의 발현 또는 활성 억제제는 TAZ 단백질에 특이적으로 결합하는 화합물, 펩티드, 펩티드 미메틱스, 앱타머, 항체, 천연물, 및 이의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것일 수 있다.
상기 뉴클레오티드는 올리고뉴클레오티드 및 폴리뉴클레오티드의 빌딩 블록일 수 있고, 본 발명의 목적을 위하여 천연 발생 및 비-천연 발생 뉴클레오티드를 모두 포함할 수 있다. 천연적으로, 뉴클레오티드, 예컨대 DNA 및 RNA 뉴클레오티드는 리보스 당 모이어티, 핵염기 모이어티 및 하나 이상의 포스페이트 기(뉴클레오시드에는 부재함)를 포함할 수 있다. 뉴클레오시드 및 뉴클레오티드는 또한 "단위" 또는 "단량체"와 상호교환적으로 지칭될 수 있다.
상기 "상보적으로 결합"하는 것의 의미는 뉴클레오시드/뉴클레오티드의 왓슨-크릭(Watson-Crick)의 염기 쌍과 관련이 있다. 왓슨-크릭 염기 쌍은 구아닌(G)-시토신(C) 및 아데닌(A)-티민(T)/우라실(U)이다. 올리고뉴클레오티드는 변형된 핵염기를 갖는 뉴클레오시드를 포함할 수 있다. 예를 들어 5-메틸 시토신이 종종 시토신 대신에 사용될 수 있다. 상기 용어 "상보적으로 결합"은 비-변형된 핵염기와 변형된 핵염기 사이의 왓슨-크릭 염기-결합을 포함할 수 있다.(예를 들어, 문헌[Hirao et al (2012) Accounts of Chemical Research vol 45 page 2055] 및 문헌[Bergstrom (2009) Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry Suppl. 37 1.4.1] 참고).
상기 안티센스 뉴클레오티드는 표적 핵산, 특히 표적 핵산 상의 인접 서열에 혼성화함으로써 표적 유전자의 발현을 조절할 수 있는 올리고뉴클레오티드로 정의될 수 있다. 안티센스 올리고뉴클레오티드는 본질적으로 이중가닥이 아니고, 이에 따라 siRNA 또는 shRNA가 아니다.
상기 용어, "작은 간섭 RNA"는 유전자의 활성을 억제하는 RNAi(RNA interference)를 유발시킬 수 있는 RNA를 의미할 수 있다. 상기 작은 간섭 RNA는 TAZ 유전자의 발현을 억제할 수 있는 miRNA, siRNA 등이 될 수 있는데, 상기 작은 간섭 RNA는 TAZ 유전자의 발현 또는 활성을 억제시키기만 하면 어떠한 형태의 것도 가능할 수 있다. 예를 들면, 화학합성 또는 생화학적 합성 또는 생체 내 합성에 의해 수득되는 siRNA, 혹은 약 40개 염기 이상의 이중가닥 RNA가 체내에서 분해된 10개 염기 이상의 이중가닥 RNA 등을 사용할 수 있다.
상기 "앱타머"는 소정의 표적 분자에 대한 결합 활성을 갖는 핵산 분자를 의미할 수 있다. 상기 앱타머는 RNA, DNA, 수식(modified) 핵산 또는 이들의 혼합물일 수 있으며, 직쇄상 또는 환상의 형태일 수 있는데, 대체로, 상기 앱타머를 구성하는 뉴클레오티드의 서열이 짧을수록 화학합성 및 대량 생산이 보다 용이하고, 비용면에서의 장점이 우수하며, 화학수식이 용이하고, 생체 내 안정성이 우수하며, 독성이 낮다고 알려져 있다.
상기 "항체"는 단백질 또는 펩티드 분자의 항원성 부위에 특이적으로 결합할 수 있는 단백질성 분자를 의미할 수 있고, 이러한 항체는, 각 유전자를 통상적인 방법에 따라 발현벡터에 클로닝하여 상기 마커 유전자에 의해 코딩되는 단백질을 얻고, 얻어진 단백질로부터 통상적인 방법을 거쳐 제조될 수 있다. 상기 항체의 형태는 특별히 제한되지 않으며 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체 또는 항원 결합성을 갖는 것이면 그것의 일부도 본 발명의 항체에 포함되고 모든 면역 글로불린 항체가 포함될 수 있을 뿐만 아니라, 인간화 항체 등의 특수 항체를 포함할 수도 있다. 아울러, 상기 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 완전한 형태뿐만 아니라 항체 분자의 기능적인 단편을 포함할 수 있다. 항체 분자의 기능적인 단편이란 적어도 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 의미하며 Fab, F(ab'), F(ab')2 또는 Fv 등이 될 수 있다.
상기 약학적 조성물은 유효성분 이외에 약학적으로 허용되는 담체를 포함할 수 있다. 이때, 약학적으로 허용되는 담체는 제제시 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아, 고무, 인산칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세 결정성 셀룰로스, 폴리비닐 피로리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필 히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다.
상기 약학적 조성물은 목적하는 방법에 따라 경구 투여하거나 비경구투여, 예를 들어, 정맥 내, 피하, 복강 내 또는 국소에 적용할 수 있으며, 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 시간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다.
