KR20190119670A - Mr에서 대사 마커로서 사용되는 과분극화된 에스테르 - Google Patents

Abstract

본 발명은 과분극화된 에스테르, 특히 에틸 아세토아세테이트를 포함하는 진단용 매질을 사용하는 것에 의한 자기 공명(MR) 검출 방법, 특히 ¹³C-MR 검출 방법에 관한 것이다. 그 방법은 과분극화된 ¹³C 카르복실에스테르 및 그것의 각각의 과분극화된 대사물의 MR 신호를 검출하는 것을 포함한다.

Description

MR에서 대사 마커로서 사용되는 과분극화된 에스테르{HYPERPOLARIZED ESTERS AS METABOLIC MARKERS IN MR}

본 발명은 자기 공명(Magnetic Resonance, MR) 분야, 특히 과분극화된 ¹³C 에스테르를 포함하는 진단용 매질을 사용하는 ¹³C-MR 조사 방법에 관한 것이다.

자기공명 영상화(MRI)는 환자와 의료인이 X-선과 같은 잠재적으로 해로운 방사선에 대해 노출되지 않고 환자의 신체 또는 신체 일부의 이미지가 비-침습성 방식으로 얻어질 수 있기 때문에 의사들에게는 특별히 매력적으로 되어가는 기법이다. 그것의 고품질 이미지 및 양호한 공간적 및 일시적 해상도 때문에, MRI는 연조직 및 기관을 영상화하기 위해 선호되는 영상화 기법이다. MRI는 MR 조영제가 있거나 없이 수행될 수 있다. 그러나, 조영-증강된 MRI는 통상적으로 훨씬 더 작은 조직 변화의 검출을 가능하게 하며, 그런 사실은 그것을, 예를 들면 작은 종양 또는 전이와 같은 초기 단계 조직 변화의 검출을 위한 강력한 도구로 만들어준다.

과분극화된 분자(hyperpolarized molecules)를 사용하는 MRI는 최근 떠오르는 기법이다. WO 9935508 에는 MRI 조영제로서 높은 T1 제제의 과분극화된 용액을 사용하는 환자의 MR 조사 방법이 개시되어 있다. 용어 "과분극화"는 제제에 존재하는 NMR 활성 핵, 즉 비-제로(non-zero) 핵 스핀을 가지는 핵, 바람직하게는 ¹³C- 또는 ¹⁵N-핵의 핵 분극화를 증강시키고, 그로써 백배 이상의 MR 신호 세기가 증폭되는 것을 의미한다. 과분극화된 ¹³C- 및/또는 ¹⁵N-풍부한 높은 T₁ 제제를 사용할 때, ¹³C 및/또는 ¹⁵N의 천연적인 풍부함을 무시할만하기 때문에 바탕값 신호로부터 간섭받는 것이 본질적으로 없을 것이고, 따라서 영상 대비는 매우 유익할 것이다. 종래의 MRI 조영제와 이들 과분극화된 높은 T₁ 제제 사이의 주된 차이는 전자의 조영 변화는 신체의 물 부분의 완화시간에 영향을 미침으로써 유발되는 반면, 후자 부류의 제제는 얻어진 신호가 제제로부터 단독으로 발생하기 때문에 비-방사성 추적자로서 간주될 수 있다는 것이다. 과분극화가 쌍을 이루지 못한 전자들과 MR 프로브로서 사용된 핵 사이의 마이크로파 보조 전달을 통해 얻어질 때, 그 기법은 동적 핵 분극화 (Dynamic Nuclear Polarization, DNP)로서 언급된다.

MR 영상 작용제로서 사용하기에 가능한 다양한 높은 T₁ 제제가 비-내인성 및 내인성 화합물을 포함하여 WO9935508에 개시되어 있다. 정상적인 대사 사이클에서 후자, 중간체의 예시들은 대사 활성의 영상화에 대해 바람직한 것으로 언급된다. 대사활성의 생체 내 영상화에 의해 조직의 대사 상태에 대한 정보가 얻어질 수 있고 상기 정보는 에를 들면 건강한 조직과 병든 조직 사이를 식별하기 위해 사용될 수 있다.

예를 들어, WO 2009077575에는 ¹³C-말레이트와 임의로 ¹³C-푸마레이트 및/또는 ¹³C-석시네이트 신호를 검출함으로써 시트르산과 우레아 사이클 둘 다를 조사하기 위하여, 과분극화된 ¹³C-푸마레이트를 포함한 영상화 매질을 사용하는 ¹³C-MR 검출 방법이 개시되어 있다. 그 방법의 바람직한 구체예에서 생성된 대사 프로필은 조사 대상인 신체 및 신체 부분의 대사 활성에 대한 정보를 제공하고, 상기 정보는 후속되는 단계에서, 예컨대 질병을 확인하기 위해 사용될 수 있다. 그런 질병은 바람직하게는 암인데, 종양 조직이 보통 변경된 대사 활성에 의해 특성확인되기 때문이다. 기술적 측면으로서, 만약 용액의 냉동 또는 냉각시에 분극화되어야 할 화합물이 결정이 된다면(crystallize), 유리(glass)-형성 첨가제가 그 용액에 첨가되어야 한다.

동적 핵 분극화(DNP)는 최근에 용액에서의 자기 공명 분광학(MRS)에 적용되었는데, 그것은 민감성의 큰 증가를 유도하기 위해 사용될 수 있다. 이 기법을 사용하면, 여러 ¹³C-표지된 화합물들의 대사가 관찰될 수 있고 시험관 내 및 생체 내에서 특이한 효소-촉매된 반응들에 대한 속도 상수를 추정하는 데 사용될 수 있다(Day SE, Kettunen MI, Gallagher FA, Hu DE, Lerche M, Wolber J, Golman K, Ardenkjaer-Larsen JH, Brindle KM. 과분극화된 ¹³C 자기공명 영상화 및 분광학을 사용한 치료에 대한 종양 반응의 검출. Nat Med 2007; 13:1382-1387; Gallagher FA, Kettunen MI, Hu DE, Jensen PR, Zandt RI, Karlsson M, Gisselsson A, Nelson SK, Witney TH, Bohndiek SE, Hansson G, Peitersen T, Lerche MH, Brindle KM. [1,4-¹³C₂]푸마레이트로부터의 과분극화된 [1,4-¹³C₂]말레이트의 생성은 종양의 세포 괴사 및 치료 반응의 마커이다. Proc Natl Acad Sci USA 2009; 106:19801-19806). 나아가, 일부 과분극화된 표지된 기질에 대해서는, 생체 내에서 영상화되는 기질과 그것의 대사물이 둘 다 공간적으로 분포된다는 충분한 신호가 있다. 이들 기질 중 일부는 이미 임상에서 상대적으로 고농도로 투여되어왔기 때문에, 이 기법은 임상적 적용으로 전환될 수 있는 잠재력을 가진다. 오늘날까지, 가장 연구가 많이 이루어진 반응은 과분극화된 [1-¹³C]피루베이트를 포함한 것들이다: 과분극화된 표지는 내인성 락테이트 또는 알라닌으로 교환될 수 있거나, 또는 다르게는 이산화탄소로 비가역적으로 전환될 수 있는데, 그것은 계속해서 탄산 탈수효소에 의해 촉매된 반응에서 중탄산염으로 전환된다. 이들 대사 반응은 종양에서, 심장 조직에서 및 간에서 관찰되었다(Merritt ME, Harrison C, Storey C, Jeffrey FM, Sherry AD, Malloy CR. 과분극화된 ¹³C는 NMR에 의한 단일 효소-촉매된 단계를 통하여 플럭스의 직접 측정을 허용한다. Proc Natl Acad Sci USA 2007; 104:19773-19777; Schroeder MA, Swietach P, Atherton HJ, Gallagher FA, Lee P, Radda GK, Clarke K, Tyler DJ. 심장에서 과분극화된 이산화탄소 및 중탄산염을 사용한 세포내 pH 측정: ¹³C 및 ³¹P MRS 연구. Cardiovasc Res 2010;86: 82-91 ; Hu S, Chen AP, Zierhut ML, Bok R, Yen YF, Schroeder MA, Hurd RE, Nelson SJ, Kurhanewicz J, Vigneron DB. 과분극화된 ¹³C-피루베이트를 사용한 정상 및 금식한 쥐의 간의 생체 내 탄소-13 동적 MRS 및 MRSI. Mol Imaging Biol 2009; 11:399-407).

과분극화된 ¹³C-피루베이트 또는 [¹³C, ²H]-락테이트의 사용 또한 특허 문헌, 예를 들면 다음의 특허 문헌들에서 개시되었다.

EP2052273은 과분극화된 ¹³C-피루베이트를 포함하는 영상화 매질을 투여하는 것을 포함하는, 세포 사멸의 검출 방법을 개시한다.

US20100178249는 락테이트 및 과분극화된 ¹³C-피루베이트를 함유하는 영상화 매질을 개시한다.

WO2011138269는 LDH 활성을 측정하기 위해 사용되는 과분극화된 [¹³C, ²H]-락테이트의 사용을 개시한다.

US20110038802는 과분극화된 ¹³C-피루베이트를 포함하는 영상화 매질을 사용하는 알라닌 아미노기 전이효소 활성의 측정 방법을 개시한다.

WO2008143519는 과분극화된 ¹³C-피루베이트를 포함하는 영상화 매질을 사용하여 종양을 등급화하는 MR 방법을 개시한다. 피루베이트의 전환은 산화성 탈카르복실화를 통해 일어난다.

