KR20190101392A - 혈소판-유래 성장 인자 b 돌연변이, 이의 제조 방법, 및 그 용도 - Google Patents

혈소판-유래 성장 인자 b 돌연변이, 이의 제조 방법, 및 그 용도 Download PDF

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Abstract

혈소판-유래 성장 인자 B 유도체, 이의 코딩 핵산 분자, 및 상기 핵산 분자를 갖는 벡터 및 숙주 세포가 제공된다. 또한 돌연변이의 제조 방법 및 세포 분열, 세포 증식, 상처 치유, 피부 재생, 뼈 및 치아 결함 재생, 및 관절 치료를 촉진하는 약제의 제조를 위한 돌연변이의 용도를 제공한다.

Description

혈소판-유래 성장 인자 B 돌연변이, 이의 제조 방법, 및 그 용도{Platelet-derived Growth Factor B Mutant, Preparation Method Therefor, and Use Thereof}
본 발명은 혈소판 유래의 성장 인자 B 유도체에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명은 혈소판 유래 성장 인자 B 돌연변이, 상기 돌연변이를 코딩하는 핵산 분자, 상기 핵산 분자를 함유하는 벡터 및 숙주 세포에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 상기 돌연변이의 제조 및 정제 방법과 관련되고, 또한 세포 분열 및 증식 촉진, 상처 치유 촉진, 피부 재생, 뼈 및 치아 결함 재생 및 관절 치료(repair)를 위한 약제의 제조를 위한 상기 돌연변이의 용도에 관한 것이다.
혈소판-유래 성장 인자(PDGF)는 다양한 세포에 의해 생성 될 수 있으며, 간질 유래 세포의 증식을 자극 할 수 있는 폴리펩타이드이다. 1970 년대에 Ross 등이 혈소판으로부터 처음 발견하여 명명하였다[1]. 지금까지 총 4 개의 PDGF 단량체, 즉 PDGF-A, PDGF-B, PDGF-C 및 PDGF-D가 발견되었다. 상기 단량체들은 사슬 내(intrachain) 및 사슬 간(interchain) 이황화 결합을 통해 5 종의 동종(homo)- 또는 이종(hetero)- 이량체(dimer)를 형성한다: PDGF-AA, PDGF-BB, PDGF-AB, PDGF-CC 및 PDGF-DD [2, 3]. PDGF 유전자와 단백질은 혈관 내피 성장 인자(VEGFs)와 태반 성장 인자(PIGF)를 포함하는 구조적 및 기능적으로 관련된 성장 인자들에 속하는 것으로 일반적으로 인정된다[4]. PDGF는 그의 수용체 PDGF-R을 활성화시킴으로써 생리학적 역할을 한다. PDGF-R은 티로신 키나아제 수용체에 속하는 PDGFR-α 및 PDGFR-β를 모두 포함한다. 수용체에 대한 리간드의 결합은 수용체 단량체의 이량체화(dimerization)를 촉발시켜 자가 인산화 및 세포 내 티로신 잔기의 활성화를 유도한다. 두 수용체는 Ras-MAPK, PI3K 및 PLC-γ와 같은 다중 신호 전달 경로에서 중요한 분자를 활성화하고[5] 관련 유전자의 전사를 활성화하고, 세포 성장을 자극하며, 아팝토시스를 억제하고, 분화를 촉진하고 지향 운동(oriented movement)을 유도하며, 이동(migration) 등 다양한 생물학적 기능을 수행한다.
PDGF-b 유전자는 22번 염색체에 위치하고 있으며, 7개의 엑손을 포함한다. 상기 유전자는 241개의 아미노산으로 구성된 전구체 단백질을 암호화하고, 단백질 분해 처리(proteolytic processing)에 의해 형성된 최종 성숙 생성물은 109개의 아미노산으로 이루어진 폴리펩타이드이고, 분자량이 12.3 kD이다. 생물체에서 PDGF-B 단백질의 활성 형태는 두 단량체로부터 이황화 결합에 의해 형성된 동종이량체(homodimer)인 PDGF-BB 또는 이종이량체(heterodimer)인 PDGF-AB이다[6]. 각각의 PDGF-B 단백질 단량체는 8개의 고도로 보존된 시스테인 잔기를 함유하고, 6개의 시스테인은 사슬 내부 이황화 결합을 형성하고(Cys I-VI, III-VII, V-VIII), 다른 둘은 상응하는 단량체와의 사슬 간 이황화 결합을 형성하며(Cys II-IV)[7], 모두 함께 성장 인자 도메인-특성의 PDGF 단백질 패밀리, 즉 시스틴 노트(cystine knots)를 형성한다. 이러한 사슬 내부- 및 사슬 간-이황화 결합은 PDGF-B 이량체 단백질의 복합 공간 구조(complex spatial structure)를 구성한다(도 1B).
또한, 단백질의 발현 및 합성 동안 PDGF 단백질의 상이한 스플라이싱 형태들이 존재하고, 이에 의해 가공 및 성숙시의 PDGF 단백질은 다양한 구조적 형태를 나타낸다. 인간 혈소판 추출물로부터 분리되고 정제된 PDGF-BB의 N-말단 아미노산 서열 분석은 적어도 세가지 다른 스플라이싱 형태들인, 20% Ser1, 45% Thr6 및 35% Thr33의 존재를 보여준다. 이러한 절단 산물의 이질성(heterogeneity)으로 인해, PDGF-BB를 정제할 때, 다양한 절단 형태의 단백질의 비율이 조절가능하지 않다[8].
본 발명의 발명자들은 광범위한 연구를 수행해왔고, 부위-특이적 프로테아제 분해 및/또는 글리코실화 변형이 다양한 PDGF-B의 존재를 담당하는 주요 원인이라는 것을 알아내었으며, 결국 부위 돌연변이(site mutation)에 의해 PDGF-B 돌연변이를 얻었다. 상기 돌연변이는 크게 증진된 균질성(homogeneity)을 가지며, 여전히 PDGF-B 단백질의 활성을 유지한다.
본 발명의 제 일 측면은 야생형(wild-type) 혈소판 유래의 성장 인자 B의 아미노산 위치 101 및 109에서의 돌연변이를 갖고(여기에서의 아미노산 부위 위치의 기재는 109개의 아미노산 잔기를 포함하는 성숙한 PDGF-B에 모두 기초하며, 이하 동일하다), 혈소판-유래 성장 인자 B 활성을 갖는, 혈소판-유래 성장 인자 B 돌연변이에 관한 것이다.
본 발명의 제 일 측면 중 어느 하나에 따른 혈소판-유래 성장 인자 B 돌연변이는 아미노산 위치 6에서의 돌연변이를 갖고, 혈소판-유래 성장 인자 B의 활성을 갖는다.
본 발명의 제 일 측면 중 어느 하나에 따른 혈소판-유래 성장 인자 B 돌연변이는 아미노산 위치 32 및/또는 33에서의 돌연변이를 갖고, 혈소판-유래 성장 인자 B의 활성을 갖는다.
본 발명의 제 일 측면 중 어느 하나에 따른 혈소판-유래 성장 인자 B 돌연변이는 야생형 혈소판-유래 성장 인자 B와 비교하여 5개 아미노산의 N-말단 결실을 갖고, 혈소판-유래 성장 인자 B의 활성을 갖는다.
본 발명의 일 실시예에서, 돌연변이는 아미노산 위치 6, 101 및 109에서 알라닌으로의 돌연변이를 갖는다.
본 발명의 다른 실시예에서, 돌연변이는 아미노산 위치 101 및 109에서 알라닌으로의 돌연변이를 갖는다.
본 발명의 제 일 측면 중 어느 하나에 따른 혈소판-유래 성장 인자 B 돌연변이는 아미노산 위치 32 및/또는 33에서 프롤린, 발린, 또는 이소류신으로의 변이를 갖는다.
본 발명의 일 실시예에서, 돌연변이는 아미노산 위치 32에서 프롤린, 발린, 또는 이소류신, 바람직하게는 프롤린에 대한 프롤린에 대한 돌연변이를 갖는다.
본 발명의 제 일 측면 중 어느 하나에 따른 혈소판-유래 성장 인자 B 돌연변이에 있어서, 상기 혈소판-유래 성장 인자 B는 포유류 유래 혈소판-유래 성장 인자 B이고, 상기 포유류는 예를 들어, 인간 또는 마우스이다.
본 발명의 일 실시예에서, 혈소판-유래 성장 인자 B 돌연변이는 5개 아미노산의 N-말단 결실, 아미노산 위치 6, 101 및 109에서의 알라닌으로의 돌연변이, 및 아미노산 위치 32에서의 프롤린으로의 돌연변이를 갖는다.
본 발명의 일 실시예에서, 혈소판-유래 성장 인자 B 돌연변이는 5개 아미노산의 N-말단 결실, 아미노산 위치 101 및 109에서의 알라닌으로의 돌연변이, 및 아미노산 위치 32에서의 프롤린으로의 돌연변이를 갖는다.
본 발명의 일 실시예에서, 혈소판-유래 성장 인자 B 돌연변이는 5개 아미노산의 N-말단 결실, 아미노산 위치 6, 101 및 109에서의 알라닌으로의 돌연변이, 및 아미노산 위치 32에서의 발린으로의 돌연변이를 갖는다.
본 발명의 일 실시예에서, 혈소판-유래 성장 인자 B 돌연변이는 5개 아미노산의 N-말단 결실, 아미노산 위치 6, 101 및 109에서의 알라닌으로의 돌연변이, 및 아미노산 위치 32에서의 이소류신으로의 돌연변이를 갖는다.
