KR20190100225A - 알포트 증후군 치료약 - Google Patents

알포트 증후군 치료약 Download PDF

Info

Publication number
KR20190100225A
KR20190100225A KR1020197019324A KR20197019324A KR20190100225A KR 20190100225 A KR20190100225 A KR 20190100225A KR 1020197019324 A KR1020197019324 A KR 1020197019324A KR 20197019324 A KR20197019324 A KR 20197019324A KR 20190100225 A KR20190100225 A KR 20190100225A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
oligonucleotide
exon
oligonucleotides
col4a5
pharmaceutically acceptable
Prior art date
Application number
KR1020197019324A
Other languages
English (en)
Inventor
가즈모토 이이지마
간다이 노즈
아케미 쇼노
마코토 고이즈미
요시유키 오니시
기요스미 다카이시
도모미 아다치
Original Assignee
다이이찌 산쿄 가부시키가이샤
고쿠리츠다이가쿠호진 고베다이가쿠
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 다이이찌 산쿄 가부시키가이샤, 고쿠리츠다이가쿠호진 고베다이가쿠 filed Critical 다이이찌 산쿄 가부시키가이샤
Publication of KR20190100225A publication Critical patent/KR20190100225A/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A61K31/713—Double-stranded nucleic acids or oligonucleotides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/12—Drugs for disorders of the urinary system of the kidneys
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/78—Connective tissue peptides, e.g. collagen, elastin, laminin, fibronectin, vitronectin or cold insoluble globulin [CIG]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C12N15/1138—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing against receptors or cell surface proteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/11—Antisense
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/14—Type of nucleic acid interfering N.A.
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/31—Chemical structure of the backbone
    • C12N2310/315—Phosphorothioates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/32—Chemical structure of the sugar
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/32—Chemical structure of the sugar
    • C12N2310/321—2'-O-R Modification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/32—Chemical structure of the sugar
    • C12N2310/323—Chemical structure of the sugar modified ring structure
    • C12N2310/3231—Chemical structure of the sugar modified ring structure having an additional ring, e.g. LNA, ENA
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/34—Spatial arrangement of the modifications
    • C12N2310/346—Spatial arrangement of the modifications having a combination of backbone and sugar modifications
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2320/00—Applications; Uses
    • C12N2320/30—Special therapeutic applications
    • C12N2320/33—Alteration of splicing

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

알포트 증후군의 분자 치료법을 확립한다. COL4A5 유전자의 cDNA 에 상보적인 뉴클레오티드 서열로 이루어지는 염기수 15 ∼ 30 의 올리고뉴클레오티드로서, 알포트 증후군의 환자의 COL4A5 유전자에 있어서의, 절두 변이를 갖고, 또한 3 의 배수의 염기수인 엑손의 스키핑을 유도할 수 있는 상기 올리고뉴클레오티드, 그 의약적으로 허용할 수 있는 염 또는 용매화물. 상기 올리고뉴클레오티드, 그 의약적으로 허용할 수 있는 염 또는 용매화물을 포함하는, 의약 (알포트 증후군 치료약).