Hurd 등의 작업에서, 과분극화된 에틸 [1-¹³C]-피루베이트(EP)의 사용은 신경학적 용도에 대한 MR 대사 영상화에서 과분극화된 [1-¹³C]-피루베이트에 대한 대체 접근법으로서 제안되었는데, 이때 피루베이트의 혈액-뇌 수송은 제한 인자일 수 있다(Hurd RE, Yen Y, Mayer D, Chen A, Wilson D, Kohler S, Bok R, Vigneron D, Kurhanewicz J, Tropp J, Spielman D, Pfefferbaum A. 과분극화된 [1-¹³C]-피루베이트 및 에틸 [1-¹³C]-피루베이트를 사용한 마취된 쥐 뇌에서의 대사 영상화. Magn Reson Med. 2010; 63(5):1137-1143). 그 작업의 저자들은 신속하고 우선적인 에틸 [1-¹³C]-피루베이트의 뇌 안으로의 흡수를 입증하고, 그로써 신경퇴행성 질병의 연구에 대해 과분극화된 EP의 사용을 제안한다; 혈액-뇌 장벽을 가로질러 신속하고 효과적으로 제제들을 전달하기 위해 에스테르를 사용하는 일반적인 전략도 제안된다.

과분극화된 에틸 에스테르의 사용은 또한 Brindle 등의 작업에서도 나타나는데(Clive Kennedy BW, Kettunen MI, Hu D, Bohndiek SE, Brindle KM. 생체 내에서 과분극화된 ¹³C 표지된 케톤체의 검출. Proc. Intl. Soc. Mag. Reson. Med. 20 (2012)), 그 작업에서 생체 내 케톤체 대사를 프로브하기 위해 [1,3-¹³C₂]-아세토아세테이트(EAcAc)가 비-종양 및 종양 내포 마우스에 주입된다. EAcAc는 아세토아세테이트로 빠르게 전환되는 것으로 나타난다; 그러나 저자들은 상기 전환이 비-특이적 에스테라제 활성으로 인해 뇌에서 일어나고, 그러므로 생체 내에서의 케톤 대사를 프로브하기 위한 EAcAc의 사용은 무시된다고 제시한다.

최근에 이르러, 다른 내인성 분자들이 성공적으로 과분극화되었다: 생체 내에서 과분극화된 ¹³C-표지된 중탄산염의 주입 후에 상대적 농도의 ¹³C-표지된 중탄산염 및 이산화탄소로부터 종양 pH가 측정되었다(Gallagher FA, Kettunen MI, Day SE, Hu DE, Ardenkjaer-Larsen JH, Zandt R, Jensen PR, Karlsson M, Golman K, Lerche MH, Brindle KM. 과분극화된 ¹³C-표지된 중탄산염을 사용한 생체 내에서의 pH의 자기 공명 영상화. Nature 2008;453:940-943); 상승된 수준의 과분극화된 말레이트는 과분극화된 ¹³C-표지된 푸마레이트의 주입 후에 생체 내에서 괴사성 종양 조직에서 증명되었다(Gallagher FA, Kettunen MI, Hu DE, Jensen PR, Zandt RI, Karlsson M, Gisselsson A, Nelson SK, Witney TH, Bohndiek SE, Hansson G, Peitersen T, Lerche MH, Brindle KM. [1,4-¹³C₂]푸마레이트로부터의 과분극화된 [1,4-¹³C₂]말레이트의 생성은 종양의 세포 괴사 및 치료 반응의 마커이다. Proc Natl Acad Sci USA 2009; 106:19801-19806); 미토콘드리아의 효소 글루타미나제에 의해 촉매된 글루타민의 글루탐산염으로의 대사는 시험관 내에서 과분극화된 ¹³C-표지된 글루타민의 투여 후에 관찰되었다(Gallagher FA, Kettunen MI, Day SE, Lerche M, Brindle KM. 과분극화된 ¹³C-표지된 글루타민을 사용한 인간 간세포 암종 세포에서 글루타미나제 활성의 ¹³C MR 분광학 측정. Magn Reson Med 2008;60:253-257); 과분극화된 ¹³C-표지된 아세테이트의 아세틸-CoA 및 아세틸 카르니틴으로의 기관-특이적 대사가 생체 내에서 관찰되었다(Jensen PR, Peitersen T, Karlsson M, In 't Zandt R, Gisselsson A, Hansson G, Meier S, Lerche MH. 생체 내에서 과분극화된 NMR로부터의 조직-특이적 짧은 사슬 지방산 대사 및 허혈 후 느린 대사 회복. J Biol Chem 2009;284:36077-36082); 그리고 분지된 사슬 아미노산의 대사가 과분극화된 ¹³C-표지된 α-케토아이소카프로에이트의 첨가 후에 종양에서 관찰되었다(Karlsson M, Jensen PR, In 't Zandt R, Gisselsson A, Hansson G, Duus JO, Meier S, Lerche MH. 과분극화된 ¹³C 케토아이소카프로에이트를 사용한 종양의 분지된 사슬 아미노산 대사의 영상화. Int J Cancer 2010; 127 : 729-736.10).

비록 그것의 병인학이 부족하긴 하지만, 암은 분자 질병으로서 특성확인이 잘 되어 있는 현상학이다. 상이한 종류의 암들은 매우 상이한 생화학적 형태를 가질 수 있지만, 그것들은 일반적인 분자상 특징을 공유할 수 있다. 암의 초기 진단은 계속해서 큰 주의를 끌고 있는데, 왜냐하면 초기 단계에서의 진단이 자주 성공적인 치료의 기회를 증가시키기 때문이다. 실제로 암을 초기 진단하고 최적의 치료에 접근하는 것을 확실히 하는 것은 상당한 생존율 개선을 유도할 수 있다.

암의 초기 진단은 상이한 유형의 암세포들에 의해 공유된 일반적인 분자 특징의 장점을 취함으로써 이루어질 수 있고, 그런 특징의 암에서의 변경은 초기에 검출될 수 있다.

카르복실에스테라제(CE, EC 3.1.1.1)는 산 및 알코올에서 에스테르의 화학적 전환을 촉매하는 효소들의 패밀리이다. 일반적인 반응 계획은 아래에 나타낸다:

카르복실에스테라제는 포유동물의 조직에서 보편적으로 발현된다. 많은 CE 아이소형태들이 아미노산 상동성을 토대로 5 개의 슈퍼패밀리(CE 1 내지 5)로 분류되었다. CE1 효소들은 주로 간에 위치하지만, 또한 대부분의 다른 조직 유형에서도 발현된다. 쥐 특이적 CE1 아이소형태는 쥐 및 마우스들에서 간으로부터 혈액으로 분비되고, 이 아이소-효소는 인간에 비교하여 설치류에서 검출되는 고수준의 하이드롤라제와 상관된다(Yan, B. Dongfang Y., Bullock, P., Parkinson, A., Rat serum carboxylesterases, 1995, JBC, 32 (270) : 19128-34; Rudakova, EV., Botneva NP., Makhaeva, GF. 인간, 마우스 및 쥐 혈액의 에스테라제 활성의 비교 분석, 2011, Bulletin of experimental biology and medicine, 152(1):73-75). 다른 중요한 아이소형태는 CE2 패밀리로, 그것 또한 대부분의 다른 조직에서뿐 아니라 인간의 간에서 CE1보다 높은 정도로 발현된다(Talvar, S. 정상적인 조직 및 암 셀라인에서 인간 카르복실에스테라제의 발현(2008), Master thesis).

카르복실에스테라제의 발현은 동물 및 인간 조직 둘 다에서 암에서 감소한다. 특히 간종양 세포에서 정상적인 간세포와 비교하여 카르복실 에스테라제의 4배 감소된 발현이 측정되었다. 아이소형태에 따라 발현은 해당하는 악성 조직에서보다 대략 1.5 내지 4배 더 높은 것으로 보고된다(Talvar, 2008).

많은 연구들이 암세포의 카르복실에스테라제에 대해 보고되었다.

카르복실에스테라제의 발현은 인간 암세포(HEPG2)에서 검출할 수 있는 것으로 보고되었고, 정상적인 인간 간(간세포)에서의 카르복실 에스테라제의 발현보다 대략 3 내지 4배 더 낮다(Talvar, 2008). 간암(HCC)으로부터의 비-종양 및 종양 조직에 대한 환자 연구는 종양 조직에서 거의 3배 감소된 카르복실 에스테라제의 발현을 나타냈다(Na, K. et al., 간세포 암종에 대한 새로운 혈청학적 생체마커 후보인 인간 혈장 카르복실에스테라제 1 (2009), Proteomics, 9:3989-99).

다른 연구는 카르복실에스테라제 활성이 마우스에서 해당하는 정상 결장 조직에 비교하여 결장암 이종이식편에서 상당히 더 낮은 것을 나타냈다(Jansen et al., 인간 결장암 셀라인 및 이종이식편에서의 CPT-11: 세포의 민감성 결정기의 특성확인, 1997, Int. J. Cancer 70:335-40).

카르복실에스테라제 활성이 건강한 및 암 폐 조직에서 에스테라제 발현과 상관되는 폐암 환자들에 대한 연구가 보고된 바 있다. 이 연구에서, 연구자들은 활성이 발현과 상당히 상관되고, 건강한 조직에서 대략 1.5배 더 높은 것으로 나타나는 것을 발견한다(Liewald F. et al, 유동 세포 분석법에 의한 인간 폐 암종의 세포내 pH, 에스테라제 활성 및 DNA 측정. 1990, Cytometry, 11:341-48).

WO2012102773에는 효소 PMPMEase(인간 카르복실에스테라제 1)의 활성을 측정함으로써 암, 특히 유방암을 진단 및 치료하는 방법이 개시되어 있다. 상기 활성은 생물학적 샘플에서 효소 발현 또는 효소 활성을 분석함으로써, 마지막으로 기질의 소모 또는 생성물의 생성의 측정을 통해 측정된다. 일반적으로 효소 분석은 생체 내에서 수행될 수 있는 것으로만 진술된다.