본 발명은 또한 상술한 다양한 기술적 해결책의 조합을 포함한다.
본 발명의 특정 실시예에서, 돌연변이의 아미노산 서열은 서열번호 3 또는 서열번호 5에 기재된 서열이다.
본 발명의 제 일 측면 중 어느 하나에 따른 혈소판-유래 성장 인자 B 돌연변이는 그 아미노산 서열 중 하나 이상의 아미노산의 치환, 결실 또는 부가를 갖고, 혈소판-유래 성장 인자 B의 활성을 갖는다.
단백질의 비 필수적 위치에서 하나 이상의 아미노산의 치환, 결실 또는 첨가가 단백질의 활성에 영향을 줌이 없이 만들어 질 수 있다는 것은 당업자에게 잘 알려져 있다. 본 발명에 있어서, 상술한 아미노산 돌연변이 위치와 다른 비 필수적 위치에서의 하나 이상의 아미노산의 치환, 결실 및/또는 부가에 의해 생성되고, 여전히 혈소판-유래 성장 인자 B의 활성을 유지하는 돌연변이가 또한 본 발명의 보호 범위 내에 있다.
본 발명의 제 이 측면은 본 발명의 제 일 측면 중 어느 하나에 따른 2개의 혈소판-유래 성장 인자 B 돌연변이가 사슬 내부- 및/또는 사슬 간-이황화 결합을 통해 형성되거나, 또는 본 발명의 제 일 측면 중 어느 하나에 따른 하나의 혈소판-유래 성장 인자 B 돌연변이와 혈소판-유래 성장 인자 A의 사슬 내부- 및/또는 사슬 간-이황화 결합에 의해 형성된 혈소판-유래 성장 인자 동종이량체 또는 이종 이량체에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 혈소판-유래 성장 인자 동종이량체 또는 이종이량체는 야생형 혈소판-유래 성장 인자와 동일한 방법으로 형성된다.
본 발명의 일 실시예에서, 본 발명의 제 일 측면 중 어느 하나의 두 혈소판-유래 성장 인자 B 돌연변이는 사슬 내부- 및 사슬 간-이황화 결합을 통해 PDGF-BB 돌연변이를 형성한다.
본 발명의 제 삼 측면은 본 발명의 제 일 측면 중 어느 하나의 혈소판-유래 성장 인자 B 돌연변이를 암호화하는 핵산 분자에 관한 것이다.
본 발명의 제 삼 측면 중 어느 하나에 따른 핵산 분자는 서열번호 4, 서열번호 6-9로 구성된 군으로부터 선택된 핵산 서열을 갖는다.
본 발명의 제 사 측면은 본 발명의 제 삼 측면 중 어느 하나에 따른 핵산 분자를 포함하는 벡터에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 발현 벡터는 발현에 사용된 숙주 세포에 따라 당업자가 선택할 수 있으며, 예를 들어, 효모 세포 또는 포유류 세포에서의 발현에 적합한 벡터를 선택할 수 있다.
본 발명의 이 실시예에 있어서, 상기 벡터는 pMEX9K이다.
본 발명의 제 오 측면은 본 발명의 제 사 측면 중 어느 하나의 벡터를 포함하는 숙주 세포에 관한 것이다.
본 발명의 제 오 측면 중 어느 하나에 따른 숙주 세포는 진핵 세포, 예를 들어, 효모 세포, 포유류 세포 또는 곤충 세포이다.
본 발명의 제 오 측면 중 어느 하나에 따른 숙주 세포는 효모 세포, 예를 들면, 피키아 파스토리스(Pichia pastoris), 사카로미세스 세레비시애(Saccharomyces cerevisiae), 클루베로미세스 락티스 (Kluyveromyces lactis), 한세누라 (Hansenula), 칸디다(Candida) 또는 토룰로프시스(Torulopsis)이다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 피키아 파스토리스 세포 주는 GS115이다.
본 발명의 제 오 측면 중 어느 하나에 따른 숙주 세포는 포유류 세포, 예를 들어, CHO 세포, BHK 세포, NS0 세포, SP2/0 세포, HEK-293 세포, COS 세포 등이다.
본 발명은 또한 본 발명의 제 오 측면 중 어느 하나의 숙주 세포를 배양하는 단계를 포함하는
본 발명은 또한 본 발명의 제 오 측면 중 어느 하나의 숙주 세포를 배양, 발현(예를 들어, 유도된 발현) 및 선택적으로 정제하는 단계를 포함하는, 본 발명의 제 일 측면 중 어느 하나의 혈소판-유래 성장 인자 B 돌연변이의 제조 방법에 관한 것이다.
본 발명에 따른 제조 방법은 다음의 단계들을 포함한다:
1) 본 발명의 제 오 측면 중 어느 하나의 숙주 세포를 배양 배지 내로 접종하고, 이어서 단계적으로 배양하고 증식시키는 단계;
2) 숙주 세포를 수집하고, 제조합 세포를 배지 내로 재현탁시키고, 메탄올을 첨가하여 발현을 유도하는 단계;
3) 유도 발현의 완료 후, 배양 상등액을 수집 및 정제하여 혈소판-유래 성장 인자 B 단백질을 수득하는 단계.
본 발명 중 어느 하나에 따른 제조 방법은 다음 중 하나 이상을 특징으로 한다:
(1) 단계 1)에서의 숙주 세포는 단일 클론 세포주이다;
(2) 단계 1)에서 기술된 단계적 배양 및 증식은 2-스테이지 배양 및 증식을 지칭하고, 상기 배양 온도는 28-30℃이며, 상기 세포는 각 스테이지에서 1-12의 OD600, 예를 들어 2-6까지 배양된다;
(3) 단계 2)에서 발현을 유도하기 위한 온도는 약 28℃이다;
(4) 단계 2)에서 메탄올의 최종 농도는 0.3-1.0%(v/v), 예를 들어 0.4-0.8%(v/v), 예를 들어 0.5%(v/v)이다;
(5) 단계 2)에서 유도된 발현을 위한 시간은 48-96 시간, 예를 들어 72시간이다;
(6) 단계 3)에서 정제 단계는 소수성 상호작용 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피 및 겔 여과 크로마토그래피를 연속적으로 포함한다.
본 발명의 제 육 측면은 혈소판-유래 성장 인자 B 또는 그의 돌연변이를 정제하는 방법에 관한 것이고, 혈소판-유래 성장 인자 B 또는 이의 돌연변이를 함유하는 배양 상등액 또는 세포 파쇄물에 대해 연속적으로 소수성 상호작용 크로마토그래피, 이온 교환 프로마토그래피 및 겔 여과 크로마토그래피를 실시하는 단계를 포함한다.
본 발명의 제 육 측면 중 어느 하나에 따른 정제 방법에서, 상기 혈소판-유래 성장 인자 B 돌연변이는 본 발명의 제 일 측면 중 어느 하나의 혈소판-유래 성장 인자 B 돌연변이이다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 소수성 상호작용 크로마토그래피에 이용되는 크로마토그래피 컬럼 매질은 페닐 세파로오스 6 패스트 플로우(Phenyl Sepharose 6 Fast Flow)이다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 이온 교환 크로마토그래피에 이용되는 크로마토그래피 매질은 소스 30S(Source 30S)이다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 겔 여과 크로마토그래피에 이용되는 크로마토그래피 매질은 힐로드 슈퍼덱스 75 프랩 그레이드(Hiload Superdex 75 prep grade)이다.
본 발명의 제 육 측면 중 어느 하나에 따른 정제 방법에 있어서:
상기 소수성 상호작용 크로마토그래피는 다음의 단계들을 포함한다:
(1) 혈소판-유래 성장 인자 B 또는 이의 돌연변이를 함유하는 배양 상등액 또는 세포 파쇄물의 전도도(conductivity)를 컨디셔닝 버퍼로 조절하는 단계; 상기 컨디셔닝 버퍼가 첨가된 최종 계(final system)는 10-50 mM 포스페이트 버퍼, 0.8-1 M (NH4)2SO4, pH 6.8-7.5이고;
(2) 평형화 버퍼(equilabrating buffer)으로 컬럼을 평형화시키는 단계; 상기 평형화 버퍼의 제형은 10-50 mM 포스페이트 버퍼, 0.8-1 M (NH4)2SO4, pH 6.8-7.5이며;
(3) 컬럼 내로 샘플을 로딩 후, 평형화 버퍼로 컬럼을 워싱하는 단계;
(4) 일루션 버퍼로 일루션하고 목적 단백질을 수집하는 단계; 상기 일루션 버퍼의 제형은 10-50 mM 포스페이트 버퍼, 30%-50% 에틸렌 글리콜, pH 6.8-7.5이고;
상기 이온 교환 크로마토그래피는 다음 단계를 포함하며:
(1) 평형 버퍼로 소수성 상호작용 크로마토그래피의 일루션 피크를 전도도 6 mS/cm 이하가 되도록 희석시키는 단계; 상기 평형 버퍼의 제형은 10-50 mM 포스페이트 버퍼, pH 6.8-7.5;
(2) 평형화 버퍼로 컬럼을 평형화시키는 단계;
(3) 컬럼으로 샘플을 로딩 후, 평형화 버퍼로 컬럼을 워싱하는 단계;
(4) 일루션 버퍼 구배를 일루션하고, 목적 단백질을 수집하는 단계; 상기 일루션 버퍼의 제형은 10-50 mM 포스페이트 버퍼, 0.8-1.2 mM NaCl, pH 6.8-7.5이고;
상기 겔 여과 크로마토그래피는 다음 단계를 포함한다:
(1) 포스페이트 버퍼로 컬럼을 평형화시키는 단계; 상기 포스페이트 버퍼의 제형은 10-50 mM 포스페이트 버퍼, 0.1-0.5 M NaCl, pH 6.8-7.5이고;
(2) 이온 교환 크로마토그래피의 일루션 피크를 로딩하는 단계; 각각의 로딩 부피는 컬럼 부피의 0.3 내지 4% 이하(예를 들어, 3%)이며;
(3) 단계 (1)에서의 포스페이트 버퍼로 컬럼을 워싱하는 것을 지속하고, 목적 단백질을 수집하며, 정제된 혈소판-유래 성장 인자 B 또는 이의 돌연변이를 얻는 단계. 본 발명에 있어서, 상기 포스페이트 버퍼의 제형은 종래 잘 알려져 있다. 본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 포스페이트 버퍼는 0.0144 몰/L Na2HPO4 및 0.0056 몰/L NaH2PO4, pH 6.8-7.5를 함유하는 20 mM PB 용액이다.