Description

알포트 증후군 치료약
본 발명은, 알포트 증후군 치료약에 관한 것으로, 보다 상세하게는, 알포트 증후군의 환자의 COL4A5 유전자에 있어서의, 절두 (truncating) 변이를 갖고, 또한 3 의 배수의 염기수인 엑손의 스키핑을 유도할 수 있는 올리고뉴클레오티드 및 그것을 포함하는 의약 (바람직하게는, 알포트 증후군 치료약) 에 관한 것이다.
알포트 증후군은 중증의 유전성 신질환으로, 그 대부분이 30 세까지 말기 신부전으로 진행한다. 가장 빈도가 높은 X 염색체 연쇄형 알포트 증후군 (XLAS) 은 4 형 콜라겐 α5 사슬을 코드하는 유전자 COL4A5 유전자의 이상으로 발병한다. 본 발명자들은 지금까지, 300 가계 이상의 XLAS 환자의 유전자 진단을 실시해 왔다. 그 결과, 약 15 ％ 정도의 가계에 있어서는, 넌센스 변이 등의 완전한 사슬 길이를 갖는 단백질이 발현하지 않는 절두 변이를 갖고, 그 경우, 미스센스 변이와 같은 비-절두 변이를 갖는 경우보다 분명하게 중증의 임상 이미지를 나타내는 것을 보고해 왔다 (비특허문헌 1 : Kidney Int. 2013 년, 85 권, p.1208-1213). 동일한 보고는 몇 개가 있고 (비특허문헌 2 : J Am Soc Nephrol. 2000 년, 11 권, p.649-657, 비특허문헌 3 : Nephrol Dial Transplant, 2002 년, 17 권, p.1218-1227, 비특허문헌 4 : J Am Soc Nephrol, 2010 년, 21 권, p.876-883) 절두 변이를 갖는 경우, 비-절두 변이를 갖는 경우와 비교하여, 10 년 이상 말기 신부전 진행 연령이 빠른 것이 판명되어 있다.
Kidney Int. 2013 년, 85 권, p.1208-1213 J Am Soc Nephrol. 2000 년, 11 권, p.649-657 Nephrol Dial Transplant, 2002 년, 17 권, p.1218-1227 J Am Soc Nephrol, 2010 년, 21 권, p.876-883
본 발명은, 알포트 증후군의 분자 치료법을 확립하는 것을 목적으로 한다.
본 발명자들은, 절두 변이를 갖는 알포트 증후군 환자에 대하여, 안티센스 올리고뉴클레오티드 (ASO) 를 투여함으로써, 절두 변이를 갖는 엑손의 스키핑을 유도하는 치료법을 확립하였다 (도 1). COL4A5 유전자는 콜라겐성 도메인을 형성하는 44 엑손 중 35 엑손이 3 의 배수의 염기수로 구성되어 있기 때문에, 이들 엑손에 절두 변이를 갖는 환자에 있어서는, 이 치료법에 의해, 비-절두 변이로 치환할 수 있다. 이에 의해, 중증의 임상 이미지를 나타내는 알포트 증후군 환자의 말기 신부전 진행 연령을 지연시키는 것이 가능해진다. 본 연구는 XLAS 에 대한 세계 최초의 분자 치료의 개발 연구가 된다.
본 발명의 요지는 이하와 같다.
(1) COL4A5 유전자의 cDNA 에 상보적인 뉴클레오티드 서열로 이루어지는 염기수 15 ∼ 30 의 올리고뉴클레오티드로서, 알포트 증후군의 환자의 COL4A5 유전자에 있어서의, 절두 변이를 갖고, 또한 3 의 배수의 염기수인 엑손의 스키핑을 유도할 수 있는 상기 올리고뉴클레오티드, 그 의약적으로 허용할 수 있는 염 또는 용매화물.
(2) 알포트 증후군의 환자의 COL4A5 유전자에 있어서의, 절두 변이를 갖고, 또한 3 의 배수의 염기수인 엑손의 뉴클레오티드 서열의 일부에 상보적인 뉴클레오티드 서열로 이루어지는 (1) 에 기재된 올리고뉴클레오티드, 그 의약적으로 허용할 수 있는 염 또는 용매화물.
(3) 알포트 증후군의 환자의 COL4A5 유전자에 있어서의, 절두 변이를 갖고, 또한 3 의 배수의 염기수인 엑손이, COL4A5 유전자의 엑손 24, 20 또는 21 인 (1) 또는 (2) 에 기재된 올리고뉴클레오티드, 그 의약적으로 허용할 수 있는 염 또는 용매화물.
(4) 서열 번호 1 ∼ 28, 37 ∼ 41, 51 또는 52 의 어느 서열 (단, 서열 중의 t 는 u 여도 되고, u 는 t 여도 된다) 의 전부 또는 일부를 포함하는 (1) ∼ (3) 중 어느 하나에 기재된 올리고뉴클레오티드, 그 의약적으로 허용할 수 있는 염 또는 용매화물.
(5) 올리고뉴클레오티드를 구성하는 당 및/또는 인산디에스테르 결합의 적어도 1 개가 수식되어 있는 (1) ∼ (4) 중 어느 하나에 기재된 올리고뉴클레오티드, 그 의약적으로 허용할 수 있는 염 또는 용매화물.
(6) 올리고뉴클레오티드를 구성하는 당이 D-리보푸라노스이고, 당의 수식이 D-리보푸라노스의 2' 위치의 수산기의 수식인 (5) 에 기재된 올리고뉴클레오티드, 그 의약적으로 허용할 수 있는 염 또는 용매화물.
(7) 당의 수식이 D-리보푸라노스의 2'-O-알킬화 및/또는 2'-O,4'-C-알킬렌화인 (6) 에 기재된 올리고뉴클레오티드, 그 의약적으로 허용할 수 있는 염 또는 용매화물.
(8) 인산디에스테르 결합의 수식이 포스포로티오에이트인 (5) ∼ (7) 중 어느 하나에 기재된 올리고뉴클레오티드, 그 의약적으로 허용할 수 있는 염 또는 용매화물.
(9) (1) ∼ (8) 중 어느 하나에 기재된 올리고뉴클레오티드, 그 의약적으로 허용할 수 있는 염 또는 용매화물을 포함하는, 의약.
(10) (1) ∼ (8) 중 어느 하나에 기재된 올리고뉴클레오티드, 그 의약적으로 허용할 수 있는 염 또는 용매화물을 포함하는, 알포트 증후군 치료약.
(11) COL4A5 유전자의 cDNA 에 상보적인 뉴클레오티드 서열로 이루어지는 염기수 15 ∼ 30 의 올리고뉴클레오티드로서, 알포트 증후군의 환자의 COL4A5 유전자에 있어서의, 절두 변이를 갖고, 또한 3 의 배수의 염기수인 엑손의 스키핑을 유도할 수 있는 상기 올리고뉴클레오티드, 그 의약적으로 허용할 수 있는 염 또는 용매화물을 의약적으로 유효한 양으로 피험자에게 투여하는 것을 포함하는, 알포트 증후군의 치료 방법.
(12) 알포트 증후군의 치료를 위한, COL4A5 유전자의 cDNA 에 상보적인 뉴클레오티드 서열로 이루어지는 염기수 15 ∼ 30 의 올리고뉴클레오티드로서, 알포트 증후군의 환자의 COL4A5 유전자에 있어서의, 절두 변이를 갖고, 또한 3 의 배수의 염기수인 엑손의 스키핑을 유도할 수 있는 상기 올리고뉴클레오티드, 그 의약적으로 허용할 수 있는 염 또는 용매화물의 사용.
(13) 알포트 증후군을 치료하는 방법에 사용하기 위한, COL4A5 유전자의 cDNA 에 상보적인 뉴클레오티드 서열로 이루어지는 염기수 15 ∼ 30 의 올리고뉴클레오티드로서, 알포트 증후군의 환자의 COL4A5 유전자에 있어서의, 절두 변이를 갖고, 또한 3 의 배수의 염기수인 엑손의 스키핑을 유도할 수 있는 상기 올리고뉴클레오티드, 그 의약적으로 허용할 수 있는 염 또는 용매화물.
본 발명에 의해, COL4A5 유전자의 엑손에 절두 변이를 갖는 환자에 있어서, 절두 변이를 비-절두 변이로 치환할 수 있고, 그 결과, 중증의 임상 이미지를 나타내는 알포트 증후군 환자의 말기 신부전 진행 연령을 지연시키는 것이 가능해진다. 또한, 본 발명에 의해, 난청, 눈 병변의 진행 예방이 가능해진다.
본 명세서는, 본원의 우선권의 기초인 일본 특허 출원, 특원 2016-254906 및 특원 2017-077374 의 명세서 및/또는 도면에 기재되는 내용을 포함한다.
도 1 은 본 발명의 알포트 증후군 치료약에 의한 치료 원리를 설명하는 모식도를 나타낸다.
도 2 는 (A) COL4A5 의 엑손 24 에 대한, 실시예 1 ∼ 27 의 화합물의 효과를 나타내는 도면이다. (B,C) 프래그먼트 1 은 엑손 24 가 스키핑을 일으키기 전의 서열인 데에 반하여, 프래그먼트 2 는, 엑손 24 가 스키핑하고 있는 서열을 가지고 있는 것을 나타내는 도면이다.
도 3 은 신사구체 상피 세포 포도사이트에 엑손 24 에 대한 올리고뉴클레오티드 (실시예 1, 실시예 2, 실시예 3) 를 도입했을 때에, COL4A5 단백의 발현 (녹색) 상승, 및, 시냅토포딘 (Synaptopodin) (적색) 의 발현 상승을 나타내는 도면이다.
도 4 는 COL4A5 의 엑손 20 에 대한, 실시예 28 ∼ 33 의 화합물의 효과를 나타내는 도면이다.
도 5 는 (A) COL4A5 의 엑손 20 에 대한, 실시예 31, 및, 34 ∼ 51 의 화합물의 효과를 나타내는 도면이다. (B, C) 프래그먼트 3 은 엑손 20 이 스키핑을 일으키기 전의 서열인 데에 반하여, 프래그먼트 4 는, 엑손 20 이 스키핑하고 있는 서열을 가지고 있는 것을 나타내는 도면이다.
도 6 은 COL4A5 의 엑손 20 에 대한, 실시예 31, 43, 및, 52 ∼ 74 의 화합물의 효과를 나타내는 도면이다.
도 7 은 (A) COL4A5 의 엑손 20 에 대한, 실시예 31, 43, 및, 52 ∼ 74 의 화합물의 효과를 나타내는 도면이다. (B,C) 프래그먼트 5 는 엑손 20 이 스키핑을 일으키기 전의 서열인 데에 반하여, 프래그먼트 6 은, 엑손 20 이 스키핑하고 있는 서열을 가지고 있는 것을 나타내는 도면이다.
도 8 은 (A) COL4A5 의 엑손 24 에 대한, 실시예 1, 2, 3, 및 13 의 화합물의 효과를 나타내는 도면이다. (B,C) 프래그먼트 7 은 엑손 24 가 스키핑을 일으키기 전의 서열인 데에 반하여, 프래그먼트 8 은, 엑손 24 가 스키핑하고 있는 서열을 가지고 있는 것을 나타내는 도면이다.
도 9 는 COL4A5 의 엑손 24 에 대한, 실시예 1 ∼ 3, 및, 75 ∼ 98 의 화합물의 효과를 나타내는 도면이다.
도 10 은 COL4A5 의 엑손 24 에 대한, 실시예 1 ∼ 3, 및, 75 ∼ 98 의 화합물의 효과를 나타내는 도면이다.
도 11 은 COL4A5 의 엑손 24 에 대한, 실시예 83, 및, 85 의 화합물의 효과를 나타내는 도면이다.
도 12 는 신사구체 상피 세포 포도사이트에 엑손 24 에 대한 올리고뉴클레오티드 (실시예 1, 실시예 2, 실시예 3, 실시예 83, 및, 실시예 85) 를 도입했을 때에, COL4A5 단백의 발현 (녹색) 상승, 및, 시냅토포딘 (적색) 의 발현 상승을 나타내는 도면이다.
도 13A 는 (A) COL4A5 의 엑손 21 에 대한, 실시예 99 ∼ 139 의 화합물의 효과를 나타내는 도면이다.
도 13BC 는 (B,C) 프래그먼트 9 는 엑손 21 이 스키핑을 일으키기 전의 서열인 데에 반하여, 프래그먼트 10 은, 엑손 21 이 스키핑하고 있는 서열을 가지고 있는 것을 나타내는 도면이다.
도 14 는 (A) COL4A5 의 엑손 21 에 대한, 실시예 99 ∼ 139 의 화합물의 효과를 나타내는 도면이다. (B, C) 프래그먼트 11 (도면 중, F11 이라고 나타낸다) 은 엑손 21 이 스키핑을 일으키기 전의 서열인 데에 반하여, 프래그먼트 12 (도면 중, F12 라고 나타낸다) 는, 엑손 21 이 스키핑하고 있는 서열을 가지고 있는 것을 나타내는 도면이다.
도 15 는 COL4A5 의 엑손 21 에 대한, 실시예 99 ∼ 139 의 화합물의 효과를 나타내는 도면이다.
도 16 은 COL4A5 의 엑손 21 에 대한, 실시예 105, 114, 116 의 화합물의 효과를 나타내는 도면이다.
도 17 은 신사구체 상피 세포 포도사이트에 엑손 21 에 대한 올리고뉴클레오티드 (실시예 102, 실시예 114, 및, 실시예 116) 를 도입했을 때에, COL4A5 단백의 발현 (녹색) 상승, 및, 시냅토포딘 (적색) 의 발현 상승을 나타내는 도면이다.
이하, 본 발명의 실시형태에 대하여 보다 상세하게 설명한다.
본 발명은, COL4A5 유전자의 cDNA 에 상보적인 뉴클레오티드 서열로 이루어지는 염기수 15 ∼ 30 의 올리고뉴클레오티드로서, 알포트 증후군의 환자의 COL4A5 유전자에 있어서의, 절두 변이를 갖고, 또한 3 의 배수의 염기수인 엑손의 스키핑을 유도할 수 있는 상기 올리고뉴클레오티드, 그 의약적으로 허용할 수 있는 염 또는 용매화물을 제공한다.
본 발명에 있어서, 알포트 증후군은, X 염색체 연쇄형 알포트 증후군 (XLAS) 이이어 된다. XLAS 는 4 형 콜라겐 α5 사슬을 코드하는 유전자 COL4A5 유전자의 이상으로 발병한다. COL4A5 유전자는 콜라겐성 도메인을 형성하는 44 엑손 중 35 엑손이 3 의 배수의 염기수로 구성되어 있기 때문에, 이들 엑손에 절두 변이를 갖는 환자에 있어서는, 본 발명의 올리고뉴클레오티드를 투여하는 치료법에 의해, 비-절두 변이로 치환할 수 있다.
절두 변이란, 넌센스 변이, 프레임 시프트 변이, 스플라이스 사이트 변이 등에 의해, 단백질 합성이 도중에 중단되는 변이이다. 한편, 비-절두 변이에서는, 미스센스 변이나 엑손 결실 변이 등의 변이를 가지지만, 판독 프레임이 어긋나지 않고 단백질 합성이 실시된다.
또한, 미스센스 변이를 가져 중증화가 염려되는 XLAS 환자로서, 미스센스 변이가 3 의 배수의 엑손 상에 있는 경우, 본 발명의 올리고뉴클레오티드를 사용하여 엑손 스키핑시키면, 단축화한 단백질이 되지만, 기능하는 단백질이면, 경증화하는 것도 기대할 수 있어, 본 발명의 올리고뉴클레오티드를 투여하는 치료법의 대상이 될 수 있다.
본 발명의 올리고뉴클레오티드가 스키핑의 대상으로 하는 엑손은, COL4A5 유전자의 콜라겐성 도메인에 위치하는 엑손 (엑손 3 - 46) 중 3 의 배수의 염기수이면 된다. 3 의 배수의 염기수인 것은, 엑손 3-18, 20-22, 24, 26, 27, 30-35, 38-41, 44-46 이다.
본 발명의 올리고뉴클레오티드는, 알포트 증후군 (특히, XLAS) 환자의 COL4A5 유전자에 있어서의, 절두 변이를 갖고, 또한 3 의 배수의 염기수인 엑손을 표적으로 하는 것이면 되고, 예를 들어, 알포트 증후군 (특히, XLAS) 환자의 COL4A5 유전자의 엑손 3-18, 20-22, 24, 26, 27, 30-35, 38-41, 44-46 의 뉴클레오티드 서열 중의 연속하는 15 ∼ 30 개의 뉴클레오티드로 이루어지는 서열에 상보적인 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것이다. 즉, 본 발명의 올리고뉴클레오티드 (안티센스 올리고뉴클레오티드) 는, 알포트 증후군 (특히, XLAS) 환자의 COL4A5 유전자에 있어서의, 절두 변이를 갖고, 또한 3 의 배수의 염기수인 엑손 (예를 들어, 엑손 3-18, 20-22, 24, 26, 27, 30-35, 38-41, 44-46 의 뉴클레오티드 서열의 일부에 상보적인 뉴클레오티드 서열로 이루어지면 된다.
알포트 증후군 (특히, XLAS) 환자의 COL4A5 유전자에 있어서의, 절두 변이를 갖고, 또한 3 의 배수의 염기수인 엑손의 뉴클레오티드 서열의 일부에 상보적인 뉴클레오티드 서열로 이루어지는 올리고뉴클레오티드로는, 서열 번호 1 ∼ 28, 37 ∼ 41, 51 또는 52 의 어느 서열 (단, 서열 중의 t 는 u 여도 되고, u 는 t 여도 된다) 의 전부 또는 일부를 포함하는 것을 예시할 수 있다. 본 발명에 있어서 「서열의 일부」 란, 통상적으로, 당해 서열 전체의 80 ％ 이상이고, 바람직하게는, 85 ％ 이고, 더욱 바람직하게는, 90 ％ 이고, 가장 바람직하게는, 94 ％ 이다. 본 발명의 올리고뉴클레오티드의 염기수는, 15 ∼ 30 이 적당하고, 15 ∼ 21 이 바람직하고, 16 ∼ 20 이 보다 바람직하다.
본 발명의 올리고뉴클레오티드 (안티센스 올리고뉴클레오티드) 를 구성하는 뉴클레오티드는, 천연형 DNA, 천연형 RNA, DNA/RNA 의 키메라, 이들의 수식체의 어느 것이어도 되지만, 적어도 1 개가 수식 뉴클레오티드인 것이 바람직하다.
수식 뉴클레오티드로는, 당이 수식된 것 (예를 들어, D-리보푸라노스가 2'-O-알킬화된 것, D-리보푸라노스가 2'-O,4'-C-알킬렌화된 것), 인산디에스테르 결합이 수식 (예를 들어, 티오에이트화) 된 것, 염기가 수식된 것, 그것들을 조합한 것 등을 예시할 수 있다. 안티센스 올리고뉴클레오티드를 구성하는 적어도 1 개의 D-리보푸라노스가 2'-O-알킬화된 것이나 2'-O,4'-C-알킬렌화된 것은, RNA 에 대한 결합력이 높은 것, 뉴클레아제에 대한 내성이 높은 것으로부터, 천연형의 뉴클레오티드 (즉, 올리고 DNA, 올리고 RNA) 보다 높은 치료 효과를 기대할 수 있다. 또한, 올리고뉴클레오티드를 구성하는 적어도 1 개의 인산디에스테르 결합이 티오에이트화된 것도, 뉴클레아제에 대한 내성이 높은 것으로부터, 천연형의 뉴클레오티드 (즉, 올리고 DNA, 올리고 RNA) 보다 높은 치료 효과를 기대할 수 있다. 상기와 같은 수식된 당과 수식된 인산의 양자를 포함하는 올리고뉴클레오티드는, 뉴클레아제에 대한 내성이 보다 높은 것으로부터, 더욱 높은 치료 효과를 기대할 수 있다.
올리고뉴클레오티드 (안티센스 올리고뉴클레오티드) 에 대하여, 당의 수식의 예로는, D-리보푸라노스의 2'-O-알킬화 (예를 들어, 2'-O-메틸화, 2'-O-아미노에틸화, 2'-O-프로필화, 2'-O-알릴화, 2'-O-메톡시에틸화, 2'-O-부틸화, 2'-O-펜틸화, 2'-O-프로파르길화 등), D-리보푸라노스의 2'-O,4'-C-알킬렌화 (예를 들어, 2'-O,4'-C-에틸렌화, 2'-O,4'-C-메틸렌화, 2'-O,4'-C-프로필렌화, 2'-O,4'-C-테트라메틸렌화, 2'-O,4'-C-펜타메틸렌화 등), D-리보푸라노스의 2'-데옥시-2'-C,4'-C-메틸렌옥시메틸렌화, S-cEt (2',4'-구속 에틸), AmNA, 3'-데옥시-3'-아미노-2'-데옥시-D-리보푸라노스, 3'-데옥시-3'-아미노-2'-데옥시-2'-플루오로-D-리보푸라노스 등을 들 수 있다.
올리고뉴클레오티드 (안티센스 올리고뉴클레오티드) 에 대하여, 인산디에스테르 결합의 수식의 예로는, 포스포로티오에이트 결합, 메틸포스포네이트 결합, 메틸티오포스포네이트 결합, 포스포로디티오에이트 결합, 포스포로아미데이트 결합 등을 들 수 있다.
염기의 수식의 예로는, 사이토신의 5-메틸화, 5-플루오로화, 5-브로모화, 5-요오드화, N4-메틸화, 티민의 5-데메틸화 (우라실), 5-플루오로화, 5-브로모화, 5-요오드화, 아데닌의 N6-메틸화, 8-브로모화, 구아닌의 N2-메틸화, 8-브로모화 등을 들 수 있다.
올리고뉴클레오티드 (안티센스 올리고뉴클레오티드) 는, 시판되는 합성기 (예를 들어, 퍼킨 엘머사의 포스포로아미다이트법에 의한 모델 392) 등을 사용하여, 문헌 (Nucleic Acids Research, 12, 4539 (1984)) 에 기재된 방법에 준하여 합성할 수 있다. 그 때에 사용되는 포스포로아미다이트 시약은, 천연형의 뉴클레오시드 및 2'-O-메틸뉴클레오시드 (즉, 2'-O-메틸구아노신, 2'-O-메틸아데노신, 2'-O-메틸시티딘, 2'-O-메틸우리딘) 에 대해서는, 시판되는 시약을 사용할 수 있다. 알킬기의 탄소수가 2 ∼ 6 개인 2'-O-알킬구아노신, 아데노신, 시티딘 및 우리딘에 대해서는, 이하와 같다.