US8198038에는 인간 간암(간세포 암종; HCC)에 걸린 사람들로부터 건강한 사람을 구별하기 위한 스크리닝 방법이 개시되는데, 그 방법은 인간 혈액을 수집하는 단계와 혈장에서 인간 간 카르복실에스테라제 1(hCE1)의 존재를 검출하는 단계를 포함하며, 이때 hCE1 단백질의 수준은 건강한 환자의 혈장에서보다 HCC에 걸린 환자들의 혈장에서 더 많이 증가된다.

WO2013/006520에는 과분극화된 다이알킬 ¹³C 석시네이트를 투여하고 각각의 과분극화된 대사 산물을 검출하는 것에 의한 대사 영상 방법이 개시된다. 이 출원에서 논의되는 것과 같이, 검출된 대사물은 특히 크렙스 트라이카르복실산 사이클("TCA 사이클")의 각각의 대사 산물, 즉 석시네이트, 아스파테이트, 말레이트 및 푸마레이트에 해당하는 ¹³C MRS 스펙트럼에서 최고조에 달한다. 다른 측면으로, 다이알킬 ¹³C 석시네이트(즉 모노알킬 ¹³C 석시네이트)에 대한 에스테라제 반응의 일차 대사 산물은 상기 출원에서 설명된 방법에 의해 검출되지 않는다.

상기의 관점에서, 건강한 조직으로부터 종양 조직을 특이하게 구별하기 위한 방법, 특히 상이한 암세포들에 의해 공유된 특징들을 생체 내에서 검출하는 것에 의한 방법에 대한 요구가 여전히 존재한다.

현재 암 조직에서 카르복실에스테라제에 의해 촉매된 과분극화된 ¹³C 에스테르의 해당하는 일차 과분극화된 대사 산물로의 전환은 건강한 조직의 것과는 상이한 신호에 대해 발생하는 것이 발견되었다. 그러므로, 상기 과분극화된 ¹³C 에스테르의 종양 및 비-종양 조직의 신호들 사이의 차이는 암 진단에 유용할 수 있다.

암 진단의 맥락 내에서, 카르복실에스테라제에 의해 대사된 상기 과분극화된 ¹³C 에스테르의 신호들의 차이는 종양의 존재를 검출하기 위해, 항암 치료법의 효능을 평가하기 위해 및/또는 종양의 시간 변화(time evolution)를 측정하기 위해 사용될 수 있다.

그러므로, 발명의 한 측면은 종양의 ¹³C-MR 조사에 사용하기 위한 모노카르복실산의 ¹³C 에스테르 또는 (C₁-C₇)다이카르복실산의 ¹³C 다이에스테르에 관련되고, 이때 상기 에스테르의 카르복실에스테라제 전환의 해당하는 일차 과분극화된 대사 산물의 신호들이 검출된다.

바람직하게 모노카르복실산은 (C₁-C₇)카르복실산이다.

보다 바람직하게, 모노- 또는 다이카르복실산은 (C₃-C₆)카르복실산이고 더욱 더 바람직하게는 C₄ 카르복실산이다.

발명의 다른 측면은 과분극화된 ¹³C 에스테르를 포함하는 영상화 매질을 사용하여 종양을 ¹³C-MR로 조사하는 방법에 관련되는데, 이 방법에서 카르복실에스테라제 전환의 해당하는 과분극화된 대사 산물의 신호들이 검출된다.

과분극화된 에스테르 분자에서, ¹³C 탄소 원자(들)은 산의 분자 부분의 일부, 알코올의 분자 부분의 일부 또는 둘 다일 수 있다. 그러므로, 검출된 대사 산물은 해당하는 산, 해당하는 알코올 또는 둘 다일 수 있다. 바람직하게, 산 부분의 ¹³C 탄소 원자(들), 보다 바람직하게는 카르복실기의 적어도 탄소는 ¹³C 탄소 원자이다. 카르복실산의 특이한 pKa에 따라 산은 더 분해되거나 덜 분해될 수 있다; 그로써 생리적 pH에서 검출된 생성물은 분해되지 않은 산 형태이거나 해당하는 카르복실레이트 음이온 중 하나일 수 있다. 따라서 아래의 명세서에서 용어 "산(또는 산성) 대사물(또는 생성물)"은 다르게 명시되지 않는 한 분해되거나 분해되지 않은 형태 둘 다를 포함한다.

발명의 바람직한 구체예에서 과분극화된 에스테르는 (C₁-C₄)알킬 에스테르이고, 보다 바람직하게는 에틸 에스테르이다.

발명의 다른 바람직한 구체예에서, 상기 과분극화된 ¹³C 에스테르는 모노카르복실산의 에스테르, 바람직하게는 (C₁-C₄)알킬 에스테르, 보다 바람직하게는 에틸 에스테르이며 보다 더 바람직하게는 에틸 아세토아세테이트이다.

검출된 대사물은 바람직하게는 각각의 산 대사물이고, 보다 바람직하게는 카르복실레이트 음이온 및 보다 더 바람직하게는 아세토아세테이트 음이온이다.

발명의 한 구체예에서, 관심의 영역으로부터 얻어진 첫 번째 신호는 두 번째 신호(전형적으로 참조 샘플로부터 유도된 신호, 예컨대 해당하는 비-종양/건강한 조직으로부터 얻어진 신호)와 비교되고; 상기 비교는 종양과 비-종양 조직 사이의 차이를 측정하기에 유용하고, 보다 더 특별하게는 종양의 위치를 제공하기 위해 사용될 수 있다.

나아가, 종양 조직을 포함하는 관심의 영역으로부터 얻어진 첫 번째 신호가 초기에 관심의 동일 영역으로부터 얻어진 두 번째 신호와 비교될 때, 상기 첫 번째 및 상기 두 번째 신호 사이의 비교는 시간 변화의 등급에 대한 정보를 제공할 수 있고, 그것은 또한 공격성, 종양 및/또는 상기 종양을 (면역)약리학 및/또는 수술 및/또는 방사선 요법에 의해 치료할 때 치료법의 효능의 표시일 수 있다.

바람직한 구체예에서, 상기 첫 번째 신호는 카르복실에스테라제 전환의 일차 대사 산물의 신호와 관심의 영역에서 검출된 투여된 기질(과분극화된 ¹³C 에스테르)의 신호 사이의 비율이다.

발명의 또 다른 측면은 상기 신호가 ¹³C 에스테르의 해당하는 과분극화된 일차 대사 산물로의 대사적 카르복실에스테라제 전환을 토대로 대사 프로필을 생성하기 위해 사용될 때 ¹³C-MR로 조사하는 상기 방법이고, 이때 상기 대사 프로필은 종양의 검출 또는 지표(indication)를 제공하기에 유용하다.

발명의 한 구체예에서, 상기 대사 프로필은 관심의 영역에서 측정되고(이때 종양 조직의 존재가 알려지거나 의심된다) 참조의 대사 프로필과 비교된다(예컨대 해당하는 비-종양 조직에 상대적임, 전형적으로 종양 조직과 매우 가까이 있는 건강한 조직).

본 발명의 또 다른 측면은 다음의 단계들을 포함하는 MRI 시스템을 작동하는 방법이다:

a. MRI 시스템에 배치되고 과분극화된 ¹³C 에스테르로 처리되었으며, 종양의 영향을 받거나 받았을 것으로 의심되는 대상을 ¹³C 핵에서 핵 스핀 전이를 일으키도록 선택된 주파수를 가지는 방사선에 노출시키고, 이때 상기 과분극화된 ¹³C 에스테르는 카르복실에스테라제 전환의 해당하는 과분극화된 대사 산물로 대사적으로 전환되는 단계;

b. 상기 여기된 핵으로부터 MR 신호를 기록하는 단계;

c. 상기 종양 또는 상기 의심되는 종양을 포함하는 관심의 영역으로부터 유도된 첫 번째 MR 신호를 상기 대상으로부터 또는 상기 대상으로부터 취한 샘플로부터 유도된 두 번째 MR 신호와 비교하는 단계.

발명의 한 구체예에서, 상기 두 번째 신호는 상기 대상의 비-종양 조직으로부터 유도된 MR-신호이다. 발명의 다른 구체예에서, 상기 두 번째 신호는 첫 번째 신호와 관련하여 보다 초기에 관심의 영역으로부터 검출된 MR-신호이다.

발명의 또 다른 측면은 다음의 단계들을 더 포함하는 상기 방법이다:

d. 상기 첫 번째 신호와 두 번째 신호 사이의 차이를 측정하는 단계;

e. 상기 d)의 차이를 참조값과 비교하여 편차값을 생성하는 단계;

f. 편차값이 절대값으로 예정된 값보다 더 높은지를 측정하는 단계.

본 발명의 또 다른 측면은 상기 두 번째 신호가 비-종양 조직에 대해 측정되는 상기 방법이고, 추가로 다음의 단계를 포함한다:

g. 편차값이, 절대값으로, 상기 예정된 값보다 높은 경우에 가능한 종양 발병의 지표를 제공하는 단계.

본 발명의 또 다른 측면은 단계 a) 내지 f)를 포함하는 MRI 시스템을 작동시키는 상기 방법으로, 이때 상기 두 번째 신호는 첫 번째 신호와 관련하여 초기에 관심의 영역에서 측정되고, 임의로 그 시스템에 보관되며, 상기 방법은 다음의 단계를 더 포함한다:

g'. 편차가, 절대값으로, 상기 예정된 값보다 높은 경우 종양 편차의 지표를 제공하는 단계.

본 발명의 또 다른 측면은 단계 a) 내지 f)를 포함하는 MRI 시스템을 작동시키는 상기 방법으로, 이때 상기 대상은 항-종양 처리를 진행하고, 상기 두 번째 신호는 상기 첫 번째 신호와 관련하여 초기에 관심의 영역에서 측정되며, 임의로 그 시스템에 보관되고, 상기 방법은 다음의 단계를 더 포함한다:

g". 이 편차가 절대값으로 예정된 값보다 더 높다면 상기 처리의 효능의 지표를 제공하는 단계.