본 발명에 있어서, 포스페이트 버퍼의 제형이 종래 잘 알려져 있다. 본 발명의 실시예에 있어서, 상기 포스페이트 버퍼는 PBS 용액 및 이의 제형은 10-50 mM PB 용액, 0.15 M NaCl, pH 6.8-7.5이다.
본 발명의 실시예에 있어서, 크로마토그래피의 각 단계를 위한 버퍼의 pH 값은 7.2이다.
본 발명의 실시예에 있어서, 크로마토그래피의 각 단계의 포스페이트 버퍼의 농도는 20 mM이다.
본 발명의 특정 실시예에 있어서, 소수성 상호작용 크로마토그래피는 다음과 같이 수행된다. (1) 효모 발현 상등액은 컨디셔닝 버퍼(60 mM PB, 3M (NH4)2SO4, pH 7.2)의 1/2 부피로 전도도를 조절한다. (2) 컬럼은 평형화 버퍼(20 mM PB, 1M (NH4)2SO4, pH 7.2)로 평형화된다. (3) 샘플을 컬럼에 넣은 후, 베이스 라인이 평평해질 때까지 컬럼을 평형화 버퍼로 세척한다. (4) 컬럼을 일루션 버퍼(20 mM PB, 50% 에틸렌 글리콜, pH 7.2)로 일루션시켜 목적 단백질을 수집한다.
본 발명의 특정 실시예에 있어서, 이온 교환 크로마토그래피를 다음과 같이 수행된다. (1) 컬럼은 PBS 버퍼(20 mM PB, 0.15 M NaCl, pH 7.2)로 평형화된다; (2) 소스 30S(Source 30S) 일루션 피크는 루프(loop)로 로딩되고, 각각의 로딩 부피는 컬럼 부피의 3% 이하이다. (3) 컬럼을 PBS로 세척하여 목적 단백질을 획득한다.
본 발명은 추가적으로 세포 분열 촉진, 증식, 상처 치유 촉진, 피부 재생, 뼈 및 치아 결함(defect) 재생, 관절 치료(repair)를 위한 약제의 제조를 위한 본 발명의 제 일 측면 중 어느 하나에 따른 혈소판-유래 성장 인자 B 돌연변이의 용도에 관한 것이다.
본 발명은 추가적으로 세포 분열 촉진, 증식, 상처 치유 촉진, 피부 재생, 뼈 및 치아 결함(defect) 재생, 관절 치료(repair)를 위한 방법에 관한 것이고,
본 발명의 제 일 측면 중 어느 하나의 혈소판-유래 성장 인자 B 돌연변이의 유효량을 이를 필요로하는 대상(subject)에 투여하는 단계를 포함한다.
본 발명은 추가적으로 본 발명의 제 일 측면 중 하나의 혈소판-유래 성장 인자 B 돌연변이에 특이적으로 결합할 수 있는 항체에 관한 것이다.
본 발명은 또한 야생형 혈소판-유래 성장 인자의 아미노산 서열을 엔지니어링하는 단계를 포함하고, 상기 엔지니어링은 다음 (a) 내지 (c) 중 하나 이상을 포함하는, 혈소판-유래 성장 인자의 발현을 균질화하는 방법에 관한 것이다:
a) 아미노산 위치 101 및 109에서의 돌연변이;
b) 아미노산 위치 6에서의 돌연변이;
c) 아미노산 위치 32 및/또는 33에서의 돌연변이;
d) 5개 아미노산의 N-말단 결실.
본 발명의 어느 하나에 따른 방법은 다음 i)-iii) 중 하나 이상을 특징으로 한다:
i) 아미노산 위치 101 및 109에서의 아미노산을 알라닌으로 돌연변이시킴;
ii) 위치 6에서의 아미노산을 알라닌으로 돌연변이시킴;
iii) 위치 32 및/또는 33에서의 아미노산을 프롤린, 발린, 또는 이소류신으로 돌연변이시킴.
본 발명 중 어느 하나에 따른 방법은 발현을 위한 진핵 발현 시스템, 예컨대 효모 세포 발현 시스템 및 포유류 세포 발현 시스템을 이용한다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 엔지니어링은 5개 아미노산의 N-말단 결실, 아미노산 위치 6, 101 및 109에서의 알라닌으로의 돌연변이, 및 아미노산 위치 32에서의 프롤린으로의 돌연변이를 지칭한다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 엔지니어링은 5개 아미노산의 N-말단 결실, 아미노산 위치 101 및 109에서의 알라닌으로의 돌연변이, 및 아미노산 위치 32에서의 프롤린으로의 돌연변이를 지칭한다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 엔지니어링은 5개 아미노산의 N-말단 결실, 아미노산 위치 6, 101 및 109에서의 알라닌으로의 돌연변이, 및 아미노산 위치 32에서의 발린으로의 돌연변이를 지칭한다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 엔지니어링은 5개 아미노산의 N-말단 결실, 아미노산 위치 6, 101 및 109에서의 알라닌으로의 돌연변이, 및 아미노산 위치 32에서의 이소류신으로의 돌연변이를 지칭한다.
본 발명의 특정 실시예에 있어서, 엔지니어링 된 혈소판-유래 성장 인자의 아미노산 서열은 서열번호 3 또는 서열번호 5에 기재된 서열이다.
본 발명은 또한 상기-기술된 다양한 기술적 해결책의 조합을 포함한다.
본 발명에 있어서, 벡터는 예를 들어, 클로닝 벡터 또는 발현 벡터이다. 상기 벡터는 본 발명에 따른 핵산 분자를 함유하고, 상기 벡터는, 예를 들어 상술한 핵산 분자를 클로닝 벡터 또는 발현 벡터 내로 삽입하는 것에 의해 얻을 수 있거나 또는 인위적 합성에 의해 얻을 수 있다.
상술한 발현 벡터는, 예를 들어 원핵 발현 벡터, 진핵 발현 벡터, 파지 벡터 또는 바이러스 벡터이다. 원핵 생물 발현 벡터는, 예를 들어 pET 벡터 또는 pGEX 벡터이다. 진핵 세포 발현 벡터는, 예를 들어 pcDNA3.1, pEGFP-C1, pPIC9K, pMEX9K, pPICZ, pPICZa, pFastBac, pPIC6aA, pPIC3.5K, pGAPZaA 또는 pAO815이다. 파지 벡터는, 예를 들어 λ 파지 벡터, λgt, 또는 λgt-λB이다. 바이러스 벡터는, 예를 들어 레트로바이러스, 렌티 바이러스, 아데노 바이러스 또는 아데노-관련 바이러스 벡터이다. 본 발명의 한 구체예에서, 벡터는 pMEX9K이다.
본 발명에서, 숙주 세포는 원핵 세포 (예컨대, E. coli 세포) 또는 진핵 세포 일 수 있다. 진핵 세포는 예를 들어, 효모 세포, 포유 동물 세포, 또는 곤충 세포이다. 숙주 세포는 상술한 핵산 분자 또는 벡터의 뉴클레오타이드 서열을 원핵 세포 또는 진핵 세포에 도입/형질 감염시킴으로써 얻을 수 있다.
본 발명에서, 효모 세포주는 당 업계에 잘 공지되어 있으며, X33, KM71, KM71H, GS115, SMD1168, SMD1163, SMD1168H 및 SMD1163H를 포함하지만 이에 한정되지는 않는다.
본 발명에서, 특정 핵산 또는 벡터로 형질 감염된 숙주 세포는 당 업계에 공지 된 임의의 종류의 형질감염 방법을 사용하여 수득 할 수 있다. 예를 들어, 핵산은 일렉트로포레이션 또는 마이크로인젝션에 의해 세포 내로 도입 될 수있거나; 또는, 대안적으로 FuGENE 6, X-tremeGENE 및 LipofectAmine과 같은 리포 펙틴 제제가 사용될 수 있거나; 또는 대안적으로 핵산은 레트로바이러스, 렌티바이러스, 아데노바이러스 또는 아데노-관련 바이러스에 기초한 적절한 바이러스 벡터에 의해 세포 내로 도입 될 수있다.
본 발명에있어서, 발현 균질성(expression homogeneity)이란, 전기 영동에 있어서의 로딩량이 10 ㎍ 이상인 경우, 환원 SDS-PAGE 전기 영동 분석은 쿠마시 브릴리언트 블루 염색에 의해 나타난 바와 같이 목적 단백질이 단일 밴드인 것을 나타내고, Image J 또는 Bandscan와 같은 소프트웨어가 95% 이상의 순도를 나타내는 것을 의미한다.
당업자는 상이한 단백질에 대한 다양한 기술을 시도하고 사용함으로써 단백질의 더욱 균질한 발현을 달성 할 수 있다.
