KR20150029689A - Eif4e를 표적화하기 위한 세포 투과 펩티드 - Google Patents

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네이더 포토우히
이 한
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프란세스카 밀레티
후이펭 누이
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에프. 호프만-라 로슈 아게
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Abstract

본 발명은 eIF4E-eIF4G 상호작용을 방해하기 위한 화합물 및 상기 화합물의 약학적으로 허용되는 염을 제공한다. 일반적으로, 상기 화합물은 포유동물 개시 인자 eIF4E에 결합하는 세포 투과 펩티드(CPP-eIF4E)이며, 이때 상기 펩티드는 서열번호 7, 9 내지 11, 12 내지 26, 27 내지 44 및 45 내지 51로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함한다. 보다 바람직하게, 상기 아미노산 서열은 적어도 9개 내지 약 40개 아미노산을 포함하며, 포유동물 개시 인자 eIF4E는 인간 개시 인자 eIF4E이다.

Description

EIF4E를 표적화하기 위한 세포 투과 펩티드{CELL PENETRATING PEPTIDES TO TARGET EIF4E}
본 발명은 진핵세포 번역 개시 인자 eIF4E와 eIF4G 사이의 단백질-단백질 상호작용을 억제하는 세포 투과 펩티드를 포함한다. eIF4E는 핵심 암-관련 유전자의 발현을 전사후 수준에서 조절함으로써 종양형성에 근본적인 기여를 하는 유망한 치료 표적이다. 본 발명의 펩티드 또는 그의 약학적으로 허용되는 염은 종양 성장 및 종양 크기를 감소시키기 위해 사용될 수 있다.
진핵세포 개시 인자 4E(eIF4E)는 mRNA의 번역 개시에 핵심 역할을 하는 24 kDa 단백질이다. mRNA 번역 개시시, eIF4E는 mRNA의 5' 말단에서 7-메틸구아노신 캡(cap)에 결합하고, 골격 단백질(scaffolding protein) eIF4G 및 헬리카제 eIF4A와 복합체(eIF4F로 불림)를 형성한다. 상기 복합체의 형성은 mRNA의 캡-의존성 번역의 개시에 필요하므로, eIF4G에 대한 eIF4E의 결합은 이 과정에서 결정적인 사건이다.
eIF4E는 형질전환 및 종양형성에서 그의 근본적인 역할을 시사하는 많은 증거 데이터로 인해 종양학 분야에서 유망한 표적으로 확인되었다. 예를 들면, 유전자전이(transgenic) 마우스에서 eIF4E의 과발현은 종양 형성을 촉진한다(문헌 [Silvera, D. et al., Nat. Rev. Cancer 2010, 10, 254-266] 및 그에 인용된 참조문헌 참조; 또한 문헌 [Konicek, B.W. et al., Cell Cycle 2008, 7, 2466-2471] 및 그에 인용된 참조문헌 참조). eIF4E의 과발현은 유방암, 폐암, 피부암, 결장암, 전립선암 및 자궁경부암을 포함하여 다양한 인간 암에서 관찰되었으며, 불량한 예후 및 감소된 생존율과 관련된다(예를 들면, 문헌 [Zhou, S. et al., BMC Cancer 2006, 6, 231] 참조). eIF4E의 발현은 자궁내막암에서 질환 진행과 관련되며, eIF4E의 siRNA 발현억제(knockdown)는 자궁내막암 세포에서 세포 성장을 억제한다(문헌 [Choi, H.C. et al., J. Cancer Res. Clin. Oncol. 2011, 137, 463-469]).
eIF4G의 서열을 기반으로 하는 나선형으로 안정된 펩티드는 eIF4E에 결합하며, 또한 비록 고농도에서지만, MCF-7 세포에서의 리포터 유전자 분석에서 캡-의존성 번역의 개시를 나타낸다(문헌 [Brown, C.J. et al., J. Mol. Biol. 2011, 405, 736-753]). eIF4E에 결합하고 만성 림프구성 백혈병 세포주에서 세포자멸(apoptosis)을 야기하는 일련의 펩티드들이 특허 출원에 개시되었다(코슨(Cosson, B.) 등, WO 2010100351 호).
eIF4E-eIF4G 상호작용의 소분자 억제제가 게르하르트 바그너(Gerhard Wagner)와 동료들에 의해 개시되었다(문헌 [Moerke, N.J. et al., Cell 2007, 128, 257-267]). 상기 화합물들의 활성은, eIF4F 복합체의 형성에 의존하는 불안 강화(fear consolidation)의 래트 모델에서 생체내에서 입증되었다(문헌 [Hoeffer, C.A. et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA 2011, 108, 3383-3388]). eIF4E-eIF4G 상호작용의 많은 소분자 억제제가 또한 NHI 분자 라이브러리 프로그램(Molecular Libraries Program)의 일부로서 민(Min)과 동료들에 의해 개시되었다(문헌 [HTS for inhibitors of Eukaryotic Translation Initiation, Probe Report by J. Min, Grant Number 1 R03 MH081216-01, Probe PubChem Compound Identifier: 16195554, June 23rd 2009]).
eIF4E의 캡 결합 부위에 결합하는 일련의 eIF4E 길항물질이 카스톤 바그너(Carston Wagner)와 동료들에 의해 개시되었다(문헌 [Jia, Y. et al., Eur. J. Med. Chem. 2010, 45, 1304-1313; and Jia, Y. PhD dissertation, University of Minnesota, Jan 2011; AN 2011:418548]). m7-GTP 부위에 결합하는 또 다른 화합물이 240차 미국 화학 학회 회의(240th National Meeting of the American Chemical Society)(2010년 8월 22-26일)에서 개시되었다(문헌 [Kopecky, D. et al., MEDI-227] 참조; AN 2010:1011833으로 화학 초록에 발췌됨). m7-GTP 부위에 결합하는 다른 화합물이 특허 출원(브라운(Brown, C.J.), WO 2010138084 호)에 개시되었다.
eIF4E는 시토졸(cytosol) 표적이므로, 펩티드- 또는 소분자-eIF4E 길항물질은, 화합물이, 예를 들면, 수동 확산에 의해 또는 내포작용(endocytosis)과 같은 특정 능동 메카니즘을 통해 세포막을 횡단함으로서 시토졸에서 전달되는 것을 필요로 한다. 그러나, 대부분의 펩티드들은 세포 투과성이 아니므로, 이것은 펩티드-기반 길항물질에 있어 과제이다.
세포 투과 펩티드(cell-penetrating peptide, CPP)는 다양한, 달리 불투과성인 거대분자들을 비교적 무독성 방식으로 세포의 원형질막을 가로질러 운반하는 능력을 갖는 펩티드의 한 부류이다. CPP 펩티드는 전형적으로 양이온성, 양친매성 또는 소수성 성질과 함께, 5 내지 약 30개 아미노산(aa)의 길이를 갖는다. 세포 투과 펩티드의 주목할만한 예로는 Tat, 페네트라틴(Penetratin) 및 트랜스포르탄(Transportan)이 포함된다(문헌 [Fawell, S. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 1994, pp 664-668; Theodore, L. et al., J. Neurosci. 1995, pp 7158-7167; Pooga, M. et al. FASEB J. 1998, pp 67-77]). Tat와 같은 세포 투과 펩티드는 작동인자(effector) 펩티드에 결합될 수 있거나, 또는 작동인자 펩티드는 본질적으로 세포 투과성일 수 있다. 본질적으로 세포 투과성인 작동인자 펩티드의 예로는 특히 Arf(1-22) 및 p28이 포함된다(문헌 [Johansson, H.J. et al., Mol. Ther. 2007, 16(1), pp 115-123; Taylor, B.N. et al., Cancer Res. 2009, 69(2), pp 537-546]).
본 발명은 일반적으로, 세포 투과성이며 eIF4E에 결합하여 eIF4E - eIF4G 상호작용을 방해하고 종양 세포주에 진입하는 능력을 갖는 펩티드에 관한 것이다.
본 발명은 eIF4E - eIF4G 상호작용을 방해하기 위한 화합물 및 상기 화합물의 약학적으로 허용되는 염을 제공한다. 일반적인 태양에서, 상기 화합물은 포유동물 개시 인자 eIF4E에 결합하는 세포 투과 펩티드(CPP-eIF4E)로서, 이때 상기 펩티드는 서열번호 7, 9 내지 11, 12 내지 26, 27 내지 44 및 45 내지 51로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함한다. 보다 바람직하게, 상기 아미노산 서열은 적어도 9개 내지 약 40개의 아미노산을 포함하며, 포유동물 개시 인자 eIF4E는 인간 개시 인자 eIF4E이다.
바람직한 태양에서, 상기 화합물은 포유동물 개시 인자 eIF4E에 결합하는 세포 투과 펩티드(CPP-eIF4E)로서, 이때 상기 펩티드는 서열번호 7, 9 및 10 내지 44로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하고, 상기 아미노산 서열은 또한, 부분적으로, 다음으로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열 모티프를 포함한다: YxxxxZZxF(서열번호 1)[여기서, Y는 티로신(Tyr)이고, x는 임의의 아미노산이며, Z는 류신(Leu) 또는 노르류신(Nle)이고, F는 페닐알라닌(Phe)이다], 또는 Tyr-Trp-Leu-Leu-Ala-Leu-Phe-Val-Tyr(서열번호 2). 보다 바람직하게, 상기 아미노산 서열은 적어도 9개 내지 약 40개의 아미노산이며, 포유동물 개시 인자 eIF4E는 인간 개시 인자 eIF4E이다.
대안적인 바람직한 태양에서, 본 발명은 제 1 펩티드 및 선택적인 제 2 펩티드로 이루어진, 적어도 9개 내지 약 40개 아미노산의 단리 및 정제된 폴리펩티드를 제공하며, 이때 상기 제 1 펩티드는 i. 9개 이상의 아미노산의 아미노산 서열을 포함하고, ii. 포유동물 개시 인자 eIF4E, 보다 바람직하게는 인간 개시 인자 eIF4E에 결합하는 능력을 가지며, iii. 상기 제 1 펩티드는 또한, 부분적으로, Ac-R1-Tyr-R2-R3-R4-R5-Leu-Leu-R6-Phe-R7-NH2(서열번호 3)의 아미노산 서열 모티프를 포함하고, 여기서 R1은 Lys-Lys, Lys-Gln, Lys-Arg 및 Lys-Ala로 이루어진 군에서 선택되고, R2는 Asp, Asn 또는 Ala이고, R3은 Arg이고, R4는 Glu, Lys, Cys, Ala, Gln 또는 Phe이고, R5는 Phe이고, R6은 Asp, Cys, Ala 또는 Aib이고, R7은 Gln-Phe-R8-R9-R10-R11(서열번호 4)이고, R8은 Met, Ala, (D)Met, Nle이고, R9는 Pro, (D)Pro, Ala이거나 또는 없고, R10은 Ala, (D)Ala이거나 또는 없고, R11은 약 5 내지 약 20개 아미노산의 세포 투과 펩티드(CPP)를 포함하는 선택적인 제 2 펩티드이다.
또 다른 바람직한 태양에서, 본 발명은 제 1 폴리펩티드 및 선택적인 제 2 폴리펩티드로 이루어진, 적어도 9개 내지 약 40개 아미노산의 단리 및 정제된 펩티드를 제공하며, 이때 상기 제 1 펩티드는 i. 9개 이상 아미노산의 아미노산 서열을 포함하고, ii. 포유동물 개시 인자 eIF4E(보다 바람직하게는 인간 개시 인자 eIF4E)에 결합하는 능력을 가지고, iii. 제 1 펩티드는 부분적으로, Tyr-Trp-Leu-Leu-Ala-Leu-Phe-Val-Tyr(서열번호 2)의 아미노산 모티프를 포함하며, 상기 선택적인 제 2 펩티드는 세포 투과 펩티드(CPP)이다.
또 다른 바람직한 태양에서, 본 발명은 포유동물 개시 인자 eIF4E, 보다 바람직하게는 인간 개시 인자 eIF4E에 결합하는 세포 투과 펩티드(CPP-eIF4E)인 서열번호 45 내지 51을 제공한다. 또는, 본 발명은 또한 포유동물 개시 인자 eIF4E, 보다 바람직하게는 인간 개시 인자 eIF4E에 결합하는 능력을 갖는 서열번호 52 내지 85를 제공한다.
또 다른 바람직한 태양에서, 본 발명은 제 1 폴리펩티드 및 선택적인 제 2 폴리펩티드로 이루어진, 적어도 9개 내지 약 40개 아미노산의 단리 및 정제된 펩티드를 제공하며, 이때 상기 제 1 펩티드는 i. 9개 이상 아미노산의 아미노산 서열을 포함하고, ii. 포유동물 개시 인자 eIF4E, 보다 바람직하게는 인간 개시 인자 eIF4E에 결합하는 능력을 가지고, 상기 제 1 펩티드는 서열번호 52 내지 85로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하고, 선택적인 제 2 펩티드는 세포 투과 펩티드(CPP)이다.
도 1은 m7-GTP 풀다운 분석(pulldown assay)에 근거한, 서열번호 7, 9, 10 및 11을 갖는 펩티드에 대한 메카니즘의 시험관내 세포 증거의 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 서열번호 9 및 10을 갖는 펩티드가 하류 표적 유전자 발현을 억제하고 세포자멸을 유도함을 보여준다.
본 발명은 포유동물 개시 인자 eIF4E에 결합하는 세포 투과 펩티드(CPP-eIF4E)인 화합물을 개시하며, 이때 상기 펩티드는 서열번호 7, 9 내지 11, 12 내지 26, 27 내지 44 및 45 내지 51로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함한다. 보다 바람직하게, 상기 아미노산 서열은 적어도 9개 내지 약 40개의 아미노산을 포함하며, 포유동물 개시 인자 eIF4E는 인간 개시 인자 eIF4E이다.
보다 특히, 본 발명은 eIF4E에 결합할 수 있는 화합물을 개시하며, 보다 특히 상기 화합물은 포유동물 개시 인자 eIF4E에 결합할 수 있는 세포 투과 펩티드(CPP-eIF4E)로서, 이때 상기 펩티드는 서열번호 7, 9 및 10 내지 44로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하고, 상기 아미노산 서열은 또한, 부분적으로, 다음으로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열 모티프를 포함한다: a) YxxxxzzxF(서열번호 1)[여기서, Y는 티로신(Tyr)이고, x는 임의의 아미노산이며, Z는 류신(Leu) 또는 노르류신(Nle)이고, F는 페닐알라닌(Phe)이다], 또는 b) Tyr-Trp-Leu-Leu-Ala-Leu-Phe-Val-Tyr(서열번호 2). 보다 바람직하게, 상기 아미노산 서열은 적어도 9개 내지 약 40개의 아미노산이며, 포유동물 개시 인자 eIF4E는 인간 개시 인자 eIF4E이다.
다른 태양에서, 포유동물 개시 인자 eIF4E에 결합할 수 있는 세포 투과 펩티드(CPP-eIF4E)는 Ac-R1-Tyr-R2-R3-R4-R5-Leu-Leu-R6-Phe-R7-NH2(서열번호 3)의 아미노산 모티프의 서열번호 7, 12 및 13 내지 26의 아미노산 서열을 포함하거나, 그렇지 않으면 이로 이루어지며, 여기서 R2 내지 R6은 임의의 아미노산이고, R1 및 R7은 임의의 아미노산 또는 아미노산 서열이고, 이때 또한 R1 또는 R7은 세포 투과 펩티드를 포함하는, 약 8 내지 약 25개 아미노산의 아미노산 서열이다(상기 태양은 서열번호 89로 개시되어 있다). 보다 특히 바람직한 태양에서, R1은 Lys-Lys, Lys-Gln, Lys-Arg 및 Lys-Ala로 이루어진 군에서 선택되고, R2는 Asp, Asn 또는 Ala이고, R3은 Arg이고, R4는 Glu, Lys, Cys, Ala, Gln 또는 Phe이고, R5는 Phe이고, R6은 Asp, Cys, Ala 또는 Aib이고, R7은 Gln-Phe-R8-R9-R10-R11(서열번호 4)이고, 여기서 R8은 Met, Ala, (D)Met, Nle이고, R9는 Pro, (D)Pro, Ala이거나 또는 없고, R10은 Ala, (D)Ala이거나 또는 없고, R11은 약 5 내지 약 20개 아미노산의 세포 투과 펩티드(CPP)이다. 보다 바람직한 태양에서, R11은 Val-Tyr-Asp-Leu-Gly-Leu-Arg-Arg-Leu-Arg-Gln-Arg-Arg-Arg-Leu-Arg-Arg(서열번호 5)이다.
다른 태양에서, eIF4E에 결합할 수 있는 세포 투과 펩티드는 식 I Ac-Lys-Arg-Tyr-Asp-Arg-Glu-Phe-Leu-Leu-Ala-Phe-Gln-Phe-Nle-R11(서열번호 6)의 펩티드를 포함하며, 여기서 R11은 약 5 내지 약 20개 아미노산의 세포 투과 펩티드(CPP)이다. 보다 바람직한 태양에서, R11은 Val-Tyr-Asp-Leu-Gly-Leu-Arg-Arg-Leu-Arg-Gln-Arg-Arg-Arg-Leu-Arg-Arg(서열번호 5)이다.
보다 특히 및 바람직하게, 본 발명의 펩티드는 서열번호 7(Ac-Lys-Arg-Tyr-Asp-Arg-Glu-Phe-Leu-Leu-Ala-Phe-Gln-Phe-Nle-Val-Tyr-Asp-Leu-Gly-Leu-Arg-Arg-Leu-Arg-Gln-Arg-Arg-Arg-Leu-Arg-Arg-NH2)로 이루어진다.
상기 서열번호 1 및/또는 3을 포함하며 또한 세포 투과성인 본 발명의 다른 보다 바람직한 펩티드는 표 2에 나타낸 바와 같은 서열번호 7, 12, 13 내지 26의 서열을 포함한다. 상기 서열번호 1 및/또는 3을 포함하거나 이로 이루어지지만 세포 투과성이 아닌 서열번호 52 내지 85는 표 1에 열거되어 있다.