2'-O-아미노에틸구아노신, 아데노신, 시티딘, 우리딘은, 문헌 (Blommers et al. Biochemistry (1998), 37, 17714-17725.) 에 따라서 합성할 수 있다.
2'-O-프로필구아노신, 아데노신, 시티딘, 우리딘은, 문헌 (Lesnik, E.A. et al. Biochemistry (1993), 32, 7832-7838.) 에 따라서 합성할 수 있다.
2'-O-알릴구아노신, 아데노신, 시티딘, 우리딘은, 시판되는 시약을 사용할 수 있다.
2'-O-메톡시에틸구아노신, 아데노신, 시티딘, 우리딘은, 특허 (US6261840) 또는, 문헌 (Martin, P. Helv. Chim. Acta. (1995) 78, 486-504.) 에 따라서 합성할 수 있다.
2'-O-부틸구아노신, 아데노신, 시티딘, 우리딘은, 문헌 (Lesnik, E.A. et al. Biochemistry (1993), 32, 7832-7838.) 에 따라서 합성할 수 있다.
2'-O-펜틸구아노신, 아데노신, 시티딘, 우리딘은, 문헌 (Lesnik, E.A. et al. Biochemistry (1993), 32, 7832-7838.) 에 따라서 합성할 수 있다.
2'-O-프로파르길구아노신, 아데노신, 시티딘, 우리딘은, 시판되는 시약을 사용할 수 있다.
2'-O,4'-C-메틸렌구아노신, 아데노신, 시티딘, 5-메틸시티딘 및 티미딘에 대해서는, WO99/14226 에 기재된 방법에 따라서, 알킬렌기의 탄소수가 2 ∼ 5 개인 2'-O,4'-C-알킬렌구아노신, 아데노신, 시티딘, 5-메틸시티딘 및 티미딘에 대해서는, WO00/47599 에 기재된 방법에 따라서 제조할 수 있다.
D-리보푸라노스의 2'-데옥시-2'-C,4'-C-메틸렌옥시메틸렌화된 뉴클레오시드는, 문헌 (Wang, G. et al. Tetrahedron (1999), 55, 7707-7724.) 에 따라서 합성할 수 있다.
S-cEt (구속 에틸) 는, 문헌 (Seth, P. P. et al. J. Org. Chem (2010), 75, 1569-1581.) 에 따라서 합성할 수 있다.
AmNA 는, 문헌 (Yahara, A. et al. ChemBioChem (2012), 13, 2513-2516.) 또는, WO2014/109384 에 따라서 합성할 수 있다.
핵산 염기 중, 우라실 (U) 과 티민 (T) 은, 호환성이 있다. 우라실 (U) 과 티민 (T) 의 어느 것도, 상보 사슬인 아데닌 (A) 과의 염기쌍 형성에 사용할 수 있다. 포스포로아미다이트 시약을 커플링 후, 황, 테트라에틸티우람디술파이드 (TETD, 어플라이드 바이오 시스템사), Beaucage 시약 (Glen Research 사), 또는, 크산탄하이드리드 등의 시약을 반응시킴으로써, 포스포로티오에이트 결합을 갖는 안티센스 올리고뉴클레오티드를 합성할 수 있다 (Tetrahedron Letters, 32, 3005 (1991), J. Am. Chem. Soc. 112, 1253 (1990), PCT/WO98/54198).
합성기에서 사용하는 콘트롤드 포어 글래스 (CPG) 로는, 2'-O-메틸뉴클레오시드가 결합한 것은, 시판되는 것을 이용할 수 있다. 또한, 2'-O,4'-C-메틸렌구아노신, 아데노신, 5-메틸시티딘 및 티미딘에 대해서는, WO99/14226 에 기재된 방법에 따라서, 알킬렌기의 탄소수가 2 ∼ 5 개인 2'-O,4'-C-알킬렌구아노신, 아데노신, 5-메틸시티딘 및 티미딘에 대해서는, WO00/47599 에 기재된 방법에 따라서 제조한 뉴클레오시드를 문헌 (Oligonucleotide Synthesis, Edited by M. J. Gait, Oxford University Press, 1984) 에 따라서, CPG 에 결합할 수 있다. 수식된 CPG (일본 공개특허공보 평7-87982 의 실시예 12b 에 기재) 를 사용함으로써, 3' 말단에 2-하이드록시에틸인산기가 결합한 올리고뉴클레오티드를 합성할 수 있다. 또한, 3'-amino-Modifier C3 CPG, 3'-amino-Modifier C7 CPG, Glyceryl CPG, (Glen Research), 3'-spacer C3 SynBase CPG 1000, 3'-spacer C9 SynBase CPG 1000 (link technologies) 을 사용하면, 3' 말단에 하이드록시알킬인산기, 또는, 아미노알킬인산기가 결합한 올리고뉴클레오티드를 합성할 수 있다.
본 발명의 올리고뉴클레오티드 (안티센스 올리고뉴클레오티드) 는, 알포트 증후군의 치료에 사용할 수 있다.
올리고뉴클레오티드 (안티센스 올리고뉴클레오티드) 는, 의약적으로 허용할 수 있는 염의 형태로 사용해도 된다. 「의약적으로 허용되는 염」 이란, 올리고뉴클레오티드 (안티센스 올리고뉴클레오티드) 의 염을 말하고, 그러한 염으로는, 나트륨염, 칼륨염, 리튬염과 같은 알칼리 금속염, 칼슘염, 마그네슘염과 같은 알칼리 토금속염, 알루미늄염, 철염, 아연염, 동염, 니켈염, 코발트염 등의 금속염 ; 암모늄염과 같은 무기염, t-옥틸아민염, 디벤질아민염, 모르폴린염, 글루코사민염, 페닐글리신알킬에스테르염, 에틸렌디아민염, N-메틸글루카민염, 구아니딘염, 디에틸아민염, 트리에틸아민염, 디시클로헥실아민염, N,N'-디벤질에틸렌디아민염, 클로로프로카인염, 프로카인염, 디에탄올아민염, N-벤질-페네틸아민염, 피페라진염, 테트라메틸암모늄염, 트리스(하이드록시메틸)아미노메탄염과 같은 유기염 등의 아민염 ; 불화수소산염, 염산염, 브롬화수소산염, 요오드화수소산염과 같은 할로겐화수소산염, 질산염, 과염소산염, 황산염, 인산염 등의 무기산염 ; 메탄술폰산염, 트리플루오로메탄술폰산염, 에탄술폰산염과 같은 저급 알칸술폰산염, 벤젠술폰산염, p-톨루엔술폰산염과 같은 아릴술폰산염, 아세트산염, 말산염, 푸마르산염, 숙신산염, 시트르산염, 타르타르산염, 옥살산염, 말레산염 등의 유기산염 ; 글리신염, 리신염, 아르기닌염, 오르니틴염, 글루타민산염, 아스파르트산염과 같은 아미노산염 등을 들 수 있다. 이들 염은, 공지된 방법으로 제조할 수 있다.
또한, 올리고뉴클레오티드 (안티센스 올리고뉴클레오티드) 및 그 의약적으로 허용되는 염은, 용매화물 (예를 들어, 수화물) 로도 존재하는 경우가 있고, 그러한 용매화물이어도 된다.
올리고뉴클레오티드 (안티센스 올리고뉴클레오티드), 그 의약적으로 허용되는 염 또는 용매화물을 알포트 증후군의 치료에 사용하는 경우에는, 그 자체 혹은 적절한 의약적으로 허용되는 부형제, 희석제 등과 혼합하고, 정제, 캡슐제, 과립제, 산제 혹은 시럽제 등에 의해 경구적으로, 혹은, 주사제, 좌제, 첩부제 혹은 외용제 등에 의해 비경구적으로 투여할 수 있다.
이들 제제는, 부형제 (예를 들어, 젖당, 백당, 포도당, 만니톨, 소르비톨과 같은 당 유도체 ; 옥수수 전분, 감자 전분, α 전분, 덱스트린과 같은 전분 유도체 ; 결정 셀룰로오스와 같은 셀룰로오스 유도체 ; 아라비아 고무 ; 덱스트란 ; 풀루란과 같은 유기계 부형제 ; 경질 무수 규산, 합성 규산알루미늄, 규산칼슘, 메타규산알루민산마그네슘과 같은 규산염 유도체 ; 인산수소칼슘과 같은 인산염 ; 탄산칼슘과 같은 탄산염 ; 황산칼슘과 같은 황산염 등의 무기계 부형제 등), 활택제 (예를 들어, 스테아르산 ; 스테아르산칼슘, 스테아르산마그네슘과 같은 스테아르산 금속염 ; 탤크 ; 콜로이드 실리카 ; 비드 왁스, 경랍과 같은 왁스류 ; 붕산 ; 아디프산 ; 황산나트륨과 같은 황산염 ; 글리콜 ; 푸마르산 ; 벤조산나트륨 ; DL 류신 ; 라우릴황산나트륨, 라우릴황산마그네슘과 같은 라우릴황산염 : 무수 규산, 규산수화물과 같은 규산류 ; 상기 전분 유도체 등), 결합제 (예를 들어, 하이드록시프로필셀룰로오스, 하이드록시프로필메틸셀룰로오스, 폴리비닐피롤리돈, 매크로골, 상기 부형제와 동일한 화합물 등), 붕괴제 (예를 들어, 저치환도 하이드록시프로필셀룰로오스, 카르복시메틸셀룰로오스, 카르복시메틸셀룰로오스칼슘, 내부 가교 카르복시메틸셀룰로오스나트륨과 같은 셀룰로오스 유도체 ; 카르복시메틸스타치, 카르복시메틸스타치나트륨, 가교 폴리비닐피롤리돈과 같은 화학 수식된 전분·셀룰로오스류 등), 유화제 (예를 들어, 벤토나이트, 비감과 같은 콜로이드성 점토 ; 수산화마그네슘, 수산화알루미늄과 같은 금속 수산화물 ; 라우릴황산나트륨, 스테아르산칼슘과 같은 음이온 계면 활성제 ; 염화벤잘코늄과 같은 양이온 계면 활성제 ; 폴리옥시에틸렌알킬에테르, 폴리옥시에틸렌소르비탄지방산에스테르, 자당지방산에스테르와 같은 비이온 계면 활성제 등), 안정제 (메틸파라벤, 프로필파라벤과 같은 파라옥시벤조산에스테르류 ; 클로로부탄올, 벤질알코올, 페닐에틸알코올과 같은 알코올류 ; 염화벤잘코늄 ; 페놀, 크레졸과 같은 페놀류 ; 티메로살 ; 디하이드로아세트산 ; 소르브산 등), 교미교취제 (예를 들어, 통상적으로 사용되는 감미료, 산미료, 향료 등), 희석제 등의 첨가제를 사용하여 주지의 방법으로 제조된다.
본 발명의 치료약은, 0.1 ∼ 250 μ㏖es/㎖ 의 올리고뉴클레오티드 (안티센스 올리고뉴클레오티드) 를 함유하면 되고, 바람직하게는, 1 ∼ 50 μ㏖es/㎖ 의 올리고뉴클레오티드 (안티센스 올리고뉴클레오티드), 그 의약적으로 허용되는 염 또는 용매화물, 0.02 ∼ 10 ％ w/v 의 탄수화물 또는 다가 알코올 및 0.01 ∼ 0.4 ％ w/v 의 의약적으로 허용할 수 있는 계면 활성제를 함유시켜 두어도 된다.
상기 탄수화물로는, 단당류 및/또는 2 당류가 특히 바람직하다. 이들 탄수화물 및 다가 알코올의 예로는, 글루코오스, 갈락토오스, 만노오스, 락토오스, 말토오스, 만니톨 및 소르비톨을 들 수 있다. 이들은, 단독으로 사용해도 되고, 병용해도 된다.
또한, 계면 활성제의 바람직한 예로는, 폴리옥시에틸렌소르비탄모노 ∼ 트리-에스테르, 알킬페닐폴리옥시에틸렌, 나트륨타우로콜레이트, 나트륨콜레이트, 및 다가 알코올에스테르를 들 수 있다. 이 중 특히 바람직한 것은, 폴리옥시에틸렌소르비탄모노 ∼ 트리-에스테르이고, 여기에 있어서 에스테르로서 특히 바람직한 것은, 올레에이트, 라우레이트, 스테아레이트 및 팔미테이트이다. 이들은 단독으로 사용해도 되고, 병용해도 된다.
또한, 본 발명의 치료약은, 더욱 바람직하게는, 0.03 ∼ 0.09 M 의 의약적으로 허용할 수 있는 중성염, 예를 들어, 염화나트륨, 염화칼륨 및/또는 염화칼슘을 함유시켜 두어도 된다.
또한, 본 발명의 치료약은, 더욱 바람직하게는, 0.002 ∼ 0.05 M 의 의약적으로 허용할 수 있는 완충제를 함유할 수 있다. 바람직한 완충제의 예로는, 시트르산나트륨, 나트륨글리시네이트, 인산나트륨, 트리스(하이드록시메틸)아미노메탄을 들 수 있다. 이들 완충제는, 단독으로 사용해도 되고, 병용해도 된다.
또한, 상기의 치료약은, 용액 상태로 공급해도 된다. 그러나, 어느 기간 보존할 필요가 있는 경우 등을 위해서, 올리고뉴클레오티드 (안티센스 올리고뉴클레오티드) 를 안정화하여 치료 효과의 저하를 방지할 목적으로 통상적으로는 동결 건조시켜 두는 것이 바람직하고, 그 경우에는 사용시에 용해액 (주사용 증류수 등) 으로 재구성 (reconstruction) 하여, 즉 투여되는 액체 상태로 하여 이용하면 된다. 따라서, 본 발명의 치료약은, 각 성분이 소정의 농도 범위가 되도록 용해액으로 재구성하여 사용하기 위한, 동결 건조된 상태의 것도 포함한다. 동결 건조물의 용해성을 촉진시킬 목적으로, 알부민, 글리신 등의 아미노산을 추가로 함유시켜 두어도 된다.
올리고뉴클레오티드 (안티센스 올리고뉴클레오티드), 그 의약적으로 허용되는 염 또는 용매화물을 사람에게 투여하는 경우에는, 예를 들어, 성인 1 일당 약 0.01 ∼ 100 ㎎/㎏ (체중), 바람직하게는 0.1 ∼ 20 ㎎/㎏ (체중) 의 투여량으로, 1 회 또는 수회로 나누어 피하 주사, 점적 정맥 주사, 또는, 정맥 주사하면 되지만, 그 투여량이나 투여 횟수는, 질환의 종류, 증상, 연령, 투여 방법 등에 따라 적절히 변경할 수 있다.
알포트 증후군 환자에 대한 올리고뉴클레오티드 (안티센스 올리고뉴클레오티드), 그 의약적으로 허용되는 염 또는 용매화물의 투여는, 예를 들어, 이하와 같이 하여 실시할 수 있다. 즉, 올리고뉴클레오티드 (안티센스 올리고뉴클레오티드), 그 의약적으로 허용되는 염 또는 용매화물을 당업자에게 주지의 방법으로 제조하고, 이것을 통상적인 방법에 의해 멸균 처리하여, 예를 들어 125 ㎎/㎖ 의 주사용 용액을 조제한다. 이 용액을, 환자 정맥 내에 올리고뉴클레오티드 (안티센스 올리고뉴클레오티드) 의 투여량이 체중 1 ㎏ 당 예를 들어 10 ㎎ 이 되도록, 예를 들어 수액의 형태로 점적 투여한다. 투여는, 예를 들어 1 주일의 간격으로 실시하고, 그 후에도, 뇨단백의 감소, 신장 기능 장해 진행의 억제 등에 의해 치료 효과의 확인을 하면서, 적절히 이 치료를 반복한다.
본 발명의 알포트 증후군 치료약은, ACE 저해약이나 안기오텐신 수용체 길항약 등의 다른 치료제와 병용해도 된다.
실시예
이하, 본 발명을 실시예에 의해 구체적으로 설명한다. 또한, 이들 실시예는, 본 발명을 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
(실시예 1)
Figure pct00001
핵산 자동 합성기 (BioAutomation 제조 MerMade 192X) 를 이용하여, 포스포로아미다이트법 (Nucleic Acids Research, 12, 4539 (1984)) 를 사용하여 합성을 실시하였다. 시약으로는, 액티베이터 용액-3 (0.25 ㏖/ℓ 5-벤질티오-1H-테트라졸·아세토니트릴 용액, 와코 순약 공업 제조, 제품 번호 013-20011), CAP A for AKTA (1-메틸이미다졸·아세토니트릴 용액, Sigma-Aldrich 제조, 제품 번호 L040050), Cap B1 for AKTA (무수 아세트산·아세토니트릴 용액, Sigma-Aldrich 제조, 제품 번호 L050050), Cap B2 for AKTA (피리딘·아세토니트릴 용액, Sigma-Aldrich 제조, 제품 번호 L050150), DCA Deblock (디클로로아세트산·톨루엔 용액, Sigma-Aldrich 제조, 제품 번호 L023050) 를 사용하였다. 포스포로티오에이트 결합을 형성하기 위한 티오화 시약으로서, 0.2 M 이 되도록 페닐아세틸디술파이드 (CARBOSYNTH 제조, 제품 번호 FP07495) 를, 아세토니트릴 (탈수, 칸토 화학 제조, 제품 번호 01837-05), 피리딘 (탈수, 칸토 화학 제조, 제품 번호 11339-05) 1 : 1 (v/v) 용액을 사용하여 용해시켜 사용하였다. 아미다이트 시약으로는, 2'-O-Me 뉴클레오시드의 포스포로아미다이트 (아데노신체 제품 번호 ANP-5751, 시티딘체 제품 번호 ANP-5752, 구아노신체 제품 번호 ANP-5753, 우리딘체 제품 번호 ANP-5754) 는 ChemGenes 제조의 것을 사용하였다. 비천연형의 포스포로아미다이트는 일본 공개특허공보 2000-297097 의 실시예 14 (5'-O-디메톡시트리틸-2'-O,4'-C-에틸렌-6-N-벤조일아데노신-3'-O-(2-시아노에틸 N,N-디이소프로필)포스포로아미다이트), 실시예 27 (5'-O-디메톡시트리틸-2'-O,4'-C-에틸렌-2-N-이소부티릴구아노신-3'-O-(2-시아노에틸 N,N-디이소프로필)포스포로아미다이트), 실시예 22 (5'-O-디메톡시트리틸-2'-O,4'-C-에틸렌-4-N-벤조일-5-메틸시티딘-3'-O-(2-시아노에틸 N,N-디이소프로필)포스포로아미다이트), 실시예 9 (5'-O-디메톡시트리틸-2'-O,4'-C-에틸렌-5-메틸우리딘-3'-O-(2-시아노에틸 N,N-디이소프로필)포스포로아미다이트), 의 화합물을 사용하였다. 고상 담체로서, Glen Unysupport FC 96 웰 포맷 0.2 μ㏖ (GlenResearch 제조) 를 이용하여, 표기의 화합물을 합성하였다. 단, 아미다이트체의 축합에 필요로 하는 시간은, 약 9 분으로 하였다.
목적 서열을 갖는 보호된 올리고뉴클레오티드 유연체를 600 ㎕ 의 진한 암모니아수로 처리함으로써 올리고머를 지지체로부터 절출함과 함께, 인 원자 상의 보호기 시아노에틸기와 핵산 염기 상의 보호기를 떼어냈다. 올리고머의 혼합 용액을, Clarity QSP DNA Loading Buffer (Phenomenex 제조) 300 ㎕ 를 혼합하고, Clarity SPE 96 well plate (Phenomenex 제조) 상에 챠지하였다. Clarity QSP DNA Loading Buffer : 물 = 1 : 1 용액 1 ㎖, 물 3 ㎖, 3 ％ 디클로로아세트산 (DCA) 수용액 3 ㎖, 물 6 ㎖ 의 순서로 첨가한 후, 20 mM Tris 수용액 : 아세토니트릴 = 9 : 1 용액으로 추출되는 성분을 모았다. 용매 증류 제거 후, 목적 화합물을 얻었다. 본 화합물은, 역상 HPLC (칼럼 (Phenomenex, Clarity 2.6 ㎛ Oligo-MS 100A (2.1 × 50 ㎜)), A 용액 : 100 mM 헥사플루오로이소프로판올 (HFIP), 8 mM 트리에틸아민 수용액, B 용액 : 메탄올, B ％ : 10 ％ → 25 ％ (4 min, 선형 구배) ; 60 ℃ ; 0.5 ㎖/min ; 260 ㎚) 로 분석하면, 2.887 분에 용출되었다. 화합물은 부이온 ESI 질량 분석에 의해 동정하였다 (계산치 : 6276.73, 실측치 : 6276.64).
본 화합물의 염기 서열은, Homo sapiens collagen type IV alpha 5 chain (COL4A5) (NCBI-GenBank 접근 번호 NG_011977) 의 뉴클레오티드 번호 162604-162621 에 상보적인 서열이다.
실시예 2 및 3 의 화합물도 실시예 1 과 동일하게 합성하였다. 실시예 1 의 데이터, 및, 실시예 2 및 3 에 대하여 표 1 에 기재한다.
Figure pct00002
표 중의 서열에 있어서 대문자는 ENA, 소문자는 2'-OMe-RNA 를 나타낸다. 개시 및 종료에 대해서는, Homo sapiens collagen type IV alpha 5 chain (COL4A5) (NCBI-GenBank 접근 번호 NG_011977) 의 뉴클레오티드 번호를 나타낸다. 표 중의 분자량은, 부이온 ESI 질량 분석에 의한 실측치를 나타낸다.
(실시예 4)
Figure pct00003