본 발명에있어서, 야생형 혈소판-유래 성장 인자 B는 길이가 109 아미노산인 비-돌연변이 된 혈소판-유래 성장 인자 B이고; 각 부위(예를 들면, 돌연변이 부위, 글리코실화 부위, 절단 부위)의 기재는 야생형 혈소판-유래 성장 인자 B를 기준으로한다.
본 발명에 있어서, 야생형 혈소판-유래 성장 인자 B의 6번, 101번 및 109번 위치의 아미노산은 모두 트레오닌(Thr)이고; 야생형 혈소판-유래 성장 인자 B의 32번 및 33번 위치의 아미노산은 아르기닌(Arg)이며; 야생형 혈소판-유래 성장 인자 B의 N-말단의 처음 5 개의 아미노산은 세린(Ser), 류신(Leu), 글리신(Gly), 세린(Ser) 및 류신(Leu)이다.
본 발명에서, 용어 "약"은 90% 내지 110%의 범위, 예를 들어 값의 95% 내지 105% 내에 있음을 의미한다.
본 발명에 있어서, PDGF-B 돌연변이는 돌연변이에 의해 얻어지고, 단백질의 균질성이 현저히 향상되며, 상기 돌연변이는 PDGF-B 단백질의 활성을 유지한다.
도 1은 PDGF-B 단백질의 구조의 개략도를 나타낸다. A: PDGF-B 전구체는 성숙 단백질이 되도록, 단백질 분해(proteolysis)에 의해, N-말단 시그널 펩타이드, 프로펩타이드, 및 C-말단 프로펩타이드 서열이 제거된다. ▲ 는 단백질 가수분해 부위를 나타낸다;
B: 두 개의 PDGF-B 단량체는 사슬 간의 이황화물 결합을 통해 PDGF-BB 동종이량체를 형성하고, 각각의 PDGF-B 단량체는 8개의 시스테인을 함유하고, 3쌍의 사슬 내 이황화 결합(C16-C60, C49-C97, C53-C99) 및 두 쌍의 사슬 내부 이황화 결합(C-43-C52, C52-C43)을 형성한다. SP: 신호 펩타이드; PRO: 성장 인자 도메인 앞에 위치한 프로-시퀀스.
도 2는 피키아 파스토리스(Pichia pastoris)에 의해 발현되고 분비되는 PDGF-BB의 SDS-PAGE 전기영동 분석을 나타낸다. 비-환원(좌) 및 환원(우) SDS-PAGE 분석을 발효 및 정제된 재조합 PDGF-BBThr6의 3가지 다른 배치(batch)에서 수행하였다. 비-환원 조건하에서, 단백질은 단일 밴드이다. DTT 처리에 있어서, PDGF-B 단량체는 불균일 분자량을 갖는 다양한 형태를 나타낸다.
도 3은 단백질 분해 및 글리코실화의 공동-효과는 PDGF-BThr6의 여러 단량체의 형성에 기여한다는 것을 나타낸다. (A) PDGF-BThr6 단백질은 N-말단 아미노산 분석을 위해 환원 조건 하에서 SDS-PAGE에 의해 분리하였다. 첫번째, 두번째, 및 세번째 밴드에서의 N-말단의 첫 다섯 아미노산 잔기는 모두 TIATP이고, 네번째 및 다섯번째 밴드에서의 N-말단의 첫 다섯 아미노산 잔기는 TNANF이며, 이는 Arg32-Thr33에서의 프로테아제 절단이 발생함을 시사한다. (B) PDGF-BThr6 단백질에 대해 환원 조건 하에서 WB(중간) 및 당단백질 염색(우) 분석을 수행하였다. WB 검출 밴드는 쿠마시 브릴리언트 블루 염색(좌)의 3 및 5 밴드에 해당하고, 당단백질 염색 밴드는 쿠마시 브릴리언트 블루 염색의 1, 2, 및 4 밴드에 해당한다. (C) PDGF-BThr6 단백질을 환원 조건 하에서 PNGase F로 처리하고, 당단백질을 염색하였다. PNGase F로 치료하기 전과 후에 밴드 타입, 분자량(좌) 및 당단백질 염색 결과에 변화는 없었다. IFN-ω는 글리코시다제 분해 및 당단백질 염색에 대한 양성 대조군으로서 역할을한다.
도 4는 PDGF-BThr6 단백질 서열의 O-링크된 글리코실화 부위의 예측 결과를 나타낸다. Thr6, Thr101 및 Thr109는 잠재적인 O-링크된 글리코실화 변형 부위이다.
도 5는 HPLC 검출시 정제된 단백질 PDGF-M2를 순도 시험한 결과를 나타낸다.
도 6은 피키아 파스토리스(Pichia pastoris)에서 발현된 PDGF-B의 번역 후 변형 부위의 분석결과를 나타낸다. (A) PDGF-M1 및 PDGF-M2 돌연변이의 부위 돌연변이의 개략도이다. (B) WB 검출은 단일밴드로서, PDGF-M1 및 PDGF-M2 단량체 및 두 밴드로서 대조구 PDGF-BThr6를 보여준다. (C) PDGF-M1 및 PDGF-M2 단량체는 SDS-PAGE에 의해 검출되었으며, 쿠마시 브릴리언트 블루 염색 결과는 단일 단백질 밴드로서 PDGF-M2를 보여주었고, 두 단백질 밴드로서 PDGF-M1을 보여주었다(도 상의 화살표에 의해 나타내었다). (D) 당단백질 염색은 PDGF-M1 및 PDGF-M2 단백질 단량체를 거의 검출할 수 없다는 것을 보여준다.
도 7은 PDGF-M2의 생물학적 활성은 PDGF-BBThr6의 생물학적 활성보다 높으며, 이들 사이에는 통계적으로 유의한 차이가 있다. 실험은 EC50을 평균±표준편차로서 표현하여 3회 반복하였다, P=0.039.
도 8은 Arg32 돌연변이가 발현 상에 미치는 효과를 나타낸다. (A) 각각의 코돈-최적화된 균주 PDGF-IM-P, PDGF-IM-V 및 PDGF-IM-I의 7 클론의 발현 생성물의 SDS-PAGE 결과들을 나타낸다. PDGF-IM-P의 단백질 발현 양은 다른 두 균주보다 유의하게 높았다. (B) 코돈 최적화된 균주 PDGF-IM-P, PDGF-IM-V 및 PDGF-IM-1을 각각 G418 내성에 의한 다중 삽입 카피에 대해 스크리닝하였다. 6개의 클론을 튜브 내에서 발현 시키기 위해 2.0 mg/ml 또는 4.0 mg/ml의 G418 농도하에서 선택하였다. SDS-PAGE 분석 결과는 PDGF-IM-P 고(high)-카피 스크리닝 주의 발현량이 다른 두 균주의 발현량보다 유의하게 높다는 것을 보여준다.
도 9는 PDGF-B 야생형 및 PDGF-M2 돌연변이의 LC/MS 플롯을 나타낸다.
본 발명의 구현예들을 이하 실시예와의 조합으로 자세히 설명할 것이지만, 당업자라면 하기 실시예들은 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이며 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 해석되어서는 안됨을 이해할 것이다.
실시예에서 구체화된 특정 조건이 없는 경우는 일반적인 조건, 또는 제조자에 의해 추천된 조건 하에서 수행되어야 한다. 제조자가 명시되지 않은 시약 또는 장비는 모두 상업적으로 이용 가능한 기존 제품들이다.
이전 연구들에서, 본 발명자들은 성공적으로 피키아 파스토리스(Pichia pastoris) 발현 시스템을 이용하여, N-말단에서 5개의 아미노산이 결실된 rhPDGF-BBThr6을 발현 수준 100 mg/L까지 발현시켰다(CN 특허 번호: ZL200410068993.2 참조). PDGF-BThr6는 생물학적 활성을 손상시키지 않으면서 발현된 단백질의 균질성을 보장하기 위해 연구 대상으로 선택되었다. 그러나, 추가 연구들은 피키아 파스토리스(Pichia pastoris)에 의해 발현된 rhPDGF-BThr6 단량체는 여전히 10 내지 15 kDa에 걸친 불균일 분자량을 가진 다양한 형태를 나타낸다는 것을 증명하였다(도 2).
다음 실시예들은 rhPDGF-BThr6에 기초한 엔지니어링에 의해 수행되며, 부위 또는 위치의 모든 설명들은 야생형 PDGF-B(109 아미노산)에 기초한다.
야생형 PDGF-B의 아미노산 서열의 Genbank 번호는 NM-002608.2이다.
rhPDGF-BBThr6의 아미노산 서열은 다음과 같다:
TIAEPAMIAECKTRTEVFEISRRLIDRTNANFLVWPPCVEVQRCSGCCNNRNVQCRPTQVQLRPVQVRKIEIVRKKPIFKKATVTLEDHLACKCETVAAARPVT (서열번호 1).
rhPDGF-BBThr6의 핵산 서열은 다음과 같다 :
5’-ACCATTGCTGAGCCGGCCATGATCGCCGAGTGCAAGACGCGCACCGAGGTGTTCGAGATCTCCCGGCGCCTCATAGACCGCACCAACGCCAACTTCCTGGTGTGGCCGCCCTGTGTGGAGGTGCAGCGCTGCTCCGGCTGCTGCAACAACCGCAACGTGCAGTGCCGCCCCACCCAGGTGCAGCTGCGACCTGTCCAGGTGAGAAAGATCGAGATTGTGCGGAAGAAGCCAATCTTTAAGAAGGCCACGGTGACGCTGGAAGACCACCTGGCATGCAAGTGTGAGACAGTGGCAGCTGCACGGCCTGTGACC-3’ (서열번호 2).