상기 약학적 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여한다. 상기 "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효용량 수준은 환자의 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 상기 약학적 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기 요소들을 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
구체적으로 일 실시예에 따른 약학적 조성물의 유효량은 환자의 연령, 성별, 상태, 체중, 체내에 활성 성분의 흡수도, 불활성율 및 배설속도, 질병종류, 병용되는 약물에 따라 달라질 수 있으며, 일반적으로는 체중 1 kg 당 0.1 내지 500 mg을 매일 또는 격일 투여하거나, 1일 1 내지 3회로 나누어 투여할 수 있다. 그러나 투여 경로, 비만의 중증도, 성별, 체중, 연령 등에 따라서 증감될 수 있으므로 상기 투여량이 어떠한 방법으로도 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
일 양태로서, 상기 약학적 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 성기능 장애의 치료방법을 제공한다. 여기에서, "개체"란 질병의 치료를 필요로 하는 대상을 의미하고, 보다 구체적으로는, 인간 또는 비-인간인 영장류, 생쥐(mouse), 개, 고양이, 말 및 소 등의 포유류를 의미할 수 있다.
다른 양상은 TAZ 유전자 또는 단백질의 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 포함하는, 성기능 장애 예방 또는 개선용 건강 기능성 식품 조성물을 제공한다.
본 명세서에서 사용되는 용어, "개선"은 치료되는 상태와 관련된 파라미터, 예를 들면 증상의 정도를 적어도 감소시키는 모든 행위를 의미할 수 있다. 여기서, 상기 건강 기능성 식품 조성물은 성기능 장애의 예방 또는 개선을 위하여 해당 질환의 발병 단계 이전 또는 발병 후, 치료를 위한 약제와 동시에 또는 별개로서 사용될 수 있다.
또한, 상기 성기능 장애 및 상기 TAZ 유전자 또는 단백질의 발현 또는 활성 억제제는 상술한 바와 같다.
상기 기능성 식품 조성물은 유효성분을 식품에 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효 성분의 혼합량은 그의 사용 목적에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 식품 또는 음료의 제조시에 상기 조성물은 원료에 대하여 30 중량% 이하, 예를 들어, 10 중량% 이하의 양으로 첨가될 수 있다. 그러나 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 양은 상기 범위 이하일 수 있다.
상기 기능성 식품 조성물은 지시된 비율로 필수 성분으로서 상기 유효성분을 함유하는 것 외에 다른 성분에는 특별한 제한이 없으며 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당, 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알코올일 수 있다. 상술한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제인 타우마틴, 스테비아 추출물, 예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등, 및 합성 향미제인 사카린, 아스파르탐 등을 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 당업자의 선택에 의해 적절하게 결정될 수 있다.
상기 외에도 일 실시예에 따른 기능성 식품 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물 또는 전해질, 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율 또한 식품 분야의 통상의 지식을 가진 당업자에 의해 적절히 선택될 수 있다.
다른 양상은 개체에 상기 TAZ 유전자 또는 단백질의 발현 또는 활성 억제제, 또는 이를 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물을 투여하는 단계를 포함하는 성기능 장애의 치료방법; 및 성기능 장애의 치료 또는 성기능 장애 치료제를 제조하기 위한, 상기 TAZ 유전자 또는 단백질의 발현 또는 활성 억제제 또는 이를 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물의 의약적 용도를 제공한다.
일 실시예에 따르면, TAZ 유전자 또는 단백질의 저해는 스테로이드 호르몬 생성 효소의 발현을 증가시키는 반면, 상기 유전자 또는 단백질의 과발현은 스테로이드 합성 효소와 관련된 유전자의 프로모터의 활성을 억제시킴을 확인할 수 있었다. 따라서 스테로이드 호르몬의 생성 및/또는 분비 조절, 예를 들어, 성기능 장애 치료 분야의 핵심기술로 활용될 것으로 기대된다.
도 1은 야생형(KO) 및 TAZ 녹아웃(KO) 마우스의 정소에서 TAZ 단백질 발현을 웨스턴 블롯(A) 및 면역형광염색(B)로 확인한 도면이다.
도 2는 야생형 및 TAZ 녹아웃 마우스의 정소에서 3βHSD2(A), StAR(B), CYP17A1(C), CYP21A2(D), CYP11A1(E) 및 17βHSD1(F)의 mRNA 양을 측정한 결과 그래프이다.
도 3은 야생형 및 TAZ 녹아웃 마우스의 정소에서 AR(A) 및 INSL3(B)의 mRNA 양을 측정한 결과 그래프이다.
도 4는 야생형 및 TAZ 녹아웃 마우스의 정소에서 3βHSD2 발현을 면역조직화학 분석(A) 및 면역형광염색(B)으로 확인한 사진이다.
도 5는 야생형 및 TAZ 녹아웃 마우스에서 레이딕(Leydig) 세포 수를 측정한 결과 그래프(A), 일차배양 레이딕 세포에서 StAR(B), CYP11A1(C), 3βHSD2(D), CYP17A1(E), INSL3(F), SF1(G) 및 NR4A1(H)의 mRNA 양을 측정한 결과 그래프, 및 3βHSD2 단백질 발현을 측정한 도면(I)이다.
도 6은 HEK293T 세포주에서 전사인자들에 의한 StAR(A), CYP17A1(B), 3βHSD2(C) 및 INSL3(D)의 프로모터 활성을 측정한 결과 그래프이다.
도 7은 HEK293T 세포주에서 StAR(A), 3βHSD2(B) 및 CYP17A1(C)의 프로모터 활성을 측정한 결과 그래프, 및 NR4A1 및 TAZ 단백질 발현을 확인한 도면(D)이다.
