KR20190115073A - 도데카펩타이드의 개선된 제조 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 부산물의 형성을 최소화하는 서열번호 1의 도데카펩타이드 NX210의 개선된 제조 방법에 관한 것이다.
Description
본 발명은 펩타이드 NX210의 제조 방법에 관한 것이다.
NX210은, SCO-스폰딘 (SCO-spondin)에서 발견되는 트롬보스폰딘 타입 1 리피트 (thrombospondine type 1 repeat, TSR)의 가장 보존된 서열로부터 유래된 서열 Trp-Ser-Gly-Trp-Ser-Ser-Cys-Ser-Arg-Ser-Cys-Gly (W-S-G-W-S-S-C-S-R-S-C-G, 서열번호: 1)로 된 도데카펩타이드로서, 세포 생존 촉진력과 더불어, 이의 세포 분화 및 신경 증식 능력으로 인한, 신경 장애를 치료하기 위한 후보 물질이다.
NX210은, 수개의 시스테인을 함유한 올리고펩타이드 및 폴리펩타이드로서, 올리고머화를 거치며, 보다 구체적으로는 분자내 고리화를 거친다. 이러한 후자 반응으로 NX210과는 구분되는 생물학적 특성을 가진 고리화된 대사산물 (시스테인 2개 사이에 이황화 결합을 함유한 NX218)이 형성된다.
허용가능한 품질의 산물을 수득하기 위한 제조 방법은, 합성 불순물의 존재가 약물 제품의 효능 또는 안전성에 심각한 영향을 미칠 수 있기 때문에, 특히 주사용 약물의 경우에는 매우 중요하다. 따라서, 의약품은 상당히 고 순도이어야 하며, 임의의 이차 산물들이 정확하게 규명되어야 한다. 그래서, 보건 당국에 의해 부여된 규칙은 환자 안전이라는 명백한 이유로 매우 엄격하다.
NX210은 펩타이드 합성시 문제가 되는 것으로 알려진 아미노산들로 이루어져 있다: 시스테인 잔기는 티올 관능기가 자유롭게 되면 전술한 올리고머화 및 고리화를 수행할 수 있으며; 시스테인 및 트립토판은 펩타이드를 트리플루오로아세트산으로 탈보호하는 동안에 노출되는 조건 등의 산성 조건에 민감하며; 통상적인 아르기닌 잔기의 측쇄 보호기 (예, 2,2,5,7,8-펜타메틸-크로만-6-설포닐 (pmc)) 또는 4-메톡시-2,3,6-트리메틸벤젠설포닐 (Mtr))는, 탈보호시, 다른 아미노산의 측쇄와 반응할 수 있는 고도의 반응성 중간산물을 유도하여, 다른 아미노산과 함께 사용할 수 없는 반응 시간을 필요로 한다.
이러한 문제가 되는 아미노산을 함유한 올리고펩타이드를 합성하는데에는, 펩타이드의 분해는 피하면서도 전체 아미노산의 측쇄를 탈보호할 수 있는, 다소 복합적인 절단 칵테일 (즉, 시약을 다수 또는 수종 포함하는)이 필요하다.
예를 들어, 다음과 같은 칵테일을 제조할 수 있다:
●
트리플루오로아세트산 (88% v/v), 페놀 (5% v/v), 물 (5% v/v) 및 트리이소프로필실란 (2% v/v)으로 된 혼합물 (시약 B),
●
트리플루오로아세트산 (81% w/w), 페놀 (5% w/w), 티오아니솔 (5% w/w), 1,2-에탄다이티올 (2.5% w/w), 물 (3% w/w), 다이메틸 설파이드 (2% w/w) 및 요오드화암모늄 (1.5% w/w)으로 된 혼합물 (시약 H),
●
트리플루오로아세트산 (82.5% v/v), 페놀 (5% v/v), 물 (5% v/v), 티오아니솔 (5% v/v) 및 1,2-에탄다이티올 (2.5% v/v)로 된 혼합물 (시약 K),
●
트리플루오로아세트산 (88% v/v), 트리이소프로필실란 (2% v/v), 1,4-다이티오트레이톨 (5% w/v) 및 물 (5% w/w)로 된 (냄새가 미미한) 혼합물 (시약 L),
●
트리플루오로아세트산 (90% v/v), 티오아니솔 (5% v/v), 1,2-에탄다이티올 (3% v/v) 및 아니솔 (2% v/v)로 된 혼합물 (시약 R).
이상적으로는, 사용되는 칵테일은 또한 펩타이드가 고상 합성 서열 말단에 부착된 수지로부터 펩타이드를 절단할 수 있어야 한다.
문제성 아미노산을 다수개 함유한 NX210과 같은 폴리펩타이드의 경우, 특히 최종 산물의 순도를 면밀하게 관리하여야하는 경우에는, 탈보호 칵테일의 선정은 사소한 일이 아니다.
이와 더불어, 펩타이드의 제조시 펩타이드의 이량화 및/또는 올리고머화를 최소화할 수 있는 조건이 매우 요망된다.
본 발명의 제1 과제는 NX210의 고리 형태의 형성을 제한할 수 있는 NX210 분리 방법에 관한 것이다.
본 발명의 제2 과제는 최종 탈보호 단계에 적합한 측쇄 상의 보호기, 특히 NX210의 올리고머 또는 NX210는 고리 형태 (NX218이라고 함)의 형성을 제한할 수 있는 보호기를 가진 아미노산을 사용하는 것을 특징으로 하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 제3 과제는 NX210의 고리 형태의 형성을 제한할 수 있는 NX210 분리 방법에 관한 것이다.