실험 재료 및 방법
재조합 발현 클론의 구축
다양한 PDGF 돌연변이들을 코딩하는 DNA 서열들을 Shanghai Sangon Inc.에 의해 합성하였다. 유전자 단편을 제한 효소 부위 Xhol 및 EcoRI를 통해 발현 벡터 pMEX9K(특허 ZL02117906.9 참조) 내로 클로닝하고, 시퀀싱에 의해 확인하였다. 재조합 플라스미드를 추출하고, SalI 분해에 의해 선형화하였으며(linearized), 그 후 일렉트로포레이션에 의해 피키아 파스토리스(Pichia pastoris) 발현 주 GS115 수용체 세포 내로 형질전환 시켰다. 효모 형질전환 체를 히스티딘 결핍 MD 플레이트로 스크리닝하였고, 양성 재조합 효모 균주를 PCR로 동정하였다.
재조합 단백질의 유도 발현
재조합 효모 균주의 단일 클론을 25 mL의 BMGY 배지 (BMGY 배지는 다음과 같이 제조 하였다 : 10 g의 효모 추출물 분말 및 20 g의 트립톤을 칭량하고, 700 ml의 물에 용해시키고, 121℃에서 20분간 오토클레이브 하였다; 실온으로 냉각시킨 후, 1M 인산 칼륨 버퍼 100 ㎖, 10×YNB 100 ㎖ 및 10×GY 100 ㎖를 첨가하였으며, 4℃에서 보관 하였다. 여기서, 10×YNB(13.4% Yeast nitrogen source base), 10×GY(10% 글리세롤), 1 M 인산 칼륨 버퍼(132 ml 1 M K2HPO4 및 868 ml 1M KH2PO4를 측정하고, 인산 또는 KOH로 pH 6.0±0.1로 조정하였으며, 121℃에서 30분간 오토클레이브하고, 실온에서 보관하였다), Yeast Extract(LP0021)는 OXOID Inc.의 제품이고, Peptone(211677)은 B&D Inc.의 제품이다), 28-30℃에서 220-250 rpm으로 OD600=2-6까지 (약 16-18시간) 배양하고 증식시켰다. 효모 배양액 25 ml를 1L BMGY 함유 플라스크 내로 접종하였고, 28-30℃에서 220-250 rpm으로 OD600=2-6까지 배양 및 증식을 지속하였다. 효모를 실온에서 1500-3000 g로 5 분간 원심분리에 의해 수집하였다. 상청액을 제거하였고, 효모를 1 L BMMY 배지로 재현탁하여 발현 유도를 시작하였다. 유도 온도는 28℃였고, 회전 속도는 220 rpm이었다. 메탄올을 매 24 시간마다 최종 농도가 0.5%가 될때까지 추가하였고, 유도 시간은 72 시간이었다. 유도가 완료된 이후, 재조합 단백질을 함유하는 상청액을 상온에서 7000 rpm으로 원심분리에 의해 수집하였다.
재조합 단백질의 정제
피키아 파스토리스(Pichia pastoris)의 발현 상청액을 적절한 버퍼 내로 원심분리 및 필터링에 의해 조정하고, 이어서 소수성 상호작용 크로마토그래피(Phenyl Sepharose 6 Fast Flow), 이온 교환 크로마토그래피(Source 30S) 및 겔 여과 크로마토그래피(Hiload Superdex 75 prep grade)를 연속적으로 수행하고, 목적 단백질을 95% 이상의 순도로 얻었다(도 5). 크로마토그래피 매질은 모두 GE Amersham Bioscience Inc.의 제품이다.
소수성 크로마토그래피를 다음과 같이 수행하였다. (1) 효모 발현 상청액을 1/2 부피의 컨디셔닝 버퍼(60 mM PB, 3 M (NH4)2SO4, pH 7.2)로 전도도를 조정하였다. (2) 지침 내의 방법에 따라, 컬럼을 평형 버퍼로 평형화시켰다. (3) 샘플을 컬럼으로 로딩한 후, 베이스라인이 평탄해질 때까지 평형화 버퍼로 컬럼을 세척하였다. (4) 컬럼을 일루션 버퍼(20 mM PB, 1 M NaCl, pH 7.2)의 구배로 일루션하고, 목적 단백질을 회수하였다.
겔 여과 크로마토피를 다음과 같이 수행하였다. (1) 컬럼을 PBS 버퍼(20 mM PB, 0.15 M NaCl, pH 7.2)로 평형화시켰다. (2) Source 30S 일루션 피크를 루프(loop)로 로딩하였고, 각 로딩의 부피는 컬럼 부피의 3% 이하였다. (3) 컬럼을 PBS 버퍼로 세척하여 목적 단백질을 수집하였다.
재조합 단백질의 SDS-PAGE 검출
적당한 농도의 정제된 단백질 30 μl를 4×SDS-PAGE 버퍼(20 mM DTT를 포함하거나 포함하지 않는) 10 μl로 각각 첨가하였고, 5분 동안 100℃에서 변성시켰고(denatured), 원심분리하였다. 그리고나서 SDS-PAGE 전기 영동 분석을 위해 30 μl의 상청액을 취했다(분리 겔은 15%). 전기 영동 후, 겔을 쿠마시 브릴리언트 블루 R250으로 염색하였다.
재조합 단백질의 웨스턴 블랏(western blot, WB) 검출
샘플은 SDS-PAGE에서와 동일한 방법으로 제조하였다. 3 μl 샘플을 SDS-PAGE로 얻었다. 전기영동 후, 단백질을 1시간 동안 300 mA 정전류(constant current)로 니트로셀룰로오스 막으로 옮기고, 1시간 동안 상온에서 5% 탈지유/TBST로 블락킹하였다. 일차 항체 PDGF-B(F-3)(Santa Cruz Biotechnology, SC-365805)를 1:1000으로 희석시켰고, 상온에서 1시간 동안 코팅하고, TBST로 몇차례 세척하였다. HRP-표지된 2차 항체(Cell Signaling Technology, #7076)를 1:10000으로 희석시켰고, 상온에서 1시간 동안 배양하였으며, TBST로 세척하였다. 기질을 추가하였고, LAS400 미니 겔 이미징 시스템(GE)으로 이미징하였다.
N-말단 아미노산 서열의 시퀀싱
샘플 제조 및 SDS-PAGE 공정은 상술한 바와 동일하였다. 전기영동의 완료 후, 단백질을 CAPS 일렉트로블랏팅 버퍼로 300 mA 정전류(constant current)에서 1시간 동안 PVDF 막으로 옮겼고, 0.1% 쿠마시 브릴리언트 블루 R250으로 염색하였으며, 그 후 바로 단백질 밴드가 보일 때까지 50% 메탄올로 완전히 탈색하였다. 측정할 단백질 밴드를 잘라내어, Military Medical Academy의 Biomedical Analysis Center의 Chromatography Laboratory로 측정을 위해 보냈다.
단백질 글리코실화의 검출
5 μl의 샘플 및 양성 대조군 IFN-ω를 3 μl의 10×당단백질 변성(denaturation) 버퍼(NEB PNGase F 효소) 및 15 μl의 물로 첨가하였고, 100℃에서 10분간 가열하여 변성시켰다. 냉각 후, 3 μl NP-40, 3 μl G7 버퍼(NEB PNGase F 효소 함유) 및 2 μl 펩타이드 N-글리코시다아제 F(PNGase F)(New England Biotech Inc. (NEB)의 제품)를 첨가하였고, 37℃에서 3시간동안 분해시켰다. 분해 완료 후, 샘플을 100℃에서 가열하여 효소를 불활성화시키고, SDS-PAGE 전기영동을 수행하였다. 전기영동의 완료 후, 당단백질 염색 키트(Thermo Scientific, #24562)를 이용하여 염색을 수행하였다. 첫째로, 겔을 50% 메탄올 100 ml로 첨가하였고, 30분 동안 고정시켰다; 겔을 3% 아세트산으로 몇차례 세척하였고, 산화 용액 25 ml으로 이동시켰고, 15분간 온화하게 진탕(shaken)시켰다; 겔을 3% 아세트 산으로 몇차례 세척하였고, 당단백질 염색 시약(Glycoprotein Staining Reagent) 25 ml로 이동시켰고, 15분 동안 온화하게 진탕시켰다; 그런 뒤, 겔을 환원 용액 25 ml로 이동시켰고, 5분간 온화하게 진탕시켰다; 그 후, 겔을 3% 아세트 산으로 세척하였고, 탈이온수로 헹구었다.
PDGF-B 생물학적 활성의 검출
BALB/C 3T3 세포(Beijing Xiehe Cell Resource Center로부터 구매)를 10% FBS를 함유하는 DMEM 완전 배지(Life Technology)에서 37℃ 및 5% 이산화탄소의 조건으로 배양하였다. 분해 및 회수 후, 완충액을 사용하여 1 ml 당 5.0×104 세포를 함유하는 세포 현탁액으로 세포를 제조하고, 96-웰 세포 배양 플레이트(웰 당 100 μl)내로 접종한 후, 37℃, 5% 이산화 탄소의 조건하에서 배양하였다. 24시간 후, 배지를 유지 배지(maintainance medium)(0.4%FBS 함유 DMEM)으로 교환한 뒤, 37℃ 및 5% 이산화탄소 조건에서 배양하였다. 배양 24 시간 후, 배양 배지를 제거하고, 사전(pre)-구배(gradient) 희석된 PDGF-BB 용액(웰 당 100 μl)를 첨가하였다. 단백질의 작용 하에서 다른 64 시간 내지 72 시간 동안 세포를 배양하였고, WST-1 방법으로 다음과 같이 세포 증식을 분석하였다: WST-1 용액(깨?, 11644807001) 10 μl를 각 웰로 첨가하였고, 37℃, 5% 이산화 탄소 조건 하에서 3시간동안 배양한 뒤, 450 nm의 파장에서 마이크로플레이트 리더(레퍼런스 파장: 630 nm)를 이용하여 흡광도를 측정하였다. 실험 데이터를 4-매개변수 회귀 계산 방법(a four-parameter regressive calculation method)에 의해 처리하였다. 두 단백질의 EC50 값을 각각 계산하였다. 실험을 3회 반복하였다. 두 그룹 간의 차이점 통계 분석을 t-테스트에 의해 수행하였다.