도 8은 TAZ와 NR4A1과의 결합(A) 및 TAZ와 SF1과의 결합(B)을 확인한 도면이다.
도 9는 TAZ에 의한 NR4A1의 DNA 결합 억제를 확인한 도면이다.
도 10은 마우스 레이딕 TM3 세포주에서 TAZ 단백질 발현을 확인한 도면(A 및 D), 3βHSD2(B 및 E) 및 CYP17A1(C 및 F)의 프로모터 활성을 측정한 결과 그래프, 및 3βHSD2(G), CYP17A1(H), StAR(I), 및 SF1(J)의 mRNA 양을 측정한 결과 그래프이다.
도 11은 스테로이드 호르몬의 생합성 과정을 나타낸 모식도이다.
도 2는 야생형 및 TAZ 녹아웃 마우스의 정소에서 3βHSD2(A), StAR(B), CYP17A1(C), CYP21A2(D), CYP11A1(E) 및 17βHSD1(F)의 mRNA 양을 측정한 결과 그래프이다.
도 3은 야생형 및 TAZ 녹아웃 마우스의 정소에서 AR(A) 및 INSL3(B)의 mRNA 양을 측정한 결과 그래프이다.
도 4는 야생형 및 TAZ 녹아웃 마우스의 정소에서 3βHSD2 발현을 면역조직화학 분석(A) 및 면역형광염색(B)으로 확인한 사진이다.
도 5는 야생형 및 TAZ 녹아웃 마우스에서 레이딕(Leydig) 세포 수를 측정한 결과 그래프(A), 일차배양 레이딕 세포에서 StAR(B), CYP11A1(C), 3βHSD2(D), CYP17A1(E), INSL3(F), SF1(G) 및 NR4A1(H)의 mRNA 양을 측정한 결과 그래프, 및 3βHSD2 단백질 발현을 측정한 도면(I)이다.
도 6은 HEK293T 세포주에서 전사인자들에 의한 StAR(A), CYP17A1(B), 3βHSD2(C) 및 INSL3(D)의 프로모터 활성을 측정한 결과 그래프이다.
도 7은 HEK293T 세포주에서 StAR(A), 3βHSD2(B) 및 CYP17A1(C)의 프로모터 활성을 측정한 결과 그래프, 및 NR4A1 및 TAZ 단백질 발현을 확인한 도면(D)이다.
도 8은 TAZ와 NR4A1과의 결합(A) 및 TAZ와 SF1과의 결합(B)을 확인한 도면이다.
도 9는 TAZ에 의한 NR4A1의 DNA 결합 억제를 확인한 도면이다.
도 10은 마우스 레이딕 TM3 세포주에서 TAZ 단백질 발현을 확인한 도면(A 및 D), 3βHSD2(B 및 E) 및 CYP17A1(C 및 F)의 프로모터 활성을 측정한 결과 그래프, 및 3βHSD2(G), CYP17A1(H), StAR(I), 및 SF1(J)의 mRNA 양을 측정한 결과 그래프이다.
도 11은 스테로이드 호르몬의 생합성 과정을 나타낸 모식도이다.
이하 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. TAZ 녹아웃 마우스의 제작
수컷 야생형 C57BL/6 마우스를 Jackson 실험실(Minneapolis, 미국)에서 구입하였다. TAZ 유전자 녹아웃 카세트를 배아줄기세포에 형질감염시키고, 상기 배아줄기세포를 배반포의 포배강에 주입하여 키메라 마우스를 얻은 후, 상기 키메라 마우스로부터 TAZ+/- 유전형질을 갖는 이형접합체 마우스을 얻었다. 이어서 상기 이형접합체 마우스를 상호교배시켜 TAZ-/- 유전형질을 갖는 동형접합체 마우스를 수득하여 제작하였다. 모든 동물은 특정 병원체가 없는(specific pathogen free) 조건에서 사육되었고, 이화여자대학교의 동물실험윤리위원회(IACUC)에 의해 승인(16-008 및 17-013)을 받아 IACUC 지침에 따라 실시되었다.
야생형 및 TAZ 녹아웃 마우스의 정소를 분리하여 웨스턴 블롯(western blot) 분석을 수행한 결과, 도 1A에 나타낸 바와 같이 TAZ 녹아웃 마우스에서는 TAZ 단백질이 발현되지 않았다. 또한, 면역조직화학(immunohistochemistry) 분석으로 2개월령 및 12개월령의 야생형 및 TAZ 녹아웃 마우스의 정소 및 주변 조직을 TAZ 단백질에 대한 항체로 염색한 결과, 도 1B에 나타낸 바와 같이 마찬가지로 TAZ 녹아웃 마우스의 정소에서 TAZ 단백질이 거의 발현되지 않음을 확인하여, 상기 TAZ 녹아웃 마우스에서 형질전환이 제대로 이루어졌음을 알 수 있었다.
실시예 2. TAZ 녹아웃 마우스의 정소에서 스테로이드 생성 효소의 발현 증가 확인
TAZ 유전자 결핍이 스테로이드 생합성 경로에 미치는 영향을 확인하기 위하여, 실시간(real-time) 역전사 중합효소 연쇄반응(reverse transcription polymerase chain reaction, RT-PCR) 및 면역조직화학 분석을 수행하였다.