당해 기술 분야의 당업자들에게 잘 알려진 바와 같이, 방법의 모든 단계들은 (달리 언급되지 않은 한) NX210의 시스테인의 황 원자의 산화를 방지하기 위해 불활성 분위기 하에 수행된다.
제1 구현예에서, 본 발명은, 서열번호 1의 펩타이드가 서열번호 1의 펩타이드의 정제 단계, 선택적인 농축 단계 및 건조 단계 내내 유기 용매를 포함하는 수용액 내에서 계속 유지되며; 상기 건조 단계가 유익하게는 동결-건조 또는 분무-건조에 의해 수행되는 것을 특징으로 하는, 서열번호 1의 펩타이드의 제조 방법에 관한 것이다.
또한, 본 발명은, 서열번호 1의 펩타이드의 정제 단계 및/또는 건조 단계, 유익하게는 동결-건조 또는 분무-건조에 의한 건조 단계가 유기 용매를 포함하는 수용액 내에서 수행되는 것을 특징으로 하는, 서열번호 1의 펩타이드의 제조 방법에 관한 것이다.
본 발명자들은, 전혀 예상치못한 방식으로, 서열번호 1의 펩타이드의 정제 단계 및 건조 단계에서 서열번호 1의 펩타이드를 함유한 수용액 내에 유기 용매가 존재하는 것이, 부산물, 특히 서열번호 1의 펩타이드의 고리 형태가 형성되는 것을 방지함을 입증하였다.
본 발명의 의미에서, i) "서열번호 1의 펩타이드가 정제 단계, 선택적인 농축 단계 및 건조 단계 내내 유기 용매를 포함하는 수용액 내에서 계속 유지되며; 상기 건조 단계가 유익하게는 동결-건조 또는 분무-건조에 의해 수행된다"는 것과, ii) "서열번호 1의 펩타이드의 정제 단계 및/또는 건조 단계, 유익하게는 동결-건조 또는 분무-건조에 의한 건조 단계가 유기 용매를 포함하는 수용액 내에서 수행된다"는 것은, 고상 합성 및 선택적인 석출 이후에, 서열번호 1의 펩타이드가, 특히 이의 염 형태로 용해된 용액에 항상 유기 용매가 함유된다는 것을 의미한다.
이는, 특히, 서열번호 1의 펩타이드를 함유한 수용액의 부피를 줄이고자 하는 임의 단계는, 유기 용매가 전부 수용액으로부터 제거되기 전에, 중단되어야 함을 의미한다.
유익하게는, 수용액에 함유된 유기 용매는 아세토니트릴이다.
본 발명에 따른 방법에서, 아세토니트릴은 정제 단계 동안에, 특히 펩타이드의 크로마토그래피 정제시 이동상으로서 이용될 수 있으며, 서열번호 1의 펩타이드의 이량체화를 줄일 수 있으므로, 선택 용매는 아세토니트릴이다.
수용액 내 유기 용매, 특히 아세토니트릴의 부피는, 유익하게는, 정제 및 선택적인 농축 단계 동안에, 수용액의 총 부피의 1 내지 90%, 특히 1 내지 10%의 비율이 되도록, 유지 및/또는 조절된다. 바람직하게는, 수용액은 유기 용매, 특히 아세토니트릴을 약 5%로 포함한다.
유익하게는, 동결-건조 또는 분무-건조에 의해 건조시킬 수용액 내 유기 용매, 특히 아세토니트릴의 부피는, 수용액의 총 부피의 1 내지 30%, 특히 1 내지 10%, 바람직하게는 약 5%의 비율이 되도록, 유지 및/또는 조절된다.
본 발명의 맥락에서, "건조시킬 수용액"은 정제 단계 이후의 서열번호 1의 펩타이드를 함유한 수용액이다. 이는 건조 단계를 거치는 수용액을 정의한다.
제2 구현예에서, 본 발명은 하기 단계들을 포함하는 전술한 방법에 관한 것이다:
a)
Fmoc-Gly 잔기를 수지에 그래프팅 (grafting)하는 단계,
b)
측쇄가 보호된 Fmoc-보호된 아미노산으로 펩타이드 체인을 연장하는 단계,
c)
아미노산 측쇄의 탈보호 및 수지로부터 폴리펩타이드의 절단을 동시에 실시하여, 서열번호 1의 폴리펩타이드를 수득하는 단계,
d)
선택적으로, 서열번호 1의 펩타이드를 석출시키는 단계,
e)
서열번호 1의 펩타이드의 정제 단계 및 선택적인 농축 단계,
f)
단계 e)에서 수득한 서열번호 1의 펩타이드의 건조 단계로서, 유익하게는 동결-건조 또는 분무-건조에 의한 건조 단계.
첫번째 글리신 잔기는 단계 a)에서 당해 기술 분야의 당업자들에게 공지된 사실상 임의 수지에, 예를 들어, 왕 수지 (Wang resin) 또는 개질된 왕 수지에 그래프팅될 수 있다.
유익하게는, 수지는 4-메틸벤즈하이드릴아민 기를 포함하는 다이비닐벤젠-가교된 폴리스티렌 수지이며, 그 이유는 덜 가혹한 조건에서 펩타이드를 절단할 수 있기 때문이다. 이러한 가교된 수지는 당해 기술 분야의 당업자들에게 공지되어 있으며, 예를 들어, Peptides: Chemistry and Biology, 2nd Edition (DOI: 10.1002 / 9783527626038)와 같은 간행물에 기술되어 있다. 이들 수지는 상업적으로 구입가능하며, 예를 들어, Sigma-Aldrich 또는 Polypeptide Laboratories 등의 공급사로부터 구입가능하다. 링커, 선택적으로 첫번째 아미노산에 의해 직접 관능화된 수지 역시 상업적으로 입수가능할 수 있다.