대안적 태양에서, 포유동물 개시 인자 eIF4E에 결합할 수 있는 세포 투과 펩티드(CPP-eIF4E)는 서열번호 9 내지 11 및 27 내지 44를 포함하거나 그렇지 않으면 이로 이루어지며, 또한 상기 서열은 Tyr-Trp-Leu-Leu-Ala-Leu-Phe-Val-Tyr(서열번호 2)의 아미노산 모티프를 포함한다. 보다 특히, 상기 아미노산 서열은 Ac-Met-Ala-R1-Leu-R2-Tyr-Trp-Leu-Leu-Ala-Leu-Phe-Val-Tyr-Met-Trp-Thr-Asp-Leu-R3-Leu-R4-Lys-Lys-Arg-Pro-Lys-Pro-NH2(서열번호 8)의 아미노산 모티프를 포함하며, 여기서 R1은 Lys 또는 Asn이고, R2는 Lys 또는 Ala이고, R3은 Leu 또는 Arg이며, R4는 Phe 또는 t-ButAla이다. 보다 바람직하게, 상기 아미노산 서열은 서열번호 9, 10 및 11로 이루어진 군에서 선택된다[(II) Ac-Met-Ala-Lys-Leu-Lys-Tyr-Trp-Leu-Leu-Ala-Leu-Phe-Val-Tyr-Met-Trp-Thr-Asp-Leu-Leu-Leu-Phe-Lys-Lys-Arg-Pro-Lys-Pro-NH2(서열번호 9); (III) Ac-Met-Ala-Asn-Leu-Ala-Tyr-Trp-Leu-Leu-Ala-Leu-Phe-Val-Tyr-Met-Trp-Thr-Asp-Leu-Arg-Leu-Phe-Lys-Lys-Arg-Pro-Lys-Pro-NH2(서열번호 10); (IV) Ac-Met-Ala-Asn-Leu-Ala-Tyr-Trp-Leu-Leu-Ala-Leu-Phe-Val-Tyr-Met-Trp-Thr-Asp-Leu-Arg-Leu-tBuAla-Lys-Lys-Arg-Pro-Lys-Pro-NH2(서열번호 11)].
보다 특히, 상기 서열번호 2를 포함하는 본 발명의 펩티드는 표 2a에 나타낸 바와 같은 서열번호 9 내지 11 및 27 내지 44를 포함한다(표 2a는 CPP이고 eIF4E에 결합하며 서열번호 2의 모티프를 갖는 본 발명의 펩티드의 예를 열거한 것이다).
또 다른 태양에서, eIF4E에 결합하고 세포 투과성인 본 발명의 펩티드는 표 3에 나타낸 바와 같은 서열번호 45 내지 51을 포함한다.
또는, 본 발명은 제 1 펩티드 및 선택적인 제 2 펩티드를 포함하거나 그렇지 않으면 이로 이루어지는, 약 9 내지 약 40개 아미노산의 단리 및 정제된 폴리펩티드를 개시하며, 이때 상기 제 1 펩티드는 i. 9개 이상 아미노산의 아미노산 서열을 포함하고, ii. 포유동물 개시 인자 eIF4E(보다 바람직하게는 인간 개시 인자 eIF4E)에 결합하는 능력을 가지고, iii. 상기 제 1 펩티드는 또한, 부분적으로, YxxxxLLxF(서열번호 90)[여기서, Y는 티로신(Tyr) 또는 페닐알라닌(Phe)이고, x는 임의의 아미노산이며, L은 류신(Leu)이고, F는 페닐알라닌(Phe)이다]의 아미노산 서열 모티프를 포함하며, 선택적인 제 2 펩티드는 세포 투과 펩티드(CPP)이다.
대안적이고 보다 바람직한 태양에서, 본 발명은 제 1 펩티드 및 선택적인 제 2 펩티드를 포함하거나 그렇지 않으면 이로 이루어진, 약 9 내지 약 40개 아미노산의 단리 및 정제된 폴리펩티드를 개시하며, 이때 상기 제 1 펩티드는 i. 9개 이상의 아미노산 서열을 포함하고, ii. 포유동물 개시 인자 eIF4E(보다 바람직하게는 인간 개시 인자 eIF4E)에 결합하는 능력을 가지고, iii. 상기 제 1 펩티드는 또한, 부분적으로, Ac-R1-Tyr-R2-R3-R4-R5-Leu-Leu-R6-Phe-R7-NH2(서열번호 3)의 아미노산 모티프의 9 내지 약 30개 아미노산의 아미노산 서열을 포함하며, 여기서 R2 내지 R6은 임의의 아미노산이고, R1 및 R7은 임의의 아미노산 또는 아미노산 서열이고, 이때 또한 R1 또는 R7은 선택적인 CPP를 포함한다(상기 태양은 서열번호 89로 개시되어 있다). 보다 바람직한 태양에서, R1은 Lys-Lys, Lys-Gln, Lys-Arg 및 Lys-Ala로 이루어진 군에서 선택되고; R2는 Asp, Asn 또는 Ala이고; R3은 Arg이고; R4는 Glu, Lys, Cys, Ala, Gln 또는 Phe이고; R5는 Phe이고; R6은 Asp, Cys, Ala 또는 Aib이고; R7은 Gln-Phe-R8-R9-R10-R11(서열번호 4)이고, 여기서 R8은 Met, Ala, (D)Met, Nle이고, R9는 Pro, (D)Pro, Ala이거나 또는 없고, R10은 Ala, (D)Ala이거나 또는 없고, R11은 약 5 내지 약 20개 아미노산의 선택적 세포 투과 펩티드(CPP)이다. 보다 바람직한 태양에서, 상기 폴리펩티드는 Ac-Lys-Arg-Tyr-Asp-Arg-Glu-Phe-Leu-Leu-Ala-Phe-Gln-Phe-Nle-R11(서열번호 6)을 포함하거나 또는 이로 이루어진다. 보다 특히, 상기 서열번호 1을 포함하거나 이로 이루어지는 태양의 제 1 펩티드는 표 1(eIF4E에는 결합하지만 세포 투과성이 아닌 펩티드)에 나타낸 바와 같은 서열번호 52 내지 85를 포함한다.
또는, 본 발명은 또한 제 1 폴리펩티드 및 선택적인 제 2 폴리펩티드로 이루어진, 적어도 9개 내지 약 40개 아미노산의 단리 및 정제된 펩티드를 제공하며, 이때 상기 제 1 펩티드는 i. 9개 이상 아미노산의 아미노산 서열을 포함하고, ii. 포유동물 개시 인자 eIF4E(보다 바람직하게는 인간 개시 인자 eIF4E)에 결합하는 능력을 가지며, iii. 상기 제 1 펩티드는 부분적으로, Tyr-Trp-Leu-Leu-Ala-Leu-Phe-Val-Tyr(서열번호 2)의 아미노산 모티프를 포함하고, 상기 선택적인 제 2 펩티드는 세포 투과 펩티드(CPP)이다.
또 다른 태양에서, 본 발명은 또한 제 1 폴리펩티드 및 선택적인 제 2 폴리펩티드로 이루어진, 적어도 9개 내지 약 40개 아미노산의 단리 및 정제된 펩티드를 제공하며, 이때 상기 제 1 펩티드는 i) 9개 이상 아미노산의 아미노산 서열을 포함하고, ii) 포유동물 개시 인자 eIF4E(보다 바람직하게는 인간 개시 인자 eIF4E)에 결합하는 능력을 가지며, iii) 서열번호 53 내지 86의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 선택적인 제 2 펩티드는 세포 투과 펩티드(CPP)이다. 상기 제 1 펩티드의 대표적인 예는 표 3에 열거되어 있다.
정의
달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술 및 과학 용어들은 본 발명이 속하는 분야에 통상의 기술을 가진 자에 의해 통상적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 갖는다. 본원에 기술된 바와 유사하거나 등가인 방법 및 재료들이 본 발명의 실시 또는 시험에 사용될 수 있지만, 적합한 방법 및 재료들을 하기에 기술한다.
본 발명의 세포 투과 펩티드(CPP)는 일반적으로 세포막에 침투하여 상이한 운반물(cargo)을 세포내로 이동시킬 수 있는, 약 5 내지 약 30개 아미노산의 펩티드를 의미한다. 보다 바람직하게, 본원에 정의된 바와 같은 CPP는 또한 서열들이 2개 이상의 비천연 또는 인공 아미노산을 포함하고 또한 측쇄 가교 또는 사이클릭 펩티드에 의해 연결된 것으로 정의된, 소위 "스테이플(stapled)" 펩티드를 배제한다.
"eIF4e에 결합하는 펩티드(들)" 또는 "eIF4E에 결합할 수 있는 펩티드(들)"이란 어구는, 표적이 eIF4e인 생화학 분석법에서 양성(본원에서 IC50 <20 μM인 것으로 정의되는)인 펩티드들의 군을 의미한다.
용어 "eIF4E" 또는 진핵세포 개시 인자 4E는 24 kDa 단백질, 보다 바람직하게는 아미노산 서열(서열번호 86)을 포함하는 인간 eIF4E를 의미한다. 보다 특히, 인간 eIF4E는 아미노산 서열 28 내지 217(aa 28-217) VAN PEHYIKHPLQ NRWALWFFKN DKSKTWQANLRLISKFDTVE DFWALYNHIQ LSSNLMPGCD YSLFKDGIEP MWEDEKNKRG GRWLITLNKQ QRRSDLDRFW LETLLCLIGE SFDDYSDDVC GAVVNVRAKG DKIAIWTTEC ENREAVTHIG RVYKERLGLP PKIVIGYQSH ADTATKSGST TKNRFVV(서열번호 87)로 이루어진다. 또는, 인간 eIF4E(상기 잔기 28 내지 217)는 정제를 용이하게 하기 위해 eIF4E의 C-말단 잔기 다음에 암호화된 추가의 6개 히스티딘과 함께 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli)에서 발현될 수 있다(서열번호 88).
용어 "아미노산 모티프"는 아미노산의 보존된 서열(예를 들면, Y----LL-F)을 의미한다. 상기 서열은 또한 모티프의 각 아미노산을 분리하는 잔기의 수를 나타내기 위한 간극을 포함할 수 있다.
용어 "아미노산"은 일반식 NH2CHRCOOH(여기서, R은 임의의 유기 기일 수 있다)의 유기 화합물을 나타낸다. 특히, 용어 아미노산은, Aib = 알파-아미노이소부티르산; tBuAla = 3급-부틸 알라닌; Thr-OBzl = 트레오닌 벤질 에스터; 5Ava = 5-아미노발레르산; Asp = D = 아스파트산; Ala = A = 알라닌; Arg = R = 아르기닌; Asn = N = 아스파라긴; Gly = G = 글리신; Glu = E = 글루탐산; Gln = Q = 글루타민; His = H = 히스티딘; Ile = I = 이소류신; Leu = L = 류신; Lys = K = 라이신; M = 메티오닌; Mamb = (3-아미노메틸)벤조산; Mamp = Met = (3-아미노메틸)페닐 아세트산; Nle = 노르류신; Nva = 노르발린; Phe = F = 페닐알라닌; Pro = P = 프롤린; Ser = S = 세린; Thr = T = 트레오닌; Trp = W = 트립토판; Tyr = Y = 티로신; 및 Val = V = 발린과 같이, 천연 및 비천연(인공) 아미노산을 말할 수 있다.
용어 "약학적으로 허용되는"은 일반적으로 안전하고, 무독성이고, 생물학적으로나 다르게나 유해하지 않은 약학 조성물을 제조하는데 유용하고, 수의학 뿐 아니라 인간 약학 용도에 허용되는 물질의 특성을 의미한다.
용어 "약학적으로 허용되는 염"은 생물학적으로나 다르게나 유해하지 않은 염을 의미한다. 약학적으로 허용되는 염은 산 및 염기 부가염을 모두 포함한다.
용어 "약학적으로 허용되는 산 부가염"은 염산, 브롬화수소산, 황산, 질산, 탄산, 인산과 같은 무기산, 및 폼산, 아세트산, 프로피온산, 글리콜산, 글루콘산, 락트산, 피루브산, 옥살산, 말산, 말레산, 말론산, 숙신산, 푸마르산, 타르타르산, 시트르산, 아스파트산, 아스콜브산, 글루탐산, 안트라닐산, 벤조산, 신남산, 만델산, 엠본산, 페닐아세트산, 메탄설폰산, 에탄설폰산, p-톨루엔설폰산 및 살리실산과 같은 유기산의 지방족, 지환족, 방향족, 아르지방족, 헤테로사이클릭, 카복실 및 설폰산 부류로부터 선택된 유기산에 의해 생성된 약학적으로 허용되는 염을 의미한다.
용어 "약학적으로 허용되는 염기 부가염"은 유기 또는 무기 염기에 의해 생성된 약학적으로 허용되는 염을 의미한다. 허용되는 무기 염기의 예로는 나트륨, 칼륨, 암모늄, 칼슘, 마그네슘, 철, 아연, 구리, 망간 및 알루미늄 염이 포함된다. 약학적으로 허용되는 유기 무독성 염기로부터 유도된 염으로는 1급, 2급 및 3급 아민의 염, 천연 치환 아민을 포함한 치환된 아민, 사이클릭 아민 및 염기성 이온 교환 수지, 예를 들면, 이소프로필아민, 트라이메틸아민, 다이에틸아민, 트라이에틸아민, 트라이프로필아민, 에탄올아민, 2-다이에틸아미노에탄올, 트라이메타민, 다이사이클로헥실아민, 라이신, 아르기닌, 히스티딘, 카페인, 프로카인, 하이드라바민, 콜린, 베타인, 에틸렌다이아민, 글루코사민, 메틸글루카민, 테오브로민, 퓨린, 피페리진, 피페리딘, N-에틸피페리딘 및 폴리아민 수지가 포함된다.
용어 "IC50 값" 또는 용어 "반 최대 억제 농도"(IC50)는 시험관내에서 생물학적 과정의 50% 억제를 달성하기 위해 필요한 특정 화합물의 농도를 의미한다. IC50 값은 대수적으로 pIC50 값(-로그 IC50)으로 전환될 수 있으며, 여기서 더 높은 값은 전형적으로 더 큰 효능을 나타낸다. IC50 값은 절대값이 아니고, 실험 조건, 예를 들면, 사용된 농도에 따라 달라진다. IC50 값은 쳉-프루소프(Cheng-Prusoff) 방정식(문헌 [Biochem. Pharmacol. (1973) 22:3099])을 사용하여 절대 억제 상수(Ki)로 전환될 수 있다.
본원에 언급된 모든 펩티드 서열들은, 달리 언급되지 않는 한, N-말단 아미노산이 좌측에 오고 C-말단 아미노산이 우측에 오는 통상적인 관례에 따라 표기된다. 두 아미노산 잔기 사이의 짧은 선은 펩티드 결합을 나타낸다. 아미노산이 이성질체 형태를 갖는 경우, 달리 특별히 언급되지 않는 한, 나타낸 것은 그 아미노산의 L 형태이다.
본 발명을 기술하는데 있어 편의를 위해, 다양한 아미노산 잔기에 대한 통상적 및 비통상적 약칭을 사용한다. 상기 약칭들은 당해 분야에 숙련된 자에게 익숙하지만, 명확성을 위해 하기에 열거한다:
Aib = 알파-아미노이소부티르산; tBuAla = 3급-부틸 알라닌; Thr-OBzl = 트레오닌 벤질 에스터; 5Ava = 5-아미노발레르산; Asp = D = 아스파트산; Ala = A = 알라닌; Arg = R = 아르기닌; Asn = N = 아스파라긴; Gly = G = 글리신; Glu = E = 글루탐산; Gln = Q = 글루타민; His = H = 히스티딘; Ile = I = 이소류신; Leu = L = 류신; Lys = K = 라이신; Met = M = 메티오닌; Mamb = (3-아미노메틸)벤조산; Mamp = Met = (3-아미노메틸)페닐 아세트산; Nle = 노르류신; Nva = 노르발린; Phe = F = 페닐알라닌; Pro = P = 프롤린; Ser = S = 세린; Thr = T = 트레오닌; Trp = W = 트립토판; Tyr = Y = 티로신; 및 Val = V = 발린.
또한, 편의를 위해서 및 당해 분야에 숙련된 자에게 용이하게 알려지듯이, 본 발명에 사용된 잔기, 시약 등을 나타내기 위해 하기의 약칭 또는 기호를 사용한다:
Et2O 다이에틸 에터
hr(s) 시간
TIS 트라이이소프로필실란
(D)Tyr D-티로신
(D)Phe D-페닐알라닌
SSA 숙신이미딜 숙신아미드
Fmoc 9-플루오레닐메틸옥시카보닐
DMF 다이메틸폼아미드
DIPEA N,N-다이이소프로필에틸아민
TFA 트라이플루오로아세트산
HOBT N-하이드록시벤조트라이아졸
BOP 벤조트라이아졸-1-일옥시-트리스-(다이메틸아미노)포스포늄-헥사플루오로포스페이트
HBTU 2-(1H-벤조트라이아졸-1-일)-1,1,3,3-테트라메틸우로늄-헥사플루오로포스페이트
NMP N-메틸-피롤리돈
FAB-MS 고속 원자 충격 질량 분석법
ES-MS 전자 분무 질량 분석법
본 발명의 화합물은 아미노산 사이의 펩티드 결합의 형성을 위한 임의의 공지된 통상적인 절차에 의해 용이하게 합성될 수 있다. 상기 통상적인 절차로는, 예를 들면, 아미노산 또는 그의 카복실기 및 다른 보호된 반응기를 갖는 그의 단편의 유리 알파 아미노기와, 또 다른 아미노산 또는 그의 아미노기 또는 다른 보호된 반응기를 갖는 그의 단편의 유리 1급 카복실기 사이에 축합을 허용하는 임의의 액상 절차가 포함된다.
본 발명의 신규 화합물을 합성하기 위한 상기 통상적인 절차들로는, 예를 들면, 임의의 고체상 펩티드 합성 방법이 포함된다. 상기 방법에서, 신규 화합물의 합성은, 고체상 방법의 일반적 원리에 따라서 목적하는 아미노산 잔기를 성장하는 펩티드 쇄 안에 하나씩 순차적으로 혼입시킴으로써 수행될 수 있다. 상기 방법들은, 예를 들면, 본원에 참고로 인용된 문헌 [Merrifield, R.B., J. Amer. Chem. Soc. 85, 2149-2154 (1963); Barany et al., The Peptides, Analysis, Synthesis and Biology, Vol. 2, Gross, E. and Meienhofer, J., Eds. Academic Press 1-284 (1980)]에 개시되어 있다.
펩티드의 합성시에, 아미노산 상의 특정 반응기, 예를 들면, 알파-아미노기, 하이드록실기 및/또는 반응성 측쇄기는 그와의 화학 반응을 방지하기 위해 보호되는 것이 바람직할 수 있다. 이것은, 예를 들면, 상기 반응기를 나중에 제거될 수 있는 보호기와 반응시킴으로써 달성될 수 있다. 예를 들면, 아미노산 또는 그 단편의 알파 아미노기는 그와의 화학 반응을 방지하기 위해 보호될 수 있는 반면, 아미노산 또는 그 단편의 카복실기는 또 다른 아미노산 또는 그 단편과 반응하여 펩티드 결합을 형성한다. 그 다음에 알파 아미노 보호기의 선택적 제거가 이어져 그 자리에서, 예를 들면, 또 다른 아미노산 또는 그 단편의 카복실기와의 후속 반응이 일어나게 된다.