실시예 1: 단백질 분해 및 글리코실화의 공동 효과는 PDGF-BB Thr6 의 다양한 단량체의 형성에 기여한다.
본 발명자들은 먼저 단백질분해(protep;ysis)가 다양한 PDGF-B 단량체 형성의 원인이라고 믿었다. 환원 SDS-PAGE 전기영동에 의해, PDGF-B의 다른 단량체들이 분리되었고, 쿠마시 브릴리언트 블루 염색을 통해 다섯 개의 밴드들이 검출되었다(도 3A). 5개의 밴드에 대해 N-말단 아미노산 시퀀스의 서열분석을 실시하였고, 그 결과는, 네 번째 및 다섯 번째 밴드에서의 N-말단의 첫 다섯 아미노산 잔기가 TNANF인 반면, 첫 번째, 두 번째 및 세 번째 밴드에서의 N-말단의 최초 다섯 아미노산 잔기 모두, 정확한 PDGF-BThr6의 N-말단 서열에 상응하는 TIAEP임을 보여주었다. 단백질 서열의 정렬은 네 번째 및 다섯 번째 단백질 단편들이 Arg32-Thr33에서의 단백질 분해성 절단(proteolytic cleavage)에 의해 생성된 절단된 단백질(truncated protein)임을 나타낸다(도 3A).
그러나, 이는 적어도 다섯 가지의 PDGF 단량체의 형성의 이유를 설명하지 못한다. 밴드 1, 2, 3 및 밴드 4, 5 사이의 분자량의 차이는 C-말단 절단으로부터 기인할 것이다. 상기 물음에 답하기 위해, 본 발명자들은 PDGF-B C-말단에 대한 특이적인 모노클로날 항체(F-3) (Santa Cruz Biotechnology, SC-365805)을 이용하여 WB 분석을 수행하였다. 그 결과는 다섯 밴드 중 두 개의 밴드만이 검출됨을 보여주었다. 그러나 흥미롭게도, 항체에 결합된 2개의 밴드는 세 번째 및 다섯 번째 단백질 단편과 상응하는 것으로 나타났다(도 3B). 첫 번째, 두 번째 및 네 번째 단백질 단편이 C-말단 절단으로 인해 항체에 의해 검출 될 수 없다면, 그들의 분자량은 더 작아야 한다. 그러나, 이는 명백히 전기영동 분석 결과와 일치하지 않는다. 이는 찾아내야할 다른 이유가 있음을 의미한다.
PDGF-B가 글리코실화 되었는지를 분석하기 위해, PDGF를 펩타이드 N-글리코시다아제 F(PNGase F)로 분해시켰고, SDS-PAGE 및 당단백질 염색을 동시에 수행하였다. PNGaseF는 글리코펩타이드/당단백질 내의 거의 모든 N-글리칸 체인에 작용할 수 있고, 당 쇄 모이어티(sugar chain moiety)의 가장 안쪽의 GlcNAc 및 아스파라긴 잔기 사이를 절단하고, 아스파라긴을 아스파르트 산으로 변경시킬 수 있는 아미다아제이며(10), 당단백질 프로테오믹스 연구에서 N-당단백질의 동정에 가장 널리 이용된다. 피키아파스토리스(Pichia pastoris)에서 발현된 재조합 IFN-ω 단백질은 N-글리코실화 단백질의 양성 대조군으로서 작용한다. 쿠마시 브릴리언트 블루 염색 결과는 절단 전후의 PDGF-B 단백질의 상대 분자량에 변화가 없었음을 보여주며 PDGF-B 단백질이 N-글리코실화를 일으키지 않았음을 나타낸다(도 3C, 좌측 도). 그러나, 당단백질 염색 결과는 PDGF-B가 실제로 당단백질임을 나타낸다(도 3C, 우측 도). 이는 피키아 파스토리스에 의해 분비된 PDGF-B가 O-글리코실화 된 것을 의미한다. 한편, 추가적인 분석은 당 염색에서 오직 세 단백질 단편들만이 검출되었음을 보였고, 이는 각각 SDS-PAGE 결과에서의 밴드 1, 2 및 4에 해당한다(도 3B). 이는 또한 상기 WB 분석의 결과와 일치한다: 첫 번째, 두 번째 및 네 번째 단백질 단편들이 이들의 C-말단에서 글리코실화되어 있고, 그러므로 항체에 대한 PDGF-BThr6의 결합에 영향을 준다.
상기 실험 결과들을 종합하면, 본 발명자들은 PDGF-BThr6 단량체들의 여러 형태가 27/28 위치의 아미노산 Arg32-Thr33 사이에서 발생하는 단백질 분해 및 변형된 번역 후 글리코실화(differentially post-translational glycosylation)의 공동-효과로부터 기인한다고 추론하였다.
표 1. PDGF-BThr6 변형에 대한 분석
Figure pat00001
주: 표에서 온전한 PDGFsms PDGF-BThr6, 즉 N-말단에서 5개의 아미노산이 결실된 PDGF-B를 의미한다.
실시예 2: PDGF-M1 및 PDGF-M2 개질제의 제조 및 단백질 특성의 검출
또한, 본 발명자들은 상기 언급된 추론을 확인하고자 하였고, 피키아 파스토리스에서의 PDGF-B의 발현이 균일할 것이라 예측하였다. 첫째, 본 발명자들은 가능한 O-글리코실화 부위를 결정하고자 하였다. PDGF-BThr6 단백질 서열의 글리코실화 부위의 예측을 온라인 웹사이트 CBS(www.CBS.dtu.dk)를 통해 수행하였다(11). 그 결과는 6, 101 및 109 위치의 Thr들이 가능한 O-글리코실화 변형 부위임을 보여준다(도 4). N-글리코실화와 비교하여, O-글리코실화 부위에 대한 명확한 모티프가 없기 때문에, 그 예측도 비교적 어렵다. 그러나, 6, 101 및 109 위치에서의 예상되는 잠재적 글리코실화 부위는 우리의 결과와 일치한다: PDGF-BThr6 단백질의 C-말단에서의 글리코실화 변형(Thr101, Thr109)이 있어야 항체에 결합하는 것을 피할 수 있다; Thr33 앞에 글리코실화 변형 부위가 있어야하고, 이는 분해된 PDGF-B에 대한 오직 하나(밴드 4)의 글리코실화-변형된 변이체가 존재한다는 사실을 설명할 수 있는 것이지만, 분해되지 않은 글리코실화된 PDGF-B 단량체에 대한 두 개의 밴드(밴드 1, 2)가 존재한다(도 3B; 표 1). 예측된 결과를 확인하기 위해, PDGF-BThr6의 두 돌연변이 PDGF-M1 및 PDGF-M2를 구축하였다. C-말단에서의 두 글리코실화 부위는 PDGF-M1에서 돌연변이 되고, 모든 3개의 잠재적 글리코실화 부위는 PDGF-M2에서 돌연변이 되었다(돌연변이 패턴에 대해 도 6A 참조). 한편, 프로테아제 절단 부위 Arg32-Thr33을 제거하기 위해, 우리는 아미노산의 진화적 선택을 고려하여, Arg32를 Pro으로 변이 시켰다. 성숙한 PDGF-B 단백질은 PDGF-A와 60%의 아미노산 서열 상동성을 가지며, 구조와 기능면에서 높은 유사성을 보인 반면, PDGF-A 단백질의 상응하는 위치에 있는 아미노산은 Pro임을 확인했다.
PDGF-M1의 아미노산 서열은 다음과 같다:
TIAEPAMIAECKTRTEVFEISRRLIDPTNANFLVWPPCVEVQRCSGCCNNRNVQCRPTQVQLRPVQVRKIEIVRKKPIFKKATVTLEDHLACKCEAVAAARPVA (서열번호 3)；
PDGF-M1의 뉴클레오티드 서열은 다음과 같다:
ACCATTGCTGAGCCGGCCATGATCGCCGAGTGCAAGACGCGCACCGAGGTGTTCGAGATCTCCCGGCGCCTCATAGACCCCACCAACGCCAACTTCCTGGTGTGGCCGCCCTGTGTGGAGGTGCAGCGCTGCTCCGGCTGCTGCAACAACCGCAACGTGCAGTGCCGCCCCACCCAGGTGCAGCTGCGACCTGTCCAGGTGAGAAAGATCGAGATTGTGCGGAAGAAGCCAATCTTTAAGAAGGCCACGGTGACGCTGGAAGACCACCTGGCATGCAAGTGTGAGGCAGTGGCAGCTGCACGGCCTGTGGCC (서열번호 4).
