KR20190104074A - 히드록시 관능기를 이용하여 다당류를 동시에 치환 및 가교결합하는 방법 - Google Patents

히드록시 관능기를 이용하여 다당류를 동시에 치환 및 가교결합하는 방법 Download PDF

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KR20190104074A
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라보라뚜와 비바시
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Abstract

본 발명은 하기 단계를 포함하는, 다당류를 이의 히드록시 관능기를 통해 수성 상에서 동시에 치환 및 가교결합하는 방법으로서,
3.16　x 10-7 내지 0.32　mol/L의 농도의 염기성 또는 산성 촉매의 존재하 및 60℃ 이하의 온도에서 수행되는 방법에 관한 것이다:
- 다당류를 수성 매질에 위치시키는 단계;
- 상기 다당류를 치환기의 하나 이상의 전구체의 존재하에 놓는 단계;
- 상기 다당류를 가교제의 존재하에 놓는 단계; 및
- 치환 및 가교결합된 다당류를 획득 및 분리하는 단계.
일 구현예에서, 상기 다당류는 특히 증강용 생체물질로서 사용되는 겔 또는 히드로겔의 형태이다.

Description

히드록시 관능기를 이용하여 다당류를 동시에 치환 및 가교결합하는 방법{METHOD FOR SIMULTANEOUSLY SUBSTITUTING AND CROSS-LINKING A POLYSACCHARIDE BY MEANS OF THE HYDROXYL FUNCTIONS THEREOF}
본 발명은 개선된 유동학적 특성을 특징으로 하고, 선택적으로는 종래의 가교결합된 다당류와 비교하여 치환기에 의해 도입된 유리한 특성, 예를 들어 보습 또는 친유화(lipophilizing) 작용을 나타내고, 특히 필러(filler) 수술, 조직 복구의 분야에서 생체물질로, 또는 관절 물질 또는 유체로 사용될 수 있는, 신규의 가교결합 및 치환된 생체적합성 다당류에 관한 것이다.
종래 기술로부터 다양한 치환 및 가교결합된 다당류가 알려져 있지만, 종래 기술의 어떠한 방법도 본 발명에 따른 상승적으로 개선된 유동학적 특성을 나타내는 다당류를 획득할 수 없었다.
FIDIA에 의한 EP　0　256　116은 다당류의 -COOH 관능기가 에스테르 관능기를 통해 치환된 가교결합된 화합물을 개시한다. 구체적으로는, 다당류의 지방족 폴리알코올 및 카르복시산 관능기 사이의 분자내 또는 분자간 반응에 의해 형성된 에스테르 가교를 통해 히알루론산 사슬이 가교결합된다. 또한, 예를 들어 에탄올 또는 벤질 알코올과 같은 히드록시 관능기를 갖는 소형 분자의 그래프팅에 의한 다당류의 에스테르 관능기를 통해 치환이 일어난다.
FIDIA에 의한 EP　0　341　745에서, 가교제 없이 다당류의 카르복시 관능기와 동일한 사슬 또는 다른 사슬의 히드록시 관능기 사이에 에스테르 관능기가 형성된다는 점에서 폴리머가 "자가-가교결합"된다. 또한, 상기 특허는 가교결합 및 치환된 폴리머를 개시한다. 또한, 상기와 같은 경우에 치환기는 에탄올 또는 벤질 알코올과 같은 알코올 사슬이고, 다당류의 카르복시 관능기를 통해 다당류에 그래프팅된다.
FIDIA에 의한 특허출원 WO　99/43728은 N-위치 또는 O-위치에서 황산화된 히알루론산을 개시한다. 상기 특허출원에 개시된 바와 같이 에스테르 가교에 의해 자가-가교결합 또는 가교결합될 수 있는(EP　0　256　116 및 EP　0　341　745) 상기 다당류는 그 후 폴리우레탄에 의해 그래프팅된다. 이에 따라, 다양한 공-가교결합된(cocrosslinked) 폴리머의 복합 매트릭스가 획득된다. 그러나, 상기 생성물은 에스테르 관능기를 통해서도 가교결합되고, O- 또는 N-황산화 다당류 및 폴리우레탄의 매트릭스의 경우에 적어도 3개의 단계를 사용할 것을 더 요구한다. 따라서, 이들은 만족스런 해결책을 제시하지 못한다.
HERCULES에 의한 특허 EP　0　749　982는 선택적으로 가교결합될 수 있는, 항산화 특성을 갖는, 장애 페놀(hindered phenol) 화합물에 의해 치환된 폴리머의 제조를 개시한다. 상기 가교결합은 다관능성 에폭시드 또는 대응되는 할로히드린(US　4　716　224, US　4　863　907, EP　0　507　604　A2, US　4　716　154, US　4　772　419, US　4 957　744), 다가 알코올(US　4　582　865, US　4　605　691), 디비닐 설폰 (US　5　128　326, US　4　582　865) 및 알데히드(US　4　713　448)를 사용하여 종래 기술에 따라 수행된다. 바람직한 구현예에 따르면, 다시 에스테르를 형성시키기 위해, 폴리머는 카르복시산 또는 다산 무수물과의 반응에 의해 가교결합된다. 따라서, 종래 기술에 개시된 화합물은 대부분의 경우에 높은 밀도의 에스테르 관능기를 갖는다.
또한, 공-가교결합된 폴리머는 예를 들어 ANTEIS에 의한 특허출원 WO　2005/012364에 개시된 하나 이상의 폴리머의 공-가교결합에 의한 매트릭스의 형성에 의해 개선된 지속성을 나타내는 것과 같이 종래 기술로부터 알려져 있다. 상기 공-가교결합된 다당류는 또한 낮은 평균 분자량 또는 소형 비폴리머성 분자를 갖는 폴리머에 의해 치환될 수 있다. 상기 폴리머는 일반적으로 셀룰로스에 의해 공-가교결합된 히알루론산이고, 그 후 상기 화합물에 벤질 에스테르를 갖는 헤파린 또는 히알루론산과 같은 소형 폴리머(Mw < 50　000 kDa)가 가교제를 통해 그래프팅될 것이다. 일부 경우에, 비타민 C와 같은 항산화제가 또한 가교제를 통해 그래프팅된다.
또한, Balazs(Biomatrix)에 의한 특허 US 4　605　691은 공-가교결합 방법(공-가교결합된 폴리머를 형성하는 과정)을 개시한다. 이때, 상기 특허는 콜라겐, 셀룰로스, 헤파린 또는 카민산에 의한 히알루론산의 공-가교결합에 관한 것이다.
종래 기술에 개시된 방법들의 공통된 특징은 관능화를 일으키는 치환 또는 그래프팅이 가교제를 통해 수행된다는 점이다. 가교결합 단독과 비교하면, 이는 가교결합을 위한 반응과 가교제를 통한 관능화 사이의 경쟁으로 반영된다.
따라서, 통상의 기술자는 항상 관능화가 가교결합을 제한하지 않도록 도입되는 가교제의 양을 적절하게 조절하도록 주의하며, 이는 반응의 각 동역학에 따라 겔의 최종 특성을 변화시킬 수 있다.
구체적으로는, 관능화제(functional agent)가 도입되기 전에 가교결합이 수행되는 경우, 한편으로는 관능화제가 가교결합된 폴리머 네트워크로 균일하게 도입되고, 다른 한편으로는 폴리머를 관능화하기에 충분한 가교제가 남겨지도록 주의하여야 한다. 모두 소비되는 경우, 추가적인 양의 가교제를 더 첨가하여야 하고, 이때 과잉 가교결합의 위험이 높아진다. 일부 경우에, 통상의 기술자는 "경쟁" 효과를 제한하기 위해 가교결합 전에 치환해야 할 것이다.
따라서, 통상의 기술자는 여전히 폴리머/가교제 및 관능화제/가교제 반응 속도를 고려하여, 폴리머를 가교결합하기 전에 또는 후에 치환시킬 것인지 및 반응 조건을 조정할 것인지의 선택에 직면할 것이다. 따라서, 상기 선택의 상기 방법에서 중요하고 난해한 단계가 된다.
술포알킬 및 에테르에 의해 치환된 술포알킬셀룰로스와 같은 수용성 셀룰로스가 또한 알려져 있다. 원하는 목적은 수용성 술포알킬셀룰로스를 얻기 위해 높은 관능화를 달성하는 것이다(예를 들어, WOLFF WALSRODE의 US　4　990　609 참조). 상기 종류의 관능화에 있어서, 술톤은 설포네이트 관능기의 강한 존재에 의해 최종 생성물의 가용성을 개선시키고 높은 수준의 관능화를 가능하게 하는 이들의 높은 반응성 때문에 종종 사용된다. 그러나, 2번째 단계에서 가교결합하기를 원하는 경우, 높은 수준의 치환은 폴리머의 만족스러운 가교결합을 방해할 수 있다. 더욱이, 관능화 조건은 종종 너무 급격해서, 다당류가 이의 유동학적 특성을 회복불가능할 정도로 약화시키도록 손상된다(예를 들어, US　3　046　272에 개시된 화합물 참조).
이는 다당류, 예를 들어 히알루론산이 알카리성 조성에 대해 상대적으로 낮은 저항을 나타내는 것으로 알려졌고, 수산화나트륨 용액에서 히알루론산의 가교결합 또는 탈아세틸화 동안에 분해가 일어나는 것으로 알려졌기 때문이며(Simkovic et al., Carbohydrate Polymers, 41, 2000, 9-14); 실제로, 종래 기술에 개시된 반응은 종종 길거나 및/또는 분해를 일으키는 pH 조건에 있다.
고농도 알칼리성 조건 및 US　4　321　367 또는 US　4　175　183에 개시된 바와 같은 공정에서 다당류에 가해지는 고온에서, 다당류의 분해가 일어난다는 것이 증명되었다(후술하는 비교예 참조).
따라서, 종래 기술에 개시된 공정에서, 상대적으로 수행하기 용이하지만, 가교결합 및 치환된 폴리머의 제조방법은 매우 종종 길고, 다양한 폴리머와 가교제를 통해 다당류에 부착된 그래프트 사이의 경쟁을 방지하기 위해 다양한 성분을 연속적으로 첨가해야 하기 때문에 다수의 단계들을 필요로 한다. 더욱이, 반응 시간 및 반응 조건 때문에, 제조되는 폴리머는 손상된 유동학적 특성을 가질 수 있다.
본 발명은 종래 기술의 방법의 모든 단점을 해결할 수 있게 하고, 또한 상승작용에 의해 개선된 유동학적 특성을 갖는 다당류를 획득할 수 있게 한다.
본 발명은 가교결합 및 치환된 다당류의 제조방법에 관한 것이다. 원칙적으로는, 상기 방법의 가교결합 및 치환 반응은 동일한 실험조건 및 동일한 반응 부위(다당류의 히드록시 관능기)에서 동시에 수행되고, 이는 관련된 다양한 개체 사이에 경쟁이 없고, 치환이 가교제를 통해 수행되지 않는 경우이다. 따라서, 획득된 치환도 및 가교결합도는 연속적으로 수행된 반응들에 의해 획득된 값들과 유사하고, 다당류의 유동학적 특성은 개선된다.
또한, 본 발명은 본 발명에 따른 방법에 의해 제조된 가교결합 및 치환된 다당류로서, 이의 유동학, 특히 이의 점탄성이 단순히 치환된 다당류뿐만 아니라, 단지 가교결합된 다당류 및 치환 및 그 후 가교결합된 다당류와 비교하여도 증가되는 다당류에 관한 것이다.
또한, 유동학적 특성이 개선된 본 발명에 따른 다당류에 치환기가 유리한 특성, 예를 들어 생물학적 특성을 도입시킨다. 더욱 놀라운 점은 상승효과가 치환 및 가교결합된 다당류의 살균 동안에도 유지된다는 점이다.
따라서, 본 발명은 이들 개질이 각각 따로 수행된 경우의 개별적인 특징을 변화시키지 않고, 그리고 특히 이들은 상호작용에 의해 개선되기 때문에 유동학적 특성을 손상시키지 않고, 치환과 관련된 이점과 가교결합에 관련된 이점을 조합시킬 수 있게 한다.
본 발명은 다당류를 이의 히드록시 관능기를 통해 수성 상에서 동시에 치환 및 가교결합하는 방법에 관한 것으로서, 상기 방법은 3.16　x 10-7 내지 0.32　mol/L의 농도의 염기성 또는 산성 촉매의 존재하 및 60℃ 미만의 온도에서 수행되며, 하기 단계를 포함한다:
- 다당류를 수성 매질에 위치시키는 단계;
- 상기 다당류를 치환기의 하나 이상의 전구체의 존재하에 놓는 단계;
- 상기 다당류를 가교제의 존재하에 놓는 단계; 및
- 치환 및 가교결합된 다당류를 획득 및 분리하는 단계.