알파 아미노기는, 예를 들면, 방향족 우레탄-유형 보호기, 예를 들면, 알릴옥시카보닐, 벤질옥시카보닐(Z) 및 치환된 벤질옥시카보닐, 예를 들면, p-클로로벤질옥시카보닐, p-니트로벤질옥시카보닐, p-브로모벤질옥시카보닐, p-바이페닐-이소프로필옥시카보닐, 9-플루오레닐메틸옥시카보닐(Fmoc) 및 p-메톡시벤질옥시카보닐(Moz); 및 지방족 우레탄-유형 보호기, 예를 들면, t-부틸옥시카보닐(Boc), 다이이소프로필메틸옥시카보닐, 이소프로필옥시카보닐 및 알릴옥시카보닐로부터 선택된 적합한 보호기에 의해 보호될 수 있다. 한 태양에서, Fmoc는 알파 아미노 보호에 사용된다.
아미노산의 하이드록실기(OH)는, 예를 들면, 벤질(Bzl), 2,6-다이클로로벤질(2,6 diCl-Bzl) 및 3급-부틸(t-Bu)로부터 선택된 적합한 보호기에 의해 보호될 수 있다. 티로신, 세린 또는 트레오닌의 하이드록실기가 보호되어야 하는 태양에서는, 예를 들면, t-Bu를 사용할 수 있다.
엡실론-아미노산기는, 예를 들면, 2-클로로-벤질옥시카보닐(2-Cl-Z), 2-브로모-벤질옥시카보닐(2-Br-Z), 알릴카보닐 및 t-부틸옥시카보닐(Boc)로부터 선택된 적합한 보호기에 의해 보호될 수 있다. 라이신의 엡실론-아미노기가 보호되어야 하는 태양에서는, 예를 들면, Boc를 사용할 수 있다.
베타- 및 감마-아미드기는, 예를 들면, 4-메틸트리틸(Mtt), 2,4,6-트라이메톡시벤질(Tmob), 4,4'-다이메톡시다이틸(Dod), 비스-(4-메톡시페닐)-메틸 및 트라이틸(Trt)로부터 선택된 적합한 보호기에 의해 보호될 수 있다. 아스파라긴 또는 글루타민의 아미드기가 보호되어야 하는 태양에서는, 예를 들면, Trt를 사용할 수 있다.
인돌기는, 예를 들면, 포르밀(For), 메시틸-2-설포닐(Mts) 및 t-부틸옥시카보닐(Boc)로부터 선택된 적합한 보호기에 의해 보호될 수 있다. 트립토판의 인돌기가 보호되어야 하는 태양에서는, 예를 들면, Boc를 사용할 수 있다.
이미다졸기는, 예를 들면, 벤질(Bzl), t-부틸옥시카보닐(Boc) 및 트라이틸(Trt)로부터 선택된 적합한 보호기에 의해 보호될 수 있다. 히스티딘의 이미다졸기가 보호되어야 하는 태양에서는, 예를 들면, Trt를 사용할 수 있다.
고체상 합성은 보호된 알파-아미노기를 적합한 수지에 커플링시킴으로써 펩티드의 C-말단 끝에서부터 시작될 수 있다. 상기 출발 물질은, 알파-아미노-보호된 아미노산을 에스터 결합에 의해 p-벤질옥시벤질 알콜(왕(Wang)) 수지에 결합시킴으로써, 또는 Fmoc-연결기, 예를 들어, p-((R,S)-α-(1-(9H-플루오렌-9-일)-메톡시폼아미도)-2,4-다이메틸옥시벤질)-페녹시아세트산(링크(Rink) 연결기)과 벤즈하이드릴아민(BHA) 수지 사이의 아미드 결합에 의해 제조될 수 있다. 하이드록시메틸 수지의 제조는 당해 분야에 공지되어 있다. Fmoc-연결기-BHA 수지 지지체는 상업적으로 시판하며, 일반적으로 합성되는 목적 펩티드가 C-말단에 비치환된 아미드를 갖는 경우에 사용된다.
한 태양에서, 펩티드 합성은 마이크로파에 의해 보조된다. 마이크로파 보조 펩티드 합성은 고체상 펩티드 합성을 촉진하기 위한 유망한 방법이다. 상기 방법은 마이크로파 펩티드 합성기, 예를 들면, 리버티(Liberty) 펩티드 합성기(씨이엠 코포레이션(CEM corporation), 미국 노스캐롤라이나주 매튜스 소재)를 사용하여 수행될 수 있다. 마이크로파 보조 펩티드 합성은 설정 온도에서 설정된 시간동안 반응을 제어하는 방법들이 창출되게 한다. 합성기는 반응에 전달되는 전력의 양을 자동적으로 조절하여 온도를 설정된 지점에서 유지시킨다.
전형적으로, 아미노산 또는 모방체는 2 내지 5 당량의 아미노산 및 적합한 커플링 시약과 함께, 아미노산 또는 모방체의 Fmoc 보호된 형태를 이용하여 Fmoc-연결기-BHA 수지 상에 커플링된다. 커플링 후에, 수지는 세척되고 진공하에 건조될 수 있다. 수지 상에 아미노산의 부하량은 분취량의 Fmoc-아미노산 수지의 아미노산 분석에 의해 또는 UV 분석에 의한 Fmoc 기의 측정에 의해 결정될 수 있다. 임의의 미반응 아미노기는 수지를 메틸렌 클로라이드 중에서 아세트산 무수물 및 다이이소프로필에틸아민과 반응시킴으로써 캡핑될 수 있다.
수지는 여러 반복적 주기를 통해 운반되어 아미노산을 차례로 부가할 수 있다. 알파 아미노 Fmoc 보호기는 염기성 조건하에서 제거된다. DMF 중의 피페리딘, 피페라진 또는 모폴린(20 내지 40%, v/v)을 상기 목적으로 사용할 수 있다. 한 태양에서, DMF 중의 20% 피페리딘이 사용된다.
알파 아미노 보호기의 제거 후에, 후속 보호된 아미노산은 중간체 보호 펩티드-수지를 수득하기 위해 바람직한 순서로 단계적으로 커플링된다. 펩티드의 고체상 합성에서 아미노산의 커플링에 사용되는 활성화 시약들은 당해 분야에 공지되어 있다. 예를 들면, 상기 합성에 적절한 시약은 벤조트라이아졸-1-일옥시-트라이-(다이메틸아미노) 포스포늄 헥사플루오로포스페이트(BOP), 브로모-트리스-피롤리디노-포스포늄 헥사플루오로포스페이트(PyBroP) 2-(1H-벤조트라이아졸-1-일)-1,1,3,3-테트라메틸우로늄 헥사플루오로포스페이트(HBTU) 및 다이이소프로필카보다이이미드(DIC)이다. 한 태양에서, 상기 시약은 HBTU 또는 DIC이다. 다른 활성화제는 문헌 [Barany and Merrifield, The Peptiedes, Vol. 2, J. Meienhofer, ed., Academic Press, 1979, pp 1-284]에 기술되어 있다. 1-하이드록시벤조트라이아졸(HOBT), N-하이드록시숙신이미드(HOSu) 및 3,4-다이하이드로-3-하이드록시-4-옥소-1,2,3-벤조트라이아진(HOOBT)과 같은 다양한 시약들이 합성 사이클을 최적화하기 위해 커플링 혼합물에 첨가될 수 있다. 한 태양에서, HOBT가 첨가된다.
펩티드 합성 후에, 차단 기를 제거하고 펩티드를 수지로부터 절단할 수 있다. 예를 들면, 펩티드-수지는 실온에서 180 분 동안, 수지 그램당 100 ㎕ 에탄다이티올, 100 ㎕ 다이메틸설파이드, 300 ㎕ 아니솔 및 9.5 ml 트라이플루오로아세트산으로 처리될 수 있다. 또는, 펩티드-수지는 실온에서 90 분 동안, 수지 그램당 1.0 ml 트라이이소프로필 실란 및 9.5 ml 트라이플루오로아세트산으로 처리될 수 있다. 수지는 이어서 여과되고 펩티드는 냉각 에틸 에터의 첨가에 의해 침전될 수 있다. 이어서, 침전물을 원심분리하고 에터 층을 경사분리할 수 있다.
조 펩티드의 정제는, 예를 들면, 역상 C18 컬럼(50 x 250 mm, 300 Å, 10 ㎛) 상에서 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)에 의해 시마주(Shimadzu) LC-8A 시스템 상에서 수행될 수 있다. 펩티드는 최소량의 물 및 아세토니트릴에 용해되어 컬럼 상에 주입될 수 있다. 구배 용출은 일반적으로 60 ml/분의 유량에서 70 분간에 걸쳐 2% 내지 90% B(완충액 A: 0.1% TFA/H2O, 완충액 B: 0.1% TFA/CH3CN)에서 출발할 수 있다. UV 검출은 220/280 nm에서 설정된다. 생성물을 함유하는 분획들을 분리하고 그의 순도는 2.5 ml/분의 유량에서, 10 분간에 걸쳐 구배(2 내지 90%)[완충액 A: 0.1% TFA/H2O, 완충액 B: 0.1% TFA/CH3CN]하에 역상 퍼슈트(Pursuit) C18 컬럼(4.6 x 50 mm)을 이용하여 시마주 LC-10AT 분석 시스템 상에서 판정할 수 있다. 이어서, 고순도인 것으로 판정된 분획들을 취합하여 동결건조시킬 수 있다.
본 발명의 펩티드를 제조하기 위한 또 다른 가능한 방법은 실온에서 펩티드 합성을 위한 하기 프로토콜이다. 이 절차에서는, 일반적으로 하기의 단계들을 취한다:
모든 세척 및 커플링을 위한 용매들은 10 내지 20 ml/g 수지의 부피로 측정된다. 합성 전체에 걸쳐 커플링 반응은 완료 정도를 측정하기 위해 카이저 닌하이드린(Kaiser Ninhydrin) 검사에 의해 모니터링될 수 있다(문헌 [Kaiser et al., Anal. Biochem. 34, 595-598 (1970)]). 임의의 불완전 커플링 반응은 새로 제조된 활성화된 아미노산과 재커플링되거나, 또는 펩티드 수지를 전술한 바와 같이 아세트산 무수물로 처리하여 캡핑시킨다. 완전히 조립된 펩티드-수지는 남은 용매의 양에 따라서 수시간동안, 일반적으로 밤새, 진공하에서 건조된다.
본 발명의 아미노산 서열은 또한 당해 분야에 통상의 기술을 가진 자에게 공지된 방법에 의해 합성될 수 있다. 상기 방법으로는 마이크로파 펩티드 합성(문헌 [Murray J.K., Aral J. and Miranda L.P., Solid-Phase Peptide Synthesis Using Microwave Irradiation In Drug Design and Discovery. Methods in Molecular Biology, 2011, Volume 716, 73-88, DOI: 10.1007/978-1-61779-012-6_5]), 및 아미노산 서열의 고체 상태 합성(문헌 [Steward and Young, Solid Phase Peptide Synthesis, Freemantle, San Francisco, Calif. (1968)])이 포함되나, 이로 한정되지는 않는다. 예시적인 고체 상태 합성 방법은 메리필드(Merrifield) 공정이다(문헌 [Merrifield, Recent Progress in Hormone Res., 23:451 (1967)]).
본원에 기술된 바와 같은 본 발명의 화합물은 또한 약학적으로 허용되는 염의 형태로 제공될 수 있다. 바람직한 염의 예는 약학적으로 허용되는 유기산, 예를 들면, 아세트산, 락트산, 말레산, 시트르산, 말산, 아스콜브산, 숙신산, 벤조산, 살리실산, 메탄설폰산, 톨루엔설폰산, 트라이플루오로아세트산 또는 파모산뿐 아니라, 중합체 산, 예를 들면, 탄닌산 또는 카복시메틸 셀룰로스에 의해 형성된 염, 및 무기산, 예를 들면, 하이드로할산(예, 염산), 황산 또는 인산에 의한 염 등이다. 숙련된 전문가에게 공지되어 있는 약학적으로 허용되는 염을 수득하기 위한 임의의 절차를 사용할 수 있다.
본원에 언급된 모든 공개공보, 특허출원, 특허 및 기타 참조문헌은 본원에 전체로 참고로 인용된다.
실시예
본 발명은 하기 실시예를 참조하여 더 충분히 이해될 것이다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 이해되어서는 안된다.
모든 용매, 이소프로판올(iPrOH), 메틸렌 클로라이드(CH2Cl2), 다이메틸폼아미드(DMF) 및 N-메틸피롤리돈(NMP)은 피셔(Fisher) 또는 버딕 앤 잭슨(Burdick & Jackson)에서 구입하였으며, 더 증류하지 않고 사용하였다.
트라이플루오로아세트산은 할로카본(Halocarbon) 또는 플루카(Fluka)에서 구입하였으며, 더 정제하지 않고 사용하였다.
다이이소프로필카보다이이미드(DIC) 및 다이이소프로필에틸아민(DIPEA)은 플루카 또는 알드리치(Aldrich)에서 구입하였으며, 더 정제하지 않고 사용하였다.
하이드록시벤조트라이아졸(HOBT), 다이메틸설파이드(DMS) 및 1,2-에탄다이티올(EDT)은 시그마 케미칼 캄파니(Sigma Chemical Co.)에서 구입하였으며, 더 정제하지 않고 사용하였다.
보호된 아미노산은 일반적으로 L 형태를 가지며, 바켐(Bachem) 또는 네오시스템(Neosystem)으로부터 상업적으로 입수하였다.
상기 시약들의 순도는 사용전에 박층 크로마토그래피, NMR 및 융점에 의해 확인하였다.
벤즈하이드릴아민 수지(BHA)는 바켐(Bachem) 또는 어드밴스드 켐테크(Advanced Chemtech)에서 구입한 스티렌 - 1% 다이비닐벤젠(100 내지 200 또는 200 내지 400 메쉬)의 공중합체였다. 이들 수지의 총 질소 함량은 일반적으로 0.3 내지 1.2 meq/g이었다.
고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)는 CLASS-VP-7.3 소프트웨어 시스템을 구비한 자동화 시마주 HPLC 상에서 수행하였다. 분석용 HPLC는 퍼슈트 C18 컬럼(4.5 x 50 mm)을 사용하여 역상 방식으로 수행하였다.
예비 HPLC 분리는 역상 배리언(Varian)(퍼슈트) 또는 워터스(Waters)(엑스테라(Xtera) 또는 엑스브리지(Xbridge)) C18 컬럼(50 x 250 mm) 상에서 실행하였다.
실시예 1
하기의 실시예는 마이크로파 펩티드 합성을 위한 전형적인 예시적 프로토콜을 기술한다.
제조사에 의해 공급된 소프트웨어를 이용하여 미리부하된 0.25 밀리몰 사이클의 수정에 의해 리버티 펩티드 합성기(씨이엠 코포레이션, 미국 노스캐롤라이나주 매튜스 소재)를 이중 커플링 및 캡핑에 맞춰 프로그램화하였다. 마이크로파 편집프로그램을 이용하여 Fmoc 탈보호, 아미노산 커플링 및 아세트산 무수물에 의한 캡핑시 사용하기 위한 마이크로파 전력 방법을 프로그램화하였다. 아미노산 첨가 및 최종 탈보호를 위한 디폴트 사이클은 사이클 편집프로그램에서 선택하였으며 펩티드를 생성하는 동안 자동으로 부하되었다.
합성은 Fmoc-연결기-BHA 수지(450 mg, 0.25 밀리몰; 아나스펙, 인코포레이티드(AnaSpec, Inc.)(미국 캘리포니아주 프레몬트 소재)에서 시판)를 사용하여 0.25 밀리몰 스케일로 수행하였다. 탈보호는 DMF중 20% 피페리딘 용액을 사용하여 수행하였다. 모든 커플링 반응은 0.5M HBTU 및 2M N-메틸 모폴린(NMM)을 사용하여 수행하였으며, 각각의 아미노산 커플링 후에 DMF 중의 25% 아세트산 무수물로 캡핑하였다(프로토콜 2). 각각의 탈보호, 커플링 및 캡핑 반응은 35 와트 전력 및 질소 버블링하에 75 ℃에서 360 초동안 마이크로파를 사용하여 수행하였다.
각각의 아미노산 커플링의 경우, 하기 0.25 밀리몰 커플링 사이클을 이용하였다.
프로토콜 2
수지를 용기로 옮긴다.
20% 피페리딘 탈보호 용매(10 ml)를 첨가한다.
최대 75 ℃에서 30 초동안 1차 탈보호를 위한 마이크로파 방법을 수행한다.
수지를 DMF(10 ml)로 세척한다.
최대 75 ℃에서 180 초동안 2차 탈보호를 위한 마이크로파 방법을 수행한다.
수지를 DMF(10 ml)로 3회 세척한다.
0.2M 아미노산(5 ml)을 첨가한다.
0.5M 활성화제(HBTU)(2 ml)를 첨가한다.
2M 활성화 염기(NMM)(1 ml)를 첨가한다.
최대 75 ℃에서 6 분동안 커플링을 위한 마이크로파 방법을 수행한다.
수지를 DMF(10 ml)로 세척한다.
0.2M 아미노산(5 ml)을 첨가한다.
0.5M 활성화제(HBTU)(2 ml)를 첨가한다.
2M 활성화 염기(NMM)(1 ml)를 첨가한다.
최대 75 ℃에서 6 분동안 커플링을 위한 마이크로파 방법을 수행한다.
수지를 DMF(10 ml)로 3회 세척한다.
마지막 아미노산 커플링 후에 펩티드를 DMF 중의 25% 아세트산 무수물로 캡핑시켰다(프로토콜 3).
프로토콜 3
수지를 DMF(10 ml)로 3회 세척한다.
20% 피페리딘 탈보호 용매(10 ml)를 첨가한다.
최대 75 ℃에서 30 초동안 1차 탈보호를 위한 마이크로파 방법을 수행한다.
수지를 DMF(10 ml)로 세척한다.
최대 75 ℃에서 180 초동안 2차 탈보호를 위한 마이크로파 방법을 수행한다.
수지를 DMF(10 ml)로 3회 세척한다.
캡핑 용매(아세트산 무수물 10 ml)를 첨가한다.
최대 75 ℃에서 180 초동안 2차 마이크로파 방법(캡핑)을 수행한다.
수지를 DMF(10 ml)로 3회 세척한다.
