KR20190108180A - 일종의 시험관 내 단백질 합성을 위한 단백질 합성시스템, 키트 및 이의 제조방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 일종의 시험관 내 단백질 합성에 사용하는 무세포 단백질 합성 시스템, 키트 및 이의 제조방법을 제공하였다.

Description

일종의 시험관 내 단백질 합성을 위한 단백질 합성시스템, 키트 및 이의 제조방법

본 발명은 생물기술 분야에 관한 것이며, 구체적으로, 일종의 시험관 내 단백질 합성을 위한 단백질 합성시스템, 키트 및 이의 제조방법에 관한 것이다.

전통적인 단백질 발현시스템은 모델생물의 세균, 진균, 식물세포 또는 동물세포 등에 의해 외인성 유전자를 발현시키는 분자 생물학적 기술을 가리킨다. 과학기술의 발전과 함께, 시험관 내 단백질합성 시스템으로도 알려진 무세포 발현시스템이 등장하였고, 이는 외인성 표적 mRNA 또는 DNA를 단백질합성을 위한 주형으로 하고, 단백질의 합성에 필요한 기질 및 전사, 번역에 관련된 단백질 인자 등 물질을 수동적으로 제어하고 보충하는 것을 통하여, 단백질을 합성하는 목적을 달성할 수 있다. 시험관 내 번역시스템에서 발현되는 단백질은 플라스미드 구축, 형질전환, 세포배양, 세포수집 및 파쇄단계를 필요로 하지 않는, 일종의 신속하고 시간을 절약하는 간편한 단백질 발현 방법이다.

상업적으로, 대장균의 시험관 내 합성 시스템이 널리 사용된다. 대장균은 배양 및 발효가 용이하고, 원가가 저렴하며, 세포의 파쇄가 간편하여, 고수율의 단백질을 합성할 수 있다. 원핵생물 시스템과 비교 시, 진핵세포는 배양이 어렵고, 비용이 많이 들며, 그의 세포추출물의 제조과정이 번거롭기 때문에, 그들의 번역 시스템의 원가가 비교적 높아, 특수실험실의 사용에만 적합하다. 따라서 산업체의 대규모(톤급) 제조 및 생산에 적합한 진핵생물 시험관 내 단백질 발현 시스템은 현재로서는 아직 존재하지 않는다.

따라서, 본 분야에서는 일종의 고수율, 저예산의 시험관 내 발현 시스템의 개발이 시급히 필요하다.

본 발명은 일종의 고수율, 저예산의 시험관 내 발현 시스템을 제공하였다.

본 발명은 현존 기술에 존재하는 결함 및 부족함을 극복하기 위한, DNA를 주형으로 하여 시험관 내에서 단백질을 합성하는 방법의 확립 및 최적화를 제공하였다.

본 발명의 첫 번째 목적은 일종의 효모추출물의 제조방법을 제공하는 것이고, 본 발명의 두 번째 목적은 일종의 시험관 내 단백질 합성 키트를 제공하는 것이다.

본 발명은 첫 번째 방면에서 일종의 시험관 내 무세포 단백질합성 시스템을 제공하며, 상기 무세포의 단백질합성 시스템은 하기 물질을 포함한다.

(a) 효모세포추출물;

(b) 폴리에틸렌글리콜;

(c) 선택적인 외인성 자당; 및

(d) 선택적인 용매, 여기서 용매는 물 또는 수성 용매이다.

또 다른 바람직한 예에서, 상기 무세포의 단백질 합성 시스템은 하기 군에서 선택되는 하나 또는 다수의 조성분을 더 포함한다.

(e1) RNA의 합성에 사용되는 기질;

(e2) 단백질의 합성에 사용되는 기질;

(e3) 마그네슘이온;

(e4) 칼륨이온;

(e5) 완충제;

(e6) RNA 중합효소;

(e7) 에너지 재생 시스템.

또 다른 바람직한 예에서, 상기 무세포의 단백질합성 시스템은 하기 군에서 선택되는 하나 또는 다수의 조성분을 더 포함한다.

(e8) 헴(Heme);

(e9) 스페르미딘.

또 다른 바람직한 예에서, 상기 효모세포는 출아형효모(Saccharomyces cerevisiae), 피키아파스토리스(Pichia pastoris), 클루이베로마이세스(Kluyveromyces) 또는 이들의 조합으로부터 선택되는 하나 또는 다수의 공급원 효모이며; 바람직하게, 상기 효모세포는 클루이베로마이세스를 포함하고, 더 바람직하게 클루이베로마이세스락티스(Kluyveromyces lactis)이다.

또 다른 바람직한 예에서, 상기 효모세포추출물은 효모세포에 대한 수성 추출물이다.

또 다른 바람직한 예에서, 상기 효모세포추출물은 효모 내인성의 장쇄 핵산분자를 포함하지 않는다.

또 다른 바람직한 예에서, 상기 효모세포추출물은 하기 단계를 포함한 방법으로 제조한다.

（i）효모세포를 제공하고;

（ii）효모세포를 세척 처리하여, 세척된 효모세포를 얻으며;

（iii）세척된 효모세포에 대해 세포파괴를 진행하여, 효모 조추출물을 얻고; 또한

（iv）효모 조추출물의 고액을 분리하여, 액체부분, 즉 효모세포추출물을 수득한다.

또 다른 바람직한 예에서, 상기 고액분리는 원심분리를 포함한다.

또 다른 바람직한 예에서, 액체상태에서 원심분리를 진행한다.

또 다른 바람직한 예에서, 상기 원심분리 조건은 5000 내지 100000×g, 바람직하게, 8000 내지 30000×g이다.

또 다른 바람직한 예에서, 상기 원심분리 시간은 0.5 내지 2h, 바람직하게 20min 내지 50min이다.

또 다른 바람직한 예에서, 상기 원심분리는 1 내지 10℃하에서 진행되고, 바람직하게, 2 내지 6℃하에서 진행된다.

또 다른 바람직한 예에서, 상기 세척처리는 pH가 7 내지 8(바람직하게, 7.4)인 세척액으로 진행한다.

또 다른 바람직한 예에서, 상기 세척액은 하기 포타슘4-(2-하이드록시에틸)-1-피페라진에탄술폰산, 초산칼륨, 초산마그네슘 또는 이들의 조합에서 선택된다.

또 다른 바람직한 예에서, 상기 세포파괴처리는 고압파쇄, 동결 및 해동(예하면 액체 질소 저온)파쇄를 포함한다.

또 다른 바람직한 예에서, 상기 RNA를 합성하는 기질은 뉴클레오시드모노포스페이트, 뉴클레오시드트리포스페이트 또는 이들의 조합을 포함한다.

또 다른 바람직한 예에서, 상기 단백질을 합성하는 기질은 1 내지 20종의 천연아미노산 및 비-천연아미노산을 포함한다.

또 다른 바람직한 예에서, 상기 마그네슘이온은 마그네슘 이온원에서 공급되고, 상기 마그네슘 이온원은 초산마그네슘, 마그네슘글루타메이트 또는 이들의 조합에서 선택된다.

또 다른 바람직한 예에서, 상기 칼륨이온은 칼륨이온원으로부터 공급되고, 상기 칼륨이온원은 초산칼륨, 포타슘글루타메이트, 또는 이들의 조합에서 선택된다.

또 다른 바람직한 예에서, 상기 에너지재생 시스템은 포스포크레아틴산/크레아틴포스포키나제, 해당경로(glycolytic pathway)) 및 이의 중간산물에너지 시스템, 또는 이들의 조합에서 선택된다.

또 다른 바람직한 예에서, 상기 무세포의 단백질 합성 시스템은 (f1) 인공적으로 합성한 tRNA를 더 포함한다.

또 다른 바람직한 예에서, 상기 완충제는 4-(2-하이드록시에틸)-1-피페라진에탄술폰산, 트리스하이드록시메틸아미노메탄 또는 이들의 조합에서 선택된다.

또 다른 바람직한 예에서, 상기 무세포의 단백질 합성 시스템은 (g1) 단백질 합성을 유도하는데 사용되는 외인성 DNA분자를 포함한다.

또 다른 바람직한 예에서, 상기 DNA분자는 선형이다.

또 다른 바람직한 예에서, 상기 DNA분자는 고리형이다.

또 다른 바람직한 예에서, 상기 DNA분자는 외인성 단백질을 암호화하는 서열을 포함한다.

또 다른 바람직한 예에서, 상기 외인성 단백질을 암호화하는 서열은 게놈서열, cDNA서열을 포함한다.

또 다른 바람직한 예에서, 상기 외인성 단백질을 암호화하는 서열은 프로모터 서열, 5'비번역서열, 3'비번역서열을 더 포함한다.

또 다른 바람직한 예에서, 상기 무세포의 단백질 합성시스템은 4-(2-하이드록시에틸)-1-피페라진에탄술폰산, 초산칼륨, 초산마그네슘, 뉴클레오티드트리포스페이트, 아미노산, 포스포크레아틴산，디티오트레이톨(DTT), 크레아틴포스포키나제, RNA 중합효소 또는 이들의 조합에서 선택된다.

또 다른 바람직한 예에서, 상기 폴리에틸렌글리콜은 PEG3000, PEG8000, PEG6000, PEG3350 또는 이들의 조합에서 선택된다.

또 다른 바람직한 예에서, 상기 폴리에틸렌글리콜은 분자량(Da)이 200 내지 10000인 폴리에틸렌글리콜을 포함하며, 더 바람직하게, 분자량이 3000 내지 10000인 폴리에틸렌글리콜을 포함한다.

또 다른 바람직한 예에서, 상기 단백질 합성 시스템에 있어서, 상기 단백질 합성 시스템의 총 부피를 기준으로, 조성분(a)의 농도(v/v)는 20% 내지 70%, 바람직하게, 30% 내지 60%, 더 바람직하게, 40% 내지 50%이다.

또 다른 바람직한 예에서, 상기 단백질 합성 시스템이 있어서, 조성분(b)의 농도(w/v, 예하면 g/ml)는 0.1 내지 8%, 바람직하게 0.5 내지 4%, 더 바람직하게, 1 내지 2%이다.

또 다른 바람직한 예에서, 상기 단백질 합성 시스템에 있어서, 단백질 합성 시스템의 총 부피를 기준으로, 조성분(c)의 농도는 0.2 내지 4%, 바람직하게 0.5 내지 4%, 더 바람직하게 0.5 내지 1%이다.

또 다른 바람직한 예에서, 상기 뉴클레오티드트리포스페이트는 아데노신 3인산, 구아노신 3인산, 사이티딘 3인산, 유리딘 3인산 또는 이들의 조합에서 선택된다.

또 다른 바람직한 예에서, 상기 단백질 합성 시스템에 있어서, 조성분(e1)의 농도는 0.1 내지 5mM, 바람직하게, 0.5 내지 3mM, 더 바람직하게, 1 내지 1.5mM이다.

또 다른 바람직한 예에서, 상기 아미노산은 글리신, 알라닌, 발린, 류신, 이소루신, 페닐알라닌, 프롤린, 트립토판, 세린, 티로신, 시스테인, 메티오닌, 아스파라긴, 글루타민, 트레오닌, 아스파르트산, 글루탐산, 라이신, 아르기닌, 히스티딘 또는 이들의 조합에서 선택된다.

또 다른 바람직한 예에서, 상기 아미노산은 D형 아미노산 및/또는 L형 아미노산을 포함한다.