2-1. 실시간 RT-PCR
야생형 마우스 및 실시예 1에서 제작한 TAZ 녹아웃 마우스의 정소를 분리 적출한 후, TRIzol 시약을 이용하여 총 RNA를 추출하였다. 이를 상보적 DNA(complementary DNA, cDNA) 합성 키트(Thermo Fisher Scientific, 미국)를 이용하여 역전사한 후, 하기 표 1의 프라이머들 및 PCR 기기(StepOnePlus, Applied Biosystems, 미국)를 이용하여 실시간 PCR을 수행하고, 각 유전자의 mRNA 수준을 β-actin의 mRNA 양으로 표준화하여 상대적인 mRNA 양을 계산하였다.
| 프라이머명 | 서열(5'→3') | 서열번호 |
| Beta-actin forward | agagggaaatcgtgcgtgac | 1 |
| Beta-actin reverse | caatagtgatgacctggccgt | 2 |
| 3betaHSD2 forward | ttgaccatgcctgggtggag | 3 |
| 3betaHSD2 reverse | tgtctccttccaacactgtc | 4 |
| StAR forward | tgtcaaggagatcaaggtcctg | 5 |
| StAR reverse | cgataggacctggttgatgat | 6 |
| CYP17A1 forward | gcccaagtcaaagacacctaat | 7 |
| CYP17A1 reverse | gtacccaggcgaagagaataga | 8 |
| CYP21A2 forward | agacccttcacgactgtgtc | 9 |
| CYP21A2 reverse | ccgactctcttggatctgctt | 10 |
| CYP11A1 forward | aggactttccctgcgctc | 11 |
| CYP11A1 reverse | atcgacgcatccttggggtcc | 12 |
| 17betaHSD1 forward | tggttatgagcaagccctgag | 13 |
| 17betaHSD1 reverse | aagcggttcgtggagaagtag | 14 |
| AR forward | tgtcaactccaggatgctctact | 15 |
| AR reverse | tggctgtacatccgagacttg | 16 |
| INSL3 forward | acgcagcctgtggagaccc | 17 |
| INSL3 reverse | aagctgcgggtctagcgctg | 18 |
그 결과, 도 2에 나타낸 바와 같이, 야생형 마우스에 비하여 TAZ 녹아웃 마우스의 정소에서 콜레스테롤 수송체인 StAR(steroidogenic acute regulatory protein), 스테로이드 생합성 경로에 관여하는 효소들인 3βHSD(hydroxysteroid dehydrogenase)2, CYP17A1(cytochrome p450 17A1; steroid 17α-monooxygenase; 17α-hydroxylase; 17,20-lyase; 17,20-desmolase), CYP21A2(cytochrome p450 21A2; steroid 21-monooxygenase; 21α-hydroxylase; 21-hydroxylase; steroid 21-hydroxylase), CYP11A1(Cholesterol side-chain cleavage enzyme; P450scc) 및 17βHSD1의 상대적인 mRNA 양이 유의하게 증가하였다. 이는 TAZ 유전자 결핍에 의해 스테로이드 생합성이 증가할 것임을 나타낸다.
한편, 도 3A에 나타낸 바와 같이 안드로겐 수용체의 mRNA 양은 TAZ 유전자 결핍에 의해 유의적인 변화가 없었으며, 도 3B에 나타낸 바와 같이 정소에서 테스토스테론을 생산하는 세포인 레이딕 세포의 마커인 INSL3의 상대적인 mRNA 양이 TAZ 유전자 결핍에 의해 증가하였다. 이는 TAZ 유전자 결핍에 의해 레이딕 세포의 기능이 향상될 수 있음을 나타낸다.
2-2. 면역조직화학 분석
야생형 마우스 및 실시예 1에서 제작한 TAZ 녹아웃 마우스의 정소를 4-5개월령일 때 분리 적출한 후, 파라핀에 포매시킨 조직 절편을 제작하였다. 조직 절편을 3βHSD2에 대한 1차 항체와 반응시킨 후, HRP(horseradish peroxidase)-접합된 2차 항체 및 DAB(3,3'-diaminobenzidine) 기질과 반응시켰다. 면역형광염색의 경우 상기 1차 항체와 반응시킨 후, 형광-표지된 2차 항체(Molecular Probes, 미국)와 반응시켰으며, 세포 핵은 DAPI(4,6-diamidino-2-phenylindole)로 대조염색하였다. 염색이 종료된 조직 슬라이드는 일반 현미경(Nikon Eclipse E200 microscope, Nikon Corporation, 일본) 또는 공초점 현미경(confocal microscope, Nikon A1R, Nikon) 및 NIS-Elements AR 3.0 소프트웨어로 사진을 찍어 관찰하였다.
그 결과, 도 4에 나타낸 바와 같이 상기 실시예 2-1의 결과와 유사하게 야생형 마우스에 비하여 TAZ 녹아웃 마우스의 정소 조직에서 3βHSD2 단백질 발현이 증가하였다.
실시예 3. TAZ 녹아웃 마우스 정소에서 레이딕 세포 수 증가 확인
TAZ 유전자 결핍이 정소 내에서 테스토스테론을 생산하는 세포인 레이딕 세포 수에 미치는 영향을 확인하기 위하여, 야생형 및 TAZ 녹아웃 마우스의 레이딕 세포 수를 계수하였다.
구체적으로, 각 마우스의 정소를 분리하고, 피막제거(decapsulation) 및 콜라게나제(collagenase) 첨가를 통해 단일 세포 현탁액(single cell suspensions)을 준비하였다. 상기 단일 세포 현탁액을 불연속 퍼콜 원심분리(discontinuous Percoll gradients)로 정제하여 레이딕 세포만을 분리하였다. 분리된 레이딕 세포에서 트리판 블루(trypan blue)로 염색되지 않은 살아있는 건강한 레이딕 세포의 수를 계수하였다.