바람직한 구체예에서, 상기 두 번째 신호는 처리를 시작하기 전, 후 또는 시작할 때 측정되며, 이때 상기 두 번째 신호의 효과적인 검출 시간은 환자의 상태, 치료 종류, 질병의 심각성의 정도 및 물질에 대한 일반적인 지식 내에 있는 어떠한 다른 임상적 매개변수에 따라 해당 기술분야의 숙련자에 의해 결정될 것이다. 상기 두 번째 신호의 측정 시간의 예는 수일, 예컨대 1 내지 5일, 1주 이상, 1개월 이상이다.

본 발명은 활용할 수 있는 과분극화된 ¹³C 에스테르를 포함하는 영상화 매질을 제조하는 장점을 제공하는데, 그 조성물은 종양과 비-종양 조직 사이를 식별할 수 있는 선택적 등급으로 종양을 진단하기 위한 MRI 기법에 사용될 수 있다.

다른 장점은 종양 조직에 과분극화된 ¹³C 에스테르의 MR 신호의 상이한 레즈스트레이션을 취할 수 있는 가능성에 의해 나타나는 한편, 항종양 치료법이 투여되고 치료법의 진전을 모니터링하는 것이다.

추가의 장점은 종양 조직에서 카르복실에스테라제 전환의 해당하는 ¹³C 과분극화된 대사 산물의 형성의 발생을 모니터링함으로써 종양의 공격적 형태를 검출하는 가능성에 의해 나타난다.

본 발명의 이들 및 다른 측면들과 장점들은 이제 도면과 실시예에 의해 제시되는 다음의 설명으로 상세하게 개시될 것이다.
도 1은 4가지의 상이한 암 셀라인(쥐 간암종, Morris; 인간 간암종, HepG2; 인간 전립선 암종, PC-3; 인간 유방 암종, MCF-7)에서 기질로서 NA를 사용하여 측정된 일반적인 카르복실에스테라제 활성을 나타낸다.
도 2A)는 쥐 및 인간 간암 세포(쥐 간암종, Morris; 인간 간암종, HepG2)에서 에틸 [1,3-¹³C₂]-아세토아세테이트의 세포에서의 DNP 전환을 나타낸다. DNP 실험은 10×10⁶개의 세포로 수행된다. 도 2B)는 에틸 [1,3-¹³C₂]-아세토아세테이트의 전체 Morris 세포 안으로의 주입 결과 대사물 [1,3-¹³C₂]-아세토아세테이트 음이온의 증가를 나타낸다.
도 3A)는 쥐 및 인간 간암 세포(쥐 간암종, Morris; 인간 간암종, HepG2)에서 에틸 [1,3-¹³C₂]-아세토아세테이트와 [1-¹³C]-피루베이트의 세포에서의 DNP 전환을 비교하여 나타낸다. DNP 실험은 10×10⁶개의 세포로 수행된다. 도 3B)는 전체 Morris 세포에서 대사물 [1,3-¹³C₂]-아세토아세테이트 음이온 및 [1-¹³C]-락테이트 음이온의 증가를 나타낸다. 아세토아세테이트 음이온 C1으로부터의 신호의 증가만이 표시된다.
도 4A)는 증가하는 농도의 기질 에틸 [1,3-¹³C₂]-아세토아세테이트의 세기를 나타내고, 도 4B)는 해당하는 [1,3-¹³C₂]-아세토아세테이트 음이온 신호의 변화를 나타낸다. 도 4C)는 증가하는 농도의 기질 [1-¹³C]-피루베이트의 세기를 나타내고, 도 4B)는 해당하는 [1-¹³C]-락테이트 신호의 변화를 나타낸다.
도 5A)는 기질 신호의 백분율로 표시된(n=3), [1-¹³C]-락테이트 음이온과 [1,3-¹³C₂]-아세토아세테이트 음이온으로의 DNP 전환을 나타낸다. 도 5B)는 인간의 전혈에서 [1,3-¹³C₂]-아세토아세테이트 음이온의 대사물 증가와 비교된 [1-¹³C]-락테이트 음이온의 대사물 증가를 나타낸다. 아세토아세테이트 신호의 감쇠만이 검출될 수 있기 때문에, 기질 에스테르의 가수분해는 DNP 용해 과정 중에 일어났을 것으로 예상된다.
도 6A)는 기질 신호의 백분율로 표시된(n=3), [1-¹³C]-락테이트 음이온과 [1,3-¹³C₂]-아세토아세테이트 음이온으로의 DNP 전환을 나타낸다. 도 6B)는 쥐의 전혈에서 [1,3-¹³C₂]-아세토아세테이트 음이온의 대사물 증가와 비교된 [1-¹³C]-락테이트 음이온의 대사물 증가를 나타낸다.
도 7은 분리된 돼지 간 카르복실에스테라제의 5개의 기질에 대해 측정된 상이한 에틸 및 다이에틸 에스테르 전환율을 나타낸다. 비교에 포함된 기질들은 다음과 같다: EAA, 에틸 아세토아세테이트; EA, 에틸아세테이트; EB, 에틸부티레이트; EPG, 에틸 파이로글루타메이트; DES, 다이에틸 석시네이트.
도 8은 왕관형 1H 해부 MR 이미지와 에틸 아세토아세테이트의 1-¹³C 피크의 ¹³C CSI 지도를 나타낸다. 상당한 양의 에틸 아세토아세테이트가 종양 덩어리에서만 발견되는데, 건강한 간에서는 20초의 획득 시간 중에 그것의 과분극화된 대사 산물로 거의 완전하게 전환되기 때문이다.
도 9는 에틸 [1,3-¹³C₂]-아세토아세테이트의 투여 후에 종양 덩어리(실선) 및 건강한 간 조직(점선)에 대해 놓여진 ROI에 대해 CSI 개별 스펙트럼의 평균으로서 얻어진 종양 및 간 조직의 ¹³C 스펙트럼을 도시한다. 아세토아세테이트 음이온(AA)과 에틸 아세토아세테이트(EAA)의 1-¹³C 및 3-¹³C로부터의 피크들이 분명하게 나타난다.
도 10은 종양 및 건강한 간 ROI로부터의 보셀(3D 화소)-평균화된 ¹³C CSI 스펙트럼의 EAA 및 AA 피크의 구역 사이의 비율을 도시한다. 위스커 박스 도표는 n=4의 Morris 간세포 암종 내포 쥐에 대해 얻어진 데이터 분포를 나타낸다. 두 조직 사이의 EAA/AA 비율의 중요한 차이가 관찰되는데, EAA의 효소적 전환의 다른 효율이 주지된다.

본 발명의 범주 내에서, 용어 MRI는 해당 기술분야의 상태에서 통상적으로 의도되고 예를 들어 WO200977575 및 본원에 인용된 참고문헌들에 개시된 것과 같이 자기 공명(MR)에 의한 영상화(전형적으로는 진단 목적의)를 의미한다.

본 발명의 범주 내에서, "영상화 매질" 및 "조영제"는 해당 기술분야의 상태에서 통상적으로 의도되고 예를 들어 WO200977575 및 본원에 인용된 참고문헌들에 개시된 것과 같이 동의어로 사용된다.

본 발명의 범주 내에서, 용어 "과분극화", "과분극화된" 또는 유사한 용어는 해당 기술분야의 상태에서 통상적으로 의도되고 예를 들어 WO200977575 및 본원에 인용된 참고문헌들에 개시된 것과 같이 높은 T₁ 제제에 존재하는 NMR 활성 핵의 핵 분극화를 증강시키는 것을 의미한다.

본 발명의 범주 내에서, 용어 동적 핵 분극화(DNP)는 해당 기술분야의 상태에서 통상적으로 의도되고 예를 들어 WO200977575 및 본원에 인용된 참고문헌들에 개시된 것과 같이 자기 공명 영상화의 기법이다.

본 발명의 의미 내에서, 용어 "과분극화된"은 열적 평형보다 높은 화합물의 핵 스핀 분극화를 의미한다.

본 발명의 범주 내에서, "MRI 시스템"은 MR 실험을 수행하기 위해, 특히 진단 목적으로 유용한 장치, 장비 및 모든 특징과 부속품들을 의미한다.

본 발명의 범주 내에서, 발명의 과분극화된 ¹³C 에스테르의 효소적 전환을 말하는 표현 "일차 과분극화된 대사 산물"은 출발하는 과분극화된 에스테르 화합물의 효소적 카르복실에스테라제 전환에 의해 직접 얻어진 대사 산물을 의미한다. 그로써 출발 화합물이 모노카르복실산의 에스테르인 경우에 카르복실에스테라제 전환의 일차 대사 산물은 에스테르를 형성하는 각각의 모노카르복실산과 알코올이고; 출발 화합물이 다이카르복실산의 다이에스테르인 경우 일차 대사 산물은 에스테르를 형성하는 다이카르복실산과 알코올의 각각의 모노에스테르이다.

과분극화된 ¹³C 에스테르는 예를 들어 WO9935508, 및 특히 WO2011124672에 개시되어 있는 공지된 방법인 동적 핵 분극화(DNP)에 의해 제조될 수 있다.

카르복실에스테라제 아이소형태의 활성은 매우 기질 의존적이다. 일반적으로 산 기보다 작은 알코올 기를 가진 기질들은 카르복실에스테라제 아이소형태 CE1에 대해 더 높은 친화성을 가지는 것으로 보고되고, 산 기보다 큰 알코올 기를 가진 역부류의 기질들은 CE2 효소에 더 높은 친화성을 가질 것이다(Imai, T. 인간 카르복실 에스테라제 아이소자임들: 촉매적 특성 및 합리적 약물 디자인, (2006) Drug Metab. Pharmacokinet 21(3):173-85).