유익하게는, 첫번째 글리신 잔기는 스페이서 (spacer)를 경유하여 수지 상에 그래프팅된다. "스페이서"는 본 발명의 의미에서 첫번째 아미노산의 카르보닐 기와 수지 사이에 위치한 체인을 의미한다.
보다 유익하게는, Fmoc-Gly 잔기는 통상적인 반응 조건 하에 메틸페녹시프로피온산 (MPPA) 스페이서에 의해 카르보닐 관능기를 통해 수지에 그래프팅된다. 다른 구현예로, 하이드록시메틸페녹시아세트산 (HMPA) 스페이서가 MPPA 대신 사용될 수 있다.
첫번째 잔기가 수지에 고정되면, (측쇄 상에) 보호된 서열번호 1의 도데카펩타이드가 수득될 때까지, (Fmoc 기의 탈보호) / (아민 상의 Fmoc 기와 측쇄 상의 보호기에 의해 보호된 아미노산과의 커플링) / 정제 순서로 이루어진 반복적인 방법을 이용함으로써, 합성한다.
이러한 반복적인 펩타이드 합성 방법은 당해 기술 분야의 당업자들에게 널리 공지된 통상적인 조건, 예를 들어, 본원의 실시예에 기술된 조건 하에서 수행될 수 있다. 특히, DIC / HOBt 시스템을 사용해 펩타이드 커플링을 수행할 수도 있다. Fmoc 기의 탈보호는 유익하게는 다이이소프로필에틸아민 (DIPEA)을 이용해 수행된다.
일 구현예에서, 아미노산은 특정 기로 보호된 자체 측쇄를 가진다. 앞서 설명한 바와 같이, 적절한 보호기의 선택은 펩타이드 합성에서 사소한 일이 아니다.
유익하게는, 본 발명은:
ㆍ
Arg 측쇄의 보호기가 2,2,4,6,7-펜타메틸다이하이드로벤조푸란-5-설포닐이고,
ㆍ
Cys 측쇄의 보호기가 트리틸이고,
ㆍ
Ser 측쇄의 보호기가 t-부틸이고,
ㆍ
Trp 측쇄의 보호기가 t-부톡시카르보닐인, 전술한 방법에 관한 것이다.
이러한 특정 보호기를 이용함으로써, 수지로부터 탈보호 및 절단 단계가 효율적으로 수행될 수 있다는 것이, 확인되었다.
수지에 결합된 보호된 도데카펩타이드는 이후 수지의 C-말단 아미노산의 절단과 이를 구성하는 아미노산 측쇄의 탈보호를 동시에 수행할 수 있게 하는, 반응 조건에 노출된다. 예상치못하게도, 잠재적으로 문제가 되는 아미노산이 존재함에도 불구하고도, 아미노산 측쇄의 탈보호와 동시적인 폴리펩타이드의 수지로부터의 절단은, 시약으로서, 트리플루오로아세트산, 물 및 1,4-다이티오트레이톨을 함유한 혼합물을 이용해 구현될 수 있다는 것이, 입증되었다. 유익하게는, 이 혼합물은 혼합물의 총 중량을 기준으로 트리플루오로아세트산 85 - 95 중량%, 1,4-다이티오트레이톨 3 - 10 중량% 및 물 100 중량% 이하로 구성된다.
탈보호 및 수지로부터의 절단 후, 반응 매질은 서열번호 1의 펩타이드, 절단 시약, 탈보호 시약 및 탈보호 단계로부터 기인한 부산물을 포함한다.
산물은 크로마토그래피 방법에 의해 직접 정제하거나, 또는 하나 이상의 정제 단계를 거친 다음 선택적으로 크로마토그래피 방법에 의해 정제할 수 있다.
유익한 구현예에서, 서열번호 1의 펩타이드를 포함하는 혼합물은 석출 단계를 거친다. 서열번호 1의 펩타이드의 제조와 관련하여, 에테르와 같이 통례적으로 사용되는 용매는 서열번호 1의 펩타이드의 조산물의 분리를 어렵게 하는 겔을 형성시키는 것으로 입증되었다. 본 발명자들은, 에테르, 특히 메틸-tert-부틸 에테르 (MTBE)와 알칸, 특히 헵탄의 혼합물을 사용하는 것이 서열번호 1의 펩타이드를 부분적으로 정제가능하게 함을, 확인하였다. 유익하게는, 에테르와 알칸의 1:1 혼합물이 사용된다. 더 유익하게는, 헵탄과 MTBE의 1: 1 비율의 혼합물이 사용된다.
전술한 바와 같이, 단계 c) 또는 단계 d) 종료 후, 바람직하게는 석출 단계 d) 이후에 수득되는 서열번호 1의 펩타이드는, 이후 정제 단계를 거친다. 정제는, 환자에게 향후 투여하기에 충분한 순도를 가진 산물이 수득되는 한, 당해 기술 분야의 당업자들에게 공지된 임의 수단에 의해, 수행될 수 있다.