또 다른 바람직한 예에서, 상기 단백질 합성 시스템에 있어서, 상기 조성분(e2)의 농도는 0.01 내지 0.48mM, 바람직하게, 0.04 내지 0.24mM, 더 바람직하게, 0.04 내지 0.2mM，가장 바람직하게, 0.08mM이다.

또 다른 바람직한 예에서, 상기 단백질 합성 시스템에 있어서, 상기 조성분(e3)의 농도는 1 내지 10mM, 바람직하게, 1 내지 5mM, 더 바람직하게, 2 내지 4mM이다.

또 다른 바람직한 예에서, 상기 단백질 합성 시스템에 있어서, 상기 조성분(e4)의 농도는 30 내지 210mM, 바람직하게, 30 내지 150mM, 더 바람직하게, 30 내지 60mM이다.

또 다른 바람직한 예에서, 상기 단백질 합성 시스템에 있어서, 상기 조성분(e6)의 농도는 0.01 내지 0.3mg/ml, 바람직하게，0.02 내지 0.1mg/ml, 더 바람직하게，0.027 내지 0.054mg/ml이다.

또 다른 바람직한 예에서, 상기 단백질 합성 시스템에 있어서, 4-(2-하이드록시에틸)-1-피페라진에탄술폰산의 농도는 5 내지 50mM, 바람직하게, 10 내지 50mM, 바람직하게, 15 내지 30mM, 더 바람직하게, 20 내지 25mM이다.

또 다른 바람직한 예에서, 상기 단백질 합성 시스템에 있어서, 상기 초산칼륨의 농도는 20 내지 210mM, 바람직하게, 30 내지 210mM, 바람직하게, 30 내지 150mM, 더 바람직하게，30 내지 60mM이다.

또 다른 바람직한 예에서, 상기 단백질 합성 시스템에 있어서, 상기 초산마그네슘의 농도는 1 내지 10mM, 바람직하게, 1 내지 5mM, 더 바람직하게, 2 내지 4mM이다.

또 다른 바람직한 예에서, 상기 단백질 합성 시스템에 있어서, 상기 포스포크레아틴산의 농도는 10 내지 50mM, 바람직하게, 20 내지 30mM, 더 바람직하게，25mM이다.

또 다른 바람직한 예에서, 상기 단백질 합성 시스템에 있어서, 상기 헴의 농도는 0.01 내지 0.1mM, 바람직하게, 0.02 내지 0.08mM, 더 바람직하게, 0.03 내지 0.05mM, 가장 바람직하게，0.04mM이다.

또 다른 바람직한 예에서, 상기 단백질 합성 시스템에 있어서, 상기 스페르미딘의 농도는 0.05 내지 1mM，바람직하게，0.1 내지 0.8mM, 더 바람직하게, 더 바람직하게, 0.2 내지 0.5mM, 더 바람직하게, 0.3 내지 0.4mM, 가장 바람직하게, 0.4mM이다.

또 다른 바람직한 예에서, 상기 단백질 합성 시스템에 있어서, 상기 디티오트레이톨(DTT)의 농도는 0.2 내지 15mM, 바람직하게, 0.2 내지 7mM, 더 바람직하게, 1 내지 2mM이다.

또 다른 바람직한 예에서, 상기 단백질 합성 시스템에 있어서, 상기 크레아틴포스포키나제의 농도는 0.1 내지 1mg/ml, 바람직하게, 0.2 내지 0.5mg/ml, 더 바람직하게，0.27mg/ml이다.

또 다른 바람직한 예에서, 상기 단백질 합성 시스템에 있어서, 상기 T7 RNA 중합효소의 농도는 0.01 내지 0.3mg/ml, 바람직하게，0.02 내지 0.1mg/ml, 더 바람직하게，0.027 내지 0.054mg/ml이다.

또 다른 바람직한 예에서, 상기 무세포 시험관 내 합성시스템은, 단백질 토탈 합성 양이 3ug단백질/ml시스템에 도달하는 성능을 구비하고 있다.

또 다른 바람직한 예에서, 상기 무세포의 단백질 합성 시스템은 하기 조성분을 포함하고 있다.

또 다른 바람직한 예에서, 상기 무세포 단백질 합성 시스템은 하기 조성을 더 포함한다.

또 다른 바람직한 예에서, 상기 PEG는 PEG3350, PEG3000, 및/또는 PEG8000에서 선택된다.

또 다른 바람직한 예에서, 상기 RNA 중합효소는 T7 RNA 중합효소이다.

본 발명은 두 번째 방면에서 일종의 시험관 내에서 단백질을 합성하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 하기 단계를 포함한다.

(i)본 발명의 첫 번째 방면에서 기술된 시험관 내 무세포의 단백질 합성 시스템을 제공하고, 단백질합성을 유도하는 외인성 DNA 분자를 첨가한다.

(ii)적절한 조건하에, 단계(i)의 단백질 합성 시스템을 일정한 시간 T1로 배양하고, 이로부터 상기 외인성 DNA에 의해 코딩되는 단백질을 합성한다.

또 다른 바람직한 예에서, 상기 방법은.

(iii)선택적으로 상기 단백질 합성 시스템으로부터, 상기 외인성 DNA에 의해 코딩된 단백질을 분리 또는 검출하는 단계를 더 포함한다.

또 다른 바람직한 예에서, 상기 외인성 DNA는 원핵생물, 진핵생물로부터 얻는다.

또 다른 바람직한 예에서, 상기 외인성 DNA는 동물, 식물, 병원체로부터 얻는다.

또 다른 바람직한 예에서, 상기 외인성 DNA는 포유동물로부터 얻으며，바람직하게 사람, 마우스, 랫트를 포함하는 영장동물, 설치류 동물이다.

또 다른 바람직한 예에서, 상기 외인성 DNA는 플루오레세인단백질, 또는 루시퍼라아제(예하면 파이어플라이루시퍼라아제), 녹색형광단백질, 황색형광단백질, 아미노아실tRNA합성효소, 글리세르알데히드-3-인산수소이탈효소, 카탈라아제, 액틴, 항체의 가변영역인 외인성 DNA, 루시퍼라아제돌연변이체의 DNA, 또는 이들의 조합에서 선택된다.

또 다른 바람직한 예에서, 상기 외인성 DNA의 염기서열은 서열번호 1 내지 7중 어느 하나에 표시된 바와 같다.

또 다른 바람직한 예에서, 상기 단계(ii)에 있어서, 반응온도는 20 내지 37℃이고, 바람직하게, 20 내지 25℃이다.

또 다른 바람직한 예에서, 상기 단계(ii)에 있어서, 반응시간은 1 내지 6h이고, 바람직하게, 2 내지 4h이다.

본 발명의 세 번째 방면에서 시험관 내 무세포 단백질 합성에 사용하는 일종의 키트를 제공하고, 상기 키트는 하기를 포함한다.

(k1) 첫 번째 용기 및 첫 번째 용기 내에 위치한 효모세포추출물;

(k2) 두 번째 용기 및 두 번째 용기 내에 위치한 폴리에틸렌글리콜

(k3) 선택적인 세 번째 용기 및 세 번째 용기 내에 위치한 자당; 및

(kt) 라벨 또는 설명서.

또 다른 바람직한 예에서, 상기 첫 번째 용기, 두 번째 용기 및 세 번째 용기는 동일한 용기 또는 상이한 용기이다.

또 다른 바람직한 예에서, 상기 키트는 선택적으로 하기로부터 선택되는 하나 또는 다수의 용기를 더 포함한다.

(k4) 네 번째 용기 및 네 번째 용기에 위치한 RNA 합성에 사용되는 기질；

(k5) 다섯 번째 용기 및 다섯 번째 용기에 위치한 단백질합성에 사용되는 기질；

(k6) 여섯 번째 용기, 및 여섯 번째 용기에 위치한 마그네슘이온；

(k7) 일곱 번째 용기, 및 일곱 번째 용기에 위치한 칼륨이온；

(k8) 여덟 번째 용기, 및 여덟 번째 용기에 위치한 완충제.

본 발명의 범위 내에서, 본 발명의 상기 각 기술적 특징 및 하기(예하면 실시예)에 구체적으로 기술되는 다양한 기술적 특징이 서로 조합되어, 새로운 또는 바람직한 실시형태를 구성할 수 있음으로 이해해야 한다. 편폭의 제한으로 인해, 여기서 하나씩 서술하지 않는다.