그 결과, 도 5A에 나타낸 바와 같이 야생형 마우스에 비하여 TAZ 녹아웃 마우스의 레이딕 세포 수가 유의하게 증가하였다. 이는 TAZ 유전자 결핍이 테스토스테론을 생산하는 레이딕 세포 수를 증가시킴으로써 테스토스테론 생산량의 변화를 가져올 수 있음을 나타낸다.
실시예 4. 일차배양 레이딕 세포의 배양
야생형 마우스 및 상기 실시에 1에서 제작한 TAZ 녹아웃 마우스의 정소로부터 실시예 3에 기재된 것과 동일한 방법으로 레이딕 세포를 분리 및 정제하고, 10% 소 태아 혈청(fetal bovine serum, FBS)을 포함하는 DMEM/F12로 세척하였다. 마우스 레이딕 세포들을 재현탁한 후 완전 DMEM/F12 배지에서 3일 동안 배양한 후, 매일 10% FBS가 첨가된 DMEM/F12 배지로 교체해주었다.
실시예 5. TAZ 결핍 일차배양 레이딕 세포에서 스테로이드 생성 효소의 발현 증가 확인
레이딕 세포에서도 TAZ 결핍에 의해 스테로이드 생성 효소 발현이 증가하는지 여부를 확인하기 위하여, 정량적 실시간 RT-PCR 및 웨스턴 블롯 분석을 수행하였다.
5-1. 정량적 실시간 RT-PCR
상기 실시예 4에서 배양한 야생형 및 TAZ 녹아웃 마우스 정소 유래 일차배양 레이딕 세포로부터 TRIzol 시약을 이용하여 총 RNA를 추출한 후, 표 1의 서열번호 1 내지 8, 11, 12, 17 및 18의 프라이머들 및 하기 표 2의 프라이머들을 이용하여 정량적 실시간 RT-PCR을 수행하였다.
| 프라이머명 | 서열(5'→3') | 서열번호 |
| SF1 forward | tccagtacggcaaggaaga | 19 |
| SF1 reverse | tcctggcggtccagctgcag | 20 |
| NR4A1 forward | gttgatgttcccgcctttg | 21 |
| NR4A1 reverse | agctggccggctgtgggtctcc | 22 |
그 결과, 도 5B 내지 5F에 나타낸 바와 같이 야생형 마우스의 레이딕 세포에 비하여 TAZ 녹아웃 마우스의 레이딕 세포에서 콜레스테롤 수송체인 StAR, 스테로이드 생합성 경로에 관여하는 효소들인 CYP11A1, 3βHSD2, CYP17A1, 및 레이딕 세포 마커인 INSL3의 mRNA 발현이 유의하게 증가하였다. 또한, 도 5G 및 5H에 나타낸 바와 같이, 스테로이드 생성 전사인자인 SF1 및 NR4A1의 mRNA 발현을 측정한 결과, NR4A1의 mRNA 발현은 유의한 차이를 보이지 않은 반면, SF1의 mRNA 발현은 야생형 마우스의 레이딕 세포에 비하여 TAZ 녹아웃 마우스의 레이딕 세포에서 유의성 있게 증가하였다.
5-2. 웨스턴 블롯
상기 실시예 4에서 배양한 야생형 및 TAZ 녹아웃 마우스 정소 유래 일차배양 레이딕 세포로부터 단백질을 추출하고, 정량한 후, 웨스턴 블롯 분석을 수행하여 3βHSD2 단백질 발현을 확인하였다.
그 결과, 도 5I에 나타낸 바와 같이, 야생형 마우스의 레이딕 세포에 비하여 TAZ 녹아웃 마우스의 레이딕 세포에서 3βHSD2 단백질 발현이 증가하였다.
실시예 6. 전사인자에 따른 스테로이드 생성 효소의 프로모터 활성 확인
스테로이드 생합성 경로에 관여하는 스테로이드 생성 효소 발현이 레이딕 세포에 중요한 전사인자의 종류에 따라 어떻게 달라지는지 확인하기 위하여, 루시퍼라제 측정법을 이용하여 유전자 프로모터 활성을 측정하였다.
구체적으로, HEK293T 세포주에 리포터 유전자인 StAR-luc, CYP17A1-luc, 3βHSD2-luc 또는 INSL3-luc를 넣고, 전사인자인 SF1, NR4A1 또는 PPARγ의 발현 벡터를 각각 다른 조합으로 도입하였다. 유전자 도입은 칼슘 인산염 방법으로 실시하였다. 48시간 동안 완전 DMEM 배지에서 배양한 다음, 세포 용해물을 회수하여 루시퍼라제 분석 키트(Promega, 미국) 및 베타-갈락토시다제 분석 키트(Thermo Fisher Scientific)로 측정하였다. 루시퍼라제 활성을 베타-갈락토시다제 활성으로 나눈 값을 각 유전자의 리포터 활성으로 계산하였고, 대조군 대비 배수로 표현하였다.
그 결과, 도 6에 나타낸 바와 같이StAR 및 INSL3은 SF1에 의해, 3βHSD2는 NR4A1에 의해 선택적으로 프로모터 활성이 증가하였고, CYP17A1은 NR4A1 및 SF1 모두에 의해 프로모터 활성이 증가하였다.