유익하게는, 정제 단계는 하나 이상의 분취용 역상 크로마토그래피 (preparative reverse phase chromatography)에 의해 달성된다. 조건 (즉, 정지상, 이동상, 유속)은 당해 기술 분야의 당업자에 의해 결정될 수 있다. 분취용 크로마토그래피는 환자에게 투여하기 충분한 순도, 유익하게는 HPLC, NMR 및/또는 GC와 같은 분석 수단에 의해 측정된 바와 같이 90% 보다 높은, 특히 95% 보다 높은 순도를 가진 산물을 제공하는 효율적인 방법이다.
분취용 역상 크로마토그래피는 전형적으로 이동상에서 트리플루오로아세트산을 이용하여 수행된다. 수득되는 산물은 따라서 서열번호 1의 펩타이드의 트리플루오로아세테이트 염이다.
따라서, 본 방법은 트리플루오로아세테이트 이온을 다른 이온으로 교환하기 위해, 특히 약제학적으로 허용가능한 염을 수득하기 위해, 이온 교환의 추가의 단계를 포함할 수 있다.
"약제학적으로 허용가능한 염"은, 본 발명의 의미에서, 일반적으로 안전하고, 무독성이며, 생물학적으로도 다른 방식으로도 부적절하지 않은 염이, 인간 투여에 허용적이며, 모 화합물의 바람직한 약리학적 활성을 가지고 있다는 것을, 의미한다. 이러한 염은 용해성 또는 가수분해 특징을 바꾸기 위해 사용될 수 있거나, 또는 지속 방출 (sustained release) 또는 프로드럭 제조를 위해 사용될 수 있다. 이들 염은 표준 공정에 의해, 예를 들어 유리 산을 적합한 유기 염기 또는 무기 염기와 반응시켜 제조할 수 있다.
이러한 염으로는 아세테이트, 락토바이오네이트, 벤젠설포네이트, 라우레이트, 벤조에이트, 말레이트, 바이카보네이트, 말리에이트, 바이설페이트, 만델레이트, 바이타르트레이트 (bitartrate), 메실레이트, 보레이트, 메틸브로마이드, 브로마이드, 메틸나이트레이트, 칼슘 에데테이트, 메틸설페이트, 캄실레이트, 무케이트, 카보네이트, 납실레이트, 클로라이드, 나이트레이트, 클라불라네이트, N-메틸글루카민, 사이트레이트, 암모늄 염, 다이하이드로클로라이드, 올리에이트, 에데테이트, 옥살레이트, 에디실레이트 (edisylate), 파모에이트 (엠보네이트 (embonate)), 에스톨레이트, 팔미테이트, 에실레이트, 판토테네이트, 푸마레이트, 포스페이트/다이포스페이트, 글루셉테이트, 폴리갈락투로네이트, 글루코네이트, 살리실레이트, 글루타메이트, 스테아레이트, 글리콜릴아르사닐레이트, 설페이트, 헥실레조르시네이트 (resorcinate), 염기성 초산염 (subacetate), 하이드라바민, 숙시네이트, 하이드로브로마이드, 설페이트, 설포네이트, 탄네이트 (tannate), 하이드로클로라이드, 타르트레이트, 트리플레이트, 하이드록시나프토에이트, 테오클레이트, 아이오다이드, 토실레이트, 이소티오네이트, 트리에티오디드 (triethiodide), 락테이트, 파노에이트 (panoate), 발레레이트 등이 있다.
유익하게는, 이온 교환은 이동상 해당 산을 이용하거나 또는 이온 교환 수지 상에서 역상 크로마토그래피에 의해 수행될 수 있다. 더 유익하게는, 이온 교환은 역상 크로마토그래피 정지상 상에서 수행될 수 있다. 특히, 이온 교환은 분취용 역상 크로마토그래피에 의한 정제에 의해 연속적으로 수행될 수 있다.
본 발명의 맥락에서, "연속적으로"는 펩타이드를 함유하며 단계 e)에서 수득된 수용액이, 수용액의 농축없이, 예를 들어, 용매의 증발 또는 당해 기술 분야의 당업자들에게 공지된 임의의 다른 수단에 의한 농축 없이, 이온 교환 공정에 투입되는 것을 의미한다.
바람직하게는, 이온 교환 단계는 (정지상의 재생 후) 산물의 정제시 사용된 정지상과 동일한 정지상에서 수행된다.
서열번호 1의 펩타이드는 최종적으로 정제 후 건조된다. 펩타이드는, 산물의 순도에 영향을 미치지 않은 한, 당해 기술 분야의 당업자들에게 공지된 임의 수단에 의해 건조될 수 있다.
유익하게는, 서열번호 1의 펩타이드는 동결-건조 또는 분무-건조에 의해 건조된다. 이러한 건조 방법은 온화하며, 산물의 분해를 방지한다. 본 발명자들이 확인한 바와 같이, 건조 단계의 초기에 유기 용매, 특히 아세토니트릴의 존재가 서열번호 1의 펩타이드의 이량체화를 방지하는데 필수적이다.
건조 단계, 유익하게는 냉동-건조 단계 또는 분무-건조 단계 초기에, 수용액 내 유기 용매, 특히 아세토니트릴의 부피는, 수용액의 총 부피의 1 내지 30%, 특히 1 내지 10%, 바람직하게는 약 5%의 비율이 되도록, 유지 및/또는 조절된다.
따라서, 본 발명은, 유기 용매, 특히 아세토니트릴을 수용액 총 부피의 1 내지 30%, 특히 1 내지 10%, 바람직하게는 약 5%로 포함하는 수용액 내 서열번호 1의 펩타이드를, 건조, 바람직하게는, 동결-건조 또는 분무-건조에 의해 건조시키는, 전술한 방법에 관한 것이다.