실시예 2
Ac-Met-Ala-Lys-Leu-Lys-Tyr-Trp-Leu-Leu-Ala-Leu-Phe-Val-Tyr-Met-Trp-Thr-Asp-Leu-Leu-Leu-Phe-Lys-Lys-Arg-Pro-Lys-Pro-NH2(서열번호 9)의 합성
CEM 마이크로파 펩티드 합성기 상에서 Fmoc 화합물을 사용하여 상기 펩티드를 합성하였다. 합성기는 실시예 1의 프로토콜 2 및 3에 기술된 모듈을 이용하여 이중 커플링에 맞춰 프로그램화하였다. 합성은 Fmoc 링크 아미드 MBHA 수지(Sub: 0.45 meq/g; 사용량 450 mg)를 사용하여 0.25 밀리몰 스케일로 수행하였다. 합성 마지막에, 수지를 절단을 위해 진탕기 상의 반응 용기로 옮겼다. 실온에서 1.5 시간동안 17 ml의 97% TFA(3% 물) 및 1 ml의 TIS 및 프로판 티올(1:2)을 사용하여 펩티드를 절단하였다. 탈보호 용액을 100 ml의 차가운 Et2O에 첨가하고, 1 ml TFA 및 30 ml의 차가운 Et2O로 세척하여 펩티드를 침전시켰다. 펩티드를 2 x 50 ml 폴리프로필렌 튜브에서 원심분리시켰다. 개개 튜브로부터 침전물을 단일 튜브에서 혼합하고 차가운 Et2O로 3회 세척하고 하우스 진공하에 데시케이터에서 건조시켰다.
조 펩티드를 엑스테라 C18-컬럼(250 x 50 mm, 10 ㎛ 입자 크기) 상에서 예비 HPLC(시마주)에 의해 정제하고, 90 분동안 유량 60 ml/분 및 검출 파장 220/280 nm에서 10 내지 99% B(완충액 A: 0.1% TFA/H2O; 완충액 B: 0.1% TFA/CH3CN)의 선형 구배로 용출시켰다. 분획들을 수거하고 분석용 HPLC로 검사하였다. 모든 분석 실행들은 A: 0.1% 물/TFA 및 B: 0.1% 아세토니트릴/TFA를 사용하여 10 내지 99%의 구배를 이용하여 C18 역상 워터스 엑스테라/퍼슈트 4.6 x 50 mm 컬럼을 이용하여 시마주 HPLC 상에서 수행하였다. 순수한 생성물을 함유하는 분획들을 합하고 동결건조시켜 197 mg(19%)의 백색 무정형 분말을 수득하였다. C177H273N39O34S2에 대해 계산된 (ES)+-LCMS m/e 3555.52, 측정치 35552.49.
실시예 3
Ac-Met-Ala-Asn-Leu-Ala-Tyr-Trp-Leu-Leu-Ala-Leu-Phe-Val-Tyr-Met-Trp-Thr-Asp-Leu-Arg-Leu-Phe-Lys-Lys-Arg-Pro-Lys-Pro-NH2(서열번호 10)의 합성
Fmoc 링크 아미드 MBHA 수지(450 mg, 0.25 밀리몰)를 일반적으로 실시예 2에서의 절차에 따라 고체상 합성 및 정제에 적용하여 73 mg(7%)의 백색 무정형 분말을 수득하였다. C173H261N41O35S2에 대해 계산된 (ES)+-LCMS m/e 3527.39, 측정치 3527.31.
실시예 4
Ac-Met-Ala-Asn-Leu-Ala-Tyr-Trp-Leu-Leu-Ala-Leu-Phe-Val-Tyr-Met-Trp-Thr-Asp-Leu-Arg-Leu-tBuAla-Lys-Lys-Arg-Pro-Lys-Pro-NH2(서열번호 11)의 합성
Fmoc 링크 아미드 MBHA 수지(450 mg, 0.25 밀리몰)를 일반적으로 실시예 2에서의 절차에 따라 고체상 합성 및 정제에 적용하여 54 mg(5%)의 백색 무정형 분말을 수득하였다. C170H265N41O35S2에 대해 계산된 (ES)+-LCMS m/e 3507.39, 측정치 3506.98.
실시예 5
특정 서열들(서열번호 7, 12 내지 21 및 23 내지 30, 45 내지 46, 52 내지 67 및 81 내지 83)의 합성은 고체 상태 합성에 의해[씨에스바이오(CSBio, 미국 캘리포니아주 멘로 파크 소재)에 의해] 수행하였다(문헌 [Steward and Young, Solid Phase Peptide Synthesis, Freemantle, San Francisco, Calif. (1968)]). 상기 서열들에 대한 고체 상태 합성을 위한 하기의 일반적인 예시적 방법을 기술한다.
재료:
모든 화학물질 및 용매, 예를 들면, DMF(다이메틸 폼아미드), DCM(메틸렌 클로라이드), DIEA(다이이소프로필에틸아민) 및 피페리딘은 VWR 및 알드리치로부터 구입하였으며, 더 정제하지 않고 구입한 대로 사용하였다. 질량 스펙트럼은 전자분무 이온화 방식으로 기록하였다. 보호된 아미노산의 자동화 단계적 조립은 중합체 지지체로서 링크 아미드 MBHA 수지를 사용하여 CS 336X 시리즈 펩티드 합성기(씨에스 바이오 캄파니(CS Bio Company), 미국 캘리포니아주 멘로 파크 소재) 상에서 수행하였다. N-(9-플루오레닐)메톡시카보닐(Fmoc) 화합물을 합성에 사용하였다. Fmoc 아미노산(AA)에 대한 보호기는 다음과 같다: Arg: (Pbf), Asn/Gln/Cys/His: (Trt), Asp/Glu: (OtBu), Lys/Trp: (Boc), Ser/Thr/Tyr: (tBu).
합성:
일반적으로, 합성 경로는 미리부하된 링크 아미드 수지의 Fmoc 제거(deFmoc) 및 모든 순서에 있어 주어진 서열들에 따라 바람직한 AA의 커플링/탈보호로부터 출발하였다. 커플링 시약은 DIC/HOBt이었으며, 반응 용매는 DMF 및 DCM이었다. 펩티딜 수지/AA/DIC/HOBT의 비는 1/4/4/4(몰/몰)이었다. 커플링 프로그램 후에, DMF 중의 20% 피페리딘을 사용하여 Fmoc 제거를 수행하였다. 예를 들면, 마지막 AA가 부착될 때까지 0.4 밀리몰 합성이 수행되었다. Fmoc 제거후, 수지를 Ac2O/DIEA로 아세틸화시켜 N-말단 Ac 서열을 수득하였다.
Fmoc-링크 아미드 수지(0.85 g, 0.4 밀리몰, sub: 0.47 mm/g, Lot#110810, 씨에스바이오)를 25 ml 반응 용기(RV)에서 DMF(10 ml)와 혼합하고, 10 내지 30 분동안 팽창시켰다. RV를 CS336 펩티드 자동화 합성기 상에 탑재하고 아미노산을 주어진 펩티드 서열에 따라 아미노산(AA) 휠 상에 부하시켰다. HOBt(DMF 중 0.5M) 및 DIC(DMF 중 0.5M)를 모두 N2 하에 이동가능한 병에서 별도로 미리-용해시켰다. Fmoc-아미노산(AA, 4 당량)을 계량하고 분말로서 AA 휠 상에 미리 위치시켰다. 예를 들면, 0.4 밀리몰 합성은 1.6 밀리몰의 AA를 필요로 하였다. 미리설정된 프로그램은 AA 튜브에서의 AA 용해로부터 출발하였으며, 용액을 M-VA를 통해 T-VA로 펌핑시켰다. HOBt 용액을 나중에 AA와 혼합하였다. N2 버블링을 이용하여 혼합을 촉진시켰다. DIC 용액을 AA/HOBt 용액과 혼합시키는 동안, 전체 혼합물을 5 분내에 수지를 배출시키면서 RV 내로 옮기는 동시에 커플링을 개시하였다. 3 내지 6 시간동안 진탕한 후에, 반응 혼합물을 여과시키고, 수지를 DMF로 3회 세척한 다음, DMF 중의 20% Pip를 사용하여 미리설정된 프로그램에 따라 Fmoc 제거를 수행하였다. 그 다음 AA를 동일 경로를 따라 결합시켰다. Fmoc 제거후에 7단계의 세척 단계를 DMF/DCM으로 양자택일적으로 수행하였다. 마지막 AA가 커플링될 때까지 주어진 순서에 따라 각각의 구성 블록을 사용하여 커플링 과정을 반복하였다. 커플링 시간은 각각의 AA 결합에 3 내지 6 시간이었다.
마지막 AA의 Fmoc 제거 후에, 수지를 DMF 중 Ac2O/DIEA로 아세틸화시켰다.
절단:
최종 펩티딜 수지(1 내지 1.5 g)를 TFA 칵테일(TFA/EDT/TIS/H2O)과 혼합하고 혼합물을 실온에서 4 시간동안 진탕시켰다. 분리된 펩티드를 여과시키고 수지를 TFA로 세척하였다. 에터 침전 및 세척 후에, 조 펩티드(200 내지 500 mg)를 50 내지 90%의 수율로 수득하였다. 조 펩티드를 동결건조하지 않고 직접 정제하였다.
정제:
조 펩티드, 200 내지 500 mg의 아세틸화 펩티드를 완충액 A(물 및 ACN 중의 0.1% TFA)에 용해시키고, 펩티드 용액을 예비 HPLC 정제 시스템 하에 C18 컬럼(2 인치) 상에 부하시켰다. 25 내지 40 ml/분의 유량하에, 60 분 구배하에 TFA(0.1%) 완충 시스템에서 정제를 마무리하였다. 예상된 MW를 함유하는 분획(펩티드 순도>95%)을 수거하였다. 이어서, 예비 HPLC 컬럼을 80% 완충액 B로 3 이상의 공극 컬럼 부피에 대해 세척하고, 다음 부하 전에 5% 완충액 B로 평형화시켰다.
동결건조:
분획들(순도>90%)을 합하고, 1 L 동결건조 자(jar)로 옮기고 액체 질소에 의해 급속 냉동시켰다. 냉동후에, 상기 자를 동결건조기(버티스 프리즈모바일(Virtis Freezemobile) 35EL) 상에 놓고 밤새 건조시켰다. 진공은 500 mT 미만이었으며, 챔버 온도는 -60 ℃ 미만이었다. 동결건조는 실온(주위 온도)에서 12 내지 18 시간 내에 완료되었다.
결과:
절차는 각 서열에 대해 약 0.4 mm 합성으로 출발하였다. 합성 수율은 약 50 내지 90%이었고, 조생성물 순도는 30 내지 70% 범위였다. 정제는 TFA 시스템에서 수행하였으며 최종 수율은 각 순서에 대해 약 10%이었다.
실시예 5a
Ac-Lys-Arg-Tyr-Asp-Arg-Glu-Phe-Leu-Leu-Ala-Phe-Gln-Phe-Nle-Val-Tyr-Asp-Leu-Gly-Leu-Arg-Arg-Leu-Arg-Gln-Arg-Arg-Arg-Leu-Arg-Arg-NH2(서열번호 7)의 합성
상기 펩티드를 고체 상태 합성에 의해 상기 실시예 5에 따라 합성하였다. 서열번호 7의 특정 제조시에, Fmoc 링크 아미드 MBHA 수지(0.55 g, 0.25 밀리몰)를 실시예 5에서의 절차에 따라 고체상 합성 및 정제에 적용하여 17 mg(2.6%)를 수득하였다. C186H307N65O41에 대해 계산된 (ES)+-LCMS m/e 측정치 4110.40.
실시예 6
인간 eIF4E에 대한 펩티드 결합을 검사하기 위해 생화학 분석을 실행하였다. C-말단 His 태그(HH-eIF4E, 서열번호 88)를 갖는 인간 eIF4E(aa 28 내지 217, 서열번호 87)를 에스케리키아 콜라이에서 봉입체(inclusion body) 중에 발현시켰다. 단백질을 8M 우레아로 가용화시키고, 니켈-충전된 HisTrap HP 컬럼(지이 헬쓰케어(GE Healthcare))을 사용하여 변성 조건하에서 정제하였다. 단백질을 6 M 우레아, 20 mM Hepes, pH 7.0, 500 mM NaCl, 1 mM DTT, 1 mM EDTA 및 0.5 M 아르기닌·HCl로 약 0.25 mg/ml로 희석시켜 리폴딩시킨 다음, 우레아를 함유하지 않는 동일한 완충액내에 밤새 투석시켰다. 단백질을 20 mM Hepes, pH 6.5, 50 mM NaCl, 1 mM EDTA 및 1 mM DTT 내로 더 투석시키고, 여과시킨 다음, Hitrap SP 세파로스 FF 컬럼(지이 헬쓰케어)을 사용하여 농축시켰다. 단백질을 20 mM Hepes, pH 7.0, 500 mM NaCl, 5 mM DTT 및 10% 글리세롤 내로 투석시키고, 사용할 때까지 -80 ℃에서 저장하였다.
시험 펩티드(DMSO 중의 1.6 mM 저장액)를 DMSO 중에서 연속하여 3배 희석시키고, 용액을 분석 완충액(50 mM NaPi, pH 6.5, 50 mM KCl, 1 mM DTT, 0.004% NP40 및 0.5 mg/ml 감마글로불린) 중에서 4배 희석하였다. 웰 당 6 ㎕의 희석 펩티드 용액 및 분석 완충액 중의 웰당 12 ㎕의 187.5 nM HH-eIF4E를 384-웰 폴리프로필렌 마이크로플레이트(매트릭스, 서멀 사이언티픽(Matrix, Thermal Scientific))에 첨가하였다. 분석 완충액 중의, 웰 당 12 ㎕의 187.5 nM 비오틴 표지된 4G2 펩티드(Ac-Lys-Gln-Tyr-Asp-Arg-Glu-Phe-Leu-Leu-Asp-Phe-Gln-Phe-Met-Pro-Lys(Aha-Bio)-NH2(서열번호 91) 1:2 TFA)를 첨가하였다. 샘플을 실온에서 20 분동안 배양하였다.
이어서, 분석 완충액(DTT 비함유) 중의 웰 당 6 ㎕의 4.8 nM Eu-스트렙타비딘(콜럼비아 바이오사이언시즈(Columbia Biosciences)) 및 48 nM 알로피코시아닌-항 His 항체(콜럼비아 바이오사이언시즈)를 첨가하고 샘플을 실온에서 30 분간 배양하였다. 엔비젼 리더(Envision Reader)(퍼킨엘머 라이프 앤 어낼리티컬 사이언시즈(PerkinElmer Life and Analytical Sciences)) 상에서 665 nm에서 발광 형광을 판독함으로써 분석 신호를 모니터링하였다. 콘도세오(Condoseo) 소프트웨어(진데이터 아게(Genedata AG), 스위스 바젤 소재)를 사용하여 IC50 값을 계산하였다. 본 발명에 있어서, 20 μM 미만의 IC50 값은 우수한 것으로 간주하고, 10 μM 미만의 IC50 값은 바람직한 것으로, 및 5 μM 미만, 특히 1 μM 미만의 IC50 값이 가장 바람직하였다.
결합 친화도- IC50으로 나타냄 -는 0.21 μM(서열번호 7), 4.404 μM (서열번호 9), 6.614(서열번호 10) 및 2.373 μM(서열번호 11)이었다.
실시예 7
NCI-H460 세포에서 eIF4E로부터 eIF4G의 변위를 평가하기 위해 하기 연구를 수행하였다.
NCI-H460 세포는 ATCC(미국 버지니아주 머내서스 소재)로부터 입수하였으며, 5% CO2 하에 37 ℃에서 10% 태아 소 혈청을 함유하는 RPMI-1640 배지중에 유지시켰다. 세포를 웰당 0.75 x 106 세포의 농도로 6-웰 플레이트에 접종하였다. 24 시간 후에, DMSO(대조군)(시그마-알드리치, D2650) 또는 펩티드를 지시된 농도에서 세포에 첨가하고, 37 ℃에서 3 시간동안 배양하였다. 처리된 세포를 2 ml 얼음 냉각시킨 PBS로 헹구었다. 플레이트를 얼음 위에 놓고, 프로테아제 억제제(로슈 어플라이드 사이언스(Roche Applied Science) 04 693 159 001)를 함유하는 500 ㎕ RIPA 용균 완충액(시그마 알드리치 R0278)을 각 웰에 가하였다. 5 분후에, 세포 단층을 긁어 내어 세포를 제거하고 용해물을 1.5 ml 원추형 튜브로 옮기고 30 분동안 얼음 위에서 배양하였다. 이어서, 각 샘플을 얼음위에서 10초동안 초음파처리하고, 불용성 단편들을 원심분리에 의해 제거하였다. eIF4E 및 결합 단백질의 친화성 정제를 위해, 25 ㎕의 미리-세정된 7-메틸-GTP 세파로스(등록상표) 4B(지이 헬쓰케어 275025)를 청정화된 용해물에 가하고 4 ℃에서 진동 플랫폼 상에서 16 시간동안 배양하였다. 세파로스 비드를 1000g에서 펠릿화하고 RIPA 완충액으로 2회 및 PBS로 2회 세척하였다. 세파로스 비드를 2X LDS 샘플 완충액(인비트로겐(InVitrogen) NP007)에 현탁시키고 95 ℃에서 5 분동안 가열하여 eIF4E 및 결합 단백질을 용출시켰다.
단백질을 비스-트리스 4 내지 12% 구배 겔 상에서 전기영동에 의해 분리하였다. PVDF 막으로의 단백질의 반-건식 전기영동 이동 전에 겔을 20 분동안 10% 메탄올을 함유하는 2X 이동 완충액(인비트로겐 NP0006-1)에 침지시켰다. 각각 1:1,000, 1:10,000 및 1:5000의 희석률에서 eIF4G(셀 시그널링 테크놀로지(Cell Signaling Technology) #2858), eIF4E(셀 시그널링 테크놀로지 #9742) 및 4E-BP1(셀 시그널링 테크놀로지 #9644)에 대한 항체를 사용하여 단백질을 검출하였다. 화학발광 신호가 증대된 화학발광 플러스(ECL)(지이 헬쓰케어 RPN2132)에 의해 발생되었으며 후지필름(Fujifilm) LAS-3000 영상장치(imager)를 사용하여 검출하였다.
실시예 8
사이토톡스-원(CytoTox-ONE, 등록상표) 호모지니어스 멤브레인 인테그리티(Homogeneous Membrane Integrity)(카탈로그 번호 G7890; 프로메가 코포레이션(Promega corp.), 미국 위스콘신주 매디슨 소재)를 사용하여, 펩티드 세포독성을 평가하기 위해 하기 락테이트 디하이드로게나제 방출(LDH) 분석을 수행하였다.
시약 제조: 기질 혼합물 및 분석 완충액을 22 ℃로 평형화시켰다. 11 ml의 분석 완충액을 기질 혼합물의 각 바이알에 첨가하여 사이토톡스-원(등록상표) 시약을 제조하고 약하게 혼합하여 기질을 용해시켰다.