실시예 1 과 동일한 조건으로 합성한 목적 서열을 갖는 보호된 올리고뉴클레오티드 유연체를 600 ㎕ 의 진한 암모니아수로 처리함으로써 올리고머를 지지체로부터 절출함과 함께, 인 원자 상의 보호기 시아노에틸기와 핵산 염기 상의 보호기를 떼어냈다. 올리고머의 혼합 용액을, Clarity QSP DNA Loading Buffer (Phenomenex 제조) 300 ㎕ 를 혼합하고, Clarity SPE 96 well plate (Phenomenex 제조) 상에 챠지하였다. Clarity QSP DNA Loading Buffer : 물 = 1 : 1 용액 1 ㎖, 0.1 M 탄산수소트리에틸암모늄 수용액 (TEAB) : 물 = 8 : 2 용액 1 ㎖, 3 ％ 디클로로아세트산 (DCA) 수용액 3 ㎖, 물 2 ㎖, 20 mM Tris 수용액 1 ㎖ 의 순서로 첨가한 후, 20 mM Tris 수용액 : 아세토니트릴 = 9 : 1 용액으로 추출되는 성분을 모았다. 용매 증류 제거 후, 목적 화합물을 얻었다. 본 화합물은, 역상 HPLC (칼럼 (Phenomenex, Clarity 2.6 ㎛ Oligo-MS 100A (2.1 × 50 ㎜)), A 용액 : 100 mM 헥사플루오로이소프로판올 (HFIP), 8 mM 트리에틸아민 수용액, B 용액 : 메탄올, B ％ : 10 ％ → 25 ％ (4 min, 선형 구배) ; 60 ℃ ; 0.5 ㎖/min ; 260 ㎚) 로 분석하면, 2.733 분에 용출되었다. 화합물은 부이온 ESI 질량 분석에 의해 동정하였다 (계산치 : 6304.76, 실측치 : 6304.75).
본 화합물의 염기 서열은, Homo sapiens collagen type IV alpha 5 chain (COL4A5) (NCBI-GenBank 접근 번호 NG_011977) 의 뉴클레오티드 번호 162604-162621 에 상보적인 서열이다.
실시예 5 내지 27 의 화합물도 실시예 4 와 동일하게 합성하였다. 실시예 4 의 데이터, 및, 실시예 5 내지 27 에 대하여 표 2 에 기재한다.
Figure pct00004
Figure pct00005
표 중의 서열에 있어서 대문자는 ENA, 소문자는 2'-OMe-RNA 를 나타낸다. 개시 및 종료에 대해서는, Homo sapiens collagen type IV alpha 5 chain (COL4A5) (NCBI-GenBank 접근 번호 NG_011977) 의 뉴클레오티드 번호를 나타낸다. 표 중의 분자량은, 부이온 ESI 질량 분석에 의한 실측치를 나타낸다.
(실시예 28)
Figure pct00006
실시예 1 과 동일한 조건으로 합성 및 정제를 실시하여, 목적 화합물을 얻었다. 본 화합물은, 역상 HPLC (칼럼 (Phenomenex, Clarity 2.6 ㎛ Oligo-MS 100A (2.1 × 50 ㎜)), A 용액 : 100 mM 헥사플루오로이소프로판올 (HFIP), 8 mM 트리에틸아민 수용액, B 용액 : 메탄올, B ％ : 10 ％ → 25 ％ (4 min, 선형 구배) ; 60 ℃ ; 0.5 ㎖/min ; 260 ㎚) 로 분석하면, 3.113 분에 용출되었다. 화합물은 부이온 ESI 질량 분석에 의해 동정하였다 (계산치 : 6401.73, 실측치 : 6401.69).
본 화합물의 염기 서열은, Homo sapiens collagen type IV alpha 5 chain (COL4A5) (NCBI-GenBank 접근 번호 NG_011977) 의 뉴클레오티드 번호 156301-156318 에 상보적인 서열이다.
실시예 29 내지 33 의 화합물도 실시예 28 과 동일하게 합성하였다. 실시예 28 의 데이터, 및, 실시예 29 내지 33 에 대하여 표 3 에 기재한다.
Figure pct00007
표 중의 서열에 있어서 대문자는 ENA, 소문자는 2'-OMe-RNA 를 나타낸다. 개시 및 종료에 대해서는, Homo sapiens collagen type IV alpha 5 chain (COL4A5) (NCBI-GenBank 접근 번호 NG_011977) 의 뉴클레오티드 번호를 나타낸다. 표 중의 분자량은, 부이온 ESI 질량 분석에 의한 실측치를 나타낸다.
(실시예 34 ∼ 74)
Figure pct00008
실시예 4 와 동일한 조건으로 합성 및 정제를 실시하여, 목적 화합물을 얻었다. 본 화합물은, 역상 HPLC (칼럼 (Phenomenex, Clarity 2.6 ㎛ Oligo-MS 100A (2.1 × 50 ㎜)), A 용액 : 100 mM 헥사플루오로이소프로판올 (HFIP), 8 mM 트리에틸아민 수용액, B 용액 : 메탄올, B ％ : 10 ％ → 25 ％ (4 min, 선형 구배) ; 60 ℃ ; 0.5 ㎖/min ; 260 ㎚) 로 분석하면, 3.213 분에 용출되었다. 화합물은 부이온 ESI 질량 분석에 의해 동정하였다 (계산치 : 6385.74, 실측치 : 6385.78).
본 화합물의 염기 서열은, Homo sapiens collagen type IV alpha 5 chain (COL4A5) (NCBI-GenBank 접근 번호 NG_011977) 의 뉴클레오티드 번호 156303-156320 에 상보적인 서열이다.
실시예 35 내지 74 의 화합물도 실시예 34 와 동일하게 합성하였다. 실시예 34 의 데이터, 및, 실시예 35 내지 74 에 대하여, 표 4 에 기재한다.
Figure pct00009
Figure pct00010
표 중의 서열에 있어서 대문자는 ENA, 소문자는 2'-OMe-RNA 를 나타낸다. 개시 및 종료에 대해서는, Homo sapiens collagen type IV alpha 5 chain (COL4A5) (NCBI-GenBank 접근 번호 NG_011977) 의 뉴클레오티드 번호를 나타낸다. 표 중의 분자량은, 부이온 ESI 질량 분석에 의한 실측치를 나타낸다.
또한, 본 명세서에 있어서, At, Gt, 5meCt, Ct, Tt, Ut, Ap, Gp, 5meCp, Cp, Tp, Up, As, Gs, 5meCs, Cs, Ts, Us, Am1t, Gm1t, Cm1t, 5meCm1t, Um1t, Am1p, Gm1p, Cm1p, 5meCm1p, Um1p, Am1s, Gm1s, Cm1s, 5meCm1s, Um1s, A2t, G2t, C2t, T2t, Ae2p, Ge2p, Ce2p, Te2p, Ae2s, Ge2s, Ce2s, Te2s, A1t, G1t, C1t, T1t, Ae1p, Ge1p, Ce1p, Te1p, Ae1s, Ge1s, Ce1s, Te1s, Am2t, Gm2t, 5meCm2t, Tm2t, Am2p, Gm2p, 5meCm2p, Tm2p, Am2s, Gm2s, 5meCm2s, Tm2s 는, 하기에 나타내는 구조를 갖는 기이다.
Figure pct00011
Figure pct00012
Figure pct00013
Figure pct00014
Figure pct00015
(시험예 1) ENA 올리고뉴클레오티드에 의한 엑손 스키핑 유도능의 해석
HMVEC (피부 미소 혈관 내피 세포) 배양
이하와 같이 하여, HMVEC 의 배양을 실시하였다.
정상 신생아 (단일) 유래 피부 미소 혈관 내피 세포 HMVEC (CC-2813, Lonza 사) 를, 유지 배지 (EGM-2MV ; CC-3202, Lonza 사) 에서 배양하였다. 또한, 3.7 x 105/10 ㎝ dish 의 파종 밀도로 계대하고, 실험에는 6 계대째까지의 세포를 사용하였다. 96 well plate 에 2-5 x 103 cells/well 의 밀도로 세포를 파종하고, 다음날 신선 유지 배지로 교환 후, 후술하는 바와 같이 실시예에서 제조한 올리고뉴클레오티드를 도입하였다.
뇨 중 낙하 세포 초대 배양계 제작
이하와 같이 하여, 뇨 중 낙하 세포의 초대 배양계를 제작하였다.
X 연쇄형 알포트 증후군이라고 유전자 진단된 환자로부터, 뇨 (∼ 100 ㎖ 정도) 를 채취하였다. 원심 (1,400 rpm x 10 min) 에 의해 상청을 폐기하고, 세포 덩어리를 cold PBS 에 의해 2 회 세정하였다. 세포 덩어리를 유지 배지 (EGM-MV (Lonza), 20 ％ FBS, 페니실린 (100 U/㎖), 스트렙토마이신 (1 ㎎/㎖), 리팜피신 (8 ㎍/㎖)) 로 현탁하고, 37 ℃, 5 ％ CO2 인큐베이터에서, 배양하였다. 2 계대째 이후에는, 리팜피신을 뺀 유지 배지에서, 배양하였다.
신사구체 상피 세포 (포도사이트) 로의 분화 유도
이하와 같이 하여, 환자 유래 뇨 중 낙하 세포로부터 신사구체 상피 세포 (포도사이트) 로의 분화를 유도하였다.
96 well plate 에 1 x 104 cells/well 의 밀도로 세포를 파종하고, 다음날 (분화 유도 0 일째), 분화 유도 배지 (DMEM/F12, 5 ％ FBS, 1 x ITS supplement, 12.5 μM 레티노산) 로 교환하였다. 이후 3 일마다 배지를 교환하였다. 분화 유도 8 일째에, 후술하는 바와 같이 실시예에서 제조한 올리고뉴클레오티드를 도입하였다.
실시예에서 제조한 올리고뉴클레오티드를 트랜스펙션
이하와 같이 하여, 실시예에서 제조한 올리고뉴클레오티드를 트랜스펙션하였다.
하기 A 액과 B 액을 제작 후, 혼합하였다.
A 액 : Opti-MEM Medium (Thermofisher) 20 ㎕
실시예에서 제조한 화합물 (20 μM) 1 ㎕ (최종 농도 50 nM)
B 액 : Opti-MEM Medium 20 ㎕
Lipofectamine RNAiMAX (Thermofisher) 1.2 ㎕
상기의 혼합액을 5 분간 실온에서 인큐베이션하였다. 제작한 용액을, 1 well 에 대하여 10 ㎕ 씩 첨가하고, 48 시간 인큐베이션하였다.
RNA 추출
이하와 같이 하여 RNA 의 추출을 실시하였다.
올리고뉴클레오티드를 트랜스펙션 후 48 시간 인큐베이션한 세포를, cold PBS 로 1 회 세정하였다. SuperPrep Cell Lysis Kit & RT Kit for qPCR (TOYOBO) 의 세포 용해액을, 1 well 에 대하여 50 ㎕ 씩 첨가하고, 30 초간 진탕 후, 실온에서 5 분간 인큐베이션하였다. SuperPrep Cell Lysis Kit & RT Kit for qPCR 의 반응 정지액을, 1 well 에 대하여 10 ㎕ 씩 첨가하고, 30 초간 진탕 후, 실온에서 2 분간 인큐베이션하였다. 합계 60 ㎕ 의 세포 용해액을 회수하고, 후술하는 역전사 반응을 실시하였다.
역전사 반응
이하와 같이 하여 역전사 반응을 실시하였다.
SuperPrep Cell Lysis & RT Kit for qPCR 의 역전사 반응 마스터 믹스 32 ㎕ 와 세포 용해액 8 ㎕ 를 혼합하였다. 역전사 반응을 이하와 같이 실시하였다 (37 ℃ 15 min, 50 ℃ 5 min, 98 ℃ 5 min, 4 ℃ Hold). 최종 산물은 -30 ℃ 에서 보존하였다.
PCR 반응과 프래그먼트 서열 해석
이하와 같이 하여 PCR 반응과 프래그먼트 서열 해석을 실시하였다.
하기와 같이, PCR 반응액을 조정하였다.
Figure pct00016
이하와 같이 PCR 반응을 실시하였다 (94 ℃ 5 min, (94 ℃ 30 sec, 60 ℃ 30 sec, 72 ℃ 30 sec) x 30 - 38 cycles, 72 ℃ 5 min, 4 ℃ Hold).
해석용 프라이머는 하기와 같이 설계하였다.
1) 전체 COL4A5 발현 해석용 (엑손 1 - 7)
Figure pct00017
2) 엑손 20 스키핑 해석용 (엑손 17 - 22)
Figure pct00018
3) 엑손 24 스키핑 해석용 (엑손 21 - 26)
Figure pct00019
4) 내재성 컨트롤 유전자 (GAPDH) 해석용
Figure pct00020
PCR 산물은 에티듐브로마이드를 포함하는 1.8 ％ 아가로오스 겔로 전기 영동하여, 해석하였다. 각 프래그먼트는, PCR purification kit (QIAGEN 사) 로 겔로부터 추출하고, BigDye v1.1 을 사용하여 시퀀스 반응을 실시하였다. ABI PRISM 3130 Genetic Analyzer (Applied Biosystems 사) 와 CLC Main Workbench 6 (CLC bio 사) 으로 염기 서열을 확인하였다.
분화 포도사이트의 면역 형광 염색
이하와 같이, 면역 형광 염색을 실시하였다.
분화 포도사이트를 PBS 로 세정하고, 4 ％ 파라포름알데히드 + 4 ％ 수크로오스/PBS 로 실온 10 분간, 고정시켰다. PBS 로 3 회 세정 후, 0.1 ％ Triton X-100/PBS 로 실온 5 분간, 투과 처리하였다. PBS 로 3 회 세정 후, 5 ％ Fetal bovine serum/PBS 로 블로킹하였다. 1 차 항체 (래트 항-COL4A5 H53 항체, 시게이 의학 연구소 ; 사도 요시카즈 선생으로부터의 공여, 마우스 항-시냅토포딘 항체, 니이가타 대학 의치학 종합 연구과 신장 연구 센터 ; 야오이타 에이신 선생으로부터 공여된 마우스 하이브리도마 상청을 사용) 를 4 ℃ 에서 하룻밤 반응시켰다. PBS 로 3 회 세정 후, 2 차 항체 (Alexa Fluor 488 염소 항-래트 IgG, Alexa Fluor 555 염소 항-마우스 IgG) 를 실온 1 시간 반응시켰다. PBS 로 3 회 세정 후, 핵 염색을 위하여, Hoechst33342 를 실온 10 분간 반응시켰다. 봉입 후, 형광 현미경으로 관찰하였다.
HMVEC 또는 알포트 증후군 환자 유래 뇨 중 낙하 세포에 있어서의, 실시예 화합물에 의한 엑손 스키핑
도 2 에 나타낸 바와 같이, HMVEC 를 사용하여 엑손 24 에 대한 올리고뉴클레오티드 (실시예 1 ∼ 실시예 27) 의 엑손 24 스키핑에 대하여 조사한 결과, 실시예 1 ∼ 실시예 27 의 올리고뉴클레오티드에서 엑손 24 스키핑이 확인되었다 (도 2A). 특히, 실시예 1, 실시예 2, 실시예 3, 실시예 13 이 높은 스키핑 효율을 나타냈다. 또한, 겔에서 볼 수 있었던 프래그먼트의 시퀀스 해석을 실시한 결과, 프래그먼트 2 가, 엑손 24 가 스키핑하고 있는 서열인 것을 확인하였다 (도 2B, 및, 2C).
도 3 에 나타낸 바와 같이, 엑손 24 에 변이를 갖는 알포트 증후군 환자 유래 뇨 중 낙하 세포를, COL4A5 발현 세포인 신사구체 상피 세포 포도사이트로 분화 유도하고, 엑손 24 에 대한 올리고뉴클레오티드 3 종류 (실시예 1, 실시예 2, 실시예 3) 를 각 50 nM 도입하고, 효과를 확인하였다. COL4A5 와 분화 포도사이트 마커인 시냅토포딘 (염소 항-시냅토포딘 항체, SantaCruz 사) 의 발현을 평가하였다. 비도입 세포 (Mock) 에 대하여, 올리고뉴클레오티드 도입 세포에서는 COL4A5 단백의 발현 (녹색) 이 상승하고, 또한 분화 포도사이트 마커인 시냅토포딘 (적색) 의 발현의 상승도 확인되었다. 이것으로부터, 올리고뉴클레오티드의 도입은 COL4A5 단백의 발현 상승에 기여할 뿐만 아니라, 포도사이트의 분화능에도 영향을 주고 있을 가능성이 시사되었다.
도 4 에 나타낸 바와 같이, COL4A5 고발현 세포 HMVEC 를 사용하여, 엑손 20 에 대한 올리고뉴클레오티드 (실시예 28 ∼ 33) 의 엑손 20 스키핑에 대하여 조사한 결과, 실시예 28 ∼ 실시예 33 의 올리고뉴클레오티드에서 엑손 20 스키핑이 확인되었다. 특히, 실시예 31 이 높은 스키핑 효율을 나타냈다.
도 5 에 나타낸 바와 같이, COL4A5 고발현 세포 HMVEC 를 사용하여, 엑손 20 에 대한 올리고뉴클레오티드 (실시예 28 ∼ 33) 의 엑손 20 스키핑에 대하여 조사한 결과, 실시예 34 ∼ 실시예 51 의 올리고뉴클레오티드에서 엑손 20 스키핑이 확인되었다 (도 5A). 특히, 실시예 43 이 높은 스키핑 효율을 나타냈다.
도 6 에 나타낸 바와 같이, COL4A5 고발현 세포 HMVEC 를 사용하여 엑손 20 에 대한 올리고뉴클레오티드 (실시예 52 ∼ 실시예 74) 의 엑손 20 스키핑에 대하여 조사한 결과, 모든 올리고뉴클레오티드에서 엑손 20 스키핑이 확인되었다.
도 7 에 나타낸 바와 같이, 엑손 20 에 변이를 갖는 알포트 증후군 환자 유래 뇨 중 낙하 세포를, COL4A5 발현 세포인 신사구체 상피 세포 포도사이트로 분화 유도하고, 엑손 20 에 대한 올리고뉴클레오티드 (실시예 52 ∼ 실시예 74) 의 엑손 20 스키핑에 대하여 조사한 결과, 모든 올리고뉴클레오티드에서 엑손 20 스키핑이 확인되었다 (도 7A). 또한, 겔에서 볼 수 있었던 프래그먼트의 시퀀스 해석을 실시한 결과, 프래그먼트 6 이, 엑손 20 이 스키핑하고 있는 서열인 것을 확인하였다 (도 7B, 및, 7C).
도 8 에 나타낸 바와 같이, 엑손 24 에 변이를 갖는 알포트 증후군 환자 유래 뇨 중 낙하 세포를, COL4A5 발현 세포인 신사구체 상피 세포 포도사이트로 분화 유도하고, 엑손 24 에 대한 올리고뉴클레오티드 (실시예 1, 2, 3, 13) 를 각 5, 15, 50 또는 100 nM 도입하고, 엑손 24 스키핑에 대하여 조사한 결과, 모든 올리고뉴클레오티드에서 농도 의존적으로 엑손 24 스키핑이 확인되었다 (도 8A). 또한, 겔에서 볼 수 있었던 프래그먼트의 시퀀스 해석을 실시한 결과, 프래그먼트 8 이, 엑손 24 가 스키핑하고 있는 서열인 것을 확인하였다 (도 8B, 및, 8C).
(실시예 75 내지 98)
실시예 75 내지 98 의 화합물도 실시예 4 와 동일하게 합성하였다. 실시예 75 내지 98 의 화합물의 서열 및 데이터에 대하여 표 5 에 기재한다.
Figure pct00021
Figure pct00022
표 중의 서열에 있어서 대문자는 ENA, 소문자는 2'-OMe-RNA 를 나타낸다. 개시 및 종료에 대해서는, Homo sapiens collagen type IV alpha 5 chain (COL4A5) (NCBI-GenBank 접근 번호 NG_011977) 의 뉴클레오티드 번호를 나타낸다. 표 중의 분자량은, 부이온 ESI 질량 분석에 의한 실측치를 나타낸다.
(실시예 99 내지 139)
실시예 99 내지 139 의 화합물도 실시예 4 와 동일하게 합성하였다. 실시예 99 내지 139 의 화합물의 서열 및 데이터에 대하여 표 6 에 기재한다.
Figure pct00023
Figure pct00024
표 중의 서열에 있어서 대문자는 ENA, 소문자는 2'-OMe-RNA 를 나타낸다. 개시 및 종료에 대해서는, Homo sapiens collagen type IV alpha 5 chain (COL4A5) (NCBI-GenBank 접근 번호 NG_011977) 의 뉴클레오티드 번호를 나타낸다. 표 중의 분자량은, 부이온 ESI 질량 분석에 의한 실측치를 나타낸다.
(시험예 2) ENA 올리고뉴클레오티드에 의한 엑손 스키핑 유도능의 해석
시험예 1 과 동일하게, HMVEC (피부 미소 혈관 내피 세포) 배양, 뇨 중 낙하 세포 초대 배양계 제작, 신사구체 상피 세포 (포도사이트) 로의 분화 유도, 실시예에서 제조한 올리고뉴클레오티드를 트랜스펙션, RNA 추출, 역전사 반응, PCR 반응과 프래그먼트 서열 해석, 및, 분화 포도사이트의 면역 형광 염색의 조작을 실시하였다.