도1은 DNA 주형으로 직접 시험관 내 단백질합성을 진행하는 단백질 합성 시스템 및 대조 반응의 비교 설명도이다. A는 버퍼(Buffer)자체이고, B는 파이어플라이루시퍼라아제(Firefly luciferase, Fluc) DNA를 첨가하지 않은 시험관 내 단백질 합성의 단백질 합성 시스템이며, C는 파이어플라이루시퍼라아제(Firefly luciferase, Fluc) DNA를 첨가한 시험관 내 단백질 합성의 단백질 합성 시스템이다. 반응조건은 20℃에서 4 h 반응시키는 것이다. 음성대조 A와 B의 활성은 각각 77RLU 및 160RLU이다. 반면에 반응샘플의 활성은 1,303,884RLU이다. 모든 오차는 3 반복의 표준편차이다.
도 2는 서로 다른 반응액이 시험관 내 단백질 합성 시스템에 미치는 영향에 대한 설명도이다. A는 Buffer 자체이고, B는 파이어플라이루시퍼라아제(Firefly luciferase, Fluc) DNA를 첨가하지 않은 시험관 내 단백질 합성의 단백질 합성 시스템이며, C는 초산마그네슘 및 초산칼륨 반응액에 파이어플라이루시퍼라아제(Firefly luciferase, Fluc) DNA를 첨가한 시험관 내 단백질 합성의 단백질 합성 시스템이고, D는 글루탐산마그네슘 및 글루탐산칼륨 반응액에 파이어플라이루시퍼라아제(Firefly luciferase, Fluc) DNA를 첨가한 시험관 내 단백질 합성의 단백질 합성 시스템이다. 반응조건은 20℃, 2h 반응시키는 것이다. 음성대조 A와 B의 활성은 각각 77RLU 및 160RLU이다. 초산단백질 합성 시스템에서, 시험관 내 단백질합성의 활성은 1,303,884RLU이고； 글루탐산단백질 합성 시스템에서, 시험관 내 단백질합성의 활성은 1,469,472RLU이다.
도 3은 서로 부동한 균액의 농도와 반응시간이 시험 관내 단백질 합성 시스템에 미치는 영향에 대한 설명도이다. 반응온도는 20℃이고, 반응시간은 2 내지 6h이다. 두 가지 균액의 농도는，OD600=4.5 및 OD600=6.9이다. 도면에서 알 수 있듯이 OD600=6.9의 균의 활성은 OD600=4.5보다 높다. 반응시간은 2 내지 4h으로, 차이가 크지 않다. 음성대조는 무mRNA 및 buffer 자체의 활성이 각각 520RLU 및 400RLU이다.
도 4는 서로 다른 원심력으로 처리된 효모추출물이 시험관 내 단백질 합성 시스템에 미치는 영향 설명도이다. 반응조건은 20℃에서, 2h 반응시키는 것이다. 반응액(reaction buffer)은 초산마그네슘과 초산칼륨계이다. A는 Buffer 자체이고, B는 파이어플라이 루시퍼라아제(Firefly luciferase, Fluc) DNA를 첨가하지 않은 시험관 내 단백질합성반응이며, C는 30,000×g로 원심분리한 효모추출물의 시험관 내 단백질합성반응이고, D는 18,000×g로 원심분리한 효모추출물의 시험관 내 단백질합성반응이며, E는 15,000×g로 원심분리한 효모추출물의 시험관 내 단백질합성반응이고, F는 12,000×g로 원심분리한 효모추출물의 시험관 내 단백질합성반응이다. 음성대조인 무mRNA 및 buffer 자체의 활성은 각각 200RLU 및 320RLU이다.
도 5는 초산마그네슘 농도가 시험관 내 단백질 합성 시스템에 미치는 영향에 대한 설명도이다. 반응조건은 20℃에서 2h 반응시키는 것이며, 반응액은 초산마그네슘과 초산칼륨 반응계이다. 단백질 합성 시스템에서 초산마그네슘의 농도범위는 1 내지 8mM, 음성대조인 무mRNA 및 buffer자체의 활성은 각각 80RLU 및 40RLU이다.
도 6은 초산칼륨 농도가 시험관 내 단백질 합성 시스템에 미치는 영향에 대한 설명도이다. 반응조건은 20℃에서 2h 반응시키는 것이며, 반응액은 초산마그네슘과 초산칼륨 반응계이다. 단백질 합성 시스템에서 초산칼륨의 농도범위는 30 내지 180mM，음성대조인 무mRNA 및 buffer자체의 활성은 각각 80RLU 및40RLU이다.
도 7은 아미노산 농도가 시험관 내 단백질 합성 시스템에 미치는 영향에 대한 설명도이다. 반응조건은 20℃에서 2h 반응시키는 것이며, 반응액은 초산마그네슘과 초산칼륨 반응계이다. 단백질 합성 시스템에서 아미노산의 농도범위는 0.04 내지 0.24mM，음성대조인 무mRNA 및 buffer 자체의 활성은 각각 52RLU 및 90RLU이다.
도 8은 ATP농도가 시험관 내 단백질 합성 시스템에 미치는 영향에 대한 설명도이다. 반응조건은 20℃에서 2h 반응시키는 것이며, 반응액은 초산마그네슘과 초산칼륨 반응계이다. 단백질 합성 시스템에서 ATP의 농도범위는 0.04 내지 0.24mM，음성대조인 무mRNA 및 buffer 자체의 활성은 각각 52RLU 및 90RLU이다.
도 9는 루시퍼라아제 유전자의 부동한 서열의 명칭 및 서열구조의 설명도이다. 여기에는 유전자서열의 5'말단과 3'말단의 서열, 폴리아데닐산의 개수 등을 포함한다. Omega 서열은 담배 모자이크 바이러스로부터 유래되었고, CrPV서열은 키릭켓트 파라라이시스 바이러스（Cricket paralysis virus）로부터 유래되었으며, 반면에 SITS2 서열은 일종의 비-의존성 번역 개시 서열에서 유래되었다. 동시에, 폴리아데닐산의 개수는 48A, 70A 및 90A를 포함한다.
도 10은 루시퍼라아제 유전자의 3'말단 비-번역 영역의 폴리아데닌디옥시뉴클레오티드가 시험관 내 단백질 합성 시스템에 미치는 영향에 대한 설명도이다. 반응조건은 25℃에서 2h 반응시키는 것이며, 반응액은 초산마그네슘과 초산칼륨 반응계이다. PC1은 상품화된 토끼망상적혈구의 시험관 내 단백질 합성 시스템이며, 양성대조로 사용된다. NC1는 음성대조로서 무DNA 주형인 시험관 내 단백질 합성 시스템이며, NC2는 음성대조 buffer 반응계이다. 양성대조 PC1의 활성은 1,334,396RLU이다. 음성대조인 무DNA 및 buffer 자체의 활성은 각각 66RLU 및 69RLU이다.
도 11은 루시퍼라아제 유전자 5'말단 서열이 시험관 내 단백질 합성 시스템에 미치는 영향에 대한 설명도이다. 반응조건은 25℃에서 2h 반응시키는 것이며, 반응액은 초산마그네슘과 초산칼륨 반응계이다. NC는 음성대조인 무DNA 주형인 시험관 내 단백질 합성 시스템을 나타내고，그의 활성은 44RLU이다.
도 12는 부동한 PEG 및 부동한 농도가 시험관 내 단백질 합성 시스템에 미치는 영향에 대한 설명도이다. 반응조건은 25℃에서 2h 반응시키는 것이며, 반응액은 초산마그네슘과 초산칼륨 반응계이다. 여기에서 PEG는 PEG3350, PEG8000 및 PEG3000 3종을 포함한다. 각각의 PEG는 단백질 합성 시스템에서 0.5%, 1%, 2% 및 4% 의 3 또는 4종의 농도를 포함한다. NC는 음성대조인 무DNA 주형인 시험관 내 단백질을 합성하는 단백질 합성 시스템을 나타내고, 그의 활성은 44RLU이다.
도 13은 자당농도가 시험관 내 단백질 합성 시스템에 미치는 영향에 대한 설명도이다. 반응조건은 25℃에서 2h 반응시키는 것이며, 반응액은 초산마그네슘과 초산칼륨 반응계이다. 단백질 합성 시스템은 0.5%, 1% 및 2%의 3종의 자당농도를 포함한다. NC는 음성대조인 무DNA 주형인 시험관 내 단백질을 합성하는 단백질 합성 시스템을 나타내고, 그의 활성은 190RLU이다.
도 14는 헴의 농도가 시험관 내 단백질 합성 시스템에 미치는 영향에 대한 설명도이다. 반응조건은 25℃에서 2h 반응시키는 것이며, 반응액은 초산마그네슘과 초산칼륨 반응계이다. 단백질 합성 시스템에 포함된 헴의 농도는 0，0.01，0.02，0.03，0.04mM이다.
도 15는 스페르미딘의 농도가 시험 관내 단백질 합성 시스템에 미치는 영향에 대한 설명도이다. 반응조건은 25℃에서 2h 반응시키는 것이며, 반응액은 초산마그네슘과 초산칼륨 반응계이다. 단백질 합성 시스템에 포함된 스페르미딘의 농도는 0，0.1，0.2，0.3，0.4mM이다.

광범위하고 심층적인 연구를 거치고, 대량의 스크리닝과 탐색을 통해, 처음으로 예기치 않게 생산량을 대폭으로 늘릴 수 있고 예산을 절감할 수 있는 일종의 시험관내 무세포 발현시스템을 발견하였다. 상용화된 무세포 발현시스템(예하면 토끼망상적혈구 시험관 내 발현시스템)과 비교 시, 본 발명의 시험관 내 무세포 발현시스템은 단백질을 매우 효율적으로 합성할 수 있을 뿐만 아니라, 글리코실화된 단백질과 같은 복잡한 단백질을 합성할 수 있다. 이 기초상에서, 본 발명인은 이 발명을 완성하였다.

구체적으로, 본 발명의 시험 관내 무세포 발현시스템을 사용하여，합성한 루시퍼라아제 활성의 상대광 단위값은 현재 상용화된 발현시스템(예를 들어, 토끼망상적혈구 시험관 내 발현시스템)의 약 60배까지 높아질 수 있다.

용어

본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "본 발명의 발현 시스템", "본 발명의 시험관내 발현시스템", "시험관 내 무세포 발현 시스템", "시험관 내 무세포 발현계"는 서로 호환하여 사용할 수 있으며, 본 발명의 효모에 기반한, 살아있는 세포를 포함하지 않는 시험관 내 단백질 발현 시스템을 가리킨다.

시험관 내 발현 시스템

효모(yeast)는 배양이 간단하고, 효율적인 단백질 폴딩 및 번역 후 변형의 장점을 겸비하고 있다. 그 중에서 출아형효모(Saccharomyces cerevisiae)와 피치아파스토리스효모(Pichia pastoris)는 복잡한 진핵 단백질과 막 단백질을 발현하는 모델생물이며, 효모는 시험관 내 번역시스템을 제조할 수 있는 원료로도 사용될 수 있다.

클루이베로마이세스 효모(Kluyveromyces)는 일종의 자낭포자 효모이며, 그 중에서 마크스크로프트 효모(Kluyveromyces marxianus)와 클루이베로마이세스 락티스 효모(Kluyveromyces lactis)는 산업적으로 광범위하게 사용되는 효모이다. 다른 효모와 비교 시 클루이베로마이세스 락티스 효모는 탁월한 분비능력, 보다 우수한 대규모 발효특성, 식품안전 수준을 구비한 동시에 단백질 번역을 수정할 수 있는 등 아주 많은 장점을 구비하고 있다.

본 발명에서, 효모의 시험관 내 발현시스템은 특별히 제한되지 않으며, 일종의 바람직한 효모의 시험관 내 발현시스템은 클루이베로마이세스 효모의 발현 시스템(더 바람직하게, 클루이베로마이세스 락티스 효모 발현 시스템）이다.

단백질 합성 시스템

본 발명은 일종의 시험관 내의 무세포의 단백질 합성 시스템을 제공하였으며, 상기 합성시스템은 하기 물질을 포함한다.

(a) 효모세포추출물；

(b) 폴리에틸렌글리콜；

(c) 선택적인 외인성 자당；및

(d) 선택적인 용매，상기 용매는 물 또는 수성 용매이다.

특히 바람직한 실시형태에서, 본 발명이 제공하는 시험관 내 단백질 합성 시스템은 효모세포추출물, 4-(2-하이드록시에틸)-1-피페라진에탄술폰산, 초산칼륨, 초산마그네슘, 아데노신 3인산(ATP), 구아노신 3인산(GTP), 사이티딘 3인산(CTP), 티디민삼인산(TTP), 아미노산혼합물, 포스포크레아틴산, 디티오트레이톨(DTT), 크레아틴포스포키나제, Rnase 억제제, 플루오레세인, 루시퍼라아제 DNA, RNA 중합효소, 스페르미딘, 헴으로부터 선택되는 하나 또는 다수 또는 전체 성분을 포함한다.

본 발명에서, RNA 중합효소는 특별히 제한되지 않으며, 하나 또는 다수의 RNA중합효소로부터 선택될 수 있으며, 전형적인 RNA 중합효소는 T7 RNA 중합효소이다.

본 발명에서, 상기 효모세포추출물은 시험관 내 단백질 합성 시스템의 비례에서 특별히 제한되지 않으며, 일반적으로 상기 효모세포추출물은 시험관 내 단백질을 합성하는 단백질 합성 시스템의 20 내지 70%를 차지하고, 바람직하게，30 내지 60%, 더 바람직하게，40 내지 50%를 차지한다.

본 발명에서, 상기 효모세포추출물은 완전한 세포를 함유하지 않으며, 전형적인 효모세포추출물은 단백질 번역을 위한 리보솜, 전달 RNA, 아미노아실 tRNA 합성효소, 단백질 합성에 필요한 개시인자, 연장인자 및 종결 방출인자를 포함한다. 그 외에, 효모추출물은 또한 효모세포의 세포질에서 유래된 기타 단백질, 특히 가용성 단백질을 더 함유하고 있다.

본 발명에서, 상기 효모세포추출물이 함유한 단백질의 함량은 20 내지 100mg/ml이며, 바람직하게 50 내지 100mg/ml이다. 상기의 단백질함량을 측정하는 방법은 쿠마시브릴리언트블루 측정방법이다.

본 발명에서, 상기 효모세포추출물의 제조방법은 제한되지 않으며, 일종의 바람직한 제조방법은 하기와 같은 단계를 포함한다.