바람직하게는, 본 발명은 아래 단계를 포함하는, 서열번호 1의 펩타이드를 제조하는 전술한 방법에 관한 것이다:
a)
Fmoc-Gly-MMPA-OH 잔기를 4-메틸벤즈하이드릴아민 기를 포함하는 다이비닐벤젠-가교된 폴리스티렌 수지에 그래프팅하는 단계,
b)
Arg 측쇄의 보호기가 2,2,4,6,7-펜타메틸다이하이드로벤조푸란-5-설포닐이고; Cys 측쇄의 보호기가 트리틸이고; Ser 측쇄의 보호기가 t-부틸이고; Trp 측쇄의 보호기가 t-부톡시카르보닐인, Fmoc 보호된 cys, ser, arg, ser, cys, ser, ser, trp, gly, ser 및 trp으로 펩타이드 체인을 연장하여, 측쇄가 보호된 서열번호 1의 펩타이드를 수득하는 단계,
c)
트리플루오로아세트산, 물 및 1,4-다이티오트레이톨의 혼합물을 사용해, 아미노산 측쇄의 탈보호와 수지로부터 폴리펩타이드의 절단을 동시에 수행하여, 서열번호 1의 폴리펩타이드를 수득하는 단계,
d)
서열번호 1의 펩타이드를 헵탄과 MTBE의 혼합물로 석출하는 단계,
e)
서열번호 1의 펩타이드가 유기 용매, 바람직하게는 아세토니트릴을 포함하는 수용액 내에서 계속적으로 유지되는 것을 특징으로 하는, 서열번호 1의 펩타이드를 분취용 역상 크로마토그래피로 정제하는 단계,
f)
단계 e)의 서열번호 1의 펩타이드를 포함하는 수용액을 농축하여, 서열번호 1의 펩타이드 및 유기 용매, 바람직하게는 아세토니트릴을 포함하는 농축된 수용액을 수득하는 단계,
g)
역상 크로마토그래피 정지상 또는 이온 교환 수지에서, 트리플루오로아세테이트 이온을 약제학적으로 허용가능한 이온으로 교환하는 단계,
h)
단계 g)에서 수득한 서열번호 1의 펩타이드를 포함하는 수용액을 농축하여, 서열번호 1의 펩타이드 및 유기 용매, 바람직하게는 아세토니트릴을 포함하는 농축된 수용액을 수득하는 단계,
i)
단계 h)에서 수득한 수용액을 건조, 유익하게는 분무-건조 또는 동결-건조에 의해 건조하여, 서열번호 1의 펩타이드를 수득하는 단계.
제2 구현예에서, 본 발명은, 서열번호 1의 펩타이드의 이량체화를, 특히 서열번호 1의 펩타이드의 정제 단계, 선택적인 농축 단계 및 건조 단계로서, 유익하게는 분무-건조 또는 동결-건조에 의해 수행되는 건조 단계 동안, 방지하기 위한, 수용액 내 유기 용매, 특히 아세토니트릴의 용도에 관한 것이다.
도 1은 서열번호 1의 도데카펩타이드를 제조하기 위한 일반 반응식을 나타낸 것이다.
도 2는 공정에서 적절한 단계, 즉 정제 및 건조 단계를 아세토니트릴을 사용하여 수행한 경우에 수득한 크로마토그램을 도시한 것이다.
도 3은 공정에서 정제 단계, 건조 단계 및 크로마토그래피 단계를 아세토니트릴을 사용하지 않고 수행한 경우에 수득한 크로마토그램을 도시한 것이다.
도 2는 공정에서 적절한 단계, 즉 정제 및 건조 단계를 아세토니트릴을 사용하여 수행한 경우에 수득한 크로마토그램을 도시한 것이다.
도 3은 공정에서 정제 단계, 건조 단계 및 크로마토그래피 단계를 아세토니트릴을 사용하지 않고 수행한 경우에 수득한 크로마토그램을 도시한 것이다.
실시예:
실시예 1. 서열번호 1의 펩타이드 제조
아래 시약들을 사용하였다:
표 1: 사용 아미노산 (아미노산 모두 L-배위임).
| 약어 | 역할 |
| Fmoc-Arg(Pbf)-OH | 보호된 아미노산 |
| Fmoc-Cys(Trt)-OH | 보호된 아미노산 |
| Fmoc-Gly-OH | 보호된 아미노산 |
| Fmoc-Gly-MPPA-OH | 보호된 아미노산-링커-OH |
| Fmoc-Ser(tBu)-OH | 보호된 아미노산 |
| Fmoc-Trp(Boc)-OH | 보호된 아미노산 |
표 2: 펩타이드 합성에 사용된 시약 및 용매
| 명칭 | 약어 | 역할 |
| N,N-다이메틸포름아미드 | DMF | 용매 |
| N,N-다이이소프로필에틸아민 | DIPEA | 시약 |
| 피페리딘 | - | 시약 |
| N,N'-다이이소프로필카르보디이미드 | DIC | 시약 |
| N-하이드록시벤조트리아졸 하이드레이트 | HOBt | 시약 |
| 2-프로판올 | 2-PrOH | 용매 |
| 질소 (기체) | N2 | 불활성 분위기 |
표 3: 수지로부터 절단 및 탈보호에 사용된 시약 및 용매
| 명칭 | 약어 | 역할 |
| 트리플루오로아세트산 | TFA | 시약 |
| 다이티오트레이톨 | DTT | 시약 |
| 헵탄 | - | 용매 |
| 메틸-tert-부틸 에테르 | MTBE | 용매 |
| 질소 (기체) | N2 | 불활성 분위기 |
| 물 | H2O | 시약 및 용매 |
표 4: 정제, 역상 크로마토그래피에 의한 이온 교환 및 동결건조에 사용된 시약 및 용매
| 명칭 | 약어 | 역할 |
| 트리플루오로아세트산 | TFA | 시약 |
| 아세트산 | AcOH | 시약 |
| 아세토니트릴 | CH3CN | 용매 |
| 물 | H2O | 용매 |
| 암모늄 아세테이트 | NH4OAc | 시약 |
| 2-프로판올 | 2-PrOH | 크로마토그래피 컬럼 패킹 용매 |
표 5: 사용 수지
| 명칭 | 약어 | 역할 |
| p-메틸벤즈하이드릴아민 폴리스티렌-1% 다이비닐벤젠 수지 | MBHA 수지 | 고상 펩타이드 합성 수지 (SPPS) |
| 실리카 C18 수지 | - | 역상 크로마토그래피의 정지상 |
NX210의 제조 방법은 펩타이드 조립시 빌딩 블록으로서 N-α-Fmoc (측쇄) 보호된 아미노산을 이용한 고상 펩타이드 합성 (SPPS) 방법에 기초한다.