"이의 히드록시 관능기를 통해"라는 용어는 치환 및 가교결합이 다당류의 -OH 기에서 수행된다는 사실을 의미하는 것으로 이해된다.
또한, 본 방법은 반응성 촉매 비 또는 RCR을 특징으로 한다.
반응성 촉매 비(reactive catalyst ratio: RCR)는 하기와 같이 정의된다:
Figure pat00001
.
일 구현예에서, 본 발명에 따른 방법의 반응성 촉매 비는 0.02:1 내지 3:1이다.
일 구현예에서, 본 발명에 따른 방법의 반응성 촉매 비는 0.2:1 내지 3:1이다.
일 구현예에서, 본 발명에 따른 방법의 반응성 촉매 비는 0.3:1 내지 3:1이다.
일 구현예에서, 본 발명에 따른 방법의 반응성 촉매 비는 0.5:1 내지 2:1이다.
일 구현예에서, 본 발명에 따른 방법의 반응성 촉매 비는 0.7:1 내지 1.5:1이다.
일 구현예에서, 본 발명에 따른 방법의 반응성 촉매 비는 1.75:1이다.
일 구현예에서, 본 발명에 따른 방법의 반응성 촉매 비는 1:1이다.
일 구현예에서, 본 발명에 따른 방법의 반응성 촉매 비는 0.8:1이다.
일 구현예에서, 본 발명에 따른 방법의 반응성 촉매 비는 0.06:1이다.
일 구현예에서, 본 발명에 따른 방법의 촉매는 염기이다.
상기 구현예에서, 촉매의 반응성 관능기는 HO- 이온이다.
수성 상에서, 환경은 pH = 14 + log([HO-]) 및 [HO-] = 10-(14-pH)이다.
일 구현예에서, 본 발명에 따른 방법의 촉매 HO-의 농도는 10- 6　mol/L 내지 0.32　mol/L, 즉 10-6　mol/L ≤ [HO-] ≤ 0.32 mol/L이다.
일 구현예에서, 본 발명에 따른 방법의 촉매 HO-의 농도는 3.16　x 10- 4　mol/L 내지 3.16　x 10- 2　mol/L, 즉 3.16　x 10- 4　mol/L ≤ [HO-] ≤ 3.16　x 10- 2　mol/L이다.
일 구현예에서, 본 발명에 따른 방법의 촉매는 무기 염기이다.
일 구현예에서, 본 발명에 따른 방법의 무기 염기는 소다(수산화나트륨) 또는 칼리(potash)(수산화칼륨)로 이루어진 군에서 선택된다.
일 구현예에서, 본 발명에 따른 방법의 무기 염기의 중량농도는 1.2　x 10-5% 내지 1.3%이다.
일 구현예에서, 본 발명에 따른 방법의 무기 염기의 중량농도는 0.25% 내지 1.1%이다.
일 구현예에서, 일 구현예에서, 본 발명에 따른 방법의 무기 염기의 중량농도는 1%이다.
일 구현예에서, 일 구현예에서, 본 발명에 따른 방법의 무기 염기의 중량농도는 0.5%이다.
일 구현예에서, 본 발명에 따른 방법의 촉매는 유기 염기이다.
일 구현예에서, 본 발명에 따른 방법의 유기 염기는 피리딘이다.
일 구현예에서, 본 발명에 따른 방법의 수성 반응매질의 pH는 염기성이다.
일 구현예에서, 본 발명에 따른 방법의 수성 반응매질의 pH는 8 내지 13.5이다.
일 구현예에서, 본 발명에 따른 방법의 수성 반응매질의 pH는 10.5 내지 12.5이다.
일 구현예에서, 본 발명에 따른 방법의 촉매는 산이다.
상기 구현예에서, 상기 촉매의 반응성 관능기는 H3O+ 이온이다.
일 구현예에서, 본 발명에 따른 방법의 촉매 H3O+의 농도는 3.16　x 10- 7　mol/L 내지 0.01　mol/L, 즉 3.16　x 10-7　mol/L ≤ [H3O+] ≤ 0.01　mol/L이다.
일 구현예에서, 본 발명에 따른 방법의 촉매 H3O+의 농도는 10- 6 mol/L 내지 3.16　x 10-5　mol/L, 즉 10-6　mol/L ≤ [H3O+] ≤ 3.16　x 10-5　mol/L이다.
수성 상에서, 환경은 pH = -log([H3O+]) 및 [H3O+] = 10-pH이다.
일 구현예에서, 본 발명에 따른 방법의 산은 무기산이다.
일 구현예에서, 본 발명에 따른 방법의 무기산은 염산이다.
일 구현예에서, 본 발명에 따른 방법의 무기산의 중량농도는 1.14　x 10-5% 내지 1.15%이다.
일 구현예에서, 본 발명에 따른 방법의 무기산의 중량농도는 0.05% 내지 1%이다.
일 구현예에서, 본 발명에 따른 방법의 무기산의 중량농도는 0.05% 내지 0.36%이다.
일 구현예에서, 본 발명에 따른 방법의 산은 유기산이다.
일 구현예에서, 본 발명에 따른 방법의 유기산은 글루탐산 및 아세트산으로 이루어진 군에서 선택된다.
일 구현예에서, 본 발명에 따른 방법의 유기산의 중량농도는 0.25% 내지 2%이다.
일 구현예에서, 본 발명에 따른 방법의 유기산의 중량농도는 0.25% 내지 1.1%이다.
일 구현예에서, 본 발명에 따른 방법의 유기산의 중량농도는 1%이다.
일 구현예에서, 본 발명에 따른 방법의 수성 반응매질의 pH는 산성이다.
일 구현예에서, 본 발명에 따른 방법의 수성 반응매질의 pH는 2 내지 6.5이다.
일 구현예에서, 본 발명에 따른 방법의 수성 반응매질의 pH는 4.5 내지 6이다.
상기 염기성 또는 산성 촉매는 수성 매질에 가용성이다.
일 구현예에서, 본 발명에 따른 방법의 다당류는 히알루론산 또는 이의 염 중 어느 하나, 키토산, 셀룰로스 및 이들의 유도체로 이루어진 군에서 선택된다.
일 구현예에서, 상기 다당류는 히알루론산이다.
일 구현예에서, 상기 다당류는 히알론산나트륨이다.
일 구현예에서, 상기 다당류는 키토산이다.
일 구현예에서, 상기 키토산은 부분적으로 탈아세틸화된다.
일 구현예에서, 약 80%의 탈아세틸화도(degree of deacetylation)를 갖는 키토산이 사용된다.
일 구현예에서, 상기 다당류는 셀룰로스 또는 이의 유도체중 어느 하나이다.
일 구현예에서, 상기 다당류는 카르복시메틸셀룰로스이다.
Mw 또는 "분자량"이라는 용어는 달톤으로 측정된, 다당류의 중량평균분자량이다.
일 구현예에서, 상기 다당류의 분자량은 0.01　MDa 내지 4.0　MDa이다.
일 구현예에서, 상기 다당류의 분자량은 0.01　MDa 내지 3.6　MDa이다.
일 구현예에서, 상기 다당류의 분자량은 0.10　MDa 내지 0.15　MDa이다.
일 구현예에서, 상기 다당류의 분자량은 0.9　MDa 내지 2　MDa이다.
일 구현예에서, 상기 다당류의 분자량은 2.5　MDa 내지 3.6　MDa이다.
일 구현예에서, 상기 다당류의 분자량 Mw는 2.7　MDa이다.
일 구현예에서, 상기 다당류의 분자량 Mw는 1.5　MDa이다.
일 구현예에서, 상기 다당류의 분자량 Mw는 1.0　MDa이다.
일 구현예에서, 상기 다당류의 분자량 Mw는 120　000 Da이다.
일 구현예에서, 본 발명에 따른 방법의 가교제는 이관능성 또는 다관능성이다.
일 구현예에서, 본 발명에 따른 방법의 이관능성 또는 다관능성 가교제는 하나 이상의 에폭시드 관능기를 갖는다.
일 구현예에서, 본 발명에 따른 방법의 이관능성 또는 다관능성 가교제는 에틸렌 글리콜 디글리시딜 에테르, 부탄디올 디글리시딜 에테르, 폴리글리세롤 폴리글리시딜 에테르, 폴리에틸렌 글리콜 디글리시딜 에테르, 폴리프로필렌 글리콜 디글리시딜 에테르, 비스에폭시 또는 1,2,3,4-디에폭시부탄 또는 1,2,7,8-디에폭시옥탄과 같은 폴리에폭시로 이루어진 군에서 선택된다.
일 구현예에서, 본 발명에 따른 방법의 상기 이관능성 또는 다관능성 가교제는 에피클로로히드린이다.
일 구현예에서, 본 발명에 따른 방법의 상기 이관능성 또는 다관능성 가교제는 하나 이상의 비닐 관능기를 갖는다.
일 구현예에서, 본 발명에 따른 방법의 상기 이관능성 또는 다관능성 가교제는 동일한 또는 상이한, 및 선형 또는 분지형 알킬기가 1 내지 4개의 탄소원자를 갖는 사슬인 디알킬 설폰이다.
일 구현예에서, 본 발명에 따른 방법의 상기 이관능성 또는 다관능성 가교제는 디비닐 설폰이다.
일 구현예에서, 본 발명에 따른 방법의 가교제는 모노-, 바이-, 또는 폴리알데히드이다.
일 구현예에서, 본 발명에 따른 방법의 가교제는 포름알데히드이다.
일 구현예에서, 본 발명에 따른 방법의 가교제는 글루타르알데히드이다.
일 구현예에서, 본 발명에 따른 방법에 사용되는 가교제 대 다당류의 몰비는 0.001 내지 0.5이다.
일 구현예에서, 본 발명에 따른 방법에 사용되는 가교제 대 다당류의 몰비는 0.01 내지 0.3이다.
일 구현예에서, 본 발명에 따른 방법에 사용되는 가교제 대 다당류의 몰비는 0.05 내지 0.2이다.
일 구현예에서, 본 발명에 따른 방법에 사용되는 가교제 대 다당류의 몰비는 0.07이다.
일 구현예에서, 본 발명에 따른 방법에 사용되는 가교제 대 다당류의 몰비는 0.08이다.
일 구현예에서, 본 발명에 따른 방법에 사용되는 가교제 대 다당류의 몰비는 0.010이다.
일 구현예에서, 본 발명에 따른 방법에 사용되는 가교제 대 다당류의 몰비는 0.14이다.
일 구현예에서, 본 발명에 따른 방법에 사용되는 가교제 대 다당류의 몰비는 0.21이다.
일 구현예에서, 본 발명에 따른 방법에서 치환기의 전구체는 비닐, 에폭시드, 알릴, 케톤, 알데히드, 티오시아네이트, 할라이드, 이소시아네이트, 할로실리콘, 니트릴 및 술톤 관능기로 이루어진 군에서 선택된 단 하나의 반응성 관능기를 포함하는 분자의 군에서 선택된다.
"반응성 관능기"라는 용어는 다당류의 히드록시 관능기와 결합을 형성할 수 있는 관능기를 의미하는 것으로 이해된다.
일 구현예에서, 상기 결합은 에테르 결합의 생성에 의해 형성된다.
일 구현예에서, 상기 결합은 헤미아세탈 결합의 생성에 의해 형성된다.
일 구현예에서, 상기 결합은 우레탄 결합의 생성에 의해 형성된다.
따라서, 본 발명에 따른 방법의 조건에서 에스테르 관능기의 형성은 제외된다.
일 구현예에서, 본 발명에 따른 방법에서 치환기의 전구체는 설포네이트, 선형 또는 분지형 알킬, 치환 또는 비치환된 방향족, 설페이트, 티올, 단당류, 포스페이트, 포스포네이트, 카르보네이트 및 에스테르 기 또는 관능기로 이루어진 군에서 선택된, 치환 및 가교결합 반응에 대해 불활성인 하나 이상의 유리한 관능기 또는 기를 추가적으로 포함하는 분자로 이루어진 군에서 선택된다.