HMVEC 또는 알포트 증후군 환자 유래 뇨 중 낙하 세포에 있어서의, 실시예 화합물에 의한 엑손 스키핑
도 9 에 나타낸 바와 같이, HMVEC 를 사용하여 엑손 24 에 대한 올리고뉴클레오티드 (실시예 75 ∼ 실시예 98) 의 엑손 24 스키핑에 대하여 조사한 결과, 실시예 75 ∼ 실시예 98 의 모든 올리고뉴클레오티드에 있어서, 도 2 와 동일하게 엑손 24 가 스키핑하고 있는 것을 나타내는 프래그먼트 2 가 검출되어, 엑손 24 스키핑이 확인되었다.
도 10 에 나타낸 바와 같이, 엑손 24 에 변이를 갖는 알포트 증후군 환자 유래 뇨 중 낙하 세포를, COL4A5 발현 세포인 신사구체 상피 세포 포도사이트로 분화 유도하고, 엑손 24 에 대한 올리고뉴클레오티드 (실시예 75 ∼ 실시예 98) 의 엑손 24 스키핑에 대하여 조사한 결과, 도 2 와 동일하게 엑손 24 가 스키핑하고 있는 것을 나타내는 프래그먼트 2 가 검출되어, 모든 올리고뉴클레오티드에서 엑손 24 스키핑이 확인되었다.
도 11 에 나타낸 바와 같이, 엑손 24 에 변이를 갖는 알포트 증후군 환자 유래 뇨 중 낙하 세포를, COL4A5 발현 세포인 신사구체 상피 세포 포도사이트로 분화 유도하고, 엑손 24 에 대한 올리고뉴클레오티드 (실시예 83, 실시예 85) 를 각 0.05, 0.5, 5, 15, 50 또는 100 nM 도입하고, 엑손 24 스키핑에 대하여 조사한 결과, 모든 올리고뉴클레오티드에서 농도 의존적으로 엑손 24 스키핑이 확인되었다.
도 12 에 나타낸 바와 같이, 엑손 24 에 변이를 갖는 알포트 증후군 환자 유래 뇨 중 낙하 세포를, COL4A5 발현 세포인 신사구체 상피 세포 포도사이트로 분화 유도하고, 엑손 24 에 대한 올리고뉴클레오티드 5 종류 (실시예 1, 실시예 2, 실시예 3, 실시예 83, 실시예 85) 를 각 50 nM 도입하고, 효과를 확인하였다. COL4A5 와 분화 포도사이트 마커인 시냅토포딘 (염소 항-시냅토포딘 항체, SantaCruz 사) 의 발현을 평가하였다. 비도입 세포 (Mock) 에 대하여, 올리고뉴클레오티드 도입 세포에서는 COL4A5 단백의 발현 (녹색) 이 상승하고, 또한 분화 포도사이트 마커인 시냅토포딘 (적색) 의 발현의 상승도 확인되었다. 이것으로부터, 올리고뉴클레오티드의 도입은 COL4A5 단백의 발현 상승에 기여할 뿐만 아니라, 포도사이트의 분화능에도 영향을 주고 있을 가능성이 시사되었다.
(시험예 3) ENA 올리고뉴클레오티드에 의한 엑손 스키핑 유도능의 해석
HEK293A (사람 태아 신장 세포 유래 주화 세포) 배양
이하와 같이 하여, HEK293A 의 배양을 실시하였다.
HEK293A (Invitrogen 사) 를, 유지 배지 (DMEM, Thermo Scientific 사, 10 ％ Fetal Bovine Serum (Thermo Scientific 사) 을 포함한다) 로 10 ㎝ dish 또는 T75 플라스크에서 배양하였다. 트랜스펙션 직전에 TrypLE Express (Thermo Scientific 사) 에 의해 세포를 박리하여 세포 현탁액으로 하고, 후술하는 바와 같이 실시예에서 제조한 올리고뉴클레오티드를, 리버스 트랜스펙션법으로 도입하였다.
실시예에서 제조한 올리고뉴클레오티드의 트랜스펙션
이하와 같이 하여, 실시예에서 제조한 올리고뉴클레오티드를 트랜스펙션하였다.
하기 A 액과 B 액을 제작 후, 혼합하였다.
A 액 : Opti-MEM Medium (Thermofisher) 4.8 ㎕
실시예에서 제조한 화합물 (10 μM) 0.5 ㎕ (최종 농도 50 nM)
B 액 : Opti-MEM Medium 5 ㎕
Lipofectamine RNAiMAX (Thermofisher) 0.3 ㎕
상기의 혼합액을 15 분간 실온에서 인큐베이션하였다. 제작한 용액을, 96 well plate 1 well 에 대하여 10.6 ㎕ 씩 분주하였다. 이 plate 에 2 x 104 cells/well 의 밀도로 세포를 파종하고 24 시간 인큐베이션하였다.
RNA 추출
이하와 같이 하여 RNA 의 추출을 실시하였다.
올리고뉴클레오티드를 트랜스펙션 후 24 시간 인큐베이션한 세포를, cold PBS 로 1 회 세정하였다. SuperPrep Cell Lysis Kit & RT Kit for qPCR (TOYOBO 사) 의 세포 용해액을, 1 well 에 대하여 50 ㎕ 씩 첨가하고, 30 초간 진탕 후, 실온에서 5 분간 인큐베이션하였다. SuperPrep Cell Lysis Kit & RT Kit for qPCR 의 반응 정지액을, 1 well 에 대하여 10 ㎕ 씩 첨가하고, 30 초간 진탕 후, 실온에서 2 분간 인큐베이션하였다. 합계 60 ㎕ 의 세포 용해액을 회수하고, 후술하는 역전사 반응을 실시하였다.
역전사 반응
이하와 같이 하여 역전사 반응을 실시하였다.
SuperPrep Cell Lysis & RT Kit for qPCR 의 역전사 반응 마스터 믹스 32 ㎕ 와 세포 용해액 8 ㎕ 를 혼합하였다. 역전사 반응을 이하와 같이 실시하였다 (37 ℃ 15 min, 50 ℃ 5 min, 98 ℃ 5 min, 4 ℃ Hold). 최종 산물은 -20 ℃ 에서 보존하였다.
PCR 반응과 프래그먼트 서열 해석
이하와 같이 하여 PCR 반응과 프래그먼트 서열 해석을 실시하였다.
하기와 같이, PCR 반응액을 조정하였다.
Figure pct00025
이하와 같이 PCR 반응을 실시하였다 (94 ℃ 2 min, (94 ℃ 30 sec, 55 ℃ 30 sec, 68 ℃ 1 min) x 30 - 40 cycles, 68 ℃ 10 min, 4 ℃ Hold).
해석용 프라이머는 하기와 같이 설계하였다.
1) COL4A5 엑손 21 스키핑 해석용 (엑손 20-23)
Figure pct00026
2) 내재성 컨트롤 유전자 (ACTB) 해석용
Figure pct00027
PCR 산물은 LabChip (등록상표) GX (Caliper LifeSciences) 로 해석하였다. 또한, PCR 산물을 에티듐브로마이드를 포함하는 2 ％ 아가로오스 겔로 전기 영동하고, NucleoSpin (등록상표) Gel and PCR Clean-up (MACHEREY-NAGEL 사) 으로 겔로부터 추출하였다. BigDye (등록상표) Terminator v3.1 을 사용하여 추출한 DNA 의 시퀀스 반응을 실시하였다. Applied Biosystems 3730 xl DNA Analyzer (Life technologies 사) 로 염기 서열을 확인하였다.
HEK293A 에 있어서의, 실시예 화합물에 의한 엑손 스키핑
도 13 에 나타낸 바와 같이, HEK293A 를 사용하여 엑손 21 에 대한 올리고뉴클레오티드 (실시예 99 ∼ 실시예 139) 의 엑손 21 스키핑에 대하여 조사한 결과, 모든 올리고뉴클레오티드에서 엑손 21 스키핑이 확인되었다 (도 13A). 또한, 겔로부터 추출한 프래그먼트의 시퀀스 해석을 실시하여, 프래그먼트 9 가 스키핑 전의 서열, 프래그먼트 10 이 엑손 21 이 스키핑하고 있는 서열인 것을 확인하였다 (도 13B, C).
(시험예 4) ENA 올리고뉴클레오티드에 의한 엑손 스키핑 유도능의 해석
시험예 1 과 동일하게, HMVEC (피부 미소 혈관 내피 세포) 배양, 뇨 중 낙하 세포 초대 배양계 제작, 신사구체 상피 세포 (포도사이트) 로의 분화 유도, 실시예에서 제조한 올리고뉴클레오티드를 트랜스펙션, RNA 추출, 역전사 반응, PCR 반응과 프래그먼트 서열 해석, 및, 분화 포도사이트의 면역 형광 염색의 조작을 실시하였다.
단, 해석용 프라이머는 하기와 같이 설계하여 사용하였다.
엑손 21 스키핑 해석용 (엑손 18-24)
Figure pct00028
HMVEC 또는 알포트 증후군 환자 유래 뇨 중 낙하 세포에 있어서의 , 실시예 화합물에 의한 엑손 스키핑
도 14A 에 나타낸 바와 같이, HMVEC 를 사용하여 엑손 21 에 대한 올리고뉴클레오티드 (실시예 99 ∼ 실시예 139) 의 엑손 21 스키핑에 대하여 조사한 결과, 모든 올리고뉴클레오티드에서 엑손 21 스키핑이 확인되었다. 또한, 겔에서 볼 수 있었던 프래그먼트의 시퀀스 해석을 실시한 결과, 프래그먼트 11 이, 엑손 20 이 스키핑하고 있는 서열인 것을 확인하였다 (도 14B, 및, 14C). 엑손 21 에 대한 올리고뉴클레오티드는, 최종 농도 5 nM 이 되도록 사용하였다.
도 15 에 나타낸 바와 같이, 엑손 21 에 변이를 갖는 알포트 증후군 환자 유래 뇨 중 낙하 세포를, COL4A5 발현 세포인 신사구체 상피 세포 포도사이트로 분화 유도하고, 엑손 21 에 대한 올리고뉴클레오티드 (실시예 99 ∼ 실시예 139) 의 엑손 21 스키핑에 대하여 조사한 결과, 모든 올리고뉴클레오티드에서 엑손 21 스키핑이 확인되었다. 엑손 21 에 대한 올리고뉴클레오티드는, 최종 농도 50 nM 이 되도록 사용하였다.
도 16 에 나타낸 바와 같이, 엑손 21 에 변이를 갖는 알포트 증후군 환자 유래 뇨 중 낙하 세포를, COL4A5 발현 세포인 신사구체 상피 세포 포도사이트로 분화 유도하고, 엑손 21 에 대한 올리고뉴클레오티드 (실시예 105, 실시예 114, 실시예 116) 를 각 0.05, 0.5, 5, 15, 50 또는 100 nM 도입하고, 엑손 21 스키핑에 대하여 조사한 결과, 모든 올리고뉴클레오티드에서 농도 의존적으로 엑손 21 스키핑이 확인되었다.
도 17 에 나타낸 바와 같이, 엑손 21 에 변이를 갖는 알포트 증후군 환자 유래 뇨 중 낙하 세포를, COL4A5 발현 세포인 신사구체 상피 세포 포도사이트로 분화 유도하고, 엑손 21 에 대한 올리고뉴클레오티드 3 종류 (실시예 102, 실시예 105, 실시예 114, 실시예 116) 를 각 5 nM 도입하고, 효과를 확인하였다. COL4A5 와 분화 포도사이트 마커인 시냅토포딘 (염소 항-시냅토포딘 항체, SantaCruz 사) 의 발현을 평가하였다. 비도입 세포 (Mock) 에 대하여, 올리고뉴클레오티드 도입 세포에서는 COL4A5 단백의 발현 (녹색) 이 상승하고, 또한 분화 포도사이트 마커인 시냅토포딘 (적색) 의 발현의 상승도 확인되었다. 이것으로부터, 올리고뉴클레오티드의 도입은 COL4A5 단백의 발현 상승에 기여할 뿐만 아니라, 포도사이트의 분화능에도 영향을 주고 있을 가능성이 시사되었다.
(실시예 140 및 141)
실시예 140 및 141 의 화합물도 실시예 4 와 동일하게 합성하였다. 실시예 140 및 141 의 화합물의 서열 및 데이터에 대하여 표 7 에 기재한다.
Figure pct00029
표 중의 서열에 있어서 대문자는 ENA, 소문자는 2'-OMe-RNA 를 나타낸다. 개시 및 종료에 대해서는, Homo sapiens collagen type IV alpha 5 chain (COL4A5) (NCBI-GenBank 접근 번호 NG_011977) 의 뉴클레오티드 번호를 나타낸다. 표 중의 분자량은, 부이온 ESI 질량 분석에 의한 실측치를 나타낸다.
(실시예 142)
Figure pct00030
실시예 142 의 화합물은, 포스포로아미다이트법 (Nucleic Acids Research, 12, 4539 (1984)) 를 사용하여 합성을 실시하였다. LNA 부분은, WO99/14226 에 기재된 포스포로아미다이트체를 사용하여 합성하였다.
본 화합물은, 역상 HPLC (칼럼 (X-Bridge C18 2.5 ㎛ (4.6 × 75 ㎜)), A 용액 : 100 mM 헥사플루오로이소프로판올 (HFIP), 8 mM 트리에틸아민 수용액, B 용액 : 메탄올, B ％ : 5 ％ → 30 ％ (20 min, 선형 구배) ; 60 ℃ ; 1 ㎖/min ; 260 ㎚) 로 분석하면, 12.87 분에 용출되었다. 화합물은 부이온 ESI 질량 분석에 의해 동정하였다 (실측치 : 6173.88).
본 화합물의 염기 서열은, Homo sapiens collagen type IV alpha 5 chain (COL4A5) (NCBI-GenBank 접근 번호 NG_011977) 의 뉴클레오티드 번호 156701-156684 에 상보적인 서열이다.
(실시예 143 내지 280)
실시예 143 내지 280 의 화합물도 실시예 140 과 동일하게 합성할 수 있다. 실시예 143 내지 280 의 화합물의 서열에 대하여 표 8 내지 11 에 기재한다.
Figure pct00031
Figure pct00032
표 중의 서열에 있어서 대문자는 LNA, 소문자는 2'-OMe-RNA 를 나타낸다. 개시 및 종료에 대해서는, Homo sapiens collagen type IV alpha 5 chain (COL4A5) (NCBI-GenBank 접근 번호 NG_011977) 의 뉴클레오티드 번호를 나타낸다.
Figure pct00033
Figure pct00034
표 중의 서열에 있어서 대문자는 LNA, 소문자는 2'-OMe-RNA 를 나타낸다. 개시 및 종료에 대해서는, Homo sapiens collagen type IV alpha 5 chain (COL4A5) (NCBI-GenBank 접근 번호 NG_011977) 의 뉴클레오티드 번호를 나타낸다.
Figure pct00035
Figure pct00036
표 중의 서열에 있어서 대문자는 LNA, 소문자는 2'-OMe-RNA 를 나타낸다. 개시 및 종료에 대해서는, Homo sapiens collagen type IV alpha 5 chain (COL4A5) (NCBI-GenBank 접근 번호 NG_011977) 의 뉴클레오티드 번호를 나타낸다.
Figure pct00037
Figure pct00038
Figure pct00039
표 중의 서열에 있어서 대문자는 LNA, 소문자는 2'-OMe-RNA 를 나타낸다. 개시 및 종료에 대해서는, Homo sapiens collagen type IV alpha 5 chain (COL4A5) (NCBI-GenBank 접근 번호 NG_011977) 의 뉴클레오티드 번호를 나타낸다.
본 명세서에서 인용한 모든 간행물, 특허 및 특허 출원을 그대로 참고로서 본 명세서에 받아들이는 것으로 한다.
본 발명은, 알포트 증후군의 치료에 이용할 수 있다.
＜서열 번호 1＞ 실시예 1, 4 ∼ 11 에서 제조한 올리고뉴클레오티드 (ex24_011, ex24_c01, ex24_c02, ex24_c03, ex24_c04, ex24_c05, ex24_c06, ex24_c07, ex24_c08) 의 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
＜서열 번호 2＞ 실시예 2, 12 ∼ 19 에서 제조한 올리고뉴클레오티드 (ex24_b04, ex24_c09, ex24_c10, ex24_c11, ex24_c12, ex24_c13, ex24_c14, ex24_c15, ex24_c16) 의 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
＜서열 번호 3＞ 실시예 3, 20 ∼ 27 에서 제조한 올리고뉴클레오티드 (ex24_b05, ex24_c17, ex24_c18, ex24_c19, ex24_c20, ex24_c21, ex24_c22, ex24_c23, ex24_c24) 의 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
＜서열 번호 4＞ 실시예 28 에서 제조한 올리고뉴클레오티드 (ex20_001) 의 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
＜서열 번호 5＞ 실시예 29 에서 제조한 올리고뉴클레오티드 (ex20_002) 의 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
＜서열 번호 6＞ 실시예 30 에서 제조한 올리고뉴클레오티드 (ex20_022) 의 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
＜서열 번호 7＞ 실시예 31 에서 제조한 올리고뉴클레오티드 (ex20_023) 의 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
＜서열 번호 8＞ 실시예 32 에서 제조한 올리고뉴클레오티드 (ex20_024) 의 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
＜서열 번호 9＞ 실시예 33 에서 제조한 올리고뉴클레오티드 (ex20_044) 의 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
＜서열 번호 10＞ 실시예 34 에서 제조한 올리고뉴클레오티드 (ex20_b02) 의 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
＜서열 번호 11＞ 실시예 35 에서 제조한 올리고뉴클레오티드 (ex20_b03) 의 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
＜서열 번호 12＞ 실시예 36 에서 제조한 올리고뉴클레오티드 (ex20_b04) 의 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
＜서열 번호 13＞ 실시예 37 에서 제조한 올리고뉴클레오티드 (ex20_b05) 의 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
＜서열 번호 14＞ 실시예 38 에서 제조한 올리고뉴클레오티드 (ex20_b07) 의 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
＜서열 번호 15＞ 실시예 39 에서 제조한 올리고뉴클레오티드 (ex20_b09) 의 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
＜서열 번호 16＞ 실시예 40 에서 제조한 올리고뉴클레오티드 (ex20_b10) 의 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
＜서열 번호 17＞ 실시예 41 에서 제조한 올리고뉴클레오티드 (ex20_b11) 의 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
＜서열 번호 18＞ 실시예 42 에서 제조한 올리고뉴클레오티드 (ex20_b12) 의 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
＜서열 번호 19＞ 실시예 43, 63 ∼ 74 에서 제조한 올리고뉴클레오티드 (ex20_b13, ex20_c12, ex20_c13, ex20_c14, ex20_c15, ex20_c16, ex20_c17, ex20_c18, ex20_c19, ex20_c20, ex20_c21, ex20_c22, ex20_c23) 의 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