3개의 하기 대조군을 실험에 사용하였다: 1) 무세포 대조군: 존재할 수 있는 배경 형광을 측정하기 위한 음성 대조군으로 사용하기 위한 세포를 함유하지 않는 웰; 2) 미처리 세포 대조군: 대조군으로 사용하기 위한 비히클(DMSO) 처리된 세포를 함유하는 웰; 3) 최대 LDH 방출 대조군: 양성 대조군 웰에 40 ㎕의 용균 용액을 첨가함으로써 최대 LDH 방출을 측정하기 위한 웰을 제조하였다.
세포독성 분석 프로토콜:
1. NCI-H460 세포를 ATCC(미국 버지니아주 머내서스 소재)로부터 입수하고, 37 ℃에서 5% CO2 하에 10% 태아 소 혈청을 함유하는 RPMI-1640 배지에서 유지시켰다. 세포를 분석 24 시간 전에 웰 당 0.75 x 106 세포의 농도로 6-웰 플레이트에 시딩(seeding)하였다.
2. 24 시간 후에, DMSO(대조군) 또는 펩티드를 지시된 농도로 세포에 첨가하고 37 ℃에서 3 시간동안 배양하였다. 처리 기간 초기에 용균 용액을 첨가하여 최대 LDH 방출 대조군을 제조하였다. 상기 대조군에 대해 수득된 값은 100% LDH 방출을 나타낸다.
3. 분석 플레이트를 37 ℃ 배양기로부터 꺼내고 22 ℃로 평형화시켰다(약 20 내지 30 분).
4. 100 ㎕의 배지를 대조군 및 처리된 세포로부터 제거하고 3중으로 96-웰 플레이트로 옮겼다.
5. 100 ㎕의 사이토톡스-원(등록상표) 시약을 각 웰에 첨가하고 30 초동안 혼합하였다.
6. 분석 플레이트를 22 ℃에서 10 분동안 배양하였다.
7. 50 ㎕의 정지 용액을 각 웰에 가하였다.
8. 플레이트를 10 초동안 혼합하고, 560 nm의 여기 파장 및 590 nm의 방출 파장을 사용하여 형광을 기록하였다.
결과 산출:
배양 배지 배경의 평균 형광 값을 실험 웰의 모든 형광 값에서 감하였다.
실험적인 최대 LDH 방출 및 배양 배지 배경으로부터의 평균 형광 값을 사용하여 세포독성 퍼센트를 산출하였다:
세포독성 퍼센트 = 100 x (실험 - 배양 배지 배경)/(최대 LDH 방출 - 배양 배지 배경).
대조군(<10%)에 필적하는 LDH 방출하에, 서열번호 7 및 9 내지 11을 갖는 펩티드는 20 μM 이하의 농도에서 세포독성이 아니다.
실시예 9
4 및 24 시간 후에 하노버 위스타(Hannover Wistar) 래트 및 인간 혈장에서 실시예 2 내지 4(서열번호 9, 10 및 11)의 화합물의 안정성을 평가하기 위해 하기 연구를 수행하였다.
대략적으로, 실시예 2 내지 4(서열번호 9, 10 및 11)의 화합물 2.0 mg를 계량하고 4 ml 갈색 바이알에 넣었다. 여기에 1.0 ml DMSO를 첨가하였다. 상기 바이알을 조심스럽게 볼텍싱하여 약 600 μM의 용액을 생성하였다.
하노버 위스타 래트 혈장 및 인간 혈장(항-응고 나트륨 EDTA)을 수조에서 30 분동안 37 ℃로 예열하였다. 두 혈장 모두의 pH를 pH 7.4로 조정하였다. 1.5 ml 미세원심분리기 바이알을 사용하였다.
실시예 2 내지 4의 화합물의 저장 용액을 래트 또는 인간 혈장 내에 10 μM의 최종 농도로 희석하였다. 2개의 바이알을 약하게 볼텍싱하여 적절히 혼합되게 하였다.
6개의 새로운 바이알을 다음과 같이 표지하였다: 래트 T0, 래트 T4, 래트 T24, 인간 T0, 인간 T4, 인간 T24. 상기 바이알들 각각에, 50 ㎕의 처리된 혈장을 가하였다. T4 및 T24 바이알을 캡핑하고 37 ℃ 배양기에 각각 4 시간 및 24 시간동안 두었다.
2개의 T0 바이알 각각에, 50 ㎕의 소렌센(Sorensen) 완충액 및 아세토니트릴중 1.0% 아세트산 200 ㎕를 가하였다. 이어서, T0 바이알을 캡핑하고, 볼텍싱하고, 10000 x g에서 10 분동안 원심분리하였다. 원심분리 완료시, 각 바이알의 상등액 100 ㎕를 96-웰 주입 블록 중 별개의 웰에 가하였다. 이어서, 밀리-큐(Milli-Q, 등록상표)수(밀리포어(Millipore)) 중 0.1% 아세트산 200 ㎕를 각 웰에 가하였다.
T0 바이알에 대해 기록된 바와 같은 상기 절차를 4 시간 시점에서 2개의 T4 바이알 및 24 시간 시점에서 T24 바이알에 대해 반복하였다. 각 시점에서 새로운 T0 샘플을 전술한 바와 같이 제조하여 샘플 분해가 없게 하였다.
모든 샘플은 LC/MS/MS에 의해 분석하였다. 수득된 크로마토그래프를 처리하여 각 샘플에 대한 피크 면적을 수득하였다. 비교 T0 샘플에 존재하는 양에 비해 각 시점에서 잔류하는 화합물의 퍼센트를 산출하였다.
Figure pct00002
데이터는 화합물들이 4 시간째에 래트 혈장에서 안정하지만 24 시간 시점에서는 허용 범위 약간 미만임을 나타낸다. 펩티드는 인간 혈장에서 4 시간 및 24 시간 시점 둘 다에서 안정하였다.
실시예 10 내지 83: 서열번호 12 내지 85의 합성
나타낸 바와 같은 실시예 2 및 5의 일반 방법(CSBIO)에 따라 하기 서열들(서열번호 12 내지 85)을 제조하였다. 이용가능한 경우 질량 분석 및 수율 결과를 각각의 서열번호에 나타내었다.
10. Ac-Met-Val-Lys-Tyr-Lys-Ile-Gly-Ser-Leu-Leu-Leu-Phe-Leu-Val-Ala-Met-Trp-Ser-Asp-Val-Gly-Leu-Cys-Lys-Lys-Arg-Pro-Lys-Pro-NH2(서열번호 12)의 합성. Fmoc 링크 아미드 MBHA 수지(0.61 g, 0.25 밀리몰)를 실시예 5에서의 절차에 따라 고체상 합성 및 정제에 적용하여 53 mg(6%)를 수득하였다. C167H270N40O36S3에 대해 계산된 (ES)+-LCMS m/e 측정치 3510.41.
11. Ac-Met-Val-Lys-Ser-Lys-Tyr-Gly-Ser-Trp-Ile-Leu-Leu-Leu-Phe-Val-Ala-Met-Trp-Ser-Asp-Val-Gly-Leu-Cys-Lys-Lys-Arg-Pro-Lys-Pro-NH2(서열번호 13)의 합성. Fmoc 링크 아미드 MBHA 수지(0.61 g, 0.25 밀리몰)를 실시예 5에서의 절차에 따라 고체상 합성 및 정제에 적용하여 128 mg(14.5%)를 수득하였다. C166H265N41O37S3에 대해 계산된 (ES)+-LCMS m/e 측정치 3523.37.
12. Ac-Met-Tyr-Lys-Ser-Lys-Ile-Leu-Leu-Trp-Phe-Leu-Val-Leu-Phe-Val-Ala-Met-Trp-Ser-Asp-Val-Gly-Leu-Cys-Lys-Lys-Arg-Pro-Lys-Pro-NH2(서열번호 14)의 합성. Fmoc 링크 아미드 MBHA 수지(0.61 g, 0.25 밀리몰)를 실시예 5에서의 절차에 따라 고체상 합성 및 정제에 적용하여 85 mg(9.3%)를 수득하였다. C176H277N41O36S3에 대해 계산된 (ES)+-LCMS m/e 측정치 3639.57.
13. Ac-Met-Val-Lys-Ser-Lys-Ile-Tyr-Ser-Trp-Ile-Leu-Leu-Leu-Phe-Phe-Ala-Met-Trp-Ser-Asp-Val-Gly-Leu-Cys-Lys-Lys-Arg-Pro-Lys-Pro-NH2(서열번호 15)의 합성. Fmoc 링크 아미드 MBHA 수지(0.61 g, 0.25 밀리몰)를 실시예 5에서의 절차에 따라 고체상 합성 및 정제에 적용하여 87 mg(9.6%)를 수득하였다. C174H273N41O37S3에 대해 계산된 (ES)+-LCMS m/e 측정치 3627.52.
14. Ac-Met-Ala-Asn-Leu-Gly-Tyr-Trp-Leu-Leu-Ala-Leu-Phe-Val-Tyr-Met-Trp-Thr-Asp-Leu-Leu-Leu-Phe-Lys-Lys-Arg-Pro-Lys-Pro-NH2(서열번호 16)의 합성. Fmoc 링크 아미드 MBHA 수지(0.61 g, 0.25 밀리몰)를 실시예 5에서의 절차에 따라 고체상 합성 및 정제에 적용하여 100 mg(11.5%)를 수득하였다. C171H258N38O35S2에 대해 계산된 (ES)+-LCMS m/e 측정치 3470.28.
15. Ac-Met-Val-Lys-Tyr-Lys-Ile-Ala-Ser-Leu-Leu-Leu-Phe-Leu-Phe-Val-Ala-Met-Trp-Ser-Asp-Val-Ala-Leu-Ala-Lys-Lys-Arg-Pro-Lys-Pro-NH2(서열번호 17)의 합성. Fmoc 링크 아미드 MBHA 수지를 실시예 5에서의 절차에 따라 고체상 합성 및 정제에 적용하였다. C169H274N40O36S2에 대해 계산된 (ES)+-LCMS m/e 측정치 3506.4.
16. Ac-Met-Val-Lys-Tyr-Lys-Ile-Ala-Ser-Leu-Leu-Leu-Phe-Leu-Phe-Val-Ala-Met-Trp-Ser-Asp-Val-Lys-Leu-Lys-Lys-Lys-Arg-Pro-Lys-Pro-NH2(서열번호 18)의 합성. Fmoc 링크 아미드 MBHA 수지를 실시예 5에서의 절차에 따라 고체상 합성 및 정제에 적용하였다. C175H288N42O36S2에 대해 계산된 (ES)+-LCMS m/e 측정치 3620.59.
17. Ac-Met-Tyr-Lys-Ser-Lys-Ile-Leu-Leu-Trp-Phe-Leu-Val-Leu-Phe-Val-Ala-Met-Trp-Ser-Asp-Val-Ala-Leu-Ala-Lys-Lys-Arg-Pro-Lys-Pro-NH2(서열번호 19)의 합성. Fmoc 링크 아미드 MBHA 수지를 실시예 5에서의 절차에 따라 고체상 합성 및 정제에 적용하였다. C177H279N41O36S2에 대해 계산된 (ES)+-LCMS m/e 측정치 3621.53.
18. Ac-Met-Val-Lys-Ser-Lys-Ile-Tyr-Ser-Trp-Ile-Leu-Leu-Leu-Phe-Phe-Ala-Met-Trp-Ser-Asp-Val-Ala-Leu-Ala-Lys-Lys-Arg-Pro-Lys-Pro-NH2(서열번호 20)의 합성. Fmoc 링크 아미드 MBHA 수지를 실시예 5에서의 절차에 따라 고체상 합성 및 정제에 적용하였다. C175H275N41O37S2에 대해 계산된 (ES)+-LCMS m/e 측정치 3609.48.
19. Ac-Met-Val-Lys-Ser-Lys-Ile-Tyr-Ser-Trp-Ile-Leu-Leu-Leu-Phe-Phe-Ala-Met-Trp-Ser-Asp-Val-Lys-Leu-Lys-Lys-Lys-Arg-Pro-Lys-Pro-NH2(서열번호 21)의 합성. Fmoc 링크 아미드 MBHA 수지를 실시예 5에서의 절차에 따라 고체상 합성 및 정제에 적용하였다. C181H289N43O37S2에 대해 계산된 (ES)+-LCMS m/e 측정치 3723.67.
20. Ac-Lys-Arg-Tyr-Asp-Arg-Glu-Phe-Leu-Leu-Ala-Phe-Gln-Phe-Nle-Arg-Arg-Leu-Arg-Gln-Arg-Arg-Arg-Leu-Arg-Arg-Glu-Arg-Val-Arg-Ala-NH2(서열번호 22)의 합성. Fmoc 링크 아미드 MBHA 수지를 실시예 2에서의 절차에 따라 고체상 합성 및 정제에 적용하여 44 mg(3%)를 수득하였다. C181H306N70O40에 대해 계산된 (ES)+-LCMS m/e 측정치 4102.86.
21. Ac-Lys-Arg-Tyr-Asp-Arg-Glu-Phe-Leu-Leu-Ala-Phe-Gln-Phe-Nle-Val-Tyr-Asp-Leu-Gly-Leu-Arg-Arg-Leu-Arg-Gln-Arg-Arg-Arg-Leu-Arg-Arg-Glu-Arg-Val-Arg-Ala-NH2(서열번호 23)의 합성. Fmoc 링크 아미드 MBHA 수지(0.55 g, 0.25 밀리몰)를 실시예 5에서의 절차에 따라 고체상 합성 및 정제에 적용하여 38.6 mg(3.3%)를 수득하였다. C211H352N76O48에 대해 계산된 (ES)+-LCMS m/e 측정치 4721.59.
22. Ac-Ala-Arg-Val-Tyr-Asp-Leu-Gly-Leu-Arg-Arg-Leu-Arg-Gln-Arg-Arg-Arg-Leu-Arg-Arg-Glu-Arg-Val-Arg-Ala-Lys-Arg-Tyr-Asp-Arg-Glu-Phe-Leu-Leu-Ala-Phe-Gln-Phe-Nle-NH2(서열번호 24)의 합성. Fmoc 링크 아미드 MBHA 수지(0.68 g, 0.25 밀리몰)를 실시예 5에서의 절차에 따라 고체상 합성 및 정제에 적용하여 6 mg(0.5%)를 수득하였다. C220H369N81O50에 대해 계산된 (ES)+-LCMS m/e 측정치 4948.85.
23. Ac-Gly-Ala-Ala-Glu-Ala-Ala-Ala-Tyr-Val-Tyr-Asp-Leu-Leu-Leu-Arg-Phe-Leu-Arg-Gln-Arg-Arg-Arg-Leu-Arg-Arg-Gln-Arg-Val-Arg-Ala-NH2(서열번호 25)의 합성. Fmoc 링크 아미드 MBHA 수지(0.55 g, 0.25 밀리몰)를 실시예 5에서의 절차에 따라 고체상 합성 및 정제에 적용하여 33 mg(3.6%)를 수득하였다. C160H271N59O39에 대해 계산된 (ES)+-LCMS m/e 측정치 3645.27.
24. Ac-Gly-Ala-Ala-Glu-Ala-Ala-Ala-Arg-Val-Tyr-Asp-Leu-Gly-Leu-Arg-Arg-Leu-Arg-Gln-Arg-Arg-Tyr-Leu-Arg-Arg-Glu-Leu-Leu-Arg-Phe-NH2(서열번호 26)의 합성. Fmoc 링크 아미드 MBHA 수지(0.73 g, 0.3 밀리몰)를 실시예 5에서의 절차에 따라 고체상 합성 및 정제에 적용하여 21 mg(2.3%)를 수득하였다. C160H271N59O39에 대해 계산된 (ES)+-LCMS m/e 측정치 3645.27.
25. Ac-Met-Ala-Ala-Leu-Ala-Tyr-Trp-Leu-Leu-Ala-Leu-Phe-Val-Tyr-Met-Trp-Thr-Asp-Leu-Leu-Leu-Phe-Lys-Lys-Arg-Pro-Lys-Pro-NH2(서열번호 27)의 합성. Fmoc 링크 아미드 MBHA 수지를 실시예 5에서의 절차에 따라 고체상 합성 및 정제에 적용하였다. C171H259N37O34S2에 대해 계산된 (ES)+-LCMS m/e 측정치 3441.28.
26. Ac-Met-Ala-Ala-Leu-Ala-Tyr-Trp-Leu-Leu-Ala-Leu-Phe-Val-Tyr-Met-Trp-Thr-Asp-Leu-Nle-Leu-Phe-Lys-Lys-Arg-Pro-Lys-Pro-NH2(서열번호 28)의 합성. Fmoc 링크 아미드 MBHA 수지를 실시예 5에서의 절차에 따라 고체상 합성 및 정제에 적용하였다. C171H259N37O34S2에 대해 계산된 (ES)+-LCMS m/e 측정치 3441.28.
27. Ac-Met-Ala-Lys-Leu-Lys-Tyr-Trp-Leu-Leu-Ala-Leu-Phe-Val-Tyr-Met-Trp-Thr-Asp-Leu-Nle-Leu-Phe-Lys-Lys-Arg-Pro-Lys-Pro-NH2(서열번호 29)의 합성. Fmoc 링크 아미드 MBHA 수지를 실시예 5에서의 절차에 따라 고체상 합성 및 정제에 적용하였다. C177H273N39O34S2에 대해 계산된 (ES)+-LCMS m/e 측정치 3555.47.
28. Ac-Met-Ala-Lys-Leu-Lys-Tyr-Trp-Leu-Leu-Ala-Leu-Phe-Val-Tyr-Met-Trp-Thr-Asp-Leu-Leu-Leu-tBuAla-Lys-Lys-Arg-Pro-Lys-Pro-NH2(서열번호 30)의 합성. Fmoc 링크 아미드 MBHA 수지를 실시예 5에서의 절차에 따라 고체상 합성 및 정제에 적용하였다. C175H277N39O34S2에 대해 계산된 (ES)+-LCMS m/e 측정치 3535.48.
29. Ac-Leu-Ala-Tyr-Trp-Leu-Leu-Ala-Leu-Phe-Val-Tyr-Met-Trp-Thr-Asp-Leu-Arg-Leu-Phe-Lys-Lys-Arg-Pro-Lys-Pro-NH2(서열번호 31)의 합성. Fmoc 링크 아미드 MBHA 수지를 실시예 2에서의 절차에 따라 고체상 합성 및 정제에 적용하여 120 mg(1%)를 수득하였다. C160H241N37O31S에 대해 계산된 (ES)+-LCMS m/e 측정치 3210.96.