"불활성"이라는 용어는 본 발명을 실시하는 조건에서 반응하지 않고, 본 발명의 방법에 따라 제조된 생성물의 저장조건에서 안정적인 관능기를 의미하는 것으로 이해된다. 따라서, 본 방법을 실시하는 조건에서 다당류의 임의의 관능기, 또는 가교제의 임의의 관능기, 또는 치환기의 전구체의 임의의 반응성 관능기와 반응하지 않을 수 있는 관능기가 본 방법을 실시하는 조건에서 불활성이다.
일 구현예에서, 본 발명에 따른 방법의 치환기는 일반식 F-R-(G)x의 분자로 이루어진 군에서 선택되고, 상기 식에서:
- F는 치환 또는 비치환된 비닐, 치환 또는 비치환된 에폭시드, 치환 또는 비치환된 알릴, 케톤, 알데히드, 티오시아네이트, 할라이드, 이소시아네이트, 할로실리콘, 니트릴 및 술톤 관능기로 이루어진 군에서 선택되는 반응성 관능기이고; R은 결합이거나, 또는 1 내지 12개의 탄소원자를 포함하고, 선택적으로 하나 이상의 헤테로원자를 포함하는, 선형 또는 분지형, 치환 또는 비치환된 방향족, 포화 또는 불포화 알킬 사슬이며;
- G는 수소이거나, 또는 설포네이트, 선형 또는 분지형 알킬, 치환 또는 비치환된 방향족, 설페이트, 티올, 단당류, 포스페이트, 포스포네이트, 카르보네이트 및 에스테르 기 또는 관능기로 이루어진 군에서 선택되고, 불활성인, 유리한 관능기 또는 기이며;
- x는 1 ≤ x ≤ 3인 양의 정수이다.
일 구현예에서, 본 발명에 따른 방법의 F는 비닐 관능기이고, 치환기의 전구체는 하기 식의 화합물로 이루어진 군에서 선택된다:
Figure pat00002
- R 및 G는 상기에서 정의된 바와 같음,
- R1, R2 및 R3은 동일하거나 상이하고, 수소 원자 또는 1 내지 3개의 탄소원자를 갖는 알킬 사슬임.
일 구현예에서, 본 발명에 따른 방법의 F는 에폭시드 관능기이고, 치환기의 전구체는 하기 식의 화합물로 이루어진 군에서 선택된다:
Figure pat00003
- R 및 G는 상기에 정의된 바와 같음,
- R1, R2 및 R3은 상기에 정의된 바와 같음.
일 구현예에서, 본 발명에 따른 방법의 F는 알릴 관능기이고, 치환기의 전구체는 하기 식의 화합물로 이루어진 군에서 선택된다:
Figure pat00004
- R 및 G는 상기에 정의된 바와 같음,
- R1, R2 및 R3은 상기에 정의된 바와 같음.
- R4 및 R5는 동일하거나 상이하고, 수소 원자 또는 1 내지 3개의 탄소원자를 갖는 알킬 사슬임.
일 구현예에서, 본 발명에 따른 방법의 G는 설페이트 관능기이다.
일 구현예에서, 본 발명에 따른 방법의 G는 수소원자이다.
일 구현예에서, 본 발명에 따른 방법의 G는 설포네이트 관능기이다.
일 구현예에서, 본 발명에 따른 방법의 치환기의 전구체는 알릴-설페이트, 에폭시-설페이트, 비닐-설포네이트 및 에폭시-알칸으로 이루어진 군에서 선택된다.
일 구현예에서, 본 발명에 따른 방법의 치환기는 비닐술폰산 및 이의 염, 에폭시부탄 및 나트륨 알릴 설페이트로 이루어진 군에서 선택된다.
일 구현예에서, 본 발명에 따른 방법의 다관능성 가교제는 1,4-부탄디올 디글리시딜 에테르(BDDE)이고, 치환기의 전구체는 나트륨 비닐설포네이트이다.
일 구현예에서, 본 발명에 따른 방법의 다관능성 가교제는 1,4-부탄디올 디글리시딜 에테르(BDDE)이고, 치환기의 전구체는 나트륨 알릴 설페이트이다.
일 구현예에서, 본 발명에 따른 방법의 다관능성 가교제는 1,4-부탄디올 디글리시딜 에테르(BDDE)이고, 치환기의 전구체는 에폭시부탄이다.
일 구현예에서, 본 발명에 따른 방법의 다관능성 가교제는 디비닐 설폰이고, 치환기의 전구체는 나트륨 비닐설포네이트이다.
일 구현예에서, 본 발명에 따른 방법에 사용되는 치환기의 전구체 대 다당류의 몰비는 0.001 내지 4.00이다.
일 구현예에서, 본 발명에 따른 방법에 사용되는 치환기의 전구체 대 다당류의 몰비는 0.20 내지 2.20이다.
일 구현예에서, 본 발명에 따른 방법에 사용되는 치환기의 전구체 대 다당류의 몰비는 0.24이다.
일 구현예에서, 본 발명에 따른 방법에 사용되는 치환기의 전구체 대 다당류의 몰비는 0.30이다.
일 구현예에서, 본 발명에 따른 방법에 사용되는 치환기의 전구체 대 다당류의 몰비는 0.35이다.
일 구현예에서, 본 발명에 따른 방법에 사용되는 치환기의 전구체 대 다당류의 몰비는 0.90이다.
일 구현예에서, 본 발명에 따른 방법에 사용되는 치환기의 전구체 대 다당류의 몰비는 1.00이다.
일 구현예에서, 본 발명에 따른 방법에 사용되는 치환기의 전구체 대 다당류의 몰비는 1.60이다.
일 구현예에서, 본 발명에 따른 방법에 사용되는 치환기의 전구체 대 다당류의 몰비는 2.00이다.
원칙적으로, 본 발명에 따른 방법의 가교결합 및 치환 반응은 동일한 실험조건 및 다당류의 동일한 반응 부위에서 동시에 수행되고, 이와 같은 경우에 관련된 다양한 개체들 사이에 경쟁이 없다. 치환도 및 가교결합도는 상기 반응들이 분리되어 수행되는 경우와 동일하다.
따라서, 겔을 제조할 수 있게 하고, 생성물을 이의 용도에 따라 용이하게 조정하게 할 수 있도록, 본 방법은 치환과 독립적으로 가교결합을 제어할 수 있게 한다.
알카리성 매질은 체류가 길어지면 분해되는데, 본 발명은 치환 및 가교결합이 동시에 일어나기 때문에 알카리성 매질에 다당류가 존재하는 시간을 제한할 수 있게 한다. 구체적으로는, 알카리성 매질에서의 단순한 치환의 경우, 예를 들어 히알루론산이 빠르게 분해되고, 이의 겔화성 및 점탄성 모두를 상실한다. 본 발명의 놀라운 효과는 가교결합 및 치환 반응이 동시에 일어난다는 점이 반응 동안에 다당류를 보호하고, 유동학적 특성, 특히 다당류의 탄성과 관련하여 상승효과(상당히 증가함)를 획득할 수 있게 한다는 것이다.
가교결합/치환 반응이 동시에 일어난다는 점에 관련된 이점은 더 뛰어난 탄성, 뛰어난 겔의 균질성, 치환기의 균일한 분포 또는 가교결합/치환 동안 다당류의 분해의 제한과 같이, 최종 생성물에서 보여지는 이점에 제한되는 것이 아니며, 반응시간 및 특히 반응 단계의 수를 포함한다. 본 발명의 방법이 모든 반응물을 동시에 도입할 수 있게 한다. 단일 반응 단계는 상당한 시간 절약을 제공하는 것뿐만 아니라, 시간 및 용매의 손실을 제한한다. 관련된 모든 반응, 즉 가교결합 및 치환 반응이 동일한 조건에서 수행됨에 따라, 도입되는 촉매가 단순한 가교결합과 비교하여 이의 양을 증가시킬 필요없이 양 반응 모두에 대해 활성이 될 것이다. 가교결합과 치환 사이의 경쟁의 부재는, 분해되는 것 또는 과다하게 빠르게 소비되는 것을 보상하기 위해 과잉의 반응물을 첨가할 필요를 방지한다.
본 발명의 방법은 단순한 산 또는 염기 외의 촉매를 사용하지 않고, 유기 용매를 사용하지 않으며, 활성화제를 사용하지 않고, 부산물이 형성되지 않기 때문에 반응의 원자 균형이 우수하다.
후자는 본 발명의 다른 이점이다: 본 발명의 방법은 정제 동안에 제거되어야하는 부산물을 제조하지 않음. 과잉의 가교제 및 촉매를 제거하기 위해 생성물을 세척하는 것만이 단순히 문제된다. 제조된 다당류의 응용, 특히 생체물질로서의 응용 측면에서, 상기와 같은 부산물의 부재가 실제로 경쟁력 있는 이점이다.
본 발명의 화합물을 획득할 수 있게 하는 방법이 종래 기술과 다른 점은, 놀랍게도 가교결합과 경쟁하는 치환 없이 다당류를 동시에 치환 및 가교결합할 수 있게 한다는 것이다. 가교결합도 또는 치환도에 대해 더욱 뛰어난 제어가 수행된다.
본 발명의 생성물을 제조할 수 있게 하는 본 방법은 반응 매질에서 독립적으로 및 동시에 일어나는 반응 각각의 파라미터를 결정하는 것에 있어서 완전한 자유를 제공한다. 따라서, 치환에 영향을 주지 않고 가교결합도를 조정할 수 있고, 반대로 가교결합에 영향을 주지 않고 치환도를 조정할 수 있다.
본 발명의 가교결합 공정의 실시는 용이하게 주입되는 높은 균질성의 생성물을 획득할 수 있게 한다. 놀랍게도, 본 발명에 따른 방법은 더 많은 가교제를 사용할 필요 없이 가교결합된 다당류의 유동학적 특성을 강화시킬 수 있게 한다. 또한, 수화 또는 친유성과 같은 다른 특성을 도입할 수 있게 한다.
본 발명의 방법은 동시에 최고 3가지의 반응을 수행하는 것을 구상할 수 있게 한다. "동시에 3가지의 반응"이라는 용어는 이중 치환과 동시에 일어나는 가교결합을 의미하는 것으로 이해된다.
일 구현예에서, 본 발명에 따른 방법에 의해 획득된 다당류는 이의 히드록시 관능기에서 치환된다.
도입 치환도(degree of substituent introduced: DSI)는 하기 식에서 정의되는 바와 같다:
Figure pat00005
.
일 구현예에서, 본 발명에 따른 방법의 도입 치환도는 0.001 내지 4.00이다(0.001　≤　DSI　≤　4.00).
일 구현예에서, 본 발명에 따른 방법의 도입 치환도는 0.20 내지 2.20이다(0.20　≤　DSI　≤　2.20).
일 구현예에서, 본 발명에 따른 방법의 도입 치환도는 0.24이다.
일 구현예에서, 본 발명에 따른 방법의 도입 치환도는 0.30이다.
일 구현예에서, 본 발명에 따른 방법의 도입 치환도는 0.35이다.
일 구현예에서, 본 발명에 따른 방법의 도입 치환도는 0.90이다.
일 구현예에서, 본 발명에 따른 방법의 도입 치환도는 1.00이다.
일 구현예에서, 본 발명에 따른 방법의 도입 치환도는 1.60이다.
일 구현예에서, 본 발명에 따른 방법의 도입 치환도는 2.00이다.
일 구현예에서, 본 발명에 따른 방법에서 획득된 다당류는 가교제와 다당류의 히드록시 관능기와의 반응에 의해 가교결합된다.
도입 가교도(degree of crosslinking agent introduced: DCI)는 하기 식에서 정의되는 바와 같다:
Figure pat00006
일 구현예에서, 본 발명에 따른 방법의 도입 가교도는 0.001 내지 0.5이다.
일 구현예에서, 본 발명에 따른 방법의 도입 가교도는 0.01 내지 0.3이다.
일 구현예에서, 본 발명에 따른 방법의 도입 가교도는 0.07이다.
일 구현예에서, 본 발명에 따른 방법의 도입 가교도는 0.08이다.
일 구현예에서, 본 발명에 따른 방법의 도입 가교도는 0.10이다.
일 구현예에서, 본 발명에 따른 방법의 도입 가교도는 0.14이다.
일 구현예에서, 본 발명에 따른 방법의 도입 가교도는 0.21이다.
일 구현예에서, 본 발명에 따른 방법에서 사용되는 다당류의 중량 대 사용되는 물의 중량의 비는 중량%로 4% 내지 20%이다.
일 구현예에서, 본 발명에 따른 방법에서 사용되는 다당류의 중량 대 사용되는 물의 중량의 비는 중량%로 6% 내지 16%이다.