용어 (C₁-C₇), (C₂-C₆), C₄ 등은 본 출원에서 카르복실산에 대해 언급될 때, 다르게 치환될 수 있고(예컨대 산소, 아미노기 등으로) 알킬 사슬에 단일 또는 이중 결합을 함유할 수 있는, 1 내지 7(또는 각각 3 내지 6 또는 4 등)개의 탄소 원자(카르복실기의 탄소 원자를 포함함)를 포함하는 직쇄, 분지형 또는 고리형 알킬 사슬을 포함한다.

(C₁-C₇), 바람직하게는 (C₃-C₆)모노- 및 다이-카르복실산의 에틸 에스테르가 CE1 아이소형태에 대한 바람직한 기질이다.

에틸 모노에스테르의 그룹 내에서 적당한 기질은 저분자량 에틸 모노에스테르, 특히 (C₂-C₆) 카르복실산의 에틸 에스테르의 부류 안에 있다. 특히 바람직한 기질은 아세토아세테이트 에틸 에스테르 및 부티레이트 에틸 에스테르이다.

보다 바람직한 기질은 모노에스테르 에틸 아세토아세테이트이다. 에틸 아세토아세테이트는 간 세포에서 효과적으로 가수분해된다는 장점을 제공하고, 이때 CE1 효소가 고도로 발현된다. 에틸 아세토아세테이트는 또한 고용해도, 고분극화, 긴 T1, 생체 내에서 가수분해 산물을 검출하기 위한 기질과 산물 사이의 충분한 화학적 시프트 분리와 같은 양호한 화학적 및 물리적 특성을 제공한다.

C₁-C₇ 다이카르복실산의 알킬(바람직하게는 에틸) 다이에스테르가 사용되는 경우, 단지 하나의 알킬기만이 카르복실에스테라제(특히 CE1)에 의해 가수분해될 것이고, 그 결과 산성 모노알킬 에스테르와 각각의 알코올(또는 에탄올)이 생성된다. 예컨대 Lobell et al., "Enzyme preparation of Pure Alkalenedicarboxylic acids monoesters: chain-length dependence of porcine liver esterase (PLE)-catalysed hydrolyses", J . Chem Soc 참조. Perkin은 문헌(Trans. I, 1993, pages 1713-1714)에서 7개 미만의 탄소 원자를 가지는 다이에스테르에 대한 에스테라제 활성은 배타적으로 순수한 모노에스테르를 유도한다는 것을 보였다(8 또는 그 이상의 탄소 원자를 가지는 다이카르복실산의 에스테르에 대해서는 대사물이 2산이다). 다이에스테르와 모노에스테르 사이의 화학적 시프트는 생체 내에서 기질로부터의 생성물을 식별할 수 있기에 충분하다. 바람직한 다이에스테르는 대칭 다이에스테르, 즉 동일한 에스테르-형성 알킬기를 가지는 것들, 예컨대 석시네이트 다이에틸 에스테르 및 2-옥소글루타레이트 다이에틸 에스테르이다.

일반적으로, 카르복실에스테라제와의 반응시 내인성인 일차 대사 화합물을 제공하는, 즉 발명의 방법이 수행되는 유기체, 조직 또는 세포가 독립적으로 발생시키거나 그것으로부터 유래되는 카르복실에스테르 기질을 사용하는 것이 바람직하다. 따라서, 모노카르복실산의 알킬 에스테르가 바람직하게 사용되고, 그것은 각각의 내인성 산 및 알코올 분자에서 대사되는데, 예를 들면 에틸아세토아세테이트(에탄올 및 아세토아세테이트로 대사됨), 에틸부티레이트(에탄올과 부티르산으로 대사됨), 에틸아세테이트(에탄올과 아세트산으로 대사됨) 또는 에틸파이로글루타메이트(에탄올과 파이로글루탐산으로 대사됨)이 사용된다.

본 발명에서 기질로서 카르복실산의 에스테르를 사용할 때의 추가의 장점은 그것들의 세포 안으로의 흡수가 주로 그것들이 중성 분자로서 세포막을 통해 확산됨으로써 일어난다는 것이다. 그러므로 그것들은 제한 흡수되지 않으며 자체 대사되는 효소의 활성만이 생성되는 과분극화된 생성물의 양에 영향을 미친다. 이것은 본 발명에서 검출된 신호가 카르복실에스테라제의 활성을 대부분 대표하는 것이고, 그로써 상기 기질이 특히 실시간 분자 조영제로서 유용하게 되는 것임을 의미한다. 대조적으로, 모노카르복실산, 예컨대 피루브산과 같은 기질은 제한 흡수된다는 단점을 나타낼 수 있고; 그러므로 그것들의 과분극화된 생성물의 신호는 검출하고자 하는 특이한 효소의 활성을 대표하는 것이 아닐 수 있다.

본 발명의 방법은 비-침습성 방법으로, 생체 내에서 카르복실에스테라제 활성의 실시간 대사적 평가를 허용한다. 상기 활성을 나타내는 영상은 기질의 정맥 내 주사 후 수초 내지 수분 후에 수집된다.

본질적으로, 본 발명에 따르는 MRI 시스템을 작동시키는 방법은 a) 여기된 핵으로부터의 MR 신호를 기록하는 단계; 및 b) 종양 또는 종양으로 추정되는 것으로부터 유도된 첫 번째 MR 신호를 동일한 대상 또는 그것의 샘플로부터 유도된 두 번째 MR 신호와 비교하는 단계를 포함한다.

바람직한 발명의 구체예에서, 상기 종양으로부터 유도된 상기 첫 번째 신호는 상기 두 번째 MR 신호보다 낮다.

본 발명의 한 구체예에서, 상기 단계 d 내지 f에서 알 수 있는 것과 같이, MRI 장치는 상기 첫 번째 신호와 상기 두 번째 신호를 상호 비교하고, 두 신호 간의 차이를 계산하며, 상기 차이를 참조 값과 비교함으로써 상기 신호들을 처리할 수 있고; 상기 단계 g에서 알 수 있는 것과 같이, 만약 이 비교로, 절대값으로, 예정된 값보다 높은 값이 제공된다면, 상기 MRI 장치는 가능한 종양 발생(tumor affection)의 지표를 제공하는 것이다.

종양에 걸린 대상의 항종양 치료법에 대한 반응을 모니터링하기 위해(단계 g') 또는 종양의 공격성을 평가하기 위해(단계 g") 상기 장치를 사용하는 것은 본 발명의 추가의 측면이다.

상기 종양의 예시는 간, 결장, 전립선 및 유방으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 가장 바람직한 종양은 간 종양이다.

본 발명에 따라서, 에스테르는 표적화된 치료법의 마커로서 탐색될 수 있고, 그 경우 표적화된 치료법에 대해 암세포의 발암에 중요한 분자를 표적화하는 것이 의도된다.

본 발명의 방법을 수행함에 있어서, 발명의 방법에 따라 첫 번째 신호(S₁), 두 번째 신호(S₂) 및 참조 값(R)이 적용된다.

전형적으로, 비교할만한 데이터를 얻기 위하여, 발명의 방법에서 얻어진 MR 신호들은 기질로서 사용된 에스테르의 해당하는 신호와 관련하여 표준화된다.

본 발명의 방법이 가능한 종양 발생의 지표를 제공하기 위해 수행될 때, 상기 첫 번째 신호 S₁은 의심되는 종양을 포함한 관심의 영역에서 검출된, 카르복실에스테라제 전환의 과분극화된 대사 산물의 MR 선의 적분과 투여된 기질(과분극화된 ¹³C 에스테르)의 MR 선의 적분 사이의 비율인 한편, 두 번째 신호 S₂는 비-종양 조직에서 계산된 유사한 비율이며; 참조 값 R은 S₂와 같거나, 과분극화된 대사 산물의 신호, 예를 들어 산성 산물이 없을 경우 고려되는 건강한 조직에서 검출되고, R은 동일한 부피의 기질 신호로 나눈 노이즈 표준 편차의 3배로 설정된다. 바람직하게는, 비-종양 조직은 종양을 둘러싸고 있어서, MR 시스템은 종양의 정확한 영상화를 제공할 수 있고, 그것은 수술 개입의 평가를 위해 매우 중요하다.

첫 번째 및 두 번째 MR 신호는 단일 신호로서 얻어지거나 또는 관심의 선택된 영역에서(S₁) 또는 비-종양 조직에서(S₂) 측정된 다수의 각각의 신호(상이한 보셀로부터)의 평균 값으로서 계산될 수 있다.

발명의 한 구체예에서, 상기 첫 번째 신호 및 상기 두 번째 신호는 단일 신호 또는 다수의 신호들의 평균 값 중 어느 하나로서 직접 비교되어 종양 조직에 대한 바람직한 정보를 얻을 수 있다. 발명의 대체 구체예에서, 신호는 매개변수의 이미지를 생성하기 위해 사용될 수 있고, 그 비교는 상기 첫 번째 및 상기 두 번째 신호에 해당하는 이미지의 지대들을 비교함으로써 수행될 수 있다.

본 발명에 따르면, 상기 첫 번째 및 상기 두 번째 신호 사이의 차이가 측정된다. 이 차이(S₁-S₂)는 본 발명의 상이한 범주에 대해 중요하다.

이 차이는 참조 값과 비교되어 상기 참조 값으로부터 상기 차이의 편차(D)를 나타내는 값을 얻을 수 있다:

D = (S₁-S₂)/R.

이 편차가 절대값으로, 예정된 값보다 높은 값을 제공하는 것으로 측정된다면, 이 편차는 발명의 방법의 목적에 따라, 가능한 종양 발생, 항종양 치료법의 효능 또는 종양 공격성의 가능한 종양 영향의 지표를 제공한다.