30. Ac-Leu-Ala-Tyr-Trp-Leu-Leu-Ala-Leu-Phe-Val-Tyr-Met-Trp-Thr-Asp-Leu-Arg-Leu-t-Butyl-Ala-Lys-Lys-Arg-Pro-Lys-Pro-NH2(서열번호 32)의 합성. Fmoc 링크 아미드 MBHA 수지를 실시예 2에서의 절차에 따라 고체상 합성 및 정제에 적용하여 55 mg(6%)를 수득하였다. C158H245N37O31S에 대해 계산된 (ES)+-LCMS m/e 측정치 3190.97.
31. Ac-Leu-Ala-Tyr-Trp-Leu-Leu-Ala-Leu-Phe-Val-Tyr-Met-Trp-Thr-Asp-Leu-Arg-Leu-Ala-Lys-Lys-Arg-Pro-Lys-Pro-NH2(서열번호 33)의 합성. Fmoc 링크 아미드 MBHA 수지를 실시예 2에서의 절차에 따라 고체상 합성 및 정제에 적용하여 46 mg(5%)를 수득하였다. C154H237N37O31S에 대해 계산된 (ES)+-LCMS m/e 측정치 3134.86.
32. Ac-Ala-Asn-Leu-Ala-Tyr-Trp-Leu-Leu-Ala-Leu-Phe-Val-Tyr-Met-Trp-Thr-Asp-Leu-Arg-Leu-Phe-Lys-Lys-Arg-Pro-Lys-Pro-NH2(서열번호 34)의 합성. Fmoc 링크 아미드 MBHA 수지를 실시예 2에서의 절차에 따라 고체상 합성 및 정제에 적용하여 71 mg(7%)를 수득하였다. C167H252N40O34S에 대해 계산된 (ES)+-LCMS m/e 측정치 3396.14.
33. Ac-Asn-Leu-Ala-Tyr-Trp-Leu-Leu-Ala-Leu-Phe-Val-Tyr-Met-Trp-Thr-Asp-Leu-Arg-Leu-Phe-Lys-Lys-Arg-Pro-Lys-Pro-NH2(서열번호 35)의 합성. Fmoc 링크 아미드 MBHA 수지를 실시예 2에서의 절차에 따라 고체상 합성 및 정제에 적용하여 93 mg(10%)를 수득하였다. C164H247N39O33S에 대해 계산된 (ES)+-LCMS m/e 측정치 3325.06.
34. Ac-Ala-Tyr-Trp-Leu-Leu-Ala-Leu-Phe-Val-Tyr-Met-Trp-Thr-Asp-Leu-Arg-Leu-Phe-Lys-Lys-Arg-Pro-Lys-Pro-NH2(서열번호 36)의 합성. Fmoc 링크 아미드 MBHA 수지를 실시예 2에서의 절차에 따라 고체상 합성 및 정제에 적용하여 74 mg(8%)를 수득하였다. C154H230N36O30S에 대해 계산된 (ES)+-LCMS m/e 측정치 3097.8.
35. Ac-Tyr-Trp-Leu-Leu-Ala-Leu-Phe-Val-Tyr-Met-Trp-Thr-Asp-Leu-Arg-Leu-Phe-Lys-Lys-Arg-Pro-Lys-Pro-NH2(서열번호 37)의 합성. Fmoc 링크 아미드 MBHA 수지를 실시예 2에서의 절차에 따라 고체상 합성 및 정제에 적용하여 60 mg(7%)를 수득하였다. C151H225N35O29S에 대해 계산된 (ES)+-LCMS m/e 측정치 3026.72.
36. Ac-Met-Ala-Asn-Leu-Ala-Tyr-Trp-Leu-Leu-Ala-Leu-Phe-Val-Tyr-Leu-Trp-Thr-Asp-Leu-Arg-Leu-Phe-Lys-Lys-Arg-Pro-Lys-Pro-NH2(서열번호 38)의 합성. Fmoc 링크 아미드 MBHA 수지를 실시예 2에서의 절차에 따라 고체상 합성 및 정제에 적용하여 7.6 mg(1%)를 수득하였다. C173H263N41O35S에 대해 계산된 (ES)+-LCMS m/e 측정치 3509.3.
37. Ac-Met-Ala-Asn-Leu-Ala-Tyr-Trp-Leu-Leu-Ala-Leu-Phe-Val-Tyr-Nle-Trp-Thr-Asp-Leu-Arg-Leu-Phe-Lys-Lys-Arg-Pro-Lys-Pro-NH2(서열번호 39)의 합성. Fmoc 링크 아미드 MBHA 수지를 실시예 2에서의 절차에 따라 고체상 합성 및 정제에 적용하여 9.7 mg(1%)를 수득하였다. C173H263N41O35S에 대해 계산된 (ES)+-LCMS m/e 측정치 3509.3
38. Ac-Met-Ala-Asn-Leu-Ala-Tyr-Trp-Leu-Leu-Ala-Leu-Phe-Val-Tyr-Lys-Trp-Thr-Asp-Leu-Arg-Leu-Phe-Lys-Lys-Arg-Pro-Lys-Pro-NH2(서열번호 40)의 합성. Fmoc 링크 아미드 MBHA 수지를 실시예 2에서의 절차에 따라 고체상 합성 및 정제에 적용하여 81.6 mg(8%)를 수득하였다. C174H265N41O35S에 대해 계산된 (ES)+-LCMS m/e 측정치 3523.33.
39. Ac-Met-Ala-Asn-Leu-Ala-Tyr-Trp-Leu-Leu-Ala-Leu-Phe-Val-Tyr-Arg-Trp-Thr-Asp-Leu-Arg-Leu-Phe-Lys-Lys-Arg-Pro-Lys-Pro-NH2(서열번호 41)의 합성. Fmoc 링크 아미드 MBHA 수지를 실시예 2에서의 절차에 따라 고체상 합성 및 정제에 적용하여 81.6 mg(8%)를 수득하였다. C173H264N44O35S에 대해 계산된 (ES)+-LCMS m/e 측정치 3552.33.
40. Ac-Met-Ala-Asn-Leu-Ala-Tyr-Trp-Leu-Leu-Ala-Leu-Phe-Val-Tyr-Met-Phe-Thr-Asp-Leu-Arg-Leu-Phe-Lys-Lys-Arg-Pro-Lys-Pro-NH2(서열번호 42)의 합성. Fmoc 링크 아미드 MBHA 수지를 실시예 2에서의 절차에 따라 고체상 합성 및 정제에 적용하여 48.7 mg(55%)를 수득하였다. C170H260N40O35S2에 대해 계산된 (ES)+-LCMS m/e 측정치 3488.3.
41. Ac-Met-Ala-Asn-Leu-Ala-Tyr-Trp-Leu-Leu-Ala-Leu-Phe-Val-Tyr-Met-1Nal-Thr-Asp-Leu-Arg-Leu-Phe-Lys-Lys-Arg-Pro-Lys-Pro-NH2(서열번호 43)의 합성. Fmoc 링크 아미드 MBHA 수지를 실시예 2에서의 절차에 따라 고체상 합성 및 정제에 적용하여 35.5 mg(3%)를 수득하였다. C174H262N40O35S2에 대해 계산된 (ES)+-LCMS m/e 측정치 3538.36.
42. Ac-Met-Ala-Asn-Leu-Ala-Tyr-Trp-Leu-Leu-Ala-Leu-Phe-Val-Tyr-Met-2Nal-Thr-Asp-Leu-Arg-Leu-Phe-Lys-Lys-Arg-Pro-Lys-Pro-NH2(서열번호 44)의 합성. Fmoc 링크 아미드 MBHA 수지를 실시예 2에서의 절차에 따라 고체상 합성 및 정제에 적용하여 24 mg(2%)를 수득하였다. C177H262N40O35S2에 대해 계산된 (ES)+-LCMS m/e 측정치 3538.36.
43. Ac-Met-Val-Lys-Tyr-Lys-Ile-Ala-Ser-Leu-Nle-Leu-Phe-Leu-Phe-Val-Ala-Met-Trp-Ser-Asp-Val-Ala-Leu-Ala-Lys-Lys-Arg-Pro-Lys-Pro-NH2(서열번호 45)의 합성. Fmoc 링크 아미드 MBHA 수지를 실시예 5에서의 절차에 따라 고체상 합성 및 정제에 적용하였다. C169H274N40O36S2에 대해 계산된 (ES)+-LCMS m/e 측정치 3506.4.
44. Ac-Met-Tyr-Lys-Ser-Lys-Ile-Nle-Leu-Trp-Phe-Leu-Val-Leu-Phe-Val-Ala-Met-Trp-Ser-Asp-Val-Lys-Leu-Lys-Lys-Lys-Arg-Pro-Lys-Pro-NH2(서열번호 46)의 합성. Fmoc 링크 아미드 MBHA 수지를 실시예 5에서의 절차에 따라 고체상 합성 및 정제에 적용하였다. C183H293N43O36S2에 대해 계산된 (ES)+-LCMS m/e 측정치 3735.72.
45. Ac-Met-Ala-Lys-Leu-Lys-Tyr-Trp-Leu-Leu-Ala-Leu-Phe-Val-Thr-Obzl-Met-Trp-Thr-Asp-Leu-Leu-Leu-tBuAla-Lys-Lys-Arg-Pro-NH2(서열번호 47)의 합성. Fmoc 링크 아미드 MBHA 수지를 실시예 2에서의 절차에 따라 고체상 합성 및 정제에 적용하였다. C177H281N39O34S2에 대해 계산된 (ES)+-LCMS m/e 측정치 3563.54.
46. Ac-Met-Ala-Asn-Leu-Ala-Tyr-Trp-Leu-Leu-Ala-Leu-Phe-Val-Thr-Obzl-Tyr-Met-Trp-Thr-Asp-Leu-Arg-Leu-tBuAla-Lys-Lys-Arg-Pro-Lys-Pro-NH2(서열번호 48)의 합성. Fmoc 링크 아미드 MBHA 수지를 실시예 5에서의 절차에 따라 고체상 합성 및 정제에 적용하였다. C172H269N41O35S2에 대해 계산된 (ES)+-LCMS m/e 측정치 3535.4.
47. Ac-Leu-Ala-Tyr-Trp-Leu-Leu-Ala-Leu-Phe-Val-Ala-Met-Trp-Thr-Asp-Leu-Ala-Leu-Phe-Lys-Lys-Arg-Pro-Lys-Pro-NH2(서열번호 49)의 합성. Fmoc 링크 아미드 MBHA 수지를 실시예 2에서의 절차에 따라 고체상 합성 및 정제에 적용하여 120 mg(13%)를 수득하였다. C154H237N37O30S에 대해 계산된 (ES)+-LCMS m/e 측정치 3118.86.
48. Ac-Trp-Leu-Leu-Ala-Leu-Phe-Val-Tyr-Met-Trp-Thr-Asp-Leu-Ala-Leu-Phe-Lys-Lys-Arg-Pro-Lys-Pro-NH2(서열번호 50)의 합성. Fmoc 링크 아미드 MBHA 수지를 실시예 2에서의 절차에 따라 고체상 합성 및 정제에 적용하여 96 mg(11%)를 수득하였다. C142H216N34O27S에 대해 계산된 (ES)+-LCMS m/e 측정치 2863.55.
49. Ac-Leu-Leu-Ala-Leu-Phe-Val-Tyr-Met-Trp-Thr-Asp-Leu-Arg-Leu-Phe-Lys-Lys-Arg-Pro-Lys-Pro-NH2(서열번호 51)의 합성. Fmoc 링크 아미드 MBHA 수지를 실시예 2에서의 절차에 따라 고체상 합성 및 정제에 적용하여 137 mg(17%)를 수득하였다. C131H206N32O26S에 대해 계산된 (ES)+-LCMS m/e 측정치 2677.33.
50. Ac-Lys-Gln-Tyr-Asp-Arg-Glu-Phe-Leu-Leu-Asp-Phe-Gln-Phe-Met-Pro-Ala-NH2(서열번호 52)의 합성. Fmoc 링크 아미드 MBHA 수지를 실시예 5에서의 절차에 따라 고체상 합성 및 정제에 적용하였다. C98H141N23O26S에 대해 계산된 (ES)+-LCMS m/e 측정치 2089.39.
51. Ac-Lys-Gln-Tyr-Asp-Arg-Glu-Phe-Leu-Leu-Asp-Phe-Gln-Phe-Met-Pro-NH2(서열번호 53)의 합성. Fmoc 링크 아미드 MBHA 수지를 실시예 5에서의 절차에 따라 고체상 합성 및 정제에 적용하였다. C98H136N22O25S에 대해 계산된 (ES)+-LCMS m/e 측정치 2018.31.
52. Ac-Lys-Gln-Tyr-Asp-Arg-Glu-Phe-Leu-Leu-Asp-Phe-Gln-Phe-Met-NH2(서열번호 54)의 합성. Fmoc 링크 아미드 MBHA 수지를 실시예 5에서의 절차에 따라 고체상 합성 및 정제에 적용하였다. C90H129N21O24S에 대해 계산된 (ES)+-LCMS m/e 측정치 1921.2.
53. Ac-Lys-Gln-Tyr-Asp-Arg-Glu-Phe-Leu-Leu-Asp-Phe-Gln-Phe-NH2(서열번호 55)의 합성. Fmoc 링크 아미드 MBHA 수지를 실시예 5에서의 절차에 따라 고체상 합성 및 정제에 적용하였다. C88H120N20O23에 대해 계산된 (ES)+-LCMS m/e 측정치 1790.
54. Ac-Lys-Gln-Tyr-Asp-Arg-Glu-Phe-Leu-Leu-Asp-Phe-NH2(서열번호 56)의 합성. Fmoc 링크 아미드 MBHA 수지를 실시예 5에서의 절차에 따라 고체상 합성 및 정제에 적용하였다. C71H103N17O20에 대해 계산된 (ES)+-LCMS m/e 측정치 1514.69.
55. Ac-Lys-Gln-Tyr-Asp-Arg-Glu-Phe-Leu-Leu-Asp-Phe-Gln-Phe-Met-Ala-Ala-NH2(서열번호 57)의 합성. Fmoc 링크 아미드 MBHA 수지를 실시예 5에서의 절차에 따라 고체상 합성 및 정제에 적용하였다. C96H139N23O26S에 대해 계산된 (ES)+-LCMS m/e 측정치 2063.36.
56. Ac-Lys-Gln-Tyr-Asp-Arg-Glu-Phe-Leu-Leu-Asp-Phe-Gln-Phe-Ala-Pro-Ala-NH2(서열번호 58)의 합성. Fmoc 링크 아미드 MBHA 수지를 실시예 5에서의 절차에 따라 고체상 합성 및 정제에 적용하였다. C96H137N23O26에 대해 계산된 (ES)+-LCMS m/e 측정치 2029.27.
57. Ac-Lys-Gln-Tyr-Asp-Arg-Glu-Phe-Leu-Leu-Ala-Phe-Gln-Phe-Met-Pro-Ala-NH2(서열번호 59)의 합성. Fmoc 링크 아미드 MBHA 수지를 실시예 5에서의 절차에 따라 고체상 합성 및 정제에 적용하였다. C97H141N23O24S에 대해 계산된 (ES)+-LCMS m/e 측정치 2045.38.
58. Ac-Lys-Gln-Tyr-Asp-Arg-Ala-Phe-Leu-Leu-Asp-Phe-Gln-Phe-Met-Pro-Ala-NH2(서열번호 60)의 합성. Fmoc 링크 아미드 MBHA 수지를 실시예 5에서의 절차에 따라 고체상 합성 및 정제에 적용하였다. C96H139N23O24S에 대해 계산된 (ES)+-LCMS m/e 측정치 2031.36.
59. Ac-Lys-Gln-Tyr-Ala-Arg-Glu-Phe-Leu-Leu-Asp-Phe-Gln-Phe-Met-Pro-Ala-NH2(서열번호 61)의 합성. Fmoc 링크 아미드 MBHA 수지를 실시예 5에서의 절차에 따라 고체상 합성 및 정제에 적용하였다. C97H141N23O24S에 대해 계산된 (ES)+-LCMS m/e 측정치 2045.38.
60. Ac-Lys-Ala-Tyr-Asp-Arg-Glu-Phe-Leu-Leu-Asp-Phe-Gln-Phe-Met-Pro-Ala-NH2(서열번호 62)의 합성. Fmoc 링크 아미드 MBHA 수지를 실시예 5에서의 절차에 따라 고체상 합성 및 정제에 적용하였다. C96H138N22O25S에 대해 계산된 (ES)+-LCMS m/e 측정치 2032.34.
61. Ac-Ala-Gln-Tyr-Asp-Arg-Glu-Phe-Leu-Leu-Asp-Phe-Gln-Phe-Met-Pro-Ala-NH2(서열번호 63)의 합성. Fmoc 링크 아미드 MBHA 수지를 실시예 5에서의 절차에 따라 고체상 합성 및 정제에 적용하였다. C98H134N22O26S에 대해 계산된 (ES)+-LCMS m/e 측정치 2032.3.
62. Ac-Lys-Gln-Tyr-Asp-Arg-Glu-Phe-Leu-Leu-Asp-Phe-Gln-Phe-Met-Pro-(D)Ala-NH2(서열번호 64)의 합성. Fmoc 링크 아미드 MBHA 수지를 실시예 5에서의 절차에 따라 고체상 합성 및 정제에 적용하였다. C98H141N23O26S에 대해 계산된 (ES)+-LCMS m/e 측정치 2089.39.
63. Ac-Lys-Gln-Tyr-Asp-Arg-Glu-Phe-Leu-Leu-Asp-Phe-Gln-Phe-Met-(D)Pro-Ala-NH2(서열번호 65)의 합성. Fmoc 링크 아미드 MBHA 수지를 실시예 5에서의 절차에 따라 고체상 합성 및 정제에 적용하였다. C98H141N23O26S에 대해 계산된 (ES)+-LCMS m/e 측정치 2089.39.
64. Ac-Lys-Gln-Tyr-Asp-Arg-Glu-Phe-Leu-Leu-Asp-Phe-Gln-Phe-(D)Met-Pro-Ala-NH2(서열번호 66)의 합성. Fmoc 링크 아미드 MBHA 수지를 실시예 5에서의 절차에 따라 고체상 합성 및 정제에 적용하였다. C98H141N23O26S에 대해 계산된 (ES)+-LCMS m/e 측정치 2089.39.
65. Ac-Lys-Gln-Tyr-Asp-Arg-Glu-Phe-Leu-Leu-Asp-Phe-Gln-(D)Phe-Met-Pro-Ala-NH2(서열번호 67)의 합성. Fmoc 링크 아미드 MBHA 수지를 실시예 5에서의 절차에 따라 고체상 합성 및 정제에 적용하였다. C98H141N23O26S에 대해 계산된 (ES)+-LCMS m/e 측정치 2089.39.