일 구현예에서, 본 발명에 따른 방법에서 사용되는 다당류의 중량 대 사용되는 물의 중량의 비는 중량%로 8% 내지 14%이다.
일 구현예에서, 본 발명에 따른 방법에서 사용되는 다당류의 중량 대 사용되는 물의 중량의 비는 중량%로 5.7%이다.
일 구현예에서, 본 발명에 따른 방법에서 사용되는 다당류의 중량 대 사용되는 물의 중량의 비는 중량%로 6.3%이다.
일 구현예에서, 본 발명에 따른 방법에서 사용되는 다당류의 중량 대 사용되는 물의 중량의 비는 중량%로 10.3%이다.
일 구현예에서, 본 발명에 따른 방법에서 사용되는 다당류의 중량 대 사용되는 물의 중량의 비는 중량%로 11.1%이다.
일 구현예에서, 본 발명에 따른 방법에서 사용되는 다당류의 중량 대 사용되는 물의 중량의 비는 중량%로 12.2%이다.
일 구현예에서, 본 발명에 따른 방법에서 사용되는 다당류의 중량 대 사용되는 물의 중량의 비는 중량%로 13.5%이다.
일 구현예에서, 본 발명에 따른 방법에서 사용되는 다당류의 중량 대 사용되는 물의 중량의 비는 중량%로 14.3%이다.
일 구현예에서, 본 발명에 따른 방법에서 사용되는 다당류의 중량 대 사용되는 물의 중량의 비는 중량%로 15.8%이다.
일 구현예에서, 본 발명에 따른 방법은 실온에서 수행된다.
"실온"이라는 용어는 18℃ 내지 25℃의 온도를 의미하는 것으로 이해된다.
일 구현예에서, 본 발명에 따른 방법은 25℃ 이상의 온도에서 수행된다.
일 구현예에서, 본 발명에 따른 방법은 60℃ 이하의 온도에서 수행된다.
일 구현예에서, 본 발명에 따른 방법은 39℃ 내지 60℃의 온도에서 수행된다.
일 구현예에서, 본 발명에 따른 방법은 40℃의 온도에서 수행된다.
일 구현예에서, 본 발명에 따른 방법은 50℃의 온도에서 수행된다.
일 구현예에서, 본 발명에 따른 방법은 15 분 내지 48 시간의 기간 동안 수행된다.
일 구현예에서, 본 발명에 따른 방법은 1 시간 내지 2 시간의 기간 동안 수행된다.
일 구현예에서, 본 발명에 따른 방법은 2 시간 내지 3 시간의 기간 동안 수행된다.
일 구현예에서, 본 발명에 따른 방법은 3 시간 내지 4 시간의 기간 동안 수행된다.
일 구현예에서, 본 발명에 따른 방법은 4 시간 내지 5 시간의 기간 동안 수행된다.
일 구현예에서, 본 발명에 따른 방법은 획득된 다당류를 세척하는 단계를 더 포함한다.
일 구현예에서, 본 발명에 따른 방법은 획득된 다당류를 약 7 pH를 갖는 완충액에 의해 세척하는 단계를 더 포함한다.
일 구현예에서, 본 발명에 따른 방법은 획득된 다당류를 정제수에 의해 세척하는 단계를 더 포함한다.
일 구현예에서, 본 발명의 방법에 따라 획득된 생성물에서 다당류의 가교결합은 식 PS-O-(CH2)n-S(O2)-(CH2)n-O-PS의 디에틸 술폰 가교에 의해 수행되고, 상기 식에서 "PS"는 다당류 잔기를 나타내고, n은 1 ≤ n ≤ 4의 정수를 나타낸다.
일 구현예에서, 본 발명의 방법에 따라 획득된 생성물에서 다당류의 가교결합은 식 PS-O-CH2-CH2-S(O2)-CH2-CH2-O-PS의 디에틸 술폰 가교에 의해 수행된다.
일 구현예에서, 본 발명의 방법에 따라 획득된 생성물에서 다당류의 가교결합은 식 PS-O-CH2-CH(OH)-CH2-X-CH2-CH(OH)-CH2-O-PS의 가교에 의해 수행되고, X기는 2 내지 6개의 탄소원자를 갖는 알킬 사슬 또는 폴리에테르 사슬이다.
일 구현예에서, 본 발명의 방법에 따라 획득된 생성물에서 다당류의 가교결합은 식 PS-O-CH2-O-PS의 에테르 가교에 의해 수행된다.
일 구현예에서, 본 발명의 방법에 따라 획득된 생성물에서 다당류의 가교결합은 식 PS-O-CH(OH)-(CH2)m-CH(OH)-O-PS의 헤미아세탈 가교에 의해 수행되고, m은 0 ≤ m ≤ 4의 정수이다.
일 구현예에서, 본 발명의 방법에 따라 획득된 생성물의 다당류는, 이의 히드록시 관능기 중 하나 이상에서, 비닐술폰산으로부터 유래된 치환기 2-에톡시에틸술폰산을 하나 이상 갖는다.
일 구현예에서, 본 발명의 방법에 따라 획득된 생성물의 다당류는, 이의 히드록시 관능기 중 하나 이상에서, 에폭시부탄으로부터 유래된 치환기 1-에톡시부탄-2-올을 하나 이상 포함한다.
일 구현예에서, 본 발명의 방법에 따라 획득된 생성물의 다당류는, 이의 히드록시 관능기 중 하나 이상에서, 나트륨 알릴 설페이트로부터 유래된 치환기 나트륨 3-프로폭시 설페이트를 하나 이상 포함한다.
본 발명은 점성보충(viscosupplementation) 조성물의 제형에 있어서 본 발명의 방법에 따라 획득된 히드로겔의 용도에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 본 발명에 따른 방법에 의해 획득된 다당류를 포함하는 조성물에 관한 것이다.
일 구현예에서, 본 발명에 따른 방법에 의해 획득된 다당류는 겔 또는 히드로겔 형태이다.
가교결합 및 치환의 완료시, 획득된 겔을 해당 분야에 알려진 표준방법, 예를 들어 염기성 매질에서 상기 방법이 수행되는 경우에 산의 첨가, 및 산성 매질에서 상기 방법이 수행되는 경우에 염기의 첨가에 따라 획득된 겔을 중화하는 것이 유리할 수 있다.
예상되는 응용예에 적합한 주사가능한 히드로겔의 형태로 겔을 획득하기 위해, 본 발명의 방법의 완료시 획득된 혼합물에는 선택적으로 추가적인 수화 단계가 가해질 수 있다.
상기 수화는 일반적으로 사용되는 다당류의 성질, 이들 각각의 가교결합도, 및 예상되는 용도에 따라 매우 넓은 범위로 달라질 수 있는 최종 농도를 획득할 수 있도록, 가교결합 및 치환된 겔을 수용액, 유리하게는 완충된 생리수용액과 단순히 혼합함으로써 수행된다. 사용될 수 있는 완충액은 예를 들어 약 6.8 내지 약 7.5의 pH를 나타내는 등삼투생리용액이다.
총 다당류의 최종 농도는 일반적으로 약 5 내지 약 100　mg/g, 바람직하게는 약 5 내지 약 50　mg/g, 예를 들어 약 20　mg/g의 히드로겔이다.
본 발명은 점성보충 조성물의 제형에 있어서 본 발명의 방법에 따라 획득된 다당류의 용도에 관한 것이다.
본 발명은 주름의 필링(filling)용 조성물의 제형에 있어서 본 발명의 방법에 따라 획득된 다당류의 용도에 관한 것이다.
목적으로 하는 응용예는, 특히 하기의 병리현상 또는 치료에 사용되거나 잠재적으로 사용될 수 있는 주사가능한 다당류 점탄성 제품의 측면에서 보통 관찰되는 응용예이다:
- 화장용 주사: 주름, 피부 결합 또는 부피의 결함(광대뼈, 턱, 입술)의 필링용;
- 골관절염의 치료: 부족한 활액(synovial fluid)을 대체 또는 보충하기 위한 관절에의 주사;
- 괄약근 부전에 의한 요실금의 치료에서 요도 주위 주사;
- 특히 복막 유착을 예방하기 위한 수술 후 주사;
- 레이저를 사용한 공막절개에 의한 원시를 위한 수술 후의 주사;
- 유리체강내 주사.
특히, 미용성형수술에서, 점탄성 및 지속성에 따라 본 발명의 방법에 따라 획득된 히드로겔은 하기를 위해 사용될 수 있다:
- 미세한, 중간의 또는 깊은 주름의 필링을 위해 사용될 수 있고, 얇은 바늘에 의해 주사될 수 있음(예를 들어, 27-게이지);
- 더 큰 직경, 예를 들어 22- 내지 26-게이지, 및 더 큰 길이(예를 들어, 30 내지 40 mm)의 바늘을 통해 주사되는 부피화(volumizing) 제품; 이와 같은 경우, 접착성이 주사되는 부위에 유지되는 것을 보장할 수 있게 함.
또한, 본 발명의 방법에 따라 획득된 다당류는 관절 수술 및 예를 들어 치주낭을 필링하기 위한 치과 수술에서 중요한 응용예를 갖는다.
하기의 응용예는 본 발명을 제한하기 위한 것이 아니고, 본 발명의 방법에 따라 획득된 다당류는 더욱 넓은 범위를 위해 제공된다:
- 부피의 필링;
- 특정 조직에 공간을 생성하여, 이들의 최적의 기능작용을 촉진한다.
- 부족한 생리학적 유체의 대체.
또한, 발명의 방법에 따라 획득된 다당류는 뼈 대체물의 제조에서 응용된다.
또한, 본 발명의 방법에 따라 획득된 다당류는 사전에 그 내부에 분산된 하나(또는 그 이상)의 유효 성분을 방출하기 위한 매트릭스로서 완전히 유리한 응용예를 갖는다. "유효 성분"이라는 용어는 약학적으로 활성인 임의의 제품: 의약용 유효 성분, 항산화 유효 성분(소르비톨, 만니톨 등), 소독용 활성 성분, 항염증성 활성 성분, 국소마취용 활성 성분(리도카인 등) 등을 의미하는 것으로 이해된다.
실무적으로, 본 발명의 방법에 따라 획득된 다당류는 직접 판매 및/또는 사용될 수 있도록, 바람직하게는 정제 및 히드로겔을 제공하기 위한 수화 후에 예를 들어 주사기에 패키징될 수 있고, 그 자체가 알려진 임의의 수단(예를 들어, 오토클레이빙(autoclaving))에 의해 살균될 수 있다.
다른 측면에 따르면, 본 발명은 살균된 주사기에 패키징된 본 발명의 방법에 따라 획득된 다당류를 포함하는 키트에 관한 것이다.
도 1은 본 발명의 실시예 1의 겔 G1A의 NMR 스펙트럼이다.
도 2은 본 발명의 실시예 1의 겔 REF1A의 NMR 스펙트럼.
도 1 및 도 2의 스펙트럼의 비교는 NaHA의 히드록시 관능기에서 VSA의 화학적 치환(공유 결합을 통함)을 확인할 수 있게 한다.
도 3는 본 발명의 실시예 3에 따라, 겔의 탄성 G'가 도입 치환도와 함께 증가한다는 것을 보여주는 그래프이다.
본 발명의 방법에 따라 획득된 다당류의 특성은 하기의 실시예에서 입증된다.
하기의 실시예에서 도입 치환도(DSI), 도입 가교도(DCI) 및 반응성 촉매 비는 하기와 같이 정의된다:
도입 가교도:
DCI = 반응매질에 도입된 가교제의 몰 수 / 반응매질에 도입된 이당류의 몰 수
도입 치환도:
DSI = 반응매질에 도입된 치환기의 반응성 관능기의 몰 수 / 반응매질에 도입된 이당류 유닛의 몰 수
반응성 촉매 비:
RCR = 반응매질에 도입된 촉매의 반응성 관능기의 몰 수 / 반응매질에 도입된 이당류 유닛의 몰 수
실시예 1:
가교결합과 동시에 수행되는 치환의 유동학적 특성에 대한 상승효과의 증명
하기의 단계들이 다음과 같이 기재된다:
o 비가교결합된 NaHA(히알론산나트륨)에서 VSA(비닐술폰산의 나트륨염)의 치환
o 치환의 분석
o BDDE(1,4-부탄디올 디글리시딜 에테르)에 의한 NaHA의 가교결합
o BDDE(1,4-부탄디올 디글리시딜 에테르)에 의한 가교결합과 동시에 NaHA에서 VSA(비닐술폰산의 나트륨염)의 치환
o NaHA에서 VSA(비닐술폰산의 나트륨염)의 치환, 및 그 후 BDDE(1,4-부탄디올 디글리시딜 에테르)에 의한 가교결합
o 가교결합과 동시에 수행된 치환에 의해 도입된 유동학적 특성에 대한 상승효과의 증명
· 겔 G1A 합성: 알카리성 매질( RCR = 0.8:1 ) 및 50℃의 온도에서, 비가교결합된 NaHA에서 VSA(비닐술폰산의 나트륨염)의 치환
단계 a): 비가교결합된 겔 형태의 히알론산나트륨 섬유의 수화
주사가능한 등급(0.9　g, 즉 2.24　mmol; 분자량: 약 2.7　MDa)의 히알론산나트륨 섬유의 중량이 용기에서 측정된다. 물(7.4　g) 중의 수산화나트륨 1% 수용액(매질에 도입된 0.25　mol/L, 즉 1.85　mmol의 HO-)이 첨가되고(RCR = 0.8:1), 조합된 혼합물은 실온 및 900　mmHg에서 스패튤라(spatula)를 사용하여 약 1시간 동안 균질화된다.