（i）효모세포를 제공하며；

（ii）효모세포를 세척 처리하여, 세척된 효모세포를 얻으며；

（iii）효모세포에 대해 세포파괴 처리를 진행하여, 효모 조추출물을 얻고;

（iv）상기 효모조추출물의 고액을 분리하여, 액체부분, 즉 효모세포 추출물을 수득한다.

본 발명에서, 상기의 고액분리방법은 특별한 제한을 받지 않으며, 일종의 바람직한 방법은 원심분리이다.

일종의 바람직한 실시형태에서, 상기의 원심분리는 액체상태하에서 진행된다.

본 발명에서, 상기 원심분리 조건은 특별한 제한을 받지 않으며, 일종의 바람직한 원심분리 조건은 5000 내지 100000×g, 바람직하게, 8000 내지 30000×g이다.

본 발명에서, 상기 원심분리 시간은 특별한 제한을 받지 않으며, 일종의 바람직한 원심분리 시간은 0.5min 내지 2h, 바람직하게, 20min 내지 50min이다.

본 발명에서, 상기 원심분리 온도는 특별한 제한을 받지 않으며, 바람직하게, 상기 원심분리는 1 내지 10℃하에 진행되며, 바람직하게, 2 내지 6℃하에 진행된다.

본 발명에서, 상기 세척처리 방법은 특별한 제한을 받지 않으며, 일종의 바람직한 세척처리방법은 세척액을 사용하여 pH가 7 내지 8（바람직하게，7.4）인 조건하에서 처리하는 것이고, 상기 세척액은 특별한 제한을 받지 않으며, 전형적인 세척처리액은 하기 포타슘4-(2-하이드록시에틸)-1-피페라진에탄술폰산, 초산칼륨, 초산마그네슘, 또는 그들의 조합에서 선택된다.

본 발명에서, 상기 파세포 처리 방법은 특별한 제한을 받지 않으며, 일종의 바람직한 상기의 파세포 처리는 고압파쇄, 동결융해(예를 들어 액체질소저온)파쇄를 포함한다.

상기 시험관 내 단백질 합성 시스템의 뉴클레오시드트리포스페이트 혼합물은 아데노신 3인산, 구아노신 3인산, 사이티딘 3인산 및 유리딘 3인산이다. 본 발명에서, 각종의 단일 뉴클레오티드의 농도는 특별한 제한을 받지 않으며, 일반적으로 각각의 단일 뉴클레오티드의 농도는 0.5 내지 5mM, 바람직하게 1.0 내지 2.0mM이다.

상기 시험관 내 단백질 합성 시스템의 아미노산 혼합물은 천연 또는 비-천연아미노산을 포함할 수 있으며, D형 또는 L형 아미노산을 포함할 수 있다. 대표적인 아미노산은 글리신, 알라닌, 발린, 류신, 이소루신, 페닐알라닌, 프롤린, 트립토판, 세린, 티로신, 시스테인, 메티오닌, 아스파라긴, 글루타민, 트레오닌, 아스파르트산, 글루탐산, 라이신, 아르기닌 및 히스티딘과 같은 20종의 천연아미노산을 포함하지만 이에 한정되지 않는다. 각종 아미노산의 농도는 일반적으로 0.01 내지 0.5mM이며, 바람직하게 0.02 내지 0.2mM이며，예를 들어 0.05, 0.06, 0.07, 0.08mM이다.

바람직한 예에서, 상기 시험관 내 단백질 합성 시스템은 폴리에틸렌글리콜 또는 이의 유사체를 더 포함한다. 폴리에틸렌글리콜 또는 이의 유사체의 농도는 특별한 제한을 받지 않으며, 일반적으로, 상기 단백질 합성 시스템의 총 부피를 기준으로, 폴리에틸렌글리콜 또는 이의 유사체의 농도(w/v)는 0.1 내지 8%이고, 바람직하게，0.5 내지 4%, 더 바람직하게, 1 내지 2%이다. 대표적인 PEG의 예로 PEG3000，PEG8000，PEG6000 및 PEG3350을 포함하지만 이에 한정되지 않는다. 본 발명의 합성시스템은 또한 다른 다양한 분자량의 폴리에틸렌글리콜(예를 들어 PEG200, 400, 1500, 2000, 4000, 6000, 8000, 10000등)을 포함할 수 있음을 이해해야 한다.

바람직한 예에서, 상기 시험관 내 단백질 합성 시스템은 자당을 더 함유한다. 자당의 농도는 특별한 제한을 받지 않으며, 일반적으로, 상기 단백질 합성 시스템의 총 부피를 기준으로, 자당의 농도(w/v)는 0.2 내지 4%이고, 바람직하게，0.5 내지 4%, 더 바람직하게, 0.5 내지 1%이다.

바람직한 예에서, 상기 시험관 내 단백질 합성 시스템은 헴을 더 함유한다. 헴의 농도는 특별한 제한을 받지 않으며, 일반적으로, 헴의 농도는 0.01 내지 0.1mM이며, 바람직하게, 0.02 내지 0.08mM, 더 바람직하게, 0.03 내지 0.05mM, 가장 바람직하게, 0.04mM이다.

바람직한 예에서, 상기 시험관 내 단백질 합성 시스템은 스페르미딘을 더 함유한다. 스페르미딘의 농도는 특별한 제한을 받지 않으며, 일반적으로, 스페르미딘의 농도는 0.05 내지 1mM이며, 바람직하게, 0.1 내지 0.8mM, 더 바람직하게, 더 바람직하게, 0.2 내지 0.5mM，더 바람직하게, 0.3 내지 0.4mM, 가장 바람직하게, 0.4mM이다.

바람직한 예에서, 상기 시험관 내 단백질 합성 시스템는 완충제를 더 함유하며, 상기 완충제의 성분은 특별한 제한을 받지 않으며, 일종의 바람직한 완충제는 4-(2-하이드록시에틸)-1-피페라진에탄술폰산 및/또는 Tris 완충액을 함유한다. 본 발명에서, 상기 완충제는 초산칼륨, 초산마그네슘과 같은 기타 완충성분을 더 함유할 수 있으며, 이로 인해 pH가 6.5 내지 8.5（바람직하게 7.0 내지 8.0）인 반응액 또는 반응 완충액을 형성한다. 본 발명에서, 완충제의 유형과 함량은 특별한 제한을 받지 않는다. 일반적으로, 완충제의 농도는 1 내지 200mM 또는 1 내지 100mM，바람직하게，5 내지 50mM이다.

일종의 특별히 바람직한 시험관 내 단백질 합성 시스템에 있어서, 효모추출물 외에, 22mM, pH가 7.4인 4-(2-하이드록시에틸)-1-피페라진에탄술폰산, 30 내지 150mM의 초산칼륨, 1.0 내지 5.0mM의 초산마그네슘, 1.5 내지 4mM의 뉴클레오티드트리포스페이트 혼합물, 0.08 내지 0.24mM의 아미노산 혼합물, 25mM의 포스포크레아틴산, 1.7mM의 디티오트레이톨, 0.27mg/mL의 크레아틴포스포키나제, 1% 내지 4% 폴리에틸렌글리콜, 0.5% 내지 2%의 자당, 8 내지 20ng/μl 파이어플라이 루시퍼라아제DNA, 0.027 내지 0.054 mg/mL의 T7 RNA 중합효소, 0.03 내지 0.04mM의 헴，0.3 내지 0.4mM의 스페르미딘에서 선택되는 하나 또는 다수 또는 모든 성분을 더 함유한다.

외인성 DNA

시험관 내 단백질합성에 사용될 때, 상기 무세포 단백질 합성 시스템은 (g1) 단백질합성을 유도하는데 사용되는 외인성 DNA 분자를 더 포함한다. 일반적으로, 상기 DNA 분자는 선형 또는 고리형이다. 상기 DNA 분자는 외래 단백질을 암호화하는 서열을 포함한다.

본 발명에서, 상기 외인성 단백질을 코딩하는 서열의 예는 게놈서열, cDNA서열을 포함하지만 이에 한정되지 않는다. 상기 외인성 단백질을 코딩하는 서열은 프로모터서열, 5'비번역서열 및 3'비번역서열을 더 포함한다.

본 발명에서, 상기 외인성 DNA의 선택은 특별한 제한을 받지 않으며, 일반적으로, 외인성 DNA는 하기 플루오레세인단백질 또는 루시퍼라아제(예를 들어 파이어플라이루시퍼라아제), 녹색형광단백질, 황색형광단백질, 아미노아실 tRNA 합성효소, 글리세르알데히드-3-인산수소이탈효소, 카탈라아제, 액틴, 항체의 가변영역인 외인성 DNA, 루시퍼라아제 돌연변이체의 DNA 또는 이들의 조합에서 선택된다. 대표적인 외인성 DNA의 서열은 서열번호 1 내지 서열번호 7에서 선택된다.

키트

본 발명은 시험관내 무세포 단백질 합성에 사용하는 키트를 제공하며，

(k1) 첫 번째 용기 및 첫째 용기 내에 위치한 효모세포추출물；

(k2) 두 번째 용기 및 두 번째 용기 내에 위치한 폴리에틸렌글리콜；

(k3) 선택적인 세 번째 용기 및 세 번째 용기에 위치한 자당; 및

(kt) 라벨 또는 설명서,

를 포함한다

일종의 바람직한 실시형태에서, 상기 첫 번째 용기, 두 번째 용기 및 세 번째 용기는 동일한 용기 또는 상이한 용기이다.

일종의 특별히 바람직한 시험관 내 단백질합성 키트는 한 개의 시험관 내 단백질을 합성하는 단백질 합성 시스템을 포함하며, 이 단백질 합성 시스템은 효모세포추출물, 4-(2-하이드록시에틸)-1-피페라진에탄술폰산, 초산칼륨, 초산마그네슘, 아데노신 3인산(ATP), 구아노신 3인산(GTP), 사이티딘 3인산(CTP), 티디민삼인산(TTP), 아미노산혼합물, 포스포크레아틴산, 디티오트레이톨(DTT), 크레아틴포스포키나제, Rnase 억제제, 플루오레세인, 루시퍼라아제 DNA, T7 RNA 중합효소, 스페르미딘, 헴에서 선택되는 하나 또는 다수 또는 전체 성분을 포함한다.

본 발명의 주요 장점은 하기 내용을 포함한다.

(1) 본 발명의 키트는 DNA를 주형으로 하는 시험관 내 단백질 합성에 사용될 수 있으며, RNA를 주형으로 하는 시험관 내 단백질 발현보다 더 간편하고 빠르다.

(2) 본 발명의 효모 시험관 내 발현시스템은 통상적인 단백질 발현시스템과 비교 시 플라스미드 형질전환, 세포배양, 수집, 파쇄 및 원심분리와 같은 시간 소모적이고 인력 낭비적인 단계를 생략하고 작업효율을 크게 개선하며 합성된 단백질의 정제가 보다 용이하게 되어 사용자로 하여금 많은 시간과 비용을 절약할 수 있게 하였다.

(3) 본 발명의 효모 시험관 내 발현시스템은 통상적인 원핵생물 시험관 내 발현시스템보다 더 많은 활성 단백질 종을 발현하며, 특히 막 단백질, 세포독성 단백질, 분자보호자, 거대분자 단백질복합체 등의 발현에서 분명한 우세를 가지고 있다.