예를 들어 발명의 한 구체예에서, 상기 예정된 값은 2로 설정될 수 있다; 따라서 만약 계산된 값 "D"가 2와 같거나 2보다 높다면, 이것은 발명의 방법의 목적에 따라 관심의 영역에서 종양이 존재할 가능성, 항종양 치료법의 효능 또는 종양 공격성을 나타내는 것일 수 있다. 바람직하게, 2부터 10의 편차 값 D는 상기 존재, 효능 또는 공격성을 나타내는 것일 수 있고, 보다 바람직한 것은 2부터 20의 편차, 보다 더 바람직한 것은 2 부터 40의 편차, 특히 바람직한 것은 2부터 60의 편차, 최대로 바람직한 것은 2부터 80의 편차, 가장 바람직한 것은 2부터 100 또는 그 이상의 편차이다.

발명의 한 구체예에서, 방법은 종양에 걸린 것으로 의심되거나 종양에 걸린 대상에 대해 수행될 수 있다.

본 발명의 다른 구체예에서, 상기 방법은 항종양 치료가 진행중이거나 수행된 적이 있는 대상에 대해 수행되고, 참조 값은 치료 전에, 중에 또는 후에 측정된 관심의 상기 영역에서 카르복실에스테라제 전환의 과분극화된 대사 산물의 신호이다. 상기에서와 같이, 편차 D가 절대 값으로, 예정된 값보다 높은 것으로 계산된다면(예컨대 2보다 높고, 바람직하게는 상기 표시된 범위 내에 있음), 이것은 항종양 치료의 효능에 대한 지표를 제공한다.

일부 구체예에서, 본 발명은 소위 "개인용 맞춤 의약", 또는 유사하게 의도된 분야에서 사용될 수 있다. 상기에서 설명된 것과 같이, 종양 치료법은 동일한 유형의 종양 및 동일한 항암 치료 프로토콜에 대해서도 그것의 효능에 있어 변수들에 의해 영향을 받는다. 그런 변수들은 환자들에 의한 상이한 개인적 반응들에 기인한다.

본 발명의 방법을 수행하는 것은 종양 치료법의 효능을 모니터링하는 것(후속 조치)과, 그 경우 의사가 그 치료법을 환자에게 맞추는 것을 허용한다.

인간 대상에서 발명의 에스테르를 사용한 전형적인 대사 영상 과정은 1T보다 크거나 같은 자기장에서 수행되어야 한다. 1.5T 또는 그 이상의 장 세기가 바람직한데, 주입된 기질(에스테르)과 관찰된 대사물(산 또는 알코올) 사이의 스펙트럼적 분리가 적용된 장의 세기에 따라 선형으로 축척되기 때문이다. MR 스캐너는 ¹H 외에 ¹³C 신호를 검출할 수 있어야 하지만, 언제나 필수적으로, 표면 또는 내시경의 고주파 코일이 특이한 기관에서 더 좋은 결과를 이루는 것을 허용할 수 있는 것은 아니다. 예를 들어 전립선 조사를 위해, 직장 내 ¹³C는 표준 전체 신체 공명기와 관련된 방법의 민감성을 강력하게 증가시키는 것으로 예상된다. 과분극화된 신호는 전형적으로 에스테르의 종단 완화 속도의 3 내지 5배 정도의 시간 범위에 대해 활용가능하기 때문에, 대사물 MR 과정에 대한 총 획득 시간은 3분을 초과하지 않을 것이다.

단일 보셀 분광학(SVS) 또는 화학적 시프트 영상화(CSI)와 같은 분광학 영상화 시퀀스는 기질로부터 유래하는 신호를 과분극화된 대사 산물로부터 유래하는 신호와 분리하기 위해 사용될 필요가 있다. EPSI와 같은 신속한 분광학적 영상화 시퀀스가 획득을 위해 활용가능한 제한된 시간으로 인해 바람직하다.

충분한 민감성을 제공하기 위한 방법을 위해, 특히 생체 내 용도에 대해, 주입 시점에 적어도 10%의 분극화를 유지하는 것을 허용하는 에스테르 제형 및 용해/수송 프로토콜이 바람직하다. 바람직하게, 적어도 약 20%의 분극화가 유지되고, 보다 바람직하게 적어도 약 30%의 분극화가 유지되며, 보다 더 바람직하게 적어도 약 60%의 분극화가 유지되고, 가장 바람직하게 적어도 약 80%의 분극화가 유지된다.

본 발명은 다음의 실시예에 의하여 한층 더 예시될 것이다.

실시예

다르게 명시되지 않는 경우에도, 다음 실시예에서 사용되는 화학물질 및 시약들은 상업적으로 입수가능하거나 해당 기술분야에 잘 알려져 있는 방법들에 따라 제조될 수 있다.

실시예 1 - 암세포에서 일반적인 카르복실에스테라제 활성

일반적인 카르복실에스테라제 활성을 앞서 기술한 것과 같이(Rudakova, 2011), 카르복실에스테라제 기질 1-나프틸 아세테이트(NA)를 사용하여 분광학적으로 측정하였다. 간단히 설명하면, 초음파 처리된 세포를 1mM의 기질과 함께 150 mM의 포스페이트 완충액(pH 7.5) 중에서 인큐베이션하고, 1-나프톨의 생성을 322nm에서 모니터링한 후 그것의 여기 흡광 계수(2200M^-1cm^-1)로부터 정량하였다. 반응을 10분 동안 30도에서 일어나도록 허용한다. 기질 농도 및 온도를, 그 조건하에서 분석이 선형 행동방식을 보이는 분석이 되도록 선택한다.

다음은 일반적인 에스테라제 검출 분석에 대한 반응 계획도이다:

상이한 기원의 세포들(쥐 간암종, Morris; 인간 간암종, HepG2; 인간 전립선 암종, PC-3; 인간 유방 암종, MCF-7)을 수확하고, 포스페이트 완충액에 10×10⁶ 세포/ml의 농도로 재용해한다.

샘플 조성은 다음과 같았다: 현탁액 중에 923㎕의 포스페이트 완충액(150 mM pH 7.3) + 77㎕의 NA 용액(아세톤 중의 13mM) + 100㎕의 세포. 샘플의 흡광도를 기질 대신 아세톤이 첨가된 참조 샘플에 비교하였다. 에스테라제 활성을 흡광 계수를 사용하여 계산하였다: ε322 = 2200 M^-1cm^-1.

결과

NA는 카르복실에스테라제 CE1과 CE2 둘 다에 대한 기질이기 때문에 이 실시예는 일반적인 카르복실에스테라제 활성이 간 세포에서뿐 아니라 전립선 및 유방 세포에서도 예상했던 것과 같이 발견되는 것을 보여준다(도 1).

간암 세포(쥐 및 인간 기원) 및 전립선암 세포의 카르복실 에스테라제 촉매된 반응에서 에틸 아세토아세테이트를 가수분해하는 능력은 매우 높은데, 측정된 활성은 95mU/1×10⁶ 세포까지이다.

실시예 2. 과분극화된 에틸 [1,3- ¹³ C ₂ ]-아세토아세테이트로 측정된 카르복실에스테라제 활성

2.a. 과분극화된 에틸 [1,3- ¹³ C ₂ ]-아세토아세테이트의 제조

A) 핀란드 라디칼, 카르복실산 형태(0.85mg, 0.82μmol)를 에틸 [1,3-¹³C₂]-아세토아세테이트(48㎕, 50.1mg, 0.378mmol)에 녹였다. 그 용액에 가돌리늄 복합체[[α1,α4,α7-트리스[(페닐메톡시)메틸]-1,4,7,10-테트라아자사이클로도데칸-1,4,7,10-테트라아세테이트(4-)]가돌리네이트(1-)]수소(100μmol/g 용액 1.1mg)의 DMSO 용액을 첨가하였다. 라디칼의 농도 및 가돌리늄의 농도는 각각 17mM과 2.3mM이었다.

B) 30μmol의 용액 A)를 과분극화하였다. 샘플을 5ml의 포스페이트 완충액(40mM, pH 7.3)에 녹였다. 용해 후 pH는 7.3이었다.

2.b. 쥐 간암 세포(Morris 7777) 및 인간 간암 세포(HepG2)에서 과분극화된 에틸 [1,3- ¹³ C ₂ ]-아세토아세테이트로 측정된 카르복실에스테라제 활성

A) 10×10⁶ 세포(쥐 간암 세포(Morris7777) 또는 인간 간암 세포(HEP-G2))를 수확하고, 500ml의 포스페이트 완충액(PBS)에 다시 녹였다. 현탁액 중의 세포를 10mm NMR 튜브에 옮기고 37℃의 14.1 T 마그넷에 연결용 튜브를 사용하여 놓았다.

B) 2ml의 용해된 과분극화된 에틸 [1,3-¹³C₂]-아세토아세테이트를 연결 라인(불용 부피 1ml)을 통해 주입하여 결과적으로 총 기질 농도는 3.5mM이었다. 30도 펄스 시리즈를 매 2초마다 획득하였다(총 56회 주사). 획득은 과분극화된 기질의 주입 직전에 시작하였다.

결과

쥐 및 인간 간암에서 생성된 과분극화된 1,3-¹³C₂-아세토아세테이트 음이온의 카운트를 도 2에서 찾아볼 수 있다.

이 실험으로부터 전체 Morris7777 및 전체 HepG2 세포에서 과분극화된 에틸 [1,3-¹³C₂]-아세토아세테이트의 가수분해로부터 유발되는 생성물, 과분극화된 에틸 [1,3-¹³C₂]-아세토아세테이트 음이온의 증가가 이어지는 것이 가능한 것을 인지할 수 있다.