단계 b): 치환
이전 단계에서 획득된 비가교결합된 히알론산나트륨(NaHA) 겔에 VSA(102　mg, 즉 0.78　mmol)가 첨가되고, 조합된 혼합물은 12-14℃의 온도에서 약 30분 동안 스패튤라에 의해 균질화된다. 조합된 혼합물은 그 후 50℃의 수조에 2h　10 동안 위치된다. 도입 치환도 DSI는 약 0.35이다.
단계 c): 중화, 정제
pH를 안정화하고 수화 또는 팽창을 가능하게 하기 위해, 치환된 최종 겔은 그 후 1N HCl의 첨가에 의해 중화되고 포스페이트 버퍼 배스(bath)에 위치되어, 20　mg/g의 HA(히알루론산)를 포함하는 겔을 획득하였다. 그 후, 상기 겔은 오토클레이빙에 의해 살균되는 주사기에 패키징되기 전에 균질화된다. 이에 따라, 치환 및 살균된 NaHA 히드로겔 G1A가 획득된다.
· 겔 REF1A 합성
겔 REF1A가 상기의 겔 G1A를 위한 절차에 따라 합성되고, VSA는 비경구 주사(WPI)를 위해 물로 대체된다.
· 액체에 의한 겔 G1A 및 REF1A에 대한 화학적 개질의 분석( 1 H NMR):
도 1에 나타난 겔 G1A의 NMR 스펙트럼.
도 2에 나타난 겔 REF1A의 NMR 스펙트럼.
도 1 및 도 2의 스펙트럼의 비교는 NaHA의 히드록시 관능기에서 VSA의 화학적 치환(공유 결합을 통함)을 확인할 수 있게 한다.
· 겔 G1B 합성: 알카리성 매질( RCR = 0.8:1 ) 및 50℃의 온도에서, BDDE(1,4-부탄디올 디글리시딜 에테르)에 의한 NaHA의 가교결합
단계 a): 겔 G1A의 합성의 단계 a)와 동일함
단계 b): 가교결합
BDDE(65　mg, 즉 0.32　mmol)가 이전 단계에서 획득된 비가교결합된 히알론산나트륨(NaHA) 겔에 첨가되고, 조합된 혼합물이 스패튤라를 사용하여 약 30분 동안 12-14℃의 온도에서 균질화된다. 조합된 혼합물은 그 후 50℃의 수조에 2시간 10분 동안 위치된다. 도입 가교도 DCI는 약 0.14이다.
단계 c): 중화, 정제
pH를 안정화하고 수화 또는 팽창을 가능하게 하기 위해, 가교된 최종 겔은 그 후 1N HCl의 첨가에 의해 중화되고 포스페이트 버퍼 배스에 위치되어, 20　mg/g의 HA(히알루론산)를 포함하는 겔을 획득하였다. 상기 겔은 그 후 오토클레이빙에 의해 살균되는 주사기에 채우기 전에 균질화된다. 이에 따라, 치환 및 살균된 NaHA 히드로겔 G1B가 획득된다.
· 겔 G1C 합성: 알카리성 매질( RCR = 0.8:1 ) 및 50℃의 온도에서, BDDE(1,4-부탄디올 디글리시딜 에테르)에 의한 가교결합과 동시에 NaHA에서 VSA(비닐술폰산의 나트륨염)의 치환
단계 a): 겔 G1A 합성의 단계 a)와 동일함
단계 b): 가교결합 및 치환
BDDE(65　mg, 즉 0.32　mmol) 및 VSA(102　mg, 즉 0.78　mmol)가 이전 단계에서 획득된 비가교결합된 히알론산나트륨(NaHA) 겔에 첨가되고, 조합된 혼합물이 스패튤라를 사용하여 약 30분 동안 12-14℃의 온도에서 균질화된다. 조합된 혼합물은 그 후 50℃의 수조에 2시간 10분 동안 위치된다. 도입 가교도 DCI는 약 0.14이고, 도입 치환도 DSI는 약 0.35이다.
단계 c): 중화, 정제
pH를 안정화하고 수화 또는 팽창을 가능하게 하기 위해, 가교 및 치환된 최종 겔은 그 후 1N HCl의 첨가에 의해 중화되고 포스페이트 버퍼 배스에 위치되어, 20　mg/g의 HA를 포함하는 겔을 획득하였다. 상기 겔은 그 후 오토클레이빙에 의해 살균되는 주사기에 패키징되기 전에 균질화된다. 이에 따라, 가교결합, 치환 및 살균된 NaHA 히드로겔 G1C가 획득된다.
· 겔 G1D 합성: 알카리성 매질( RCR = 0.8:1 ) 및 40℃의 온도에서, NaHA에 서 VSA(비닐술폰산의 나트륨염)의 치환 및 그 후 BDDE(1,4-부탄디올 디글리시딜 에테르)에 의한 가교결합
단계 a): 겔 G1A 합성의 단계 a)와 동일함
단계 b): 치환
VSA(102　mg, 즉 0.78　mmol)가 이전 단계에서 획득된 비가교결합된 히알론산나트륨(NaHA) 겔에 첨가되고, 조합된 혼합물이 스패튤라를 사용하여 약 30분 동안 12-14℃의 온도에서 균질화된다. 조합된 혼합물은 그 후 40℃의 수조에 1시간 동안 위치된다. 도입 치환도 DSI는 약 0.35이다. 하기 가교결합 단계를 위해 충분히 두꺼운 겔을 유지하기 위해, G1A 시험과 비교하여 시간 및 온도는 감소되었다.
단계 c): 가교결합
BDDE(65　mg, 즉 0.32　mmol)는 이전 단계에서 획득된 비가교결합된 치환된 히알론산나트륨(NaHA) 겔에 첨가되고, 조합된 혼합물이 스패튤라를 사용하여 약 30분 동안 12-14℃의 온도에서 균질화된다. 조합된 혼합물은 그 후 50℃의 수조에 2시간 10분 동안 위치된다. 도입 가교도 DCI는 약 0.14이다.
단계 d): 중화, 정제
pH를 안정화하고 수화 또는 팽창을 가능하게 하기 위해, 가교결합 및 치환된 최종 겔은 그 후 1N HCl의 첨가에 의해 중화되고 포스페이트 버퍼 배스에 위치되어, 20　mg/g의 HA를 포함하는 겔을 획득하였다. 상기 겔은 그 후 오토클레이빙에 의해 살균되는 주사기에 패키징되기 전에 균질화된다. 이에 따라, 치환, 그 후 가교결합 및 살균된 NaHA 히드로겔 G1D가 획득된다.
· 가교결합과 동시에 수행되는 치환에 의해 도입된 유동학적 특성에 대한 상승효과의 입증
살균 겔의 점도 η가 25℃의 제어된 스트레스 조건에서 TA Instruments AR 2000 Ex 유량계에서 분석된다. 점도값이 0.02 s-1의 스트레스에서 기록된다.
25℃의 진동에서, 살균 겔의 탄성 성분 G' 및 점성 성분 G"이 TA Instruments AR 2000 Ex 유량계에 분석되고, 탄성 및 점성 성분의 값이 1　Hz의 진동수에서 기록된다.
유동학적 결과는 하기 표 1에 나타난다.
G1A G1B G1C G1D
점도: 0.02　s-1에서 η (Pa.s) 7 1822 1959 1502
탄성 성분: 1 Hz에서 G' (Pa) 0.5 107 131 78
점성 성분: 1 Hz에서 G" (Pa) 3 27 29 22
하기의 겔과 비교하여, 겔에 가교결합과 동시에 치환하는 것(G1C 시험)은 우수한 점탄성 특성을 도입한다:
o 단순히 치환(겔 G1A),
o 단순히 가교결합(겔 G1B),
o 먼저 치환 및 그 후 가교결합(겔 G1D).
놀랍게도, 가교결합과 동시에 수행되는 치환은 획득된 겔의 유동학적 특성을 상승효과에 의해 개선시킨다.
실시예 2:
알카리성 매질 ( RCR = 0.8:1 ) 및 50℃의 온도에서, BDDE(1,4-부탄디올 디글리시딜 에테르)에 의한 가교결합과 동시에 NaHA에서 VSA ( 비닐술폰산의 나트륨염) 치환
유동학적 특성을 측정함으로써, 본 실시예는 하기를 입증할 수 있게 한다:
o 가교결합 동안 NaHA에서 비닐 관능기의 치환, 및 치환에 의해 도입된 구조의 차이;
o 치환 및 가교결합된 겔의 라디칼 분해에 대한 더 우수한 저항.
· 겔 G2 합성
단계 a): 비가교결합된 겔 형태의 히알론산나트륨 섬유의 수화
주사가능한 등급의 히알론산나트륨 섬유(0.9　g, 즉 2.24　mmol; 분자량: 약 2.7　MDa)의 중량이 용기에서 측정된다. 물(7.4　g) 중의 수산화나트륨 1% 수용액(매질에 도입된 0.25　mol/L, 즉 1.85　mmol의 HO-)이 첨가되고(RCR = 0.8:1), 조합된 혼합물은 실온 및 900　mmHg에서 스패튤라를 사용하여 약 1시간 동안 균질화된다.
단계 b): 가교결합 및 치환
이전 단계에서 획득된 비가교결합된 히알론산나트륨(NaHA) 겔에 BDDE(65　mg, 즉 0.32　mmol) 및 VSA(70　mg, 즉 0.54　mmol)가 첨가되고, 조합된 혼합물은 12-14℃의 온도에서 약 30분 동안 스패튤라에 의해 균질화된다. 조합된 혼합물은 그 후 50℃의 수조에 2시간　10분 동안 위치된다. 도입 가교도 DCI는 약 0.14이고, 도입 치환도 DSI는 약 0.24이다.
단계 c): 중화, 정제
pH를 안정화하고 수화 또는 팽창을 가능하게 하기 위해, 가교결합 및 치환된 최종 겔은 그 후 1N HCl의 첨가에 의해 중화되고 포스페이트 버퍼 배스에 위치되어, 20　mg/g의 HA를 포함하는 겔을 획득하였다. 상기 겔은 그 후 오토클레이빙에 의해 살균되는 주사기에 패키징되기 전에 균질화된다. 이에 따라, 가교결합, 치환 및 살균된 NaHA 히드로겔 G2가 획득된다.
· 겔 REF2 합성
겔 REF2가 상기의 겔 G2에 대한 절차에 따라 합성되고, VSA가 비경구투여(WPI)를 위해 물로 대체된다.
· 압출력 또는 "주사가능성", 및 겔 G2 및 REF2의 탄성의 분석
압출력은 27G ½" 바늘에 의해 50　mm/min의 압축속도에서 Mecmesin 인장/압축 시험장치에서 분석되고, 결과는 하기의 표에 주어진다.
살균 겔의 탄성이 25℃의 진동에서 TA Instruments AR 2000 Ex 유량계에서 분석되고, 탄성값은 1　Hz의 진동수에서 기록되며, 결과는 하기 표 2에 나타난다.
G2 REF2
압출력 (N), 27G ½" 바늘, 속도 50　mm/min 35 38
탄성: 1 Hz에서 G'(Pa) 116 105
치환은 약간 더 낮은 주사가능성 수준(-8%)에 대해 더 큰 유동학적 특성(+10%)의 완성 제품을 획득할 수 있게 한다. 상기 유동학적 데이터는 NaHA에 대한 화학적 개질, 및 이에 따른 가교결합 동안 NaHA에서 비닐 관능기의 치환을 입증한다.