＜서열 번호 20＞ 실시예 44 에서 제조한 올리고뉴클레오티드 (ex20_b14) 의 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
＜서열 번호 21＞ 실시예 45 에서 제조한 올리고뉴클레오티드 (ex20_b15) 의 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
＜서열 번호 22＞ 실시예 46 에서 제조한 올리고뉴클레오티드 (ex20_b16) 의 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
＜서열 번호 23＞ 실시예 47 에서 제조한 올리고뉴클레오티드 (ex20_b17) 의 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
＜서열 번호 24＞ 실시예 48 에서 제조한 올리고뉴클레오티드 (ex20_b18) 의 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
＜서열 번호 25＞ 실시예 49 에서 제조한 올리고뉴클레오티드 (ex20_b19) 의 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
＜서열 번호 26＞ 실시예 50 에서 제조한 올리고뉴클레오티드 (ex20_b20) 의 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
＜서열 번호 27＞ 실시예 51 에서 제조한 올리고뉴클레오티드 (ex20_b21) 의 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
＜서열 번호 28＞ 실시예 52 ∼ 62 에서 제조한 올리고뉴클레오티드 (ex20_c01, ex20_c02, ex20_c03, ex20_c04, ex20_c05, ex20_c06, ex20_c07, ex20_c08, ex20_c09, ex20_c10, ex20_c11) 의 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
＜서열 번호 29＞ 전체 COL4A5 발현 해석용 (엑손 1-7) Forward (5'-3') 프라이머의 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
＜서열 번호 30＞ 전체 COL4A5 발현 해석용 (엑손 1-7) Reverse (5'-3') 프라이머의 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
＜서열 번호 31＞ COL4A5 엑손 20 스키핑 해석용 (엑손 17-22) Forward (5'-3') 프라이머의 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
＜서열 번호 32＞ COL4A5 엑손 20 스키핑 해석용 (엑손 17-22) Reverse (5'-3') 프라이머의 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
＜서열 번호 33＞ COL4A5 엑손 24 스키핑 해석용 (엑손 21-26) Forward (5'-3') 프라이머의 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
＜서열 번호 34＞ COL4A5 엑손 24 스키핑 해석용 (엑손 21-26) Reverse (5'-3') 프라이머의 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
＜서열 번호 35＞ 내재성 컨트롤 유전자 (GAPDH) 해석용 Forward (5'-3') 프라이머의 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
＜서열 번호 36＞ 내재성 컨트롤 유전자 (GAPDH) 해석용 Reverse (5'-3') 프라이머의 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
＜서열 번호 37＞ 실시예 75 ∼ 82 에서 제조한 올리고뉴클레오티드 (ex24_c25, ex24_c26, ex24_c27, ex24_c28, ex24_c29, ex24_c30, ex24_c31, ex24_c32) 의 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
＜서열 번호 38＞ 실시예 83 ∼ 90 에서 제조한 올리고뉴클레오티드 (ex24_c33, ex24_c34, ex24_c35, ex24_c36, ex24_c37, ex24_c38, ex24_c39) 의 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
＜서열 번호 39＞ 실시예 91 ∼ 98 에서 제조한 올리고뉴클레오티드 (ex24_c41, ex24_c42, ex24_c43, ex24_c44, ex24_c45, ex24_c46, ex24_c47, ex24_c48) 의 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
＜서열 번호 40＞ 실시예 99, 113 ∼ 116 에서 제조한 올리고뉴클레오티드 (ex21_010, ex21_c10, ex21_c12, ex21_c13, ex21_c14) 의 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
＜서열 번호 41＞ 실시예 100, 136 ∼ 139 에서 제조한 올리고뉴클레오티드 (ex21_011, ex21_c34, ex21_c35, ex21_c36, ex21_c37) 의 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
＜서열 번호 42＞ 실시예 101, 104 ∼ 112 에서 제조한 올리고뉴클레오티드 (ex21_b08, ex21_c01, ex21_c02, ex21_c03, ex21_c04, ex21_c05, ex21_c06, ex21_c07, ex21_c08, ex21_c09) 의 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
＜서열 번호 43＞ 실시예 102, 117 ∼ 125 에서 제조한 올리고뉴클레오티드 (ex21_b09, ex21_c15, ex21_c16, ex21_c17, ex21_c18, ex21_c19, ex21_c20, ex21_c21, ex21_c22, ex21_c23) 의 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
＜서열 번호 44＞ 실시예 103, 126 ∼ 135 에서 제조한 올리고뉴클레오티드 (ex21_b10, ex21_c24, ex21_c25, ex21_c26, ex21_c27, ex21_c28, ex21_c29, ex21_c30, ex21_c31, ex21_c32, ex21_c33) 의 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
＜서열 번호 45＞ COL4A5 엑손 21 스키핑 해석용 (엑손 20-23) Forward (5'-3') 프라이머의 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
＜서열 번호 46＞ COL4A5 엑손 21 스키핑 해석용 (엑손 20-23) Reverse (5'-3') 프라이머의 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
＜서열 번호 47＞ 내재성 컨트롤 유전자 (ACTB) 해석용 Forward (5'-3') 프라이머의 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
＜서열 번호 48＞ 내재성 컨트롤 유전자 (ACTB) 해석용 Reverse (5'-3') 프라이머의 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
＜서열 번호 49＞ COL4A5 엑손 21 스키핑 해석용 (엑손 18-24) Forward (5'-3') 프라이머의 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
＜서열 번호 50＞ COL4A5 엑손 21 스키핑 해석용 (엑손 18-24) Reverse (5'-3') 프라이머의 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
＜서열 번호 51＞ 실시예 140 에서 제조한 올리고뉴클레오티드 (ex21_012-2) 의 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
＜서열 번호 52＞ 실시예 141 에서 제조한 올리고뉴클레오티드 (ex21_012-4) 의 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
SEQUENCE LISTING <110> DAIICHI SANKYO COMPANY, LIMITED NATIONAL UNIVERSITY CORPORATION KOBE UNIVERSITY <120> Therapeutic agents against Alport syndrome <130> FP-225PCT <150> JP P2016-254906 <151> 2016-12-28 <150> JP P2017-077374 <151> 2017-04-10 <160> 52 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 1 cccuggcaau ccatcctg 18 <210> 2 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 2 ccuggcaauc cauccugu 18 <210> 3 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 3 ctggcaatcc auccugtc 18 <210> 4 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 4 uauagcutac taggagga 18 <210> 5 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 5 gcuuacuagg aggaaugu 18 <210> 6 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 6 ggagguccag gaatggaa 18 <210> 7 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 7 gtccaggaau ggaaautc 18 <210> 8 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 8 aggaauggaa auuccagg 18 <210> 9 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 9 uaactgcagc ccctaaga 18 <210> 10 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 10 aauatagcuu acuaggag 18 <210> 11 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 11 atauagctua cuaggagg 18 <210> 12 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 12 atagcuuacu aggaggaa 18 <210> 13 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 13 uagctuacua ggaggaau 18 <210> 14 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 14 ctuacuagga ggaaugtg 18 <210> 15 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 15 uacuaggagg aaugugag 18 <210> 16 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 16 gaggtccagg aauggaaa 18 <210> 17 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 17 agguccagga auggaaau 18 <210> 18 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 18 gguccaggaa tggaaatu 18 <210> 19 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 19 uccaggaaug gaaauucc 18 <210> 20 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 20 ccaggaatgg aaatucca 18 <210> 21 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 21 caggaaugga aautccag 18 <210> 22 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 22 ccauaactgc agccccta 18 <210> 23 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 23 cauaacugca gccccuaa 18 <210> 24 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 24 ataacugcag ccccuaag 18 <210> 25 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 25 aacugcagcc ccuaagau 18 <210> 26 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 26 acugcagccc cuaagatu 18 <210> 27 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 27 ctgcagcccc taagautc 18 <210> 28 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 28 gtccaggaat ggaaautc 18 <210> 29 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 29 cagaggctgc ggcttgctat 20 <210> 30 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 30 ccacgttctc ccttggttcc a 21 <210> 31 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 31 gggatggtga aaagggccaa aaag 24 <210> 32 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 32 cctttgtcac ctttcactcc ttgt 24 <210> 33 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 33 caaggagtga aaggtgacaa aggt 24 <210> 34 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 34 ccctttagga cctggtattc ctg 23 <210> 35 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 35 cccttcattg acctcaac 18 <210> 36 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 36 ttcacaccca tgacgaac 18 <210> 37 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 37 ccctggcaat ccaucctg 18 <210> 38 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 38 cctggcaatc caucctgt 18 <210> 39 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 39 cuggcaaucc auccuguc 18 <210> 40 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 40 ctuggagtcc tuuaucac 18 <210> 41 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 41 ggagtcctuu aucacctg 18 <210> 42 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 42 ccuuggaguc cuutauca 18 <210> 43 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 43 utggaguccu tuatcacc 18 <210> 44 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 44 uggaguccuu taucaccu 18 <210> 45 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 45 cagttatggg tcctcctggc 20 <210> 46 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 46 agttgcacca gcttgtcctt 20 <210> 47 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 47 tggcacccag cacaatgaa 19 <210> 48 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 48 ctaagtcata gtccgcctag aagca 25 <210> 49 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 49 gacctcctgg acttgtaatt ccta 24 <210> 50 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 50 ctcctggaat gcctggtaat cct 23 <210> 51 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 51 tcctuuauca cctgg 15 <210> 52 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 52 ctuuaucacc tggag 15