실시예 7. TAZ 과발현에 의한 스테로이드 생성 효소의 프로모터 활성 감소 확인
TAZ 과발현에 의한 스테로이드 생성 효소의 프로모터 활성 변화를 확인하기 위하여, 루시퍼라제 활성을 측정하였다.
구체적으로, HEK293T 세포주에 SF1 또는 NR4A1의 발현 벡터를 루시퍼라제 리포터 유전자인 StAR-luc, 3βHSD2-luc 또는 CYP17A1-luc와 함께 도입하고, 베타-갈락토시다제 리포터 유전자인 pCMVβ 또는 RSVβ도 도입하였다. 또한, 칼슘 인산염 방법으로 TAZ 발현 벡터의 양을 다르게 하여 세포 내에 함께 도입시켰다. 각 유전자들이 도입된 세포의 루시퍼라제 활성을 상기 실시예 6에 기재된 것과 동일한 방법으로 측정 및 계산하였다.
그 결과, 도 7에 나타낸 바와 같이 SF1에 의해 증가한 StAR의 프로모터 활성이 TAZ 과발현에 의해 농도 의존적으로 감소되었고, NR4A1에 의해 증가한 3βHSD2 및 CYP17A1의 프로모터 활성이 TAZ 과발현에 의해 감소되었다. 이는 TAZ가 스테로이드 생성 효소의 전사를 억제할 수 있음을 나타낸다.
실시예 8. TAZ 단백질과 NR4A1 또는 SF1과의 결합 확인
TAZ 단백질이 직접적으로 스테로이드 생성 전사인자 NR4A1 및 SF1과 작용하는지 확인하기 위하여, 면역침강법(immunoprecipitation) 및 면역블롯 분석을 수행하였다.
구체적으로, HEK293T 세포주에 Flag-NR4A1 및 Myc-TAZ 발현 벡터를 칼슘 인산염 형질전환 방법으로 형질전환시킨 후, 48시간 뒤에 세포를 회수하였다. 면역침강을 위해 전체 세포 용해물(whole cell lysates)을 Flag-M2 아가로즈 비즈(beads)(Sigma-Aldrich, 미국)와 반응시킨 후, Myc 항체를 이용하여 면역블롯 분석을 수행하였다. 또한, HEK293T 세포주에 His-SF1 및 Myc-TAZ 발현 벡터를 형질전환시킨 후, 상기와 동일한 방법으로 면역침강 및 면역블롯 분석을 수행하였다.
그 결과, 도 8에 나타낸 바와 같이TAZ 단백질이 직접적으로 전사인자인 NR4A1 및 SF1에 결합함을 확인하였다. 이는 TAZ가 스테로이드 생성 전사인자인 NR4A1 및 SF1에 직접적으로 결합함으로써 그 활성을 억제하여 스테로이드 생성 효소의 전사를 억제할 수 있음을 나타낸다.
실시예 9. TAZ에 의한 NR4A1의 DNA 결합 억제 확인
NR4A1의 DNA 결합 활성에 대한 TAZ의 영향을 알아보고자 DNA 침전법(DNA pulldown assay)을 수행하였다.
구체적으로, 상기 실시예 8에 기재된 것과 동일한 방법으로 HEK293T 세포주에 Flag-NR4A1 및 Myc-TAZ 발현 벡터를 형질전환시킨 후, 세포를 회수하였다. 하기 표 3의 Top 및 Bottom 가닥을 혼합 및 가열한 후, 서서히 온도를 낮추어 이중나선 구조를 형성시켜 비오틴 결합된 공통(consensus) NBRE 및 3βHSD2/NBRE DNA를 얻었다. 회수한 세포로부터 단백질을 추출하고, 단백질 용해물을 상기 이중나선 구조의 공통 NBRE 및 3βHSD2/NBRE DNA와 각각 4시간 동안 반응시킨 다음, 스트렙트아비딘(steptavidin)-아가로즈 비즈와 함께 1시간 동안 반응시켰다. DNA-단백질 복합체를 면역블롯으로 분석하였다.
| 서열 명칭 | 서열 | 서열번호 |
| consensus NBRE_top | 5'-biotin- gatctcgaaaaggtcacggga-3' | 23 |
| consensus NBRE_bottom | 5'-ttccctgtgaccttttcgagat-3' | 24 |
| 3βHSD2/NBRE_top | 5'-biotin-ctgcagaggtcacaaggtga-3' | 25 |
| 3βHSD2/NBRE_bottom | 5'-ctcaccttgtgacctctgca-3' | 26 |
그 결과, 도 9에 나타낸 바와 같이NR4A1 및 TAZ가 함께 존재하는 경우에 공통 NBRE 또는 3βHSD2/NBRE에 결합된 NR4A1가 검출되지 않았다. 이는 TAZ가 NR4A1의 DNA 결합을 억제함을 나타낸다.
실시예 10. 마우스 레이딕 세포주에서 TAZ 과발현에 의한 스테로이드 생성 효소의 프로모터 활성 감소 확인
안정적으로 TAZ를 발현하는 TM3 세포주(TAZ/TM3)에서 NR4A1에 의해 증가되는 스테로이드 생성 효소의 프로모터 활성이 TAZ를 발현하지 않는 대조군 TM3 세포주에 비하여 감소하는지 여부를 확인하고자 하기와 같은 실험을 수행하였다.