· 겔 G2 및 REF2의 라디칼 분해에 대한 시험
겔은 또한 37℃에서의 시험관내 시험에 의해 라디칼 분해에 대해 분석되었다. 상기 시험은 주사된 겔의 사후 생체내(피부내, 관절내 등) 지속성을 시뮬레이션할 수 있도록 한다.
이는 문헌 ["Antioxidant activities of sulfated polysaccharides from brown and red seaweeds" Rocha de Souza, J. Appl. Phycol. (2007), 19, 153-160]에 개시된 시험에 기반하여 수행되었다.
상기 겔은 과산화수소와 제1철 이온 사이의 펜톤반응에 의해 생성된 자유 라디칼에 의해 분해된다. 상기 분해는 37℃에서 유동학적으로 관찰되고, 복합 점도가 측정된다. 상기 2가지 겔에 대한 분해결과의 경향 곡선은 그 후 상기 다양한 겔의 반감기(n* = n*0 / 2를 획득하기 위해 필요한 기간, 단위: 분, 여기서 n*0 = 분석되는 겔의 t0에서의 복합 점도)를 분석할 수 있게 한다. 획득된 반감기는 하기 표 3에 주어진다.
G2 REF2
반감기 (분) 8.0 5.1
따라서, 약간 더 낮고, 수술 활동에 대한 우수한 제어를 유지할 수 있게 하는 주사가능성에 있어서, 본 발명에 따라 개질된 겔의 반감기는 더 길고, 이는 더 긴 시간의 생체내 지속성을 보장하며, 이는 낮은 치환도에 의해 시험한 경우에도 같다.
실시예 3:
알카리성매질 ( RCR = 0.8:1 ) 및 50℃의 온도에서, BDDE(1,4-부탄디올 디글리시딜 에테르)에 의한 가교결합과 동시에 NaHA에서 VSA ( 비닐술폰산의 나트륨염) 치환
본 실시예는 겔에 도입된 탄성의 증가를 치환도의 함수로서 유동학에 의해 입증할 수 있게 한다.
·겔 G3A 및 겔 G3B 합성
겔의 합성은 겔 G1C 및 G2의 합성과 동일하고, 단 VSA의 양이 시험되는 도입 치환도에 따라 조절된다(하기 표 4 참조).
DSI
G3A 1.00
G3B 2.00
· 겔 G3A 및 G3B의 탄성 분석
겔의 탄성이 실시예 2에 기재된 TA Instruments AR 2000　Ex 유량계에서 분석되고, 결과는 하기 표 5에 주어진다.
G2 G1C G3A G3B REF2
도입 치환도 DSI 0.24 0.35 1.00 2.00 -
탄성: 1 Hz에서 G' (Pa) 116 131 199 213 105
도 3에서 그래프에 의해 표시된 결과는, 겔의 탄성 G'가 도입 치환도와 함께 증가한다는 것을 보여준다: 실제로, 화학적 개질이 겔의 점탄성의 최적화에 책임이 있음.
실시예 4:
알카리성매질 ( RCR = 0.8:1 ) 및 50℃의 온도에서, BDDE(1,4-부탄디올 디글리시딜 에테르)에 의한 가교결합과 동시에 NaHA에서 EB ( 에폭시부탄 ) 치환
본 실시예는 가교결합과 동시에 NaHA에서 에폭시 관능기의 치환을 유동학에 의해 입증할 수 있게 한다.
·겔 G4 합성
단계 a): 겔 G1A 합성의 단계 a)와 동일함.
단계 b): 가교결합 및 치환
이전 단계에서 획득된 비가교결합된 히알론산나트륨(NaHA) 겔에 BDDE(65　mg, 즉 0.32　mmol) 및 EB(147　mg, 즉 2.02　mmol)가 첨가되고, 조합된 혼합물은 12-14℃의 온도에서 약 30분 동안 스패튤라에 의해 균질화된다. 조합된 혼합물은 그 후 50℃의 수조에 2시간　10분 동안 위치된다. 도입 가교도 DCI는 약 0.14이고, 도입 치환도 DSI는 약 0.90이다.
단계 c): 중화, 정제
pH를 안정화하고 수화 또는 팽창을 가능하게 하기 위해, 가교결합 및 치환된 최종 겔은 그 후 1N HCl의 첨가에 의해 중화되고 포스페이트 버퍼 배스에 위치되어, 20　mg/g의 HA를 포함하는 겔을 획득하였다. 상기 겔은 그 후 오토클레이빙에 의해 살균되는 주사기에 패키징되기 전에 균질화된다. 이에 따라, 가교결합, 치환 및 살균된 NaHA 히드로겔 G4가 획득된다.
· 겔 REF4 합성
겔 REF4가 상기의 겔 G4에 대한 절차에 따라 합성되고, EB가 비경구투여(WPI)를 위해 물로 대체된다.
· 겔 G4 및 REF4의 탄성 분석
겔의 탄성이 실시예 2에 기재된 TA Instruments AR 2000　Ex 유량계에서 분석되고, 결과는 하기 표 6에 주어진다.
G4 REF4
탄성: 1 Hz에서 G'(Pa) 180 150
상기 유동학적 결과에 의해, NaHA에서 에폭시 반응기를 포함하는 분자의 치환이 확인되었다: 화학적 개질에 의해, 더 높은 탄성을 갖는 완성 제품을 획득할 수 있음.
상기 유동학적 데이터는 가교결합 동안 NaHA에서 에폭시드 관능기의 치환을 확인시켜준다.
실시예 5:
알카리성 매질 ( RCR = 0.7:1 ) 및 50℃의 온도에서, BDDE(1,4-부탄디올 디글리시딜 에테르)에 의한 가교결합과 동시에 NaHA에서 VSA ( 비닐술폰산의 나트륨염) 치환
본 실시예는 낮은 분자량의 NaHA에서 치환을 유동학적으로 입증한다.
· 겔 G5 합성
단계 a): 비가교결합된 겔 형태의 히알론산나트륨 섬유의 수화
주사가능한 등급의 히알론산나트륨 섬유(0.9　g, 즉 2.24　mmol; 분자량: 약 1.5　MDa)의 중량이 용기에서 측정된다. 물(6.3　g) 중의 수산화나트륨 1% 수용액(매질에 도입된 0.25　mol/L, 즉 1.57　mmol의 HO-)이 첨가되고(RCR = 0.7:1), 조합된 혼합물은 실온 및 900　mmHg에서 스패튤라를 사용하여 약 1시간 동안 균질화된다.
단계 b): 가교결합 및 치환
이전 단계에서 획득된 비가교결합된 히알론산나트륨(NaHA) 겔에 BDDE(30　mg, 즉 0.15　mmol) 및 VSA(87　mg, 즉 0.67　mmol)가 첨가되고, 조합된 혼합물은 12-14℃의 온도에서 약 30분 동안 스패튤라에 의해 균질화된다. 조합된 혼합물은 그 후 50℃의 수조에 2시간　10분 동안 위치된다. 도입 가교도 DCI는 약 0.07이고, 도입 치환도 DSI는 약 0.30이다.
단계 c): 중화, 정제
pH를 안정화하고 수화 또는 팽창을 가능하게 하기 위해, 가교결합 및 치환된 최종 겔은 그 후 1N HCl의 첨가에 의해 중화되고 포스페이트 버퍼 배스에 위치되어, 20　mg/g의 HA를 포함하는 겔을 획득하였다. 상기 겔은 그 후 주사기에 패키징되기 전에 균질화된다. 이에 따라, 가교결합 및 치환된 NaHA 히드로겔 G5가 획득된다.
·겔 REF5 합성
겔 REF5가 상기의 겔 G5에 대한 절차에 따라 합성되고, VSA가 비경구투여(WPI)를 위해 물로 대체된다.
· 겔 G5 및 REF5의 탄성 분석
겔의 탄성이 실시예 2에 기재된 TA Instruments AR 2000　Ex 유량계에서 분석되고, 결과는 하기 표 7에 주어진다.
G5 REF5
탄성: 1 Hz에서 G' (Pa) 519 433
치환은 더 높은 탄성을 가지는 완성 제품을 획득할 수 있게 한다. 상기 유동학적 데이터는 실시예 2(높은 분자량의 NaHA)와 같이 다양한 분자량을 가지는 NaHA에서 치환이 수행될 수 있음을 확인한다.
실시예 6:
알카리성 매질( RCR = 1:1) 및 50℃의 온도에서, BDDE(1,4-부탄디올 디글리시딜 에테르)에 의한 치환과 동시에 CMC(카르복시메틸셀룰로스)에서 VSA ( 비닐술폰산의 나트륨염) 치환
본 실시예는 NaHA 외의 다당류에서의 치환을 유동학적으로 입증한다.
· 겔 G6 합성
단계 a): 비가교결합된 겔 형태의 CMC 수화
0.93　g, 즉 2.20　mmol의 나트륨 CMC(Sigma에 의해 공급, 분자량: 약 1.0　MDa)의 중량이 용기에서 측정된다. 물(9.0　g) 중의 수산화나트륨 1% 수용액(매질에 도입된 0.25　mol/L, 즉 2.25　mmol의 HO-)이 첨가되고(RCR = 1:1), 조합된 혼합물은 실온 및 900　mmHg에서 스패튤라를 사용하여 약 90분 동안 균질화된다.
단계 b): 가교결합 및 치환
이전 단계에서 획득된 비가교결합된 CMC 겔에 BDDE(37　mg, 즉 0.18　mmol) 및 VSA(87　mg, 즉 0.67　mmol)가 첨가되고, 조합된 혼합물은 12-14℃의 온도에서 약 30분 동안 스패튤라에 의해 균질화된다. 조합된 혼합물은 그 후 50℃의 수조에 3시간 35분 동안 위치된다. 도입 가교도 DCI는 약 0.08이고, 도입 치환도 DSI는 약 0.30이다.
단계 c): 중화, 정제
pH를 안정화하고 수화 또는 팽창을 가능하게 하기 위해, 가교결합 및 치환된 최종 겔은 그 후 1N HCl의 첨가에 의해 중화되고 포스페이트 버퍼 배스에 위치되어, 30　mg/g의 CMC를 포함하는 겔을 획득하였다. 상기 겔은 그 후 주사기에 패키징되기 전에 균질화된다. 이에 따라, 가교결합 및 치환된 CMC 히드로겔 G6이 획득된다.
·겔 REF6 합성
겔 REF6이 상기의 겔 G6에 대한 절차에 따라 합성되고, VSA가 비경구투여(WPI)를 위해 물로 대체된다.
· 겔 G6 및 REF6의 탄성 분석
겔의 탄성이 실시예 2에 기재된 TA Instruments AR 2000　Ex 유량계에서 분석되고, 결과는 하기 표 8에 주어진다.
G6 REF6
탄성: 1 Hz에서 G' (Pa) 524 483
치환은 더 높은 탄성을 가지는 완성 제품을 획득할 수 있게 한다. 상기 유동학적 데이터는 실시예 2(NaHA)와 같이 다양한 다당류 백본(backbone), 특히 셀룰로스 유도체에서 치환이 수행될 수 있음을 확인시켜준다.
실시예 7:
약산 매질( RCR = 0.06:1)과 강산 매질( RCR = 1:1) 및 50℃의 온도에서, BDDE(1,4-부탄디올 디글리시딜 에테르)에 의한 가교결합과 동시에 CH(키토산)에서 EB(에폭시부탄) 치환
본 실시예는 가교결합과 동시에 산성 매질에서의 치환을 유동학적으로 입증할 수 있게 한다.
· (약산 매질에서) 겔 G7a 합성
단계 a): 비가교결합된 겔 형태의 CH 수화
0.99　g, 즉 2.93　mmol의 약 80%의 탈아세틸화도를 갖는 CH(Kitozyme에 의해 공급, 분자량: 약 120　000　Da)의 중량이 용기에서 측정된다. 물(9.0　g) 중의 글루탐산 1% 수용액(0.07　mol/L)이 첨가된다. 글루탐산은 약산이기 때문에, 물에 부분적으로 용해된다. 하기의 식을 통해 수용액의 pH가 계산된다(근사치의 결과로 측정됨): pH = (½ pKa) - (½ log [글루탐산]), 즉 pH = (½x 2.19) - (½ x log(0.07)) = 1.67. 히드로늄 H3O+ 이온의 농도가 하기의 식에 의해 계산될 수 있다: [H3O+] = 10-pH, 즉 [H3O+] = 0.02　mol/L, 즉 0.19　mmol의 히드로늄 이온이 반응매질에 도입됨(RCR = 0.06:1). 조합된 혼합물은 실온 및 900　mmHg에서 스패튤라를 사용하여 약 90분 동안 균질화된다. 반응매질의 pH는 5.3이다.