(4) 고압분쇄 또는 액체질소 분쇄에 의해 제조된 효모추출물은 DNA 주형을 사용하여 단백질을 직접 합성하는 능력을 가지며, 초산마그네슘, 초산칼륨, 아미노산, ATP, 서로 다른 서열의 DNA 주형, 폴리에틸렌글리콜, 자당과 같은 반응 조건의 최적화에 의해 합성된 루시퍼라아제의 상대적 활성은 60,000,000RLU에 달하고, 토끼망상적혈구의 시험관 내 발현시스템과 같은 상용화된 무세포 발현시스템은 단지 1,000,000RLU의 루시퍼라제 활성을 구비하고 있다.

(5) 본 발명에서 최적의 조건하에서 합성된 루시퍼라아제 활성의 상대광 단위값은 상업적 시스템의 60배이다.

(6) 본 발명에서 제조된 효모추출물 및 키트의 제조는 현재기술의 결점을 극복할 뿐만 아니라 현재기술보다 더 큰 우세 및 전망을 구비하고 있다. 한편, 본 발명에서 사용되는 원료 효모세포는 배양이 간편하고, 조작이 편리하고, 증식이 빠르며, 비용이 비교적 낮고, 대량 제조에 적합하여, 산업적 생산에 우세를 가지고 있으며, 또한 본 발명에 사용되는 파쇄방법인 고압균질기 파쇄 방법 및 액체질소기계 파쇄 방법은 간단하고, 효율적이며, 확장이 용이하여, 산업화생산의 대규모제조에 적합하다.

하기 구체적인 실시예와 결합하여, 본 발명을 더 한층 설명하였다. 이러한 실시예는 단지 본 발명을 설명하기 위한 것이며 본 발명의 범위를 한정하려는 것이 아님을 이해해야 한다. 하기 실시예에서 명시되지 않은 실험방법의 구체적인 조건은, 일반적으로 통상적인 조건, 예를 들어 Sambrook 등, 분자클로닝：실험실 메뉴얼(New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)에 기재된 조건을 따르거나, 또는 제조업체에서 권장하는 조건을 따른다. 다른 설명이 없으면，백분율 및 부는 중량백분율 및 중량부이다.

달리 언급하지 않는 한, 본 발명의 실시예에 사용되는 모든 재료와 시약은 모두 시판되는 제품이다.

실시예 1: 고압파쇄에 의한 효모세포추출물의 제조

1.1 효모 종자액의 제조： 평판에서 클루이베로마이세스 락티스 효모의 단일집락을 선택하여, 50mL의 YPD 배지(YPD 배지의 성분：1% 효모추출물，2% 펩톤，2% 포도당，pH 5.5)를 함유한 250mL의 삼각플라스크(액체양 20%, 이하, 하기도 동일)에 접종하고, 접종이 된 삼각플라스크를 진탕기에 넣고 배양하였으며，배양조건은 온도가 30℃, 회전속도는 200rpm이며, 24h 배양 후 얻은 물질이 곧 종자액이다；

1.2 효모 세포의 배양：1.1에서 제조한 종자액을 400mL의 YPD 배지가 들어있는 2L 삼각플라스크에 0.1 내지 1%의 접종 양으로 접종하고, 진탕기에 넣어 배양하였으며, 배양조건은：온도가 30℃, 회전속도는 200rpm이다. 효모의 대수증식기의 중간 및 후기단계(OD600=3.0 내지 6.9)에서，배양을 종결하여, 세포배양액을 얻었다；

1.3 1.2에서 배양된 세포 배양물질을 10 내지 30min 동안 얼음과 물의 혼합물에서 미리 냉각시켰다.

1.4 1.3의 미리 냉각된 세포 배양물질을 저온원심분리기에서 원심분리조건(3,000×g, 10min, 4℃)하에 원심분리하고 효모세포를 수득하였다.

1.5 1.4에서 얻은 효모세포를 사전 냉각된 세척 완충액（Washing buffer）에 재현탁하고 세척완충액(Washing buffer）의 양은 50 내지 100mL/L배양액이었다. 재현탁액을 저온원심분리기에서 원심분리하여 효모세포를 원심분리조건: 3000Хg, 10min, 4℃에서 수득하였다. 세척완충액(Washing buffer)의 조성： 10 내지 40mM, pH가 7.4인 포타슘4-(2-하이드록시에틸)-1-피페라진에탄술폰산, 50 내지 150mM초산칼륨，1 내지 4mM 초산마그네슘；

1.6 1.5단계를 2 내지 3회 반복하였다.

1.7 단계 1.6에서 수득된 효모세포를 후속 조작에 직접 적용하거나, 또는 액체질소로 급속 냉동한 후 -80℃에 보존하였다.

1.8 고압균질화기로 효모세포를 파쇄하였다. 효모세포는 그램 당 0.2 내지 0.5mL의 완충액(buffer) A에 재현탁시키고，고압균질화기에 의해 현탁액을 파괴하여 세포 조추출물을 수득하였다. 고압파쇄의 조건： 압력은 1000 내지 1400 bar，온도는 4℃, 파쇄회수는 1회 또는 여러 회이다.

1.9 1.8단계에서 수확한 효모세포 조추출물을 1 내지 2회 원심분리하였고, 원심력은12000 내지 30000Хg，시간은 30min, 온도는 4℃이다；

1.10 원심분리 후, 상층의 상층액, 즉 효모세포추출물을 취하였다.

1.11 준비된 효모세포 추출물을 분주하고, 액체질소에서 신속히 동결시킨 후 -80℃에 보존하였다. 쿠마시 브릴리언트 블루 분석방법으로, 서로 다른 배치의 효모세포추출물에서 단백질 함량을 측정했을 때 평균 약 20 내지 100mg/ml, 평균 약 60 내지 70mg/ml이었다.

실시예 2: 액체질소 파쇄법에 의한 효모세포추출물 제조

2.1 효모종자액의 제조： 평판에서 클루이베로마이세스 락티스 효모의 단일집락을 선택하여, 50mL의 YPD 배지(YPD 배지의 성분：1% 효모추출물, 2% 펩톤，2% 포도당，pH 5.5)를 250mL의 삼각플라스크(액체양 20%, 이하 상동)에 접종하고, 접종이 된 삼각플라스크를 진탕기에 넣고 배양하였으며, 배양조건은 온도가 30℃, 회전속도가 200rpm이다. 24h 배양 후 얻은 물질이 곧 종자액이다.

2.2 효모세포의 배양：2.1에서 제조한 종자액을 400mL의 YPD 배지가 들어있는 2L 삼각플라스크에 0.1 내지 1의 접종양으로 접종하고 진탕기에 넣고 배양하였으며, 배양조건은 온도가 30℃, 회전속도가 200rpm이다. 효모의 대수증식기의 중간 및 후기단계(OD600=3.0 내지 6.9)에서, 배양을 종결하여, 세포배양약을 얻었다；

2.3 2.2에서 배양된 세포배양물질을 10 내지 30min 동안 얼음과 물의 혼합물에서 미리 냉각시켰다.

2.4 2.3의 미리 냉각된 세포배양물질을 저온원심분리기에서 원심분리조건(3,000×g, 10min, 4℃)하에 원심분리하여 효모세포를 수득하였다.

2.5 2.4에서 얻은 효모세포를 사전 냉각된 세척 완충액（Washing buffer）에 재현탁하고, 세척완충액（Washing buffer） 양은 50 내지 100mL/L이었다. 재현탁액을 저온원심분리기에서 원심분리하여 효모세포를 원심분리조건: 3000Хg, 10min, 4℃에서 수득하였다. 세척 완충액(Washing buffer)의 조성：20 내지 30mM의 pH가 7.4인 4-(2-하이드록시에틸)-1-피페라진에탄술폰산, 100 내지 150mM의 초산칼륨，1 내지 4mM 초산마그네슘；

2.6 2.5단계를 2 내지 3회 반복하였다.

2.7 2.6에서 수득된 효모세포를 후속 조작에 직접 적용하거나, 또는 액체질소로 급속 냉동한 후 -80℃에 보존하였다.

2.8 액체질소균질화기로 효모세포를 파쇄하였다. 적절한 양의 액체질소를 균질화기에 첨가하고, 원심 분리에 의해 수득된 효모세포 또는 2.7에서 -80℃에 보존된 효모세포를 첨가하였다. 회전속도：45,000rpm, 파쇄 3 내지 10min； 파쇄된 저온분말을 50mL의 원심분리 튜브에 분주하고, 무게를 측정하여 사용하기 전까지 -80℃에 보관하였다.

2.9 2.8에서 수득된 효모세포 파쇄분말을 실온에서 4℃로 냉각시키고, 그램 당 세포 분쇄분말을 4℃에서 0.2 내지 1mL의 사전에 냉각된 용해 완충액(Lysis buffer)으로 용해시켜 효모세포 조추출물을 수득하였다. 용해 완충액(Lysis buffer)은 10 내지 40mM의 pH가 7.4인 포타슘4-(2-하이드록시에틸)-1-피페라진에탄술폰산, 50 내지 150mM의 초산칼륨, 1 내지 4mM의 초산마그네슘, 2 내지 7mM의 디티오트레이톨, 0.5 내지 2mM의 페닐메틸술포닐플루오라이드로 이루어졌다.

2.10 2.9단계에서 수확한 효모세포 조추출물을 1 내지 2회 원심분리하였고, 원심력은12000 내지 30000Хg，시간은 30min, 온도는 4℃이다；

2.11 원심분리 후, 상층의 상청액을 수득하였으며 이는 곧 효모세포추출물이다.

2.12 준비된 효모세포 조추출물을 분주하고, 액체질소에서 신속히 동결시킨 후 -80℃에 보존하였다. 쿠마시 브릴리언트 블루 분석방법으로, 서로 다른 배치의 효모세포추출물에서 단백질함량을 측정했을 때 약 25 내지 100mg/ml이며, 평균 약 60 내지 70mg/ml이었다.

실시예 3: 무세포 시험관 내 단백질 합성 시스템

3.1 시험관 내 단백질 합성 시스템의 저장액 제조：1M의 pH가 7.4인 4-(2-하이드록시에틸)-1-피페라진에탄술폰산, 5M의 초산칼륨, 250mM의 초산마그네슘，아데노신 3인산, 구아노신 3인산, 사이티딘 3인산 및 유리딘 3인산을 포함한 25mM의 4종 뉴클레오티드트리포스페이트의 혼합물，글리신, 알라닌, 발린, 류신, 이소루신, 페닐알라닌, 프롤린, 트립토판, 세린, 티로신, 시스테인, 메티오닌, 아스파라긴, 글루타민, 트레오닌, 아스파르트산, 글루탐산, 라이신, 아르기닌 및 히스티딘을 포함한 1mM의 20종 아미노산 혼합물, 20종 아미노산의 농도는 모두 1.0mM이며, 1M의 포스포크레아틴산, 1M의 디티오트레이톨, 6.48 mg/mL의 크레아틴포스포키나제, 1.7 mg/ml 의 T7 RNA 중합효소, 20% 내지 50% 폴리에틸렌글리콜(polyethylene glycol, PEG)3350 또는 (polyethylene glycol, PEG) 8000, 20% 내지 40% 자당, 1 내지 4mM의 스페르미딘, 0.1 내지 0.4mM의 헴；

3.2 시험관 내 단백질합성 시스템： 최종농도가 22mM인 pH가 7 내지 8인 4-(2-하이드록시에틸)-1-피페라진에탄술폰산, 30 내지 150mM인 초산칼륨, 1.0 내지 5.0mM인 초산마그네슘, 1.5 내지 4mM인 뉴클레오티드트리포스페이트 혼합물(아데노신 3인산, 구아노신 3인산, 사이티딘 3인산 및 유리딘 3인산), 0.08 내지 0.24mM의 아미노산 혼합물(글리신, 알라닌, 발린, 류신, 이소루신, 페닐알라닌, 프롤린, 트립토판, 세린, 티로신, 시스테인, 메티오닌, 아스파라긴, 글루타민, 트레오닌, 아스파르트산, 글루탐산, 라이신, 아르기닌 및 히스티딘), 25mM의 포스포크레아틴산, 1.7mM의 디티오트레이톨, 0.27 mg/mL의 크레아틴포스포키나제, 8 내지 20ng/μL의 파이어플라이 루시퍼라아제 DNA, 0.027 내지 0.054 mg/mL의 T7 RNA 중합효소, 1% 내지 4%의 폴리에틸렌글리콜, 0.5% 내지 2%의 자당, 0.03 내지 0.04mM의 헴, 0.3 내지 0.4mM의 스페르미딘이며, 마지막으로 50% 부피의 효모세포 추출물을 첨가하였다.