PDGF-M2의 아미노산 서열은 다음과 같다:
AIAEPAMIAECKTRTEVFEISRRLIDPTNANFLVWPPCVEVQRCSGCCNNRNVQCRPTQVQLRPVQVRKIEIVRKKPIFKKATVTLEDHLACKCEAVAAARPVA (서열번호 5)；
PDGF-M2의 뉴클레오티드 서열은 다음과 같다:
GCCATTGCTGAGCCGGCCATGATCGCCGAGTGCAAGACGCGCACCGAGGTGTTCGAGATCTCCCGGCGCCTCATAGACCCCACCAACGCCAACTTCCTGGTGTGGCCGCCCTGTGTGGAGGTGCAGCGCTGCTCCGGCTGCTGCAACAACCGCAACGTGCAGTGCCGCCCCACCCAGGTGCAGCTGCGACCTGTCCAGGTGAGAAAGATCGAGATTGTGCGGAAGAAGCCAATCTTTAAGAAGGCCACGGTGACGCTGGAAGACCACCTGGCATGCAAGTGTGAGGCAGTGGCAGCTGCACGGCCTGTGGCC (서열번호 6).
PDGF-M1 및 PDGF-M2를 코딩하는 DNA 서열을 발현 벡터 pMEX9K 내로 삽입하고, 피키아 파스토리스 균주 GS115에 통합시켰다. 발현은 메탄올에 의해 유도하였고, 단백질을 크로마토그래피를 통해 정제하였다. 엔지니어링된 단백질의 특성을 알아보기 위해, 정제된 PDGF-B 단백질에 대해 SDS-PAGE, 당단백질 염색 및 웨스턴 블랏팅 검출을 수행하였다. WB 결과는 두 개의 돌연변이가 감소된 후에 오직 단일 밴드만이 검출될 수 있으며, 예상되는 것과 일치하게 상대 분자량이 약 12 kDa인 것을 보여주었다(도 6B). SDS-PAGE 결과는 PDGF-M2가 단일밴드이지만, PDGF-M1은 여전히 주 밴드(major band) 위에 비주요 밴드(minor band)를 갖는다는 것을 보여준다(도 6c). 이 밴드는 Th6의 글리코실화로부터 유래하는 것으로 추정되었다. 당단백질 염색 결과는 두 돌연변이의 글리코실화 수준이 돌연변이 전의 것과 비교하여 매우 낮고, 당단백질 염색에 의해 거의 검출되지 않는다는 것을 보여주었다(도 6D). 상기 결과는 32 위치에서 R의 P로의 돌연변이가 잠재적 Kex2 프로테아제 절단 부위를 제거하고, Thr33 절단된 PDGF-B 단량체의 형성을 방해하는 반면에, 세 개의 글리코실화 부위 Th6, 101 및 109의 돌연변이가 또한 단백질의 번역-후 글리코실화 변형을 다른 정도로 폐지함으로써, 피키아 파스토리스에서의 PDGF-B 단백질의 발현을 균질하게 만든다는 것을 보여준다.
실시예 3: PDGF-M2의 활성을 강화하는 세포 증식의 검출
글리코실화 부위 Th6-Ala, Thr101-Ala 및 Thr109-Ala의 돌연변이 및 Arg32-Pro KEX 절단 부위의 돌연변이가 PDGF-BB의 생물학적 활성에 영향을 줄 수 있는지 여부를 분석하기 위해, 본 발명자들은 WST-1 방법을 이용한 Balb/c 3T3 세포 상의 PDGF-BThr6 및 PDGF-M2의 증식 활성을 측정하였다. 그 결과는 PDGF-BThr6의 EC50이 5.434±0.6475 ng/ml인 반면에 PDGF-M2의 EC50이 3.492±0.4078 ng/ml임을 보여준다. t-테스트는 엔지니어링 후의 단백질 활성이 엔지니어링 전보다 더 높고, 0.0117의 P 값을 갖는다는 것을 보여준다(도 7).
실시예 4: 발현 수준 상의 PDGF-M2 Arg32 돌연변이의 영향
PDGF-M2의 발현 수준을 향상시키기 위해, 본 발명자들은 온라인 툴인 JAVA Codon Adaptation Tool을 이용하여 단백질 발현 동안 피키아 파스토리스의 코돈 선호도에 따라, PDGF-M2상의 코돈-최적화를 수행하였다. 최적화된 암호화 DNA 서열은 다음과 같다:
PDGF-IM-P를 코딩하는 DNA 서열:
5'GCTATCGCTGAACCAGCTATGATCGCTGAATGTAAGACTAGAACTGAAGTTTTCGAAATCTCTAGAAGATTGATCGACCCAACTAACGCTAACTTCTTGGTTTGGCCACCATGTGTTGAAGTTCAAAGATGTTCTGGTTGTTGTAACAACAGAAACGTTCAATGTAGACCAACTCAAGTTCAATTGAGACCAGTTCAAGTTAGAAAGATCGAAATCGTTAGAAAGAAGCCAATCTTCAAGAAGGCTACTGTTACTTTGGAAGACCACTTGGCTTGTAAGTGTGAAGCTGTTGCTGCTGCTAGACCAGTTGCT-3’ (서열번호 7).
이의 단백질 서열은 PDGF-M2와 동일하다.
코돈 최적화에 기초하여, Arg32를 Val(PDGF-IM-V, 사용된 Val 코돈은 GTT 임) 및 Ile(PDGF-IM-I, 사용된 Ile 코돈은 ATC 임)로 변이시켰고, 단백질 발현 상의 Arg32의 돌연변이의 효과를 분석하기 위해 발현 수준을 PDGF-M2의 것과 비교하였다.
PDGF-IM-V의 뉴클레오티드 서열은 다음과 같다:
GCTATCGCTGAACCAGCTATGATCGCTGAATGTAAGACTAGAACTGAAGTTTTCGAAATCTCTAGAAGATTGATCGACGTTACTAACGCTAACTTCTTGGTTTGGCCACCATGTGTTGAAGTTCAAAGATGTTCTGGTTGTTGTAACAACAGAAACGTTCAATGTAGACCAACTCAAGTTCAATTGAGACCAGTTCAAGTTAGAAAGATCGAAATCGTTAGAAAGAAGCCAATCTTCAAGAAGGCTACTGTTACTTTGGAAGACCACTTGGCTTGTAAGTGTGAAGCTGTTGCTGCTGCTAGACCAGTTGCT (서열번호 8).
PDGF-IM-I의 뉴클레오티드 서열은 다음과 같다:
GCTATCGCTGAACCAGCTATGATCGCTGAATGTAAGACTAGAACTGAAGTTTTCGAAATCTCTAGAAGATTGATCGACATCACTAACGCTAACTTCTTGGTTTGGCCACCATGTGTTGAAGTTCAAAGATGTTCTGGTTGTTGTAACAACAGAAACGTTCAATGTAGACCAACTCAAGTTCAATTGAGACCAGTTCAAGTTAGAAAGATCGAAATCGTTAGAAAGAAGCCAATCTTCAAGAAGGCTACTGTTACTTTGGAAGACCACTTGGCTTGTAAGTGTGAAGCTGTTGCTGCTGCTAGACCAGTTGCT (서열번호 9).
PDGF-IM-P, PDGF-IM-V 및 PDGF-IM-I을 코딩하는 DNA 서열을 제한 부위(restriction site), 터미네이터(terminator)와 같은 서열에 연결하였고, 발현 벡터 pMEX9K 내로 복제하였으며, 발현 균주 GS115로 통합시켰다. 히스티딘-결핍 MD 플레이트 스크리닝에 이어서, 9개의 클론을 무작위로 선택하였고, 튜브 내의 메탄올에 의해 유도된 발현을 일으켰다. 배양 상청액의 SDS-PAGE 전기 영동 분석 결과, PDGF-IM-P 단백질의 발현량이 다른 두 균주보다 유의하게 더 높았다(도 8A).
다중 삽입을 갖는 GS115/PDGF-IM-P, GS115/PDGF-IM-V, 및 GS115/PDGF-IM-P 클론의 스크리닝을 G418로 수행하였다. 2.0 mg/ml 및 4.0 mg/ml의 G418을 갖는 플레이트 상에서 성장한 클론의 발현을 각각 분석하였다. 그 결과는 PDGF-IM-P의 평균 발현 수준이 다른 두 균주보다 더 높다는 것을 보여주었다(도 8B). 이는 Arg32 부위의 돌연변이가 피키아 파스토리스에서의 PDGF의 분비 및 발현 수준에 영향을 주고, 이 부위의 Pro로의 돌연변이가 발현에 비교적 유리하다는 것을 나타낸다.
실시예 5: PDGF-B 및 PDGF-M2 돌연변이의 글리코실화의 LS/MS 검출
방법
재조합 PDGF-B 야생형 및 PDGF-M2 돌연변이를 DTT(2.5 mM)에 의해 37℃에서 30분간 감소시켰고, 버퍼 A(0.1% 포름산을 함유하는 수성 용액)로 희석시킨 후, 액상 크로마토그래피 및 질향 분석기(LC/MS) 분석을 수행하였다. EASY-nLC 시스템(Thermo Fisher Scientific)을 이용하여 Easy-spray 컬럼(15 cm×75 μm ID, 3 μm C18 입자) 상에 단백질을 분리하였고, 버퍼 B(메탄올 내의 0.1% 포름산 용액 함유; 0-90%, 20분)의 선형 구배(linear gradient)로 용출시켰다. 60,000의 해상도, m/z 350-1600의 조건하에서 Q Exactive Mass Spectrometer(Thermo Ficher Scientific)를 이용하여 고 해상도 스펙트럼을 얻었고, Xtract 소프트웨어(Thermo scientific)을 이용하여 디콘볼루션시켰다(de-convoluted).