실시예 3. 간암 세포에서 과분극화된 에틸 [1,3- ¹³ C ₂ ]-아세토아세테이트의 대사와 과분극화된 [1- ¹³ C]-피루베이트의 대사 사이의 비교

동일한 양(30μmol)의 화합물에서 에틸 [1,3-¹³C₂]-아세토아세테이트와 [1-¹³C]-피루브산의 공동 분극화로 실험을 수행하여, 실험에서 각각 대략 3.5mM의 기질 농도를 유발하였다. 에틸 [1,3-¹³C₂]-아세토아세테이트의 DNP 제조를 실시예 2.a.에서 설명한 것과 같이 수행하였고, [1-¹³C]-피루베이트의 DNP 제조를 WO 2006/011809에서 기술되어 있는 것과 같이 수행하였다. 두 개의 기질을 기질 혼합 없이 공동 분극화하였다. 5ml의 포스페이트 완충액(40mM, pH 7.3)에 용해시킨 후 2.5㎕의 NaOH를 첨가하여 피루브산을 중화시켰고(그것은 피루베이트 음이온 형태로 전환된다), 기질 혼합물을 현탁액 중의 10×10⁶ 세포에 주입하였다. 실험을 실시예 2.b.에서 설명한 것과 같이 수행하였다. 데이터를 유닛을 얻기 위해 첫 번째 스펙트럼의 기질 신호로 나누고 100을 곱한 대사물의 곡선 아래의 구역으로서 나타내고, DNP 전환을 백분율로 표시한다(도 3).

결과

쥐 간암종 Morris 세포에서의 세포 실험에서 두 개의 표지된 탄소 원자들을 첨가함으로써 유발된 [1,3-¹³C₂]-아세토아세테이트 음이온에 대한 신호의 양은 DNP의 [1-¹³C]-락테이트 음이온에 대한 신호의 대략 2배이다. 이것은 기질의 분극화 수준과 T1 완화의 차이가 적용된 실험 조건 하에서 아주 조금 중요하거나 거의 중요하지 않기 때문에 두 개의 기질의 유사한 턴오버를 가리킨다. 유사한 비교를 인간 간암 세포(HepG2)에서도 시행하였다. 대사물, [1-¹³C]-락테이트 음이온과 [1,3-¹³C₂]-아세토아세테이트 음이온에 대한 과분극화된 신호의 상대적인 양은 이 경우에 더 크다, 도 3.

실시예 4. 쥐 암세포에서 과분극화된 에틸 [1,3- ¹³ C ₂ ]-아세토아세테이트와 과분극화된 [1- ¹³ C]-피루베이트의 농도 의존성 대사

모든 실험을 동일한 양의 화합물(대략 10, 30 및 90μmol)에서 에틸 [1,3-¹³C₂]-아세토아세테이트와 [1-¹³C-피루브산]의 공동 분극화로 수행하였고, 그 결과 실시예 3에서 기술한 것과 같이 고체 용액을 녹이고 중화시킨 후에 각각의 기질의 대략 1, 3.5 및 10mM의 실험 농도를 얻었다. 모든 실험에서 10×10⁶ 세포를 사용하였다. 실시예 2.b로부터의 실험 설정을 적용하였다. 데이터를 기질 또는 대사물 신호 중 어느 하나의 최대 피크 세기로서 나타낸다.

결과

도 4는 증가하는 농도의 에틸 아세토아세테이트(EAA) 및 피루베이트으로부터의 해당하는 더 높은 기질 신호를 나타낸다. 마찬가지로 결과적으로 대사물([1,3-¹³C₂]-아세토아세테이트 음이온(AA) 및 [1-¹³C]-락테이트 음이온)의 측정된 양의 변화는 증가하는 기질 농도와 함께 나타낸다. 에틸 아세토아세테이트로부터 유발되는 대사물 신호는 기질 농도의 증가와 함께 거의 정량적으로 증가한다. 대조적으로, 락테이트 신호는 3mM에서 10mM로 변화하지 않은 채로 유지되고, 그것은 흡수 한계 또는 그렇지 않으면 피루베이트가 기질일 때 세포 대사 한계를 시사한다.

실시예 5. 쥐 및 인간 혈액에서 과분극화된 에틸 [1,3- ¹³ C ₂ ]-아세토아세테이트와 과분극화된 [1- ¹³ C]-피루베이트의 대사 사이의 비교

모든 실험을 동일한 양의 화합물(90μmol)에서 에틸 [1,3-¹³C₂]-아세토아세테이트와 [1-¹³C]-피루베이트의 공동 분극화로 수행하였고, 그 결과 실시예 3에서 기술한 것과 같이 고체 용액을 녹이고 중화시킨 후에 각 기질의 대략 5mM의 실험 농도를 얻었다. 모든 실험에서 2.5ml의 인간 혈액 또는 2.5ml의 쥐 혈액을 사용하였다. 실시예 2.b로부터의 실험 설정을 적용하였다. 데이터를 유닛을 얻기 위해 첫 번째 스펙트럼의 기질 신호로 나누고 100을 곱한 대사물의 곡선 아래의 구역으로서 나타내고, DNP 전환을 백분율로 표시한다.

결과

도 5 및 6에서, 인간(도 5) 및 쥐(도 6) 전혈 중의 락테이트 탈수소효소(LDH) 활성을 카르복실 에스테라제 활성의 그것과 비교한다.

이들 실험에 적용된 실험적 조건 하에서, 대사물 신호의 증가는 인간 혈액 중의 에틸 아세토아세테이트로부터 측정할 수 없었던 한편, 에틸 아세토아세테이트의 전환은 쥐 혈액에서 나타난다. 락테이트의 증가는 쥐 및 인간 전혈 둘 다에서 상당하고, 두 가지 매트릭스에서 모두 에틸 아세토아세테이트의 전환보다 더 높다. 두 가지 상이한 실험에서 세포 크기 및 세포의 양의 차이로 인해 혈액 대 암세포 중에서의 상대적인 전환에 대한 정량적인 비교는 이루어질 수 없다. 비록 카르복실 에스테라제가 쥐 혈액에서 소량으로 발견되고 인간 혈액에서는 더 낮은 양으로 발견될 수 있지만, 혈액으로부터 유발되는 것에 의한 조직에서 측정된 대사물 신호의 오염은 사소하고 모든 경우에 그것이 기질로서 [1-¹³C]-피루베이트를 사용할 수 있게 되는 것보다 덜 중요한 것으로 예상된다.

실시예 6. 상이한 에틸 에스테르에 대한 카르복실 에스테라제 활성의 비교

실험을 돼지의 간으로부터 상업적으로 입수가능한 CE1으로 수행하였다. 기질로서 사용된 에틸 에스테르는 에틸 아세토아세테이트(EAA); 에틸 아세테이트(EA); 에틸 부티레이트(EB); 에틸 파이로글루타메이트(EPG); 에틸 피루베이트(EP); 다이에틸 석시네이트(DES)이다.

각각의 기질 샘플을 모두 다음의 방식으로 만들었다: 26μmol을 에펜도르프 튜브에서 무게를 측정하였다. 550㎕의 변성된 포스페이트 완충액(200mM, pH 7.5)을 첨가하고 기질을 소용돌이로 혼합함으로써 용액으로 만들었다. 그 용액을 5mm의 NMR 튜브에 넣고 37℃의 분광기에 삽입하였다. 참조 실험을 효소가 없는 기질에 대해 얻은 후 10㎕의 에스테라제 스톡 용액(변성된 포스페이트 완충액 중의 37U/ml)을 튜브의 상부에 첨가하였다. 샘플을 혼합하고 다시 분광기로 복귀시켰다. 일련의 열적 1D 1H NMR 실험을 매 5분마다 60분 동안 기록하였다. 데이터를 분석하고 첫 번째 스펙트럼의 기질 신호의 피르 세기에 대해 축척된 생성물의 피크 세기로서 나타낸다.

결과

조사한 모든 에스테르는 CE1에 대한 기질이었지만, 매우 상이한 턴오버 속도를 나타낸다, 도 7. 전체적으로 가장 빠르게 전환된 기질은 다이에틸 석시네이트였고, 그것은 에틸 부티레이트 및 에틸 아세토아세테이트보다 거의 2배 더 빠르게 전환되었으며 에틸 아세테이트보다 10배 더 빠르게 전환되었다. 다이에틸 석시네이트에서는 단지 하나의 에스테르기만이 가수분해된다; 모노-에스테르는 CE1에 대한 기질이 아니다. 파이로글루타메이트의 에틸 에스테르의 전환은 겨우 검출되었고, 에틸 피루베이트로 측정될 수 있는 모든 것에서는 전환이 없었다.

실시예 7. Morris7777 종양이 이식된 쥐 간에서 생체 내에서 과분극화된 에틸 [1,3- ¹³ C ₂ ]-아세토아세테이트로 측정된 카르복실에스테라제 활성

4마리의 마취된 Buffalo 쥐에 간 좌엽의 간성 협막 아래에 0.2ml의 둘베코 변형 이글스 배지(DMEM) 배지 중에 현탁된 10×10⁶개의 McA-RH7777 세포를 주입하였다.

실시예 2.a의 설명을 따라 만들어진 0.24mmol의 에틸 [1,3-¹³C₂]-아세토아세테이트 샘플을 과분극화하였다. 그 샘플을 100mg/l의 EDTA를 첨가한 5ml의 TRIS 완충액(40mM, pH 7)에 녹였다. 용해 후의 pH는 7.5였다.

각각의 동물에 2.8ml의 양의 용해된 과분극화된 에틸 [1,3-¹³C₂]-아세토아세테이트를 정맥 내로, 약 0.25mL/초의 주입 속도로 동물의 꼬리 정맥에 위치한 카테테르를 통해 주입하였고(불용 부피 0.3ml), 그 결과 총 0.4mmol/kg의 용량을 투여하였다. 화학적 시프트 영상(CSI) 지도를 쥐의 복부 영역에 위치한 대략 8mm의 관상 슬라이스 상에서 얻었다. 평면에서 시야는 40×55mm²으로 설정하였고, 해당 매트릭스 크기는 14×14였다. 나머지 획득 매개변수는 다음과 같이 설정하였다: RF 플립각 - 5°, 보유시간 = 105ms. 획득은 에틸 [1,3-¹³C₂]-아세토아세테이트의 주입이 끝났을 때 시작하였고 20초 후에 끝났다.