3.3 시험관 내 단백질 합성반응：상기 반응계를 20 내지 30℃의 환경에서, 2 내지 6 시간 동안 방치하였다.

3.4 루시퍼라아제 활성측정： 반응이 끝난 후，동일한 부피의 기질 루시퍼라아제(luciferine)를 96웰 화이트 플레이트 또는 384웰 화이트 플레이트에 첨가하고, 즉시 Envision 2120 다기능 마이크로플레이트리더(Perkin Elmer)에 넣어, 수치를 판독하여, 파이어플라이 루시퍼라아제의 활성을 측정하였고，도 1 내지 도 8, 도 10 내지 도 13에 도시된 바와 같이 상대광단위값(RLU)을 활성의 단위로 하였다.

실험결과

1. DNA를 주형으로 한 시험관 내 단백질 합성 시스템

도 1에서 알 수 있듯이, 20℃에서 2시간 반응시키는 반응조건하에서, 시험관 내 단백질 합성반응시스템의 상대광 단위값은 1,303,884 (Relative Light Unit, RLU)이고, 무DNA 및 buffer 자체 음성대조의 활성은 각각 77RLU 및 160RLU이다. 이로서, 효모추출물은 보다 강한 시험관 내 단백질합성능력을 구비하였음을 알 수 있다.

2. 반응 완충액이 시험관 내 단백질합성 반응시스템에 미치는 영향

도 2에서 알 수 있듯이，20℃에서 2시간 동안 반응시키는 동일한 반응조건이다. 음성 대조 A 및 B의 활성은 각각 77RLU 및 160RLU이다. 아세트산 반응계와 글루탐산 반응계는 뚜렷한 활성의 차이가 없었으며, 활성은 각각 1,303,884RLU와 1,469,472RLU이다.

3. 균액의 농도가 시험관 내 단백질 합성 시스템에 미치는 영향

도 3에서 알 수 있듯이, 서로 다른 OD600값에서 수확한 균으로 제조하여 수득한 추출물은 동일한 반응시간에서 일정한 차이를 보였으며, 반응온도가 20℃이고, 반응시간이 2 내지 6h이며, 도에서 알 수 있듯이 OD600=6.9인 균 시험관 내 합성 단백질의 활성은 OD600=4.5보다 높았다. 하지만 시험관 내 합성 단백질의 능력에 대한 반응시간의 영향은 크지 않았다. 그 중 OD600가 6.9인 효모추출물의 단백질 합성 활성은 125,346RLU에 달할 수 있다.

4. 서로 다른 원심력으로 처리된 효모추출액이 시험관 내 단백질 합성 시스템에 미치는 영향

도면에서 알 수 있듯이, 반응조건은 20℃에서 2h 반응시키는 것이며, 반응액은 초산마그네슘과 초산칼륨 반응계이고，각각 30,000×g(C), 18,000×g(D), 15,000×g(E), 12,000×g(F)인 원심력으로 처리되어 수득한 효모추출물은 시험관 내 단백질 합성반응에서 큰 차이가 없었으며, 활성은 모두 1,000,000RLU이상 이었다. 음성 대조인 무DNA 및 buffer 자체의 활성은 각각 200RLU 및 320RLU였다.

5. 초산마그네슘 농도가 시험관 내 단백질 합성 시스템에 미치는 영향

반응조건은 20℃에서 2h 반응시키는 것이며, 반응액은 초산마그네슘과 초산칼륨 반응계이고, 상기 반응계에서 초산마그네슘의 농도범위는 1 내지 8mM이다. 도5에서 알 수 있듯이, 1 내지 5mM의 초산마그네슘의 반응계에서, 효모세포추출물이 합성한 루시퍼라아제의 상대광 단위값은 모두 1,000,000RLU보다 낮지 않으며, 그 중 2mM의 초산마그네슘의 단백질 합성능력이 가장 높고, 상대광 단위값은 2,884,286RLU에 달할 수 있으며； 반면에 6 내지 8mM의 초산마그네슘은 합성된 루시퍼라아제의 상대광 단위값을 감소시켰다.

6. 초산칼륨의 농도가 시험관 내 단백질 합성 시스템에 미치는 영향

시험관 내 단백질 합성반응시스템에서, 30, 45, 60, 75, 90, 120, 150 및 180mM의 초산칼륨을 사용하였고, 20℃에서 2h 반응하였으며, 결과는 도 6에 도시되었고, 도 6에서 알 수 있듯이, 초산칼륨의 농도가 30 내지 180mM 구간에서, 그의 상대광 단위값은 모두 1,000,000RLU보다 낮지 않고, 효과가 가장 좋은 것은 30mM초산칼륨이며, 이의 상대광 단위값은 3,338,091RLU에 달하였다.

7. 아미노산 농도가 시험관 내 단백질 합성 시스템에 미치는 영향에 대한 설명도

반응조건은 20℃에서 2h 반응시키는 것이며, 반응액은 초산마그네슘과 초산칼륨 반응계이다. 단백질 합성 시스템에서 아미노산의 농도범위는 0.04 내지 0.24mM이다. 도 7에서 알 수 있듯이, 아미노산의 농도가 0.08 내지 0.24mM 구간에서, 그의 상대광 단위값은 모두 1,000,000RLU보다 낮지 않으며, 서로 다른 아미노산 농도간의 활성차이는 비교적 작다.

8. ATP농도가 시험관 내 단백질 합성 시스템에 미치는 영향

반응조건은 20℃에서 2h 반응시키는 것이며, 반응액은 초산마그네슘과 초산칼륨 반응계이다. 단백질 합성 시스템에서 ATP의 농도범위는 1.5 내지 4.5mM이다. 도8에서 알 수 있듯이, ATP의 농도가 2.5, 3 및 4mM일 경우, 그 상대광 단위값은 모두 1,000,000RLU보다 낮지 않고, 활성의 차이는 비교적 작다. 1.5mM보다 낮거나 또는 4.0mM보다 높은 ATP는 모두 시험관 내 단백질합성능력에 영향을 미친다.

9. 서로 다른 DNA 주형의 루시퍼라아제 유전자의 구조적 조성

도 9는 상기 단백질 시험관 내 합성시스템에 적용된 7종의 서로 다른 루시퍼라아제 유전자 주형을 포함하며, 그 중 omega서열, SITS2서열 및 CrPV서열과 같은 서로 다른 5'말단을 포함하였다. 3'말단의 서열은 주로 lacZ로부터 유래한 종결자 서열 및 서로 다른 폴리아데닐산의 개수를 포함하였다.

10. 루시퍼라아제 유전자의 3'말단 서열이 시험관 내 단백질 합성 시스템에 미치는 영향

반응조건은 20℃에서 2h 반응시키는 것이며, 반응액은 초산마그네슘과 초산칼륨 반응계이다. PC1은 상품화된 토끼망상적혈구 시험관 내 단백질 합성 시스템이다. 도 10에서 알 수 있듯이, 양성대조와 비교 시, 50A, 70A, 90A 및 lacZ 종결자서열을 포함한 루시퍼라아제 유전자는 모두 효모추출물에서 번역을 진행할 수 있으며, 그 중 90A의 활성이 가장 높고, 그의 상대광 단위값은 6,844,583RLU이고, 반면에 상품화된 토끼망상적혈구 시험관 내에서 합성된 루시퍼라아제의 상대광 단위는 1,000,000RLU밖에 되지 않았다. 음성대조 무DNA 및 buffer 자체의 활성은 각각 66RLU 및 69RLU이다.

11. 플루오레세인 유전자 5'말단 서열이 시험관 내 단백질 합성 시스템에 미치는 영향

반응조건은 25℃에서 2h 반응시키는 것이며, 반응액은 초산마그네슘과 초산칼륨 반응계이다. 도 11에서 알 수 있듯이, 음성 대조와 비교 시, 루시퍼라아제 유전자 5'말단의 omega 서열, CrPV 서열 및 SITS2 서열은 모두 루시퍼라아제 유전자로 하여금 효모추출물에서 발현될 수 있게끔 하고, 그 중 활성이 가장 높은 것은 SITS2 서열이며, 그 상대광 단위값은 5,816,496RLU이다. 반면에 omega 서열의 시험관 내 단백질 합성 시스템의 상대광 단위값은 3,458,701RLU이다.

12. PEG가 시험관 내 단백질 합성 시스템에 미치는 영향

반응조건은 25℃에서 2h 반응시키는 것이며, 반응액은 초산마그네슘과 초산칼륨 반응계이다. 도 12에서 알 수 있듯이, PEG를 첨가하지 않은 반응계와 비교 시, 3종의 PEG는 모두 효모추출물의 시험관 내 단백질합성능력을 유의하게 개선시켰고, 그 중 2% PEG3350, 2% PEG8000 및 4% PEG8000에서 특히 뛰어났으며, 상대광 단위값은 60,000,000RLU에 달하였다.

13. 도 13은 자당농도가 시험관 내 단백질 합성 시스템에 미치는 영향을 보여준다.

반응조건은 25℃에서 2h 반응시키는 것이며, 반응액은 초산마그네슘과 초산칼륨 반응계이다. 도 13에서 알 수 있듯이, 자당을 첨가하지 않은 반응계와 비교 시, 자당 농도가 0.5%, 1% 및 2%의 3가지 농도일 경우 모두 효모추출물의 시험관 내 단백질합성능력을 향상시켰고, 그 중 0.5% 농도에서 특히 뛰어났다. NC는 음성대조인 무DNA 주형의 시험관 내 단백질 합성 반응 시스템을 나타내고, 그 활성은 190RLU이다.

14. 도 14는 헴의 농도가 시험관 내 단백질 합성 시스템에 미치는 영향이다.

반응조건은 25℃에서 2h 반응시키는 것이며, 반응액은 초산마그네슘과 초산칼륨 반응계이다. 도 14에서 알 수 있듯이, 헴을 첨가하지 않은 반응계와 비교 시, 헴의 농도는 0.01，0.02，0.03，0.04mM의 4가지 농도에서 모두 효모추출물의 시험관 내 단백질합성능력을 향상시켰고, 그 중 0.04mM 농도에서 특히 뛰어났다.

15. 도 15는 스페르미딘 농도가 시험관 내 단백질 합성 시스템에 미치는 영향이다.