결과
고 해상도 LC/MS에 의한 PDGF-B 야생형 및 PDGF-M2 돌연변이의 분석은 야생형 PDGF에 대해서 6개까지 탄수화물 잔기를 함유하는 다른 이성질체들이 검출되었고, 세 개의 탄수화물 잔기들을 함유하는 이성질체의 함량이 가장 높았다는 것을 보여주었다. 한편, PDGF-M2(M2) 돌연변이에 대한 글리코실화는 거의 검출할 수 없었다(도 9).
본 발명의 특정 실시예가 상세히 설명되었을 지라도, 당업자는 개시된 모든 교시들에 따라, 다양한 변경 및 대체가 이들 세부사용에 대해 이루어질 수 있고, 이러한 변경이 모두 본 발명의 범위 내에 있다는 것을 이해할 것이다. 본 발명의 범위는 첨부된 청구범위 및 그 등가물에 의해 주어진다.
참고자료
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Claims (23)

  1. 인간의 성숙한 혈소판-유래 성장 인자 B의 아미노산 위치 101 및 109에서 트레오닌으로부터 알라닌으로의 치환을 갖고, 혈소판-유래 성장 인자 B의 활성을 갖는 인간의 성숙한 혈소판-유래 성장 인자 B 돌연변이.
  2. 제 1 항에 있어서, 아미노산 위치 6에서 트레오닌으로부터 알라닌으로의 치환을 추가적으로 갖는 인간의 성숙한 혈소판-유래 성장 인자 B 돌연변이.
  3. 제 1 항에 있어서, 아미노산 위치 32, 아미노산 위치 33, 또는 아미노산 위치 32 및 33에서 아르기닌으로부터 프롤린, 발린 또는 이소류신으로의 치환을 추가적으로 갖는 인간의 성숙한 혈소판-유래 성장 인자 B 돌연변이.
  4. 제 1 항에 있어서, 5개 아미노산의 N-말단 결실을 추가적으로 갖는 인간의 성숙한 혈소판-유래 성장 인자 B 돌연변이.
  5. 제 1 항에 있어서,
    ● 아미노산 위치 6에서 트레오닌으로부터 알라닌으로의 치환, 및
    ● 아미노산 위치 32, 아미노산 위치 33, 또는 아미노산 위치 32 및 33에서 아르기닌으로부터 프롤린, 발린 또는 이소류신으로의 치환
    을 추가적으로 갖는 인간의 성숙한 혈소판-유래 성장 인자 B 돌연변이.
  6. 제 1 항에 있어서, 아미노산 위치 33에서 아르기닌으로부터 프롤린으로의 치환을 추가적으로 갖는 인간의 성숙한 혈소판-유래 성장 인자 B 돌연변이.
  7. 제 1 항에 있어서,
    ● 아미노산 위치 6에서 트레오닌으로부터 알라닌으로의 치환, 및
    ● 아미노산 위치 33에서 아르기닌으로부터 프롤린으로의 치환
    을 추가적으로 갖는 인간의 성숙한 혈소판-유래 성장 인자 B 돌연변이.
  8. 아미노산 서열은 서열번호 3 또는 서열번호 5에 기재된 서열인 인간의 성숙한 혈소판-유래 성장 인자 B 돌연변이.
  9. 두 제 1 항의 인간의 성숙한 혈소판-유래 성장 인자 B 돌연변이로 구성된 혈소판-유래 성장 인자 동종이량체.
  10. 하나의 제 1 항의 인간의 성숙한 혈소판-유래 성장 인자 B 돌연변이와 하나의 혈소판-유래 성장 인자 A로 구성된 혈소판-유래 성장 인자 이종이량체.
  11. 제 1 항의 인간의 성숙한 혈소판-유래 성장 인자 B 돌연변이를 암호화하는 핵산 분자.
  12. 제 11 항에 있어서, 서열번호 4 및 서열번호 6-9에 기재된 서열로 구성된 그룹으로부터 선택되는 핵산 서열로 구성된 핵산 분자.
  13. 제 11 항의 핵산 분자를 포함하는 벡터.
  14. 제 13 항의 벡터를 포함하는 숙주 세포.
  15. 제 14 항에 있어서, 상기 숙주 세포는 진핵 세포인 숙주 세포.
  16. 제 15 항에 있어서, 상기 숙주 세포는 피키아 파스토리스(Pichia pastoris)인 숙주 세포.
  17. 제 13 항의 숙주 세포를 배양, 발현 및 선택적으로 정제하는 단계를 포함하는 제 1 항의 인간의 성숙한 혈소판-유래 성장 인자 B 돌연변이의 제조 방법.
  18. 제 1 항의 인간의 성숙한 혈소판-유래 성장 인자 B 돌연변이를 포함하는 배양 상등액 또는 세포 파쇄물에 대해 연속적으로 소수성 상호작용 크로마토그래피(hydrophobic interation chromatography), 이온 교환 크로마토그래피 및 겔 여과 크로마토그래피를 실시하는 단계를 포함하는 제 1 항의 인간의 성숙한 혈소판-유래 성장 인자 B 돌연변이를 정제하는 방법.
  19. 제 18 항에 있어서, 다음 (1) 내지 (3) 중 어느 하나 이상을 특징으로 하는 정제 방법:
    (1) 소수성 상호작용 크로마토그래피에 이용되는 크로마토그래피 매질이 페닐 세파로오스 6 패스트 플로우(Phenyl Sepharose 6 Fast Flow)임;
    (2) 이온 교환 크로마토그래피에 이용되는 크로마토그래피 매질이 소스 30S(Source 30S)임;
    (3) 겔 여과 크로마토그래피에 이용되는 크로마토그래피 매질이 힐로드 슈퍼덱스 75 프랩 그레이드(Hiload Superdex 75 prep grade)임.
  20. 제 18 항에 있어서,
    상기 소수성 상호작용 크로마토그래피는 다음 단계를 포함하고:
    (1) 혈소판-유래 성장 인자 B 돌연변이를 함유하는 배양 상등액 또는 세포 파쇄물의 전도도를 컨디셔닝 버퍼로 조절하는 단계; 상기 컨디셔닝 버퍼가 첨가된 최종 계(final system)는 10-50 mM 포스페이트 버퍼, 0.8-1 M (NH4)2SO4, pH 6.8-7.5이고;
    (2) 평형화 버퍼(equilabrating buffer)으로 컬럼을 평형화시키는 단계; 상기 평형화 버퍼의 제형은 10-50 mM 포스페이트 버퍼, 0.8-1 M (NH4)2SO4, pH 6.8-7.5이며;
    (3) 컬럼 내로 샘플을 로딩 후, 평형화 버퍼로 컬럼을 워싱하는 단계;
    (4) 일루션 버퍼로 일루션하고 목적 단백질을 수집하는 단계; 상기 일루션 버퍼의 제형은 10-50 mM 포스페이트 버퍼, 30%-50% 에틸렌 글리콜, pH 6.8-7.5이고;
    상기 이온 교환 크로마토그래피는 다음 단계를 포함하며:
    (1) 평형화 버퍼로 소수성 상호작용 크로마토그래피의 일루션 피크를 전도도 6 mS/cm 이하가 되도록 희석시키는 단계; 상기 평형화 버퍼의 제형은 10-50 mM 포스페이트 버퍼, pH 6.8-7.5;
    (2) 평형화 버퍼로 컬럼을 평형화시키는 단계;
    (3) 컬럼으로 샘플을 로딩 후, 평형화 버퍼로 컬럼을 워싱하는 단계;
    (4) 일루션 버퍼 구배를 일루션하고, 목적 단백질을 수집하는 단계; 상기 일루션 버퍼의 제형은 10-50 mM 포스페이트 버퍼, 0.8-1.2 mM NaCl, pH 6.8-7.5이고;
    상기 겔 여과 크로마토그래피는 다음 단계를 포함하는, 정제 방법:
    (1) 포스페이트 버퍼로 컬럼을 평형화시키는 단계; 상기 포스페이트 버퍼의 제형은 10-50 mM 포스페이트 버퍼, 0.1-0.5 M NaCl, pH 6.8-7.5이고;
    (2) 이온 교환 크로마토그래피의 일루션 피크를 로딩하는 단계; 각각의 로딩 부피는 컬럼 부피의 0.3 내지 4% 이하이며;
    (3) 단계 (1)에서의 포스페이트 버퍼로 컬럼을 워싱하는 것을 지속하고, 목적 단백질을 수집하며, 정제된 혈소판-유래 성장 인자 B 돌연변이를 얻는 단계.
  21. 제 1 항의 인간의 성숙한 혈소판-유래 성장 인자 B 돌연변이에 특이적으로 결합할 수 있는 항체.
  22. 인간의 성숙한 혈소판-유래 성장 인자 B의 아미노산 서열을 변형시키는 단계를 포함하고, 상기 변형은 아미노산 위치 101 및 109에서 트레오닌으로부터 알라닌으로의 치환을 포함하는, 인간의 성숙한 혈소판-유래 성장 인자 B의 발현을 균질화하는 방법.
  23. 제 22 항에 있어서, 상기 변형은 다음 (a) 내지 (c) 중 하나 이상을 추가적으로 포함하는, 인간의 성숙한 혈소판-유래 성장 인자 B의 발현을 균질화하는 방법:
    (a) 아미노산 위치 6에서 트레오닌으로부터 알라닌으로의 치환;
    (b) 아미노산 위치 32, 아미노산 위치 33, 또는 아미노산 위치 32 및 33에서 아르기닌으로부터 프롤린, 발린, 또는 이소류신으로의 치환;
    (c) 5개 아미노산의 N-말단 결실.
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