사용 프로토콜은 MBHA 수지 상에서 MPPA 링커에 결합된 C-말단 글리신 N-α-Fmoc-보호된 아미노산의 커플링 및 후속적인 Fmoc 커플링/탈보호 순서로 구성된다.
수지 상에서 펩타이드를 조립한 후, 수지로부터의 펩타이드 절단 및 아미노산 측쇄의 탈보호 단계를 동시에 수행한다.
서열번호 1의 펩타이드 조산물을 석출, 여과 및 건조한다. 이 서열번호 1의 펩타이드는, 분취용 역상 크로마토그래피에 의해 정제하기 전에, 아세토니트릴이 함유된 수용액에 용해한다. 정제된 용액 내 펩타이드는 이후 농축 후 이온 교환 단계를 수행하여 아세테이트 염 형태로 서열번호 1의 펩타이드를 수득한다.
단계 1: 펩타이드 조립:
첫번째 글리신 잔기를 수지에 Fmoc-Gly-MPPA-OH 형태로 DMF 중의 DIC / HOBt 시스템을 사용해 커플링하였다 (비율 MBHA / FmocGlyMPPA / DIC / HOBt: 1, 1.35, 1.35, 1.35).
각각의 커플링 단계에 앞서, DMF 중의 25% 피페리딘을 사용해 Fmoc-보호기를 제거하고, 과량의 피페리딘을 제거하기 위해 수지를 DMF로 세척하였다. Fmoc-보호된 아미노산의 커플링은 DMF 중의 DIC / HOBt 시스템을 사용해 수행하였다.
하나의 아미노산과의 커플링을 완료한 후, 다음 커플링은 유사한 조건 하에 수행하였다.
트립토판 말단 아미노산의 커플링 및 말단 Fmoc 기의 탈보호화를 수행한 후, 수지를 DMF 및 2-프로판올로 세척한 다음 일정한 중량으로 건조하였다.
단계 2: 수지로부터 펩타이드 절단과 측쇄 탈보호의 동시 수행:
다양한 탈보호 및 절단 조건들을 적용하였다. 최상의 결과는 트리플루오로아세트산 / 물 / 1,4-다이티오트레이톨 칵테일 (86/5/9 v / v / m)을 사용하였을 때 달성되었다. 이후, 수지를 여과 제거하였으며, 펩타이드는 시약 및 부산물과의 복합 혼합물로서 용액에 잔류하였다.
단계 3: HPLC에 의해 정제하기 전 펩타이드 석출 및 여과:
서열번호 1의 펩타이드를 함유한 여과물의 부피를 줄이고, 펩타이드를 MTBE 및 헵탄 혼합물을 사용해 석출시켰다. 통상적으로 사용되는 다른 용매 (예, 다이에틸 에테르 또는 MTBE 단독)를 사용하면 여과할 수 없는 겔이 형성된다.
여과 후, 고형물을 중량이 일정해질 때까지 감압 하에 건조하였다.
단계 4: HPLC에 의해 정제하기 전 석출물 용해:
석출에 의해 수득한 순수하지 않은 NX210을, 정제하기 전, 아세토니트릴 / 물 / 아세트산 혼합물에 용해하였다.
수용액에 아세토니트릴을 첨가하는 것이 충분히 고 순도의 펩타이드를 수득하는데 핵심이다. 실제, 물/아세트산 혼합물을 사용하면, 이량체의 형성이 증가하는 것으로 관찰되었다. 이들 이량체는, 특히 척추강내 직접 투여에 적합하지 않은 응집체를 형성하는 경향으로 인해, 치료제 개발에 더 이상 적합하지 않은 보다 복잡한 올리고머의 형성을 유도한다.
용해 시간에 대한 아세토니트릴의 효과는 특히 이례적이며, 지금까지 설명불가능하다. 또 다른 성과는, 측정의 오퍼레이터가 무엇이든, 산물 분석시 산물의 실제 불순물 함량을 반영하고 신뢰할 수 있도록, 아세토니트릴 함유 용액에 산물을 용해시켜야 한다는 것을 확인한 것이다.