Claims (13)

  1. COL4A5 유전자의 cDNA 에 상보적인 뉴클레오티드 서열로 이루어지는 염기수 15 ∼ 30 의 올리고뉴클레오티드로서, 알포트 증후군의 환자의 COL4A5 유전자에 있어서의, 절두 변이를 갖고, 또한 3 의 배수의 염기수인 엑손의 스키핑을 유도할 수 있는 상기 올리고뉴클레오티드, 그 의약적으로 허용할 수 있는 염 또는 용매화물.
  2. 제 1 항에 있어서,
    알포트 증후군의 환자의 COL4A5 유전자에 있어서의, 절두 변이를 갖고, 또한 3 의 배수의 염기수인 엑손의 뉴클레오티드 서열의 일부에 상보적인 뉴클레오티드 서열로 이루어지는 올리고뉴클레오티드, 그 의약적으로 허용할 수 있는 염 또는 용매화물.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    알포트 증후군의 환자의 COL4A5 유전자에 있어서의, 절두 변이를 갖고, 또한 3 의 배수의 염기수인 엑손이, COL4A5 유전자의 엑손 24, 20 또는 21 인 올리고뉴클레오티드, 그 의약적으로 허용할 수 있는 염 또는 용매화물.
  4. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서,
    서열 번호 1 ∼ 28, 37 ∼ 41, 51 또는 52 의 어느 서열 (단, 서열 중의 t 는 u 여도 되고, u 는 t 여도 된다) 의 전부 또는 일부를 포함하는 올리고뉴클레오티드, 그 의약적으로 허용할 수 있는 염 또는 용매화물.
  5. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서,
    올리고뉴클레오티드를 구성하는 당 및/또는 인산디에스테르 결합의 적어도 1 개가 수식되어 있는 올리고뉴클레오티드, 그 의약적으로 허용할 수 있는 염 또는 용매화물.
  6. 제 5 항에 있어서,
    올리고뉴클레오티드를 구성하는 당이 D-리보푸라노스이고, 당의 수식이 D-리보푸라노스의 2' 위치의 수산기의 수식인 올리고뉴클레오티드, 그 의약적으로 허용할 수 있는 염 또는 용매화물.
  7. 제 6 항에 있어서,
    당의 수식이 D-리보푸라노스의 2'-O-알킬화 및/또는 2'-O,4'-C-알킬렌화인 올리고뉴클레오티드, 그 의약적으로 허용할 수 있는 염 또는 용매화물.
  8. 제 5 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서,
    인산디에스테르 결합의 수식이 포스포로티오에이트인 올리고뉴클레오티드, 그 의약적으로 허용할 수 있는 염 또는 용매화물.
  9. 제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 기재된 올리고뉴클레오티드, 그 의약적으로 허용할 수 있는 염 또는 용매화물을 포함하는, 의약.
  10. 제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 기재된 올리고뉴클레오티드, 그 의약적으로 허용할 수 있는 염 또는 용매화물을 포함하는, 알포트 증후군 치료약.
  11. COL4A5 유전자의 cDNA 에 상보적인 뉴클레오티드 서열로 이루어지는 염기수 15 ∼ 30 의 올리고뉴클레오티드로서, 알포트 증후군의 환자의 COL4A5 유전자에 있어서의, 절두 변이를 갖고, 또한 3 의 배수의 염기수인 엑손의 스키핑을 유도할 수 있는 상기 올리고뉴클레오티드, 그 의약적으로 허용할 수 있는 염 또는 용매화물을 의약적으로 유효한 양으로 피험자에게 투여하는 것을 포함하는, 알포트 증후군의 치료 방법.
  12. 알포트 증후군의 치료를 위한, COL4A5 유전자의 cDNA 에 상보적인 뉴클레오티드 서열로 이루어지는 염기수 15 ∼ 30 의 올리고뉴클레오티드로서, 알포트 증후군의 환자의 COL4A5 유전자에 있어서의, 절두 변이를 갖고, 또한 3 의 배수의 염기수인 엑손의 스키핑을 유도할 수 있는 상기 올리고뉴클레오티드, 그 의약적으로 허용할 수 있는 염 또는 용매화물의 사용.
  13. 알포트 증후군을 치료하는 방법에 사용하기 위한, COL4A5 유전자의 cDNA 에 상보적인 뉴클레오티드 서열로 이루어지는 염기수 15 ∼ 30 의 올리고뉴클레오티드로서, 알포트 증후군의 환자의 COL4A5 유전자에 있어서의, 절두 변이를 갖고, 또한 3 의 배수의 염기수인 엑손의 스키핑을 유도할 수 있는 상기 올리고뉴클레오티드, 그 의약적으로 허용할 수 있는 염 또는 용매화물.
KR1020197019324A 2016-12-28 2017-12-25 알포트 증후군 치료약 KR20190100225A (ko)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JPJP-P-2016-254906 2016-12-28
JP2016254906 2016-12-28
JPJP-P-2017-077374 2017-04-10
JP2017077374 2017-04-10
PCT/JP2017/046304 WO2018123925A1 (ja) 2016-12-28 2017-12-25 アルポート症候群治療薬