66. Ac-Tyr-Asp-Arg-Glu-Phe-Leu-Leu-Asp-Phe-Gln-Phe-Met-NH2(서열번호 68)의 합성. Fmoc 링크 아미드 MBHA 수지를 실시예 2에서의 절차에 따라 고체상 합성 및 정제에 적용하여 5 mg(1%)를 수득하였다. C79H109N17O21S에 대해 계산된 (ES)+-LCMS m/e 측정치 1664.89.
67. Ac-Tyr-Asp-Arg-Glu-Phe-Leu-Leu-Asp-Phe-Gln-Phe-NH2(서열번호 69)의 합성. Fmoc 링크 아미드 MBHA 수지를 실시예 2에서의 절차에 따라 고체상 합성 및 정제에 적용하여 69 mg(17%)를 수득하였다. C74H100N16O20에 대해 계산된 (ES)+-LCMS m/e 측정치 1533.7.
68. Ac-Tyr-Asp-Arg-Glu-Phe-Leu-Leu-Asp-Phe-Gln-Phe-Nle-NH2(서열번호 70)의 합성. Fmoc 링크 아미드 MBHA 수지를 실시예 2에서의 절차에 따라 고체상 합성 및 정제에 적용하여 128 mg(29%)를 수득하였다. C80H111N17O21에 대해 계산된 (ES)+-LCMS m/e 측정치 1646.85.
69. Ac-Tyr-Asp-Arg-Gln-Phe-Leu-Leu-Asp-Phe-Gln-Phe-Nle-NH2(서열번호 71)의 합성. Fmoc 링크 아미드 MBHA 수지를 실시예 2에서의 절차에 따라 고체상 합성 및 정제에 적용하여 157 mg(35%)를 수득하였다. C80H112N18O20에 대해 계산된 (ES)+-LCMS m/e 측정치 1645.87.
70. Ac-Tyr-Asp-Arg-Glu-Phe-Leu-Leu-Ala-Phe-Gln-Phe-Nle-NH2(서열번호 72)의 합성. Fmoc 링크 아미드 MBHA 수지를 실시예 2에서의 절차에 따라 고체상 합성 및 정제에 적용하여 145.5 mg(34%)를 수득하였다. C79H111N17O19에 대해 계산된 (ES)+-LCMS m/e 측정치 1602.85.
71. Ac-Tyr-Asp-Arg-Glu-Phe-Leu-Leu-Aib-Phe-Gln-Phe-Nle-NH2(서열번호 73)의 합성. Fmoc 링크 아미드 MBHA 수지를 실시예 2에서의 절차에 따라 고체상 합성 및 정제에 적용하여 64 mg(15%)를 수득하였다. C80H113N17O19에 대해 계산된 (ES)+-LCMS m/e 측정치 1616.87.
72. Ac-Tyr-Asn-Arg-Glu-Phe-Leu-Leu-Asp-Phe-Gln-Phe-Nle-NH2(서열번호 74)의 합성. Fmoc 링크 아미드 MBHA 수지를 실시예 2에서의 절차에 따라 고체상 합성 및 정제에 적용하여 18 mg(3%)를 수득하였다. C80H112N18O20에 대해 계산된 (ES)+-LCMS m/e 측정치 1645.87.
73. Ac-Tyr-Asn-Arg-Gln-Phe-Leu-Leu-Asp-Phe-Gln-Phe-Nle-NH2(서열번호 75)의 합성. Fmoc 링크 아미드 MBHA 수지를 실시예 2에서의 절차에 따라 고체상 합성 및 정제에 적용하여 9 mg(2%)를 수득하였다. C80H113N19O19에 대해 계산된 (ES)+-LCMS m/e 측정치 1644.89.
74. Ac-Tyr-Mamb-Leu-Leu-Ala-Phe-Gln-Phe-Nle-NH2(서열번호 76)의 합성. Fmoc 링크 아미드 MBHA 수지를 실시예 2에서의 절차에 따라 고체상 합성 및 정제에 적용하였다. C63H85N11O12에 대해 계산된 (ES)+-LCMS m/e 측정치 1188.43.
75. Ac-Tyr-Mamp-Leu-Leu-Ala-Phe-Gln-Phe-Nle-NH2(서열번호 77)의 합성. Fmoc 링크 아미드 MBHA 수지를 실시예 2에서의 절차에 따라 고체상 합성 및 정제에 적용하였다. C64H87N11O12에 대해 계산된 (ES)+-LCMS m/e 측정치 1202.46.
76. Ac-Tyr-NVa-Leu-Leu-Ala-Phe-Gln-Phe-Nle-NH2(서열번호 78)의 합성. Fmoc 링크 아미드 MBHA 수지를 실시예 2에서의 절차에 따라 고체상 합성 및 정제에 적용하였다. C60H87N11O12에 대해 계산된 (ES)+-LCMS m/e 측정치 1154.41.
77. Ac-Phe-5Ava-Leu-Leu-Ala-Phe-Gln-Phe-Nle-NH2(서열번호 79)의 합성. Fmoc 링크 아미드 MBHA 수지를 실시예 2에서의 절차에 따라 고체상 합성 및 정제에 적용하였다. C60H87N11O11에 대해 계산된 (ES)+-LCMS m/e 측정치 1138.41.
78. Ac-Lys-Arg-Tyr-Asp-Arg-Glu-Phe-Leu-Leu-Ala-Phe-Gln-Phe-Nle-NH2(서열번호 80)의 합성. Fmoc 링크 아미드 MBHA 수지를 실시예 2에서의 절차에 따라 고체상 합성 및 정제에 적용하여 60 mg(12%)를 수득하였다. C91H135N23O21에 대해 계산된 (ES)+-LCMS m/e 측정치 1887.21.
79. Ac-Gln-Tyr-Asp-Arg-Glu-Phe-Leu-Leu-Asp-Phe-Gln-Phe-Met-Pro-Ala-NH2(서열번호 81)의 합성. Fmoc 링크 아미드 MBHA 수지를 실시예 5에서의 절차에 따라 고체상 합성 및 정제에 적용하였다. C92H129N21O25S에 대해 계산된 (ES)+-LCMS m/e 측정치 1961.22.
80. Ac-Tyr-Asp-Arg-Glu-Phe-Leu-Leu-Asp-Phe-Gln-Phe-Met-Pro-Ala-NH2(서열번호 82)의 합성. Fmoc 링크 아미드 MBHA 수지를 실시예 5에서의 절차에 따라 고체상 합성 및 정제에 적용하였다. C87H121N19O23S에 대해 계산된 (ES)+-LCMS m/e 측정치 1833.09.
81. Ac-(D)Lys-Gln-Tyr-Asp-Arg-Glu-Phe-Leu-Leu-Asp-Phe-Gln-Phe-Met-Pro-Ala-NH2(서열번호 83)의 합성. Fmoc 링크 아미드 MBHA 수지를 실시예 5에서의 절차에 따라 고체상 합성 및 정제에 적용하였다. C98H141N23O26S에 대해 계산된 (ES)+-LCMS m/e 측정치 2089.39.
82. Ac-Lys-Arg-Phe-Asp-Arg-Glu-Phe-Leu-Leu-Ala-Phe-Gln-Phe-Nle-NH2(서열번호 84)의 합성. Fmoc 링크 아미드 MBHA 수지를 실시예 2에서의 절차에 따라 고체상 합성 및 정제에 적용하여 64 mg(11%)를 수득하였다. C91H135N23O20에 대해 계산된 (ES)+-LCMS m/e 측정치 1871.21.
83. Ac-Lys-Arg-Lys-Arg-Phe-Asp-Arg-Glu-Phe-Leu-Leu-Ala-Phe-Gln-Phe-Nle-NH2(서열번호 85)의 합성. Fmoc 링크 아미드 MBHA 수지를 실시예 2에서의 절차에 따라 고체상 합성 및 정제에 적용하였다. C103H159N29O22에 대해 계산된 (ES)+-LCMS m/e 측정치 2155.57.
실시예 84
eIF4E에 대한 결합에 대해 측정된 IC50 하에 본 발명의 다른 대표적인 펩티드 뿐 아니라, eIF4E에 대한 결합에 대해 측정된 IC50 하에 본 발명의 다른 대표적인 세포 투과 펩티드의 표 및 목록.
[표 1]
eIF4E에 결합하지만 세포 투과성이 아닌 펩티드
Figure pct00003
Figure pct00004
[표 2]
Y----LL-F 모티프(서열번호 90)를 갖는 세포 투과 펩티드
Figure pct00005
Figure pct00006
Figure pct00007
[표 2a]
Y----LL-F 모티프(서열번호 90) 및 YWLLALFVY 모티프(서열번호 2)를 갖는 세포 투과 펩티드
Figure pct00008
Figure pct00009
Figure pct00010
[표 3]
Y----LL-F 모티프(서열번호 90)를 갖지 않는 세포 투과 펩티드
Figure pct00011
전장(full-length) eIF4E 서열(서열번호 86)
Figure pct00012
eIF4E 서열 28 내지 217(서열번호 87)
Figure pct00013
<110> F. Hoffmann - La Roche AG <120> CELL PENETRATING PEPTIDES TO TARGET EIF4E <130> 30810 WO <140> PCT/EP2013/064209 <141> 2013-07-05 <150> US 61/669207 <151> 2012-07-09 <160> 91 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <220> <221> MOD_RES <222> (2)..(5) <223> Any amino acid <220> <221> MOD_RES <222> (6)..(7) <223> Leu or Nle <220> <221> MOD_RES <222> (8)..(8) <223> Any amino acid <400> 1 Tyr Xaa Xaa Xaa Xaa Leu Leu Xaa Phe 1 5 <210> 2 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 2 Tyr Trp Leu Leu Ala Leu Phe Val Tyr 1 5 <210> 3 <211> 36 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <220> <223> N-term Ac <220> <221> MOD_RES <222> (2)..(2) <223> Lys, Gln, Arg or Ala <220> <221> MOD_RES <222> (4)..(4) <223> Asp, Asn or Ala <220> <221> MOD_RES <222> (6)..(6) <223> 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(5)..(5) <223> Ala, (D)Ala or not present <220> <221> MOD_RES <222> (6)..(25) <223> Any amino acid and this region may encompass 5 to 20 residues <400> 4 Gln Phe Xaa Xaa Ala Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 10 15 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 20 25 <210> 5 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 5 Val Tyr Asp Leu Gly Leu Arg Arg Leu Arg Gln Arg Arg Arg Leu Arg 1 5 10 15 Arg <210> 6 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <220> <223> N-term Ac <220> <221> MOD_RES <222> (14)..(14) <223> Nle <220> <221> MOD_RES <222> (15)..(34) <223> Any amino acid and this region may encompass 5 to 20 residues <400> 6 Lys Arg Tyr Asp Arg Glu Phe Leu Leu Ala Phe Gln Phe Leu Xaa Xaa 1 5 10 15 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 20 25 30 Xaa Xaa <210> 7 <211> 31 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <220> <223> N-term Ac <220> <221> MOD_RES <222> (14)..(14) <223> Nle <220> <223> C-term NH2 <400> 7 Lys Arg Tyr Asp Arg Glu Phe Leu Leu Ala Phe Gln Phe Leu Val Tyr 1 5 10 15 Asp Leu Gly Leu Arg Arg Leu Arg Gln Arg Arg Arg Leu Arg Arg 20 25 30 <210> 8 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <220> <223> N-term Ac <220> <221> MOD_RES <222> (3)..(3) <223> Lys or Asn <220> <221> MOD_RES <222> (5)..(5) <223> Lys or Ala <220> <221> MOD_RES <222> (20)..(20) <223> Leu or Arg <220> <221> MOD_RES <222> (22)..(22) <223> Phe or tButAla <220> <223> C-term NH2 <400> 8 Met Ala Xaa Leu Xaa Tyr Trp Leu Leu Ala Leu Phe Val Tyr Met Trp 1 5 10 15 Thr Asp Leu Xaa Leu Xaa Lys Lys Arg Pro Lys Pro 20 25 <210> 9 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <220> <223> N-term Ac <220> <223> C-term NH2 <400> 9 Met Ala Lys Leu Lys Tyr Trp Leu Leu Ala Leu Phe Val Tyr Met Trp 1 5 10 15 Thr Asp Leu Leu Leu Phe Lys Lys Arg Pro Lys Pro 20 25 <210> 10 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <220> <223> N-term Ac <220> <223> C-term NH2 <400> 10 Met Ala Asn Leu Ala Tyr Trp Leu Leu Ala Leu Phe Val Tyr Met Trp 1 5 10 15 Thr Asp Leu Arg Leu Phe Lys Lys Arg Pro Lys Pro 20 25 <210> 11 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <220> <223> N-term Ac <220> <221> MOD_RES <222> (22)..(22) <223> tBuAla <220> <223> C-term NH2 <400> 11 Met Ala Asn Leu Ala Tyr Trp Leu Leu Ala Leu Phe Val Tyr Met Trp 1 5 10 15 Thr Asp Leu Arg Leu Ala Lys Lys Arg Pro Lys Pro 20 25 <210> 12 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <220> <223> N-term Ac <220> <223> C-term NH2 <400> 12 Met Val Lys Tyr Lys Ile Gly Ser Leu Leu Leu Phe Leu 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of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <220> <223> N-term Ac <220> <221> MOD_RES <222> (14)..(14) <223> Nle <220> <223> C-term NH2 <400> 22 Lys Arg Tyr Asp Arg Glu Phe Leu Leu Ala Phe Gln Phe Leu Arg Arg 1 5 10 15 Leu Arg Gln Arg Arg Arg Leu Arg Arg Glu Arg Val Arg Ala 20 25 30 <210> 23 <211> 36 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <220> <223> N-term Ac <220> <221> MOD_RES <222> (14)..(14) <223> Nle <220> <223> C-term NH2 <400> 23 Lys Arg Tyr Asp Arg Glu Phe Leu Leu Ala Phe Gln Phe Leu Val Tyr 1 5 10 15 Asp Leu Gly Leu Arg Arg Leu Arg Gln Arg Arg Arg Leu Arg Arg Glu 20 25 30 Arg Val Arg Ala 35 <210> 24 <211> 38 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <220> <223> N-term Ac <220> <221> MOD_RES <222> (38)..(38) <223> Nle <220> <223> C-term NH2 <400> 24 Ala Arg Val Tyr Asp Leu Gly Leu Arg Arg Leu Arg Gln Arg Arg Arg 1 5 10 15 Leu Arg Arg Glu Arg Val 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Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <220> <223> N-term Ac <220> <223> C-term NH2 <400> 49 Leu Ala Tyr Trp Leu Leu Ala Leu Phe Val Ala Met Trp Thr Asp Leu 1 5 10 15 Arg Leu Phe Lys Lys Arg Pro Lys Pro 20 25 <210> 50 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <220> <223> N-term Ac <220> <223> C-term NH2 <400> 50 Trp Leu Leu Ala Leu Phe Val Tyr Met Trp Thr Asp Leu Arg Leu Phe 1 5 10 15 Lys Lys Arg Pro Lys Pro 20 <210> 51 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <220> <223> N-term Ac <220> <223> C-term NH2 <400> 51 Leu Leu Ala Leu Phe Val Tyr Met Trp Thr Asp Leu Arg Leu Phe Lys 1 5 10 15 Lys Arg Pro Lys Pro 20 <210> 52 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <220> <223> N-term Ac <220> <223> C-term NH2 <400> 52 Lys Gln Tyr Asp Arg Glu Phe Leu Leu Asp Phe Gln Phe Met Pro Ala 1 5 10 15 <210> 53 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <220> <223> N-term Ac <220> <223> C-term NH2 <400> 53 Lys Gln Tyr Asp Arg Glu Phe Leu Leu Asp Phe Gln Phe Met Pro 1 5 10 15 <210> 54 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <220> <223> N-term Ac <220> <223> C-term NH2 <400> 54 Lys Gln Tyr Asp Arg Glu Phe Leu Leu Asp Phe Gln Phe Met 1 5 10 <210> 55 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <220> <223> N-term Ac <220> <223> C-term NH2 <400> 55 Lys Gln Tyr Asp Arg Glu Phe Leu Leu Asp Phe Gln Phe 1 5 10 <210> 56 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <220> <223> N-term Ac <220> <223> C-term NH2 <400> 56 Lys Gln Tyr Asp Arg Glu Phe Leu Leu Asp Phe 1 5 10 <210> 57 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <220> <223> N-term Ac <220> <223> C-term NH2 <400> 57 Lys Gln Tyr Asp Arg Glu Phe Leu Leu Asp Phe Gln Phe Met Ala Ala 1 5 10 15 <210> 58 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <220> <223> N-term Ac <220> <223> C-term NH2 <400> 58 Lys Gln Tyr Asp Arg Glu Phe Leu Leu Asp Phe Gln Phe Ala Pro Ala 1 5 10 15 <210> 59 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <220> <223> N-term Ac <220> <223> C-term NH2 <400> 59 Lys Gln Tyr Asp Arg Glu Phe Leu Leu Ala Phe Gln Phe Met Pro Ala 1 5 10 15 <210> 60 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <220> <223> N-term Ac <220> <223> C-term NH2 <400> 60 Lys Gln Tyr Asp Arg Ala Phe Leu Leu Asp Phe Gln Phe Met Pro Ala 1 5 10 15 <210> 61 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <220> <223> N-term Ac <220> <223> C-term NH2 <400> 61 Lys Gln Tyr Ala Arg Glu Phe Leu Leu Asp Phe Gln Phe Met Pro Ala 1 5 10 15 <210> 62 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <220> <223> N-term Ac <220> <223> C-term NH2 <400> 62 Lys Ala Tyr Asp Arg Glu Phe Leu Leu Asp Phe Gln Phe Met Pro Ala 1 5 10 15 <210> 63 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <220> <223> N-term Ac <220> <223> C-term NH2 <400> 63 Ala Gln Tyr Asp Arg Glu Phe Leu Leu Asp Phe Gln Phe Met Pro Ala 1 5 10 15 <210> 64 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <220> <223> N-term Ac <220> <221> MOD_RES <222> (16)..(16) <223> (D)Ala <220> <223> C-term NH2 <400> 64 Lys Gln Tyr Asp Arg Glu Phe Leu Leu Asp Phe Gln Phe Met Pro Ala 1 5 10 15 <210> 65 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <220> <223> N-term Ac <220> <221> MOD_RES <222> (15)..(15) <223> (D)Pro <220> <223> C-term NH2 <400> 65 Lys Gln Tyr Asp Arg Glu Phe Leu Leu Asp Phe Gln Phe Met Pro Ala 1 5 10 15 <210> 66 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <220> <223> N-term Ac <220> <221> MOD_RES <222> (14)..(14) <223> (D)Met <220> <223> C-term NH2 <400> 66 Lys Gln Tyr Asp Arg Glu Phe Leu Leu Asp Phe Gln Phe Met Pro Ala 1 5 10 15 <210> 67 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <220> <223> N-term Ac <220> <221> MOD_RES <222> (13)..