단계 5: HPLC에 의한 1차 정제:
정제 및 아세테이트 염으로의 변환은 역상 HPLC에 의한 중간산물의 정제 없이 2 단계로 수행힌디. 단계 4에서 수득한 NX210을 컬럼에 흡착시키고, 트리플루오로아세트산 희석 수용액 중에서의 아세토니트릴 농도 구배에 의해 컬럼으로부터 용출시킨다 (실온에서).
크로마토그래피는 하기 조건 하에 수행하였다:
컬럼: LC110 다목적 (정지상 Luna® C18 실리카 그래프팅됨, 15 μm, 100 Å, NX210 조산물 주입량 12 g에 대해 약 1250 g, 즉 충전율 약 1%).
유속: 450 mL/분
용출 농도 구배: 이동상 (아세토니트릴 / 물 (80/20, v / v) 중의 0.1% 아세트산) 7-32%, 30분간.
정지상, 주입량, 유속 및 농도 구배 선택은 물론 불순물의 분리를 개선하기 위해 조절할 수 있다.
단계 6: 2차 정제 및 아세테이트 염으로의 변환:
2차 정제 및 아세테이트로의 변환은 다목적 LC110 컬럼에서 분취용 역상 CHLP으로 수행하였다. 정지상은 Luna® C18 실리카 그래프팅됨 (15 μm, 100 Å, 펩타이드 조산물 주입량 19 g에 대해 약 1250 g)이다. 컬럼의 충전 및 세척을 수행하였다.
실시예 2. 비교 검사:
정제 단계에서 아세토니트릴의 첨가 중요성을 조사하였다. 단계들 사이에 아세토니트릴을 증발시키고, 동결-건조 전에 아세토니트릴을 생략하는 것을 제외하고는, 실시예 1과 동일한 공정으로 수행하였다.
그 결과는 아래 표에 나타낸다:
| 불순물 | 상 | 피크 세기 | 증가율 (%) |
| 이량체 1 | 아세토니트릴 | 0.05 | |
| 물 | 0.15 | 300 | |
| 이량체 2 | 아세토니트릴 | 0.31 | |
| 물 | 1.21 | 390 | |
| 이량체 3 | 아세토니트릴 | 0.14 | |
| 물 | 0.98 | 700 | |
| 삼량체 | 아세토니트릴 | 검출 한계 미만 | |
| 물 | 0.07 | n/a |
분석 결과에 나타난 바와 같이, 아세토니트릴이 없는 조건에서는, 제조 방법의 완료시 수득되는 산물은 이량체를 현저하게 높은 비율로 포함하였다. 아세토니트릴을 사용하지 않은 경우, 분석에서 삼량체도 관찰되었다.
SEQUENCE LISTING
<110> NEURONAX
<120> IMPROVED PROCESS FOR THE PREPARATION OF A DODECAPEPTIDE
<130> IFB 16 NEU DODE
<160> 1
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> NX210
<400> 1
Trp Ser Gly Trp Ser Ser Cys Ser Arg Ser Cys Gly
1 5 10
Claims (15)
- 서열번호 1의 펩타이드의 제조 방법으로서,
서열번호 1의 펩타이드의 정제 단계, 선택적인 농축 단계 및 건조 단계로서, 유익하게는 동결-건조 또는 분무-건조에 의해 수행되는 건조 단계 동안, 서열번호 1의 펩타이드가 유기 용매를 포함하는 수용액 내에서 계속 유지되는 것을 특징으로 하는, 제조 방법. - 서열번호 1의 펩타이드의 제조 방법으로서,
서열번호 1의 펩타이드의 정제 단계 및/또는 건조 단계로서, 유익하게는 동결-건조 또는 분무-건조에 의한 건조 단계가 유기 용매를 포함하는 수용액 내에서 수행되는 것을 특징으로 하는, 제조 방법. - 제1항 또는 제2항에 있어서,
상기 유기 용매가 아세토니트릴인 것을 특징으로 하는, 제조 방법. - 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 수용액 내 상기 유기 용매의 부피가, 정제 단계 및 선택적인 농축 단계 동안에 수용액의 총 부피의 1 내지 90%, 특히 1 내지 10%, 바람직하게는 약 5%의 비율이 되도록 유지 및/또는 조절되는 것을 특징으로 하는, 제조 방법. - 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
건조시킬, 유익하게는 동결-건조 또는 분무-건조에 의해 건조시킬 수용액 내 유기 용매의 부피가, 수용액의 총 부피의 1 내지 30%, 특히 1 내지 10%, 바람직하게는 약 5%의 비율이 되도록 유지 및/또는 조절되는 것을 특징으로 하는, 제조 방법. - 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
하기 단계 a) - f)를 포함하는, 제조 방법:
a) Fmoc-Gly 잔기를 수지에 그래프팅 (grafting)하는 단계,
b) 측쇄가 보호된 Fmoc-보호된 아미노산으로 펩타이드 체인을 연장하는 단계,
c) 아미노산 측쇄의 탈보호 및 수지로부터 폴리펩타이드의 절단을 동시에 실시하여, 서열번호 1의 폴리펩타이드를 수득하는 단계,
d) 선택적으로, 서열번호 1의 펩타이드를 석출하는 단계,
e) 서열번호 1의 펩타이드의 정제 단계 및 선택적인 농축 단계,
f) 단계 e)에서 수득한 서열번호 1의 펩타이드를 건조하는 단계로서, 유익하게는 동결-건조 또는 분무-건조에 의해 건조하는 단계. - 제6항에 있어서,
상기 수지가 4-메틸벤즈하이드릴아민 기를 포함하는 다이비닐벤젠-가교된 폴리스티렌 수지인 것을 특징으로 하는, 제조 방법. - 제6항 또는 제7항에 있어서,
단계 a)에서 Fmoc-Gly 잔기가 Fmoc-Gly-MPPA-OH 잔기인 것을 특징으로 하는, 제조 방법. - 제6항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
ㆍ Arg 측쇄의 보호기가 2,2,4,6,7-펜타메틸다이하이드로벤조푸란-5-설포닐이고,
ㆍ Cys 측쇄의 보호기가 트리틸이고,
ㆍ Ser 측쇄의 보호기가 t-부틸이고,