단계 b): 가교결합 및 치환
이전 단계에서 획득된 비가교결합된 CH 겔에 BDDE(60　mg, 즉 0.30　mmol) 및 EB(337　mg, 즉 4.68　mmol)가 첨가되고, 조합된 혼합물은 12-14℃의 온도에서 약 30분 동안 스패튤라에 의해 균질화된다. 조합된 혼합물은 그 후 50℃의 수조에 위치된다. 도입 가교도 DCI는 약 0.10이고, 도입 치환도 DSI는 약 1.60이다.
단계 c): 중화, 정제
pH를 안정화하고 수화 또는 팽창을 가능하게 하기 위해, 가교결합 및 치환된 최종 겔은 그 후 1N 수산화나트륨 용액의 첨가에 의해 중화되고 포스페이트 버퍼 배스에 위치되어, 22　mg/g의 CH를 포함하는 겔을 획득하였다. 그 후, 상기 겔은 오토클레이빙에 의해 살균되는 주사기에 패키징되기 전에 균질화된다. 이에 따라, 가교결합, 치환 및 살균된 CH 히드로겔 G7a가 획득된다.
· (강산 매질에서) 겔 G7b 합성
단계 a): 비가교결합된 겔 형태의 CH 수화
0.99　g, 즉 2.93　mmol의 약 80%의 탈아세틸화도를 갖는 CH(Kitozyme에 의해 공급, 분자량: 약 120　000　Da)의 중량이 용기에서 측정된다. 물(9.0　g) 중의 염산 1.15% 수용액(0.32　mol/L, 즉 2.88　mol의 H3O+ 이온이 반응매질에 도입됨 => RCR = 1:1)이 첨가된다. 조합된 혼합물은 실온 및 900　mmHg에서 스패튤라를 사용하여 약 90분 동안 균질화된다. 반응매질의 pH는 3이다.
단계 b): 가교결합 및 치환
이전 단계에서 획득된 비가교결합된 CH 겔에 BDDE(60　mg, 즉 0.30　mmol) 및 EB(337　mg, 즉 4.68　mmol)가 첨가되고, 조합된 혼합물은 12-14℃의 온도에서 약 30분 동안 스패튤라에 의해 균질화된다. 조합된 혼합물은 그 후 50℃의 수조에 위치된다. 도입 가교도 DCI는 약 0.10이고, 도입 치환도 DSI는 약 1.60이다.
단계 c): 중화, 정제
pH를 안정화하고 수화 또는 팽창을 가능하게 하기 위해, 가교결합 및 치환된 최종 겔은 그 후 1N 수산화나트륨 용액의 첨가에 의해 중화되고 포스페이트 버퍼 배스에 위치되어, 22　mg/g의 CH를 포함하는 겔을 획득하였다. 그 후, 상기 겔은 오토클레이빙에 의해 살균되는 주사기에 패키징되기 전에 균질화된다. 이에 따라, 가교결합, 치환 및 살균된 CH 히드로겔 G7b가 획득된다.
· 겔 REF7 합성
겔 REF7이 상기의 겔 G7에 대한 절차에 따라 합성되고, EB가 비경구투여(WPI)를 위해 물로 대체된다.
· 겔 G7a 및 REF7의 점성 분석
2가지 겔 G7a 및 REF7은 일관되게 탄성보다는 점성을 더 가지고, 이에 따라 점성을 특징으로 한다.
살균 겔의 점도가 실시예 1에 기재된 TA Instruments AR 2000　Ex 유량계에서 분석되고, 결과는 하기 표 9에 주어진다.
G7a REF7
점도 (Pa.s) 67.1 35.4
치환은 더 뛰어난 유동학적 특성의 완성 제품을 획득할 수 있게 한다. 상기 유동학적 데이터는 실시예 2(염기성 조건의 NaHA) 및 실시예 6(염기성 조건의 CMC)과 같이 다양한 다당류 백본(backbone) 및 산성 및 염기성 조건 모두에서 치환이 수행될 수 있음을 확인한다.
실시예 8
알카리성 매질( RCR = 1.75:1 ) 및 40℃의 온도에서, DVS(디비닐 설폰)에 의한 가교결합과 동시에 NaHA에서 VSA(비닐술폰산의 나트륨염) 치환
본 실시예는 다양한 가교제에 의해 가교된 NaHA에서의 치환을 유동학적으로 입증할 수 있게 한다.
· 겔 G8 합성
단계 a): 비가교결합된 겔 형태의 히알론산나트륨 섬유의 수화
주사가능한 등급의 히알론산나트륨 섬유(0.9　g, 즉 2.24　mmol; 분자량: 약 2.7　MDa)의 중량이 용기에서 측정된다. 물(15.7　g) 중의 수산화나트륨 1% 수용액(매질에 도입된 0.25　mol/L, 즉 3.92　mmol의 HO-)이 첨가되고(RCR = 1.75:1), 조합된 혼합물은 실온 및 900　mmHg에서 스패튤라를 사용하여 약 1시간 동안 균질화된다.
단계 b): 가교결합 및 치환
이전 단계에서 획득된 비가교결합된 히알론산나트륨(NaHA) 겔에 DVS(57　mg, 즉 0.48　mmol) 및 VSA(87　mg, 즉 0.67　mmol)가 첨가되고, 조합된 혼합물은 12-14℃의 온도에서 약 30분 동안 스패튤라에 의해 균질화된다. 조합된 혼합물은 그 후 40℃의 수조에 1시간 동안 위치된다. 도입 가교도 DCI는 약 0.21이고, 도입 치환도 DSI는 약 0.30이다.
단계 c): 중화, 정제
pH를 안정화하고 수화 또는 팽창을 가능하게 하기 위해, 가교결합 및 치환된 최종 겔은 그 후 1N HCl의 첨가에 의해 중화되고 포스페이트 버퍼 배스에 위치되어, 20　mg/g의 HA를 포함하는 겔을 획득하였다. 그 후, 상기 겔은 주사기에 패키징되기 전에 균질화된다. 이에 따라, 가교결합 및 치환된 NaHA 히드로겔 G8이 획득된다.
· 겔 REF8 합성
겔 REF8이 상기의 겔 G8에 대한 절차에 따라 합성되고, VSA가 비경구투여(WPI)를 위해 물로 대체된다.
· 겔 G8 및 REF8의 탄성 분석
겔의 탄성이 실시예 2에 기재된 TA Instruments AR 2000　Ex 유량계에서 분석되고, 결과는 하기 표 10에 주어진다.
G8 REF8
탄성: 1 Hz에서 G' (Pa) 110 103
치환은 더 뛰어난 탄성을 갖는 완성 제품을 획득할 수 있게 한다. 상기 유동학적 데이터는 실시예 2(BDDE에 의한 가교결합)와 같이 치환이 가교제의 성질이 어떠하던지 다당류의 가교로서 동시에 수행될 수 있음을 확인한다.
실시예 9:
알카리성 매질( RCR = 0.8:1 ) 및 50℃의 온도에서, BDDE(1,4-부탄디올 디글리시딜 에테르)에 의한 가교결합과 동시에 NaHA에서 SAS(나트륨 알릴 설페이트 ) 치환
본 실시예는 유동학적으로 하기를 입증할 수 있게 한다:
- 가교결합 동안 NaHA에서 알릴 관능기의 치환, 및 치환에 의해 도입된 구조의 차이,
- 설페이트 펜던트기에 의해 치환된 겔의 라디칼 분해에 대한 더 뛰어난 저항.
· 겔 G9 합성
단계 a): 겔 G1A 합성의 단계 a)와 동일함.
단계 b): 가교결합 및 치환
이전 단계에서 획득된 비가교결합된 히알론산나트륨(NaHA) 겔에 BDDE(65　mg, 즉 0.32　mmol) 및 SAS(111　mg, 즉 0.68　mmol)가 첨가되고, 조합된 혼합물은 12-14℃의 온도에서 약 30분 동안 스패튤라에 의해 균질화된다. 조합된 혼합물은 그 후 50℃의 수조에 2시간 10분 동안 위치된다. 도입 가교도 DCI는 약 0.14이고, 도입 치환도 DSI는 약 0.30이다.
단계 c): 중화, 정제
pH를 안정화하고 수화 또는 팽창을 가능하게 하기 위해, 가교결합 및 치환된 최종 겔은 그 후 1N HCl의 첨가에 의해 중화되고 포스페이트 버퍼 배스에 위치되어, 20　mg/g의 HA를 포함하는 겔을 획득하였다. 그 후, 상기 겔은 오토클레이빙에 의해 살균되는 주사기에 패키징되기 전에 균질화된다. 이에 따라, 가교결합, 치환 및 살균된 NaHA 히드로겔 G9가 획득된다.
· 겔 REF9 합성
겔 REF9가 상기의 겔 G9에 대한 절차에 따라 합성되고, SAS가 비경구투여(WPI)를 위해 물로 대체된다.
· 겔 G9 및 REF9의 탄성 분석
살균된 겔의 탄성이 실시예 2에 기재된 TA Instruments AR 2000　Ex 유량계에서 분석되고, 결과는 하기 표 11에 주어진다.
G9 REF9
탄성: 1 Hz에서 G' (Pa) 123 105
치환은 더 뛰어난 유동학적 특성(+17%)을 갖는 완성 제품을 획득할 수 있게 한다. 상기 유동학적 데이터는 가교결합과 동시에 NaHA에서 알릴 관능기의 치환을 확인시켜준다.
· 겔 G9 및 REF9의 라디칼 분해에 대한 시험
또한, 겔은 실시예 2에 기재된 바와 같은 온도에서 시험관내 시험에 의해 라디칼 분해에 대해 분석되었다. 획득된 반감기는 하기의 표 12에 주어진다.
G9 REF9
반감기 (분) 12.6 6.6
따라서, 본 발명에 따라 획득된 설페이트 펜던트기에 의해 치환된 겔의 반감기는 더 길고, 이는 더 긴 생체내 지속 시간을 보장한다.
비교예
비교예 1:
본 비교예는 종래 기술의 급격한 온도 및 pH 조건에서 수행된 실시예 1과 비견된다.
a) 겔 G1Ca 합성: 농축된 알카리성 매질( RCR 4.1:1 ) 및 80℃의 온도에서, BDDE(1,4-부탄디올 디글리시딜 에테르)에 의한 가교결합과 동시에 NaHA에서 VSA(비닐술폰산의 나트륨염)의 치환
단계 a): 비가교결합된 겔 형태의 히알론산나트륨 섬유의 수화
주사가능한 등급의 히알론산나트륨 섬유(0.9　g, 즉 2.24　mmol; 분자량: 약 2.7　MDa)의 중량이 용기에서 측정된다. 물(7.4　g) 중의 수산화나트륨 5% 수용액(매질에 도입된 1.25　mol/L, 즉 9.25　mmol의 HO-)이 첨가되고(RCR = 4.1:1), 조합된 혼합물은 실온 및 900　mmHg에서 스패튤라를 사용하여 약 1시간 동안 균질화된다.
단계 b): 가교결합 및 치환
이전 단계에서 획득된 비가교결합된 히알론산나트륨(NaHA) 겔에 BDDE(65　mg, 즉 0.32　mmol) 및 VSA(102　mg, 즉 0.78　mmol)가 첨가되고, 조합된 혼합물은 12-14℃의 온도에서 약 30분 동안 스패튤라에 의해 균질화된다. 조합된 혼합물은 그 후 80℃의 수조에 2시간 10분 동안 위치된다. 도입 가교도 DCI는 약 0.14이고, 도입 치환도 DSI는 약 0.35이다.
80℃에서 20분 후에, 반응매질은 완전히 분해되었다(액체, 갈색, "카라멜화"된 외관).
고온(80℃) 및 농축된 수산화나트륨 용액의 사용이 다당류 네트워크를 분해시키고, 이에 따라 폴리머 사슬의 치환 및 가교결합을 파괴한다.
b) 겔 G1Cb 합성: 농축된 알카리성 매질( RCR 8.2:1 ) 및 80℃의 온도에서, BDDE(1,4-부탄디올 디글리시딜 에테르)에 의한 가교결합과 동시에 NaHA에서 VSA(비닐술폰산의 나트륨염)의 치환
단계 a): 비가교결합된 겔 형태의 히알론산나트륨 섬유의 수화
주사가능한 등급의 히알론산나트륨 섬유(0.9　g, 즉 2.24　mmol; 분자량: 약 2.7　MDa)의 중량이 용기에서 측정된다. 물(7.4　g) 중의 수산화나트륨 10% 수용액(매질에 도입된 2.5　mol/L, 즉 18.5　mmol의 HO-)이 첨가되고(RCR = 8.2:1), 조합된 혼합물은 실온 및 900　mmHg에서 스패튤라를 사용하여 약 1시간 동안 균질화된다.