반응조건은 25℃에서 2h 반응시키는 것이며, 반응액은 초산마그네슘과 초산칼륨 반응계이다. 도 15에서 알 수 있듯이, 스페르미딘을 첨가하지 않은 반응계와 비교 시, 스페르미딘은 농도가 0.2, 0.3 및 0.4mM에서 모두 효모추출물의 시험관내 단백질합성능력을 향상시켰고, 그 중 0.4mM에서 특히 뛰어났다.

본 발명의 결과는 고압파쇄법 또는 액체질소파쇄법에 의해 제조된 효모추출물은 직접 DNA 주형을 사용하여 단백질을 합성하는 능력이 있다는 것을 나타내었다. 동시에 초산마그네슘, 초산칼륨, 아미노산，ATP, 상이한 서열 서열조성을 갖고 있는 DNA 주형, 폴리에틸렌글리콜, 자당의 최적화 등과 같은 다양한 반응조건의 최적화를 통해, 합성된 루시퍼라아제의 상대적 활성은 60,000,000RLU에 도달하였고，상용화된 토끼망상적혈구 시험관 내 발현시스템과 같은 무세포 발현시스템의 활성은 단지 1,000,000RLU에 달할 뿐이다. 본 발명에서 최적의 조건으로 합성된 루시퍼라아제 활성의 상대광 단위값은 상용화 시스템의 60배이며, 이는 본 발명의 큰 우세를 구현하였다.

본 발명에서 언급한 모두 문헌은 각각의 문헌이 단독으로 인용되어 참조로 하는 것처럼 본 명세서에 참조로 인용되었다. 또한, 상기 본 발명의 기재된 내용을 읽은 후 당업자는 본 발명을 다양하게 변경 또는 수정할 수 있으며, 이들의 등가 형태는 본 출원에 첨부된 청구 범위에 의해 정의된 범위 내에 있음을 이해해야 한다.

<110> KANGMA-HEATHCODE (SHANGHAI) BIOTECH CO., LTD <120> PROTEIN SYNTHESIS SYSTEM FOR PROTEIN SYNTHESIS IN VITRO, KIT AND PREPARATION METHOD THEREOF <130> IP19-0033 <150> CN 201710125619.9 <151> 2017-03-04 <150> PCT/CN 2017/0077814 <151> 2017-03-23 <160> 7 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 1773 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Omega-48A <400> 1 ggtattttta caacaattac caacaacaac aaacaacaaa caacattaca attactattt 60 acaattacaa tggaagacgc caaaaacata aagaaaggcc cggcgccatt ctatcctcta 120 gaggatggaa ccgctggaga gcaactgcat aaggctatga agagatacgc cctggttcct 180 ggaacaattg cttttacaga tgcacatatc gaggtgaaca tcacgtacgc ggaatacttc 240 gaaatgtccg ttcggttggc agaagctatg aaacgatatg ggctgaatac aaatcacaga 300 atcgtcgtat gcagtgaaaa ctctcttcaa ttctttatgc cggtgttggg cgcgttattt 360 atcggagttg cagttgcgcc cgcgaacgac atttataatg aacgtgaatt gctcaacagt 420 atgaacattt cgcagcctac cgtagtgttt gtttccaaaa aggggttgca aaaaattttg 480 aacgtgcaaa aaaaattacc aataatccag aaaattatta tcatggattc taaaacggat 540 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cttttacaga tgcacatatc gaggtgaaca tcacgtacgc ggaatacttc 240 gaaatgtccg ttcggttggc agaagctatg aaacgatatg ggctgaatac aaatcacaga 300 atcgtcgtat gcagtgaaaa ctctcttcaa ttctttatgc cggtgttggg cgcgttattt 360 atcggagttg cagttgcgcc cgcgaacgac atttataatg aacgtgaatt gctcaacagt 420 atgaacattt cgcagcctac cgtagtgttt gtttccaaaa aggggttgca aaaaattttg 480 aacgtgcaaa aaaaattacc aataatccag aaaattatta tcatggattc taaaacggat 540 taccagggat ttcagtcgat gtacacgttc gtcacatctc atctacctcc cggttttaat 600 gaatacgatt ttgtaccaga gtcctttgat cgtgacaaaa caattgcact gataatgaat 660 tcctctggat ctactgggtt acctaagggt gtggcccttc cgcatagaac tgcctgcgtc 720 agattctcgc atgccagaga tcctattttt ggcaatcaaa tcattccgga tactgcgatt 780 ttaagtgttg ttccattcca tcacggtttt ggaatgttta ctacactcgg atatttgata 840 tgtggatttc gagtcgtctt aatgtataga tttgaagaag agctgttttt acgatccctt 900 caggattaca aaattcaaag tgcgttgcta gtaccaaccc tattttcatt cttcgccaaa 960 agcactctga ttgacaaata cgatttatct aatttacacg aaattgcttc tgggggcgca 1020 cctctttcga aagaagtcgg ggaagcggtt gcaaaacgct tccatcttcc agggatacga 1080 caaggatatg ggctcactga gactacatca gctattctga ttacacccga gggggatgat 1140 aaaccgggcg cggtcggtaa agttgttcca ttttttgaag cgaaggttgt ggatctggat 1200 accgggaaaa cgctgggcgt taatcagaga ggcgaattat gtgtcagagg acctatgatt 1260 atgtccggtt atgtaaacaa tccggaagcg accaacgcct tgattgacaa ggatggatgg 1320 ctacattctg gagacatagc ttactgggac gaagacgaac acttcttcat agttgaccgc 1380 ttgaagtctt taattaaata caaaggatat caggtggccc ccgctgaatt ggaatcgata 1440 ttgttacaac accccaacat cttcgacgcg ggcgtggcag gtcttcccga cgatgacgcc 1500 ggtgaacttc ccgccgccgt tgttgttttg gagcacggaa agacgatgac ggaaaaagag 1560 atcgtggatt acgtcgccag tcaagtaaca accgcgaaaa agttgcgcgg aggagttgtg 1620 tttgtggacg aagtaccgaa aggtcttacc ggaaaactcg acgcaagaaa aatcagagag 1680 atcctcataa aggccaagaa gggcggaaag tccaaattgg tttaatttat acttagataa 1740 gtatgtactt acaggtatat ttctatgaga tactgatgta tacatgcatg ataatattta 1800 aacggttatt agtgccgatt gtcttgtgcg ataatgacgt tcctatcaaa gcaatacact 1860 taccacctat tacatgggcc aagaaaatat tttcgaactt gtttagaata ttagcacaga 1920 gtatatgatg ttatccgtta gattatgcat gattcattcc tacaactttt tcgtagcata 1980 aggattaatt acttggatgc caataaaaaa aaaaaagcga catagcaaaa aaaaaaaaaa 2040 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaa 2076 <210> 4 <211> 2096 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Omega-LT-70A <400> 4 ggtattttta caacaattac caacaacaac aaacaacaaa caacattaca attactattt 60 acaattacaa tggaagacgc caaaaacata aagaaaggcc cggcgccatt ctatcctcta 120 gaggatggaa ccgctggaga gcaactgcat aaggctatga agagatacgc cctggttcct 180 ggaacaattg cttttacaga tgcacatatc gaggtgaaca tcacgtacgc ggaatacttc 240 gaaatgtccg ttcggttggc agaagctatg aaacgatatg ggctgaatac aaatcacaga 300 atcgtcgtat gcagtgaaaa ctctcttcaa ttctttatgc cggtgttggg cgcgttattt 360 atcggagttg cagttgcgcc cgcgaacgac atttataatg aacgtgaatt gctcaacagt 420 atgaacattt cgcagcctac cgtagtgttt gtttccaaaa aggggttgca aaaaattttg 480 aacgtgcaaa aaaaattacc aataatccag aaaattatta tcatggattc taaaacggat 540 taccagggat ttcagtcgat gtacacgttc gtcacatctc atctacctcc cggttttaat 600 gaatacgatt ttgtaccaga gtcctttgat cgtgacaaaa caattgcact gataatgaat 660 tcctctggat ctactgggtt acctaagggt gtggcccttc cgcatagaac tgcctgcgtc 720 agattctcgc atgccagaga tcctattttt ggcaatcaaa tcattccgga tactgcgatt 780 ttaagtgttg ttccattcca tcacggtttt ggaatgttta ctacactcgg atatttgata 840 tgtggatttc gagtcgtctt aatgtataga tttgaagaag agctgttttt acgatccctt 900 caggattaca aaattcaaag tgcgttgcta gtaccaaccc tattttcatt cttcgccaaa 960 agcactctga ttgacaaata cgatttatct aatttacacg aaattgcttc tgggggcgca 1020 cctctttcga aagaagtcgg ggaagcggtt gcaaaacgct tccatcttcc agggatacga 1080 caaggatatg ggctcactga gactacatca gctattctga ttacacccga gggggatgat 1140 aaaccgggcg cggtcggtaa agttgttcca ttttttgaag cgaaggttgt ggatctggat 1200 accgggaaaa cgctgggcgt taatcagaga ggcgaattat gtgtcagagg acctatgatt 1260 atgtccggtt atgtaaacaa tccggaagcg accaacgcct tgattgacaa ggatggatgg 1320 ctacattctg gagacatagc ttactgggac gaagacgaac acttcttcat agttgaccgc 1380 ttgaagtctt taattaaata caaaggatat caggtggccc ccgctgaatt ggaatcgata 1440 ttgttacaac accccaacat cttcgacgcg ggcgtggcag gtcttcccga cgatgacgcc 1500 ggtgaacttc ccgccgccgt tgttgttttg gagcacggaa agacgatgac ggaaaaagag 1560 atcgtggatt acgtcgccag tcaagtaaca accgcgaaaa agttgcgcgg aggagttgtg 1620 tttgtggacg aagtaccgaa aggtcttacc ggaaaactcg acgcaagaaa aatcagagag 1680 atcctcataa aggccaagaa gggcggaaag tccaaattgg tttaatttat acttagataa 1740 gtatgtactt acaggtatat ttctatgaga tactgatgta tacatgcatg ataatattta 1800 aacggttatt agtgccgatt gtcttgtgcg ataatgacgt tcctatcaaa gcaatacact 1860 taccacctat tacatgggcc aagaaaatat tttcgaactt gtttagaata ttagcacaga 1920 gtatatgatg ttatccgtta gattatgcat gattcattcc tacaactttt tcgtagcata 1980 aggattaatt acttggatgc caataaaaaa aaaaaagcga catagcaaaa aaaaaaaaaa 2040 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaa 2096 <210> 5 <211> 2117 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Omega-LT-90A <400> 5 ggtattttta caacaattac caacaacaac aaacaacaaa caacattaca attactattt 60 acaattacaa tggaagacgc caaaaacata aagaaaggcc cggcgccatt ctatcctcta 120 gaggatggaa ccgctggaga gcaactgcat aaggctatga agagatacgc cctggttcct 180 ggaacaattg cttttacaga tgcacatatc gaggtgaaca tcacgtacgc ggaatacttc 240 gaaatgtccg ttcggttggc agaagctatg aaacgatatg ggctgaatac aaatcacaga 300 atcgtcgtat gcagtgaaaa ctctcttcaa ttctttatgc cggtgttggg cgcgttattt 360 atcggagttg cagttgcgcc cgcgaacgac atttataatg aacgtgaatt gctcaacagt 420 atgaacattt cgcagcctac cgtagtgttt gtttccaaaa aggggttgca aaaaattttg 480 aacgtgcaaa aaaaattacc aataatccag aaaattatta tcatggattc taaaacggat 540 taccagggat ttcagtcgat gtacacgttc gtcacatctc atctacctcc cggttttaat 600 gaatacgatt ttgtaccaga gtcctttgat cgtgacaaaa caattgcact gataatgaat 660 tcctctggat ctactgggtt acctaagggt gtggcccttc cgcatagaac tgcctgcgtc 720 agattctcgc atgccagaga tcctattttt ggcaatcaaa tcattccgga tactgcgatt 780 ttaagtgttg ttccattcca tcacggtttt ggaatgttta ctacactcgg atatttgata 840 tgtggatttc gagtcgtctt aatgtataga tttgaagaag agctgttttt acgatccctt 900 caggattaca aaattcaaag tgcgttgcta gtaccaaccc tattttcatt cttcgccaaa 960 agcactctga ttgacaaata cgatttatct aatttacacg aaattgcttc tgggggcgca 1020 cctctttcga aagaagtcgg ggaagcggtt gcaaaacgct tccatcttcc agggatacga 1080 caaggatatg ggctcactga gactacatca gctattctga ttacacccga gggggatgat 1140 aaaccgggcg cggtcggtaa agttgttcca ttttttgaag cgaaggttgt ggatctggat 1200 accgggaaaa cgctgggcgt taatcagaga ggcgaattat gtgtcagagg acctatgatt 1260 atgtccggtt atgtaaacaa tccggaagcg accaacgcct tgattgacaa ggatggatgg 1320 ctacattctg gagacatagc ttactgggac gaagacgaac acttcttcat agttgaccgc 1380 ttgaagtctt taattaaata caaaggatat caggtggccc ccgctgaatt ggaatcgata 1440 ttgttacaac accccaacat cttcgacgcg ggcgtggcag gtcttcccga cgatgacgcc 1500 ggtgaacttc ccgccgccgt tgttgttttg gagcacggaa agacgatgac ggaaaaagag 1560 atcgtggatt acgtcgccag tcaagtaaca accgcgaaaa agttgcgcgg aggagttgtg 1620 tttgtggacg aagtaccgaa aggtcttacc ggaaaactcg acgcaagaaa aatcagagag 1680 atcctcataa aggccaagaa gggcggaaag tccaaattgg tttaatttat acttagataa 1740 gtatgtactt acaggtatat ttctatgaga tactgatgta tacatgcatg ataatattta 1800 aacggttatt agtgccgatt gtcttgtgcg ataatgacgt tcctatcaaa gcaatacact 1860 taccacctat tacatgggcc aagaaaatat tttcgaactt gtttagaata ttagcacaga 1920 gtatatgatg ttatccgtta gattatgcat gattcattcc tacaactttt tcgtagcata 1980 aggattaatt acttggatgc caataaaaaa aaaaaagcga catagccaaa aaaaaaaaaa 2040 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2100 aaaaaaaaaa aaaaaaa 2117 <210> 6 <211> 2242 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CrpV-Lt-90A <400> 6 gagaaagcaa aaatgtgatc ttgcttgtaa atacaatttt gagaggttaa taaattacaa 60 gtagtgctat ttttgtattt aggttagcta tttagcttta cgttccagga tgcctagtgg 120 cagccccaca atatccagga agccctctct gcggtttttc agattaggta gtcgaaaaac 180 ctaagaaatt tacctatgga agacgccaaa aacataaaga aaggcccggc gccattctat 240 cctctagagg atggaaccgc tggagagcaa ctgcataagg ctatgaagag atacgccctg 300 gttcctggaa caattgcttt tacagatgca catatcgagg tgaacatcac gtacgcggaa 360 tacttcgaaa tgtccgttcg gttggcagaa gctatgaaac gatatgggct gaatacaaat 420 cacagaatcg tcgtatgcag tgaaaactct cttcaattct ttatgccggt gttgggcgcg 480 ttatttatcg gagttgcagt tgcgcccgcg aacgacattt ataatgaacg tgaattgctc 540 aacagtatga acatttcgca gcctaccgta gtgtttgttt ccaaaaaggg gttgcaaaaa 600 attttgaacg tgcaaaaaaa attaccaata atccagaaaa ttattatcat ggattctaaa 660 acggattacc agggatttca gtcgatgtac acgttcgtca catctcatct acctcccggt 720 tttaatgaat acgattttgt accagagtcc tttgatcgtg acaaaacaat tgcactgata 780 atgaattcct ctggatctac tgggttacct aagggtgtgg cccttccgca tagaactgcc 840 tgcgtcagat tctcgcatgc cagagatcct atttttggca atcaaatcat tccggatact 900 gcgattttaa gtgttgttcc attccatcac ggttttggaa tgtttactac actcggatat 960 ttgatatgtg gatttcgagt cgtcttaatg tatagatttg aagaagagct gtttttacga 1020 tcccttcagg attacaaaat tcaaagtgcg ttgctagtac caaccctatt ttcattcttc 1080 gccaaaagca ctctgattga caaatacgat ttatctaatt tacacgaaat tgcttctggg 1140 ggcgcacctc tttcgaaaga agtcggggaa gcggttgcaa aacgcttcca tcttccaggg 1200 atacgacaag gatatgggct cactgagact acatcagcta ttctgattac acccgagggg 1260 gatgataaac cgggcgcggt cggtaaagtt gttccatttt ttgaagcgaa ggttgtggat 1320 ctggataccg ggaaaacgct gggcgttaat cagagaggcg aattatgtgt cagaggacct 1380 atgattatgt ccggttatgt aaacaatccg gaagcgacca acgccttgat tgacaaggat 1440 ggatggctac attctggaga catagcttac tgggacgaag acgaacactt cttcatagtt 1500 gaccgcttga agtctttaat taaatacaaa ggatatcagg tggcccccgc tgaattggaa 1560 tcgatattgt tacaacaccc caacatcttc gacgcgggcg tggcaggtct tcccgacgat 1620 gacgccggtg aacttcccgc cgccgttgtt gttttggagc acggaaagac gatgacggaa 1680 aaagagatcg tggattacgt cgccagtcaa gtaacaaccg cgaaaaagtt gcgcggagga 1740 gttgtgtttg tggacgaagt accgaaaggt cttaccggaa aactcgacgc aagaaaaatc 1800 agagagatcc tcataaaggc caagaagggc ggaaagtcca aattggttta atttatactt 1860 agataagtat gtacttacag gtatatttct atgagatact gatgtataca tgcatgataa 1920 tatttaaacg gttattagtg ccgattgtct tgtgcgataa tgacgttcct atcaaagcaa 1980 tacacttacc acctattaca tgggccaaga aaatattttc gaacttgttt agaatattag 2040 cacagagtat atgatgttat ccgttagatt atgcatgatt cattcctaca actttttcgt 2100 agcataagga ttaattactt ggatgccaat aaaaaaaaaa aagcgacata gcaaaaaaaa 2160 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2220 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aa 2242 <210> 7 <211> 2175 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SITS2-Lt-90A <400> 7 gggagatctt aagttttatt ttattttatt ttattttatt ttattttatt ttattttatt 60 ttattttatt ttattttacc atgacagtaa tgtataaagt ctgtaaagac ataaaacacg 120 taagtgaaac cgaagacgcc aaaaacataa agaaaggccc ggcgccattc tatcctctag 180 aggatggaac cgctggagag caactgcata aggctatgaa gagatacgcc ctggttcctg 240 gaacaattgc ttttacagat gcacatatcg aggtgaacat cacgtacgcg gaatacttcg 300 aaatgtccgt tcggttggca gaagctatga aacgatatgg gctgaataca aatcacagaa 360 tcgtcgtatg cagtgaaaac tctcttcaat tctttatgcc ggtgttgggc gcgttattta 420 tcggagttgc agttgcgccc gcgaacgaca tttataatga acgtgaattg ctcaacagta 480 tgaacatttc gcagcctacc gtagtgtttg tttccaaaaa ggggttgcaa aaaattttga 540 acgtgcaaaa aaaattacca ataatccaga aaattattat catggattct aaaacggatt 600 accagggatt tcagtcgatg tacacgttcg tcacatctca tctacctccc ggttttaatg 660 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Claims (11)