(13) <223> (D)Phe <220> <223> C-term NH2 <400> 67 Lys Gln Tyr Asp Arg Glu Phe Leu Leu Asp Phe Gln Phe Met Pro Ala 1 5 10 15 <210> 68 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <220> <223> N-term Ac <220> <223> C-term NH2 <400> 68 Tyr Asp Arg Glu Phe Leu Leu Asp Phe Gln Phe Met 1 5 10 <210> 69 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <220> <223> N-term Ac <220> <223> C-term NH2 <400> 69 Tyr Asp Arg Glu Phe Leu Leu Asp Phe Gln Phe 1 5 10 <210> 70 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <220> <223> N-term Ac <220> <221> MOD_RES <222> (12)..(12) <223> Nle <220> <223> C-term NH2 <400> 70 Tyr Asp Arg Glu Phe Leu Leu Asp Phe Gln Phe Leu 1 5 10 <210> 71 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <220> <223> N-term Ac <220> <221> MOD_RES <222> (12)..(12) <223> Nle <220> <223> C-term NH2 <400> 71 Tyr Asp Arg Gln Phe Leu Leu Asp Phe Gln Phe Leu 1 5 10 <210> 72 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <220> <223> N-term Ac <220> <221> MOD_RES <222> (12)..(12) <223> Nle <220> <223> C-term NH2 <400> 72 Tyr Asp Arg Glu Phe Leu Leu Ala Phe Gln Phe Leu 1 5 10 <210> 73 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <220> <223> N-term Ac <220> <221> MOD_RES <222> (8)..(8) <223> Aib <220> <221> MOD_RES <222> (12)..(12) <223> Nle <220> <223> C-term NH2 <400> 73 Tyr Asp Arg Glu Phe Leu Leu Xaa Phe Gln Phe Leu 1 5 10 <210> 74 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <220> <223> N-term Ac <220> <221> MOD_RES <222> (12)..(12) <223> Nle <220> <223> C-term NH2 <400> 74 Tyr Asn Arg Glu Phe Leu Leu Asp Phe Gln Phe Leu 1 5 10 <210> 75 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <220> <223> N-term Ac <220> <221> MOD_RES <222> (12)..(12) <223> Nle <220> <223> C-term NH2 <400> 75 Tyr Asn Arg Gln Phe Leu Leu Asp Phe Gln Phe Leu 1 5 10 <210> 76 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <220> <223> N-term Ac <220> <221> MOD_RES <222> (2)..(2) <223> Mamb <220> <221> MOD_RES <222> (9)..(9) <223> Nle <220> <223> C-term NH2 <400> 76 Tyr Xaa Leu Leu Ala Phe Gln Phe Leu 1 5 <210> 77 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <220> <223> N-term Ac <220> <221> MOD_RES <222> (2)..(2) <223> Mamp <220> <221> MOD_RES <222> (9)..(9) <223> Nle <220> <223> C-term NH2 <400> 77 Tyr Xaa Leu Leu Ala Phe Gln Phe Leu 1 5 <210> 78 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <220> <223> N-term Ac <220> <221> MOD_RES <222> (2)..(2) <223> NVa <220> <221> MOD_RES <222> (9)..(9) <223> Nle <220> <223> C-term NH2 <400> 78 Tyr Val Leu Leu Ala Phe Gln Phe Leu 1 5 <210> 79 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <220> <223> N-term Ac <220> <221> MOD_RES <222> (2)..(2) <223> 5Ava <220> <221> MOD_RES <222> (9)..(9) <223> Nle <220> <223> C-term NH2 <400> 79 Phe Xaa Leu Leu Ala Phe Gln Phe Leu 1 5 <210> 80 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <220> <223> N-term Ac <220> <221> MOD_RES <222> (14)..(14) <223> Nle <220> <223> C-term NH2 <400> 80 Lys Arg Tyr Asp Arg Glu Phe Leu Leu Ala Phe Gln Phe Leu 1 5 10 <210> 81 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <220> <223> N-term Ac <220> <223> C-term NH2 <400> 81 Gln Tyr Asp Arg Glu Phe Leu Leu Asp Phe Gln Phe Met Pro Ala 1 5 10 15 <210> 82 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <220> <223> N-term Ac <220> <223> C-term NH2 <400> 82 Tyr Asp Arg Glu Phe Leu Leu Asp Phe Gln Phe Met Pro Ala 1 5 10 <210> 83 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <220> <223> N-term Ac <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(1) <223> (D)Lys <220> <223> C-term NH2 <400> 83 Lys Gln Tyr Asp Arg Glu Phe Leu Leu Asp Phe Gln Phe Met Pro Ala 1 5 10 15 <210> 84 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <220> <223> N-term Ac <220> <221> MOD_RES <222> (14)..(14) <223> Nle <220> <223> C-term NH2 <400> 84 Lys Arg Phe Asp Arg Glu Phe Leu Leu Ala Phe Gln Phe Leu 1 5 10 <210> 85 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <220> <223> N-term Ac <220> <221> MOD_RES <222> (16)..(16) <223> Nle <220> <223> C-term NH2 <400> 85 Lys Arg Lys Arg Phe Asp Arg Glu Phe Leu Leu Ala Phe Gln Phe Leu 1 5 10 15 <210> 86 <211> 217 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 86 Met Ala Thr Val Glu Pro Glu Thr Thr Pro Thr Pro Asn Pro Pro Thr 1 5 10 15 Thr Glu Glu Glu Lys Thr Glu Ser Asn Gln Glu Val Ala Asn Pro Glu 20 25 30 His Tyr Ile Lys His Pro Leu Gln Asn Arg Trp Ala Leu Trp Phe Phe 35 40 45 Lys Asn Asp Lys Ser Lys Thr Trp Gln Ala Asn Leu Arg Leu Ile Ser 50 55 60 Lys Phe Asp Thr Val Glu Asp Phe Trp Ala Leu Tyr Asn His Ile Gln 65 70 75 80 Leu Ser Ser Asn Leu Met Pro Gly Cys Asp Tyr Ser Leu Phe Lys Asp 85 90 95 Gly Ile Glu Pro Met Trp Glu Asp Glu Lys Asn Lys Arg Gly Gly Arg 100 105 110 Trp Leu Ile Thr Leu Asn Lys Gln Gln Arg Arg Ser Asp Leu Asp Arg 115 120 125 Phe Trp Leu Glu Thr Leu Leu Cys Leu Ile Gly Glu Ser Phe Asp Asp 130 135 140 Tyr Ser Asp Asp Val Cys Gly Ala Val Val Asn Val Arg Ala Lys Gly 145 150 155 160 Asp Lys Ile Ala Ile Trp Thr Thr Glu Cys Glu Asn Arg Glu Ala Val 165 170 175 Thr His Ile Gly Arg Val Tyr Lys Glu Arg Leu Gly Leu Pro Pro Lys 180 185 190 Ile Val Ile Gly Tyr Gln Ser His Ala Asp Thr Ala Thr Lys Ser Gly 195 200 205 Ser Thr Thr Lys Asn Arg Phe Val Val 210 215 <210> 87 <211> 190 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 87 Val Ala Asn Pro Glu His Tyr Ile Lys His Pro Leu Gln Asn Arg Trp 1 5 10 15 Ala Leu Trp Phe Phe Lys Asn Asp Lys Ser Lys Thr Trp Gln Ala Asn 20 25 30 Leu Arg Leu Ile Ser Lys Phe Asp Thr Val Glu Asp Phe Trp Ala Leu 35 40 45 Tyr Asn His Ile Gln Leu Ser Ser Asn Leu Met Pro Gly Cys Asp Tyr 50 55 60 Ser Leu Phe Lys Asp Gly Ile Glu Pro Met Trp Glu Asp Glu Lys Asn 65 70 75 80 Lys Arg Gly Gly Arg Trp Leu Ile Thr Leu Asn Lys Gln Gln Arg Arg 85 90 95 Ser Asp Leu Asp Arg Phe Trp Leu Glu Thr Leu Leu Cys Leu Ile Gly 100 105 110 Glu Ser Phe Asp Asp Tyr Ser Asp Asp Val Cys Gly Ala Val Val Asn 115 120 125 Val Arg Ala Lys Gly Asp Lys Ile Ala Ile Trp Thr Thr Glu Cys Glu 130 135 140 Asn Arg Glu Ala Val Thr His Ile Gly Arg Val Tyr Lys Glu Arg Leu 145 150 155 160 Gly Leu Pro Pro Lys Ile Val Ile Gly Tyr Gln Ser His Ala Asp Thr 165 170 175 Ala Thr Lys Ser Gly Ser Thr Thr Lys Asn Arg Phe Val Val 180 185 190 <210> 88 <211> 196 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 88 Val Ala Asn Pro Glu His Tyr Ile Lys His Pro Leu Gln Asn Arg Trp 1 5 10 15 Ala Leu Trp Phe Phe Lys Asn Asp Lys Ser Lys Thr Trp Gln Ala Asn 20 25 30 Leu Arg Leu Ile Ser Lys Phe Asp Thr Val Glu Asp Phe Trp Ala Leu 35 40 45 Tyr Asn His Ile Gln Leu Ser Ser Asn Leu Met Pro Gly Cys Asp Tyr 50 55 60 Ser Leu Phe Lys Asp Gly Ile Glu Pro Met Trp Glu Asp Glu Lys Asn 65 70 75 80 Lys Arg Gly Gly Arg Trp Leu Ile Thr Leu Asn Lys Gln Gln Arg Arg 85 90 95 Ser Asp Leu Asp Arg Phe Trp Leu Glu Thr Leu Leu Cys Leu Ile Gly 100 105 110 Glu Ser Phe Asp Asp Tyr Ser Asp Asp Val Cys Gly Ala Val Val Asn 115 120 125 Val Arg Ala Lys Gly Asp Lys Ile Ala Ile Trp Thr Thr Glu Cys Glu 130 135 140 Asn Arg Glu Ala Val Thr His Ile Gly Arg Val Tyr Lys Glu Arg Leu 145 150 155 160 Gly Leu Pro Pro Lys Ile Val Ile Gly Tyr Gln Ser His Ala Asp Thr 165 170 175 Ala Thr Lys Ser Gly Ser Thr Thr Lys Asn Arg Phe Val Val His His 180 185 190 His His His His 195 <210> 89 <211> 59 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <220> <223> N-term Ac <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(25) <223> Any amino acid and this region may encompass 8 to 25 residues <220> <221> MOD_RES <222> (27)..(27) <223> Any amino acid <220> <221> MOD_RES <222> (28)..(28) <223> Any amino acid <220> <221> MOD_RES <222> (29)..(29) <223> Any amino acid <220> <221> MOD_RES <222> (30)..(30) <223> Any amino acid <220> <221> MOD_RES <222> (33)..(33) <223> Any amino acid <220> <221> MOD_RES <222> (35)..(59) <223> Any amino acid and this region may encompass 8 to 25 residues <220> <223> C-term NH2 <220> <223> see specification as filed for detailed description of substitutions and preferred embodiments <400> 89 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 10 15 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Tyr Xaa Xaa Xaa Xaa Leu Leu 20 25 30 Xaa Phe Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 35 40 45 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 50 55 <210> 90 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <220> <221> MOD_RES <222> (2)..(5) <223> Any amino acid <220> <221> MOD_RES <222> (8)..(8) <223> Any amino acid <400> 90 Tyr Xaa Xaa Xaa Xaa Leu Leu Xaa Phe 1 5 <210> 91 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <220> <223> N-term Ac <220> <221> MOD_RES <222> (16)..(16) <223> Lys(Aha-Bio) <220> <223> C-term NH2 <400> 91 Lys Gln Tyr Asp Arg Glu Phe Leu Leu Asp Phe Gln Phe Met Pro Lys 1 5 10 15

Claims (18)

  1. 서열번호 7, 9 내지 11, 12 내지 26, 27 내지 44, 및 45 내지 51로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는, 포유동물 개시 인자 eIF4E에 결합하는 세포 투과 펩티드(CPP-eIF4E).
  2. 제 1 항에 있어서,
    아미노산 서열이 적어도 9개 내지 약 40개 아미노산이고, 또한 포유동물 개시 인자 eIF4E가 인간 개시 인자 eIF4E인 세포 투과 펩티드.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    세포 투과 펩티드가 서열번호 7, 9, 및 10 내지 44의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 아미노산 서열이 또한, 부분적으로, 다음으로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열 모티프를 포함하는 세포 투과 펩티드:
    a) YxxxxzzxF(서열번호 1)(여기서, Y는 티로신(Tyr)이고, x는 임의의 아미노산이고, z는 류신(Leu) 또는 노르류신(Nle)이고, F는 페닐알라닌(Phe)이다), 또는
    b) Tyr-Trp-Leu-Leu-Ala-Leu-Phe-Val-Tyr(서열번호 2).
  4. 제 3 항에 있어서,
    아미노산 서열이 적어도 9개 내지 약 40개 아미노산이고, 또한 포유동물 개시 인자 eIF4E가 인간 개시 인자 eIF4E인 세포 투과 펩티드.
  5. 제 4 항에 있어서,
    세포 투과 펩티드가 서열번호 7, 12, 및 13 내지 26으로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하고, 또한 아미노산 서열 모티프가 YxxxxzzxF(서열번호 90)(여기서, Y는 티로신(Tyr)이고, x는 임의의 아미노산이고, z는 류신(Leu)이고, F는 페닐알라닌(Phe)이다)인 세포 투과 펩티드.
  6. 제 5 항에 있어서,
    식 I Ac-Lys-Arg-Tyr-Asp-Arg-Glu-Phe-Leu-Leu-Ala-Phe-Gln-Phe-Nle-R11(서열번호 6)(여기서, R11은 약 5 내지 약 20개 아미노산의 세포 투과 펩티드(CPP)이다)의 펩티드를 포함하는 세포 투과 펩티드.
  7. 제 6 항에 있어서,
    R11이 Val-Tyr-Asp-Leu-Gly-Leu-Arg-Arg-Leu-Arg-Gln-Arg-Arg-Arg-Leu-Arg-Arg(서열번호 5)인 세포 투과 펩티드.
  8. 제 5 항에 있어서,
    세포 투과 펩티드가 서열번호 7로 이루어진 세포 투과 펩티드.
  9. 제 4 항에 있어서,
    세포 투과 펩티드가 서열번호 9 내지 11, 및 27 내지 44를 포함하고, 또한 아미노산 서열 모티프가 Tyr-Trp-Leu-Leu-Ala-Leu-Phe-Val-Tyr(서열번호 2)인 세포 투과 펩티드.
  10. 제 9 항에 있어서,
    Ac-Met-Ala-R1-Leu-R2-Tyr-Trp-Leu-Leu-Ala-Leu-Phe-Val-Tyr-Met-Trp-Thr-Asp-Leu-R3-Leu-R4-Lys-Lys-Arg-Pro-Lys-Pro-NH2(서열번호 8)(여기서, R1은 Lys 또는 Asn이고, R2는 Lys 또는 Ala이고, R3은 Leu 또는 Arg이고, R4는 Phe 또는 t-ButAla이다)의 아미노산 서열을 포함하는 세포 투과 펩티드.
  11. 제 10 항에 있어서,
    세포 투과 펩티드가 서열번호 9, 10 및 11로 이루어진 군에서 선택되는 세포 투과 펩티드.
  12. 제 10 항에 있어서,
    세포 투과 펩티드가 서열번호 9인 세포 투과 펩티드.
  13. 제 10 항에 있어서,
    세포 투과 펩티드가 서열번호 10인 세포 투과 펩티드.
  14. 제 10 항에 있어서,
    세포 투과 펩티드가 서열번호 11인 세포 투과 펩티드.
  15. 제 1 펩티드 및 선택적인 제 2 펩티드로 이루어진, 약 9 내지 약 40개 아미노산의 단리 및 정제된 폴리펩티드로서,
    제 1 펩티드가,
    i. 9개 이상의 아미노산의 아미노산 서열을 포함하고,
    ii. 포유동물 개시 인자 eIF4E(보다 바람직하게는 인간 개시 인자 eIF4E)에 결합하는 능력을 가지고,
    iii. 또한, 부분적으로, Ac-R1-Tyr-R2-R3-R4-R5-Leu-Leu-R6-Phe-R7-NH2(서열번호 3)[여기서, R1은 Lys-Lys, Lys-Gln, Lys-Arg 및 Lys-Ala로 이루어진 군에서 선택되고, R2는 Asp, Asn 또는 Ala이고, R3은 Arg이고, R4는 Glu, Lys, Cys, Ala, Gln 또는 Phe이고, R5는 Phe이고, R6은 Asp, Cys, Ala 또는 Aib이고, R7은 Gln-Phe-R8-R9-R10-R11(서열번호 4)이고, R8은 Met, Ala, (D)Met, Nle이고, R9는 Pro, (D)Pro, Ala이거나 또는 없고, R10은 Ala, (D)Ala이거나 또는 없고, R11은 약 5 내지 약 20개 아미노산의 세포 투과 펩티드(CPP)를 포함하는 선택적인 제 2 펩티드이다]의 아미노산 서열 모티프를 포함하는 단리 및 정제된 폴리펩티드.
  16. 제 15 항에 있어서,
    식 I Ac-Lys-Arg-Tyr-Asp-Arg-Glu-Phe-Leu-Leu-Ala-Phe-Gln-Phe-Nle-R11(서열번호 6)의 펩티드를 포함하는 단리 및 정제된 펩티드.
  17. 제 1 폴리펩티드 및 선택적인 제 2 폴리펩티드로 이루어진, 약 9 내지 약 40개 아미노산의 단리 및 정제된 펩티드로서,
    제 1 펩티드가,
    i. 9개 이상의 아미노산의 아미노산 서열을 포함하고,
    ii. 인간 개시 인자 eIF4E에 결합하는 능력을 가지고,
    iii. 부분적으로, Tyr-Trp-Leu-Leu-Ala-Leu-Phe-Val-Tyr(서열번호 2)의 아미노산 모티프를 포함하고,
    선택적인 제 2 펩티드가 세포 투과 펩티드(CPP)인 단리 및 정제된 펩티드.
  18. 제 1 폴리펩티드 및 선택적인 제 2 폴리펩티드로 이루어진, 약 9 내지 약 40개 아미노산의 단리 및 정제된 펩티드로서,
    제 1 펩티드가,
    i. 9개 이상의 아미노산의 아미노산 서열을 포함하고,
    ii. 포유동물 개시 인자 eIF4E(보다 바람직하게는 인간 개시 인자 eIF4E)에 결합하는 능력을 가지고,
    iii. 서열번호 52 내지 85의 아미노산 서열을 포함하고,
    선택적인 제 2 펩티드가 세포 투과 펩티드(CPP)인 단리 및 정제된 펩티드.
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