10-1. TAZ 단백질이 과발현된 TM3 세포주의 제작
마우스 레이딕 세포주 TM3 세포(Cat. #. CRL-1714, ATCC)를 10% FBS가 포함된 DMEM/F12 배지에서 배양하였다. TAZ를 발현하는 레트로바이러스 발현 벡터를 제작하고 바이러스 생성 세포주 PLAT-E 세포에서 바이러스를 생산하였다. 생성된 바이러스를 TM3 세포에 넣어 TAZ가 세포에 발현되게 한 다음 레트로바이러스 벡터 내의 항생제 내성 유전자를 이용하여 항생제 배지에서 살아남은 세포를 선별하여 안정적인 TAZ 과발현 TM3 세포주를 제작하였다. TAZ 유전자가 없는 레트로바이러스를 이용하여 상기와 동일한 방법으로 대조군 세포를 제작하였다. 상기 대조군(con) 및 TAZ 과발현 세포(TAZ)를 회수하여 단백질을 추출한 후 웨스턴 블롯 분석으로 TAZ 단백질 발현을 확인한 결과, 도 10A에 나타낸 바와 같이 TAZ 과발현 세포에서 TAZ 단백질 발현이 증가하였다.
10-2. TAZ 과발현에 의한 스테로이드 생성 효소의 프로모터 활성 감소 확인
상기 TAZ 과발현 세포 및 대조군 세포에 NR4A1의 발현을 유도하고, 3βHSD2-luc 또는 CYP17A1-luc를 도입하여 제작한 세포의 루시퍼라제 활성을 상기 실시예 6에 기재된 것과 동일한 방법으로 측정 및 계산하였다.
그 결과, 도 10B 및 10C에 나타낸 바와 같이, NR4A1에 의해 증가된 3βHSD2 및 CYP17A1의 프로모터 활성이 TAZ 과발현에 의해 유의하게 억제되었다. 이는 TAZ가 스테로이드 생성 효소의 전사를 억제할 수 있음을 재확인한 것으로 상기 실시예 7에서 확인한 결과와 일치하는 결과이다.
실시예 11. 마우스 레이딕 세포주에서 TAZ 발현 억제에 의한 스테로이드 생성 효소의 프로모터 활성 및 mRNA 양 증가 확인
TAZ 발현을 지속적으로 감소시킨 마우스 레이딕 TM3 세포주(TAZi)에서 NR4A1에 의해 증가되는 스테로이드 생성 효소의 프로모터 활성이 TAZ 발현이 억제되지 않는 대조군 TM3 세포주(coni)에 비하여 증가하는지 여부를 확인하고자 하기와 같은 실험을 수행하였다.
11-1. TAZ 단백질 발현이 억제된 TM3 세포주의 제작
마우스 레이딕 세포주 TM3 세포(Cat. #. CRL-1714, ATCC)를 10% FBS가 포함된 DMEM/F12 배지에서 배양하였다. TM3 세포에 shRNA(short hairpin RNA)를 이용한 TAZ 발현이 감소된 세포주를 제작하였다. 구체적으로, TAZ 넉다운 레트로바이러스 벡터를 바이러스 생산 세포에 도입하고 생산된 바이러스를 TM3 세포주에 넣어 TAZ 넉다운 세포(TAZi)를 제작하였다. 또한, TM3 세포에 뒤섞인(scrambled) shTAZ 벡터를 형질도입하여 대조군(coni) 세포를 제작하였다. 상기 대조군 및 TAZ 넉다운 세포를 회수하여 단백질을 추출한 후 웨스턴 블롯 분석으로 TAZ 단백질 발현을 확인한 결과, 도 10D에 나타낸 바와 같이, TAZ 넉다운 세포에서 TAZ 단백질 발현이 감소하였다.
11-2. TAZ 발현 억제에 의한 스테로이드 생성 효소의 프로모터 활성 증가 확인
상기 TAZ 넉다운 세포 및 대조군 세포에 NR4A1의 발현 벡터와 3βHSD2-luc 또는 CYP17A1-luc 리포터 유전자를 삽입하고, 루시퍼라제 활성을 상기 실시예 6에 기재된 것과 동일한 방법으로 측정 및 계산하였다.
그 결과, 도 10E 및 10F에 나타낸 바와 같이, NR4A1에 의해 증가된 3βHSD2 및 CYP17A1의 프로모터 활성이 TAZ 발현이 억제된 세포에서 더욱 증가하였다. 이는 TAZ 발현 억제에 의해 스테로이드 생성 효소의 전사가 증가될 수 있음을 나타낸다.
11-3. TAZ 발현 억제에 의한 스테로이드 생성 효소의 mRNA 양 증가 확인
상기 실시예 11-1에서 제작한 대조군 및 TAZ 넉다운 세포로부터 TRIzol 시약을 이용하여 총 RNA를 추출하고, 표 1의 서열번호 1 내지 8의 프라이머들 및 표 2의 서열번호 19 및 20의 프라이머들을 이용하여 실시예 2-1에 기재된 것과 동일한 방법으로 실시간 RT-PCR을 수행하였다.
그 결과, 도 10G 내지 10J에 나타낸 바와 같이, 대조군에 비하여 TAZ 넉다운 세포에서 스테로이드 생성 효소들인 3βHSD2 및 CYP17A1, 콜레스테롤 수송체인 StAR, 및 스테로이드 생성 전사인자인 SF1의 상대적인 mRNA 양이 증가하였다. 이는 TAZ 발현 억제에 의하여 스테로이드 생합성에 관여하는 인자들의 발현이 증가할 수 있음을 나타낸다.