1. 무세포 단백질 합성 시스템이
   (a) 효모세포추출물；
   (b) 폴리에틸렌글리콜；
   (c) 선택적인 외인성자당；및
   (d) 선택적인 용매，상기 용매는 물 또는 수용성 용매인 것;
   을 포함하는 것을 특징으로 하는 일종의 시험관 내 무세포 단백질 합성 시스템.
2. 제1항에 있어서, 상기 무세포 단백질 합성 시스템은
   (e1) RNA의 합성에 사용되는 기질；
   (e2) 단백질의 합성에 사용되는 기질；
   (e3) 마그네슘이온；
   (e4) 칼륨이온；
   (e5) 완충제；
   (e6) RNA중합효소；
   (e7) 에너지재생 시스템,
   에서 선택되는 하나 또는 다수의 조성분을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 단백질 합성 시스템.
   
3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 무세포 단백질 합성 시스템은
   (e8) 헴； 및
   (e9) 스페르미딘에서 선택되는 하나 또는 다수의 조성분을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 단백질 합성 시스템.
   
4. 제1항에 있어서, 상기 무세포 단백질 합성 시스템은 (f1) 인공적으로 합성한 tRNA를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 단백질 합성 시스템.
   
5. 제1항에 있어서, 상기 무세포 단백질 합성 시스템은 (g1) 단백질합성을 유도하는데 사용되는 외인성 DNA 분자를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 단백질 합성 시스템.
   
6. 제1항에 있어서, 상기 폴리에틸렌글리콜은 PEG3000, PEG8000, PEG6000, PEG3350 또는 이들의 조합으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 단백질 합성 시스템.
   
7. 제1항에 있어서, 상기 단백질 합성 시스템에서, 상기 단백질 합성 시스템의 총 부피를 기준으로, 조성분(a)의 농도(v/v)는 20% 내지 70%이며, 바람직하게, 30 내지 60%이며, 더 바람직하게, 40% 내지 50%인 것을 특징으로 하는 단백질 합성 시스템.
   
8. 제1항에 있어서, 상기 단백질 합성 시스템에서, 조성분(b)의 농도(w/v)는 0.1 내지 8%, 바람직하게, 0.5 내지 4%, 더 바람직하게，1 내지 2%인 것을 특징으로 하는 단백질 합성 시스템.
   
9. (i) 제1항에 기재된 시험관 내 무세포 단백질 합성 시스템을 제공하고，단백질합성을 유도하는데 사용되는 외인성 DNA 분자를 첨가하는 단계；
   (ii) 적절한 조건하에서, 단계(i)의 단백질 합성 시스템을 일정한 시간 T1 동안 배양하고, 이로부터 상기 외인성 DNA에 의해 코딩되는 단백질을 합성하는 단계,
   를 포함하는 것을 특징으로 하는 일종의 시험관 내 단백질을 합성하는 방법.
   
10. 제9항에 있어서, (iii) 선택적으로 상기 단백질 합성 시스템에서 상기 외인성 DNA로부터 코딩된 단백질을 분리 또는 검출하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
    
11. (k1) 첫 번째 용기, 및 첫 번째 용기 내에 위치한 효모세포추출물；
    (k2) 두 번째 용기, 및 두 번째 용기 내에 위치한 폴리에틸렌글리콜；
    (k3) 선택적인 세 번째 용기, 및 세 번째 용기 내에 위치한 자당；및
    (kt) 라벨 또는 설명서를 포함하는 것을 특징으로 하는 일종의 시험관 내 무세포 단백질 합성에 사용되는 키트.

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