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20190100225A true KR20190100225A (ko) 2019-08-28

Family

ID=62708210

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020197019324A KR20190100225A (ko) 2016-12-28 2017-12-25 알포트 증후군 치료약

Country Status (9)

Country Link
US (1) US11230709B2 (ko)
EP (1) EP3564373A4 (ko)
JP (1) JP7072748B2 (ko)
KR (1) KR20190100225A (ko)
CN (1) CN110199023A (ko)
AU (1) AU2017386771A1 (ko)
CA (1) CA3047894A1 (ko)
TW (1) TW201828953A (ko)
WO (1) WO2018123925A1 (ko)

Family Cites Families (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH0787982A (ja) 1993-01-29 1995-04-04 Sankyo Co Ltd 修飾オリゴデオキシリボヌクレオチド
US6096881A (en) 1997-05-30 2000-08-01 Hybridon, Inc. Sulfur transfer reagents for oligonucleotide synthesis
WO1999014226A2 (en) 1997-09-12 1999-03-25 Exiqon A/S Bi- and tri-cyclic nucleoside, nucleotide and oligonucleotide analogues
CN1273478C (zh) 1999-02-12 2006-09-06 三共株式会社 新型核苷及低聚核苷酸类似物
US6261840B1 (en) 2000-01-18 2001-07-17 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense modulation of PTP1B expression
US7902160B2 (en) 2002-11-25 2011-03-08 Masafumi Matsuo ENA nucleic acid drugs modifying splicing in mRNA precursor
CN1871033A (zh) * 2003-08-07 2006-11-29 希龙公司 作为抗癌治疗靶标的三叶因子3(tff3)
CN103898110A (zh) * 2007-10-03 2014-07-02 夸克制药公司 新siRNA结构
UA116639C2 (uk) * 2012-10-09 2018-04-25 Рег'Юлес Терап'Ютікс Інк. Способи лікування синдрому альпорта
JP6270742B2 (ja) 2013-01-10 2018-01-31 塩野義製薬株式会社 架橋型核酸誘導体の製造方法
CA2949517A1 (en) * 2014-05-20 2015-11-26 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Boron-containing proteasome inhibitors for use after primary cancer therapy
JP6416731B2 (ja) 2015-10-20 2018-10-31 株式会社ニューギン 遊技機

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
J Am Soc Nephrol, 2010 년, 21 권, p.876-883
J Am Soc Nephrol. 2000 년, 11 권, p.649-657
Kidney Int. 2013 년, 85 권, p.1208-1213
Nephrol Dial Transplant, 2002 년, 17 권, p.1218-1227

Also Published As

Publication number Publication date
JP7072748B2 (ja) 2022-05-23
US11230709B2 (en) 2022-01-25
JPWO2018123925A1 (ja) 2019-10-31
WO2018123925A1 (ja) 2018-07-05
CA3047894A1 (en) 2018-07-05
EP3564373A1 (en) 2019-11-06
AU2017386771A1 (en) 2019-06-20
US20200080080A1 (en) 2020-03-12
EP3564373A4 (en) 2020-12-16
CN110199023A (zh) 2019-09-03
TW201828953A (zh) 2018-08-16

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP2386636B1 (en) Ena nucleic acid drugs modifying splicing in mrna precursor
KR101985382B1 (ko) 톨-유사 수용체 기반 면역 반응을 조절하기 위한 면역 조절 올리고뉴클레오타이드(ｉｒｏ) 화합물
EP0928290B1 (en) Oligoribonucleotides and ribonucleases for cleaving rna
RU2648950C2 (ru) Модифицированные нуклеозиды, нуклеотиды и нуклеиновые кислоты и их применение
US5789573A (en) Antisense inhibition of ICAM-1, E-selectin, and CMV IE1/IE2
KR20220148241A (ko) Pd-l1을 표적화하기 위한 방법 및 조성물
JP2002531102A (ja) アポトーシス−２細胞性阻害剤発現のアンチセンス調節
CN114574495A (zh) 核苷类衍生物改性的核酸适体r50
KR20190100225A (ko) 알포트 증후군 치료약
KR20210019498A (ko) 심근 장해 치료약
WO2021010301A1 (ja) ＤＵＸ４ ｐｒｅ－ｍＲＮＡのスプライシングを変化させるアンチセンスオリゴヌクレオチド
WO2019111791A1 (ja) ジストロフィン遺伝子のイントロンリテンションを解消するアンチセンスオリゴヌクレオチド
JP6536911B2 (ja) ＣＤ４４遺伝子のバリアントエクソンのスキッピングを誘導し、正常型ＣＤ４４ｍＲＮＡの発現を増加させる核酸医薬
EP4067489A1 (en) Method for reducing toxicity of antisense nucleic acids
CN115916976A (zh) 诱导血管紧张素转换酶2基因外显子跳跃的反义核酸

Legal Events

Date Code Title Description
WITB Written withdrawal of application