결과

도 8에서, 각각의 Morris 간세포 암종 내포 쥐에 대한 에틸 아세토아세테이트의 분포의 CSI 지도가 도시된다. 에틸 아세토아세테이트는 주로 종양 덩어리에서 관찰된다. 도 9는 종양 덩어리 및 간에 위치한 관심의 영역에 대해 평균화된 해당하는 ¹³C 스펙트럼을 도시한다. 도 10은 도 9에서 나타낸 것과 같이 보셀-평균 스펙트럼으로부터 계산된, 간과 종양에서 에틸 아세토아세테이트 및 아세토아세테이트 음이온의 피크 구역 사이의 비율의 데이터 분포(4마리위 쥐에 대한)를 나타낸다.

모든 실험 관찰결과는 암조직과 관련하여 정상적인 간세포에서 더 빠른 에틸 [1,3-¹³C₂]-아세토아세테이트의 전환이 일어났음을 나타낸다. 건강한 조직과 병든 조직 사이의 상이한 대사 활성의 존재는 과분극화된 에틸 [1,3-¹³C₂]-아세토아세테이트의 투여 후에 CSI 획득에 의해 간세포 암종 쥐 모델에서 종양 덩어리의 진단을 허용한다.

실시예 8. 건강한 간 및 간암에서 에틸 [1,3- ¹³ C ₂ ]-아세토아세테이트의 전환을 예시하는 생체 내 ¹³ C MRS 데이터

1×10⁶개의 McA-RH7777 세포를 0.2ml의 둘베코 변형 이글스 배지(DMEM) 배지에 현탁하고, 마취된 Buffalo 쥐의 간 좌엽의 간성 협막 아래에 주입하였다.

실시예 2.a의 설명을 따라 만들어진 0.24mmol의 에틸 [1,3-¹³C₂]-아세토아세테이트 샘플을 과분극화하였다. 그 샘플을 100mg/l의 EDTA를 첨가한 5ml의 TRIS 완충액(40mM, pH 7)에 녹였다. 용해 후의 pH는 7.5였다.

2.8ml의 양의 용해된 과분극화된 에틸 [1,3-¹³C₂]-아세토아세테이트를 정맥 내로, 약 0.25mL/초의 주입 속도로 동물의 꼬리 정맥에 위치한 카테테르를 통해 주입하였고(불용 부피 0.3ml), 그 결과 총 0.4mmol/kg의 용량을 투여하였고 기질 농도는 48mM이었다.

총 8마리의 동물을 이 연구에 사용하였다. 4마리의 쥐에는 종양을 이식하였고(즉 종양 그룹), 한편 나머지 동물은 동일한 계통에 대해 건강한 조직과 병든 조직 사이를 비교하기 위하여 대조표준으로서 사용하였다(즉 간 그룹). 주입된 에틸 [1,3-¹³C₂]-아세토아세테이트의 대사 운명은 종양 또는 건강한 간 조직의 어느 하나의 선택적 획득을 허용하는 국한된 분광기 순서에 의해 이어졌다. 획득은 과분극화된 기질의 주입 직전에 시작하였고, 3초의 속도로 샘플화된 일련의 64회-도메인 포인트로 구성되었다. 적용된 플립각은 10도였다.

결과

과분극화된 에틸 [1,3-¹³C₂]-아세토아세테이트는 건강하거나 병든 간 세포 둘 다에 의해 흡수되고, DNP 실험의 시간 척도에 대해, 그것의 과분극화된 대사물, [1,3-¹³C₂]-아세토아세테이트 음이온으로 전환된다. 과분극화된 에틸 [1,3-¹³C₂]-아세토아세테이트의 그것의 대사물로의 부분적인 전환과, 궁극적으로는 그것의 T₁ 완화 속도에 따른 감쇠로 인해, 과분극화된 기질의 신호는 감쇠인 한편, 그것의 과분극화된 대사 산물의 신호는 증가이다.

과분극화된 기질(에틸 [1,3-¹³C₂]-아세토아세테이트) 신호의 더 빠른 감소는 암조직과 관련하여 건강한 간에서 관찰된 대사물 신호의 더 높은 증가 속도(전형적으로 ≥2)와 함께, 정상적인 간 대 병든 조직에서 더 높은 전환율 및 계속해서 더 큰 에스테라제 활성을 가리킨다. 그러므로, 건강한 조직과 병든 조직 사이의 상이한 대사 활성의 존재는 과분극화된 에틸 [1,3-¹³C₂]-아세토아세테이트의 투여 후에 국한된 동적 ¹³C 분광학을 통해 강조될 수 있다.

Claims (18)

1. 종양의 ¹³C-MR 조사에 사용하기 위한 모노카르복실산의 과분극화된 ¹³C 에스테르 또는 (C₁-C₇)다이카르복실산의 과분극화된 ¹³C 다이에스테르로서, 상기 조사에서 에스테르 또는 다이에스테르의 카르복실에스테라제 전환의 해당하는 과분극화된 일차 대사 산물의 신호가 검출되는 과분극화된 ¹³C 에스테르.
2. 제 1항에 있어서, 상기 에스테르는 (C₁-C₇)모노카르복실산의 에스테르인 것을 특징으로 하는 과분극화된 ¹³C 에스테르.
3. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 에스테르 또는 다이에스테르는 에틸 에스테르 또는 다이에스테르인 것을 특징으로 하는 과분극화된 ¹³C 에스테르.
4. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 에스테르는 에틸 아세토아세테이트인 것을 특징으로 하는 과분극화된 ¹³C 에스테르.
5. 제 4항에 있어서, 상기 해당하는 일차 과분극화된 대사 산물은 아세토아세테이트 음이온인 것을 특징으로 하는 과분극화된 ¹³C 에스테르.
6. 모노카르복실산의 과분극화된 ¹³C 에스테르 또는 (C₁-C₇)다이카르복실산의 과분극화된 ¹³C 다이에스테르를 포함하는 영상 매질이 투여되었던 환자에 대해 종양의 ¹³C-MR을 조사하는 진단 방법으로서, 상기 방법은 상기 에스테르 또는 다이에스테르의 카르복실에스테라제 전환의 해당하는 과분극화된 일차 대사 산물의 신호를 검출하는 것을 포함하는 방법.
7. 제 6항에 있어서, 상기 과분극화된 ¹³C 에스테르는 모노-카르복실산의 에스테르인 것을 특징으로 하는 방법.
8. 제 6항 또는 제 7항에 있어서, 상기 에스테르 또는 다이에스테르는 에틸 에스테르 또는 다이에스테르인 것을 특징으로 하는 방법.
9. 제 8항에 있어서, 상기 과분극화된 ¹³C 에스테르는 에틸 아세토아세테이트인 것을 특징으로 하는 방법.
10. 제 9항에 있어서, 상기 해당하는 일차 과분극화된 대사 산물은 아세토아세테이트 음이온인 것을 특징으로 하는 방법.
11. 모노카르복실산의 과분극화된 ¹³C 에스테르 또는 (C₁-C₇)다이카르복실산의 과분극화된 ¹³C 다이에스테르를 포함하는 영상 매질을 사용하는 ¹³C-MR 조사 방법으로서, 그 방법으로 카르복실에스테라제 전환의 해당하는 과분극화된 일차 대사 산물의 신호가 검출되고, 상기 신호는 대사 프로필을 작성하는 데 사용되며, 상기 대사프로필은 종양의 조사에 사용되는 방법.
12. a. MRI 시스템에 배치되고 모노카르복실산의 과분극화된 ¹³C 에스테르 또는 (C₁-C₇)다이카르복실산의 과분극화된 ¹³C 다이에스테르를 투여받았으며, 종양의 영향을 받거나 받았을 것으로 의심되는 대상을 ¹³C 핵에서 핵 스핀 전이를 일으키도록 선택된 주파수를 가지는 방사선에 노출시키고, 이때 상기 에스테르 또는 다이에스테르는 카르복실에스테라제 전환의 해당하는 과분극화된 대사 산물로 대사적으로 전환되는 단계;
    b. 상기 여기된 핵으로부터 MR 신호를 기록하는 단계;
    c. 상기 종양 또는 상기 의심되는 종양을 포함하는 관심의 영역으로부터 유도된 첫 번째 MR 신호를 상기 대상으로부터 또는 상기 대상으로부터 취한 샘플로부터 유도된 두 번째 MR 신호와 비교하는 단계
    를 포함하는, MRI 시스템의 작동 방법.
13. 제 12항에 있어서,
    a. 상기 첫 번째 신호와 두 번째 신호 사이의 차이를 측정하는 단계;
    b. 상기 a)의 차이를 참조값과 비교하여 편차값을 생성하는 단계;
    c. 편차값이, 절대값으로, 예정된 값보다 더 높은지를 측정하는 단계를 더 포함하는 방법.
14. 제 13항에 있어서, 상기 두 번째 신호는 비-종양 조직에 대해 측정되고, 다음의 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법:
    d. 편차 값이, 절대값으로, 상기 예정된 값보다 높은 경우에 가능한 종양 발병의 지표를 제공하는 단계.
15. 제 14항에 있어서, 상기 지표는 종양의 위치를 제공하기 위해 사용되는 것을 특징으로 하는 방법.
16. 제 12항 내지 제 15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 첫 번째 신호는 카르복실에스테라제 전환의 과분극화된 대사 산물의 신호와 투여된 에스테르 또는 다이에스테르의 신호 사이의 비율인 것을 특징으로 하는 방법.
17. 제 12항 내지 제 16항 중 어느 한 항의 방법을 수행하는 MRI 시스템.
18. 종양의 존재의 지표를 제공하기 위해 사용되는 제 17항의 시스템의 용도.

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