단계 b): 가교결합 및 치환
이전 단계에서 획득된 비가교결합된 히알론산나트륨(NaHA) 겔에 BDDE(65　mg, 즉 0.32　mmol) 및 VSA(102　mg, 즉 0.78　mmol)가 첨가되고, 조합된 혼합물은 12-14℃의 온도에서 약 30분 동안 스패튤라에 의해 균질화된다. 약 0.14의 도입 가교도 DCI 및 약 0.35의 도입 치환도 DSI를 획득하기 위해, 조합된 혼합물은 그 후 80℃의 수조에 2시간 10분 동안 위치된다.
80℃에서 15분 후에, 반응매질은 완전히 분해되었다(액체, 갈색, "카라멜화"된 외관).
고온(80℃) 및 농축된 수산화나트륨 용액의 사용이 다당류 네트워크를 분해시키고, 이에 따라 폴리머 사슬의 치환 및 가교결합을 파괴한다.
비교예 2:
본 비교예는 종래 기술의 급격한 온도 및 pH 조건에서 수행된 실시예 6과 비견된다.
a) 농축된 알카리성 매질( RCR 5.1:1 ) 및 80℃의 온도에서, BDDE(1,4-부탄디올 디글리시딜 에테르)에 의한 가교결합과 동시에 CMC(카르복시-메틸셀룰로스)에서 VSA(비닐술폰산의 나트륨염) 치환
· 겔 G6a 합성
단계 a): 비가교결합된 겔 형태의 CMC의 수화
0.93　g, 즉 2.20　mmol의 나트륨 CMC(Sigma에 의해 공급, 분자량: 약 1.0　MDa)의 중량이 용기에서 측정된다. 물(9.0　g) 중의 수산화나트륨 5% 수용액(매질에 도입된 1.25　mol/L, 즉 11.25　mmol의 HO-)이 첨가되고(RCR = 5.1:1), 조합된 혼합물은 실온 및 900　mmHg에서 스패튤라를 사용하여 약 90분 동안 균질화된다.
단계 b): 가교결합 및 치환
이전 단계에서 획득된 비가교결합된 CMC 겔에 BDDE(37　mg, 즉 0.18　mmol) 및 VSA(87　mg, 즉 0.67　mmol)가 첨가되고, 조합된 혼합물은 12-14℃의 온도에서 약 30분 동안 스패튤라에 의해 균질화된다. 조합된 혼합물은 그 후 80℃의 수조에 3시간 35분 동안 위치된다. 도입 가교도 DCI는 약 0.08이고, 도입 치환도 DSI는 약 0.30이다.
단계 c): 중화, 정제
pH를 안정화하고 수화 또는 팽창을 가능하게 하기 위해, 가교결합 및 치환된 최종 겔은 그 후 1N HCl의 첨가에 의해 중화되고 포스페이트 버퍼 배스에 위치되어, 30　mg/g의 CMC를 포함하는 겔을 획득하였다. 그 후, 상기 겔은 주사기에 패키징되기 전에 균질화된다. 이에 따라, 가교결합 및 치환된 CMC 히드로겔 G6a가 획득된다.
상기 겔은 과잉되게 액상이고, 과잉되게 분산되었으며, 충분히 탄성이 아닌 외관을 갖는다.
b) 농축된 알카리성 매질( RCR 10.2:1) 및 80℃의 온도에서, BDDE(1,4-부탄디올 디글리시딜 에테르)에 의한 가교결합과 동시에 CMC(카르복시-메틸셀룰로스)에 서 VSA(비닐술폰산의 나트륨염) 치환
· 겔 G6b 합성
단계 a): 비가교결합된 겔 형태의 CMC의 수화
0.93　g, 즉 2.20　mmol의 나트륨 CMC(Sigma에 의해 공급, 분자량: 약 1.0　MDa)의 중량이 용기에서 측정된다. 물(9.0　g) 중의 수산화나트륨 10% 수용액(매질에 도입된 2.5　mol/L, 즉 22.5　mmol의 HO-)이 첨가되고(RCR = 10.2:1), 조합된 혼합물은 실온 및 900　mmHg에서 스패튤라를 사용하여 약 90분 동안 균질화된다.
단계 b): 가교결합 및 치환
이전 단계에서 획득된 비가교결합된 CMC 겔에 BDDE(37　mg, 즉 0.18　mmol) 및 VSA(87　mg, 즉 0.67　mmol)가 첨가되고, 조합된 혼합물은 12-14℃의 온도에서 약 30분 동안 스패튤라에 의해 균질화된다. 조합된 혼합물은 그 후 80℃의 수조에 3시간 35분 동안 위치된다. 도입 가교도 DCI는 약 0.08이고, 도입 치환도 DSI는 약 0.30이다.
단계 c): 중화, 정제
pH를 안정화하고 수화 또는 팽창을 가능하게 하기 위해, 가교결합 및 치환된 최종 겔은 그 후 1N HCl의 첨가에 의해 중화되고 포스페이트 버퍼 배스에 위치되어, 30　mg/g의 CMC를 포함하는 겔을 획득하였다. 그 후, 상기 겔은 주사기에 패키징되기 전에 균질화된다. 이에 따라, 가교결합 및 치환된 CMC 히드로겔 G6b가 획득된다.
상기 겔은 과잉되게 액상이고, 과잉되게 분산되었으며, 충분히 탄성이 아닌 외관을 갖는다.
c) 겔 G6a 및 G6b의 탄성 분석
겔의 탄성이 실시예 2에 기재된 TA Instruments AR 2000　Ex 유량계에서 분석되고, 결과는 하기 표 13에 주어진다.
G6a G6b G6 REF6
탄성: 1 Hz에서 G'(Pa) 17 12 524 483
유동학적 데이터는 하기와 같이 관찰된 측면을 보여준다: 겔은 예상된 일관성을 갖지 않으며, 이들은 목표인 응용예에 필요한 점탄성을 나타내지 않음.고온(80℃) 및 농축된 수산화나트륨 용액의 사용이 다당류 네트워크를 분해시키고, 이에 따라 폴리머 사슬의 그래프팅 및 가교결합을 파괴한다.

Claims (32)

  1. 다당류를 이의 히드록시 관능기를 통해 수성 상에서 동시에 치환 및 가교결합하는 방법으로서,
    - 다당류를 수성 매질에 위치시키는 단계;
    - 상기 다당류를 치환기의 하나 이상의 전구체의 존재하에 놓는 단계;
    - 상기 다당류를 가교제의 존재하에 놓는 단계; 및
    - 치환 및 가교결합된 다당류를 획득하고 분리하는 단계;를 포함하며,
    상기 방법은 3.16　x 10-7 내지 0.32　mol/L 농도의 염기성 또는 산성 촉매의 존재하에 60℃ 이하의 온도에서 수행되는 것인 방법.
  2. 제1항에 있어서,
    하기 식에 의해 정의되는 반응성 촉매 비(reactive catalyst ratio: RCR)가 0.02:1 내지 3:1인 것을 특징으로 하는 방법:
    Figure pat00007
    .
  3. 제2항에 있어서,
    상기 반응성 촉매 비(RCR)는 0.2:1 내지 3:1인 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 촉매는 염기인 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 염기는 수산화나트륨 및 수산화칼륨 중에서 선택되는 무기 염기이고, 상기 촉매의 반응성 관능기는 OH- 이온인 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 무기 염기의 중량농도는 1.2　x10-5% 내지 1.15%인 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제4항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
    10- 6　mol/L　≤ [HO-]　≤　0.32　mol/L가 되도록, 촉매 HO-의 농도가 10- 6　mol/L 내지 0.32　mol/L인 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제4항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
    수성 반응 매질의 pH는 염기성이고, 8.5 내지 13.5인 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 촉매는 산인 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 제9항에 있어서,
    상기 산은 무기산 염산이고, 상기 촉매의 반응성 관능기는 H3O+ 이온인 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 제9항 또는 제10항에 있어서,
    상기 무기산의 중량농도는 1.14　x 10-5% 내지 1.3%인 것을 특징으로 하는 방법.
  12. 제9항에 있어서,
    상기 산은 글루탐산 및 아세트산으로 이루어진 군에서 선택되는 유기산인 것을 특징으로 하는 방법.
  13. 제12항에 있어서,
    상기 유기산의 중량농도는 0.25% 내지 2%인 것을 특징으로 하는 방법.
  14. 제9항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서,
    3.16　x 10- 7　mol/L ≤ [H3O+] ≤ 0.01　mol/L가 되도록, 촉매 H3O+의 농도가 3.16　x 10- 7 mol/L 내지 0.01　mol/L인 것을 특징으로 하는 방법.
  15. 제9항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서,
    수성 반응 매질의 pH는 산성이고, 2 내지 6.5인 것을 특징으로 하는 방법.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 다당류는 히알루론산 또는 이의 염 중 어느 하나, 키토산, 셀룰로스 및 이들의 유도체로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  17. 제16항에 있어서,
    상기 다당류의 분자량 Mw는 0.01　MDa 내지 4.0　MDa인 것을 특징으로 하는 방법.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 가교제는 이관능성 또는 다관능성인 것을 특징으로 하는 방법.
  19. 제18항에 있어서,
    상기 이관능성 또는 다관능성 가교제는 에틸렌 글리콜 디글리시딜 에테르, 부탄디올 디글리시딜 에테르, 폴리글리세롤 폴리글리시딜 에테르, 폴리에틸렌 글리콜 디글리시딜 에테르, 폴리프로필렌 글리콜 디글리시딜 에테르, 1,2,3,4-디에폭시부탄 또는 1,2,7,8-디에폭시옥탄과 같은 비스에폭시 또는 폴리에폭시, 디알킬 설폰, 디비닐 설폰, 포름알데히드 및 글루타르알데히드로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  20. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 치환기의 전구체는 치환 또는 비치환된 비닐, 치환 또는 비치환된 에폭시드, 치환 또는 비치환된 알릴, 케톤, 알데히드, 티오시아네이트, 할라이드, 이소시아네이트, 할로실리콘, 니트릴 및 술톤 관능기 중에서 선택된 단 하나의 반응성 관능기를 포함하는 분자로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  21. 제20항에 있어서,
    상기 치환기의 전구체는 설포네이트, 선형 또는 분지형 알킬, 치환 또는 비치환된 방향족, 설페이트, 티올, 단당류, 포스페이트, 포스포네이트, 카르보네이트 및 에스테르 기 또는 관능기 중에서 선택된 하나 이상의 유리한 관능기 또는 기를 추가적으로 포함하는 분자로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  22. 제20항 또는 제21항에 있어서,
    상기 치환기의 전구체는 알릴-설페이트, 비닐-설포네이트, 에폭시-설페이트 및 에폭시-알칸으로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  23. 제20항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 치환기의 전구체는 비닐술폰산 및 이의 염, 에폭시부탄 및 나트륨 알릴 설페이트로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  24. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서,
    획득된 상기 다당류는 하기 식에 의해 정의되는 도입 치환도(degree of substituent introduced: DSI)를 0.001 내지 4.00으로 나타내는 것을 특징으로 하는 방법:
    Figure pat00008
    .
  25. 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서,
    획득된 상기 다당류는 하기 식에 의해 정의되는 도입 가교도(degree of crosslinking agent introduced: DCI)를 0.001 내지 0.5로 나타내는 것을 특징으로 하는 방법:
    Figure pat00009
    .
  26. 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서,
    39℃ 내지 60℃의 온도에서 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
  27. 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서,
    15분 내지 48시간의 기간 동안 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
  28. 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서,
    획득된 상기 다당류를 세척하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  29. 제1항 내지 제28항 중 어느 한 항의 방법에 따라 획득된 다당류를 포함하는 조성물.
  30. 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항의 방법에 따라 획득된 다당류를 점성보충(viscosupplementation) 조성물의 제형에 사용하는 방법.
  31. 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항의 방법에 따라 획득된 다당류를 주름의 필링(filling)용 조성물의 제형에 사용하는 방법.
  32. 살균 주사기에 패키징된 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항의 방법에 따라 획득된 다당류를 포함하는 키트.
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