ㆍ Trp 측쇄의 보호기가 t-부톡시카르보닐인 것을 특징으로 하는, 제조 방법. - 제6항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서,
단계 c)가 트리플루오로아세트산, 물 및 1,4-다이티오트레이톨로 된 혼합물, 특히 혼합물의 총 중량을 기준으로 트리플루오로아세트산 85 - 95 중량%, 1,4-다이티오트레이톨 3 - 10 중량% 및 물 100 중량% 이하로 구성되는 혼합물을 사용해 수행되는 것을 특징으로 하는, 제조 방법. - 제6항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 제조 방법이 석출 단계 d)를 포함하고,
서열번호 1의 펩타이드의 석출이 바람직하게는 MTBE와 헵탄의 혼합물을 사용해 수행되는 것을 특징으로 하는, 제조 방법. - 제6항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서,
단계 e)의 정제가 하나 이상의 분취용 역상 크로마토그래피 (preparative reverse phase chromatography)를 포함하는 것을 특징으로 하는, 제조 방법. - 제12항에 있어서,
단계 e)의 정제가 역상 크로마토그래피 정지상 또는 이온 교환 수지에서의 이온 교환을 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 제조 방법. - 하기 a) - i)를 포함하는 서열번호 1의 펩타이드의 제조 방법:
a) Fmoc-Gly-MMPA-OH 잔기를 4-메틸벤즈하이드릴아민 기를 포함하는 다이비닐벤젠-가교된 폴리스티렌 수지에 그래프팅하는 단계,
b) Arg 측쇄의 보호기가 2,2,4,6,7-펜타메틸다이하이드로벤조푸란-5-설포닐이고; Cys 측쇄의 보호기가 트리틸이고; Ser 측쇄의 보호기가 t-부틸이고; Trp 측쇄의 보호기가 t-부톡시카르보닐인, Fmoc 보호된 cys, ser, arg, ser, cys, ser, ser, trp, gly, ser 및 trp으로 펩타이드 체인을 연장하여, 측쇄가 보호된 서열번호 1의 펩타이드를 수득하는 단계,
c) 트리플루오로아세트산, 물 및 1,4-다이티오트레이톨로 된 혼합물을 사용해, 아미노산 측쇄의 탈보호와 수지로부터 폴리펩타이드의 절단을 동시에 수행하여, 서열번호 1의 폴리펩타이드를 수득하는 단계,
d) 서열번호 1의 펩타이드를 헵탄과 MTBE의 혼합물을 사용해 석출하는 단계,
e) 서열번호 1의 펩타이드를 유기 용매, 바람직하게는 아세토니트릴을 포함하는 수용액 내에서 계속적으로 유지시키는 것을 특징으로 하는, 서열번호 1의 펩타이드를 분취용 역상 크로마토그래피로 정제하는 단계,
f) 단계 e)에서 수득한 서열번호 1의 펩타이드를 포함하는 수용액을 농축하여, 서열번호 1의 펩타이드 및 유기 용매, 바람직하게는 아세토니트릴을 포함하는 농축된 수용액을 수득하는 단계,
g) 역상 크로마토그래피 정지상 또는 이온 교환 수지에서, 트리플루오로아세테이트 이온을 약제학적으로 허용가능한 이온, 특히 아세테이트로 교환하는 단계,
h) 단계 g)에서 수득한 서열번호 1의 펩타이드를 포함하는 수용액을 농축하여, 서열번호 1의 펩타이드 및 유기 용매, 바람직하게는 아세토니트릴을 포함하는 농축된 수용액을 수득하는 단계,
i) 단계 h)에서 수득한 수용액을 건조, 유익하게는 분무-건조 또는 동결-건조에 의해 건조하여 서열번호 1의 펩타이드를 수득하는 단계. - 서열번호 1의 펩타이드의 이량체화를, 특히 서열번호 1의 펩타이드의 정제 단계, 선택적인 농축 단계 및 건조 단계로서 유익하게는 분무-건조 또는 동결-건조에 의해 수행되는 건조 단계 동안에, 방지하기 위한, 수용액 내 유기 용매, 특히 아세토니트릴의 용도.
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Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2008109079A2 (en) * | 2007-03-01 | 2008-09-12 | Novetide, Ltd. | High purity peptides |
| JP2014162722A (ja) * | 2013-02-21 | 2014-09-08 | Chemical And Biopharmaceutical Labolatories Of Patra Sa | 側鎖結合を介する固相ペプチド合成 |
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|---|---|---|---|---|
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|---|---|---|---|---|
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Non-Patent Citations (2)
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|---|
| Albert Isidro-Llobet et al., ‘Amino Acid-Protecting Groups’, Chemical Reviews, Vol. 109, pp. 2455-2504, 2009.* * |
| Laurent Sakka et al., ‘SCO-Spondin Derived Peptide NX210 Induces Neuroprotection In Vitro and Promotes Fiber Regrowth and Functional Recovery after Spinal Cord Injury’, PLoS ONE, Vol. 9, 2014.* * |
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