<110> Ewha University - Industry Collaboration Foundation
<120> Modulation of steroidogenic gene expression by TAZ
<130> PN126563KR
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<160> 26
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Beta-actin forward
<400> 1
agagggaaat cgtgcgtgac 20
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Beta-actin reverse
<400> 2
caatagtgat gacctggccg t 21
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 3betaHSD2 forward
<400> 3
ttgaccatgc ctgggtggag 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 3betaHSD2 reverse
<400> 4
tgtctccttc caacactgtc 20
<210> 5
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> StAR forward
<400> 5
tgtcaaggag atcaaggtcc tg 22
<210> 6
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> StAR reverse
<400> 6
cgataggacc tggttgatga t 21
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<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CYP17A1 forward
<400> 7
gcccaagtca aagacaccta at 22
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<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CYP17A1 reverse
<400> 8
gtacccaggc gaagagaata ga 22
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
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<400> 9
agacccttca cgactgtgtc 20
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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ccgactctct tggatctgct t 21
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aggactttcc ctgcgctc 18
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atcgacgcat ccttggggtc c 21
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<400> 13
tggttatgag caagccctga g 21
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<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<400> 14
aagcggttcg tggagaagta g 21
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<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> AR forward
<400> 15
tgtcaactcc aggatgctct act 23
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<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> AR reverse
<400> 16
tggctgtaca tccgagactt g 21
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<400> 17
acgcagcctg tggagaccc 19
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<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> INSL3 reverse
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aagctgcggg tctagcgctg 20
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<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
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<400> 19
tccagtacgg caaggaaga 19
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SF1 reverse
<400> 20
tcctggcggt ccagctgcag 20
<210> 21
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
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gttgatgttc ccgcctttg 19
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<212> DNA
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agctggccgg ctgtgggtct cc 22
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> consensus NBRE_top
<400> 23
gatctcgaaa aggtcacggg a 21
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> consensus NBRE_bottom
<400> 24
ttccctgtga ccttttcgag at 22
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<223> 3betaHSD2/NBRE_top
<400> 25
ctgcagaggt cacaaggtga 20
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 3betaHSD2/NBRE_bottom
<400> 26
ctcaccttgt gacctctgca 20
Claims (12)
- TAZ(Transcriptional coactivator with PDZ-binding motif) 유전자 또는 단백질의 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 포함하는, 성기능 장애 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
- 청구항 1에 있어서, 상기 TAZ 유전자의 발현 또는 활성 억제제는 TAZ mRNA에 상보적으로 결합하는 안티센스 뉴클레오티드, 작은 간섭 RNA(small interfering RNA, siRNA), 짧은 헤어핀 RNA(short hairpin RNA, shRNA) 및 이의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것인, 약학적 조성물.
- 청구항 1에 있어서, 상기 TAZ 단백질의 발현 또는 활성 억제제는 TAZ 단백질에 특이적으로 결합하는 화합물, 펩티드, 펩티드 미메틱스, 앱타머, 항체, 천연물, 및 이의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것인, 약학적 조성물.
- 청구항 1에 있어서, 상기 성기능 장애는 남성의 성기능 장애인 것인, 약학적 조성물.
- 청구항 4에 있어서, 상기 남성의 성기능 장애는 발기기능장애(erectile dysfunction) 또는 조루증(premature ejaculation)인 것인, 약학적 조성물.
- 청구항 1에 있어서, 상기 조성물은 스테로이드 호르몬 생성을 증가시키는 것인, 약학적 조성물.
- 청구항 6에 있어서, 상기 스테로이드 호르몬은 안드로겐인 것인, 약학적 조성물.
- 청구항 7에 있어서, 상기 안드로겐은 디히드로에피안드로스테론(dehydroepiandrosterone, DHEA), 안드로스테네디온(androstenedione), 안드로스테네디올(androstenediol), 안드로스테론(androsterone), 디히드로테스토스테론(dihydrotestosterone, DHT) 및 테스토스테론(testosterone)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것인, 약학적 조성물.
- TAZ(Transcriptional coactivator with PDZ-binding motif) 유전자 또는 단백질의 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 포함하는, 성기능 장애 예방 또는 개선용 건강 기능성 식품 조성물.
- 청구항 9에 있어서, 상기 TAZ 단백질의 발현 또는 활성 억제제는 TAZ 단백질에 특이적으로 결합하는 화합물, 펩티드, 펩티드 미메틱스, 앱타머, 항체, 천연물, 및 이의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것인, 건강 기능성 식품 조성물.
- 청구항 9에 있어서, 상기 성기능 장애는 남성의 성기능 장애인 것인, 건강 기능성 식품 조성물.
- 청구항 11에 있어서 상기 남성의 성기능 장애는 발기기능장애 또는 조루증인 것인, 건강 기능성 식품 조성물.
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| JP2011501741A (ja) * | 2007-10-04 | 2011-01-13 | エイジェンシー・フォー・サイエンス，テクノロジー・アンド・リサーチ（エイ・スター） | がんの診断および治療のためのｔａｚ／ｗｗｔｒ１ |
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2019
- 2019-04-17 KR KR1020190045139A patent/KR102217986B1/ko active IP Right Grant
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2011501741A (ja) * | 2007-10-04 | 2011-01-13 | エイジェンシー・フォー・サイエンス，テクノロジー・アンド・リサーチ（エイ・スター） | がんの診断および治療のためのｔａｚ／ｗｗｔｒ１ |
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